Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие белка теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (Hsp90) с некоторыми сократительными и цитоскелетными белками
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие белка теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (Hsp90) с некоторыми сократительными и цитоскелетными белками"
Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова
Биологический факультет
На правах рукописи
Ма Юйшу
РГБ ОД
1 7 АПР 2000
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА С МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 90 кДа 0ЕЬр9О) С НЕКОТОРЫМИ СОКРАТИТЕЛЬНЫМИ И ЦИТО СКЕЛЕТНЫМИ ВЕЖАМИ
03.00.04 - биологическая химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2000
Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова.
Научный руководитель: доктор биологических наук,
профессор Гусев Н.Б.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Левицкий Д.И.
доктор биологических наук Ширинский В.П.
Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН
Защита состоится 15 мая 2000 года в 1530 на заседании диссертационного совета Д.053.05.32 по адресу: 119899 Москва, Воробьевы Горы, Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, аудитория ББА.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета.
Автореферат разослан 0 / апреля 2000 года.
Ученый секретарь Диссертационного Совета, .
кандидат биологических наук — Медведева М.В.
05У./, 0
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Цитоскелет и сократительный аппарат играют ясную роль в нормальной жизнедеятельности клеток. Цитоскелет является [соко динамичной структурой, подверженной постоянным процессам сборки и зборки. Различные белки-компоненты дитоскелета и сократительного аппарата льно отличаются по времени своей жизни и скорости обмена. Поэтому в юцессе жизнедеятельности постоянно происходит обновление и замена старых мпонентов на новые. При физиологических условиях многие белки дитоскелета сократительного аппарата (такие как тропонин I и тропонин Т, а также льпонин) обладают выраженной склонностью к агрегации. Поэтому остается не всем понятным, как эти белки транспортируются от мест синтеза к местам их >стоянного функционирования. До сих пор довольно загадочным остается трос о том, как происходит высоко упорядоченная сборка сложных «молекулярных комплексов, которые являются основой как дитоскелета, так и 1кратительного аппарата.
В клетках эукариот как в нормальных условиях, так и особенно после ресса синтезируется несколько классов белков теплового шока (heat shock oteins, hsp), которые способствуют правильному котрансляционному юрачиванию полипептидных цепей, препятствуют агрегации частично ;натурированных белков, участвуют в транспорте белковых молекул к местам их значения и способствуют сборке надмолекулярных комплексов. Белок :плового шока с молекулярной массой 90 кДа (hsp90) синтезируется в большом >личестве в клетках при нормальных условиях и на долю hsp90 может отходиться до 2% растворимых белков [Lai et al., 1984]. Hsp90 способен ¡аимодействовать с F-актином [Koyasu et al., 1986], белками цитоскелета [Czar et ., 1996], рецепторами стероидных гормонов [Büchner, 1999] и некоторыми ротеинкиназами [Pratt, 1997]. Hsp90 обладает шаперонной активностью и таствует в сворачивании своих белков-мишеней. Все эти свойства делают hsp90 цним из кандидатов, которые могли бы участвовать в сборке дитоскелета и экратительного аппарата.
Целью данной работы было исследование взаимодействия hsp9( некоторыми белками цитоскелета и сократительного аппарата. В соответстви этой основной целью были поставлены следующие основные задачи: разработать модифицированный метод выделения hsp90, 2) исследот взаимодействие hsp90 с несколькими цитоскелетными и сократительнь белками и выявить возможные белки-мишени для hsp90, 3) подро! проанализировать взаимодействие hsp90 с калытонином и локализовать учас двух белков, вовлеченные в образование комплекса, 4) изучить влияние hsp90 взаимодействие кальпонина с глобулярным и фибриллярным актином.
Научная новизна и практическая значимость работы. Разработ модифицированная процедура выделения hsp90 из печени кролика, и с помои трех хроматографических стадий получены препараты высоко очищенного hsp1
Установлено, что изолированный hsp90 не взаимодействует с димерн (или тетрамерным) десмином и не влияет на полимеризацию десмина. По луч с свидетельства того, что hsp90 взаимодействует с тропонином С и тропонино скелетных мышц.
Обнаружено, что кальпонин гладких мышц образует прочные комплекс; hsp90. В формировании комплекса принимают участие N-концевой фрагм (остатки 7-144) кальпонина, а также крупные N-концевые и централы (начинающийся с остатков 392/400) пептиды hsp90. Впервые показано, что hs] препятствует полимеризации G-актина, индуцируемой кальпонин Установлено, что hsp90 частично препятствует вызываемой кальпонин агрегации нитей актина.
Высказано предположение, что кальпонин может быть одним из белк субстратов hsp90 in vivo и что взаимодействие кальпонина с hsp90 может игр определенную роль в формировании цитоскелета и сократительного аппар клетки.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были долож« на международной конференции «Структура белка, стабильность и свертывая Фундаментальные и медицинские приложения» (Москва, 1998),
ждународной конференции «Биологическая подвижность: современные методы следования» (Пущино, 1998), на II съезде Биофизиков России (Москва, 1999), а кже на 27 и 28-ом Европейских мышечных конгрессах в Лунде (Швеция) в 1998 и в Йорке (Англия) в 1999 г.
Публикации. По материалам работы опубликовано 5 тезисов и 3 статьи.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, зора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных зультатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на
_ страницах машинописного текста, содержит _ рисунков и _ таблиц.
1исок литературы включает_источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Методы получения белков. Hsp90 из печени кролика выделяли по »дифицированной нами методике Ионезава и соавт. [Yonezawa et al., 1988]. шьпонин, тропомиозин и десмин выделяли из мускульного желудка уток по :тодам, описанным в литературе [Takahashi et al., 1986; Geisler, Weber, 1980]. пин из скелетных мышц кролика выделяли по методу Парди и Спудича [Pardee, ludich, 1982].
Методы получения и анализа пептидов. Ограниченный трипсинолиз hsp90 юводили по ранее описанной методике [Lees-Miller, Anderson, 1989]. Пептиды >двергали электрофорезу в ПААГ в присутствии SDS, переносили на PVDF-гмбрану и определяли N-концевуго последовательность на секвенаторе 477 А Lpplied Biosystems). Автор благодарен проф. Дж.Коллинзу (Университет штата эриленд, США) и А.А.Тагаеву (Институт биоорганической химии РАН) за юведение опытов по секвенированию пептидов hsp90. Ограниченный шотрипсинолиз кальпонина проводили по методу Мецгуельди и соавт. lezgueldi et al., 1992].
Методы изучения белок-белковых взаимодействий. При использовании гтода химического «сшивания» смесь двух белков обрабатывали растворимым 1рбодиимидом в присутствии N-гидроксисукцинимида [Vandekerckhove et al., >89] и следили за формированием ковалентных комплексов двух белков с
помощью электрофореза в ПААГ в присутствии SDS. При использовании ми нативного электрофореза о взаимодействии исследуемых белков судили по влиянию на электрофоретическую подвижность белка-партнера [Medvedeva et 1997]. При использовании метода хроматографии по сродству на Вг( активированной Сефарозе иммобилизовали один из белков и анализировали взаимодействие со вторым белком или со смесью протеолитических фрагмен второго белка. Этот подход был использован и для картирования учасп вовлеченных в формирование контактов двух белков-партеров.
Для изучения взаимодействия кальпонина с F-актином использовали ме двух стадийного центрифугирования. С помощью кратковременного ни скоростного центрифугирования отделяли пучки от отдельных актино! филаментов, а с помощью последующего ультрацентрифугирования собир отдельные актиновые филаменты. Анализ состава белков, остающихся супернатанте после центрифугирования, а также белков соосаждающихс: отдельными актиновыми филаментами или их пучками позволяет исслсдое взаимодействие кальпонина с актином [Kolakowski et al., 1995], а та] анализировать влияние hsp90 на этот процесс.
Оптические методы были использованы для регистрации проце полимеризации актина и десмина. За полимеризацией актина и десмина след по увеличению светорассеяния под углом 90° при 340 нм [Cooper, Pollard, IS Khaitlina et al., 1997] на спектрофлуориметре Hitachi F-3000. Аналогичный ме был использован для анализа взаимодействия hsp90 с кальпонином и десмин Флуоресцентная спектроскопия была использована для регистрации кинет; полимеризации G-актина, ковалентно модифицированного N-пирен иодацетамидом [Criddle et al., 1985]. Флуоресценцию пиренильного оста возбуждали светом с длиной волны 365 нм и регистрировали при 407 нм.
Электронная микроскопия была использована для анализа структз пучков нитей актина и отслеживания процесса полимеризации актина. Обра; контрастировали уранилацегатом и анализировали под электрона микроскопом JEM 100СЕ. Автор благодарен А.В.Воротникову (Ннсти
спериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-юизводственного комплекса МЗ РФ) за помощь в проведении опытов по ектронной микроскопии.
Электрофорез белков и пептидов в ПЛАТ в присутствии SDS проводили по ;тоду Лэммли [Laemmli, 1970]. Гели окрашивали серебром или Куммасси R-250 сканировали на денситометре LKB Ultrascan XL.
Концентрацию белков определяли либо спектрофотометрически, либо по ;тоду Спектора [Spectoi, 1978].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выделение hsp90 из печени кролика. Взяв за основу описанную в ггературе методику выделения hsp90 [Yonezawa et al., 1988], мы разработали одифицированную процедуру выделения. Модификации касались первой эоматографической стадии очистки. Было установлено, что использование енил-сефарозы вместо бутил-сефарозы, применявшейся в оригинальной етодике, позволяет уже на первых стадиях повысить очистку исследуемого глка. Использование Q-сефарозы вместо ДЭАЭ-целлюлозы также обеспечило олее эффективную очистку hsp90. Было обнаружено, что с hsp90 соочищается ругой белок с близкой молекулярной массой. Полного разделения этих белков дается достичь только после хроматографии на гидроксилапатите. Успешное ыделение hsp90 возможно только из свежей ткани. Препараты белка, ыделенные из мороженой печени, были склонны к агрегации и не выдерживали аже однократного цикла замораживания-оттаивания. Разработанная методика озволяет с помощью трех хроматографических стадий получить гомогенный репарат hsp90 с выходом около 15 мг из 100 г ткани.
Изучение взаимодействия hsp90 с десмином. Данные литературы видетельствуют о том, что в ряде случаев hsp90 может располагаться на ромежуточных филаментах [Fostinis et al., 1992; Czar et al., 1996]. В этой связи южно было предположить, что hsp90 окажется способным взаимодействовать с ;есмином, одним из основных белков промежуточных филаментов гладких 1ышц. Используя метод светорассеяния, мы установили, что hsp90 не способен
взаимодействовать с димерным (тетрамерным) десмином. Увеличе светорассеяния, происходящее при подамеризации десмина и индуцирован добавлением солей двухвалентных металлов, происходило с одинако скоростью и достигало одинаковых величин как в присутствии, так и в отсутст Ьзр90. Это свидетельствовало против прямого взаимодействия Ьзр90 с димерн (тетрамерным) десмином. В полном согласии с этим выводом находя результаты, полученные методом ультрацентрифугирования. Добавление ЬБр9С оказывало существенного влияния на степень полимеризации десмина и поэте количество димерного (тетрамерного) десмина, остающегося в супернатанте также количество полимерного десмина, переходящего в осадок, мало зависело присутствия Ьзр90 (рис.1).
Рис.1. Исследование взаимодействия Ьзр90 с десмином метем ультрацентрифугирования. К 3,6 цМ десмина в 10 мМ трис-ацетате (рН 8 добавляли разные количества димера ЬзрЭО. Полимеризацию десм1 инициировали добавлением М§СЬ до конечной концентрации 5 мМ. Белков состав осадков и супернатантов, полученных после ультрацентрифугирован анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии \ — исход] смесь белков, э - сулернатанты и р - осадки после ультрацентрифугирования, гели наносили образцы, содержащие 10% суммарного сулернатанта и 3' суммарного осадка. Цифры над треками соответствуют номерам проб, при эт пробы 1-7 содержали 3,6 цМ десмина и 0; 0,45; 0,9; 1,35; 1,8; 2,7 и 3,6 цМ дим< ЬврЭО соответственно. Проба 8 содержала 1,8 цМ изолированного димера Ьзр90
Следует отметить, что при высоких концентрациях ЬэрЭО мой соосаждаться с полимеризованным десмином (пробы 5-7). С этим может бь связана описанная в литературе локализация Ьэр90 на промежуточн филаментах. Однако даже при очень высоких концентрациях Ьзр90 практичес не влиял на полимеризацию десмина, а количество ЬэрЭО в оса; полимеризованного десмина было очень незначительным.
1_ 2 3 4__5__б__7__8
в р I £ р 1 в р I в р 1 5 р 1 Э р 1 Э 0 ] 5
—Ьэр90
детин
Использование метода «нулевой» химической сшивки для скрининга тоскелетных и сократительных белков, способных взаимодействовать с э90. Для поиска возможных мишеней hsp90 среди цитоскелетных и фатительных белков мы использовали метод химического «сшивания», пользуя этот подход, мы установили, что тропонин С и тропонин I скелетных гшц могут взаимодействовать с hsp90. Тропонин С может быть «пришит» к )90 только в присутствии Са2+. Образующийся комплекс имеет кажущуюся лекулярную массу около 115 кДа и, по всей видимости, соответствует зимолярному комплексу hsp90 и тропонина С. В присутствии Са2+ тропонин С еныпает вероятность образования «сшитых» димеров hsp90. Поведение эпонина С во многом аналогично поведению кальмодулина, который также особен взаимодействовать с hsp90 [Minami et al., 1993].
«Сшивание» hsp90 с тропонином I сопровождается ослаблением полос «омера и димера hsp90 и формированием диффузной белковой зоны с очень лыной молекулярной массой. Тропонин I в высшей степени склонен к агрегации otter, 1982]. Формирование диффузной зоны при «сшивании» hsp90 с опонином I может быть следствием формирования олигомерных комплексов, лючающих в свой состав как тропонин I, так и hsp90. Аналогичные результаты гли получены и с тропонином Т скелетных мышц. Однако в этом случае позначная интерпретация полученных данных затруднена из-за образования южественных зон «сшитого» тропонина Т.
Метод «нулевой» химической сшивки был использован и для анализа зможного взаимодействия hsp90 с кальпонином, цитоскелетным и кратительным белком гладких мышц. Было обнаружено, что кальпонин может ш> «пришит» к hsp90, при этом образуется два вида комплексов с кажущимися шекулярными массами около 120-150 кДа и более 300 кДа. Белки с злекулярными массами в интервале 120-150 кДа могут соответствовать вимолярным комплексам hsp90 и кальпонина, а белки с высокой молекулярной 1ссой, по всей видимости, образуются при «сшивании» олигомеров hsp90 и льпонина. В связи с тем, что по данным химического «сшивания» кальпонин
оказался одним из наиболее эффективных белков-субстратов Ьзр90, обратились к более подробному анализу взаимодействия этих двух белков.
Изучение взаимодействия 1ир90 с кальпонином. Для доказательства т что ЬБр90 способен образовывать прочные комплексы с кальпонином использовали несколько экспериментальных подходов. Титрова фиксированного количества Ьэр90 кальпонином сопровождается гиперболичес увеличением светорассеяния, что является свидетельством образования комши между двумя белками. Кальпонин сорбируется на колонке с иммобилизован] ЬэрЭО, и, наоборот, Ьэр90 задерживается на колонке с иммобилизован] кальпонином. Взаимодействие кальпонина с Ьвр90 достаточно специфично, при нанесении на колонку с иммобилизованным кальпонином смеси, состоя: из 0,2 мг Ьэр90 и 1 мг бычьего сывороточного альбумина (белю изоэлектрической точкой, близкой изоэлектрической точке 1^90), полностью задерживался на колонке, а более 90% альбумина не сорбировалос: аффинном носителе.
При нативном электрофорезе изолированный Ьэр90 мигрирует в виде дил с молекулярной массой около 180 кДа. В этих условиях изолирован кальпонин, имеющий сильно щелочную изоэлектрическую точку, вообще входит в гель. При электрофорезе смеси, состоящей из фиксирован! количества ЬврЭО и увеличивающихся количеств кальпонина, зона димера Ь уменьшается по интенсивности, а при высоких концентрациях кальпов исчезает вовсе (рис.2А). Это говорит об образовании комплекса кальпонин-Ьв; который в силу своего большого размера или изоэлектрической точки, не мс проникать в гель.
Строя зависимость интенсивности полосы димера Ьэр90, остающегос свободном состоянии, от концентрации добавленного кальпонина, можно хотя приблизительно оценить прочность взаимодействия кальпонина с ЬБр90 (рис.: Оказалось, что при низкой ионной силе (50 мМ трис-НС1) полумаксималь уменьшение интенсивности полосы Ь$р90 происходит при концентра) кальпонина, равной 15 цМ. Повышение ионной силы сопровождав
энижением сродства Ьэр90 к кальпонину, но даже в присутствии 100 мМ ЫаС1 элумаксималыгое уменьшение интенсивности полосы свободного димера Ьэр90 аблюдается при концентрации кальпонииа около 30 цМ (рис.2Б). редставленные результаты означают, что ЬБр90 может с высоким сродством шимодействовать с кальпонином.
1234 56789 10
~Г~ПППРП.------
1 0 0 1
« 8 0 -
о4
Я „ 6 0 -
ч О
о 4 0 -
ю а,
о
« л 2 0 -
о
0 -
1 о
2 0
3 О
кальпонин
4 0
ц М
5 0
ис.2. Исследование взаимодействия Ьзр90 с кальпонином методом нативного ;ль-электрофореза. А. Фотография геля после электрофореза смеси 1вр90 (0,16 г/мл) с увеличивающимися количествами кальпонина. Титрование проводили в реде с низкой ионной силой (50 мМ трис-НС1). Концентрация кальпонина в меси кальпонин-ЬБрЭО составляла 0, 3,5,7,11, 14,18,21, 32 и35 рМ для дорожек -9, соответственно. Изолированный кальпонин (35 цМ) наносили на дорожку 10. [оложение Ьвр90 отмечено стрелкой. Б. Процент Ьзр90, остающегося свободным, ри разных концентрациях кальпонина. Образцы, нагружаемые на гель, одержали только 50 мМ трис-НС1 (кривая 1) или тот же буфер с добавлением 50 ли 100 мМ ЫаС1 (кривые 2 и 3, соответственно).
Локализация участков, обеспечивающих взаимодействие Ьвр90 с альионином. Для того, чтобы определить участки кальпонина, ответственные за го взаимодействие с Ьзр90, мы использовали метод хроматографии по сродству.
При нанесении на колонку с иммобилизованным Ьэр90 смеси пептидов, олученных при мягком химотрипсинолизе кальпонина, оказалось, что крупный [-концевой пептид кальпонина с Мг 22 кДа сорбируется на носителе, а короткий '-концевой пептид с Мг 13 кДа не способен связываться с ЬБр90 (рис.3А), короткий Ы-концевой пептид кальпонина с Мг 14 кДа, образующийся при более пубоком химотрипсинолизе кальпонина, также сорбируется на колонке с
иммобилизованным Ьзр90 (рис.ЗБ). Хотя этот пептид, ограниченный остатками 144 [Мег§ие1(И ег а!., 1992], имеет меньшее сродство к иммобилизованному ЬБр! чем интактный кальпонин, можно заключить, что по крайне мере часть Ьэр^ связывающего участка кальпонина располагается в И-концевой части белка.
22кОа
< О .0 1 •
0,0 0
14кОа-
5 10 15 20 25 30
№ фракций
0.0 8
<4 0,0 4
0,0 0
5 10 15 1
№ фракций
Рис.3. Хроматография по сродству химотриптических фрагментов кальпонина 1 колонке иммобилизованного Ьзр90. 0,5 мг пептидов кальпонина, полученнь после мягкого (А) или глубокого (Б) химотрипсинолиза, нагружали на колонк содержащую 1,6 мг иммобилизованного Ьзр90. Колонку отмывали буфере уравновешивания и связавшиеся пептиды элюировали, повышая ионную силу ; 450 мМ №0 (стрелка на профиле элюции). На врезках показан белковый сост! наносимой на колонку смеси (1), фракций, не сорбирующихся на аффиннс колонке (2), и фракций, задерживаемых на колонке (3). Положение пептидов с Г 13, 14 и 22 кДа отмечено стрелками.
Метод хроматографии по сродству был использован и для картирован! участков Ьзр90, вовлеченных во взаимодействие с калыюнином. Для этого Ьэр? подвергали ограниченному трипсинолизу, смесь триптических пептидов наносил на колонку с иммобилизованным кальпонином и анализировали пептид! сорбирующиеся на аффинном носителе. В выбранных нами условш ограниченный трипсинолиз Ьзр90 сопровождался образованием 6 групп пептидо различающихся по молекулярной массе и разделяемых при электрофорезе
0.0 4
\АГ в присутствии SDS. Четыре группы крупных пептидов мигрировали в виде плетов и имели Мг 39-41 кДа (группа I), 37-38 кДа (группа II), 31-32 кДа эуппа III) и 26-27 кДа (группа IV). Две группы коротких пептидов имели Мг 171 кДа (группа V) и 14-15 кДа (группа VI). Оказалось, что только относительно упные пептиды первых четырех групп с Мг не менее 26 кДа сорбируются на лонке иммобилизованного кальпонина. Пептиды, сорбирующиеся на аффинном юителе, подвергали электрофорезу в ПААГ в присутствии SDS, переносили на /DF-мембрану и подвергали частичному секвенированию. Оказалось (табл.1), о N-концевая последовательность самых крупных пептидов с Мг 39-41 кДа, рбирующихся на иммобилизованном кальпонине, совпадает с »следовательностью остатков 1-5 ß-изоформы hsp90. Пептиды с Мг 37-38 кДа кже задерживались на колонке иммобилизованного кальпонина. N-концевая »следовательность этих пептидов также полностью совпадала с »следовательностью остатков 1-5 ß-изоформы hsp90. Часть пептидов с Мг 31-32 Ja, сорбирующихся на кальпонин-сефарозе, была довольно гетерогенной и мы : смогли определить их N-концевую последовательность. N-концевая ¡следовательность последней группы пептидов с Мг 26-27 кДа, аимодействующих с кальпонином, имела вид EMLQQ и соответствовала (следовательности, начинающейся с остатка 392 ß-изоформы или остатка 400 а-юформы hsp90 (табл.1).
1блица 1. И-концевые последовательности протеолитических фрагментов Ьэр90 : печени кролика, сорбирующихся на колонке иммобилизованного кальпонина.
Молекулярная Установленная Соответствующая
масса пептидов последовательность последовательность в
(кДа) структуре hsp90
39-41 PEEVH 'PEEVH5 (ß-изоформа)
37-38 PEEVH 'PEEVH5 (ß-изоформа)
31-32 не определена
26-27 EMLQQ 392EMLQQ396 (ß-изоформа) 400EMLOO404 (а-изоформа)
На основе полученных собственных экспериментальных результатов и шных литературы мы заключили, что в первичной структуре Ьзр90 есть как
минимум два участка, способных взаимодействовать с кальпонином. ПерЕ участок расположен в ^концевой части молекулы и имеет кажущук молекулярную массу 37-41 кДа, а второй участок расположен в центральной и концевой частях Ьзр90, начинается с остатков 392/400 и имеет кажущу* молекулярную массу 26-27 кДа (рис.4). Таким образом, наши результг означают, что либо в структуре Ь5р90 есть два независимых участка связывш кальпонина, либо Тч-концевой и центральный участки сближены в пространств формируют единый центр связывания кальпонина, либо, наконец, что кальпон: связывающий центр очень велик по размерам и захватывает остатки 1-614/1 ЬБр90.
интактный hsp90
„282 389 „614, 819
К_Rj_К ^/R
1
группа 1,39-41 кДа □
1
группа II, 37-38 кДа С
1
группа III, 31-32 кДа Е
группа IV, 26-27 кДа
4т
Рис.4. Схема расположения пептидов hsp90, взаимодействующих с кальпонин Стрелками (К282, R399 и K614/R619) обозначены участки трипсинолиза, штрихов] отмечены высоко подвижные иммуногенные участки (остатки 227-310 и 702-7 [Nemoto et al., 1997].
Представленные данные свидетельствуют о том, что в структуре кальпош и hsp90 есть определенные участки, обеспечивающие формирование довол: прочного комплекса этих белков. Учитывая высокое содержание hsp90 (10-20 р и кальпонина (80-150 цМ) в гладкой мышце, а также лежащую в микромоляр] области константу диссоциации комплекса Ьзр90-кальпонин, можно 6i предполагать, что эти белки могут взаимодействовать и in vivo. Если предположение справедливо, то можно было ожидать, что hsp90 тем или ин способом окажется способным влиять на взаимодействие кальпонина с актино?
Влияние Ьвр90 на вызванную кальпопином полимеризацию актина. Из
анных литературы [Каке й а1., 1995; Tang е! а1., 1997] известно, что в пределенных условиях калъпонин индуцирует полимеризацию О-актина и репятствует деполимеризации Б-актина. Мы показали, что при низкой ионной зле добавление кальпонина к раствору, содержащему О-актин, одифицированпый пиренил-иодацетамидом, сопровождается значительным величением флуоресценции (рис.5, кривая 5). Это увеличение флуоресценции гражает процесс полимеризации актина [Сп<Ы1е а!., 1985]. Максимальный ффект кальпонина наблюдался при добавлении 0,5-1,0 моля кальпонина на моль ктина, что хорошо согласуется с данными литературы [Каке й а!., 1995].
3 ,0 -
1 ,5 ■
2 ,0
1 ,5
1 ,0 -
1 2
время,мин
'ис.5. Влияние кальпонина и Ьэр90 на полимеризацию актина, регистрируемую о увеличению флуоресценции лиренил-иодацетамида. ковалентио связанного с ктином. По оси ординат отложено отношение флуоресценции в данный момент ремени (1^) к флуоресценхши в нулевой момент времени (Р0) после внесения в робу последней добавки. По оси абсцисс - время инкубации. К смеси, состоящей а 3,3 рМ ^модифицированного и 0,4 дМ модифицированного О-актина в 1уфере в (2 мМ трис-НС1, рН 8,2, 0,2 мМ АТФ, 0,5 мМ р-меркапгоэтанол, 0,005% ТаИз), добавляли разные количества 1г5р90. Реакцию начинали добавлением явных объемов буфера (кривая 0) или кальпонина до конечной концентрации 3,3 [М (кривые 1-5). Экспериментальные кривые были получены при молярном оотношении димер Ьзр90/кальпонин, равном 0 (кривая 5), 1/24 (кривая 4), 1/12 кривая 3), 1/6 (кривая 2) и 1/4 (кривая 1).
Если до добавления кальпонина в инкубационную пробу вносили Ьзр90, вызванная кальпонином полимеризация актина замедлялась, а увеличен флуоресценции к концу инкубации было значительно меньшим по амплитуде, ч в отсутствие ЬэрЭО (см. рис.5). Это означает, что Ьэр90 каким-то образ препятствует вызванной кальпонином полимеризации актина. С этим выводоь полной мере согласуются результаты электронной микроскопии. Действителы при низкой ионной силе актин находится в деполимеризованном состоянии и электронных микрофотографиях не удается выявить никаких упорадоченн: структур (рис.бА). Добавление кальпонина приводило к образованию коротк отдельно лежащих актиновых филаментов (рис.бБ). №р90 сам по себе не влиял процессы полимеризации в-актина. Однако, будучи добавленным к в-актину кальпонина, ЬБр90 практически полностью предотвращал полимеризацию актш индуцируемую кальпонином (рис.бВ).
Рис.6. Электронная микроскопия комплексов актина и кальпонина. Полимеризацию актина (8,7 цМ) (А) индуцировали добавлением кальпонина (1,2 цМ) (Б) и добавлением 1,2 цМ кальпонина в присутствии 2,4 рМ Ьзр90 (В). Б-актин (3,5 (Л тропомиозин (0,6 цМ) (Г) смешивали с кальпонином (1,8 цМ) в отсутствие (Д) или присутствии (Е) ЬБр90 (1,1 цМ). Длина отрезка соответствует 100 нм.
Использование методов ультрацентрифугирования и светорассеяния в шной мере подтвердило тот факт, что индуцируемая кальпонином шимеризация в-актина может частично или полностью предотвращаться Ьзр90. :е эти экспериментальные данные свидетельствуют о том, что кальпонин аимодействует с в-актином и с Ьэр90 с соизмеримым сродством. В этой связи в >исутствии Ьэр90 часть кальпонина оказывается связанной с белком теплового ока и неспособной вызывать полимеризацию в-актина.
Влияние Ьэр90 на взаимодействие кальпонина с Е-актином. Известно, о кальпонин способен связываться с одиночными нитями Р-актина и может вывать латеральное слипание нитей актина, при котором образуются пучки тиновых филаментов [Ко1ако\уз1а е1 а1., 1995; Тагщ й а]., 1997]. №р90 также ¡особен связываться с нитями актина и вызывает их пучкование [Коуаэи е1 а1., '86]. В этой связи исследование прямого влияния Ьэр90 на параметры язывания кальпонина с актином оказывается довольно затруднительным, днако добавление тропомиозина полностью предотвращает связывание Ъзр90 с пями актина [ТЧПзЫёа а1., 1986] и практически не влияет на взаимодействие льпонина с актином [Ьи й а1., 1995]. Таким образом, проводя все эксперименты присутствии насыщающих концентраций тропомиозина, мы могли полностью жлючить связывание ЬБр90 с нитями актина и изучить влияние белка теплового ока на взаимодействие кальпонина с фибриллярным актином.
Титрование нитей актина, содержащих тропомиозин, кальпонином гаровождается образованием пучков актиновых филаментов, которые могут лть отделены от одиночных филаментов с помощью низко скоростного этгрифугирования (см. «Материалы и методы»), В выбранных спериментальных условиях половина актиновых филаментов образовывала гчки при концентрации кальпонина, равной 1,00-1,25 цМ (рис.7). Дальнейшее >вышение концентрации кальпонина сопровождалось увеличением доли регированных нитей актина и параллельным уменьшением доли одиночных тиновых филаментов.
1 о о
<L>
а et а о
о «
X
s
H
и «
8 0 -
б 0 -
4 0 -
2 0 -
О ,0
О ,5
1 ,0
1 ,5
2 ,0
2 ,5
кальпонин, ц M
Рис.7. Влияние hsp90 (1 цМ димера) на взаимодействие кальпонина с комплею F-актин (3,8 цМ)-тропомиозин (0,6 juM). Комплекс F-актин-тропомио титровали кальпонином в отсутствие (1 и 3, заполненные символы) шл присутствии (2 и 4, открытые символы) hsp90. Образец подвергали сначала ни скоростному центрифугированию и отделяли пучки нитей актина. Получен! супернатант подвергали ультрацентрифугированию и собирали отдельные н актина. Представлена зависимость доли актина в пучках (1 и 2 , квадратики) одиночных филаментах (3 и 4, кружки) от суммарной концентрации кальпонш инкубационной среде. Кривые 5 и 6 были получены путем суммирования крш 1 и 3, а также 2 и 4 соответственно.
Если к смеси актин-тропомиозин сначала добавляли hsp90, то титрова кальпонином также сопровождалось образованием пучков актино] филаментов. Однако концентрация кальпонина, при которой достит полумаксимальная агрегация нитей актина, составляла около 2 цМ (рис.7). ! означает, что hsp90 каким-то образом препятствует вызываемой кальпонш агрегации нитей F-акгина, содержащих тропомиозин. Важно отметить, что ; этом hsp90 остается в растворе и не соосаждается ни с одиночными нит; актина, ни с пучками актиновых филаментов.
В дополнительной серии экспериментов мы исследовали влия возрастающих количеств hsp90 на вызванное кальпонином пучкование ни актина. При этом к нитям актина, содержащим тропомиозин, сначала добавл
о
¡зные количества hsp90, а затем в пробы вносили одинаковые количества шьпонина. Оказалось, что по мере увеличения концентрации hsp90 уменьшается зля филаментов, формирующих пучки, и увеличивается доля одиночных становых филаментов. При этом молярное отношение кальпонин/актин в пучках ятей актина не изменялось.
Таким образом, биохимические данные говорят о том, что hsp90 эепятствует вызванной кальпонином агрегации нитей актина. Данные гектронной микроскопии в полной мере согласуются с этим заключением, ействительно, в отсутствие кальпонина на электронных микрофотографиях 1дны одиночные нити актина, содержащие тропомиозин (рис.бГ). Добавление шьпонина приводит к образованию толстых пучков актиновых филаментов 1ис.6Д). Если добавлению кальпонина предшествовало внесение в якубационную пробу hsp90 (рис. 6Е), то большая часть актиновых филаментов г образовывала пучков. В этом случае на микрофотографиях преимущественно адны отдельные нити актина.
Завершая работу, можно заключить, что hsp90 может взаимодействовать с ^сколькими белками цитоскелета и сократительного аппарата. Hsp90 образует зочные комплексы с кальпонином гладких мышц. Белок теплового шока может зедотвращать вызванную кальпонином полимеризацию G-актина, а также зепятствовать вызванной кальпонином агрегации актиновых филаментов. Все :о позволяет высказать предположение, что hsp90 может взаимодействовать с шьпонином in vivo и что такое взаимодействие может играть определенную роль функционировании и сборке цитоскелета и сократительного аппарата клетки.
ВЫВОДЫ
1. Разработан модифицированный метод выделения белка теплового шока с олекулярной массой 90 кДа (hsp90) из печени кролика.
2. Исследовано взаимодействие hsp90 с несколькими сократительными и итоскелетными белками. Установлено, что изолированный hsp90 не ¡аимодействует с димерами (тетрамерами) десмина и не влияет на
полимеризацию десмина. Hsp90 может быть химически «сшит» с тропонином тропонином I скелетных мышц.
3. Используя методы «нулевой» химической сшивки, натив? электрофореза, светорассеяния и хроматографии по сродству установили, hsp90 образует прочные комплексы с кальпонином гладких мышц.
4.. N-концевой пептид (остатки 7-144) кальпонина участвует взаимодействии с hsp90. Крупные N-концевые пептиды hsp90 с кажуще молекулярной массой 37-41 кДа, а также пептид, имеющий кажущу молекулярную массу 26-27 кДа и расположенный в центральной части hs] могут взаимодействовать с кальпонином.
5. Hsp90 может блокировать индуцируемую кальпонином полимериза1 G-актина.
6. Установлено, что hsp90 препятствует агрегации нитей актина, коте вызывается кальпонином. При этом hsp90 не влияет на соотпоше кальпонин/актин как в изолированных, так и в агрегированных нитях актина.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Bogatcheva, N.V., Ma, YuShu, Nesterova, Yu.V., Gusev, N.B. Interactioi Hsp90 with calponin and troponin T. Abstracts of the international symposium "Pro structure, stability and folding. Fundamental and medical applications", 87, Mosc 1998.
2. Ma, YuShu, Bogatcheva, N.V., Gusev, N.B. Interaction of calponin with 1 shock protein (hsp90). Abstracts of the international symposium "Biological moti] modern methods for studying", 87, Puschino, 1998.
3. Bogatcheva, N.V., Ma, YuShu., Gusev, N.B. Interaction of smooth mu: calponin with heat shock proteins HSP9D. Abstracts of the 27th European Mu, Conference, B-8, Lund (Sweden), 1998.
4. Ma, Юйшу, Богачева, H.B., Гусев, Н.Б. Выделение белка теплового moi молекулярной массой 90 кДа (Hsp90) из печени кролика и изучение взаимодействия с компонентами тропонина и кальпонином. Биохимия, 63, 53 1998.
5. Ma, Ю., Богачева, Н.В., Гривенников, С.И., Гусев, Н.Б. Взаимодействие злка теплового шока HSP90 с кальпонином. Тезисы II съезда биофизиков оссии, т.1, 337, Москва, 1999.
6. Ma, YuShu, Bogatcheva, N.V., Gusev, N.B. Heat shock protein (HSP90) Tects calponin-actin interaction. Abstracts of the 28th European Muscle Congress, 79, ork (Great Britain), 1999.
7. Bogatcheva, N.V., Ma, YuShu, Urosev, D., Gusev, N.B. Localization of ilponin binding sites in the structure of 90 kDa heat shock protein (Hsp90). FEBS ett, 457,369-374, 1999.
8. Ma, YuShu., Bogatcheva, N.V., Gusev, N.B. Heat shock protein (hsp90) teracts with smooth muscle calponin and affects calponin-binding to actin. Biochimica Biophysica Acta., 1476, 300-310, 2000.
Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда ундаментальных исследований и Wellcome Trust (Великобритания).
Сокращения, используемые в работе
ААГ, полиакриламидный гель; hsp90, белок теплового шока с молекулярной ассой 90 кДа; PVDF, поливинилиден дифторидная мембрана; SDS, эдецилсульфат натрия.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ма Юйшу
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Строение и свойства белков теплового шока.
1.1. Общая характеристика белков теплового шока.
1.2. Регуляция синтеза белков теплового шока.
1.3. Классификация белков теплового шока и некоторые свойства белков теплового шока с молекулярными массами 60 кДа (¡гзрбО) и
70 кДа (кзр70).
1.3.1. НзрбО (шаперонины).
1.3.2. Нзр70.
1.4. Белки теплового шока с молекулярной массой 90 кДа ^р90).
1.4.1. Доменная структура Ьэр90.
1.4.2. Строение 1Ч-концевого домена 1^90: Шаперонная активность, связывание АТФ и антибиотиков ансамицинового ряда.
1.4.3. С-концевой домен Ьзр90: Шаперонная активность и олигомеризация.
1.4.4. Строение фолдосомы («шаперонной машины») и белки-партнеры Ьэр90.
1.4.5. Взаимодействие Ьзр90 с различными белками-субстратами. а) Взаимодействие Ь.зр90 с рецепторами стероидных гормонов. б) Взаимодействие 1^90 с протеинкиназами. в) Взаимодействие Ьзр90 с белками цитоскелета.
2. Белки промежуточных филаментов.
2.1. Классификация белков промежуточных филаментов.
2.2. Десмин.
3. Сократительный аппарат клетки.
3.1. Молекулярные механизмы сократительной активности различных типов мышц и пути ее регуляции.
3.2. Кальпонин -регуляторный и цитоскелетный белок гладких мышц.
3.2.1. Физико-химические свойства кальпонина.
3.2.2. Доменная структура кальпонина.
3.2.3. Взаимодействие кальпонина с различными белками. а). Взаимодействие кальпонина с актином. б). Взаимодействие кальпонина с тропомиозином. в). Взаимодействие кальпонина с кальций-связывающими белками. г). Взаимодействие кальпонина с другими белками и возможное участие кальпонина в перемещении протеинкиназ внутри клетки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Методы получения белков.
1.1. Выделение белка теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (Нзр90) из печени кролика.
1.2. Выделение калъпонина из мускульных желудков уток.
1.3. Выделение актина из ацетонового порошка скелетной мышцы кролика.
1.4. Выделение десмина из мускульных желудков уток.
1.5. Препараты кальдесмона, тропомиозина и компонентов тропонина.
2. Методы получения пептидов.
2.1. Фрагментация полипептидной цепи кяр90.
2.1.1. Ограниченный трипсинолиз Ьзр90.
2.1.2. Получение фосфорилированных пептидов Ьзр90.
2.2. Ограниченный химотрипсинолиз кальпонина.
3. Методы изучения белок-белковых взаимодействий.
3.1. Метод «нулевой сшивки».
3.2. Нативный электрофорез.
3.3. Хроматография по сродству.
3.4. Методы центрифугирования и соосаждения.
3.5. Оптические методы исследования.
3.5.1. Светорассеяние.
3.5.2. Флуоресцентная спектроскопия.
3.6. Электронная микроскопия.
4. Некоторые аналитические методы.
4.1. Методы переноса белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу.
4.1.1. Иммуноблоттинг.
4.1.2. Метод переноса пептидов на мембраны Иммобилон.
4.2. Определение молекулярной массы белка с помощью метода нативного электрофореза.
4.3. Прокрашивание геля серебром.
4.4. Определение концентрации белков.
4.4.1. Спектрофотометрический метод.
4.4.2. Определение концентрации белка по методу Спектора [Брейог, 1978].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Выделение белка теплового шока с молекулярной массой
90 кДа (нзр90) из печени кролика.
2. Предварительный анализ взаимодействия шр90 с различными сократительными и регуляторными белками.
2.1. Изучение взаимодействия кзр90 с десмином.
2.2. Использование метода «нулевой» химической сшивки для скрининга белков, способных взаимодействовать с кзр90.
3. Изучение взаимодействия hsp90 с кальпонином.
3.1. Использование метода нашивного электрофореза в полиакршамидном геле для определения олигомерного состояния hsp90 и исследования его взаимодействия с кальпонином.
3.2. Определение участка кальпонина, обеспечивающего его взаимодействие с hsp90.Ill
3.3. Определение кальпонин-связывающего участка hsp90.
3.4. Влияние фосфорилирования hsp90 на его взаимодействие с кальпонином.
3.5. Влияние hsp90 на взаимодействие кальпонина с актином.
3.5.1. Влияние hsp90 на вызванную кальпонином полимеризацию G-актина.
3.5.2. Влияние hsp90 на пучкование нитей актина, вызываемое кальпонином.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие белка теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (Hsp90) с некоторыми сократительными и цитоскелетными белками"
Цитоскелет и сократительный аппарат играют важную роль в нормальной жизнедеятельности клеток. И цитоскелет, и сократительный аппарат, представляют собой сложные многокомпонентные белковые комплексы. Эти структуры в высшей степени динамичны и постоянно подвергаются процессам сборки и разборки. Различные белки-компоненты этих комплексов сильно отличаются по времени своей жизни и скорости обмена. Поэтому в процессе жизнедеятельности постоянно происходит обновление и замена старых компонентов на новые. При физиологических условиях многие белки цитоскелета и сократительного аппарата (такие как тропонин I и тропонин Т, а также кальпонин) обладают выраженной склонностью к агрегации. Поэтому остается не совсем понятным, как эти белки транспортируются от мест синтеза к местам их постоянного функционирования. Кроме того, многие компоненты цитоскелета и сократительного аппарата (такие, например, как тропонин I и тропонин Т, кальпонин и кальдесмон) отличаются повышенной чувствительностью к действию протеаз. Поэтому возникает вопрос о том, каким образом эти белки защищаются от протеолиза в ходе их переноса от рибосом на сократительный аппарат или элементы цитоскелета. Помимо этого до сих пор довольно загадочным остается вопрос о том, как происходит высоко упорядоченная сборка сложных надмолекулярных комплексов, которые являются основой как цитоскелета, так и сократительного аппарата.
В клетках эукариот как в нормальных условиях, так и особенно после стресса синтезируется несколько классов белков теплового шока (heat shock proteins, hsp), которые способствуют правильному котрансляционному сворачиванию полипептидных цепей, препятствуют агрегации частично денатурированных белков, участвуют в транспорте белковых молекул к местам их назначения и способствуют сборке некоторых надмолекулярных комплексов. Одним из белков теплового шока является белок с молекулярной массой 90 кДа (hsp90). Hsp90 синтезируется в большом количестве в клетках при нормальных условиях. На долю этого белка приходится до 2% растворимых белков клетки [Lai et al., 1984]. Hsp90 способен взаимодействовать со многими белками, такими, как F-актин [Koyasu et al., 1986], белки цитоскелета [Czar et al., 1996], рецепторы стероидных гормонов [цит. по Büchner, 1999] и некоторые протеинкиназы [цит. по Pratt, 1997]. Hsp90 обладает шаперонной активностью и участвует в сворачивании своих белков-мишеней. Возможно, hsp90 участвует также в транспорте своих белков-мишеней к местам назначения [цит. по Pratt, 1997]. Все эти свойства делают hsp90 одним из кандидатов, которые могли бы участвовать в сборке цитоскелета и сократительного аппарата.
Целью данной работы было исследование взаимодействия hsp90 с некоторыми белками цитоскелета и сократительного аппарата. В соответствии с этой основной целью были поставлены следующие основные задачи:
1) Разработать модифицированный метод выделения hsp90;
2) Исследовать взаимодействие hsp90 с несколькими цитоскелетными и сократительными белками и выявить возможные белки-мишени для hsp90;
3) Подробно проанализировать взаимодействие hsp90 с кальпонином и локализовать участки двух белков, вовлеченные в образование комплекса;
4) Изучить влияние hsp90 на взаимодействие кальпонина с глобулярным и фибриллярным актином.
Научная новизна и практическая значимость. Разработана модифицированная процедура выделения hsp90 из печени кролика, с помощью трех хроматографических стадий получены препараты высоко очищенного hsp90.
Исследовано взаимодействие hsp90 с десмином гладких мышц, а также с компонентами тропонина скелетных мышц. Установлено, что изолированный hsp90 не взаимодействует с димерами (тетрамерами) десмина и не влияет на полимеризацию десмина. Получены свидетельства того, что hsp90 взаимодействует с тропонином С и тропонином I скелетных мышц.
Обнаружено, что кальпонин гладких мышц образует прочные комплексы с hsp90. В формировании комплекса принимают участие N-концевой фрагмент (остатки 7-144) кальпонина, а также крупные N-концевые и центральный (начинающийся с остатков 392/400) участки hsp90. Определен участок, фосфорилируемый казеинкиназой II типа в структуре hsp90 и установлено, что фосфорилирование не влияет на взаимодействие hsp90 с кальпонином.
Впервые показано, что hsp90 препятствует полимеризации G-актина, индуцируемой кальпонином. Установлено, что hsp90 частично препятствует вызываемому кальпонином пучкованию нитей актина.
Высказано предположение, что кальпонин может быть одним из белков-субстратов hsp90 in vivo и что взаимодействие кальпонина с hsp90 может играть определенную роль в формировании цитоскелета и сократительного аппарата клетки.
Обзор литературы
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ма Юйшу
Выводы
1. Разработан модифицированный метод выделения белка теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (Ьзр90) из печени кролика.
2. Исследовано взаимодействие Ьзр90 с несколькими сократительными и цитоскелетными белками. Установлено, что изолированный Ьвр90 не взаимодействует с димерами (тетрамерами) десмина и не влияет на полимеризацию десмина. Нзр90 может быть химически «сшит» с тропонином С и тропонином I скелетных мышц.
3. Используя методы «нулевой» химической сшивки, нативного электрофореза, светорассеяния и хроматографии по сродству установили, что ЬБр90 образует прочные комплексы с кальпонином гладких мышц.
4. К-концевой пептид (остатки 7-144) кальпонина участвует во взаимодействии с Ьэр90. Крупные ТЧ-концевые пептиды Ьзр90 с кажущейся молекулярной массой 37-41 кДа, а также пептид, имеющий кажущуюся молекулярную массу 26-27 кДа и расположенный в центральной части Ьзр90, могут взаимодействовать с кальпонином.
5. Нзр90 может блокировать индуцируемую кальпонином полимеризацию в-актина.
6. Установлено, что Ьзр90 препятствует агрегации нитей актина, которая вызывается кальпонином. При этом Ьзр90 не влияет на соотношение кальпонин/актин как в изолированных, так и в агрегированных нитях актина.
Выражаю глубокую благодарность Николаю Борисовичу Гусеву за научное руководство и неоценимую помощь в работе. Благодарю своих коллег из нашей лаборатории за поддержку и дружеские советы, а также коллег из Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ за помощь при выполнении данной работы.
Благодарю весь коллектив кафедры биохимии за полученные знания.
Заключение
В процессе данного исследования мы разработали модифицированный метод выделения hsp90 из печени кролика и проанализировали взаимодействие этого белка с несколькими цитоскелетными и сократительными белками. Мы не смогли обнаружить взаимодействия изолированного hsp90 с димерами и тетрамерами десмина и не выявили влияния hsp90 на полимеризацию десмина. Эти отрицательные результаты не исключают возможности того, что hsp90 все-таки способен взаимодействовать с промежуточными филаментами либо через свои белки-партнеры, либо за счет взаимодействия с другими компонентами промежуточных филаментов.
Было установлено, что hsp90 Са -зависимым образом взаимодействует с тропонином С скелетных мышц. По всей видимости, это взаимодействие имеет много общего со взаимодействием hsp90 с кальмодулином. Наши предварительные данные также свидетельствуют о том, что тропонин I скелетных мышц также способен взаимодействовать с hsp90. Хотя у нас пока нет убедительных данных о том, что тропонин Т также способен взаимодействовать с hsp90, полученные нами результаты могут указывать на то, что hsp90 в той или иной мере может участвовать в сборке тропонинового комплекса или в транспортировке отдельных компонентов тропонина внутри клетки.
Подробно изучено взаимодействие цитоскелетного и сократительного белка гладких мышц - кальпонина - с hsp90. Установлено, что в условиях in vitro hsp90 и кальпонин способны формировать прочные комплексы. N-концевой пептид кальпонина, ограниченный остатками 7-144, может участвовать во взаимодействии с hsp90. Пептиды, расположенные в N-концевой и центральной частях hsp90 совместно или по врозь участвуют в связывании кальпонина. Казеинкиназа II типа фосфорилирует несколько участков, расположенных в N-концевом домене hsp90. Фосфорилирование казеинкиназой II типа не влияет на взаимодействие hsp90 с кальпонином.
В связи с тем, что концентрации кальпонина и hsp90 в гладких мышцах довольно высоки и соизмеримы с кажущейся константой диссоциации комплекса кальпонин-Ьзр90, мы предположили, что и в условиях in vivo эти белки могут взаимодействовать друг с другом. Если это действительно так, то можно было ожидать влияния hsp90 на взаимодействие кальпонина с актином. Действительно, мы обнаружили, что hsp90 препятствует вызываемой кальпонином полимеризации актина, а также частично предотвращает пучкование нитей актина, вызываемое кальпонином.
Полученные результаты позволяют предположить, что hsp90 может участвовать в переносе и встраивании кальпонина в цитоскелет и сократительный аппарат клетки.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ма Юйшу, Москва
1. Верин А.Д. (1990) // Некоторые особенности структуры и свойства компонентов тропонина сердца. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. МГУ, Москва
2. Гусев Н.Б. (1985) // Протеинкиназы и фосфатазы, участвующие в фосфорилировании и дефосфорилировании сократительных белков. В книге: Механизмы контроля мышечной деятельности, стр. 148-170, Ленинград, «Наука»
3. Гусев Н.Б., Воротников А.В., Бирюков К.Г., Ширинский В.П. (1991) // Кальдесмон и кальпонин белки, участвующие в регуляции взаимодействия миозина и актина в немышечных клетках и гладких мышцах. Биохимия, 56, 1347-1367
4. Гусев Н.Б., Добровольский А.Б. (1978) // Методы выделения и разделения тропонинового комплекса из скелетных мышц кролика. Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков. Под редакцией Иваницкого Г.Р., стр. 151-165, Ленинград, «Наука»
5. Курочкина Л.П., Месянжинов В.В. (1996) // Фолдинг белка в клетке. Усп. биол. химии, 36, 49-86
6. Остерман Л.А. (1985) // Хроматография белков и нуклеиновых кислот, стр. 1-536, Москва, «Наука»
7. Филатов В.Л., Катруха А.Г., Буларгина Т.В., Гусев Н.Б. (1999) // Тропонин: строение, свойства и механизм функционирования. Биохимия, 64, 5-24
8. Abe М., Takahashi К., Hiwada К. (1990) // Simplified co-purification of vascular smooth muscle calponin and caldesmon. J. Biochem., 107, 507509
9. Aligue R., Akhavan-Niak H., Russell P. (1994) // A role of hsp90 in cell cycle control: Weel tyrosine kinase activity requires interaction with hsp90. EMBO J., 13, 6099-6106
10. Applegate D., Feng W., Green R.S., Taubman M.B. (1994) // Cloning of expression of a novel acidic calponin isoform from rat aortic vascular smooth muscle. J. Biol. Chem., 269, 10683-10690
11. Bohen S.P. (1998) // Genetic and biochemical analysis of p23 and ansamycin antibiotics in the function of hsp90-dependent signaling proteins. Mol. Cell. Biol., 18, 3330-3339
12. Bose S., Weikl T., Bugl H., Buchner J. (1996) // Chaperone function of hsp90-associated proteins. Science, 274, 1715-1717
13. Buchner J. (1999) // Hsp90 & Co. a holding for folding. TIBS, 24, 136-141
14. Cambiazo V., Gonzalez M., Isamit C., Maccioni R.B. (1999) // The (3-isoform heat shock protein hsp-90 is structurally related with human microtubule-interacting protein Mip-90. FEBS Lett., 457, 343-347
15. Carrello A., Ingley E., Minchin R.F., Tsai S., Ratajczak T. (1999) // The common tetratricopeptide repeat acceptor site for steroid receptor-associated immunophilins and Hop is located in the dimerization domain of hsp90. J. Biol. Chem., 274, 2682-2689
16. Castresana J., Saraste M. (1995) // Hypothesis: Does Vav bind to F-actin through a CH domain? FEBS Lett., 374, 149-151
17. Chadli A, Ladjimi M.M., Baulieu E-E., Catelli M.G. (1999) // Heat-induced oligomerization of the molecular chaperone hsp90: inhibition by ATP and geldanamycin and activation by transition metal oxyanions. J. Biol. Chem., 274,4133-4139
18. Chalovich J.M., Sen A., Resetar A., Leinweber B., Fredricksen R.S., Lu F., Chen Y.-D. (1998) // Caldesmon: binding to actin and myosin and effects on elementary steps in the ATPase cycle. Acta. Physiol. Scand., 164, 427-435
19. Chang H-C.J., Nathan D.F., Lindquist S. (1997) // In vivo analysis of the hsp90 cochaperone Stil (p60). Mol. Cell. Biol., 17, 318-325
20. Chen C.F., Chen Y., Dai K., Chen P.L., Riley D.J., Lee W.H. (1996) // A new member of the hsp90 family of molecular chaperones interacts with the retinoblastoma protein during mitosis and after heat shock. Mol. Cell. Biol., 16, 4691-4699
21. Childs T.J., Watson M.H., Novy R.E., Lin J.J.-C., Mak A.S. (1992) // Calponin and tropomyosin interaction. Biochim. Biophys. Acta., 1121, 41-46
22. Collier N.C., Schlesinger M.J. (1986) // The dynamic state of heat shock proteins in chicken embryo fibroblasts. J. Cell Biol., 103, 1495-1507
23. Conconi M., Petropoulos I., Emod I., Turlin E., Biville F., Friguet B. (1998) // Protection from oxidative inactivation of the 20S proteasome by heat-shock protein 90. Biochem. J., 333, 407-415
24. Cooper J.A., Pollard T.D. (1982) // Methods to measure actin polymerization. Methods Enzymol., 85, 182-210
25. Cooper J.A., Walker S.B., Pollard T.D. (1983) // Pyrene actin: documentation of the validity of a sensitive assay for actin polymerization. J. Muscle Res. Cell Motil., 4, 253-262
26. Craig E.A., Weissman J.S., Horwich A.L. (1994) // Heat shock proteins and molecular chaperones: mediator of protein conformation and turnover in the cell. Cell, 78, 365-372
27. Criddle A.H., Geeves M.A., Jeffries T. (1985) // The use of actin labelled with N-(l-pyrenyl) iodoacetamide to study the interaction of actin with myosin subfragments and troponin/tropomyosin. Biochem. J., 232, 343349
28. Csermely P., Kahn C.R. (1991) // The 90-kDa heat shock protein (hsp-90) possesses an ATP binding site and autophosphorylating activity. J. Biol. Chem., 266, 4943-4950
29. Csermely P., Kajtar J., Hollosi M., Jalsovszky G., Holly S., Kahn C.R., Gergely P., Soti C., Mihaly K., Somogy J. (1993) // ATP induces a conformational change of the 90-kDa heat shock protein. J. Biol. Chem., 268, 1901-1907
30. Csermely P., Miyata Y., Schnaider T., Yahara I. (1995) // Autophosphorylation of grp94 (endoplasmin). J. Biol. Chem., 270, 6381-6388
31. Csermely P., Miyata Y., Soti C., Yahara I. (1997) // Binding affinity of proteins to hsp90 correlates with both hydrophobicity and positive charges: a surface plasmon resonance study. Life Science, 61, 411-418
32. Csermely P., Schaider T., Soti C., Prohaszka Z., Nardai G. (1998) // The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol. Ther., 79, 129-168
33. Czar M.J., Welsh M.J., Pratt W.B. (1996) // Immunofluorescence localization of the 90-kDa heat-shock protein to cytoskeleton. Eur. J. Cell Biol., 70, 322-330
34. Davis B J. (1964) // Disc electrophoresis II. Method and application to human serum proteins. Ann. N.Y. Acad. Sci., 121, 404-436
35. Eggers D.K., Welch W.J., Hansen W.J. (1997) // Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells. Mol. Biol. Cell, 8, 1559-1573
36. EL-Mezgueldi M. (1996) // Calponin. Int. J. Biochem.Cell Biol., 28, 1185-1189
37. Farah C.S., Reinach F.C. (1995) // The troponin complex and regulation of muscle contraction. FASEB J., 9, 755-767
38. Flicker P.J., Phillips G.N., Cohen C. (1982) // Troponin and its interactions with tropomyosin: an electron microscope study. J. Mol. Biol., 162, 495-501
39. Fostinis Y., Theodoropoulos P.A., Gravanis A., Stournaras C. (1992) // Heat shock protein hsp90 and its association with the cytoskeleton: a morphological study. Biochem. Cell. Biol., 70, 779-786
40. Freeman B.C., Morimoto R.I. (1996) // The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. EMBO J., 15, 2969-2979
41. Fuchs E., Weber K. (1994) // Intermediate filament: structure, dynamics, function and disease. Annu. Rev. Biochem., 63, 345-382
42. Fujii T., Hiromori T., Hamamoto M., Suzuki T. (1997) // Interaction of chicken gizzard smooth muscle calponin with brain microtubules. J. Biochem., 122,344-351
43. Galigniana M.D., Housley P.R., DeFranco D.B., Pratt W.B. (1999) // Inhibition of glucocorticoid receptor nucleocytoplasmic shuttling by okadaic acid requires intact cytoskeleton. J. Biol. Chem., 274, 16222-16227
44. Gamier C., Barbier P., Gilli R., Lopez C., Peyrot V., Briand C. (1998a) // Heat-shock protein 90 (hsp90) binds in vitro to tubulin dimer and inhibits microtubule formation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 250, 414-419
45. Geisler N., Weber K. (1980) // Purification of smooth-muscle desmin and a protein-chemical comparison of desmins from chicken gizzard and hog stomach. Eur. J. Biochem., Ill, 425-433
46. Gerthoffer W., Pohl J. (1994) // Caldesmon and calponin phosphorylation in regulation of smooth muscle contraction. Can. J. Physiol. Pharmacol., 72, 1410-1414
47. Gething M.J., Sambrook J. (1992) // Protein folding in the cell. Nature, 355,33-45
48. Gimona M., Mital R. (1998) // The single CH-domain of calponin is neither sufficient nor necessary for F-actin binding. J. Cell Sci., Ill, 18131821
49. Gimona M., Small V.J. (1996) // Calponin in the book "Biochemistry of smooth muscle contraction". M. Barany (Ed.), p. 91-103, San Diego, Academic Press
50. Gong B.J., Mabuchi K., Takahashi K., Nadal-Ginard B., Tao T. (1993) // Characterization of wild type and mutant chicken gizzard calponin expressed in E. coli. J. Biochem., 114, 453-456
51. Grabarek. Z., Gergely J. (1990) // Zero-length cross-linking procedure with the use of active esters. Anal. Biochem., 185, 131-135
52. Graceffa P., Jansco A., Mabuchi K. (1992) // Modification of acidic residues normalizes sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of caldesmon and other proteins that migrate anomalously. Arch. Biochem. Biophys., 297, 46-51
53. Grammatikakis N., Lin J.H., Grammatikakis A., Tsichlis P.N., Cochran B.H. (1999) // p50(cdc37) acting in concert with hsp90 is required for Raf-1 function. Mol. Cell. Biol., 19, 1661-1672
54. Greaser M.L., Gergely J. (1973) // Purification and properties of the components from troponin. J. Biol. Chem., 248,2125-2133
55. Grenert J.P., Johnson B.D., Toft D.O. (1999) // The importance of ATP binding and hydrolysis by hsp90 in formation and function of protein heterocomplexes. J. Biol. Chem., 274, 17525-17533
56. Hansen J., Gafni A. (1994) // Fluorescence detection of conformational changes in GroEL induced by thermal switching and nucleotide binding. J. Biol. Chem., 269, 6286-6289
57. Hartson S.D., Ottinger E.A., Huang W., Barany G., Burn P., Matts R.L.1998) // Modular folding and evidence for phosphorylation of an hsp90-dependent kinase. J. Biol. Chem., 273, 8475-8482
58. Hartson S.D., Thulasiraman V., Huang W., Whitesell L., Matts R.L.1999) // Molybdate inhibits hsp90, induces structural changes in its C-terminal domain, and alters its interactions with substrates. Biochemistry, 38, 3837-3849
59. Holt S.E., Aisner D.L., Baur J., Tesmer V.M., Dy M., Ouellette M., Trager J.B., Morin G.B., Toft D.O., Shay J.W., Wright W.E., White M.A. (1999) // Functional requirement of p23 and hsp90 in telomerase complexes. Genes. Dev., 13, 817-826
60. Horiuchi K.Y., Chacko S. (1991) // The mechanism for the inhibitory of actin-activated ATPase of smooth muscle heavy meromyosin by calponin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 176, 1487-1493
61. Houdusse A., Love M.L., Dominquez R., Grabarek Z., Cohen C. (1997) // Structure of the Ca2+-bound troponin C at 2.0 A resolution: further insight into the Ca2+-switch in the calmodulin superfamily. Structure, 5, 1695-1711
62. Houk T.W., Ue K. (1974) // The measurement of actin concentration in solution: a comparison of methods. Anal. Biochem., 62, 66-74
63. Huiatt T.W., Robson R.M., Arakawa N., Stromer M.H. (1980) // Desmin from avian smooth muscle. J. Biol. Chem., 255, 6981-6989
64. Hurley J.H. (1996) // The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Struct., 25, 137-162
65. Hutchison K.A., Stancato L.F., Jove R., Pratt W.B. (1992) // The protein-protein complex between pp60v-src and hsp90 is stabilized by molybdate, vanadate, tungstate, and an endogenous cytosolic metal. J. Biol. Chem., 267, 13952-13957
66. Iannotti A.M., Rabideau D.A., Dougherty J.J. (1988) // Characterization of purified avain 90,000-Da heat shock protein. Arch. Biochem. Biophys., 264, 54-60
67. Inagaki M., Gonda Y., Matsuyama M., Nishizawa K., Nishi Y., Sato C. (1988) // Intermediate filament reconstitution in vitro: the role of phosphorylation on the assembly-disassembly of desmin. J. Biol. Chem., 263, 5970-5978
68. Ip W., Fellows M.E. (1990) // Fluorescent measurement of desmin intermediate filament assembly. Anal. Biochem., 185, 10-16
69. Itoh H., Ogura M., Komatsuda A., Wakui H., Miura A.B., Tashima Y. (1999) // A novel chaperone-activity-reducing mechanism of the 90-kDa molecular chaperone hsp90. Biochem. J., 343, 697-703
70. Itoh H., Tashima Y. (1993) // Domain structure of the 90-kDa stress protein: heparin- and antibody-binding domain. Int. J. Biochem., 25, 157-161
71. Jaiswal R.K., Weissinger E., Kolch W., Landreth G.E. (1996) // Nerve growth factor-mediated activation of the mitogen-activated protein (MAP) kinase cascade involves a signaling complex containing B-Raf and hsp90. J. Biol. Chem., 271, 23626-23629
72. Jakob U., Lilie H., Meyer I., Buchner J. (1995a) // Transient interaction of hsp90 with early unfolding intermediates of citrate synthase: implications for heat shock in vivo. J. Biol. Chem., 270, 7288-7294
73. Jakob U., Meyer I., Bugl H., Andre S., Bardwell J.C.A., Buchner J. (1995b) // Structural organization of procaryotic and eucaryotic hsp90: influence of divalent cations on structure and function. J. Biol. Chem., 270, 14412-14419
74. Jakob U., Scheibel T., Bose S., Reinstein J., Buchner J. (1996) // Assessment of the ATP binding properties of hsp90. J. Biol. Chem., 271, 10035-10041
75. Johnson B.D., Schumacher R.J., Ross E.D., Toft D.O. (1998) // Hop modulates hsp70/hsp90 interactions in protein folding. J. Biol. Chem., 273, 3679-3686
76. Kake T., Kimura S., Takahashi K., Maruyama K. (1995) // Calponin induces actin polymerization at low strength and inhibits depolymerization of actin filaments. Biochem. J., 312, 587-592
77. Kaufmann E., Weber E., Geisler N. (1985) // Intermediate filament forming ability of desmin derivatives lacking either the amino-terminal 67 or the carboxy-terminal 27 residues. J. Mol. Biol., 185, 733-742
78. Kellermayer M.S.Z., Csermely P. (1995) // ATP induces dissociation of the 90 kDa heat shock protein (hsp90) from F-actin: interference with the binding of heavy meromyosin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 211, 166174
79. Khaitlina S.Yu., Antropova O., Kuznetsova I., Turoverov K.J. (1997) // Correlation of conformational changes and polymerize ability of scallop (3-like and rabbit skeletal muscle a-actin. J. Muscle Res. Cell Motil., 18, 125
80. Kimura Y., Rutherford S.L., Miyata Y., Yahara I., Freeman B.C., Yue L., Morimoto R.I., Lindquist S. (1997) // Cdc37 is a molecular chaperone with specific functions in signal transduction. Genes. Dev., 11, 1775-1785
81. Knowlton A.A., Kapadia S., Torre-Amione G., Durand J-B., Bies R., Young J., Mann D.L. (1998) // Differential expression of heat shock proteins in normal and failing human hearts. J. Mol. Cell. Cardiol., 30, 811-818
82. Kojima M., Hoshimaru M., Aoki T., Takahashi J.B., Ohtsuka T., Asahi M., Matsuura N., Kikuchi H. (1996) // Expression of heat shock proteins in the developing rat retina. Neuroscience Lett., 205, 215-217
83. Kolakowski J., Makuch R., Stepkowski D., Dabrowska R. (1995) // Interaction of calponin with actin and its functional implications. Biochem. J., 306, 199-204
84. Koyasu S., Nishida E., Kadowaki T., Matsuzaki F., Iida K., Harada F., Kasuga M., Sakai H., Yahara I. (1986) // Two mammalian heat shock proteins, hsp90 and hsplOO, are actin-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8054-8058
85. Laemmli U.K. (1970) // Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T-4. Nature, 227, 680-685
86. Lai B-T., Chin N.W., Stanek A.E., Ken W., Lanks K.W. (1984) // Quantitation and intracellular localization of the 85K heat shock protein by using monoclonal and polyclonal antibodies. Mol. Cell. Biol., 4, 2802-2810
87. Lanks K.W. (1989) // Temperature-dependent oligomerization of hsp85 in vitro. J. Cell. Physiol., 140, 601-607
88. Lawson B., Brewer J.W., Hendershot L.M. (1998) // Geldanamycin, an hsp90/GRP94-binding drug, induces increased transcription of endoplasmic reticulum (ER) chaperones via the ER stress pathway. J. Cell. Physiol., 174, 170-178
89. Lees-Miller S.P., Anderson C.W. (1989a) // The human double-stranded DNA-activated protein kinase phosphorylates the 90-kDa heat shock protein, hsp90a at two NH2-terminal threonine residues. J. Biol. Chem., 264, 17275-17280
90. Lees-Miller S.P., Anderson C.W. (1989b) // Two human 90-kDa heat shock proteins are phosphorylated in vivo at conserved serines that are phosphorylated in vitro by casein kinase II. J. Biol. Chem., 264, 2431-2437
91. Legagneux V., Dubois M-F., Morange M., Bensaude O. (1988) // Phosphorylation of the 90 kDa heat shock protein in heat shocked HeLa cell lysates. FEBS Lett., 231, 417-420
92. Legagneux V., Morange M., Bensaude O. (1991) // Heat shock increases turnover of 90 kDa heat shock protein phosphate groups in HeLa cells. FEBS Lett., 291, 359-362
93. Liao J., Lowthert L.A., Ghori N., Omary M.B. (1995) // The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J. Biol. Chem., 270, 915-922
94. Lindquist S., Craig E.A. (1988) // The heat-shock proteins. Annu. Rev. Genet., 22, 631-677
95. Lorimer G.H. (1994) // GroEL structure: a new chapter on assisted folding. Structure, 15, 1125-1128
96. Lu F.W., Freedman M.V., Chalovich J.M. (1995) // Characterization of calponin binding to actin. Biochemistry, 34, 11864-11871
97. Lu Z., Cyr D.M. (1998) // Protein folding activity of hsp70 is modified differentialy by the hsp40 co-chaperones Sisl and Ydjl. J. Biol. Chem., 273, 27824-27830
98. Mabuchi K., Li B., Ip W., Tao T. (1997) // Association of calponin with desmin intermediate filaments. J. Biol. Chem., 272, 22662-22666
99. Mabuchi K., Tao T., Wang C.-L.A. (1996) // Immunochemical localization of caldesmon and calponin in chicken gizzard smooth muscles. J. Muscle Res. Cell Motil., 17, 243-260
100. Makuch R., Birukov K., Shirinsky V., Dabrowska R. (1991) // Functional interrelationship between calponin and caldesmon. Biochem. J., 280,33-38
101. Malnic B., Reinach F.C. (1994) // Assembly of functional skeletal muscle troponin complex in Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 222, 49-54
102. Marston S.B. (1991) // Properties of calponin isolated from sheep aorta thin filaments. FEBS Lett., 292, 179-182
103. Marston S.B., Huber P.A.J. (1996) // Caldesmon in the book "Biochemistry of smooth muscle contraction". M. Barany (Ed.), p. 77-90, San Diego, Academic Press
104. Maruya M., Sameshima M., Nemoto T., Yahara I. (1999) // Monomer arrangement in hsp90 dimer as determined by decoration with N and C-terminal region specific antibodies. J. Mol. Biol., 285, 903-907
105. McGough A. (1998) // F-actin binding proteins. Curr. Opin. Struct. Biol., 8, 166-176
106. Meggio F., Donella-Deana A., Pinna L.A., Moret V. (1977) // Phosphorylation of casein fractions by rat liver "phosvitin kinase". FEBS Lett., 75, 192-196
107. Menice C.B., Hulvershorn J., Adam L.P., Wang A.C.-L., Morgan K.G. (1997) // Calponin and mitogen-activated protein kinase signaling in differentiated vascular smooth muscle. J. Biol. Chem., 272, 25157-25161
108. Mezgueldi M., Fattoum A., Derancourt J., Kassab R. (1992) // Mapping of the functional domains in the amino-terminal region of calponin. J. Biol. Chem., 267, 15943-15951
109. Mezgueldi M., Strasser P., Fattoum A., Gimona M. (1995b) // Expressing functional domains of mouse calponin: involvement of the region around alanine 145 in the actomyosin ATPase inhibitory activity of calponin. J. Muscle Res. Cell Motil, 171, 124
110. Minami Y., Hohfeld J., Ohtsuka K., Hartl F-U. (1996) // Regulation of the heat shock protein 70 reaction cycle by the mammalian DnaJ homology, hsp40. J. Biol. Chem, 271, 19617-19624
111. Minami Y, Kawasaki H, Miyata Y, Suzuki K, Yahara I. (1991) // Analysis of native forms and isoform compositions of the mouse 90-kDa heat shock protein, hsp90. J. Biol. Chem, 266, 10099-10103
112. Minami Y, Kawasaki H, Suzuki K, Yahara I. (1993) // The calmodulin-binding domain of the mouse 90-kDa heat shock protein. J. Biol. Chem, 268, 9604-9610
113. Mino T„ Yuasa U„ Nakamura F, Naka F, Tanaka T. (1998) // Two distinct actin-binding sites of smooth muscle calponin. Eur. J. Biochem, 251, 262-268
114. Miyata Y, Yahara I. (1991) // Cytoplasmic 8S glucocorticoid receptor binds to actin filaments through the 90-kDa heat shock protein moiety. J. Biol. Chem, 266, 8779-8783
115. Miyata Y., Yahara I. (1992) // The 90-kDa heat shock protein, hsp90, binds and protects casein kinase II from self-aggregation and enhances its kinase activity. J. Biol. Chem., 267, 7042-7047
116. Miyata Y., Yahara I. (1995) // Interaction between casein kinase II and the 90-kDa stress protein, hsp90. Biochemistry, 34, 8123-8129
117. Moore S.K., Kozak C., Robinson E.A., Ullrich S.J., Appella E. (1989) // Murine 86- and 84-kDa heat shock proteins, cDNA sequences, chromosome assignments, and evolutionary origins. J. Biol. Chem., 264, 5343-5351
118. Murphy R.A. (1994) // What is special about smooth muscle? The significance of covalent cross-bridge regulation. FASEB J., 8, 311-318
119. Nadeau K„ Das A., Walsh C.T. (1993) // Hsp90 chaperonins possess ATPase activity and bind heat shock transcription factors and peptidyl prolyl isomerases. J. Biol. Chem., 268, 1479-1487
120. Naka M., Kureishi Y., Muroga Y., Takahashi K., Ito M., Tanaka T. (1990) // Modulation of smooth muscle calponin by protein kinase C and calmodulin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 171, 933-937
121. Nemoto T., Ohara-Nemoto Y., Ota M., Takagi T., Yokoyama K. (1995) // Mechanism of dimer formation of the 90-kDa heat-shock protein. Eur. J. Biochem., 233, 1-8
122. Nemoto T., Sato N. (1998) // Oligomeric forms of the 90-kDa heat shock protein. Biochem. J., 330, 989-995
123. Nicholl I.D., Quinlan R.A. (1994) // Chaperone activity of a-crystallin modulates intermediate filament assembly. EMBO J., 13, 945-953
124. Nishida E., Koyasu S., Sakai H., Yahara I. (1986) // Calmodulin-regulated binding of the 90-kDa heat shock protein to actin filaments. J. Biol. Chem., 261, 16033-16036
125. North A.J., Gimona M., Cross R.A., Small J.V. (1994) // Calponin is localized in both the contractile apparatus and the cytoskeleton of smooth muscle cells. J. Cell Sci., 107,437-444
126. Obermann W.M.J., Sondermann H., Russo A.A., Pavletich N.P., Hartl F.U. (1998) // In vivo function of hsp90 is dependent on ATP binding and ATP hydrolysis. J. Cell Biol., 143, 901-910
127. Oppermann H., Levinson W., Bishop J.M. (1981) // A cellular protein that associates with the transforming protein of Rous sarcoma virus is also a heat-shock protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1067-1071
128. Panaretou B., Prodromou C., Roe S.M., O'Brien R., Ladbury J.E., Piper P.W., Pearl L.H. (1998) // ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J., 17, 4829-4836
129. Pardee J.D., Spudich J.A. (1982) // Purification of muscle actin. Methods Enzymol., 85, 164-176
130. Parker C.A., Takahashi K., Tang J.X., Tao T., Morgan K.G. (1998) // Cytoskeletal targeting of calponin in differentiated, contractile smooth muscle cells of the ferret. J. Physiology, 508, 187-198
131. Parker C.A., Takahashi K., Tao T., Morgan K.G. (1994) // Agonist-induced redistribution of calponin in contractile vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol., 267, 1262-1270
132. Parsell D.A., Lindquist S. (1993) // The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. Annu. Rev. Genet., 27, 437-496
133. Perdew G.H., Hord N., Hollenback C.E., Welsh M.J. (1993) // Localization and characterization of the 86- and 84-kDa heat shock proteins in Hepa lclc7 cells. Exp. Cell Res., 209, 350-356
134. Perry S.V. (1998) // Troponin T: genetics, properties and function. J. Muscle Res. Cell Motil., 19, 575-602
135. Perry S.V. (1999) // Troponin I: inhibitor or facilitator. Mol. Cell. Biochemistry, 190, 9-32
136. Pinna L.A., Ruzzene M. (1996) // How do protein kinases recognize their substrates? Biochim. Biophys. Acta., 1314, 191-225
137. Potter J.D. (1982) // Preparation of troponin and its subunits. Methods Enzymol., 85,234-240
138. Pratt W.B. (1993) // The role of heat shock proteins in regulating the function, folding, and trafficking of the glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem., 268, 21455-21458
139. Pratt W.B. (1997) // The role of the hsp90-based chaperone system in signal transduction by nuclear receptors and receptors signaling via MAP kinase. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 37, 297-326
140. Pratt W.B., Dittmar K.D. (1998) // Studies with purified chaperones advance the understanding of the mechanism of glucocorticoid receptor-hsp90 heterocomplex assembly. TEM., 9, 244-252
141. Prodromou C., Roe S.M., Piper P.W., Pearl L.H. (1997) // A molecular clamp in the crystal structure of the N-terminal domain of the yeast hsp90 chaperone. Nature Struct. Biol., 4,477-482
142. Prodromou C., Siligardi G., O'Brien R., Woolfson D.N., Regan L., Panaretou B., Ladbury J.E., Piper P.W., Pearl L.H. (1999) // Regulation of hsp90 ATPase activity by tetratricopeptide repeat (TPR)-domain co-chaperones. EMBO J., 18, 754-762
143. Quinlan R., Hutchison C., Lane B. (1995) // Intermediate filament proteins. Protein Profile, 2, 801-832
144. Quraishi H., Brown I.R. (1995) // Expression of heat shock protein 90 (hsp90) in neural and nonneural tissues of the control and hyperthermic rabbit. Exp. Cell Res., 219, 358-363
145. Rayment I., Holden H.M. (1994) // The three-dimensional structure of molecular motor. Trends in Biochem. Sci., 19, 129-134
146. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D.R., Benninng M.M., Winkelma D.A., Wesenberg G., Holden H.M. (1993) // Three dimensional structure of myosin subfragmment-1: a molecular motor. Science, 261, 50-58
147. Riera M., Roher N., Miro F., Gil C., Trujillo R., Aguilera J., Plana M., Itarte E. (1999) // Association of protein kinase CK2 with eukaryotic translation initiation factor eIF-2 and with grp94/endoplasmin. Mol. Cell. Biochem., 191, 97-104
148. Roe S.M., Prodromou C., O'Brien R., Ladbury J.E., Piper P.W., Pearl L.H. (1999) // Structural basis for inhibition of the hsp90 molecular chaperone by the antitumor antibiotics radicicol and geldanamycin. J. Med. Chem., 42, 260-266
149. Rose D.W., Wettenhall R.E.H., Kudlicki W., Kramer G., Hardesty B. (1987) // The 90-kilodalton peptide of the heme-regulated eIF-2a kinase has sequence similarity with the 90 kilodalton heat shock protein. Biochemstry, 26, 6583-6587
150. Sakagami M., Morrison P., Welch WJ. (1999) // Benzoquinoid ansamycins (herbimycin A and geldanamycin) interfere with the maturation of growth factor receptor tyrosine kinases. Cell Stress Chaperones, 4, 19-28
151. Santoro M.G. (1999) // Heat shock factors and the control of the stress response. Biochem. Pharmacol., 59, 55-63
152. Scheibel T., Buchner J. (1998) // The hsp90 complex a super-chaperone machine as a novel drug target. Biochem. Pharmacol., 56, 675-682
153. Scheibel T., Neuhofen S., Weikl T., Mayr C., Reinstein J., Vogel P.D., Buchner J. (1997) // ATP-binding properties of human hsp90. J. Biol. Chem., 272, 18608-18613
154. Scheibel T., Siegmund H.I., Jaenicke R., Ganz P., Lilie H., Buchner J. (1999) // The charged region of hsp90 modulates the function of the N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1297-1302
155. Scheibel T., Weikl T., Buchner J. (1998) // Two chaperone sites in hsp90 differing in substrate specificity and ATP dependence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1495-1499
156. Schlatter L.K., Howard K.J., Parker M.G., Distelhorst C.W. (1992) // Comparison of the 90-kilodalton heat shock protein interaction with in vitro translated glucocorticoid and estrogen receptors. Mol. Endocrinol., 6, 132-140
157. Schneider H-C., Berthold J., Bauer M.F., Dietmeier K., Guiard B., Brunner M., Neupert W. (1994) // Mitochondrial hsp70/MIM44 complex facilitates protein import. Nature, 371, 768-774
158. Schowaiter D.B., Sullivan W.P., Maihle N.J., Dobson A.D.W., Conneely O.M., O'Malley B.W., Toft D.O. (1991) // Characterization of progesterone receptor binding to the 90- and 70-kDa heat shock proteins. J. Biol. Chem., 266, 21165-21173
159. Schulte T.W., Blagosklonny M.V, Ingui C., Neckers L. (1995) // Disruption of the Raf-l-hsp90 molecular complex results in destabilization of Raf-1 and loss of Raf-l-Ras association. J. Biol. Chem., 270, 24585-24588
160. Segnitz B., Gehring U. (1997) // The function of steroid hormone receptors is inhibited by the hsp90-specific compound geldanamycin. J. Biol. Chem., 272, 18694-18701
161. Shi Y., Brown E.D., Walsh C.T. (1994) // Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2767-2771
162. Shirinsky V.P., Birukov K.G., Hettash J.M., Sellers J.R. (1992) // Inhibition of the relative movement of actin and myosin by caldesmon and calponin. J. Biol. Chem., 267, 15886-15892
163. Small J.V., Gimona M. (1998) // The cytoskeleton of the vertebrate smooth muscle cell Acta Physiol. Scand., 164, 341-345
164. Smith D.F., Whitesell L., Nair S.C., Chen S., Prapapanich V., Rimerman R.A. (1995) // Progesterone receptor structure and function altered by geldanamycin, an hsp90-binding agent. Mol. Cell. Biol., 15, 6804-6812
165. Sobue K., Sellers J.R. (1991) // Caldesmon, a novel regulatory protein in smooth muscle and nonmuscle actomyosin systems. J. Biol. Chem., 266, 12115-12118
166. Spector T. (1978) // Refinement of the Coomassie blue method of protein quantitation. Anal. Biochem., 86, 142-146
167. Squire J.M., Morris E.P. (1998) // A new look at thin filamnet regulation in vertebrate skeletal muscle. FASEB J., 12, 761-771
168. Stafford W.F., Mabuchi K., Takahashi K., Tao T. (1995) // Physical characterization of calponin: a circular dichroism, analytical ultracentrifuge, and electron microscopy study. J. Biol. Chem., 270, 10576-10579
169. Stebbins C.E., Russo A.A., Schneider C., Rosen N., Hartl F.U., Pavletich N.P. (1997) // Crystal structure of an Hsp90-geldanamycin complex: targeting of a protein chaperone by an antitumor agent. Cell, 89, 239-250
170. Steinert P.M., Roop D.R. (1988) // Molecular and cellular biology of intermediate filaments. Annu. Rev. Biochem., 57, 593-625
171. Stradal T, Kranewitter W., Winder S.J., Gimona M. (1998) // CH domains revisited. FEBS Lett., 431, 134-137
172. Stull J. T. (1980) // Phosphorylation of contractile proteins in relation to muscle function. Adv. Cycl. Nucl. Res., 13, 39-91
173. Sullivan W.P., Stensgard B., Caucutt G., Bartha B., McMahon N., Alnemri E.S., Litwack G., Toft D.O. (1997) // Nucleotides and two functional states of hsp90. J. Biol. Chem., 272, 8007-8012
174. Sullivan W.P., Toft D.O. (1993) // Mutational analysis of hsp90 binding to the progesterone receptor. J. Biol. Chem., 268, 20373-20379
175. Szabo A., Langer T., Schroder H., Flanagan J., Bukau B., Hartl F.U. (1994) // The ATP hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli hsp70 system DnaK, DnaJ and GrpE. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1034510349
176. Szpacenko A., Dabrowska R. (1989) // Functional domain of caldesmon. FEBS Lett., 202, 182-186
177. Szymanski P.T., Goyal R. (1999) // Calponin binds to the 20-kilodalton regulatory light chain of myosin. Biochemistry, 38, 3778-3784
178. Szymanski P.T., Tao T. (1997) // Localization of protein regions involved in the interaction between calponin and mysoin. J. Biol. Chem., 272, 11142-11146
179. Takahashi K., Abe M., Hiwada K, Kokubu T. (1988) // A novel troponin T-like protein (calponin) in vascular smooth muscle: interaction with tropomyosin paracrystals. J. Hypertens., 6, 940-943
180. Takahashi K., Hiwada K., Kokubu T. (1986) // Isolation and characterization of 34000-dalton calmodulin- and F-actin-binding protein from chicken gizzard smooth muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun., 141, 2026
181. Takahashi K., Nadal-Ginard B. (1991) // Molecular cloning and sequence analysis of smooth muscle calponin. J. Biol. Chem., 266, 1328413288
182. Takahashi K., Nadal-Ginard B. (1992) // Addition and corrections to: Molecular cloning and sequence analysis of smooth muscle calponin. J. Biol. Chem., 267, 26128
183. Tang J.X., Janmey P.A. (1996) // The polyelectrolyte nature of F-actin and the mechanism of actin bundle formation. J. Biol. Chem., 271, 8556-8563
184. Tang J.X., Szymanski P.T., Janmey P.A., Tao T. (1997) // Electrostatic effects of smooth muscle calponin on actin assembly. Eur. J. Biochem., 247, 432-440
185. Thulasiraman V., Matts R.L. (1996) // Effects of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry, 35, 13443-13450
186. Uehara Y., Fukazawa H. (1998) // Use and selectivity of herbimycin A as inhibitor of protein-tyrosine kinases, in Protein phosphorylation, Ed. Sefton, B.M. and Hunter T., p. 563-571, Academic Press
187. Vancompernolle K, Gimona M, Herzog M, Van Damme J, Vandekerckove J, Small V. (1990) // Isolation and sequence of a tropomyosin-binding fragment of turkey gizzard calponin. FEBS Lett, 274, 146-150
188. Vandekerckhove J.S, Kaiser D.A, Pollard T.D. (1989) // Acanthamoeba actin and profilin can be cross-linked between glutamic acid 364 of actin and lysine 115 of profilin. J. Cell Biol, 109, 619-626
189. Vorotnikov A.V, Gusev N.B. (1991) // Some properties of smooth muscle caldesmon. Biochem. J, 273, 161-163
190. Walker A.I, Hunt T, Jackson R.J, Anderson C.W. (1985) // Double-stranded DNA induces the phosphorylation of several proteins including the 90 000 mol. wt. heat-shock protein in animal cell extracts. EMBO J, 4, 139145
191. Walsh M.P. (1991) // Calcium-dependent mechanisms of smooth muscle contraction. Biochem. Cell Biol, 69, 771-800
192. Walsh M.P. (1993) // Regulation of vascular smooth muscle tone. Can. J. Physiol. Pharmacol, 72, 919-936
193. Walsh M.P. (1994) // Calmodulin and the regulation of smooth muscle contraction. Mol. Cell. Biochem, 135, 21-41
194. Wang P, Gusev N.B. (1996) // Interaction of smooth muscle calponin with desmin. FEBS Lett, 392, 255-258
195. Wartmann M, Davis R.J. (1994) // The native structure of the activated Raf protein kinase is a membrane-bound multi-subunit complex. J. Biol. Chem, 269, 6695-6701
196. Wearsch P.A, Nicchitta C.V. (1997) // Interaction of endoplasmic reticulum chaperone grp94 with peptide substrates is adenine nucleotide-independdent. J. Biol. Chem, 272, 5152-5156
197. Welch W.J, Feramisco J.R. (1982) // Purification of the major mammalian heat shock proteins. J. Biol. Chem, 257, 14949-14959
198. Whitesell L, Cook P. (1996) // Stable and specific binding of heat shock protein 90 by geldanamycin disrupts glucocorticoid receptor function in intact cells. Mol. Endocrinol, 10, 705-712
199. Wills F.L, McCubbin W.D, Kay C.M. (1993) // Characterization of smooth muscle calponin and calmodulin complex. Biochemistry, 32, 23212328
200. Wills F.L, McCubbin W.D, Kay C.M. (1994) // Smooth muscle calponin-caltropin interaction: effect on biological activity and stability of calponin. Biochemistry, 33, 5562-5569
201. Winder S.J, Allen B.G, Fraser E.D, Kang H.-M, Kargacin G.J, Walsh M.P. (1993b) // Calponin phosphorylation in vitro and in intact muscle. Biochem. J, 296, 827-836
202. Winder S.J., Pato M.D., Walsh M.P. (1992a) // Purification and characterization of calponin phosphatase from smooth muscle: effect of dephosphorylation on calponin function. Biochem. J., 286, 197-203
203. Winder S J., Sutherland C., Walsh M.P. (1992b) // A comparison of the effects of calponin on smooth and skeletal muscle actomyosin systems in the presence and the absence of caldesmon. Biochem. J., 288, 157-164
204. Winder S.J., Walsh M.P. (1990) // Smooth muscle calponin: inhibition of actomyosin MgATPase and regulation by phosphorylation. J. Biol. Chem., 265, 10148-10155
205. Winder S.J., Walsh M.P. (1993) // Calponin: thin filament-linked regulation of smooth muscle contraction. Cell Signal., 5, 677-686
206. Winder S.J., Walsh M.P., Vasulka C., Johnson J.D. (1993a) // Calponin-calmodulin interaction: properties and effects on smooth and skeletal muscle actin binding and actomyosin ATPases. Biochemistry, 32, 1332713333
207. Yahara I., Iida H., Koyasu S. (1986) // A heat shock-resistant variant of Chinese hamster cell line constitutively expressing heat shock protein of Mr 90,000 at high level. Cell. Struct. Funct., 11, 65-73
208. Yonehara M., Minami Y., Kawata Y., Nagai J., Yahara I. (1996) // Heat-induced chaperone activity of hsp90. J. Biol. Chem., 271, 2641-2645
209. Yonezawa N., Nishida E., Sakai H., Koyasu S., Matsuzaki F., Iida K., Yahara I. (1988) // Purification and characterization of the 90-kDa heat-shock protein from mammalian tissues. Eur. J. Biochem., 177, 1-7
210. Young J.C, Obermann W.M.J., Hartl F.U. (1998) // Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. J. Biol. Chem., 273, 18007-18010
211. Young J.C., Schneider C., Hartl F.U. (1997) // In vitro evidence that hsp90 contains two independent chaperone sites. FEBS Lett., 418,139-143
-
Ма Юйшу
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2000
-
ВАК 03.00.04
- Защита эндотелиальных клеток сосудов человека от повреждения при ишемии in vitro
- Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы под действием белка теплового шока Hsp90
- Сравнительный структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и крысы
- Термодинамический анализ доменной организации кальций-зависимых белков
- Тропомиозин и альфа-актинин-4 в составе мультимолекулярных цитоплазматических комплексов, не связанных со структурами цитоскелета
