Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные свойства продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функциональные свойства продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина"

На правах рукописи

КУДРЯШОВ Дмитрий Семенович

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПРОДУКТОВ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛОКУСА КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ

МИОЗИНА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в лаборатории Клеточной подвижности НИИ Экспериментальной Кардиологии Российского Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Научный руководитель: доктор биологических наук

В.П. Ширинский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Н.Б. Гусев

доктор биологических наук Д. И. Левицкий

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной

биофизики РАН

Защита состоится 27 апреля 2000 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 074.22.02 в РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Автореферат разослан 27 марта 2000 года

Ученый секретарь диссертациошюго совета, кандидат биологических наук

Т.И. Венгерова

ОЫЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Способность к целенаправленной подвижности является одной из отличительных характеристик живых организмов любого уровня сложности. В основе сократительной активности всех типов мышечных тканей лежит энергозависимое продвижение миознновых филаментов относительно актиновых нитей. Эта же способность актина и миозина обусловливает подвижность немышечных клеток, их миграционную активность, внутриклеточный транспорт, секрецию, кэппинг рецепторов на поверхности мембран и другие процессы жизнедеятельности клеток. Ключевым регуляторным ферментом, контролирующим активность актомиозинового аппарата гладких мышц и немышечных тканей, является киназа легких цепей миозина (КЛЦМ). КЛЦМ фосфорилирует регуляторные легкие цепи (РЛЦ) миозина, что приводит к активации АТФ-азы миозина и способствует гамосборке миознновых филаментов. В отличие от гладких мышц и немышечных клеток, в поперечнополосатой мускулатуре взрослого организма КЛЦМ играет лишь подстроенную роль (Sweeney et al , 1493). Однако, она, по-видимому, необходима на ранних стадиях эмбриогенеза в период формирования саркомероп, а также в процессе гипертрофии или регенерации мышечных волокон (Aoki et al„ 2000; Libera et al., 1997).

КЛЦМ-210

функции домена неизвестны

КЛЦМ-108

каталитическим и регуляторный ю мены_

KRP

Рис.1 Продукты генетического локуса КЛЦМ (по \Vatterson «7 <//., 1995; Шгик<>\> а я/., 1998).

Генетический локус КЛЦМ имеет сложное строение. Помимо классической КЛЦМ (МВ = 108 кДа) он кодирует два других продукта - высокомолекулярную изоформу КЛЦМ (МВ = 210 кДа) и белок КДР (КтаБе-ЯеЫесиРкЛет) с молекулярным весом 17 кДа (Рис.1) Первичная структура КЛЦМ-210 полностью включает в себя аминокислотную последовательность КЛЦМ-108, а также содержит уникальную Ы-концевую последовательность (\Vatterson еС а1, 1995). Аналогично, аминокислотная последовательность КЯР идентична С-кокцевому домену КЛЦМ (СоНйще еХ а!., 1992). Ген ККР находится внутри гена КЛЦМ и имеет собственный промотор, расположенный в интроне гена КЛЦМ (СоШп§е й а!., 1992). Промоторные участки гена КЛЦМ пока не идентифицированы, и остается

непонятным, являются л» изоформы КЛЦМ продуктами альтернативного сплайсинга или экспрессируготся с различных промоторов.

Данные литературы свидетельствуют, что все продукты генетического локуса КЛЦМ вовлечены в регуляцию актомиозинового аппарата KR1' стабилизирует филамситы гладкомышечкого миозина, предотвращая их деполимеризацию под действием физиологических концентраций АТФ за счет связывания с молекулами миозина и перевода их в развернутую конформацию (Shirinsky et al., 1993). Согласно сообщению Katayama и соавторов (Katayama et al.,1995), другой мажорный миозин-связывающий белок - кальдесмон - также обладает KRP-подобными свойствами. Однако, кальдесмон не влияет на конформационные переходы миозина п механизм его стабилизирующего действия на филаменты миозина требует дальнейшего изучения.

Функциональные свойства КЛЦМ-210 исследованы крайне мало, что, в частости, определяется отсутствием методов выделения этого белка. Установлено, что КЛЦМ-210 может фосфоршшровать РЛЦ миозина (Gallagher et al., 1995, Garcia et al., 1997), однако, соотношение ее активности с активностью КЛЦМ-108 не известно Наконец, в литературе полностью отсутствуют данные о функциональных свойствах и регуляторных элементах, связанных с. уникальной аминокислотной последовательностью КЛЦМ-210. Вместе с тем очевидно, что именно эта часть молекулы должна определять ее специфические свойства

Цель и задачи исследований На основании вышесказанного, целью настоящей диссертационном работы явилось: изучение функциональных свойств белков - продуктов генетического локуса КЛЦМ. В работе был» поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияния миозин-связывагсщих белков KRP и кальдешона на процесс полимеризации гладкомышечного миозина in vitro

2. Разработать метод выделения КЛЦМ-210 из гладких мышц аорты и исследовать ее функциональные свойства.

3. Изучить взаимодействие уникального домена КЛЦМ-210 с белками цитоскелета v возможность регуляции этих взаимодействий фосфоршшрованием.

Научная новизна работы. Впервые выделена в чистом виде высокомолекулярна; изоформа КЛЦМ-210 и исследованы ее свойства. Показано, что КЛЦМ-210 обладает фосфотрансферазной активностью по отношению к РЛЦ в составе миозиновой молекулы, сравнимой с удельной активностью КЛЦМ-108. Установлено, что КЛЦМ-210 связывается с актином и, посредством своего KRP домена, с миозином. Впервые исследованы свойствг уникального домена КЛЦМ-210 in vitro, и установлено, что он связывается с актином вызывая образование пучков Ф-актина. Показано, что уникальный домен КЛЦМ-2К способен взаимодействовать с кератином in vitro, что может указывать на роль КЛЦМ-210 i

iH-rei рации актомиозинового цитоскелета и промежуточных филаментов. Впервые показано, по уникальным домен КЛЦМ-210 может быть фосфорилирован in vitro цАМФ-зависимои [ротеинкиназой по Сер-127 и Сер-140, что приводит к ослаблению его взаимодействия с ктином и кератином.

Исследовано влияние KRP и кальдесмона на полимеризацию миозина гладких мышц )бнаружено, что при совместном действий KRP и кальдесмон могут контролировать размер количество миозиновых филаментов, а также существенно ослаблять их склонность к грегации.

Практическая значимость работы. Результат данной работы способствует более лубокому пониманию механизмов регуляции сокращения гладких мышц и подвижности емышечных клеток. Полученные в работе антитела, иолекулярно-генетические конструкции рекомбинпнтные белки, а также разработанные методические подходы н предложенные юханизмы действия изученных белков, могут быть использованы для широкого спектра сследований в области мышечного сокращения и клеточной подвижности.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на ¡ссроссийской конференции "Прикладные аспекты исследования скелетных, сердечных и ладких мышц", (Пущпно, Россия, 1996), на 2-ом, 3-ем и 4-ом совещаниях стипендиатов Медицинского Института Говарда Хьюза (Варшава, Польша, 1997; Москва, Россия, 1999), на [еждународном симпозиуме "Биологическая подвижность: современные методы сследования" (Пущино, Россия, 1998), па 37-ом конгрессе Американского Клеточно-иологнческого общества (Вашингтон, США, 1997), на 27-он и 28-ой Европейских мышечных онференциях (Лунд, Швеция, 1998, Йорк, Великобритания, 1999).

Публикации. По данным работы опубликовано 4 статьи и 14 тезисов.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 границах машинописного текста, включает 34 рисунка и 1 таблицу, состоит из введения, бзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, ыводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 154 источника.

Методы и материалы исследования.

Определение концентрации белков. Концентрацию белков определяли пектрофотометрически, используя известные коэффициенты экстинкции, или методом Lowry et al., 1951), используя бычин сывороточный альбумин (БСА) в качестве стандарта

Выделение белков Белки выделяли по стандартным протоколам: кальмодулин олучали из мозга быка (Gopalakrishna and Anderson, 1982); актин выделяли из ацетонового орошка скелетных мышц (Spudich and Watt, 1971); из мускульного желудка цыпленка ыделяли кальдесмон и тропомиозин (Bretscher, 1984), КЛЦМ (Adelstein and Klee, 1982), KRP

(Ito et al. 1989), миозин (Sellers and Pato, 1484). Фрагмент гладкомышечного тяжелого меромиозина (ТММ) получали, как описано в (Sellers, 1985). В работе был использован коммерческий препарат кератина нз эпидермиса человека (Sigma, США).

Метод выделения КЛЦМ-210 из аорты цыпленка с использованием специфических антител к ее уникальной области был разработан в настоящей работе Разработанный метод позволяет получать 10-40 мкг КЛЦМ-210 из 5-10 г ткани аорты цыпленка за один день. Выделенная КЛЦМ-210 не содержит примесей других белков и, в частности, КЛЦМ-108. Она сохраняет Са2,-кальмодулин-зависимую ферментативную активность, субстратную специфичность и способность взаимодействовать с белками цитоскелета.

Электрофорез н денситометрии. Препараты белков и экстракты тканей и клето подвергали электрофорезу в пластинах полиакриламидного геля в присутстви додецилсульфата натрия (ДСН) и (З-меркапгоэтанола по методу (Laemmli, 1970).

Гели окрашивали KyMaccn-R-250, отмывали, высушивали, сканировали с помощы сканера Hewlett-Packard HP-Ilex и проводили денситометрический анализ с помощы программы N1H Image версия 1.59.

'Электронная микроскопия. Исследуемые белковые смеси инкубировали при 20°С в течение 20-30 минут, после чего разбавляли соотвеюгвующим буфером до конечной концентрации белков в растворе 50-100 мкг/мл. Разведенные образцы быстро наносили на покрытые Формваром и напыленные углеродом сетки, которые были гидрофнлизировапы путем облучения ультрафиолетом. На сетки наносили 1% уранил ацетат, инкубировали 2 мин п промывали 5 раз раствором 1% уранил ацетата. Электронную микроскопию проводили на микроскопе JEM 100СХ при lOOkV. Увеличение калибровали по периоду кристалла каталазы пли по 14.5 им периоду миозпновых филаментов

Дифференциальное центрифугирование. Перед экспериментом растворимые белки центрифугировали при 100 000 х g 30 мин в роторе LP42TÍ (Beckman, США) при 20°С, тгобы осадить возможные агрегаты. Образцы инкубировали 30 мин при 25°С. Образцы подвергали ультрацентрифугированию при указанном выше режиме и отбирали надосадочную жидкость и осадок для анализа с помощью электрофореза При исследовании влияния фрагментов КЛЦМ-210 на формирование агрегатов Ф-актина дифференциальное центрифугирование проводили при низких скоростях (12 000 х g) для разделения Ф-актина и его агрегатов.

Определение активности КЛЦМ. Фосфорилирование ТММ и РЛЦ под действием КЛЦМ проводили в буфере, содержащем 0.5 мМ [7-32р]ДТФ, по методу (Sellers et al., 1982).

Получение и характеристика антител к уникальному фрагменту КЛЦМ-210 Антитела к рекомбинантному N875 фрагменту КЛЦМ-210 вырабатывали в кроликах Животных иммунизировали подкожными инъекциями раствора N875 в фосфатном солево\

уфере (ФС1>) с адъювантом ФреГшда в соответствии со стандартной процедурой (Harlow and ane, 1988) Аффинные антитела получали с помощью экспрессированного N875 фрагмента, овалентно иммобилизованного на матриксе (Affigel 10, Bio-Rad, США).

В иммуноблоттпнге тотального белкового экстракта аорты цыпленка антитела к N875 рагмснту специфически узнавали КЛЦМ-210.

Имиуноблоттинг. Иммуиоблоттинг проводили по методу (Towbin et al 1970) с одификациями.

Конструирование N934 и NS75 фрагментов КЛЦМ-210 для экспрессии в клетках .coli. Для бактериальной экспрессии N875 и N934 фрагментов КЛЦМ-210 исполыовали ;ктор рЕТ 30-(h)+- (Novagen, США) ДНК фрагментов получали путем полимеразиой цепной гакции (ПЦР) со следующими праймерами: 5'праймер общий для обоих продуктов -AAAGATCTCATGGGGGATGTTAAAC3': З'праймер для N934

TTGGATCCTATTGCTCGGCTGGG3'; З'праймер для N875

TTGGATCCTACTCAGCTGCTCTGG3'. 5' и З'-праймеры содержали последовательности гстрикции Bgl 11 и BamHl эндонуклеазами соответственно (подчеркнуты). З'-праймеры >держали стоп-кодон ПЦР-продукты лигировали в вектор рЕТ 30-(b)+ (Novagen, США) по gl II it BamHI сайтам в З'-положении от участка связывания рибосомы.

Индуцированную IPTG (3 мМ) экспрессию конструкций N-концевых фрагментов ЛЦМ-210 проводили в Е. Coli штамм BL21(DE3)pLyz: согласно протоколу для рЕТ системы •Jovagen. США). Экспрессированные полипептиды содержали полигистидинопую ■¡следовательность в С-концевой части, для очистки на Ni-NTA мсгалл-хелатнон колонке Juiagen, Germany) по протоколу производителя.

Конструирование N875 фрагмента КЛЦМ-210 для экспрессии в эукарнотическои жуловнруснон системе. Для получения ДНК фрагмента в ходе полимеразиой цепной :акшш использовали Pfu ДНК-полимеразу (Clontech, США) и пранмеры следующего ютава:

праймер - 5'-ААAGATCTCATGGGGGATGTTAААС-3';

-праймер - 5'-TTGGATCCTACTTATCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTCAGCTGCTCTGG В ютав 5'- и З'-праймеров входили участки рестрикции эндонуклеазами Bgl II и BamH I ¡ответственно. 3'-праймер содержал стоп-кодон и нуклеотиды, кодирующие юледовательность аминокислот, узнаваемую антителами aHTii-FLAG-M2 (Kodak, США). ЦР-продукт клонировали в вектор pVL1392 (PharMingen, США) по Bgl II и BamH I сайтам.

Гомологичную рекомбинацию BaculoGold линеаризованной бакуловирусной ДНК harMingen, США) с N875-pVL1392 вектором, а также все последующие процедуры, включая фщкрование SF9 клеток, амплификацию бакуловируса н экспрессию N875 фрагмента.

проводили согласно протоколу производителя. Очистку фрагмента производили на аффинной колонке с иммобилизованными на носителе aHTH-FLAG-M2 антителами. Элюциго с аффинной колонки осуществляли коммерческим FLAG-пептидом.

Миозин-связывающие рекомбинантные фрагменты кальдесмона, N152 и HI (Vorotnifcov et al., ¡997), были любезно предоставлены доктором Воротниковым А.В (лаборатория клеточной подвижности, ИЭК, РК НПК, МЗ РФ). .

Полимеразная цепная реакция (ГГЦР). ПЦР проводили в приборах фирм Perkin Elmer PCR System 9600 (США) и Hybaid Omnigene (Англия), используя рекомбинантную AmpliTaq полимеразу (Perkin Elmer, США) и Pfu ДНК полимеразу (Clontech, США) Праймеры рассчитывали с помощью программ PC-Gene и DNAStar и синтезировали коммерчески,

РЕЗУЛЬТАТЫ IT ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Действие миознн-связывающих б ел кто в KRP и кальдесмона на полимеризацию миошна гладких мышц.

Характерной особенностью гладкомышечного/немышечного миозина (I типа являете! то, что в присутствии физиологических концентраций АТФ он не формирует филаментов i существует в мономерной форме в, так называемой, свернутой конформации. Стабили зацп; филаментов миозина в присутствии АТФ может осуществляться либо за сне фосфоршшрования миозина КЛЦМ, либо путем его связывания с KRP, Механизм индукцш филаментообразования состоит в переводе молекул миозина в развернутую конформацию и i их последующей самосборке в филаменты Недавно было сообщено, что другой миозин связывающий белок, кальдесмон, является более эффективным индукторо« филаментообразования, чем KRP, однако молекулярный механизм его действия описан не бы. (Katayama etail., ¡995), Мы изучили зтог вопрос, проведя сравнение влияния KRP и

Рис. 2 Влияние KRP и кшьдесмои на полимеризацию миошш индуцированную ионами Mg2~.

Гяадкомышечный миозин (ГМК (1мкМ) инкубировали в присупктт, 14 мкМ КНР. 14 мкМ KíUbóec.wii или в отсутствие обоих белков щ различных концентрациях нот и 0,5 мМ А ТФ.

Мд2+, мМ

кальдесмона на полимеризацию гладкомышечного миозина с помощью методов дифференциального ультрацентрифугироаания и электронной микроскопии.

Хорошо известно, что в присутствии АТФ растворимый мономерный миозин может быть переведен в полимерное состояние при повышении концентрации ионов MgJ+. По-видимому, этот эффект связан со способностью ионов Mg2' стабилизировать развернутую конформацию молекулы миозина, а также приводить к латеральным взаимодействиям миозиновых филаментов, благодаря формированию солевых мостиков между отрицательно заряженными остатками стержневой части молекул миозина. Пороговая концентрация ионов Mg2+, необходимая для образования филаментов миозина, в наших экспериментальных условиях составляла 7-8 мМ (Рис. 2). При 9-10 мМ MgCl; весь миозин переходил в полимерную форму в присутствии 0,5 мМ АТФ. KRP и кальдесмон в этих условиях оказывают противоположное действие на равновесие между полимерной и мономерной формами миозина. Уже при подпороговых концентрациях ионов Mg2+ KRP вызывал переход миозина в полимерную форму. Катьдесмон, напротив, ингибировал филаментообразование, ослабляя действие ионов Mg2+. Мы установили, что кальдесмон не вызывает полимеризации дефосфорилированного миозина в присутствии АТФ и дестабилизирует миозиновые филаменты в широком диапазоне экспериментальных условий.

Рис. 3 Сравнительное действие кальдесмона и N152 на полимеризацию миозина.

Полимеризацию гладкомышечного миозина (1,5 мкМ) в АТФ (0,5 мМ) инициировали добавлением MgCl2 (9 мМ) в присутствии 15 мкМ кальдесмона (+КаД'), 15 мкМ N152 (+N152) или в отсутствие обоих (миозин). Белковые смеси подвергали центрифугирован ию, осадки (О) и надосадочные фракции (Н) анализировали ДСН-электрофорезом. На графике представлены

усредненные результаты трех независимых экспериментов.

иозин-КаД • 100

И О 11 О 11 О

«до*.''

Миозин +КаД + N152

Молекула кальдесмона содержит два участка связывания с миозином, расположенные в И- и С-концевых частях молекулы и разделенные друг от друга протяженным а-спиральным доменом. Для того, чтобы выяснить какой из этих участков вызывает дестабилизацию

полимерного миозина, мы исследовали функциональные свойства экспресспрованных рекомбинантных полипептидов, N152 и Ш, содержащих соотвегственно N-концевой и С-концевой миозин-связывающие участки кальдесмона. Оказалось, что N152, так же как и сам кальдесмон, дестабилизирует полимерный миозин (Рис. 3), тогда как HI фрагмент не проявляет подобного действия (данные не показаны)

Для качественной оценки состояния миозина в присутствии KRP и кальдесмона мы применили метод электронной микроскопии

Как и ожидалось, при подпороговой концентрации ионов Mg2* (4мМ) в присутствии кальдесмона и N152 миозин находился в мономерной форме (Рис.4А, Д, Е), а в присутствии KRP наблюдалось образование филаментов небольшого размера, длина которых составляла 420 +/-70 нм (Рис. 4В).

При концентрации ионов Mg2 выше пороговой весь полимерный миозин находился в виде надфиламентарных агрегатов, представляющих собой скопления филаментов, взаимодействующих боковыми поверхностями (Рис. 4Б) Миозиновые филаменты в составе агрегатов проявляли характерные 14,5 нм повторы (Рис.4Б, вставка). Принято считать, что эти повторы являются следствием осевого смещения мономеров и создаются головками миозина, прижатыми к филаменту.

Вид миозиновых филаментов, сформированных при высокой концентрации ионов MgJ~ в присутствии KRP, существенно отличался or таковых в контроле. При этом обнаруживались длинные (1640 +/- 370 нм длины) индивидуальные филаменты, демонстрирующие аксиальные 14,5 нм повторы, в то время как агрегаты филаментов в этих препаратах отсутствовали.

В этих же экспериментальных условиях кальдесмон приводил к появлению большого числа коротких гомогенных филаментов (размером 390 +\- 50 нм). Поскольку кальдесмон не стабилизирует полимерной структуры миозина, появление филаментов можно отнести за счет перераспределения полимерного миозина из агрегатов. В отличие от кальдесмона, действие N152 не приводит к накоплению отдельных филаментов (Рис. 4Е). При этом при электронной микроскопии обнаруживаются агрегаты, которых, однако, становится значительно меньше. Таким образом, наряду с общей способностью дестабилизировать полимерный миозин, кальдесмон и его N-концевой миозин-связывающий фрагмент оказывают различное влияние на структуру филаментов.

При совместном добавлении KRP н кальдесмон сохраняют характер своего действия на миозин. Филаменты миозина, собранные в присутствии KRP при концентрации MgCl2 7 мМ, имели среднюю длину 1120+/- 440 нм (Рис. 5А). Кальдесмон приводил к уменьшению общего количества филаментарного миозина, сформированного под действием KRP, и существенно уменьшал средний размер филаментов (Рис, 5Б). При совместном добавлении KRP и

+ 4 мМ МеС1 + 9 мМ МеС1

Рис. 4 Электронная микроскопия миозина в присутствии КЙР, кальдесмона и N152.

Миозин гладких мышц (1,5 мкМ) инкубировали в присутствии 15 мкМ КЯР (В, Г); 15 мкМ кальдесмона (Д,Е1; 15 мкМ N152 (Ж,3) или в их отсутствие (А, Б) при концентрациях ионов Мд2* 4 мМ (А, В, Д, Ж, И) или 9 мМ (Б, Г, В, 3). Филамент, сформированный под действием КИР демонстрирует боковую полярность (И). Единица масштаба для А-3 равна 500 им, для И - равна 150 нм.

Рис. 5 Электронная микроскопия филамеитов миозина, образованных при совместном действии KRP и кальдесмона или N152.

Миозин гладких мышц (1,5 мкМ) инкубировали е буфере, содержащем 0,5 мМ АТФ и 7 мМ MgCh в присутствии 15 мкМ KRP (А ,Б, В), 15 мкМ кальдесмона (Б) или 15 мкМ N152 (В). Кальдесмон приводил к: уменьшению размеров филамеитов, тогда как N152 не оказывал существенного влияния на их длину. Маркер соответствует 500 нм.

кальдесмона филаменты были более гомогенны и имели размеры 500 +/- 80 нм. N152 снижал количество полимерного миозина, но при этом практически не влиял на размер филамеитов (1030+/-180 нм; Рис. 5В).

Далее было установлено, что KRP и кальдесмон независимо связываются с миозином. Следовательно, их противоположное действие на филаментообразование есть результат качественно разных модификаций молекулы миозина, а не конкурентных отношений между этими белками при связывании с миозином.

На основании полученных результатов и данных литературы деполимеризующий эффект кальдесмона может быть объяснен следующим образом. Известно, что кальдесмон взаимодействует с миозином в области S2 субфрагмента (Ikebe and Reardon., 1988). Этот фрагмент включает в себя более 30% аминокислотных остатков стержневой части молекулы миозина (Marston and Redwood, 1991), которая определяет филаментообразование. Согласно предлагаемой модели (Рис. 6), связывание N-концевого домена кальдесмона с этой областью приводит к ее исключению из участия в формировании филамеитов и, следовательно, к понижению устойчивости филамеитов в присутствии АТФ. Таким образом, действуя одаонаправленно с АТФ, кальдесмон, а также его миозин-связывакяций N-концевой фрагмент N152, ослабляют действие таких полимеризующих агентов, как KRP и Mg2+, не оказывая

Рис. 6 Схема участия КНР и кальдесмопа в сборке филамсптов гладкомьииечного миозина

Влияние КНР и кшьдесмона на полимеризацию миозина

складывается из нескольких составляющих. Направления

действии кшьдесмона (КаД) обозначены стрелками серого цвета, направления действии КИР стрелками черного цвета. КЯР стабилизирует филаменты миозина и препятствует образованию агрегатов. Кальдесмоп

дестабилизирует филаменты

миозина и, в то же время, способствует их пуклеацни, связывая вместе несколько мономеров миозина. Подробный объяснения а тексте.

шияния на равновесие между развернутой и свернутой конформациямн миозина. N152 более |ффективно диссоциирует филаменты, чем полноразмерный белок. Это, вероятно, связано е ем, что стехиометрия связывания Б-2 с N152 в 3-4 раза выше, чем с каль'десмоном (Уогоцпкоу Л а1. 1997). В силу этого, N152 вызывает большую дестабилизацию мономеров в составе ¡жламента и в большей степени препятствует их включению в филамент.

Благодаря наличию двух миозин-связывающих участков, кальдесмои способствует процессу нуклеацин, то есть образованию олигомерньгх затравок новых филаментов. Однако, « сформированных затравок не могут быть собраны филаменты, поскольку миозин в трисутствии АТФ находится в свернутой конформации. Филаментообразование в этом случае 5удет возможно только в присутствии стабилизирующих агентов, таких как КЯР или ионы При прочих равных условиях размер филаментов будет находиться в обратной 1ависимости от количества сформированных затравок. Этим, по нашему мнению, объясняется формирование коротких гомогенных филаментов в присутствии кальдесмона, но не в фисутстшш N152, который не содержит второго мнозин-связывающего участка

Мы обнаружили неизвестную ранее способность ККР препятствовать образованию лакроагрегатов миозиновых филамеитов. Это свойство КЯР может иметь большое значение т /¡уо в гладких мышцах, где высокая концентрация миозина (около 90 мкМ) благоприятствует :го агрегации. С точки зрения механики мышечного сокращения, агрегация толстых филаментов является нежелательным эффектом, поскольку она приводит к маскировке части

моторных доменов миозина и снижению силовых характеристик мышцы. Таким образом, KRF выполняет роль своеобразного буфера, поддерживающего существование упорядоченные индивидуальных миозиновых филаментов, но не мономеров и не миозиновых агрегатов Электронная микроскопия показала, что филаменты, реконструированные in vitro i присутствии KRP и АТФ, приближаются по строению к толстым филаментам, выделенным и: различных гладких мышц

Из наших данных также следует, что KRP не является обязательным партнерол кальдесмона. Поэтому кальдесмон может проявлять свое действие и в немышечных клетках где содержание KRP низко (Herring and Smith, 1996), а филаментообразование миозинг иницируется его фосфорилированием (Ikebe, 1989).

Итак, проведенные исследования показывают, что совместное действие KRP i кальдесмона позволяет регулировать количество и длину филаментов, состояние и> агрегпрованности, а также обеспечивает регулируемое динамическое равновесие между филаментарным и растворимым миозином

Функциональные свойства КЛЦМ-210 Выделение КЛЦМ-210 ш гладких мышц аорты

Для того, чтобы изучить функциональные свойства КЛЦМ-210, мы получили антитела i уникальному фрагменту КЦЛМ-210 и разработали метод ее выделения из ткани гладких мьпш аорты. Разработанный метод включает стадии экстракции в условиях высокой ионной силы i высокой концентрации ионов Mg*1 , ультрацентрифугирования, ионобменной хроматографии i аффинной хроматографии. Электрофорез и иммуноблотгинг подтвердили, что полученна; таким образом КЛЦМ-210 была свободна от примесей КЦЛМ-108 и других белков. Каталитическая активность КЛЦМ-210

Мы обнаружили, что КЛЦМ-210 активируется Са2*-кальмодулином и фосфоршшруе-миозин и его фрагмент, тяжелый меромиозин (ТММ). Миозин, фосфорилированный КЛЦМ 210, способен поддерживать движение актиновых филаментов in vitro со скоростью 0.6 -1.1 мкм/с, т.е с такой же, какую развивает миозин, фосфорилированный КЛЦМ-108 Фосфопептидный анализ показал, что КЛЦМ-210 фосфорилирует тот же пептид в npenapaTi РЛЦ и ТММ, что и КЛЦМ-108 из мускульного желудка индейки.

Для проведения дальнейших экспериментов препарат КЛЦМ-210 был элюирован i аффинного матрикса глициновым буфером рН 2.2, содержащем IM NaCl, и немедленн< нейтрализован. После диализа КЛЦМ-210 в нейтральный буфер была измерена активност: фермента в растворе с использованием ТММ и РЛЦ в качестве субстратов. Данные по расчет удельной активности различных препаратов КЛЦМ-210 суммированы в виде таблицы (Таблиц 1).

№ эксперимент а Форма препарата КЛЦМ-210 Субстрат

Иммунопреципитат ТММ РЛЦ

1 3.5+0,4

2 1.4 ±0.2

3 1.3+0,1

4 1.1+0,2

Растворимая

5 0.7 ±0,2

6 0.8+0,2

Таблица 1. Удельная активность КЛЦМ-210

Удельная активность растворимой п адсорбированной на аффинном матриксе (иммуиопрсциннтат) Ю1ЦМ-2Н), выраженная в мкм (мнн*мг фермента), была измерена согласно (НаНеп е1 а1, 19Я2). Концентрацию КЛЦМ-210 определят с помощью денентометрни полиакрнламидных гелен, окрашенных Ку.масси 1{-250, или

Активность КЦЛМ-210 оказалась сравнимой с удельной активностью КЦЛМ-108, пмеренной в параллельных экспериментах. Это согласуется с данными по первичной :труктуре КЛЦМ-210 и КЛЦМ-Ю8, так как Са2+-кальмодулин-связывающий регулягорный Юмен и каталитический домен являются общими для обеих изоформ киназы. Удельная ктивность иммобилизованной формы КЛЦМ-210, как правило, была несколько выше, чем >астворимой формы. Меньшую активность растворимой формы КЛЦМ-210 можно объяснить гастичной инактивацией фермента под действием буфера с низким рН, который использовался фи снятии КЛЦМ-210 с аффинной колонки.

Связывание КЛЦМ-210 с актином и миозином

Взаимодействие КЛЦМ-210 с миозином и актином исследовали методом шфференциального центрифугирования. Полимерный миозин и Ф-актин при 'льтрацентрифугировании выпадают в осадок. В отсутствие полимерных белков КЛЦМ-210 шходится преимущественно в растворимой форме и обнаруживается в надосадочной кидкостн (Рис 7). Появление КЛЦМ-210 в осадке и уменьшение ее содержания в надосадочной фракции, говорит о связывании КЦЛМ-210 с актином и миозином (Рис 7). Мы обнаружили, гго в присутствии избытка КЯР меньшее количество КЛЦМ-210 переходит в миозиновый

осадок (Рис. 7, Б), соответственно, больше киназы остается в надосадочной жидкости растворимой, несвязанной с миозином, форме. Эхо указывает на участие КНР-домена киназы i связывании с миозином.

А

Н

О

н

о

н

о

н

о

н

о

Без актина

+2 мкМ актина

+4мкМ актина

+ 0.6 мкМ ГММ + 0.6 мкМ ГММ +18 мкМ KRP

Рис. 7 Связывание КЛЦМ-210 с актином и миозином

КЛЦМ-210 инкубировали с актином (А), а также с миозином в присутствии или в отсутствие KRP (Б). Образцы подвергали ультрацентрифугированию для осаждения актина и миозина и анализировали осадки (О) и надосадочные фракции (Н) электрофорезом и последующим иммуноблоттингом.

Мы показали, что КЛЦМ-210, как и КЛЦМ-108, взаимодействуете актином. Ы-концево! актин-связывающий участок КЛЦМ-108 располагается в пределах аминокислотных остатков 2 42 КЛЦМ-108 кролика (Gallagher and Stuli, 1997). Показано, что важную роль в связывании i актином играют расположенные а этой области три высоко консервативны! последовательности DFRA/SN/VL, отделенные друг от друга интервалами из 23 аминокисло-(Smith et al., 1999). Анализ области уникального домена КЛЦМ-210, непосредственш прилегающей к N-концевому участку КЛЦМ-108, позволил обнаружить в ней сходные повторы 880-DVRGVL-885 и 908-DFRDIL-913, также разделенные вставками в 23 аминокислоты Принимая во внимание высокую консервативность ключевых остатков в обнаружении] повторах, и расстояний между повторами, логично предположить, что все 5 повторов входят i состав одного протяженного актин-связывающего участка. В таком случае КЛЦМ-108 содержи-лишь часть участка связывания с актином, который полностью присутствует в КЛЦМ-210.

Таким образом, мы впервые получили препарат КЛЦМ-210 и показали, что эта изоформ; КЛЦМ обладает функциональными свойствами, которые известны для КЛЦМ-108, а именно фосфотрансферазной активностью по отношению к РЛЦ в составе тяжелого меромиозина i способностью связываться с актином и миозином. Для того чтобы понять, существуют л1 функциональные различия между изоформами КЛЦМ, мы исследовали свойства уникальной домена КЛЦМ-210.

Изучение функциональных свойств уникальной N-концевой области КЛЦМ-210

Для изучения свойств уникальной N-концевой области КЛЦМ-210 мы экспрессировали тва фрагмента. N934 и N875, отличающихся друг от друга наличием 59 аминокислотных эстатков в области, непосредственно примыкающей к N-концевой части КЛЦМ-108. Оба фрагмента были экспрессированы в бактериальной системе в клетках E.coli; а меньший, N875, фрагмент был дополнительно экспрессирован в эукариотической бакуловирусной системе в эР9 клетках в суспензионной культуре.

Взаимодействие уникального домена КЦЛМ-210 с актином н миозином

С помощью метода дифференциального ультрацентрифугирования мы изучили ;вязывание экспрессированных фрагментов КЛЦМ-210 с актином и миозшшм. Было эбнаружено, что при повышении концентрации актина происходит дозозависнмое увеличение удержания N934 в осадке (Рис. 8, темные колонки). С другой стороны, в условиях наших 1КСнериментов не наблюдается существенного связывания уникальных доменов КЛЦМ-210 с «юзином. N934 н N875. вне зависимости от того, в какой системе они были экспрессированы, ¡роявляли сходные качественные характеристики связывания с актином и миозином. Таким юразом было установлено, что уникальный домен КЛЦМ-210 обладает собственными частками связывания с актином. Следовательно, КЛЦМ-210 должна более эффективно :вязываться с актиновыми филаментами, чем низкомолекулярная нзоформа кнназы.

Рис. 8 Сравншпыъиое связывание N875 и фосфо-Н875 с актином.

Связывание N875 фрагмента (1,2 мкМ) КЛЦМ-210 с актином исследовали методом Оифференциалыюго

ультрацентрнфугирокатм. NS75,

фосфори.шрованныи нротеинкшшзон-А, хуже связывается с актином. чем контрольный. Содержание белков в надосадочпых фракциях ч осадках анализировали электрофорезом. Гель окрашивали красителем Кумасси R-250, сканированt и обсчитываю в программе NIH-Imagc. Представлены усредненные результаты трех независимых экспериментов.

Связывание уникальны* доменов КЛЦМ-210 с актином приводит к образованию 1учков Ф-актиня

Мы исследовали структуру филаментов актина в присутствии уникального домена СЛЦМ-210 методом электронной микроскопии. Оказалось, что N934 проявляет агрегацпонное (ействие в отношении Ф-актина, приводя к образованию толстых пучков актиновых

S 8 80

9 m

0 ю ou "

Ш О

1 5 40-

0

0

1 2 3

[N934], мкМ

Рис. 9 Соосаждсние Ф-актипа и N954 при низкоскоростном центрифугировании

Ф-актин (10 мкА/) инкубировали в присутствии различных концентраций N934. Образцы центрифугировали при 12 ООО х g в настольной микроцентрифуге. Содержание актина в осадке и надосадочной фракциях анализировали ДСН-злектрофорезо.и. N934 вызывает переход актина в осадок. Представлены данные трех независимых экспериментов. На вставке: электронная микроскопия Ф-актина в отсутствие N934 (А), и в его присутствии (Б). Маркер соответствует I микрометру.

филаментов (вставка на Рис. 9). Дм количественной оценки способности N934 формировать пучки Ф-актина был применен метод дифференциального низкоскоростного центрифугирования. Отдельные, не взаимодействующие.друг с другом нити филаментарного актина не переходят в осадок при центрифугировании при 12 ООО х g, тогда как нити, связанные друг с другом посредством сшивающего белка, образуют пучки, седиментирующие в указанных условиях. В присутствии уникальных доменов КЛЦМ-210 происходит образование пучков Ф-актина и, как следствие, увеличение количество седиментирующего актина (Рис. 9).

Способность уникальных доменов КЛЦМ формировать пучки Ф-актина предполагав наличие нескольких актин-связывающих участков, обеспечивающих связывание более чем с одним филаментом актина. Следует ожидать, что полноразмерная КЛЦМ-210 будет еще более эффективно, чем ее фрагменты, осуществлять связывание и образование пучков Ф-актина зе счет наличия дополнительных участков взаимодействия, общих с КЛЦМ-108.

Мы предполагаем, что способность КЛЦМ-210 образовывать пучки Ф-актина обнаруженная нами in vitro, может иметь важное значение в формировании актомиозиновоп

цитоскелета немышечных тканей. Хорошо известно, что существенная часть миозина в иемышечных клетках находится в мономерном состоянии. КЛЦМ-210, связываясь с актином, и собирая его в пучки, может одновременно фосфорилировать находящийся в растворимом состоянии миозин, тем самым вызывая сборку мпозиновых фпламеитов рядом с актиновыми фнламентами и инициируя двигательную активность.

Связывание N875 фрагмента с кератнном

Наличие дополнительного ^концевого уникального фрагмента у КЛЦМ-210 может также обусловливать функциональные свойства, которые отсутствуют у низкомолекулярной изоформы В последние годы появились данные о важной роли КЛЦМ в поддержании упорядоченной структуры цитоскелета. Мы предположили, что функции уникального домена КЛЦМ-210 могут заключаться в образовании связей не только с актином, но и с другими компонентами цитоскелета Обнаружено, что высокий уровень экспрессии КЛЦМ-210 наблюдается в клетках этпелнальных тканей (В1гикоу е( а!., 1998). В этих тканях наиболее характерным компонентом цитоскелета являются цитокератины.

Методом дифференциального центрифугирования было установлено, что уникальный цоме.н КЦЛМ-210 связывается с кератином (Рис. 10, темные колонки). В качестве контроля ;пецифичности связывания уникального домена КЦЛМ-210 и кератина была использована

Рис. К) Сравнительное связывание N875 а фосфо-№875 с кератином Связывание N875 фрагмента (1,2 мкМ) с кератином (14 мкМ и 28 мкМ) изучали методом дифференциального

ультрацентрифугнрования При повышении концентрации кератина происходит дозозависимое увеличение содержания N875 в осадках кератина (черные колонки) Фосфорилироваиный протеинкиназой-А N875 (светлые колонки) слабее связывается с кератином в тех же условиях. График построен на основании данных трех независимых экспериментов..

0 14 28

[Кератин], мкМ

КЛЦМ-108. В условиях, когда уникальный домен КЛЦМ-210 связывается с кератином, КЛЦМ-108 не взаимодействует с ним.

Таким образом, полученные данные позволяют предполагать, что КЛЦМ-210 может обеспечивать связь между актомиознновым цитоскелетом и промежуточными филаме1гтами. Хорошо известно, что различные компоненты цитоскелета не являются полностью эбособленными и независимыми. Между ними существует тесная взаимосвязь,

осуществляемая различными сшивающими белками По-видимому, КЛЦМ-210 является одним из таких белков, благодаря которым происходит интеграция компонентов, цитоскелега единой целое.

В настоящий момент мы не имеем прямых доказательств, свидетельствующих с физиологической значимости взаимодействия КЛЦМ-210 и цитокератинов. Однако, с литературе имеются сведения, косвенно подтверждающие возможность взаимодействия КЛЦМ-210 с внутриклеточными структурами, отличными от актомиозинового цитоскелста Так в неактивированных клетках культивируемых эндотелиоцитов характер окрашивания КЛЦМ-210 и актина не совпадает (Garcia et al., 1999). Однако, в процессе активации этих клеток тромбином происходит перераспределение окрашивания КЛЦМ-210 и актина, после чего наблюдается их частичное совпадение. Маловероятно, что в неактивированных эндотелиоцитах КЛЦМ-210 находится в растворенном состоянии, вне связей с компонентами цитоскелега. Как и клетки других барьерных эпителиев, эндотелиоциты имеют хорошо развитую сеть промежуточных филаментов. Возможно, высокомолекулярная тоформа КЛЦМ способна избирательно взаимодействовать либо с акто-миозиновым аппаратом, либо с промежуточными филаментами. Эта область представляется достойной внимания г дальнейших исследований.

Фосфоршшрованиг уникальны* доменов КЛЦМ-210 пАМФ-мписимш протеннкинаюй

Цптоскелет немышечных клеток, как правило, находится в состоянии непрерывны? динамических перестроек. Если наши предположения верны, и КЛЦМ-210 действнгелык принимает участие в интеграции компонентов цитоскелета, то следовало бы ожидать, что эт; способность КЛЦМ-210 будет регулироваться. Одним из наиболее распространенных способо! регуляции такого рода активностей является фосфорилирование. Анализ первичной структурь уникальной последовательности КЛЦМ-210 выявил множество потенциальных участко! фосфорилирования серин-треониновыми и тнрозиновыми протеинкиназами.

Действительно, мы обнаружили, что под действием цАМФ-зависимой протеинкнназь (ПК-А) происходит активное включение радиоактивного фосфата в уникальный домен КЛЦМ 210. ПК-А, добавленная в инкубационную смесь, приводила к включению от 1,8 до 2,1 мол1 неорганического фосфата на моль N875. Смесь пептидов, полученных при гидролизе фосфо N875 трипсином, анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографш (ВЭЖХ) Были выделены 2 пептида, содержащих 80% радиоактивности всего образца Микросиквенс этих пептидов и исследование их методом масс-спектрометрии показали, чт< они соответствуют 126-133 и 139-158 аминокислотным остаткам КЛЦМ-210. В каждом и обнаруженных пептидов содержится по одному участку фосфорилирования протеинкшшой А

зто серин-127 и серин-140.

Свщмкание уникального домена КЛЦМ-210 е актином и кератином регулируется ^осфорилпрованием

Фосфорилирование уникальных доменов КЛЦМ-210 протеинкиназон-А приводило к зслаблению связывания как с актином (Рис. 8), так и с кератином (Рис. 10). При этом ;пособность фосфорилированных фрагментов формировать пучки Ф-актина также ;ушественно ослаблялось.

Таким образом, мы установили, что аминокислотные остатки, фосфорилируемые ПК-А, ! составе уникального домена КЛЦМ-210 находятся в непосредственной близости друг от фуга. Примечательно, что фосфорилирование по этим участкам приводит к ослаблению :вязывания фрагментов КЛЦМ как с актином, так и с кератином. Возможно, это является сражением тесного соседства участков связывания актина и кератина в молекуле КЛЦМ-210 1е исключено, также, что фосфорилирование по этим участкам приводит к глобальным шутримолекулярным перестройкам в структуре уникального домена КЛЦМ-210 В таком :лучае изменения в связывании актнновых и промежуточных филаментов могут наблюдаться гаже в том случае, когда участки их связывания на КЛЦМ-210 не находятся в ^посредственной близости от фосфорилируемых остатков.

Известно, что активация ПК-А в клетках REF-52, которые преимущественно кспрессируют КЛЦМ-210, приводит к ингибировашпо ее активности и разборке волокон «пряжения (Lamb et al., 1988), На основании этих данных высказано предположение, что (естабилизация волокон напряжения обусловлена разборкой толстых филаментов в результате (ефосфорплированпя миозина и его мономеризашш лод действием внутриклеточной АТФ.

Результаты наших исследовании позволяют предположить, что дестабилизирующий ффект ПК-А на актомиозиновый цитоскелет может быть более комплексным, чем [редставлялось ранее. Помимо ингибирования каталитической активности КЛЦМ-210, ПК-А тожет фосфорилировать ее уникальный домен и существенно понижать способность КЛЦМ-:10 формировать пучки Ф-актина. Это будет приводить к большей доступности Ф-актина для (ействия северирующнх белков.

Наиболее близкими структурными гомологами продуктов генетического локуса КЛЦМ [вляются гигантские протеннкиназы: твитчин, титнн и прожектин. Исследования последних [ет, включая данную работу, указывают также на функциональное сходство этих белков. Так »сновная часть молекулы титана состоит из KRP-подобных модулей, и этот белок, как и KRP, ювлечен в стабилизацию миозиновых филаментов в мышцах. Подобно КЛЦМ, гигантские фотеинкнназы могут аутофосфорилироваться и участвовать в регуляции сократительного >твета мышечных клеток. Наконец, полученные нами данные позволяют предположить, что

КЛЦМ-210 благодаря протяженно» структуре и множественным участкам взаимодействия цитоскелетом может принимать непосредственное участие в интеграции сократительных опорных элементов цитоскелега немышечных клеток. В этом отношении она бли.» напомннает гигантские протеинкиназы, одной из функций которых считается интеграш компонентов сократительного аппарата саркомеров поперечно-полосатых мышц.

В целом, накопленные знания свидетельствуют о первостепенной роли генетическтн локуса КЛЦМ в регуляции актомиозина посредством своих множественных продуктов клетках и тканях эукариотических организмов.

ВЫВОДЫ

1. Миозин-связывающие белки KRP и кальдесмон разнонаправленно влияют i филаментообразование гладкомышечного миозина в присутствии АТФ. KRP стимулиру! сборку филаментов с боковой полярностью и препятствует их агрегации. Кальдесмс способствует нуклеации филаментов, но тормозит их рост. Действуя совместно, KRP кальдесмон могут регулировать количество и размер полимеров миозина в условия приближенных к физиологическим.

2. Получены специфические антитела к уникальному N-концевому домену КЛЦМ-210 разработан метод аффинной очистки этого белка Впервые показано, что КЛЦМ-210 имс сравнимую с КЛЦМ-108 каталитическую активность ч способна взаимодействовать с актином миозином.

3. Впервые продемонстрировано связывание экспрессированной N-концевой части КЛЦМ-210 актином и кератином in vitro, а также возможность регуляции этих взаимодействий пуп фосфорилирования Сер-127 и Сер-140 уникального домена цАМФ-зависимоп протеннкиназоп

Список публикаций по теме диссертации

dryashov DS, Chibalina MV., Birukov K.G., Lukas 'ГJ., Sellers JR., Van Eldik L.J., Walterson VI, Shirinsky V.P. (1999) Unique sequence of a high molecular weight myosin light chain kinase is olved in interaction with actin cytoskeleton EEBS Lett., 463, 67-71.

балина M.B., Кудряшов Д.С., Шехонин Б.В., Ширинский В.П. (2000) Функциональные )йства и внутриклеточная локализация высокомолекулярной изоформы киназы легких цепей озииа. Цитология, 42: 248-255.

луева Т.Л., Теплова М.В., Бушуев В Н., Кудряшов Д.С., Воротников А.В , Ширинский В.П. '99) Стабильность структуры белка KRP (Kinase Related Protein) Молекулярная биология, 33, 7-236.

ротников A.B., Крымский М.А, Чибалина М.В., Кудряшов Д.С., Ширинский В.П. (2000) !лпчия в форбол-зависимом фосфорилнровашш регуляторных белков и сокращении фазных и шческих гладкггх мышц. Цитология, 42: 378-391

ibalinaM.V., KudryashovD S., Shekhonin B.V., Shirinsky V.P. (1998) Isolation, characterization and -ue distribution of myosin light chain kinase isoforms. Abstracts of the International Symposium '(¡logical motility: modem methods for studying", Pushchino, 30.

dryashov D.S., Vorotnikov A.V., Flicker P.F., Silver D.S., Sellers J.R., Watterson D M., Shirinsky (1998) Smooth muscle myosin polymerization supervised by a kinase-related protein (telokin) and desmon../. Mol. Cell. Cardiol. 30. A38

rotnikov A V, Kudriashov DS., Shirinsky VP. Differential effect of caldesmon and kinase-related itein on smooth muscle myosin filament formation. (1996) J. Muscle Res. Cell Motil. 17: 153.

dryashov D.S., Vorotnikov A.V., Flicker P.F., Silver D.S., Sellers J.R, Watterson D.M., Shirinsky (1997) Opposite action of Kinase-Related Protein and caldesmon on smooth muscle myosin einbly. Mol. Biol. Cell, 8: 39a.

rin.sky V.P., Bimkov K.G., Chibalina M.V., Kudryashov D.S., Stepanova O.V.. Vorotnikov A.V, lers J R., Collinge M, Lukas T.J., Van Eldik L.J., Watterson D.M. (1997) MLCK.-210 - a novel iduct ofMLCK/KRP genetic locus. 2nd HHMI meeting of the International Research Scholars from FSV and Eastern Europe, Warsaw, 38.

шуева Т.Л, Бушуев ВН., Кудряшов ДС\, Ширинский В.П. (1996) Изучение структуры белка Р (Kinase Related Protein) методами флуоресценции и ЯМР. Таксы всероссийской Iфереиции "Прикладные аспекты исследовании скелетных, сердечных и гладких мышц", шино, 82-83.

11.Кудряшов Д.С., Воротников А.В., Степанова О.В., Бирюков К.Г., Ширинский В.П. (1996) Беж KRP (телокин) ослабляет связывание актина и дефосфорилированного тяжелого меромиозш из гладких мышц. Тезисы всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследоват скелетных, сердечных и гладких мышц", Пущино, 85-86.

12.Birukov K.G., Chibalina M.V., Kudryashov D.S., Stepanova O.V., Vorotnikov A.V., Sellers JJ Collinge M., Lukas T.J., Van Eldik L.J., Watterson D.M., Shirinsky V.P. (1997) MLCK-210 - a nov product of MLCK/KRP genetic locus. 2nd HHM1 meeting of ¡he International Research Scholars fro the FSUand Eastern Europe, Warsaw, 38.

13.Vorotnikov A.V., Krymsky M.A., Kudryashov D.S., Nikashin A.V., Chibalina M.V., Shirinsky V.: (1998) Phorbol ester stimulated protein phosphorylation in intact smooth muscle. Abstracts of t) International Symposium "Biological motility: modem methods for studying", Pushchino, 176-177.

M.Krymsky M.A. Vorotnikov A.V., Kudryashov D.S, Chibalina M.V., Shirinsky V.P. (1998) Order< phosphorylation of KRP (telokin) and myosin light chain kinase in intact smooth muscle. Abstracts of ti International Symposium "Biological motility: modern methods for studying", Pushchino, 75.

15.Krymsky M.A., Kudryashov D.S., Chibalina M.V., Lukas T.J., Watterson D.M., Shirinsky V.I Vorotnikov A.V. (1999) Common sited phosphorylation of KRP (telokin) and myosin light chain kina in intact smooth muscle cells../. Muscle Res. CellMotil. 20; 96.

16.Kudryashov D.S., Chibalina M.V., Birukov K G., Lukas T.J., Sellers J.R., Van Eldik L.J., Wattersi DM, Shirinsky V.P. High molecular weight myosin light chain kinase unique sequence is involved actin-binding and actin cytoskeleton stabilization. Abstract book of the XXlrIH European Muse Conference.

17.Shirinsky VP., Vorotnikov A.V., Kudryashov D.S., Stepanova O.V., Dudnakova T.V., Silver D.I Sellers J.R., Watterson D.M. (1998) Toward understanding the role of Kinase-Related Protein ai caldesmon in the smooth muscle. 3-rd HHMI meeting of the International Research Scholars from t, FSU and Eastern Europe, Hungary, Budapest, 68

IS.Shirinsky V.P., Kudryashov D.S., Chibalina M.V., Birukov K.G., Lukas T.J., Sellers JR., Van Eld L. J., Watterson D.M. (1999) Potential role of a high-molecular-weight kinase as a stabilizer of the acl cytoskeleton. 4-th HHMI meeting of the International Research Scholars from the FSU and Easte Europe,Russia, Moscow, 53.

Работа выполнена при финансовой поддержке ННМ1 (грант 75195-546901) и РФФИ (гранты 95-0 12260а и 96-04-106).

Отпечатано в отделе оперативной печати Геологического ф-та МГУ Тираж 160 экз. Заказ № 34

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональные свойства продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина"

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ 9

ГЛАВА 1. МИОЗИН М-ОГО ТИПА 11

1. Строение и особенности функционирования немышечного и 11 гладкомышечного миозина 11-ого типа.

1.1. Строение миозина 11-ого типа 11

1.1.1. Молекула миозина - гексамер 11

1.1.2. Регуляторные легкие цепи миозина 13

1.1.3. Существенные легкие цепи миозина 14

1.2. Конформационные состояния молекулы миозина 15

1.2.1. 10S и 6S конформации 15

1.2.2. Зависимость преобладания 10S или 6S конформаций 17 миозина от внешних условий

1.3. Полимеризация миозина 18

1.3.1. Структуры молекулы миозина, участвующие в 18 формировании межмолекулярных связей в филаменте

1.3.2. Динамика формирования филаментов 19

1.3.3. Строение миозиновых филаментов 20

1.3.4. Дефосфорилированный миозин поддерживает 23 филаментарную структуру in vivo

1.3.5. Возможные механизмы стабилизации филаментов 24 дефосфорилированного миозина

ГЛАВА 2. КАЛЬДЕСМОН - БЕЛОК РЕГУЛЯТОР СОКРАТИТЕЛЬНОГО АППАРАТА НЕМЫШЕЧНЫХ ТКАНЕЙ И ГЛАДКИХ МЫШЦ

2.1. Введение 25

2.2. Экспрессия кальдесмона в различных тканях 25

2.3. Внутриклеточная локализация изоформ кальдесмона 27

2.4. Физико-химические свойства кальдесмона 27

2.5. Доменная организация и функциональные свойства 28 молекулы кальдесмона

2.5.1. Общий план доменной организации молекулы кальдесмона 28

2.5.2. Функционально значимые участки С-концевого домена 31 кальдесмона

2.5.2.1. Участки взаимодействия с актином 31

2.5.2.2. Связывание с тропомиозином 32

2.5.2.3. Взаимодействие с комплексом Са2+-кальмодулин 32

2.5.3. Функционально значимые участки N-концевого домена 33 кальдесмона

2.5.3.1. Миозин-связывающие центры 33

2.6. Тропомиозин-зависимое ингибирование АТФ-азы актомиозина 34

2.7. Кальдесмон как структурный компонент сократительного 35 аппарата

ГЛАВА 3. ПРОДУКТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛОКУСА КЛЦМ

3.1. Введение

37

3.2. Строение генетического локуса киназы легких цепей миозина 37

3.2.1. Ген KRP 39

3.2.1.1. Строение гена KRP 39

3.2.1.2. Сравнение устройства гена KRP человека и курицы 41

3.2.2. Строение гена КЛЦМ 42

3.3. Тканевое распределение продуктов генетического локуса 44 КЛЦМ в эмбриогенезе и во взрослом организме

3.3.1. Экспрессия KRP регулируется промотором, специфичным 44 для гладких мышц

3.3.2. Экспрессия изоформ КЛЦМ в разных тканях в различные 47 периоды онтогенеза

3.3.2.1. Экспрессия изоформ КЛЦМ в мышечных тканях 47

3.3.2.2. Экспрессия изоформ КЛЦМ в немышечных тканях и 48 клеточных культурах

3.3.2.3. Внутриклеточная локализация изоформ КЛЦМ 49

3.4. Строение и функциональные свойства продуктов 51 генетического локуса киназы легких цепей миозина

3.4.1. Строение КЛЦМ-108 52

3.4.1.1. Физико-химические свойства КЛЦМ-108 52

3.4.1.2. Доменное строение КЛЦМ-108 53

3.4.2. Функциональные свойства КЛЦМ-108 53

3.4.2.1. Роль КЛЦМ в функционировании немышечных тканей и 53 гладких мышц

3.4.2.2. Механизм регуляции активности КЛЦМ 55

3.4.2.3. Ингибиторное действие КЛЦМ-108 на подвижность 57 актомиозиновых нитей in vitro

3.4.2.4. Связывание КЛЦМ-108 с актином 58 3.4.2.4.1. Участки связывания КЛЦМ с актином 58

3.4.2.5. Взаимодействие КЛЦМ-108 с миозином 59

3.4.2.6. Фосфорилирование КЛЦМ как способ регуляции ее 62 активности

3.4.2.6.1. Фосфорилирование КЛЦМ Са /кальмодулин-зависимой 62 ПКИ

3.4.2.6.2. Фосфорилирование КЛЦМ ПК-С 63

3.4.2.6.3. Фосфорилирование КЛЦМ ПК-А 64

3.4.2.6.4. Фосфорилирование КЛЦМ МАП-киназой и циклин- 65 зависимой киназами-1и 2 (cdk-1,2)

3.4.2.6.5. Аутофосфорилирование КЛЦМ-108 66

3.4.3. Строение и функциональные особенности КЛЦМ-210 67

3.4.3.1. Первичная структура КЛЦМ-210 67

3.4.3.2. Функциональные свойства КЛЦМ-210 70

3.5. Структура и свойства KRP 71

3.5.1. Строение молекулы KRP 71

3.5.1.1. Физико-химические свойства KRP 71

3.5.1.2. Третичная структура молекулы KRP 71

3.5.2. Гетерогенность KRP 74

3.5.3. Функциональные свойства KRP 75 3.5.3.1. Взаимодействие KRP с миозином 75

3.5.3.1.1. Участки молекулы KRP, ответственные за связывание 76 миозина

3.5.3.1.2. Участки связывания с KRP на молекуле миозина 76

3.5.3.1.3. ККР стабилизирует развернутую конформацию миозина 78

3.5.4. КР1Р ингибирует активность КПЦМ 80

ГЛАВА 4. МЕТОДЫ

4.1. Биохимические и физико-химические методы 81

4.1.1. Определение концентрации белков 81

4.1.2. Электрофорез и денситометрия 81

4.1.3. Выделение белков 82

4.1.4. Электронная микроскопия белков 83

4.1.5. Дифференциальное ультрацентрифугирование 85

4.1.6. Определение активности КЛЦМ и фосфорилирование 86 миозина

4.1.7. Фосфорилирование фрагментов КЛЦМ 87

4.1.8. Приготовление образцов тканей для электрофореза 87

4.2. Иммунохимические методы 88

4.2.1. Получение и характеристика антител к уникальному 88 домену КЛЦМ-210

4.2.2. Иммуноблоттинг 89

4.3. Молекулярно-биологические методы 90

4.3.1. Генетическое конструирование фрагментов N934 и N875 90 КЛЦМ-210 для экспрессии в клетках Е.соН

4.3.2. Генетическое конструирование фрагмента N875 для 91 экспрессии в эукариотической бакуловирусной системе; экспрессия и выделение продукта

4.3.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 92

4.4. Статистический анализ 93

РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЛАВА 5. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА КЛЦМ-210 И ЕЕ 94 УНИКАЛЬНОЙ ^КОНЦЕВОЙ ОБЛАСТИ

5. Введение 94

5.1. Выделение КЛЦМ-210 и изучение ее функциональных 94 свойств

5.1.1. Выделение КЛЦМ-210 из ткани аорты курицы 94

5.1.2. Функциональные свойства КЛЦМ-210 95

5.1.2.1. Каталитическая фосфотрансферазная активность КЛЦМ- 95 210

5.1.2.2. Связывание КЛЦМ-210 с актином и миозином 99

5.2. Изучение функциональных свойств уникальной ^ 101 концевой области КПЦМ-210

5.2.1. Создание генетических рекомбинантных фрагментов, 101 соответствующих уникальной части КЛЦМ-210, и экспрессия кодируемых ими полипептидов

5.2.2. Связывание фрагментов N934 и N875 с актином и 103 миозином

5.2.3. Связывание уникальных доменов КЛЦМ-210 с актином 103 приводит к образованию пучков Ф-актина

5.2.4. Связывание фрагмента N875 с кератином 106

5.2.5. Фосфорилирование уникальных доменов КЛЦМ-210 109 протеинкиназой А

5.2.6. Фосфорилирование уникальных доменов КЛЦМ-210 110 протенкиназой А ослабляет их связывание с актином и кератином

5.3. ОБСУЖДЕНИЕ 113

5.3.1. КЛЦМ-210 иКЛЦМ-108 проявляют схожие 113 функциональные свойства

5.3.2. Уникальный домен КЛЦМ-210 связывается с актином и 115 приводит к формированию пучков Ф-актина

5.3.3. Уникальный домен КЛЦМ-210 связывается с кератином 118

5.3.4. Фосфорилирование уникальных доменов КЛЦМ-210 120 протеинкиназой А

5.3.5. Доменная организация КЛЦМ-210 и КЛЦМ-подобных 121 киназ

ГЛАВА 6. ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ МИОЗИНА ПОД КОНТРОЛЕМ KRP 122 ИКАЛЬДЕСМОНА

6.1. Введение 122

6.2. Результаты 122

6.2.1. KRP препятствует агрегации миозиновых филаментов 122

6.2.2. Сравнение эффектов KRP и кальдесмона на Мд2+- 123 зависимую полимеризацию миозина в присутствии АТФ

6.2.3. 17кДа миозин-связывающий фрагмент кальдесмона 130 воспроизводит эффект целого белка на седиментацию миозина

6.2.4. Электронная микроскопия миозина в присутствии KRP и 130 кальдесмона

6.2.5. Совестное действие KRP и кальдесмона на 134 полимеризацию миозина

6.2.6. Совместное связывание KRP и кальдесмона с миозином 137

6.3. Обсуждение 138

6.3.1. Факторы, оказывающие влияние на сборку миозиновых 138 филаментов

6.3.2. KRP стабилизирует филаменты миозина в присутствии 142 АТФ

6.3.3. Кальдесмон не индуцирует образование филаментов 143 миозина

6.3.4. Возможные механизмы деполимеризующего действия 144 кальдесмона

6.3.5. Управляемая сборка миозиновых филаментов при 147 участии KRP и кальдесмона

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 149

ВЫВОДЫ 152

Список цитируемой литературы 153

Список сокращений, встречающихся в тексте диссертации

Apr аргинин

АТФ аденозин-б'-трифосфат цАМФ циклический аденозин - 3':5'- монофосфат

БСА бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

Г-актин глобулярный актин

Ф-актин фибриллярный актин гм/нм гладкомышечная/немышечная

ГМК гладкомышечная клетка

ГММ гладкомышечный миозин

ДСН додецилсульфат натрия

ДТТ дитиотрейтол

КаМ кальмодулин

КаД кальдесмон

КЛЦМ киназа легких цепей миозина

KRP Kinase-related Protein

РЛЦ регуляторная легкая цепь миозина

СЛЦ существенная легкая цепь миозина

ЛММ легкий меромиозин

Лиз лизин

ЛЦ легкие цепи

МАП киназа (МАПК) митоген-активируемая протеинкиназа

MOPS морфолинпропансульфоновая кислота мРНК матричная РНК

ПААГ полиакриламидный гель

ПК-А цАМФ-зависимая протеинкиназа

ПК-С протеинкиназа С

ПЦР полимеразная цепная реакция

S-1 субфрагмент 1 миозина

S-2 субфрагмент 2 миозина

Сер серин

Тир тирозин

Тре треонин

Трис трис (гидроксиметил) аминометан

ТХУ трихпоруксусная кислота 7

ИСК Ма-р-тозил-1-лизинхлорометилкетон

ТРСК М-тозил-1-фенилаланинхлорометилкетон

ТММ тяжелый меромиозин

ФСБ фосфатный солевой буфер

ФМСФ фенилметилсульфонилфторид

ФЛЦМ фосфатаза легких цепей миозина

Фн неорганический фосфат

ЭГТА этиленгликоль бис(Р-аминоэтиловый эфир)

МД^Ы'-тетрауксусной кислоты ЭДТА этилендиаминотетрауксусная кислота

Обозначение аминокислот

Алании А Глицин в Лейцин Ь Валин V

Аргинин К Гистидин Н Метионин М Серин Б

Аспарагин N Изолейцин I Тирозин У Пролин Р

Аспарагиновая к-та Р Триптофан \Л/ Треонин Т Лизин К

Глутаминовая к-та Е Глутамин О Фенилаланин Р Цистеин С

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ВВЕДЕНИЕ

Энергозависимое продвижение миозиновых филаментов относительно актиновых нитей составляет основу сократительной активности как мышечных, так и немышечных тканей. Сократительная активность скелетных и гладких мышц регулируется различным образом. На молекулярном уровне регуляция процесса сокращения в скелетной мускулатуре осуществляется Са2+-зависимым белковым комплексом, тесно связанным с тонкими, актиновыми филаментами и получившим название тропонинового комплекса. Регуляция сократительной активности гладких мышц и немышечных тканей, напротив, в большей степени связана с толстыми, миозиновыми филаментами (Рис.1), так как регулируется обратимым фосфорилированием самой миозиновой молекулы, а точнее - ее регуляторных легких цепей.

Фермент, катализирующий эту ключевую регуляторную реакцию, получил название киназа легких цепей миозина (КЛЦМ). Таким образом, КЛЦМ -основной регуляторный фермент, контролирующий активность гладкомышечного и немышечного миозинов 11-ого типа.

Научные исследования минувшего десятилетия показали, что ген КЛЦМ имеет необычное устройство, так как кодирует одновременно три различных беловых продукта - КЛЦМ-108, КЛЦМ-210 и KRP (Collinge et al., 1992; Watterson et al., 1995; Gallagher and Herring, 1991) - каждый из которых, по всей видимости, принимает участие в работе акгомиозинового сократителного аппарата.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЙ

Целью настоящей диссертационной работы явилось: изучение функциональных свойств белков - продуктов генетического локуса КЛЦМ.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияния миозин-связывающих белков KRP и кальдесмона на процесс полимеризации гладкомышечного миозина in vitro.

2. Разработать метод выделения КЛЦМ-210 из гладких мышц аорты и исследовать ее функциональные свойства.

3. Изучить взаимодействие уникального домена КЛЦМ-210 с белками цитоскелета и возможность регуляции этих взаимодействий фосфорилированием.

Са2+вне

Са2+внутри

Шю-киназа

Дефосфорилирование РЛЦ

-РАССЛАБЛЕНИЕ

Ф осфорилирование РЛЦ -СОКРАЩЕНИЕ

Рис. 1. Регуляция работы сократительного аппарата немышечных и гладкомышечных клеток киназой легких цепей миозина

Вход ионов Са2+ приводит к образованию комплекса Са2+-Кальмодулин, который с высокой аффинностью связывается с киназой легких цепей миозина (КЛЦМ) и активирует ее. Активная КЛЦМ фосфорилирует регуляторные легкие цепи миозина и, тем самым, активирует актин-зависимую АТФазу миозина. Активированные миозиновые филаменты взаимодействуют с Ф-актином - развивается процесс сокращения.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кудряшов, Дмитрий Семенович

ВЫВОДЫ

На основании полученных в результате работы даных сделаны следующие выводы:

1. Миозин-связывающие белки KRP и кальдесмон разнонаправленно влияют на филаментообразование гладкомышечного миозина в присутствии АТФ. KRP стимулирует сборку филаментов с боковой полярностью и препятствует их агрегации. Кальдесмон способствует нуклеации филаментов, но тормозит их рост. Действуя совместно, KRP и кальдесмон могут регулировать количество и размер полимеров миозина в условиях, приближенных к физиологическим.

2. Получены специфические антитела к уникальному N-концевому домену КЛЦМ-210 и разработан метод аффинной очистки этого белка. Впервые показано, что КЛЦМ-210 имеет сравнимую с КЛЦМ-108 каталитическую активность и способна взаимодействовать с актином и миозином.

3. Впервые продемонстрировано связывание экспрессированной N-концевой части КЛЦМ-210 с актином и кератином in vitro, а также возможность регуляции этих взаимодействий путем фосфорилирования Сер-127 и Сер-140 уникального домена цАМФ-зависимой протеинкиназой.

Заключение

Актиновый и миозиновый цитоскелет эукариотических организмов приспособлен к выполнению широкого спектра функций, связанных с подвижностью. Полученные нами экспериментальные данные указывают на то, что все продукты генетического локуса КЛЦМ самым непосредственным образом вовлечены в регуляцию работы и динамических перестроек актомиозинового цитоскелета.

Актин и миозин скелетных и сердечных мышечных волокон собраны в саркомеры, которые имеют строго упорядоченное строение. Скорость обмена белков в саркомерах невелика, видимо поэтому, миозин этих тканей нелегко перевести в мономерную форму, и он не растворяется в присутствии АТФ. Строго упорядоченная саркомерная структура поперечнополосатых мышечных волокон не требует постороннего вмешательства в свою работу. Однако для формирования саркомеров в эмбриогенезе, а также при регенерации поврежденных мышечных волокон возникает необходимость в белке-организаторе, способном скоординировать взаимодействие различных факторов, необходимых для построения саркомеров. КЛЦМ, по всей видимости, и является таким белком-организатором. В эмбриональной сердечной мышце, а также в сердечных мышцах при гепертрофии наблюдается высокий уровень ее экспрессии, а в скелетных мышцах КЛЦМ появляется в процессе их регенерации, то есть во всех тех случаях, когда возникает необходимость в формировании саркомеров de novo.

Актомиозиновый цитоскелет гладких мышц тоже имеет упорядоченную организацию, однако он значительно более пластичен и подвержен динамическим перестройкам. В отношении пластичности сократительного аппарата гладкие мышцы занимают промежуточное положение между скелетными мышцами и немышечными клетками. Они значительно более «чувствительны», чем скелетные мышцы, и способны отвечать не только на электрические импульсы, но и на широкий спектр гуморальных факторов, тонко регулирующих сократительную активность. Миозин гладких мышц значительно более приспособлен к динамическим перестройкам и в дефосфорилированном виде может быть легко переведен в мономерную форму в присутствии АТФ. Высокий уровень упорядоченности цитоскелета гладких мышц, наряду со способностью к динамическим трансформациям, достигается, по-видимому, благодаря совместному действию на полимерный миозин АТФ, KRP и КЛЦМ. Действительно, KRP способен стабилизировать дефосфорилированный миозин в полимерном состоянии в покоящихся клетках, а КЛЦМ - в активно работающих клетках, препятствуя противоположно направленному действию АТФ. Молекула KRP содержит несколько участков фосфорилирования различными протеинкиназами. Возможно, благодаря фосфорилированию KRP по этим участкам происходит тонкая регуляция динамического равновесия между полимерной и мономерной формами миозина.

Наконец, актомиозиновый цитоскелет немышечных клеток наиболее пластичен и чувствителен к влиянию внешних факторов. Он характеризуется непрекращающимися процессами формирования и разборки: формирования

151 там, где в нем возникает необходимость, и разборки, как только эта необходимость пропадает. Видимо поэтому, из трех продуктов генетического локуса КЛЦМ в немышечных клетках экспрессируется преимущественно КЛЦМ-210, тогда как К1ЧР в них не обнаруживается совсем. Благодаря множественным протяженным участкам связывания с актином КЛЦМ-210 стабилизирует актиновый цитоскелет, а, фосфорилируя РЛЦ миозина, она обеспечивает сборку миозиновых филаментов. Таким образом формируются функционально активные актомиозиновые волокна. Фосфорилирование КЛЦМ-210 другими протеинкиназами, например ПКА, может приводить к ослаблению связывания КЛЦМ-210 с актином и к растворению под действием АТФ полимерного миозина, который будет вновь собран в полимеры, как только в этом появится необходимость.

Полученные результаты позволяют предполагать, что генетический локус КЛЦМ посредством трех своих белковых продуктов контролирует формирование актомиозинового цитоскелета во всех типах тканей и, кроме того, осуществляет контроль над активностью и целостностью актомиозинового цитоскелета в гладких мышцах и немышечных тканях.

152

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кудряшов, Дмитрий Семенович, Москва

1. Гусев, Н.Б., Воротников, А.В., Бирюков, К.Г., Ширинский, В.П., Кальдесмон и кальпонин белки, участвующие в регуляции взаимодействия миозина и актина в немышечных клетках и гладких мышцах. Биохимия, 56, 13471368, 1991.

2. Левицкий, Д.И., Легкие цепи миозина и их роль в регуляции мышечного сокращения. Успехи биологической химии 27, 74-100, 1986.

3. Abe, М., Hasegawa, К., and Hosoya, Н., Activation of chicken gizzard myosin light chain kinase by Ca2+/calmodulin is inhibited by autophosphorylation. Cell Struct.Funct. 21, 183-188, 1996.

4. Adelstein, R.S., Conti, M.A., Hathaway, D.R., and Klee, C.B., Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by the catalytic subunit of adenosine 3': 5'-monophosphate-dependent protein kinase. J.Biol.Chem. 253, 8347-8350,1978.

5. Adelstein, R.S. and Klee, C.B., Purification and characterization of smooth muscle myosin light chain kinase. J.Biol.Chem. 256, 7501-7509, 1981.

6. Adelstein, R.S. and Klee, C.B., Purification of smooth muscle myosin light-chain kinase. Methods Enzymol. 85 Pt B, 298-308, 1982.

7. Adelstein, R.S. and Sellers, J.R., Myosin structure and function. In " Biochemistry of smooth muscle contraction" (M. Barany and K. Barany, Eds.), pp. 3-19, Acad. Press, 1996.

8. Aksoy, M.O., Mras, S., Kamm, K.E., and Murphy, R.A., Ca2+, cAMP, and changes in myosin phosphorylation during contraction of smooth muscle. Am. J.Physiol. 245, C255-C270, 1983.

9. Aoki, H., Sadoshima, J., Izumo, S., Myosin light chain kinase mediates sarcomere organization during cardiac hypertrophy in vivo. Nature med. 6, 183-188,2000.

10. Applegate, D. and Pardee, J.D., Actin-facilitated assembly of smooth muscle myosin induces formation of actomyosin fibrils. J. Cell Biol. 117, 1223-1230, 1992.

11. Bagchi, I.C., Kemp, B.E., and Means, A.R., Myosin light chain kinase structurefunction analysis using bacterial expression. J.Biol.Chem. 264, 15843-15849, 1989.

12. Benian, G.M., Kiff, J.E., Neckelmann, N., Moerman, D.G., and Waterston, R.H., Sequence of an unusually large protein implicated in regulation of myosin activity in C. elegans. Nature 342, 45-50, 1989.

13. Bissonnette, M., Kuhn, D., and de Lanerolle, P., Purification and characterization of myosin light-chain kinase from the rat pancreas. Biochem. J. 258,739-747,1989.

14. Bogatcheva, N.V., Vorotnikov, A.V., Birukov, K.G., Shirinsky, V.P., and Gusev, N.B., Phosphorylation by casein kinase II affects the interaction of caldesmon with smooth muscle myosin and tropomyosin. Biochem. J. 290, 437-442, 1993.

15. Bretscher, A., Smooth muscle caldesmon. Rapid purification and F-actin cross-linked properties. J.Biol.Chem. 259,12873-12880,1984.

16. Bretscher, A. and Lynch, W., Identification and localization of immunoreactive forms of caldesmon in smooth and nonmuscle cells: a comparison with the distribution of tropomyosin and alpha-actinin. J. Cell Biol. 100, 1656-1663, 1985.

17. Bretscher, A., Thin filament regulatory proteins of smooth- and non-muscle cells. Nature 321, 726-727, 1986.

18. Bryan, J., Imai, M., Lee, R., Moore, P., Cook, R.G., and Lin, W.-G., Cloning and expression of a smooth muscle caldesmon. J.Biol.Chem. 264, 13873-13879, 1989.

19. Bushueva, T.L., Teplova, M.V., Bushuev, V.N., Kudriashov, D.S., Vorotnikov, A.V., and Shirinskii, V.P., Stability of the structure of KRP (kinase related protein) protein., Mol Biol (Mosk) 33,227-236,1999.

20. Cande, W.Z. and Ezzell, R.M., Evidence for regulation of lamellipodial and tail contraction of glycerinated chicken embryonic fibroblasts by myosin light chain kinase. Cell Motil Cytoskeleton 6, 640-648, 1986.

21. Castellino, F., Ono, S., Matsumura, F., and Luini, A., Essential role of caldesmon in the actin filament reorganization induced by glucocorticoids. J. Cell Biol. 131, 1223-1230, 1995.

22. Chacko, S., Conti, M.A., and Adelstein, R.S., Effect of phosphorylation of smooth muscle myosin on actin activation and Ca2+ regulation.

23. Proc.Natl. Acad.Sci.USA 74, 129-133, 1977.

24. Chalovich, J.M., Hemric, M.E., and Velaz, L., Regulation of ATP hydrolysis by caldesmon. A novel change in the interaction of myosin with actin. Ann.N-Y Acad.Scl. 599, 85-99, 1990.

25. Chandra, T.S., Nath, N., Suzuki, H., and Seidel, J.C., Modification of thiols of gizzard myosin alters ATPase activity, stability of myosin filaments, and the 610 S conformational transition. J.Biol.Chem. 260, 202-207, 1985.

26. Conti, M.A. and Adelstein, R.S., The relationship between calmodulin binding and phosphorylation of smooth muscle myosin kinase by the catalytic subunit of 3':5' cAMP-dependent protein kinase. J.Biol.Chem. 256, 3178-3181, 1981.

27. Craig, R., Smith, R., and Kendrick-Jones, J., Light-chain phosphorylation controls the conformation of vertebrate non-muscle and smooth muscle myosin molecules. Nature 302, 436-439, 1983.

28. Cross, R.A., Cross, K.E., and Sobieszek, A., ATP-linked monomer-polymer equilibrium of smooth muscle myosin: the free folded monomer traps ADP.Pi. EMBO J. 5, 2637-2641, 1986.

29. Cross, R.A., Geeves, M.A., and Kendrick-Jones, J., A nucleation-elongation mechanism for the self-assembly of side polar sheets of smooth muscle myosin. EMBO J. 10, 747-756, 1991.

30. D'Angelo, E.K., Singer, H.A., and Rembold, C.M., Magnesium relaxes arterial smooth muscle by decreasing intracellular Ca2+ without changing intracellular Mg2+. J Clin Invest 89, 1988-1994, 1992.

31. Dabiri, G.A., Turnacioglu, K.K., Sanger, J.M., and Sanger, J.W., Myofibrillogenesis visualized in living embryonic cardiomyocytes. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 9493-9498, 1997.

32. Dabrowska, R., Aromatorio, D., Sherry, J.M., and Hartshorne, D.J., Composition of the myosin light chain kinase from chicken gizzard. Biochem.Biophys.Res. Commun. 78, 1263-1272, 1977.

33. Earley, J.J., Su, X., and Moreland, R.S., Caldesmon inhibits active crossbridges in unstimulated vascular smooth muscle : An antisense oligodeoxynucleotide approach. Circ.Res. 83, 661-667, 1998.

34. Eilertsen, K.J., Kazmierski, S.T., and Keller, T.C., Cellular titin localization in stress fibers and interaction with myosin II filaments in vitro. J. Cell Biol. 126, 1201-1210, 1994.

35. Fisher, S.A. and Ikebe, M., Developmental and tissue distribution of expression of nonmuscle and smooth muscle isoforms of myosin light chain kinase. Biochem.Biophys.Res. Commun. 217, 696-703, 1995.

36. Foyt, H.L., Guerriero, V.J., and Means, A.R., Functional domains of chicken gizzard myosin light chain kinase. J.Biol.Chem. 260, 7765-7774, 1985.

37. Gallagher, P.J. and Herring, B.P., The carboxyl terminus of the smooth muscle myosin light chain kinase is expressed as an independent protein, telokin. J.Biol.Chem. 266, 23945-23952, 1991.

38. Gallagher, P.J., Herring, B.P., Griffin, S.A., and Stull, J.T., Molecular characterization of a mammalian smooth muscle myosin light chain kinase published erratum appears in J Biol Chem 1992 May 5;267(13):9450., J.Biol.Chem. 266, 23936-23944, 1991.

39. Gallagher, P.J., Garcia, J.G., and Herring, B.P., Expression of a novel myosin light chain kinase in embryonic tissues and cultured cells. J.Biol.Chem. 270, 29090-29095, 1995.

40. Gallagher, P.J. and Stull, J.T., Localization of an actin binding domain in smooth muscle myosin light chain kinase. Mol. Cell Biochem. 173, 51-57, 1997.

41. Garcia, J.G., Verin, A.D., Schaphorst, K., Siddiqui, R., Patterson, C.E., Csortos, C., and Natarajan, V., Regulation of endothelial cell myosin light chain kinase by Rho, cortactin, and p60(src). Am. J.Physiol. 276, L989-L998, 1999.

42. Garcia, J.G.N., Lazar, V., Gilbert-McClain, LI., Gallagher, P.J., and Verin, A.D., Myosin light chain kinase in endothelium: molecular cloning and regulation. Am. J.Respir. Cell Mol.Biol. 16, 489-494, 1997.

43. Gerthoffer, W.T. and Murphy, R.A., Ca2+, myosin phosphorylation, and relaxation of arterial smooth muscle. Am. J.Physiol. 245, C271-C277, 1983.

44. Gerthoffer, W.T. and Murphy, R.A., Myosin phosphorylation and regulation of cross-bridge cycle in tracheal smooth muscle. Am. J.Physiol. 244, C182-C187, 1983.

45. Gilbert-McClain, LI., Verin, A.D., Shi, S., Irwin, R.P., and Garcia, J.G., Regulation of endothelial cell myosin light chain phosphorylation and permeability by vanadate. J.Cell Biochem. 70, 141-155, 1998.

46. Gillis, J.M., Cao, M.L., and Godfraind-De Becker, A., Density of myosin filaments in the rat anococcygeus muscle, at rest and in contraction. II. J.Muscle Res. Cell Motil. 9, 18-29, 1988.

47. Graceffa, P., Wang, C.L.A., and Stafford, W.F., Caldesmon. Molecular weight and subunit composition by analytical ultracentrifugation. J.Biol.Chem. 263, 14196-14202, 1988.

48. Gusev, N.B. and Vorotnikov, A.V., Effect of phosphorylation and Ca-binding proteins on functioning of caldesmon, thin filament linked regulator of smooth muscle and non-muscle motility. Sov.Sci.Rev.D.Physicochem.Biol. 11, 1XXEP: 53, 1993.

49. Haeberle, J.R., Trybus, K.M., Hemric, M.E., and Warshaw, D M., The effects of smooth muscle caldesmon on actin filament motility. J.Biol.Chem. 267, 2300123006, 1992.

50. Harpaz, Y. and Chothia, C., Many of the immunoglobulin superfamily domains in cell adhesion molecules and surface receptors belong to a new structural set which is close to that containing variable domains. J. Mol.Biol. 238, 528-539, 1994.

51. Hayashi, K., Kanda, K., Kimizuka, F., Kato, I., and Sobue, K., Primary structure and functional expression of h-caldesmon complementary DNA.

52. Biochem. Biophys. Res. Commun. 164, 503-511, 1989.

53. Heierhorst, J., Probst, W.C., Kohanski, R.A., Buku, A., and Weiss, K.R., Phosphorylation of myosin regulatory light chains by the molluscan twitchin kinase. EurJBiochem. 233, 426-431, 1995.

54. Hemric, M.E. and Chalovich, J.M., Characterization of caldesmon binding to myosin. J.Biol. Chem. 265, 19672-19678, 1990.

55. Herring, B.P. and Smith, A.F., Telokin expression is mediated by a smooth muscle cell-specific promoter. Am. J.Physiol. 270, C1656-C1665, 1996.

56. Herring, B.P. and Smith, A.F., Telokin expression in A10 smooth muscle cells requires serum response factor. Am. J.Physiol. 272, C1394-C1404, 1997.

57. Hnath, E.J., Wang, C.L., Huber, P.A., Marston, S.B., and Phillips, G.N.J., Affinity and structure of complexes of tropomyosin and caldesmon domains. Biophys J 71,1920-1933, 1996.

58. Holden, H.M., Ito, M., Hartshorne, D.J., and Rayment, I., X-ray structure determination of telokin, the C-terminal domain of myosin light chain kinase, at 2.8 A resolution. J.Mol.Biol. 227, 840-851, 1992.

59. Horowitz, A., Trybus, K.M., Bowman, D.S., and Fay, F.S., Antibodies probe for folded monomeric myosin in relaxed and contracted smooth muscle. J.Cell Biol. 126, 1195-1200, 1994.

60. Hosoya, H., Yamashiro, S., and Matsumura, F., Mitosis-specific phosphorylation of myosin light chain kinase. J.Biol.Chem. 266, 22173-22178, 1991.

61. Hosoya, N., Hosoya, H., Yamashiro, S., Mohri, H., and Matsumura, F., Localization of caldesmon and its dephosphorylation during cell division. J.Cell Biol. 121, 1075-1082, 1993.

62. Huber, P.A., Fraser, I.D., and Marston, S.B., Location of smooth-muscle myosin and tropomyosin binding sites in the C-terminal 288 residues of human caldesmon. Biochem.J. 312 ( Pt 2), 617-625, 1995.

63. Ikebe, M., Inagaki, M., Kanamaru, K., and Hidaka, H., Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by Ca2+-activated, phospholipid-dependent protein kinase. J.Biol.Chem. 260, 4547-4550, 1985a.

64. Ikebe, M. and Hartshorne, D.J., Phosphorylation of smooth muscle myosin at two distinct sites by myosin light chain kinase. J.Biol.Chem. 260, 10027-10031, 19856.

65. Ikebe, M., Hartshorne, D.J., and Elzinga, M., Identification, phosphorylation, and dephosphorylation of a second site for myosin light chain kinase on the 20,000-dalton light chain of smooth muscle myosin. J.Biol.Chem. 261, 36-39, 1986.

66. Ikebe, M., Stepinska, M., Kemp, B.E., Means, A.R., and Hartshorne, D.J., Proteolysis of smooth muscle myosin light chain kinase. Formation of inactive and calmodulin-independent fragments. J.Biol.Chem. 262, 13828-13834, 1987.

67. Ikebe, M. and Reardon, S., Binding of caldesmon to smooth muscle myosin. J.Biol.Chem. 263, 3055-3058, 1988.

68. Ikebe, M., Phosphorylation of a second site for myosin light chain kinase on platelet myosin. Biochem. 28, 8750-8755, 1989.

69. Ikebe, M., Ikebe, R., Kamisoyama, H., Reardon, S., Schwonek, J.P., Sanders, C.R.2., and Matsuura, M., Function of the NH2-terminal domain of the regulatory light chain on the regulation of smooth muscle myosin. J.Biol.Chem.269, 28173-28180, 1994.

70. Ishikawa, R., Yamashiro, S., Kohama, K., and Matsumura, F., Regulation of actin binding and actin bundling activities of fascin by caldesmon coupled with tropomyosin. J.Biol.Chem. 273, 26991-26997, 1998.

71. Ito, M., Dabrowska, R., Guerriero, V., Jr., and Hartshorne, D.J., Identification in turkey gizzard of an acidic protein related to the C-terminal portion of smooth muscle myosin light chain kinase. J.Biol.Chem. 264, 13971-13974, 1989.

72. Jiang, M.J. and Morgan, K.G., Intracellular calcium levels in phorbol ester-induced contractions of vascular muscle. Am. J.Physiol. 253, H1365-H1371, 1987.

73. Kamm, K.E. and Stull, J.T., The function of myosin and myosin light chain kinase phosphorylation in smooth muscle. Annu.Rev.Pharmacol. Toxicol. 25, 593-620, 1985.

74. Katayama, E., Scott-Woo, G.C., Ikebe, M., and Scott-Woo, G., Effect of caldesmon on the assembly of smooth muscle myosin. J.Biol. Chem. 270, 3919-3925, 1995.

75. Katoch, S.S., REegg, J.C., and Pfitzer, G., Differential effects of a K+ channel agonist and Ca2+ antagonists on myosin light chain phosphorylation in relaxation of endothelin-1-contracted tracheal smooth muscle. Pflug.Arch. 433, 472-477, 1997.

76. Kemp, B.E. and Pearson, R.B., Spatial requirements for location of basic residues in peptide substrates for smooth muscle myosin light chain kinase. J.Biol.Chem. 260, 3355-3359, 1985.

77. Kemp, B.E., Pearson, R.B., Guerriero, V.J., Bagchi, I.C., and Means, A.R., The calmodulin binding domain of chicken smooth muscle myosin light chain kinase contains a pseudosubstrate sequence. J.Biol. Chem. 262, 2542-2548, 1987.

78. Kendrick-Jones, J., Smith, R.C., Craig, R., and Citi, S., Polymerization of vertebrate non-muscle and smooth muscle myosins. J.Mol.Biol. 198, 241-252, 1987.

79. Klemke, R.L., Cai, S., Giannini, A.L., Gallagher, P.J., de Lanerolle, P., Cheresh, D.A., and de-Lanerolle, P., Regulation of cell motility by mitogen-activated protein kinase. J. Cell Biol. 137, 481-492, 1997.

80. Kojima, S., Mishima, M., Mabuchi, I., and Hotta, Y., A single Drosophila melanogaster myosin light chain kinase gene produces multiple isoforms whose activities are differently regulated. Genes. Cells. 1, 855-871, 1996.

81. Krauze, K., Makuch, R., Stepka, M., and Dabrowska, R., The first caldesmon-like protein in higher plants. Biochem.Biophys.Res.Commun. 247, 576-579, 1998.

82. Krueger, J.K., Olah, G.A., Rokop, S.E., Zhi, G., Stull, J.T., and Trewhella, J., Structures of calmodulin and a functional myosin light chain kinase in the activated complex: a neutron scattering study. Biochem. 36, 6017-6023, 1997.

83. Krueger, J.K., Olah, G.A., Rokop, S.E., Zhi, G., Stull, J.T., and Trewhella, J., Structures of calmodulin and a functional myosin light chain kinase in the activated complex: a neutron scattering study. Biochem. 36, 6017-6023, 1997.

84. Kudryashov, D.S., Chibalina, M.V., Birukov, K.G., Lukas, T.J., Sellers, J.R., Van Eldik, L.J., Watterson, D.M., Shirinsky, V.P., Unique sequence of a high molecular weight myosin light chain kinase is involved in interaction with actin

85. AII i|— I—I LL A O r*~J —I A A r\r\r\uyiusKeieiun. rnoo isu. <»QO, O/-/ i,

86. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685, 1970.

87. Lamb, N.J., Fernandez, A., Mezgueldi, M., LabbB, J.P., Kassab, R., and Fattoum, A., Disruption of the actin cytoskeleton in living nonmuscle cells by microinjection of antibodies to domain-3 of caldesmon. Eur J Cell Biol. 69, 3644, 1996.

88. Lazar, V. and Garcia, J.G., A single human myosin light chain kinase gene (MLCK; MYLK). Genomics 57, 256-267, 1999.

89. Lehman, W., Denault, D., and Marston, S., The caldesmon content of vertebrate smooth muscle. Biochim.Biophys.Acta 1203, 53-59, 1993.

90. Li, L., Eto, M., Lee, M.R., Morita, F., Yazawa, M., Kitazawa, T.J., Possible involvement of the novel CPI-17 protein in protein kinase C signal transduction of rabbit arterial smooth muscle. Physiol (Lond). 508, 871-881, 1998.

91. Lin, J.J., Lin, J.L., Davis-Nanthakumar, E.J., and Lourim, D., Monoclonal antibodies against caldesmon, a Ca++/calmodulin- and actin-binding protein of smooth muscle and nonmuscle cells. Hybridoma 7, 273-288, 1988.

92. Lowry, J.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J., Protein measurement with thefolin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 261-275, 1951.

93. Lukas, T.J., Burgess, W.H., Prendergast, F.G., Lau, W., and Watterson, D M., Calmodulin binding domains: characterization of a phosphorylation and calmodulin binding site from myosin light chain kinase. Biochem. 25, 14581464, 1986.

94. Lukas, T.J., Mirzoeva, S., and Watterson, D.M., Calmodulin-regulated protein kinases. In " Calmodulin and signal transduction" (L.J. Van Eldik and D.M. Watterson, Eds.), pp. 65-168, Acad.Press, London, 1998.

95. Mabuchi, K., Li, Y., Tao, T., and Wang, C.L., Immunocytochemical localizationui oaiucsi iiui i ai iu uaijjui 1111 111 ui nur\ei i yi/.z.ai u si i iuuii i mu&oie, j. iviusuic?

96. Res. Cell Motil. 17, 243-260, 1996.

97. Marston, S.B., The regulation of smooth muscle contractile proteins. Prog.Biophys. Mol.Biol. 41, 1XXEP: 41, 1983.

98. Marston, S.B. and Redwood, C.S., The molecular anatomy of caldesmon. Biochem. J. 279, 1-16, 1991.

99. Marston, S.B., Pinter, K., and Bennett, P., Caldesmon binds to smooth muscle myosin and myosin rod and crosslinks thick filaments to actin filaments.

100. J.Muscle Res.Cell Motil. 13, 206-218, 1992.

101. Marston, S.B. and Redwood, C.S., The essential role of tropomyosin in cooperative regulation of smooth muscle thin filament activity by caldesmon. J.Biol.Chem. 268, 12317-12320, 1993.

102. Marston, S.B. and Huber, P.A.J., Caldesmon. In " Biochemistry of smooth muscle contraction" (M. Barany and K. Barany, Eds.), pp. 77-90, Acad Press,1996.

103. Masato, T., Numata, T., Katoh, T., Morita, F., and Yazawa, M., Crosslinking of telokin to chicken gizzard smooth muscle myosin. J.Biochem. 121, 225-230,1997.

104. Matsu-ura, M. and Ikebe, M., Requirement of the two-headed structure for the phosphorylation dependent regulation of smooth muscle myosin. FEBS Lett. 363,246-250,1995.

105. Matsumura, F., Ono, S., Yamakita, Y., Totsukawa, G., and Yamashiro, S., Specific localization of serine 19 phosphorylated myosin II during cell locomotion and mitosis of cultured cells. J. Cell Biol. 140, 119-129, 1998.

106. Means, A.R. and George, S.E., Calmodulin regulation of smooth-muscle myosin light-chain kinase. J Cardiovasc Pharmacol 12 Suppl 5, S25-S29, 1988.

107. Medvedeva, M.V., Kolobova, E.A., Huber, P.A., Fraser, I D., Marston, S.B., and Gusev, N.B., Mapping of contact sites in the caldesmon-calmodulin complex. Biochem. J. 324 ( Pt 1), 255-262, 1997.

108. Mills, J.C., Stone, N.L., Erhardt, J., and Pittman, R.N., Apoptotic membrane blebbing is regulated by myosin light chain phosphorylation. J. Cell Biol. 140, 627-636, 1998.

109. Murphy, R.A., Special topic: contraction in smooth muscle cells. Annu.Rev. Physiol. 51, 275-283, 1989.

110. Nishikawa, M., Shirakawa, S., and Adelstein, R.S., Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by protein kinase C. Comparative study of the phosphorylated sites. J.Biol.Chem. 260, 8978-8983, 1985.

111. Okamoto, Y., Sekine, T., Grammer, J., and Yount, R.G., The essential light chains constitute part of the active site of smooth muscle myosin. Nature 324, 78-80, 1986.

112. Okayama, N., Joh, T., Miyamoto, T., Kato, T., and Itoh, M., Role of myosin light-chain kinase and protein kinase C in pepsinogen secretion from guinea pig gastric chief cells in monolayer culture. Dig Dis Sci 39, 2547-2557, 1994.

113. Olson, N.J., Pearson, R.B., Needleman, D.S., Hurwitz, M.Y., Kemp, B E., and Means, A.R., Regulatory and structural motifs of chicken gizzard myosin light chain kinase. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87, 2284-2288, 1990.

114. Ozawa, K, Masujima, T., Ikeda, K, Kodama, Y., and Nonomura, Y., Different pathways of inhibitory effects of wortmannin on exocytosis are revealed by video-enhanced light microscope. Biochem.Biophys.Res.Commun. 222, 243248, 1996.

115. Park, C.S., Chang, S.H., Lee, H.S., Kim, S.H., Chang, J.W., and Hong, C D.,1.hibition of renin secretion by Ca2+ through activation of myosin light chain kinase. Am. J.Physiol. 271, C242-C247,1996.

116. Pearson, R.B., Jakes, R., John, M., Kendrick-Jones, J., and Kemp, B E., Phosphorylation site sequence of smooth muscle myosin light chain (Mr = 20 000). FEBSLett. 168, 108-112, 1984.

117. Pearson, R.B., Floyd, D.M., Hunt, J.T., Lee, V.G., and Kemp, B.E., Hydroxyamino acid specificity of smooth muscle myosin light chain kinase. Arch Biochem Biophys 260, 37-44, 1988.

118. Phillips, S.V., Scott-Woo, G.C., Walsh, M.P., and Kargacin, G.J., Comparison of the caldesmon content of cardiac and smooth muscle. J Mol Cell Cardiol 31, 1413-1417, 1999.

119. Rasmussen, H., Forder, J., Kojima, I., and Scriabine, A., TPA-induced contraction of isolated rabbit vascular smooth muscle.

120. Biochem.Biophys.Res.Commun. 122, 776-784, 1984.

121. Rasmussen, H., Takuwa, Y., and Park, S., Protein kinase C in the regulation of smooth muscle contraction. FASEB J. 1, 177-185, 1987.

122. Richardson, M.R., Taylor, D.A., Casey, M.L., MacDonald, P.C., and Stull, J.T., Biochemical markers of contraction in human myometrial smooth muscle cells in culture. In Vitro Cell Dev Biol 23, 21-28, 1987.

123. Ruegg, J.C., Vertebrate smooth muscle. In " Calcium in Muscle Activation" (Anonymouspp. 201-238, 1986.

124. Rusconi, F., Potier, M.C., Le Caer, J.P., Schmitter, J.M., and Rossier, J., Characterization of the chicken telokin heterogeneity by time-of- flight massspectrometry. Biochem. 36, 11021-11026, 1997.

125. Russo, M.A., Guerriero, V.J., and Means, A.R., Hormonal regulation of a chicken oviduct messenger ribonucleic acid that shares a common domain with gizzard myosin light chain kinase. Mol.Endocrinol. 1, 60-67, 1987.

126. Samizo, K., Okagaki, T., and Kohama, K., Inhibitory effect of phosphorylated myosin light chain kinase on the ATP-dependent actin-myosin interaction. Biochem.Biophys.Res. Commun. 261, 95-99, 1999.

127. Schulman, H., The multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 22, 39-112, 1988.

128. Scott-Woo, G.C., Walsh, M.P., Ikebe, M., and Kargacin, G.J., Identification and localization of caldesmon in cardiac muscle. Biochem. J. 334 ( Pt 1), 161-170, 1998.

129. Sellers, J.R., Eisenberg, E., and Adelstein, R.S., The binding of smooth muscle heavy meromyosin to actin in the presence of ATP. Effect of phosphorylation. J.Biol.Chem. 257, 13880-13883, 1982.

130. Sellers, J.R. and Pato, M.D., The binding of smooth muscle myosin light chain kinase and phosphatases to actin and myosin. J.Biol.Chem. 259, 7740-7746, 1984.

131. Sellers, J.R., Mechanism of the phosphorylation-dependent regulation of smooth muscle heavy meromyosin. J.Biol.Chem. 260, 15815-15819, 1985.

132. Sellers, J.R. and Goodson, H.V., Motor proteins 2: myosin. Protein Profile, 1995.

133. Sellers, J.R., Goodson, H.V., and Wang, F., A myosin family reunion. J.Muscle Res. Cell Motil. 17, 7-22, 1996.

134. Shirinsky, V.P., Bushueva, T.L., and Frolova, S.I., Caldesmon-calmodulin interaction: study by the method of protein intrinsic tryptophan fluorescence. Biochem. J. 255, 203-208, 1988.

135. Shirinsky, V.P., Birukov, K.G., Vorotnikov, A.V., and Gusev, N.B., Caldesmon150, caldesmon77 and skeletal muscle troponin T share a common antigenic determinant. FEBS Lett. 251, 65-68, 1989.

136. Silver, D.L., Vorotnikov, A.V., Watterson, D.M., Shirinsky, V.P., and Sellers,

137. D Qifflc rvf ly ¡ r-» o o ¿a mlot^rJ r»rr\+o¡n onrl cmnrvth rvi i io^Iqj. i \., vjii^o w i ii i i^i auuui i k^^ivv^^i i r\11 iaot/ i ciaicu pi w ic; i1 i ai iu oí i ivjvju i i i iuouicmyosin. J.Biol.Chem. 272, 25353-25359, 1997.

138. Small, J.V. and Sobieszek, A., Contractile and structural proteins of smooth muscle. In: «Biochemistry of smooth muscle» (Stefens, N.L. ed.) 85-140, CRC Press, 1983.

139. Smith, A.F., Bigsby, R.M., Word, R.A., and Herring, B.P., A 310-bp minimal promoter mediates smooth muscle cell-specific expression of telokin.

140. Am. J.Physiol. 274, C1188-95; discussion C1187, 1998.

141. Smith, L., Su, X., Lin, P., Zhi, G. and Stull, T.J. Identification of a novel actin binding motif in smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem. 274, 29433-29438,1999.

142. Sobieszek, A., Cross-bridges on self-assembled smooth muscle myosin filaments. J.Mol.Biol. 70, 741-744, 1972.

143. Sobieszek, A., Ca-linked phosphorylation of a light chain of vertebrate smooth-muscle myosin. Eur.J.Biochem. 73, 477-483, 1977.

144. Sobieszek, A. and Small, J.V., Regulation of the actin-myosin interaction in vertebrate smooth muscle: activation via a myosin light-chain kinase and the effect of tropomyosin. J.Mol.Biol. 112,559-576,1977.

145. Sobue, K, Muramoto, Y., Fujita, M., and Kakiuchi, S., Purification of a calmodulin-binding protein from chicken gizzard that interacts with F-actin. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78, 5652-5655, 1981.

146. Sobue, K., Tanaka, T., Kanda, K, Ashino, N., and Kakiuchi, S., Purification and characterization of caldesmon (77): a calmodulin-binding protein thatinteracts with actin filaments from bovine adrenal medula. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82,5025-5029, 1985.

147. Sobue, K., Kanda, K., Tanaka, T., and Ueki, N., Caldesmon: a common actin-linked regulatory protein in the smooth muscle and nonmuscle contractile system. J. Cell Biochem. 37, 317-325, 1988.

148. Somlyo, A.V., Butler, T.M., Bond, M., and Somlyo, A.P., Myosin filaments have non-phosphorylated light chains in relaxed smooth muscle. Nature 294, 567569,1981.

149. Spudich, J.A. and Watt, S., The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin- troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J.Biol.Chem. 246, 48664871,1971.

150. Stull, J.T., Tansey, M.G., Tang, D.-C., Word, R.A., Kamm, K.E., and Tang, D.C., Phosphorylation of myosin light chain kinase: a cellular mechanism for Ca2+desensitization. Mol. Cell Biochem. 127/128,229-237, 1993.

151. Stull, J.T., Krueger, J.K., Kamm, K.E., Gao, Z.-H., Zhi, G., and Padre, R.C., Myosin Light Chain Kinase. In " Biochemistry of Smooth Muscle Contraction" (Anonymouspp. 119-129, Academic Press, Inc., 1996.

152. Surgucheva, I. and Bryan, J., Over-expression of smooth muscle caldesmon in mouse fibroblasts. Cell Motil Cytoskeleton 32, 233-243, 1995.

153. Suzuki, H., Onishi, H., Takahashi, K., and Watanabe, S., Structure and function of chicken gizzard myosin. J.Biochem. 84, 1529-1542, 1978.

154. Sweeney, H.L., Bowman, B.F., and Stull, J.T., Myosin light chain phosphorylation in vertebrate striated muscle: regulation and function. Am.J.Physiol. 264, C1085-95, 1993.

155. Szymanski, P.T., Ferguson, D.G., and Paul, R.J., Polylysine activates smooth muscle myosin ATPase activity via induction of a 10S to 6S transition.

156. Am. J. Physiol. 265, C379-C386, 1993.

157. Szymanski, P.T., Chacko, T.K., Rovner, A.S., and Goyal, R.K., Differences in contractile protein content and isoforms in phasic and tonic smooth muscles. Am. J.Physiol. 275, C684-C692, 1998.

158. Tansey, M.G., Hori, M., Karaki, H., Kamm, K.E., and Stull, J.T., Okadaicacid uncouples myosin light chain phosphorylation and tension in smooth muscle. FEBS Lett. 270, 219-221, 1990.

159. Taylor, D.A. and Stull, J.T., Calcium dependence of myosin light chain phosphorylation in smooth muscle cells. J.Biol.Chem. 263, 14456-14462,1988.

160. Tokui, T., Ando, S., and Ikebe, M., Autophosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase at its regulatory domain. Biochem. 34, 5173-5179, 1995.

161. Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J., Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS 76, 4350-4354, 1979.

162. Trinick, J., Titin and nebulin: protein rulers in muscle? Trends Biochem Sci 19, 405-409, 1994.

163. Trybus, K.M., Huiatt, T.W., and Lowey, S., A bent monomeric conformation of myosin from smooth muscle. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 79, 6151-6155, 1982.

164. Trybus, K.M. and Lowey, S., The regulatory light chain is required for folding of smooth muscle myosin. J.Biol.Chem. 263, 16485-16492, 1988.

165. Trybus, K.M., Filamentous smooth muscle myosin is regulated by phosphorylation. J. Cell Biol. 109, 2887-2894, 1989.

166. Trybus, K.M., Assembly of cytoplasmic and smooth muscle myosins. Curr. Opin. Cell Biol. 3, 105-111, 1991.

167. Tullio, A.N., Accili, D., Ferrans, V.J., Yu, Z.X., Takeda. K., Grinberg, A., Westphal, H., Preston, Y.AJ, Adelstein, R.S., Nonmuscle myosin ll-B is required for normal development of the mouse heart. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 12407-12412, 1997

168. Umemoto, S., Bengur, A.R., and Sellers, J.R., Effect of multiple phosphorylations of smooth muscle and cytoplasmic myosins on movement in an in vitro motility assay. J.Biol.Chem. 264, 1431-1436, 1989.

169. Verin, A.D., Lazar, V., Torry, R.J., Labarrere, C.A., Patterson, C.E., and Garcia, J.G., Expression of a novel high molecular-weight myosin light chain kinase in endothelium. Am J Respir Cell Mol Biol 19, 758-766, 1998a.

170. Verin, A.D., Gilbert-McClain, LI., Patterson, C.E., and Garcia, J.G., Biochemical regulation of the nonmuscle myosin light chain kinase isoform in bovine endothelium. Am J Respir Cell Mol Biol 19, 767-776, 19986.

171. Vorotnikov, A.V., Silver, D.L., Sellers, J.R., Watterson, D.M., and Shirinsky, V.P., Kinase-related protein is phosphorylated both in vitro and in smooth muscle by mitogen-activated and cyclic AMP-dependent protein kinases.

172. J. Muscle Res. Cell Motil. 17, 153a, 1996.

173. Wagner, P.D. and Stone, D.B., Myosin heavy chain-light chain recombinations and interactions between the two classes of light chains. J.Biol.Chem. 258, 8876-8882, 1983.

174. Walsh, M.P., Limited proteolysis of smooth muscle myosin light chain kinase. Biochem. 24, 3724-3730, 1985.

175. Warren, K.S., Shutt, D.C., McDermott, J.P., Lin, J.L., Soil, D.R., and Lin, J.J., Overexpression of microfilament-stabilizing human caldesmon fragment, CaD39, affects cell attachment, spreading, and cytokinesis. Cell

176. Motil. Cytoskel. 34, 215-229, 1996.

177. Warrick, H.M. and Spudich, J.A., Myosin structure and function in cell motility. Annu.Rev. Cell Biol. 3, 379-421, 1987.

178. Watterson, D.M., Collinge, M.A., Lukas, T.J., Van-Eldik, L.J., Birukov, K.G., Stepanova, O.V., and Shirinsky, V.P., Multiple gene products are produced from a novel protein kinase transcription region. FEBS Lett. 373, 217-220, 1995.

179. Wysolmerski, R.B. and Lagunoff, D., Involvement of myosin light-chain kinase in endothelial cell retraction. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87, 16-20, 1990.

180. Xie, X., Harrison, D.H., Schlichting, I., Sweet, R.M., Kalabokis, V.N., Szent-GyOrgyi, A.G., and Cohen, C., Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2.8 A resolution see comments. Nature 368, 306-312, 1994.

181. Yamakita, Y., Yamashiro, S., and Matsumura, F., In vivo phosphorylation of regulatory light chain of myosin II during mitosis of cultured cells. J. Cell Biol.1. A A ^ on HO-7 A r\f\ A

182. Yamashiro, S. and Matsumura, F., Mitosis-Specific Phosphorylation of Caldesmon Possible Molecular Mechanism of Cell Rounding During Mitosis. Bioessays 13, 563-568, 1991.