Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические свойства миорода и телокина, сократительных белков гладких мышц

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства миорода и телокина, сократительных белков гладких мышц"

На правах рукописи

Матусовский Олег Самойлович

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИОРОДА И ТЕЛОКИНА, СОКРАТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ ГЛАДКИХ МЫШЦ

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток-2005

Работа выполнена в лаборатории биофизики клетки Института биологии моря Дальневосточного отделения РАН, Владивосток и в Институте молекулярной биологии Австрийской АН, Зальцбург.

Научный руководитель: д.б.н., с.н.с., Шелудько Н.С.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН

ВаськовскийВ.Е. к.б.н., с.н.с., Кондрашев C.JL

Ведущая организация:

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится «_»

2005 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 31-40-50. Email: science@piboc.,dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (Владивосток-22, пр. 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат диссертации разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

старшии научный сотрудник

Прокопенко Г.И.

л tf9j-

22.43377

з

Актуальность проблемы

В основе сокращения мышц лежит взаимодействие миозина и актина, которое стимулируется повышением концентрации кальция в саркоплазме. Последующее снижение концентрации кальция в фазных мышцах приводит к их быстрому расслаблению. В гладких тонических мышцах это расслабление замедлено, что позволяет мышцам некоторое время поддерживать напряжение при незначительном расходе энергии. В случае гладких мышц позвоночных такое состояние называется latch. В гладких мышцах беспозвоночных - двустворчатых моллюсков - это явление (catch) выражено очень ярко. Запирательные мышцы моллюсков могут часами находиться в сокращенном состоянии без признаков утомления. Молекулярные механизмы catch и latch неизвестны и вызывают большой интерес, поскольку их трудно объяснить в рамках бытующих в настоящее время представлений о механизмах биологической подвижности.

В гладких мышцах взаимодействие миозиновых (толстых) и актиновых (тонких) нитей инициируется активированием* толстых нитей либо прямым связыванием кальция с легкими цепями миозина (беспозвоночные), либо посредством фосфорилирования легких цепей киназой легких цепей миозина в присутствии кальция (позвоночные). Представляется вероятным, что белки, связанные с толстой нитью, могут модулировать актин-миозиновое взаимодействие, замедляя или приостанавливая расслабление, и тем самым придавать сократительному процессу ту или иную степень тоничности. Такими белками в запирательных мышцах моллюсков могут быть твитчин (Vibert et al., 1993) и миород (Shelud'ko et al., 1998a). Известно, что белок толстых нитей гладких мышц позвоночных - телокин in vitro влияет на скорость фосфорилирования миозина (Shirinsky et al., 1993) и, следовательно, может быть потенциальным модулятором актин-миозинового взаимодействия.

Твитчин, действительно, принимает участие в регуляции catch-состояния мышц моллюсков (Siegman et al., 1998). Его дефосфорилирование in vivo приводит мышцу в catch-состояние, а фосфорилирование вызывает расслабление мышцы. Согласно «мостиковой» гипотезе catch (Lowy et al, 1964), фосфорилированный твитчин взаимодействует с миозином, в результате чего миозин остается связанным с актином при понижении концентрации кальция, образуя catch-сшивки (Butler et al., 2001). Согласно альтернативной «твитчиновой» гипотезе, твитчин является одновременно и регуляторным и исполнительным белком, образуя независимые catch-сшивки между толстыми и тонкими нитями (Shelud'ko et al., 2004b). Функция миорода остается неясной и в настоящее время не получено доказательств его прямого участия в catch (Shelud'ko et al., 2001; Yamada et al., 2001). Миород является продуктом альтернативного сплайсинга гена тяжелых

<>ОС. i.......

6

цепей миозина и его протеолитическая субструктура, как показано в данной работе, аналогична субструктуре миозина (рис. 1).

Уникальные части.

Общие части

SH АСР^

■МММ

SH ACD,

±=ш

Миород Миозин

X

S1 (головка) S2 (шея)

LMM (хвост)

Рис. 1. Сравнение протеолитических субструктур миорода и миозина. Обозначения: S1 - субфрагмент-1 миозина, S2 - субфрагмент-2 миозина, LMM -легкий меромиозин, SH - Cys722 миорода и соответствующий цистеин миозина, ACD (assembly competence domain) - участок, ответственный за полимеризацию миозина и, соответственно, миорода.

Ввиду очевидного функционального сходства между явлениями catch в запирательных мышцах моллюсков и latch в гладких мышцах позвоночных, не исключено, что существует и сходство молекулярных механизмов этих явлений. Если это так, то один из возможных подходов к выяснению этих механизмов является сравнительное изучение белков гладких мышц позвоночных и беспозвоночных, предположительно принимающих участие в данных явлениях.

Цели и задачи работы

Целью работы было исследование миорода из запирательных мышц моллюсков мидии Грея и телокина из гладких мышц желудков индейки с тем, чтобы расширить существующие представления о свойствах этих белков и их роли в данных мышцах и, возможно, обнаружить между ними сходство во влиянии на актин-миозиновое взаимодействие. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать субструктуру и физико-химические свойства миорода

2. Изучить механизм действия телокина на процессы фосфо-рилирования и дефосфорилирования миозина.

Положения, выносимые на защиту:

1. Протеолитическая субструктура миорода, построенная по результатам ограниченного протеолиза миорода папаином, аналогична миозиновой.

2. Миород в зависимости от условий среды образует различные полимеры: короткие, длинные нитевидные и латеральные агрегаты нитевидных полимеров.

3. Полимеры миорода обладают высокой вязкостью и сильно выраженной тиксотропией.

4. Модификация аминокислоты Суэ722 миорода М-этилмалеимидом полностью ингибирует его полимеризацию, но придает ему способность к агрегации в присутствии

5. Миород фосфорилируется киназой легких цепей миозина из гладких мышц позвоночных. Участок фосфорилирования находится в И-уникальном домене молекулы.

6. Показано влияние телокина на скорость дефосфорилирования миозина гладких мышц позвоночных.

Научная новизна работы

Определена протеолитическая субструктура миорода - нового белка запирательных мышц моллюсков. Показано, что эта субструктура аналогична субструктуре миозина. Предполагается, что уникальный И-концевой домен миорода расположен в межфиламентном пространстве и способен модулировать взаимодействие между толстыми и тонкими нитями. Выявлена сильная зависимость полимеризации миорода от условий среды. Описаны три разновидности полимеров миорода, которые, однако, не включают веретенообразные полимеры, характерные для миозина. Мы предполагаем, что уникальный домен миорода влияет на характер его полимеризации. Установлено, что модификация всего лишь одной аминокислоты (Суз722) в стержневой части миорода радикально меняет его свойства - он теряет способность к полимеризации и приобретает способность к агрегации. Не исключено, что эта аминокислота входит в состав регуляторного домена, воспринимающего конформационные изменения парамиозина, либо других поверхностных белков толстых нитей - миозина и твитчина. Выявлены высокая вязкость и ярко выраженная тиксотропия нитевидных полимеров миорода, в основе чего, как предполагается, лежит способность этих полимеров к латеральной агрегации. Обнаружено, что миород способен фосфорилироваться киназой легких цепей миозина (КЛЦМ) позвоночных, которая отсутствует в мышцах моллюсков, но входит в качестве домена в состав гигантского белка твитчина, регулирующего са^-состояние в мышцах моллюсков. Показано, что киназа в составе твитчина является активной. Предполагается, что миород может быть субстратом этого

киназного домена и принимать участие наряду с твитчином в регуляции запирательного тонуса мышц моллюсков.

Обнаружено, что телокин - белок толстых нитей мышц позвоночных -не только уменьшает скорость фосфорилирования миозина из этих мышц, но и увеличивает скорость дефосфорилирования миозина. Предложен механизм влияния телокина на фосфатазно-киназную активность в данных мышцах.

Научно-практическое значение работы

В работе детально описаны методы выделения и очистки миорода, твитчина и телокина, модификация метода ДСН-электрофореза и метод протеолитического расщепления миорода, которые могут быть использованы в других исследованиях в области биологической подвижности. Предложенные механизмы и интерпретации экспериментальных данных могут быть полезными при изучении механизма регуляции гладких мышц.

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертационной работы были доложены на международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2001,

2004), III Биофизическом съезде (Воронеж, 2004), VIII, IX Международных школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2004, 2005) и ежегодной научной конференции Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток,

2005). По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы из 152 наименований. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста. В диссертации 2 таблицы и 37 рисунков.

Данная работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 01-04-49462 и 05-04-49895), Конкурса проектов ДВО РАН (гранты № 04-Ш-Г-06-034 и 05-Ш-Г-06-078), Программы обменов Австрийской Академии Наук и Фонда содействия отечественной науке (грант конкурса «Лучшие аспиранты РАН»),

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и очистка белков

Миород, твитчин, миозин и тропомиозин выделяли из гладких запирательных (catch) мышц двустворчатых моллюсков Crenomytilus grayanus и Mizuchopecten yessoensis (Shelud'ko et al, 2001, 2004). Модификация этого метода подробно описана в диссертации. Актин

получали из ацетонизированного порошка поперечно-полосатых мышц кролика (Spudich and Watt, 1971).

Телокин, миозин и его протеолитические фрагменты, киназу легких цепей миозина и кальмодулин (СаМ) получали из гладких мышц мускульного желудка индейки (Sobieszek and Bremel, 1975; Sobieszek et al., 1997a).

Чистоту и состав препаратов сократительных белков из гладких мышц моллюсков оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) (Laemmli, 1970) в модификации (Шелудько, 1975). Для исследования низкомолекулярных компонентов гладких мышц позвоночных (телокин, СаМ, легкие цепи) использовали градиентный электрофорез (9-18%) в присутствии ДСН (Sobieszek, 1994).

Концентрацию белков определяли биуретовым методом или методом Бредфорда.

Полимеризация миорода

Миород в 0.5 М KCl сначала разбавляли раствором с высокой ионной силой, а затем раствором с низкой ионной силой так, чтобы получить необходимую ионную силу (20-150 мМ KCl) и концентрацию белка (0.05-1.0 мг/мл) в присутствии 1 мМ NaN3, 0.5 мМ ДТТ и 50 мМ трис-HCl, pH 7.0. Актин и тропомиозин полимеризовали добавлением концентрированных солевых растворов так, чтобы получить такие же условия, как и в случае миорода.

О ходе полимеризации миорода и миозина, в присутствии или в отсутствие добавок, судили по изменению оптической плотности, считая полимеризацию завершенной, после выхода на плато кривой зависимости оптической плотности от времени. Оптическую плотность при 400 нм измеряли посредством спектрофлуориметра Спекол-11 ("Carl Zeiss Jena") с использованием приставки ЕК-1. Средний размер полимерных частиц миорода регистрировали лазерным дифракционным измерителем частиц (Laser Diffraction Particle Sizer ЗбООЕс, Malvern, England).

Для исследования влияния добавок (5 мМ АТФ, 5 мМ MgCl2, 0.5 мМ NEM в разных комбинациях) на полимеризацию миорода и миозина белки в растворе 0.5 М KCl, 0.5 мМ ДТТ, 0.5 мМ ФМСФ, 1 мМ NaN3, 50 мМ трис-HCl, pH 7.0 разбавляли таким же раствором, вводили исследуемые добавки, инкубировали в течение 10 минут, а затем полимеризовали.

Измерение вязкости полимерного миорода

Вязкость при низких градиентах скорости измеряли методом "падающего шарика" (Pollard and Cooper, 1982), а при высоких градиентах посредством капиллярного вискозиметра Уббелоде. В обоих случаях рассчитывали приведенную вязкость %Д/С и характеристическую вязкость

№ (Луд/С)с-о.

Электронная микроскопия

Электронно-микроскопические исследования полимеров/агрегатов миорода проводили на микроскопе JEOL-IOOB при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении 30000*. Суспензии миорода (0.05-0.3 мг/мл) при разных ионных силах наносили на сеточки с коллодиевой пленкой, укрепленной углеродом, и окрашивали 1%-ным водным раствором уранилацетата.

Протеолитическое расщепление миорода

Для исследования протеолитической субструктуры белка, миород подвергали протеолитическому расщеплению папаином в растворах с низкой и высокой ионных силах. Используемые соотношения фермента к миороду -1:100 или 1:30 (по массе), при концентрации миорода 3 мг/мл.

Сооеаждение смесей миозина и телокина в глицериновом градиенте

Глицериновые градиенты были получены медленным добавлением раствора 60 мМ КС1, 2 мМ MgCl2, 0.5 мМ ДТТ, 10 мМ имидазол-HCl, рН 7.5, „содержащего разные концентрации глицерина (10, 25 или 50%), в прозрачную центрифужную пробирку. Суспензии миозина и телокина в различных молярных соотношениях и с требуемыми добавками (0.1 мМ Са2+ или 2.5 мМ ЭГТА) наносили на вершину градиента и центрифугировали при скорости 2000 - 4000 об/мин в течение 4 минут. После центрифугирования пробирки фотографировали на черном фоне.

Фосфорилирование белков in vitro Миозин гладких мышц позвоночных и миород из гладких мышц моллюсков, фосфорилировали в присутствии радиоактивного изотопа [у-32Р] АТФ (0.5-1 мМ) посредством киназы легких цепей миозина и ее активатора кальмодулина в среде, содержащей 0.1 мМ Са2+, при температуре 25°С. Для контроля фосфорилирования белковых препаратов применяли метод авторадиографии. Радиоактивность 32Р-меченных препаратов измеряли методом счета по Черенкову, в импульсах в минуту на счетчике LS-6500 (Beckman, USA).

Для фосфорилирования твитчина гладких мышц моллюсков использовали каталитическую субъединицу протеинкиназы A (Sigma) в присутствии 0.5 мМ АТФ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Протеолитическое расщепление молекулы миорода папаином

Прежде чем исследовать физико-химические свойства миорода мы определили его субструктуру посредством протеолитического расщепления молекулы папаином для изучения свойств фрагментов, которые часто являются доменами, определяющими отдельные свойства белка. Примером является миозин, субструктура которого хорошо известна (рис. 1). Поскольку аминокислотная последовательность миорода более чем на 70% идентична

последовательности миозина (Yamada et al., 2000), представляет интерес определить аналогичным образом субструктуру миорода.

На рисунке 2 показана временная зависимость результатов протеолитического расщепления миорода папаином в растворах, содержащих 50 или 500 мМ KCl. При низкой ионной силе (рис. 2, дорожки 2-7) образуется стабильный нерастворимый фрагмент (100-106 кДа), очевидно являющийся С-концевой стержневой частью миорода. Последующий протеолиз в высокой ионной силе (рис. 2, дорожки 8-13) приводит к образованию другого С-концевого стабильного фрагмента, названного нами «хвост». Этот фрагмент, как можно судить по расчетной молекулярной массе, идентичен LMM миозина, полученному в таких же условиях.

- 50 мМ КС! -3 4 5 6

щ*

- 500 мМ KCl-~Н

9 10 11 12 13

«м

"MR rod -MR teil

0 1 3 6 12 20 30 1 3 6 12 20 30 Время протеолитического расщепления (мин)

Рис. 2. Зависимость протеолитического расщепления полимерного и мономерного миорода мидии от времени. Соотношение папаина к миороду (3 мг/мл) 1:30 (по весу). Реакцию проводили в 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.0), 5 мМ MgCl2 и 0.05 М КС1 (дорожки 2-7) или 0.5 М КС1 (дорожки 8-13). Дорожка 1 - интактный миород.

Протеолитическая субструктура миорода была построена на основании результатов протеолитического расщепления белка папаином (рис. 3). Поскольку миород в мышцах мидии представлен двумя полипептидами - а-миородом (ос-МИ.) и (3-миородом (Р-М11), предлагаемая схема включает оба полипептида, исходя из предположения, что Р-МЯ короче а-МЯ на 69 начальных аминокислот (Уатаёа еС а1., 2000).

В молекуле миорода существует головной домен (аналог 81 фрагмента миозина) и стержневая часть (аналог стержневой части миозина); соединение между ними расщепляется папаином в полимерном миороде. Стержневая часть, в свою очередь, состоит из шейной области (аналог 82 фрагмента

миозина) и хвостового домена (идентичен LMM); соединение между ними расщепляется папаином в мономерном миороде.

Таким образом, несмотря на большое различие между миозином и миородом в молекулярной массе, их субструктуры качественно одинаковы. Полимеризация миорода и свойства его полимеров В С-стержневой части миозина и, соответственно, миорода, присутствует участок ответственный за полимеризацию, так называемый ACD домен (Sohn et al., 1997). Миород способен полимеризоваться в растворах с низкой и физиологической ионной силой, однако свойства его полимеров необычны - полимерный миород сочетает свойства суспензии с низкой оптической плотностью со свойствами вязкого геля. Так, значения приведенной вязкости полимерного миорода, измеренные при низком градиенте скорости, превышают таковые для Ф-актина (рис. 4). Из рисунка 4 следует, что миород является тиксотроным белком - его вязкость зависит от градиента скорости, также, как в случае Ф-актина. Более того, столь высокая чувствительность вязкости к градиенту скорости наводит на мысль о том, что вязкость миорода является структурной вязкостью, которая обычно чувствительна к условиям среды. Наиболее ярко это проявляется при варьировании ионной силы раствора, что приводит к изменению вязкостных свойств полимерного миорода. Интересно, что уменьшение вязкости в интервале 100 - 20 мМ KCl сопровождается зеркальным увеличением размера частиц (рис. 5). Эти процессы, действительно, связаны, поскольку в их основе лежит агрегация полимеров миорода (рис. 6 в).

N

а - head „

а - myorod

Unique part

156 aa, 16.6 kDa

1 23

985 aa, 112.6 kDa Part common to MHC

829 aa, 96.0 kDa

Non - helical tailpiece

.pUji!...;"

Neck

21 aa, 2.3 kDa

Tail ( = LMM) SH

1

119 aa, ' 12.5 kDa

ß - hea(|

228 aa, 26.3 kDa

638 aa, 73.8 kDa EDTA - rod

52 aa, 5.6 kDa

866 aa, 100.1 kDa Mg(2) - rod

881 aa, 101.8 kDa Mg(1) - rod ( = ß - myorod)

919 aa, 105.6 kDa

Рис. 3. Схематичное изображение субструктуры молекулы миорода мидии.

Обозначения: р - потенциальные участки фосфорилирования в N- и С-концевых частях молекулы миорода; Neck - шейная область молекулы миорода; Tail - хвостовая часть молекулы миорода; SH - участок полипептидной цепи миорода, содержащий консервативный цистеиновый (Cys722) остаток; Non-helical tailpiece - неспирализованный участок в С-стержневой части молекулы миорода. Двойными стрелками указаны участки чувствительные к протеолизу папаином.

На рис. б приведены электронные микрофотографии полимеров миорода, полученных при различных ионных силах. Можно выявить 4 типа структур: короткие полимеры (150 мМ KCl), длинные нитевидные полимеры (100 мМ KCl), латеральные агрегаты длинных полимеров (100 мМ KCl) и толстые извитые пучки агрегатов длинных полимеров (50 мМ KCl). Максимальную вязкость имеют нитевидные полимеры в 100 мМ KCl, а низкая вязкость и большой размер частиц в 50 мМ KCl соответствуют крупным пучкам полимеров (рис.5).

Г] уд/С, мл/мг

С, мг/мл

Рис. 4. Характеристическая вязкость миорода, актина и тропомиозина, измеренная при низком (светлые обозначения) и высоком (темные обозначения) градиенте скорости.

Условия: 75 мМ KCl, 1 мМ NaN3, 0.5 мМ ДТТ, 50 мМ Трис-НС1, pH 7.0.

т]уд/С - приведенная вязкость (мл/мг).

Роль уникальной аминокислотной последовательности миорода в его полимеризации

Протеолитическое расщепление полимерного миорода (при низкой ионной силе) сопровождается изменениями оптических свойств его суспензий (рис. 7). На первых этапах протеолиза оптическая плотность увеличивается, что, по-видимому, определяется более высокой агрегационной способностью стержневой части миорода по сравнению с интактным белком. Удаление уникального домена во время обработки

папаином, может приводить к деполимеризации существующих полимеров и образованию новых полимеров стержневой части, обладающих другими оптическими свойствами.

На рис. 7 сравнивается кинетика протеолиза миорода, зарегистрированная по изменению оптической плотности, с кривой изменения его вязкости в процессе протеолиза. Оказывается, что увеличение оптической плотности, отражающее отщепление уникальной последовательности, коррелирует с уменьшением вязкости. Это говорит о том, что высокая вязкость полимеров миорода связана с наличием уникальной части в его молекуле. Кроме того, существуют значительные различия в полимеризации миорода и его стержневой части - миород значительно растворимее своего стержня и его полимеризация, в отличие от стержня, не зависит от ионов магния (данные не представлены).

Все вместе взятое, указывает на то, что «головной» деспирализованный домен, по всей вероятности непосредственно не участвующий в полимеризации, способен радикально модифицировать агрегационные свойства стержневого домена.

Г}уд/С, мл/мг

—I—

150

с1, мкм

г 14 •13 -12 -11 -ю

-9

-8 -7 -6 -5

-4 -3 -2 1

Рис. 5. Влияние ионной силы на приведенную вязкость (7) и размеры частиц (2) миорода. Концентрация белка - 0.3 мг/мл.

КС! [мЩ

Влияние АТФ, и Ъ!-этилмалеимида на полимеризацию миорода При исследовании зависимости полимеризации миорода от условий среды мы обнаружили влияние на процесс его полимеризации ряда веществ: АТФ, ионов магния и И-этилмалеимида (ТЧЕМ).

Известно, что АТФ ингибирует полимеризацию скелетно-мышечного миозина в результате взаимодействия с миозиновым стержнем (Harrington and Himmelfarb, 1972). Такое же ингибирование наблюдается и в случае белков из моллюсков, как миозина, так и миорода. NEM, в отличие от АТФ, ингибирует только полимеризацию миорода. Полимеризация же миозина, судя по оптической плотности, наоборот, усиливается. Присутствие Mg2+ существенно модифицирует действие и АТФ и NEM. Ингибирующее действие АТФ сильно ослабляется, что согласуется с действием Mg2+ATO на скелетно-мышечный миозин (Pinset-Harstron and Truffy, 1979). Внешне такое же действие оказывает Mg2+ и на NEM-модифицированный миород. В присутствии Mg2+ оптическая плотность NEM-модифицированных полимеров миорода превышает контрольное значение, однако более детальные эксперименты показали, что механизм этого влияния иной.

Оказалось, что стимулирующее влияние Mg2+ на полимеризацию NEM-модифицированного миорода сильно зависит от концентрации белка, что обычно характерно не для полимеризации, а для агрегации белков. Действительно, средний размер частиц, которые образует NEM-модифицированный миород в присутствии Mg2+, почти на порядок больше, чем у нативного миорода. Кроме того, суспензия частиц NEM-модифицированного миорода обладает низкой вязкостью в отличие от полимеров нативного миорода. Это указывает на глобулярную форму частиц NEM-модифицированного миорода, что тоже характерно для агрегатов.

Таким образом, модификация миорода NEM приводит к потере им способности к полимеризации, о чем свидетельствует отсутствие оптических изменений в его растворах в условиях полимеризации и очень небольшое количество осаждаемого материала при центрифугировании. Однако NEM-модифицированный миород в присутствии Mg2+ приобретает способность к агрегации, на что указывает образование крупных глобулярных частиц и сильная зависимость этого процесса от концентрации. Очевидно, что столь радикальные изменения в свойствах миорода должны определяться столь же радикальными изменениями в его структуре. Мы полагаем, что эти структурные изменения связаны с SH-доменом миорода, содержащим Cys722. Он находится в С-концевой части молекул миорода и миозина, однако, вне ACD участка, который необходим для полимеризации миозина (Sohn et al., 1997). Это единственный общий цистеин в аминокислотной последовательности трех миородов из различных мышц двух видов моллюсков (Yamada et al, 2000; Perreault-Micale et al., 1996).

Рис. 6. Электронные микрофотографии полимеров миорода, сформированных при разных ионных силах: а - 150 мМ КС1, б - 100 мМ КС1, в - 50 мМ KCL Масштабный отрезок - 0.2 мкм.

D 400

Г) уд/С, мл/мг

-1-1-1-1-

О 20 40 60 80 100

Длительность расщепления, мин

Рис. 7. Изменение вязкости (1) и оптической плотности (2) суспензии миорода в процессе протеолитического расщепления папаином. Условия: 50 мМ КС1, 1 мМ №N3, 0.5 мМ ДТТ, 50 мМ Трис-НС1, рН 7.0; концентрация миорода - 0.3 мг/мл.

Скорее всего, возможная регуляторная роль SH-домена не имеет отношения к регуляции полимеризации миорода in vivo, поскольку он, также как миозин, существует в мышце в виде сополимера с парамиозиновым стержнем. Можно предположить, что регуляторные возможности этого домена реализуются при взаимодействии с парамиозином, который способен интегрировать конформационные изменения поверхностных белков - миозина, миорода и твитчина, например, в результате фосфорилирования, и тем самым регулировать функциональное состояние мышцы.

Фосфорилирование миорода киназои легких цепей миозина

В первичной аминокислотной последовательности миорода выявлены два потенциальных участка фосфорилирования (Yamada et al., 2000). Мы провели поиск киназ, способных фосфорилировать миород для того, чтобы в последующем исследовать свойства такого миорода и сравнить с таковыми нефосфорилированного миорода.

Для исследования возможного фосфорилирования миорода мы использовали несколько киназ: протеин киназу А (РКА), которая присутствует в гладких мышцах моллюсков, киназу легких цепей миозина (КЛЦМ), выделенную из гладких мышц позвоночных, твитчин, который содержит эту киназу в качестве домена, и ERK киназу.

Из всех перечисленных киназ только КЛЦМ заметным образом фосфорилирует миород. Как известно, в гладких мышцах позвоночных КЛЦМ катализирует перенос фосфата на легкие цепи миозина при активировании мышц кальцием. Следует отметить, что в гладких мышцах моллюсков эта киназа не обнаружена.

Фосфорилирование миорода КЛЦМ зависит от условий среды: ионной силы раствора и от концентрации киназы. Обнаружено, что скорость фосфорилирования увеличивается при увеличении ионной силы раствора, достигая максимума при 220 мМ NaCl. Максимальный уровень фосфорилирования достигается при использовании высоких концентраций КЛЦМ (5 мкМ).

Определение локализации участков фосфорилирования в молекуле миорода

Показано, что в первичной аминокислотной последовательности один из участков фосфорилирования в молекуле миорода расположен в С-концевой, миозиноподобной части, в неспирализованном участке (Castellani and Cohen, 1988), другой в N-концевом уникальном домене (Yamada et al., 2000). КЛЦМ фосфорилирует миород только на одном из двух возможных участков, как можно судить исходя из уровня включения

фосфора на молекулу белка, который составляет 0.8 моль/молекулу миорода.

Ранее было обнаружено, что миозин моллюсков фосфорилируется в С-концевом неспирализованном участке эндогенной киназой, выделенной из мышц моллюсков (Castellani and'Cohen, 1987а; Castellani and Cohen, 1988). Исходя из этого, нами была предпринята попытка фосфорилировать миозин гладких мышц мидии Mytilus edulis КЛЦМ позвоночных, однако мы не обнаружили включения метки, что согласуется с литературными данными для миозина из гладких мышц М. edulis, а также для миозина из гладких мышц гребешка Pecten maximus (Cooley et al., 1979). Поскольку миозин и миород имеют одинаковые стержневые части, мы предположили, что участок ответственный за фосфорилирование миорода, находится в N-уникальном домене.

Это предположение согласуется с отсутствием фосфорилирования протеолитического фрагмента миорода, представляющего собой стержневую часть молекулы, аналогичную С-концевому участку миозина (рис.8).

Для исследования фосфорилирования миорода при его N-уникальном домене мы выделили пептиды уникальной последовательности нефосфорилированного миорода, которые фосфорилировались при добавлении КЛЦМ (рис. 9).

Способность миорода фосфорилироваться открывает новый подход для выяснения еще неизвестной функции этого белка в гладких мышцах моллюсков. Хотя КЛЦМ, фосфорилирующая миород, в мышцах моллюсков не обнаружена, она присутствует в качестве домена в твитчине - регуляторном белке запирательных мышц. Однако в присутствии твитчина миород не фосфорилируется, что может быть связано, либо с отсутствием киназной активности КЛЦМ твитчина, либо с неоптимальными условиями активации киназного домена твитчина.

12 3 4

MR -<'

4

Рис. 8. Электрофореграмма (дорожки 1, 3) и соответствующая ей авторадиограмма (дорожки 2, 4) молекулы миорода (дорожки 1, 2) и С-концевой части миорода, полученной протеолитическим расщеплением молекулы миорода папаином (дорожки 3, 4). Концентрация миорода 3 мг/мл. Отношение папаина к миороду по массе 1:100.

Исследование киназной активности твитчииа

Известно, что твитчин из моллюска Aplysia californica, фосфорилирует изолированные регуляторные легкие цепи (РЛЦ) гладкомышечного миозина, в присутствии Са2+/СаМ (Heierhorst et al., 1995). С другой стороны, Фунабара и сотр. (Funabara et al., 2001) не обнаружили киназной активности у твитчина из Mytilus edulis.

Для исследования киназной активности твитчина Crenomytilus gray anus мы использовали РЛЦ миозина гладких мышц желудка индейки как субстрат и Са2+/СаМ в качестве активаторов киназы. На рис. 10 представлены электрофореграмма (рис. 10 А) и соответствующая ей авторадиография (рис. 10 Б), из которых видно, что с увеличением концентрации твитчина возрастает степень фосфорилирования РЛЦ (рис. 10 Б, дорожки 3-5). На авторадиографии мы отметили присутствие полосы на уровне твитчина (рис. 10 Б, дорожка 5). Возможно, ее происхождение связано с авто-фосфорилированием КЛЦМ, входящей в состав твитчина, что согласуется с литературными данными по твитчину из Aplysia californica (Heierhorst et al., 1994; Lei et al., 1994) и указывает на серин/треониновую киназную активность твитчина.

Таким образом, твитчин фосфорилирует легкие цепи миозина позвоночных, из чего следует, что киназный домен твитчина активен. Это означает, что потенциально твитчиновая киназа может фосфорилировать миород, однако оптимальные условия для этого процесса не найдены. Возможно это связано с низкой «концентрацией» киназного домена при фосфорилировании миорода в разбавленных растворах. Поскольку твитчин обладает очень большим молекулярным весом, необходима очень высокая

концентрация твитчина для обеспечения «концентрации» домена.

А . Б

достаточной

1 2 3 4 5 6"?

Рис. 9. Электрофореграмма (А) и соответствующая ей авторадиография (Б) фосфоршшрованиых пептидов Ы-уникального домена. Стрелкой отмечены низкомолекулярные пептиды, полученные с помощью протеолитического расщепления молекулы миорода папаином. Концентрация миорода 3 мг/мл. Отношение папаина к миороду по массе 1:100. Цифры на рисунке соответствуют времени (мин) реакции.

КЛЦМ является очень специфичной и, исключая миород, известно всего два субстрата этой киназы - регуляторные легкие цепи миозина и телокин. Телокин - белок гладких мышц позвоночных, который, также как миород, является белком толстой нити.

Влияние телокина на скорость фосфорилирования и дефосфо-рилироваиия миозина

Телокин входит в состав толстых нитей, с которыми ассоциированы киназа и фосфатаза, и поэтому вполне может быть вовлечен в процессы сокращения и расслабления мышцы.

Известно, что телокин замедляет фосфорилирование миозина (БЬуппзку е! а1., 1993). Предполагается, что ингибирование скорости фосфорилирования миозина является следствием нарушения взаимодействия КЛЦМ с субстратом под действием телокина в результате конкуренции за один участок связывания на миозиновой молекуле (БЬуппзку а1., 1993). Подобная конкуренция должна приводить не только к уменьшению скорости, но и к снижению общего уровня фосфорилирования, который, однако, по нашим данным, остается неизменным. Более того, телокин не ингибирует фосфорилирование Б1 фрагмента миозина, легких цепей и лишь частично ингибирует фосфорилирование НММ. Из этих данных становится очевидно, что предположение о конкурентных взаимоотношениях телокина и киназы не может объяснить всех имеющихся экспериментальных данных.

Влияние телокина на скорость фосфорилирования миозина,

возможно, имеет отношение к изменению структуры миозиновых нитей. Мы обнаружили, что телокин заметно снижает скорость осаждения миозиновых нитей в глицериновом градиенте (рис. 11).

А Б

I 2 3 4 S 12 3 4 5

TW ' * ! . ..!

Рис. 10. Фосфорилирование легких цепей гладкомышечного миозина позвоночных твитчином СгепотуШив &*ауапш. Электрофореграмма (А) и соответствующая ей авторадиограмма (Б). 1 дорожка - твитчин, 2 дорожка -легкие цепи, 3, 4 и 5 дорожки -различные концентрации твитчина (0.075, 0.15 и 0.3 мг/мл, соответственно) при постоянной концентрации легких цепей. Отмечена способность твитчина к автофосфорили-рованию (Б, дорожка 5).

Полученные данные указывают на то, что телокин, по-видимому, способствует частичной дезагрегации миозиновых нитей, что согласуется с результатами Кудряшова и сотр., которые показали, что телокин предотвращает латеральную агрегацию миозиновых нитей (Kudryashov et al., 2002). Мы полагаем, что изменение структуры толстой нити в присутствии телокина способствует удалению киназы, связанной с миозиновыми нитями. Высвобождение киназы, которая переходит в раствор, приводит к последующему уменьшению скорости фосфорилирования миозина. К аналогичному выводу пришли Незнанский и Собешик, которые показали, что телокин может менять степень олигомерности киназы, тем самым ослабляя взаимодействие КЛЦМ с миозиновыми нитями (Nieznanski and Sobieszek, 1997).

Нами показано, что телокин по-разному действует на активность ассоциированных с миозином ферментов - он ингибирует скорость фосфорилирования миозина, тогда как скорость дефосфорилирования, т.е. активность фосфатазы легких цепей миозина (ФЛЦМ), напротив, увеличивает. Это вполне согласуется с идеей Джонсона и Снайдера (Johnson and Snyder, 1995), в которой предполагается, что фосфатаза, в комплексе с киназой легких цепей миозина, неактивна.

1 2 3-4 5 6 7 8

А' 64:1 32:1 16:1 8:1 4:1 2:1 1:1

Рис. П. Осаждение миозина в глицериновом градиенте в присутствии увеличивающихся концентраций телокина. Используемые молярные соотношения указаны под каждой пробой. К - миозин, к которому телокин не добавляли. Смеси центрифугировали 5 мин, 2000 об/мин.

Известно, что киназа и фосфатаза легких цепей миозина образуют функциональный комплекс (ЗоЫеБгек е1 а1., 1997Ь), который, локализован на миозиновых нитях. Возможно, удаление киназы с миозиновых нитей под действием телокина, активирует фосфатазу, обеспечивая увеличение скорости дефосфорилирования регуляторных легких цепей.

Таким образом, телокин может выступать как эффективный модулятор актин-миозинового взаимодействия, поддерживая определенный уровень фосфорилирования в гладкой мышце позвоночных.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что протеолитическая субструктура миорода, построенная по результатам ограниченного протеолиза папаином, аналогична миозиновой. Миород имеет уникальный N-концевой головной домен (аналог S1 миозина) и С-концевую стержневую часть. Стержневая часть, в свою очередь, состоит из «шейного» домена (аналог S2 миозина) и «хвостового» (идентичен LMM миозина).

2. Миород полимеризуется в растворах с физиологической ионной силой. В зависимости от условий среды он способен образовывать различные полимеры: короткие, длинные нитевидные и латеральные агрегаты нитевидных полимеров. Миород не образует миозиноподобные полимеры, несмотря на идентичность участков, ответственных за полимеризацию в молекулах миозина и миорода. Очевидно, что особенности полимеризации миорода определяет его уникальный N-концевой домен.

3. Полимеры миорода обладают высокой вязкостью и тиксотропией, значения которых превышают таковые для фибриллярного актина. Вязкость и тиксотропия миорода в сильной степени зависят от условий образования полимеров. Реологические свойства миорода обусловлены структурной вязкостью его растворов. Модификация N-этилмалеимидом аминокислоты Cys722 миорода полностью ингибирует его полимеризацию, но придает ему способность к агрегации в присутствии Mg2+.

4. Миород фосфорилируется киназой легких цепей миозина из гладких мышц позвоночных. Участок фосфорилирования локализован в N-уникальном «головном» домене. Поскольку киназа легких цепей миозина входит в качестве домена в состав регуляторного белка твитчина, предполагается, что миород является субстратом твитчиновой киназы и наряду с твитчином принимает участие в регуляции запирательного тонуса мышц моллюсков.

5. Телокин, белок гладких мышц позвоночных, влияет на кииазно-фосфатазную активность, ассоциированных с миозином ферментов, регулируя актин-миозиновое взаимодействие. Он не только ингибирует скорость фосфорилирования миозина, но и активирует скорость дефосфорилирования регуляторных цепей фосфатазой легких цепей миозина. Предполагается, что влияние телокина на активность ферментов осуществляется посредством влияния на структуру толстых нитей, с которыми эти ферменты ассоциированы.

Публикации по теме диссертации

1. Shelud'ko N., Permyakova Т., Tuturova К., Tyurina О., Matusovskaya G., Matusovsky О. Properties of myorod, a thick filament protein in molluscan smooth muscles // Abst. Internat. Symp. «Biolog. Motility: New Trends in Research». Pushchino, 2001. P. 135-136.

2. Shelud'ko N.S., Permyakova T.V., Tuturova K.F., Tyurina O.V., Matusovskaya G.G., Matusovsky O.S. Proteolytic substructure of myorod, a thick filament protein of molluscan smooth muscles // Сотр. Biochem. Physiol. Part B. 2002. Vol. 133. P. 69-75.

3. Матусовский O.C., Собешик А. Фосфорилирование миорода, сократительного белка гладких мышц двустворчатых моллюсков // Тез. VIII международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2004. С. 21.

4. Shelud'ko N.S., Matusovskaya G.G., Permyakova T.V., Matusovsky O.S. Twitchin from molluscan catch muscle can interact with actin and thick filament paramyosin core. "Twitchin hypothesis" for the mechanism of catch // Abst. Internat. Symp. «Biolog, Motility: New Trends in Research». Pushcino, 2004. P. 101-102.

5. Шелудько H.C., Пермякова T.B., Матусовская Г.Г., Матусовский О.С. «Твитчиновая» гипотеза запирательного тонуса мышц моллюсков // Тез. III биофизического съезда. Воронеж, 2004. Т.1. С. 152.

6. Shelud'ko N.S., Matusovskaya G.G., Permyakova T.V., Matusovsky O.S. Twitchin, a thick filament protein from molluscan catch muscle, interacts with F-actin in a phosphorylation-dependent way // Arch. Biochem. Biophys. 2004. Vol.432, № 2, P. 269-277.

7. Матусовская Г.Г., Пермякова T.B., Матусовский O.C., Шелудько Н.С. NEM-модификация миорода ингибирует полимеризацию миорода // Биофизика. 2004. Т. 49, № 6. С. 1003-1007.

8. Матусовский О.С., Пермякова Т.В., Матусовская Г.Г., Дроздов A.JL, Шелудько Н.С. Полимеризация миорода - поверхностного белка толстых нитей гладких мышц моллюсков // Биофизика. 2005. Т. 50, № 1. С. 69-74.

9. Sobieszek A., Andruchov O.Y, Grabarek Z., Kulikova N., Liebetrau C., Matusovsky O.S. Modulation of myosin filament activation by telokin in smooth muscle. Liberation of myosin kinase and phosphatase from supramolecular complexes // Biophys. Chem. 2005. Vol. 113. P. 25-40.

10. Матусовский O.C., Матусовская Г.Г. Твитчин, регуляторный белок запирательных мышц моллюсков, взаимодействует с парамиозиновой основой толстых нитей // Тез. IX международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2005. С. 120-121

Соискатель . Матусовский О.С.

Матусовский Олег Самойлович

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИОРОДА И ТЕЛОКИНА, СОКРАТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ ГЛАДКИХ МЫШЦ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Зак. № 613. Формат 60x84 '/,„. Усл. п.л. 1,0. Тираж 100 экз. Подписано в печать 15.11.2005 г. Печать офсстная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО «ДАЛЬПРИБОР». 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел. 32-70-49 (32-44)

fif g 3 3 4

РНБ Русский фонд

2006-4 25897

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Матусовский, Олег Самойлович

Список сокращений и обозначений, принятый в данной работе.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональное разнообразие мышц.

Ш 1.2. Гладкие мышцы моллюсков.

1.2.1. Регуляция сократительного цикла гладких мышц моллюсков. 14 Запирательный тонус (catch) гладких мышц моллюсков.

1.2.2. Миород и твитчин - новые белки запирательных мышц моллюсков.

1.3. Гладкие мышцы мускульного желудка птиц.

1.3.1. Регуляция сократительного цикла гладких мышц мускульного желудка птиц.

Активация киназы и фосфатазы легких цепей миозина.

1.3.2. Телокин - новый регуляторный белок гладких мышц мускульного желудка птиц.

Строение и свойства телокина.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выделение белков из гладких мышц моллюсков.

2.2. Выделение белков из гладких мышц позвоночных.

2.2.1. Выделение миозина.

2.2.2. Выделение регуляторных легких цепей миозина.

2.2.3. Выделение киназы легких цепей миозина и телокина.

2.2.4. Выделение кальмодулина.

Ф 2.3. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле.

2.4. Соосаждение смесей миозина и телокина в глицериновом градиенте.

2.5. Полимеризация миорода.

2.6. Фосфорилирование белков.

Вспомогательные методы.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Исследование физико-химических свойств миорода.

3.1.1. Протеолитическое расщепление миорода папаином.

3.1.2. Особенности полимеризации миорода и свойства его полимеров.

3.1.3. Влияние N-этилмалеимида на полимеризацию миорода.

3.1.4. Фосфорилирование миорода киназой легких цепей миозина.

3.2. Локализация киназы и фосфатазы легких цепей миозина гладких мышц позвоночных.

3.3. Влияние телокина на скорость фосфорилирования и дефосфорилирования миозина.

3.4. Взаимодействие телокина с миозином.

3.5. Влияние телокина на ассоциацию киназы и фосфатазы с толстыми нитями.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Строение молекулы миорода и его локализация.

4.2. Полимеризация миорода и свойства его полимеров.

4.3. Зависимость полимеризации миорода от состояния SH групп.

4.4. Фосфорилирование миорода.

4.4. Возможное участие миорода в запирательном тонусе.

4.5. Телокин — регуляторный белок толстых нитей гладких мышц позвоночных.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические свойства миорода и телокина, сократительных белков гладких мышц"

Актуальность проблемы. В основе сокращения мышц лежит взаимодействие миозина и актина (Huxley and Hanson, 1957), которое стимулируется повышением концентрации кальция в саркоплазме. Последующее снижение концентрации кальция в фазных мышцах приводит к их быстрому расслаблению. В гладких тонических мышцах это расслабление замедлено, что позволяет мышцам некоторое время поддерживать напряжение при незначительном расходе энергии. В случае гладких мышц позвоночных такое состояние называется latch. В гладких мышцах беспозвоночных - двустворчатых моллюсков - это явление (catch) выражено очень ярко. Запирательные мышцы моллюсков могут часами находиться в сокращенном состоянии без признаков утомления. Молекулярные механизмы catch и latch неизвестны и вызывают большой интерес, поскольку их трудно объяснить в рамках бытующих в настоящее время представлений о механизмах биологической подвижности.

В гладких мышцах взаимодействие миозиновых (толстых) и актиновых (тонких) нитей инициируется активированием толстых нитей либо прямым связыванием кальция с легкими цепями миозина (беспозвоночные), либо посредством фосфорилирования легких цепей киназой легких цепей миозина в присутствии кальция (позвоночные). Представляется вероятным, что белки, связанные с толстой нитью, могут модулировать актин-миозиновое взаимодействие, замедляя или приостанавливая расслабление, и тем самым придавать сократительному процессу ту или иную степень тоничности. Такими белками в запирательных мышцах моллюсков могут быть твитчин (Vibert et al., 1993) и миород (Shelud'ko et al., 1998a). Известно, что белок толстых нитей гладких мышц позвоночных - телокин in vitro влияет на скорость фосфорилирования миозина (Shirinsky et al., 1993) и, следовательно, может быть потенциальным модулятором актин-миозинового взаимодействия.

Твитчин, действительно, принимает участие в регуляции catch-состояния мышц моллюсков (Siegman et al., 1998). Его дефосфорилирование in vivo приводит мышцу в catch-состояние, а фосфорилирование вызывает расслабление мышцы. Согласно «мостиковой» гипотезе catch (Lowy et al., 1964), фосфорилированный твитчин взаимодействует с миозином, в результате чего миозин остается связанным с актином при понижении концентрации кальция, образуя catoh-сшивки (Butler et al., 2001). Согласно альтернативной «твитчиновой» гипотезе, твитчин является одновременно и регуляторным и исполнительным белком, образуя независимые catch-сшивки между толстыми и тонкими нитями (Shelud'ko et al., 2004b). Функция миорода остается неясной. Пока не получено доказательств его прямого участия в catch (Shelud'ko et al., 2001; Yamada et al., 2001),

Ввиду очевидного функционального сходства между явлениями catch в запирательных мышцах моллюсков и latch в гладких мышцах позвоночных, не исключено, что существует и сходство молекулярных механизмов этих явлений. Если это так, то один из возможных подходов к выяснению этих механизмов является сравнительное изучение белков гладких мышц позвоночных и беспозвоночных, предположительно принимающих участие в данных явлениях.

Цели и задачи работы. Целью работы было исследование миорода из запирательных мышц мидии Грея и телокина из гладких мышц желудков индейки с тем, чтобы расширить существующие представления о свойствах этих белков и их роли в данных мышцах и, возможно, обнаружить между ними сходство во влиянии на актин-миозиновое взаимодействие. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать субструктуру и физико-химические свойства миорода.

2. Изучить механизм действия телокина на процессы фосфорилирования и дефосфорилирования миозина.

Положения, выносимые на защиту:

1. Установлена протеолитическая субструктура миорода, построенная по результатам ограниченного протеолиза миорода папаином.

2. Миород в зависимости от условий среды образует различные полимеры: короткие, длинные нитевидные и латеральные агрегаты нитевидных полимеров.

3. Полимеры миорода обладают высокой вязкостью и сильно выраженной тиксотропией.

4. Модификация аминокислоты Cys722 миорода N-этилмалеимидом полностью ингибирует его полимеризацию, но придает ему способность к агрегации в присутствии Mg2+.

5. Обнаружено фосфорилирование миорода киназой легких цепей миозина и локализовано место фосфорилирования.

6. Показано влияние телокина на скорость дефосфорилирования миозина гладких мышц позвоночных.

Научная новизна работы. Определена протеолитическая субструктура миорода - нового белка запирательных мышц моллюсков. Показано, что эта субструктура аналогична субструктуре миозина. Предполагается, что уникальный N-концевой домен миорода расположен в межфиламентном пространстве и способен модулировать взаимодействие между толстыми и тонкими нитями. Выявлена сильная зависимость полимеризации миорода от условий среды. Описаны три разновидности полимеров миорода, которые, однако, не включают веретенообразные полимеры, характерные для миозина. Предполагается, что уникальный домен миорода влияет на характер его полимеризации. Установлено, что модификация всего лишь одной аминокислоты (Cys722) в стержневой части миорода радикально меняет его свойства - он теряет способность к полимеризации и приобретает способность к агрегации. Предполагается, что эта аминокислота входит в состав регуляторного домена, воспринимающего конформационные изменения парамиозина, либо других поверхностных белков толстых нитей - миозина и твитчина. Выявлены высокая вязкость и ярко выраженная тиксотропия нитевидных полимеров миорода, в основе чего, как предполагается, лежит способность этих полимеров к латеральной агрегации. Обнаружено, что миород способен фосфорилироваться киназой легких цепей миозина позвоночных, которая отсутствует в мышцах моллюсков, но входит в качестве домена в состав гигантского белка твитчина, регулирующего catoh-состояние в мышцах моллюсков. Показано, что киназа в составе твитчина является активной. Предполагается, что миород может быть субстратом этого киназного домена и принимать участие наряду с твитчином в регуляции запирательного тонуса мышц моллюсков.

Обнаружено, что телокин - белок толстых нитей мышц позвоночных -не только уменьшает скорость фосфорилирования миозина из этих мышц, но и увеличивает скорость дефосфорилирования миозина. Предложен механизм влияния телокина на фосфатазно-киназную активность в данных мышцах.

Научно-практическое значение работы. В работе детально описаны методы выделения и очистки миорода, твитчина и телокина, модификация метода ДСН-электрофореза и метод протеолитического расщепления миорода, которые могут быть использованы в других исследованиях в области биологической подвижности. Предложенные механизмы и интерпретации экспериментальных данных могут быть полезными при изучении механизма регуляции гладких мышц.

Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2001, 2004), III

Биофизическом съезде (Воронеж, 2004), VIII и IX международных школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2004, 2005) и ежегодной научной конференции Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток, 2005). По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Матусовский, Олег Самойлович

выводы

1. Показано, что протеолитическая субструктура миорода, построенная по результатам ограниченного протеолиза папаином, аналогична миозиновой. Миород имеет уникальный N-концевой головной домен (аналог S1 миозина) и С-концевую стержневую часть. Стержневая часть, в свою очередь, состоит из «шейного» домена (аналог S2 миозина) и «хвостового» (идентичен LMM миозина).

2. Миород полимеризуется в растворах с физиологической ионной силой. В зависимости от условий среды он способен образовывать различные полимеры: короткие, длинные нитевидные и латеральные агрегаты нитевидных полимеров. Миород не образует миозиноподобные полимеры, несмотря на идентичность участков, ответственных за полимеризацию в молекулах миозина и миорода. Очевидно, что особенности полимеризации миорода определяет его уникальный N-концевой домен.

3. Полимеры миорода обладают высокой вязкостью и тиксотропией, значения которых превышают таковые для фибриллярного актина. Вязкость и тиксотропия миорода в сильной степени зависят от условий образования полимеров. Реологические свойства миорода обусловлены структурной вязкостью его растворов. Модификация N-этилмалеимидом аминокислоты Cys722 миорода полностью ингибирует его полимеризацию, но придает ему способность к агрегации в присутствии Mg2+.

4. Миород фосфорилируется киназой легких цепей миозина из гладких мышц позвоночных. Участок фосфорилирования локализован в N-уникальном «головном» домене. Поскольку киназа легких цепей миозина входит в качестве домена в состав регуляторного белка твитчина, предполагается, что миород является субстратом твитчиновой киназы и наряду с твитчином принимает участие в регуляции запирательного тонуса мышц моллюсков. Телокин, белок гладких мышц позвоночных, влияет на киназно-фосфатазную активность, ассоциированных с миозином ферментов, регулируя актин-миозиновое взаимодействие. Он не только ингибирует скорость фосфорилирования миозина, но и активирует скорость дефосфорилирования регуляторных цепей фосфатазой легких цепей миозина. Предполагается, что влияние телокина на активность ферментов осуществляется посредством влияния на структуру толстых нитей, с которыми эти ферменты ассоциированы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матусовский, Олег Самойлович, Владивосток

1. Бегшоу, К. Мышечное сокращение // М.: Мир. 1985. С. 126.

2. Бушуева, Т.Л., Теплова, М.В., Бушуев, В.Н., Кудряшов, Д.С., Воротников, А.В., Ширинский, В.П. Стабильность структуры белка КНР (kinase related protein) // Молекулярная биология. 1999. Т. 33, № 2. С. 227-236.

3. Воротников А.В., Крымский, М.А., Ширинский, В.П. Внутриклеточная сигнализация и фосфорилирование белков при сокращении гладких мышц//Биохимия. 2002. Т. 67, № 12. С. 1587-1610.

4. Левицкий, Д.И. Актомиозиновые системы биологической подвижности // Биохимия. 2004. Т. 69, № 11. С. 1147-1462.

5. Орлова, А.А. Сравнительное изучение парамиозинов из запирательных мышц моллюсков в связи с особенностями структуры толстых нитей // Автореф. канд. дис., Пущино. 1990.

6. Пермякова, Т.В. Зависимость свойств синтетического актомиозина от условий его реконструкции // Автореф. канд. дис., Владивосток. 1997.

7. Поглазов, Б.Ф., Левицкий Д.И. Миозин и биологическая подвижность // М.: Наука. 1982. С. 160.

8. Премингер, Н. К. Белковый состав сократительного аппарата мышечных тканей мидии // Биология моря. 1977, № 5. С. 82-84.

9. Хапчаев, А.Ю., Ширинский В.П., Воротников, А.В. Структура, свойства и регуляция белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина // Успехи биологической химии. 2003. Т. 43. С. 365-420.

10. Шелудько, Н.С. Белковый состав миофибрилл кролика, определенный методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия // Цитология. 1975. Т. 17. С. 1148-1152.

11. Шелудько, Н.С., Пермякова, Т.В., Тутурова, К.Ф., Неверкина, О.В. Миород -новый белок толстых нитей гладких мышц двустворчатых моллюсков:выделение и некоторые свойства // Тез. докл. Ш биофиз. съезда. Москва, 1999а. С. 152.

12. Achazi, R.K. Phosphorylation of molluscan paramyosin // Pflugers Arch. 1979. Vol. 379, №2. P. 197-201.

13. Adelstein, R.S., Klee, C.B. Purification and characterization of smooth muscle myosin light chain kinase // J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256. P. 7501-7509.

14. Adelstein, R.S., Sellers, J.R. Myosin structure and function // Biochemistry of smooth muscle contraction. 1996. P. 3-19.

15. Babiychuk, E.B., Babiychuk, V.S., Sobieszek, A. Ca2+/calmodulin-dependent, oligomeric-type modifications // Biochemistry. 1995. Vol. 34, № 19. P. 6366-6372.

16. Bartelt, D.C., Moroney, S., Wolff, D.J. Purification, characterization and substrate specificity of calmodulin-dependent myosin light-chain kinase from bovine brain // Biochem. J. 1987. Vol. 247. P. 747-756.

17. Benian, G.M., Kiff, J.E., Neckelmann, N., Moerman, D.G., Waterston, R.H. Sequence of an unusually large protein implicated in regulation of myosin activity in C. elegans // Nature. 1989. Vol. 342. P. 45-50.

18. Bennett, P.M., Elliott, A. The structure of the paramyosin core in molluscan thick filaments // J. Muscle Res. Cell Motil. 1981. Vol. 2, № 1. P. 65-81.

19. Butler, T.M., Mooers, S.U., Li, C.Q., Narayan, S., Siegman, M.J. Regulation of catch muscle by twitchin phosphorylation: Effects on force, ATPase, and shortening // Biophys. J. 1998. Vol. 75, № 4. P. 1904-1914.

20. Butler, T.M., Narayan, S.R., Mooers, S.U., Hartshorne, D.J., Siegman, M.J. The myosin cross-bridge cycle and its control by twitchin phosphorylation in catch muscle //Biophys. J. 2001. Vol. 80. P. 415-426.

21. Castellani, L., Cohen, C. Myosin rod phosphorylation and the catch state of molluscan muscles // Science. 1987a. Vol. 235. P. 334-337.

22. Castellani, L., Cohen, C. Rod phosphorylation favors folding in a catch muscle myosin // Proc. Natl. Acad. Sci. 1987b. Vol. 84, № 12. P. 4058-4062.

23. Ther. 1992. Vol. 55, № 2. P. 95-148. Chi, R.J., Olenych, S.G., Kim, K., Keller, T.C.S. Smooth muscle a-actinin interaction with smitin // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2005. Vol. 37. P. 14701482.

24. Cohen, C., Castellani, L. New perspectives on catch // Сотр. Biochem. Physiol.

25. Csizmadia, A.M., Bonetkerrache, A., Nyitray, L., Mornet, D. Purification and properties of caldesmon-like protein from molluscan smooth muscle // Сотр. Biochem. Physiol. PartB. 1994. Vol. 108, № 1. P. 59-63.

26. Ebashi, E., Endo, M., Ohtsuki, I. Control of muscle contraction // on Quart. Rev.

27. Biophys. 1969. Vol. 2. P. 351-384. Edelman, A.M., Blumenthal, D.K., Krebs, E.G. Protein serine/threonine kinases //

28. Elliott, A. The arrangement of myosin on the surface of paramyosin filaments in the white adductor muscle of Crassostrea angulata II Рос. Roy. Soc. Lond. 1974. Vol. 186(B). P. 53-66.

29. Elliott, A., Bennett, P.M. Structure of the thick filaments in molluscan adductor muscle // In: Basic Biology of muscle: a comparative approach, ed. by B. Twarog, R. Levine, M. Dewey, Raven Press, N.-Y. 1982. P. 11-27.

30. Fahrmann, M., Fonk, I., Beinbrech, G. The kinase activity of the giant projectin of the flight muscle of Locusta migratoria II Insect Biochem. Mol. Biol. 2002. Vol. 32, P. 1401-1407.

31. Filenlco, A.M., Danilova, V.M., Sobieszek, A. Smooth muscle myosin light chain kinase, supramolecular organization, modulation of activity, and related conformational changes // Biophys. J. 1997. Vol. 73. P. 1593-1606.

32. Funabara, D., Kinoshita, S., Watabe, S., Siegman, M.J., Butler, T.M. Phosphorylation of molluscan twitchin by the cAMP-dependent protein kinase // Biochemistry. 2001. Vol. 40, № 7. P. 2087-2095.

33. Gallagher, P.J., Herring, B.P. The carboxyl terminus of the smooth muscle myosin light chain kinase is expressed as an independent protein, telolcin // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 23945-23952.

34. Gallagher, P.J., Herring, B.P., Griffin, S.A., Stull, J.T. Molecular characterization of a mammalian smooth muscle myosin light chain kinase // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 23936-23944.

35. Gallagher, P.J., Herring, B.P., Stull, J.T. Myosin light chain kinases // J. Muscle Res. Cell Motil. 1997. Vol. 18. P. 1-16.

36. Galler, S., Kogler, H., Ivemeyer, M., Ruegg, J.C. Force responses of skinned molluscan catch muscle following photoliberation of ATP // Pflugers Arch. 1999. Vol. 438, № 4. P. 525-530.

37. Galler, S., Hopflinger, M.C., Andruchov, O., Andruchova, E., Grassberger, H. Effects of vanadate, phosphate and 2,3-butanedione monoxime (BDM) on skinned molluscan catch muscle // Pflugers Arch. 2005. Vol. 449, № 4, P. 372-383.

38. Heierhorst, J., Tang, X., Lei, J., Probst, W.C., Weiss, K.R., Kemp, B.E. Substrate specificity and inhibitor sensitivity of Ca2+/S 100-dependent twitchin kinases // Eur. J. Biochem. 1996b. Vol. 242, № 3. P. 454-459.

39. Heierhorst, J., Mann, R.J., Kemp, B.E. Interaction of the recombinant S100A1 protein with twitchin kinase, and comparison with other Ca2+-binding proteins // Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 249, №1.P. 127-133.

40. Holden, H.M, Ito, M., Hartshorne, D.J., Rayment, I. X-ray structure determination of telokin, the C-terminal domain of myosin light chain kinase, at 2.8 A resolution // J. Mol. Biol. 1992. Vol. 227. P. 840-851.

41. Hoppe, P.E., Waterston, R.H. A region of the myosin rod important for interaction with paramyosin in Caenorhabditis elegans striated muscle // Genetics. 2000. Vol. 156, № 2. P. 631-643.

42. Hu, S.H., Lei, J.Y., Wilce, M.C., Valenzuela, M.R., Benian, G.M., Parker, M.W., Kemp, B.E. Crystallization and preliminary X-ray analysis of the auto-inhibited twitchin kinase // J. Mol. Biol. 1994a. Vol. 236, № 4. P. 12591261.

43. Hu, S.H., Parker, M.W., Lei, J.Y., Wilce, M.C., Benian, G.M., Kemp, B.E. Insights into autoregulation from the crystal structure of twitchin kinase // Nature. 1994b. Vol. 369, № 6481. P. 581-584.

44. Janes, D.P., Patel, H., Chantler, P.D. Primary structure of myosin from the striated adductor muscle of the Atlantic scallop, Pecten maximus, and expression of the regulatory domain // J. Muscle Res. Cell Motil. 2000. Vol. 21. P. 415422.

45. Johnson, J.D., Snyder C.H. Calcium regulation of smooth muscle contractile protein // In: Advances in second mesenger and phosphoprotein research, ed. by Means, A.R, Raven Press, N.-Y. 1995. P. 153-174.

46. Kemp, B.E., Pearson, R.B., Guerriero, Jr.V., Bagchi, I.C., Means, A.R. The calmodulin binding domain of chicken smooth muscle myosin light chain kinase contains a pseudosubstrate sequence // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. P. 2542-2548.

47. Kendrick-Jones, J., Lehman, W. Regulation in molluscan muscles // J. Mol. Biol. 1970. Vol. 54. P. 313-326.

48. Kim, K., Keller, T.C.S. Smitin, a novel smooth muscle titin-like protein, interacts with myosin filaments in vivo and in vitro // J. Cell Biol. 2002. Vol. 156. P. 101-111.

49. Klee, C.B., Krinlcs, M.H. Purification of cyclic 3',5'-nucleotide phosphodiesterase inhibitory protein by affinity chromatography on activator protein coupled to Sepharose//Biochemistry. 1978. Vol. 17. P. 120-126.

50. Knighton, D.R., Pearson, R.B., Sowadslci, J.M., Means, A.R., Ten Eyck, L.F., Taylor, S.S., Kemp, B.E. Structural basis of the intrasteric regulation of myosin light chain kinase // Science. 1992. Vol. 258. P. 130-135.

51. Kondo, S., Morita, F. Smooth muscle of scallop adductor contains at least two kinds of myosin // J. Biochem. (Tokyo). 1981. Vol. 90, № 3. P. 673-681.

52. Mayans, O., van der Wilm, M., Mues, A., Young, P., Furst, D.O., Wilmanns, M., Gautel, M. Structural basis for activation of the titin kinase domain during myofibrillogenesis //Nature. 1998. Vol. 395, № 6705. P. 863-869.

53. McLachlan, A.D., Karm, J. Periodic features in the amino acid sequence of nematode myosin rod // J. Mol. Biol. 1983. Vol. 164, № 5. P. 605-626.

54. Miller, G., Musa, H., Gautel, M., Peckham, M. A targeted deletion of the C-terminal end of titin, including the titin kinase domain, impairs myofibrillogenesis // J. Cell. Sci. 2003. Vol. 116, № 23. P. 4811-4819.

55. Moerman, D.G., Benian, G.M., Barstead, R.J., Schriefer, L.A., Waterston, R.H. Identification and intracellular localization of the unc-22 gene product of Caenorhabditis elegans II Genes Dev. 1988. Vol. 2, № 1. P. 93-105.

56. Nieznanski, K., Sobieszek, A. Telokin (kinase-related protein) modulates the oligomeric state of smooth-muscle myosin light-chain kinase and its interaction with myosin filaments // Biochem. J. Part 1. 1997. Vol. 322. P. 65-71.

57. Nunnally, M.H., Stull, J.N. Mammalian skeletal muscle myosin light chain kinases. A comparison by antiserum cross-reactivity // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259, №3. P. 1776-1780.

58. Oosawa, F. Physical chemistry of actin past, present and future // Biophys. Chem. 1993. Vol. 47, №2. P. 101-111.

59. Perry, S.V., Davies, V., Hayter, D. "Natural" tropomyosin and the factor sensitizing actomyosin adenosine-triphosphatase to ethylenedioxybis-(ethyleneamino)-tetraacetic acid // Biochem. J. 1966. Vol. 99. P. lc-2c.

60. Pinset-Harstron, I., Truffy, J. Effect of adenosin triphosphate, inorganic phosphate and divalent cations on the size and structure of synthetic myosin filaments //J. Mol. Biol. 1979. Vol. 134, № 1. P. 173-188.

61. Pires, E., Perry, S.V., Thomas, M.A. Myosin light-chain kinase, a new enzyme from striated muscle // FEBS Lett. 1974. Vol. 41. P. 292-296.

62. Pollard, T.D., Cooper, J.A. Methods to characterize actin filament networks //

63. Shelud'ko, N.S., Kropacheva, I.V. Turbidity of myofibril and actomyosin suspensions and its change by ATP // J. Colloid Interface Sci. 1996. Vol. 179. P. 194-200.

64. Silver, D.L., Vorotnikov, A.V., Watterson, D.M., Shirinsky, V.P., Sellers, J.R. Sites of interaction between lcinase-related protein and smooth muscle myosin // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, № 40. P. 25353-25359.

65. Silverman, R., Eisenberg, E., Kielley, W.W. Interaction of SHI-blocked HMM with actin and ATP // Nature New Biol. 1972. Vol. 240. P. 207-208.

66. Sobieszek, A., Bremel, R.D. Preparation and properties of vertebrate smooth-muscle myofibrils and actomyosin // Eur. J. Biochem. 1975. Vol. 55. P. 4960.

67. Sobieszek, A., Small, J.V. Regulation of the actin-myosin interaction in vertebrate smooth muscle: activation via a myosin light-chain kinase and the effect of tropomyosin // J. Mol. Biol. 1977. Vol. 112. P. 559-576.

68. Sobieszek, A. Phosporylation reaction of vertebrate smooth muscle myosin: an enzyme kinetic analysis //Biochemistry. 1985. Vol. 24, № 5. P. 1266-1274.

69. Sobieszek, A. Bulk isolation of the 20,000-Da light chain of smooth muscle myosin: separation of the unphosphorylated and phosphorylated species // Analyt. Biochem. 1988. Vol. 172. P. 43-50.

70. Sobieszek, A. Smooth muscle myosin as a calmodulin binding protein. Affinity increase on filament assembly // J. Muscle Res. Cell Motil. 1990. Vol. 11. P. 114-124.

71. Sobieszek, A. Regulation of smooth muscle myosin light chain kinase allosteric effects and co-operative activation by calmodulin // J. Mol. Biol. 1991. Vol. 220, № 4. P. 947-957.

72. Sobieszek, A. Regulation of myosin light chain kinase: kinetic mechanism autophosphorylation, and cooperative activation by Ca2+ and calmodulin // Canadian J. Physiol. Pharmacol. 1994. Vol. 72, № 11. P. 1368-1376.

73. Sobieszek, A., Andruchov, O.Y., Nieznanski, K. Kinase-related protein (telokin) is phosphorylated by smooth-muscle myosin light-chain kinase and modulates the kinase activity // Biochem. J. Part 2. 1997a. Vol. 328. P. 425-430.

74. Sobieszek, A., Borkowski, J., Babiychuk, V.S. Purification and characterization of a smooth muscle myosin light chain kinase-phosphatase complex // J. Biol. Chem. 1997b. Vol. 272, № 11. P. 7034-7041.

75. Sohma, H., Inoue, K., Morita, F. A cAMP-dependent regulatory protein for RLC-a myosin kinase catalyzing the phosphorylation of scallop smooth muscle myosin light chain // J. Biochem. (Tokyo). 1988a. Vol. 103, № 3. P. 431435.

76. Sohma, H., Sasada, H., Inoue, K., Morita, F. Regulatory light chain-a myosin kinase (aMK) catalyzes phosphorylation of smooth muscle myosin heavy chains of scallop Patinopecten yessoensis II J. Biochem. 1988b. Vol. 104, № 6. P. 889-893.

77. Sohn, R.L., Vikstrom, K.L., Strauss, M., Cohen, C., Szent-Gyorgyi, A.G., Leinwand, L.A. A 29 residue region of the sarcomeric myosin rod is necessary for filament formation // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 266, № 2. P. 317-330.

78. Somlyo, A.P., Somlyo, A.V. Ca sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: Modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase // Physiol. Rev. 2003. Vol. 83, № 4. P. 1325-1358.

79. Spudich, J.A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction // J. Biol. Chem. 1971. Vol. 246. P. 4866-4871.

80. Standiford, D.M., Davis, M.B., Miedema, K., Franzini-Armstrong, C., Emerson, C.P. Myosin rod protein: A novel thick filament component of Drosophila muscle // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 265. P. 40-55.

81. Sugi, H., Iwamoto, H., Shimo, M., Shirakawa, I. Evidence for load-bearing structures specialized for the catch state in Mytilus smooth muscle // Сотр. Biochem. Physiol. Part A. 1999. Vol. 122, № 3. P. 347-353.

82. Suzuki, H., Onishi, H., Takahashi, K., Watanabe, S. Structure and function of chicken gizzard myosin//J. Biochem. 1978. Vol. 84. P. 1529-1542.

83. Szent-Gyorgyi, A.G., Cohen, C., Kendrick-Jones, J. Paramyosin and the filaments of molluscan 'catch' muscles 2. Native filaments: Isolation and characterization//J. Mol. Biol. 1971. Vol. 56. P. 239-258.

84. Szent-Gyorgyi, A.G., Szentkiralyi, E.M., Kendrick-Jones, J. The light chains of scallop myosin as regulatory subunits // J. Mol. Biol. 1973. Vol. 74, № 2. P. 179-203.

85. Szent-Gyorgyi, A.G., Chantler, P.D. Control of contraction by calcium binding to myosin // In: A. Engel, C. Franzini-Annstrong, C. (eds). Myology, McGraw-Hill, N.-Y. 1994. P. 506-528.

86. Szent-Gyorgyi, A.G., Kalabokis, V.N., Perreault-Micale, C.L. Regulation by molluscan myosins //Mol. Cell. Biochem. 1999. Vol. 190. P. 55-62.

87. Szymanski, P.T. Calponin (CaP) as a latch-bridge protein a new concept in regulation of contractility in smooth muscles // J. Muscle Res. Cell Motil. 2004. Vol. 25. P. 7-19.

88. Tang, D.C., Stull, J.S., Kubota, Y., Kamm, K.E. Regulation of the Ca dependence of the smooth muscle contraction // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267, № 12. P. 11839-11845.

89. Trybus, K.M., Huiatt, T.W., Lowey, S. A bent monomeric conformation of myosin from smooth muscle // Proc. Natl. Acad. Sci. 1982. Vol. 79. P. 6151-6155.

90. Tskhovrebova, L., Triniclc, J. Titin: Properties and family relationships // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003. Vol. 4, № 9. P. 679-689.

91. Twarog, B.M., Muneolca, J. Calcium and the control of contraction and relaxation in a molluscan catch muscle // Cold Spring Harbor Symp. on Quantitative Biology. 1973. Vol. 37. P. 489-504.

92. Twarog, B.M. Aspects of smooth muscle function in molluscan catch muscle // Physiol. Rev. 1976. Vol. 56, № 4. P. 829-838.

93. Vanberlcum, M.F.A., Means, A.R. Three amino acid substitutions in domain-I of calmodulin prevent the activation of chicken smooth muscle myosin light chain kinase//J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266, № 32. P. 21488-21495.

94. Vibert, P., Edelstein, S.M., Castellani, L., Elliott, B.W. Mini-titins in striated and smooth molluscan muscles: structure, location and immunological crossreactivity // J. Muscle Res. Cell Motil. 1993. Vol. 14, № 6. P. 598-607.

95. Watabe, S., Tsuchiya, Т., Hartshorne, D. Phosphorylation of paramyosin // Сотр. Biochem. Physiol. 1989. Vol. 94B. P. 813-821.

96. Weitkamp, В., Jurlc, K., Beinbrech, G. Projectin-thin filament interactions and modulation of the sensitivity of the actomyosin ATPase to calcium by projectin kinase // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, №31. P. 19802-19808.

97. Yamada, A., Yoshio, M., Nalcayama, H. Bi-directional movement of actin filaments along long bipolar tracks of oriented rabbit skeletal muscle myosin molecules // FEBS Lett. 1997. Vol. 409, № 3. P. 380-384.

98. Yamada, A., Yoshio, M., Oiwa, K., Nyitray, L. Catchin, a novel protein in molluscan catch muscles, is produced by alternative splicing from the myosin heavy chain gene // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 295, №> 2. P. 169-178.

99. Yamada, A., Yoshio, M., Kojima, H., Oiwa, K. An in vitro assay reveals essential protein components for the "catch" state of invertebrate smooth muscle // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. Vol. 98, № 12. P. 6635-6640.

100. Yamada, A., Yoshio, M., Nalcamura, A., Kohama, K., Oiwa, K. Protein phosphatase 2B dephosphorylates twitchin, initiating the catch state of invertebrate smooth muscle // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 39. P. 40762-40768.