Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы под действием белка теплового шока Hsp90

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы под действием белка теплового шока Hsp90"

На правах рукописи

ПОСТНИКОВ АЛЕКСАНДР БОРИСОВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ РАСТВОРИМОЙ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ ПОД ДЕЙСТВИЕМ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА Hsp90

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в проблемной научно-исследовательской лаборатории «Химии ферментов» кафедры биоорганической химии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Коц А. Я.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Муронец В. И.

доктор биологических наук, профессор, Медведев А.Е.

Ведущая организация:

Защита состоится_

НИИ экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Ло

,.2004 года в

на заседании диссертационного совета

Д501.001.71 на биологическом факультете МГУ им. М. В. Ломоносова, по адресу: 119992 ГСП-2 Ленинские горы, д. 1, корп. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан, .2004 года

2.9.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

а/

М. В. Медведева

ОБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Растворимая гуанилатциклаза (рГЦ) является гетеродимерным гемсодержащим ферментом, который представляет собой основной рецептор оксида азота (N0). Молекула N0 - универсальный регулятор состояния сердечнососудистой, иммунной и нервной систем организма. Синтез N0 в клетке осуществляется из молекулы аргинина различными изоформами - фермента NO-синтазы (NOS). N0 связывается с гемовой группой рГЦ, активируя, синтез циклического гуанозинмонофосфата (cGMP) из GTP. Этот внутриклеточный мессенджер в свою очередь модулирует активность cGMP-зависимых протеинкиназ, cGMP-зависимых ионных каналов и cGMP-регулируемых фосфодиэстераз, которые участвуют в таких клеточных процессах как расслабление гладкомышечных клеток, ингибирование агрегации тромбоцитов, модуляция синаптической передачи нервного импульса и экспрессия генов. N0 является наиболее эффективным физиологическим активатором рГЦ (Bian, Murad, 2003). Тем не менее, спектр эндогенных активаторов рГЦ довольно широк и включает в себя низкомолекулярные соединения различной природы. В число этих соединений входят как активаторы, так и ингибиторы рГЦ, которые действуют на различные регуляторные участки фермента. рГЦ подвержена ингибированию различными окислителями, которые переводят гемовое железо га ферро в ферри форму, блокируя связывание N0 (например, производные оксадиазолохиноксалинона), или модифицируют сульфгидрильные группы, ответственные за функционирование фермента В литературе 7080-х годов описаны факторы белковой природы способные стимулировать рГЦ, однако эти факторы • не были идентифицированы и не была доказана их способность специфично -взаимодействовать с рГЦ. Недавно было обнаружено взаимодействие одной из изоформ рГЦ с белком постсинаптической плотности синаптосом мозга (PSD-95), что может быть связано с формированием функциональных многокомпонентных белковых комплексов, в которых синтез сигнальных молекул и ответные реакции ферментов-эффекторов пространственно сопряжены (Fedele et al., 1998). Однако в этом исследовании не было выявлено непосредственное влияние взаимодействия рГЦ и PSD-95 на синтез cGMP. Таким образом, несмотря на единичные сведения о взаимодействии рГЦ с другими белками клетки, не существует ясных представлений о регуляции активности фермента за счет белок-белковых взаимодействий.

Синтез, стабильность и связывание оксида азота с рГЦ, а также функционирование фермента в клетке зависят от окислительно-восстановительного состояния гема и SH-rpyrai. Таким образом, внутриклеточная система передачи сигнала NO^^cGMP может быть

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

^ вШ Г lili л «ля ьа *

«

повреждена в ходе окислительного стресса, который сопровождает многие патологические состояния, такие как ишемия/реперфузия, диабет и атеросклеротическое повреждение кровеносных сосудов. В нормальной клетке существует специальная антиоксидантная система, функцией которой является нейтрализация различных активных форм кислорода -основных повреждающих агентов окислительного стресса Известно, однако, что умеренный непродолжительный стресс может в значительной мере защитить NO-зависимые пути передачи сигнала от последующего острого стресса (Kodani et al., 2002). В результате такого защитного стресса индуцируется синтез ряда белков теплового шока (Hsp). Помимо основной функции Hsp, заключающейся в осуществлении фолдинга и поддержании функционального взаимодействия белков, для некоторых из них характерна способность к защите различных ферментов от окислительной инактивации подобно внутриклеточным низкомолекулярным тиолам. Например, повышенная экспрессия Hsp90 может быть связана с уменьшением чувствительности некоторых ферментов к окислительной инактивации, вызванной ионами металлов. Однако точный механизм защитного действия Hsp не известен.

Недавние исследование показали роль Hsp90 в регуляции системы NOрГЦ-cGMP. Например, Hsp90 может регулировать активность эндотелиальной и нейрональной изоформ NO-синтаз. Hsp90 стимулирует синтез N0 и подавляет образование супероксид-аниона, осуществляемые NOS. Hsp90 связывается с эндотелиальной NOS и стимулирует активацию фермента кальмодулином. Оказалось, что Hsp90 значительно облегчает встраивание гемовой группы в молекулу NO-синтазы, участвуя в формировании активного фермента.

В настоящем исследовании был осуществлен широкий поиск белковых факторов, способных регулировать активность рГЦ. На основании существующих теоретических предпосылок была сформулирована и проверена гипотеза о том, что помимо NO-синтаз, Hsp90 может взаимодействовать с рГЦ и регулировать ее активность.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы было исследовать влияние Hsp90 на синтез cGMP, катализируемый растворимой ГЦ, в присутствии гемзависимых, гемнезависимых и аллостерических активаторов рГЦ, а также в модельных условиях окислительного стресса В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. охарактеризовать взаимодействие Hsp90 и рГЦ с использованием очищенных белков, а также показать возможность образования комплекса Hsp90 и рГЦ в ткани.

2. показать специфичность эффектов Hsp90 по сравнению с другими белками теплового шока

3. изучить влияние Hsp90 на гемзависимую и гемнезависимую активность рГЦ.

4. исследовать возможность конформационной стабилизации рГЦ под действием Hsp90

в условиях, моделирующих окислительный стресс.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В результате поиска белковых факторов, способных регулировать активность рГЦ, было обнаружено, что Hsp90 активирует Мп2+-зависимую активность фермента. Поскольку взаимодействие рГЦ и Hsp90 показано впервые, в работе были детально изучены кинетические и равновесные параметры связывания двух белков. С использованием метода поверхностного плазмонного резонанса было показано, что связывание рГЦ и Hsp9O характеризуется высокой аффинностью, наибольшей в ряду известных белков-мишеней Hsp90. Комплекс рГЦ и Hsp90 формируется медленно, но, сформировавшись, остается стабильным в течение продолжительного времени. Основную роль в образовании комплекса играют ионные силы, в то время как гидрофобные взаимодействия между двумя молекулами не столь существенны. Снижение уровня экспрессии Hsp90 в клетках приводило к заметному снижению NO-зависимого синтеза cGMP. Показано, что Hsp90 стимулирует активность рГЦ в присутствии различных регуляторов фермента, включая ионы Мп2+, протопорфирин-1Х, N0 и комбинацию N0 и аллостерического активатора фермента BAY 41-2272. Исследование механизма регуляции активности рГЦ под действием Hsp90 показало, что белок теплового шока стабилизирует молекулу рГЦ, сохраняя способность фермента эффективно связывать N0. Было показано, что в комплексе с Hsp90 функциональные SH-группы рГЦ пространственно защищены от модификации под действием ионов Мп2+ и Cd2+, которая может приводить к ингибированию базальной и NO-зависимой активности фермента.

Результаты данного исследования вносят существенный вклад в развитие представлений о механизмах регуляции сигнального каскада КО-рГЦ-cGMP. Понимание участия Hsp90 в синтезе cGMP, осуществляемом рГЦ, может быть использовано при создании эффективных способов воздействия на NO/cGMP-зависимые процессы. Апробация работы.

Результаты работы были представлены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова (Москва, 15 декабря 2003), на международной конференции «Физиология кровообращения» (Москва, 19 января 2004), на ежегодном семинаре Европейского физиологического общества («Рецепторы и клеточная сигнализация в условиях окислительного стресса», Будапешт, Венгрия, апрель 2003), на XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, февраль 2002), на международной

конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ-2001»

(Москва, апрель 2001).

Публикации.

Результаты работы опубликованы в одной статье, одном патенте Российской Федерации и 6 тезисах международных конференций. Структура и объём диссертации.

Диссертационная работа построена по традиционному принципу и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 155 страниц машинописного текста, 4 таблицы и 29 рисунков. Список литературы включает 272 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определения активности рГЦ. Метод определения активности рГЦ основан на каталитическом превращении [ct-32P]GTP в [32P]cGMP, выделении [32P]cGMP из реакционной смеси и определении его концентрации при помощи метода измерения радиоактивности по Черепкову. Активность рГЦ выражали в пмоль или нмоль cGMP/мин/мг белка.

Стандартная инкубационная смесь содержала Конечная концентрация рГЦ в пробе составляла 10-30 мкг белка/мл. Пробы инкубировали при 37°С в течение 15 мин. Реакцию останавливали кипячением в водяной бане в течение 2 мин. Не вступивший в реакцию GTP и денатурированный кипячением белок удаляли при помощи соосаждения с карбонатом цинка.

Для выделения использовали хроматографию на колонках с окисью

алюминия нейтральной по Брокману (II). Элюат собирали в сцинтилляционные флаконы. Радиоактивность образцов определяли по Черепкову на сцинтилляционном счетчике Rack-Beta (LKB, Швеция) в тритиевом канале.

Выделение рГЦ из легких свиньи.

Все операции проводили при температуре Активность рГЦ определяли, как описано выше. По результатам. измерения активности рГЦ на каждой стадии были объединены фракции, которые использовали для последующих стадий хроматографической очистки. Стадии очистки рГЦ:

1. Гомогенизация и получение супернатанта 100000 g легких свиньи.

2. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Toyopearl.

3. Аффинная хроматография на голубой агарозе.

4. Адсорбционная хроматография на гидроксиапатите.

5. Ионообменная хроматография БРЬС на колонке р-НуТгар 5 мл.

6. Гель-фильтрация БРЬС на Сефакриле 8-300.

Аналогичный протокол за исключением стадий 4, 5 и 6 был использован и для получения препарата частично очищенной рГЦ из легких быка. Чистота препарата рГЦ из легких свиньи по данным ДС-Ка-электрофореза и лазерного денситометрирования геля составила 85%. Аликвоты очищенного белка хранили в жидком азоте. В зависимости от выделения и источника рГЦ активность очищенного фермента и профиль действия аллостерических регуляторов варьировали, что отражено в разделе «Результаты исследования».

Реконструкция рГЦ с активирующими факторами. Для выявления факторов, способных активировать рГЦ использовали частично очищенный фермент из ткани легких быка. рГЦ в концентрации 40 мкг/мл преинкубировали (в конечном объеме 25 мкл) с препаратами активатора, полученными при фракционировании экстракта печени кролика на фенил-сефарозе СЬ-4Б, ДЭАЭ-Тойоперл 650М, гидроксиапатите (от 1 до 1500 мкг белка/мл) или с очищенным из печени кролика Нр90 (чистота 90%) при 37°С в течение 15 мин. Затем в пробах определяли активность рГЦ, добавляя стандартную инкубационную смесь, содержащую 5 мМ МпС12. В ходе преинкубации концентрация очищенного №р90 составляла 0,4 мг/мл, что соответствует конечной концентрации в пробе для определения активности рГЦ 0,1 мг/мл.

Изучение характеристик взаимодействия рГЦ и Hsp90 при помощи метода поверхностного плазменного резонанса.

Термодинамические и кинетические константы связывания рГЦ и Нф90 изучались с использованием установки Б1асоге X при 25°С. Рекомбинантная рГЦ человека и Нр90 из печени кролика были иммобилизованы на поверхности сенсорного чипа СМ5. Иммобилизацию проводили по аминогруппам белка Оптический сигнал с каната Бс1 автоматически вычитался из сигнала контрольного канала Бс2. В отсутствие раствора белка базовая линия сигнала была стабильна и изменялась не более чем на 1 Яи (условную единицу).

Все эксперименты были выполнены с использованием буфера НБ8Р, содержащего 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4,150 мМ №С1 и 0,005% неионный детергент Р-20. Скорость протока подвижной фазы через чип составляла 10-30 мкл/мин. Рост оптического сигнала свидетельствует об ассоциации белка. При промывке чипа НБ8Р наблюдается диссоциация адсорбированного балка. Поверхность чипа регенерировали при помощи НБ8Р, содержащего 2 М №С1.

Обработка данных производилась при помощи программного пакета Б1Леуа1иайоп V. 3.1. Для стадии диссоциации проводилось определение кинетической константы диссоциации

согласно простой экспоненциальной модели при помощи статистического оценочного критерий Массив данных стадии ассоциации использовался для определения константы ассоциации к,. Равновесная константа диссоциации вычислялась Ко равная отношению к^кк* Для описания процесса взаимодействия рГЦ и Hsp90 была использована модель адсорбции 1:1 Лангмюра Кривые для различных концентраций белка в подвижной фазе приводились к одному модельному уравнению одновременно. При определении Ко был использован подход, рекомендованный Myszka (Myszka, 1999).

Коиммунопреципитация рГЦ и взаимодействующих с ней белков из ткани легких кролика. Анализ состава преципитированных комплексов рГЦ.

Небольшие фрагменты свежевыделенных легких кролика (200 мг), лишенные крупных сосудов инкубировали при 37°С в 0,5 мл питательной среды ДМЕМ (рН 7,0) с различными добавками. После инкубации ткань гомогенизировали в 0,5 мл буфера для гомогенизации, содержащего пирофосфат

натрия, 2,5 мМ ЭДТА и 1 табл. комбинированного препарата ингибиторов протеаз («Roche», Швейцария)/4 мл. Гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин при +4°С. К супернатанту добавляли 30 мкл протеин-А-сефарозы для удаления неспецифически сорбируемых белков и эндогенных иммуноглобулинов. Через 15 мин протеин-А-сефарозу удаляли и в 410 мкл супернатанта вносили 10 мкл антител клона В4 к а-субъединице рГЦ, и в качестве контроля к ним - равное количество моноклональных антител к филамину. Пробы инкубировали в течение 3 ч при +4°С, затем добавляли 30 мкл протеин-А-сефарозы и продолжали инкубацию в течение 1 ч. Осадок протеин-А-сефарозы промывали один раз буферным раствором, содержащим 50 мМ Трис-HCl, pH 7,6,0,75% Тритон Х-100, и один раз 50 мМ Трис -HCI. К промытой протеин-А-сефарозе добавляли 100 мкл денатурирующей смеси для электрофорезе по методу Лэммли и кипятили на водяной бане в течение 3 мин. Преципитированные белки анализировали методом ДС-Ка-электрофореза с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану и усиленной хемилюминесценции.

Электрофорез в полиакриламидном геле и денситометрия.

Электрофорез проводили по методу Леммли (Laemmli, 1970) в присутствии додецилсульфата натрия (ДС-Na). Концентрация полиакриламида в разделяющем геле составляла 8,5 - 11%,. при массовом соотношении акриламида и метиленбисакриламида равном 37,5. Гель окрашивали кумасси R-250 или осуществляли перенос белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану методом иммуноблоттинга Окрашенные гели сканировали на лазерном денситометре Ultroscan XL (LKB, Швеция), а площади пиков рассчитывали с помощью программы Gelscan v.2.0.

Иммуноблоттинг.

После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану по методу Tcwbin (Towbin, 1979). Для переноса белков использовали буфер, содержащий Трис-глицин/этанольный буфер, содержащий 0,1% (вес/объем) ДС-Na. Мембрану блокировали в течение 30 мин при 37°С в солевом буферном растворе, содержащем 0,05% Tween, 5% обезжиренное сухое молоко. В этот раствор вносили необходимое количество моноклональных антител к целевому белку и инкубировали 1 час. Далее мембрану инкубировали с раствором, содержащим вторичные антикроличьи («Calbiochem», США) или антимышиные Fc-специфичные антитела, коныогированные с пероксидазой, в течение 1 час. Белки, взаимодействующие с антителами, проявляли с использованием диаминобензидина. Окрашенную нитроцеллюлозу сканировали, а площадь и интенсивность полос вычисляли с помощью программы SigmaGel. В некоторых случаях комплексы белков с антителами на поверхности мембраны визуализировали при помощи метода усиленной хемилюминесценции. Время экспозиции мембраны с пленкой Hyperfflm ECL («Ameisham Pharmacia Biotech», Великобритания) 5-45 мин.

Определение свободных сульфгидрильных групп при взаимодействии ДТТ или цистеина с ионами Мп2+, и Cd2*.

Определение проводили по методу Эллмана (Ellman, 1963). Метод основан на реакции свободных сульфгидрильных групп с ДТНБ, в результате которой образуется интенсивно окрашенная 5',5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) с максимумом поглощения при 412 нм (е-13600 М*'см'').

Пробы содержали раствор хлорида

металла в указанной концентрации (5 мкМ - 5 мМ). Пробы инкубировали при 37°С в течение 5 -60 мин и добавляли 1 мл 0,5 мМ ДТНБ на 25 мМ Трис-HCl рН 7,6. Определение оптической плотности проводили на спектрофотометре Ultrospec 2000, «Pharmacia Biotech», Швеция.

Определение концентрации белков.

Для определения концентрации белка при каждом измерении строили калибровочную кривую. Для этого в качестве стандарта использовали раствор сывороточного альбумина человека. Метод описан ранее Лоури с соавт. (Lowry et al., 1951). Общий белок в гомогенатах тканей определяли по цветной реакции с амидовым черным по методу, описанному Шафнером и Вейсманом (Schaflner and Weissman, 1973)

Статистическая обработка результатов проводилась с применением f-критерия Стьюдента для нормального распределения. Отличия считались достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение из печени кролика факторов, регулирующих Мп3*-зависимую активность рГЦ легких, и их идентификация. В литературе описано несколько типов эндогенных факторов, регулирующих активность рГЦ. В некоторых случаях факторами, активирующими рГЦ, оказывались низкомолекулярные соединения, — полиненасыщенные жирные кислоты или производные порфирина. Известны также и высокомолекулярные факторы, активирующие рГЦ. Из легких свиньи был выделен фактор с молекулярной массой 85 кДа, дозозависимо активирующий рГЦ (Какагаша, КИа^та, 1980). В присутствии этого фактора значение увеличивалось в 4 раза, тогда как значение не

изменялось. Фактор оказался чувствительным к нагреванию и протеолизу, устойчивым в кислых и щелочных условиях, не отдиализовывался. Из печени кролика был выделен термостабильный не содержащий гема фактор с молекулярной массой 170 кДа, активирующий рГЦ (ОКЫет е! а1., 1982).

Изучение влияния эндогенных факторов на КО-стимулированную активность рГЦ может быть осложнено присутствием восстановителей и белков, способных взаимодействовать с N0 или влиять на скорость генерации N0 из используемых доноров. Активация рГЦ ионами Мп2*, отличие от N0, не является физиологической, так как обнаруживается при концентрациях, значительно превышающих нормальную концентрацию ионов Мпг+ в клетке. Этот факт позволяет предположить, что в клетке отсутствуют биологические механизмы, на которые специфически воздействуют ионы в высоких концентрациях. С другой стороны, в экстракте ткани, по-видимому, отсутствуют факторы, которые могли бы значительно повлиять на высокую концентрацию ионов (в опытах используется 5 мМ МпС1г). Следует отметить, что активация рГЦ иона^Лд^статочно высока и позволяет установить как ингибирующее, так и стимулирующее действие эндогенных факторов. Известно участие ионов в окислительно-восстановительной

регуляции активности рГЦ. Таким образом, исследование влияния эндогенных факторов на -стимулированную активность рГЦ может привести к идентификации эндогенных факторов, влияющих и на этот способ регуляции активности фермента.

На первой стадии выделения факторов, регулирующих -зависимую активность рГЦ были проведены экстракция и фракционирование сульфатом аммония гомогената печени кролика, как описано в разделе «Материалы и методы». Полученный после центрифугирования супернатант фракционировали с помощью метода гидрофобной хроматографии на колонке с фенил-сефарозой СЬ-4В. Было проанализировано влияние хроматографических фракций на -зависимую активность рГЦ при использовании метода реконструкции, как описано в разделе «Материалы и методы». Как видно из

представленных данных (рис. 1а), гидрофобная хроматография позволяет идентифицировать в печени кролика несколько факторов, активирующих Мп2+-зависимую активность рГЦ. Во всех повторных экспериментах обнаруживается активирующий фактор, соответствующий пику активности реконструированной рГЦ в концевой части градиента сульфата аммония (на

рис. к - фракции 46-54). Активирующее влияние других пиков, сходящих в средней части градиента, на Мп2*-зависимую активность рГЦ сильно варьировало в ходе разных выделений.

На следующем этапе было проведено фракционирование стабильного пика активатора рГЦ с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Тойоперл 650М. Ионообменная хроматография позволяет выделить как минимум два пика активации реконструированной рГЦ (рис. 16), что свидетельствует о неоднородности пика, соответствующего фракциям 46-54 гидрофобной хроматографии. Было обнаружено, что во фракциях 17-23 присутствовал термостабильный фактор, активирующий Мп^-зависимую активность рГЦ. С помощью адсорбционной хроматографии на гидроксиапатите был идентифицирован один пик реконструированной активности рГЦ (рис. 1в). В процессе выделения фактора, стимулирующего -зависимую активность рГЦ, удалось очистить относительно термостабильный белок с молекулярной массой 90 кДа. По молекулярной массе этот фактор сходен с ранее описанными активаторами (Nakazawa, Kitajima, 1980). Мы предположили, что выделенный активатор является белком теплового шока Hsp90. Для проверки этого предположения методом иммуноблоттинга было изучено взаимодействие выделенного активатора с антителами клона 4Н2 к Hsp90 кролика (рис. 1г). Препарат активатора содержал Hsp90, чистота которого после адсорбционной хроматографии на гидроксиапатите составляла 90% Дополнительным доказательством того, что фактор, стимулирующий Мп^-зависимую активность рГЦ представляет собой Нвр90, было совпадение пиков реконструированной Мп3+-зависимой активности рГЦ и содержания: Hsp90 во фракциях на всех стадиях хроматографической очистки (рис. 1а-в).

Изучение взаимодействия очищенных рГЦ и Hsp90 и обнаружение комплексов белков в ткани. Для того чтобы проверить предположение о взаимодействии рГЦ и Н^р90, был использован метод поверхностного плазмонного резонанса, который позволяет изучать кинетические параметры взаимодействия макромолекул различной природы в режиме реального времени и без использования каких-либо меток для детектирования макромолекул. Использование различных концентраций изучаемых белков в подвижной фазе дает наборы аналогичных кинетических кривых, сенсограмм, свидетельствующих о том, что взаимодействие белков в принципе имеет место (рис. 2).

На первом этапе анатиза сенсограмм проводилось определение кинетической константы диссоциации (для стадии диссоциации) согласно простой экспоненциальной модели. Затем массив данных стадии ассоциации использовался для определения константы ассоциации. На последнем этапе вычислялась равновесная константа диссоциации равная отношению кинетической константы диссоциации и константы ассоциации.

А Б

О 200 400 600 0 200 400 600

Время, сек Время, сек

(А) (Б)

кв (М-'-секг1) 1,08-Ю4 9.84104

кл (сек-1) 2,48-Ю"4 5,ОНО"4

Кв (нМ) 23,1 5,04

Рис. 2. Взаимодействие рекомбинантной рГЦ человека и НярЭО из печени кролика, (а) Рекомбинантная рГЦ человека (750 1Ш) бьиа иммобилизована на поверхности чипа, а НэрЭО, выделенный из печени кролика находился в подвижной фазе (скорость пропускания 30 мкл/мин). (б) №р90 из печени кролика (3000 ИЦ) был иммобилизован на поверхности чипа, а рекомбинантная рГЦ человека находилась в подвижной фазе (скорость пропускания 30 мкл/мин). Кинетические характеристики взаимодействия определялись, как описано в разделе «Материалы и методы». 1Ш - условная единица величины оптического резонансного сигнала.

Из полученных данных видно, что для взаимодействия иммобилизованного Hsp90 и рГЦ характерны медленная ассоциация - 9,84 104 М"' сек"1) и также очень медленная диссоциация Итоговая равновесная константа диссоциации

составляет 5,04 нМ и означает, что взаимодействие характеризуется высокой афинностью. Это означает, что комплекс рГЦ и Нэр90 формируется медленно, но, сформировавшись, остается относительно стабильным в течение продолжительного времени. Аналогичные данные получены при изучении взаимодействия иммобилизованной

Метод поверхностного плазмонного резонанса позволил изучить некоторые биохимические характеристики взаимодействия

а

Контроль

б

О 200 400 600

Время, сек

0 200 400 600

Время, сек

Рис. 3. Влияние неионного детергента Р-20, NaCl и гельданамицина на взаимодействие рГЦ и Hsp90. .(a) Hsp90 из печени кролика (3000 RU) бьи иммобилизован на поверхности чипа, а рекомбинантная рГЦ человека в концентрации 62,5 нМ находилась в подвижной фазе (скорость пропускания 30 мкл/мин). Раствор рГЦ был приготовлен с использованием буфера HBSP (Контроль) и HBSP, содержащего 0,5% Р-20 (Р-20,0,5%) или 0,5 М NaCl (NaCl, 0,5 М). Буферы аналогичного сотава использовались и на стадиях диссоциации, (б) Рекомбинантная рГЦ человека (750 RU) была иммобилизована на поверхности чипа, a Hsp90, выделенный из печени кролика находился в подвижной фазе (скорость пропускания. 30 мкл/мин). Раствор Hsp90 в концентрации 1,1 мкМ, приготовленный с использованием буфера HBSP, преинкубировали 5 мин в присутствии 5 мкМ гельданамицина (Гельданамицин, 5 мкМ) или в его отсутствие (Контроль) и затем использовали в качестве подвижной фазы. На стадии диссоциации использовался буфера HBSP (Контроль) или HBSP, содержащий 5 мкМ гельданамицин (Гельданамицин, 5 мкМ).

Было показано, что 0,5% неионный детергент Р-20 лишь незначительно увеличивает (с 4,09 10"4 сек'1 до 5,69 10"* сек"1) кинетическую константу диссоциации комплекса иммобилизованного Hsp90 и рГЦ, в то время как 0,5 М N0 практически полностью блокирует образование комплекса этих белков. Этот результат свидетельствует о том, что основную роль в образовании комплекса рГЦ и Hsp90 играют ионные силы, в то время как гидрофобные взаимодействия между двумя белками оказываются не столь существенными. В другом эксперименте (рис. 36) было показано, что известный ингибитор функций Hsp90, гельданамицин, не влияет на образование комплекса рГЦ и Hsp90. Такой результат позволяет предположить, что конформация АТР/гельданамицин-связывающего ^концевого домена Hsp90 не влияет на связывание белков.

Для доказательства возможности взаимодействия рГЦ и Hsp90 в условиях in vivo был использован метод коиммунопреципитации этих белков из экстракта ткани. Для этой цели были использованы моноклональные антитела к а-субъединице рГЦ клона В4, способность которых специфично преципитировать белок из экстракта ткани была изучена ранее. Помимо простого обнаружения комплексов рГЦ и Hsp90 в ткани легких было изучено влияния различных регуляторов активности фермента на взаимодействие исследуемых белков. Было также изучено влияние гельданамицина на стабильность комплекса рГЦ и Hsp90 (рис. 4).

Видно, что обработка ткани не влияет на содержание белков в исходных экстрактах. Вместе с рГЦ среди преципитированных белков удалось обнаружить только Нр90. Отсутствие других белков в преципитате свидетельствует об относительной специфичности взаимодействия рГЦ и Нр90. Также видно, что инкубация ткани в присутствии различных добавок не влияет на стабильность комплекса рГЦ и №р90.

Регуляция активности рГЦ под действием Hsp90. Результаты списанных экспериментов свидетельствуют о том, что взаимодействие рГЦ и Hsp90 характеризуется высокой афинностью, и комплексы этих белков присутствуют в ткани. В первой части исследования Hsp90 был идентифицирован как фактор, стимулирующий Мп3+-зависимую активность рГЦ. Следующей задачей было изучение влияния Hsp90 на активность рГЦ в присутствии различных активаторов (рис. 5). В этом эксперименте были также изучены эффекты различных белков теплового шока на активность рГЦ в аналогичных услозиях.

Как видно из рисунка 5, Hsp90 стимулирует активность рГЦ в присутствии ионов марганца, протопорфирина IX - гем-независимого активатора рГЦ, SNP (донора N0 - гем-зависимого активатора рГЦ) и комбинации SNP и аллостерического активатора рГЦ BAY 412272. Активность рГЦ в отсутствие Hsp для каждого из активаторов фермента была принята за 100%, что позволяет выявить на диаграмме эффекты белков теплового шока. Видно, что стимуляция Мп2+-зависимой активности рГЦ под действием Hsp90 в несколько раз превосходит стимуляцию фермента под действием Hsp90 в присутствии других активаторов. Hsp90 в равной степени активирует рГЦ в присутствие протопорфирина IX, донора N0 или его комбинации с аллостерическим регулятором, BAY 41-2272. Таким образом, можно выделить, по меньшей мере, два различных типа воздействия Hsp90 на активность рГЦ в присутствии различных регуляторов.

Необходимо также отметить, что эти эксперименты проводились в присутствии бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл). Это в значительной мере снижает вероятность неспецифического защитного влияние Hsp90 на активность рГЦ, но более строгим доказательством специфичности эффектов Hsp90 является превосходство его эффектов над эффектами других белков теплового шока, которое наблюдается в большинстве случае. Различные белки теплового шока, включая Hsp70, Hsp60, Hsp40 и Hsp25 также оказывают некоторые стимулирующие эффекты на активность рГЦ. Однако ни один из них не оказывает такого значительного стимулирующего эффекта на активность рГЦ в присутствии ионов марганца, как Hsp90. Следовательно, стимуляция активности рГЦ под действием Hsp90 относительно специфична в сравнении с другими белками теплового шока. Поэтому далее изучались эффекты Hsp90 на механизмы регуляции активности рГЦ.

Поскольку основным биологическим активатором рГЦ является N0, на первом этапе был исследован механизм стимуляции активности рГЦ в присутствии донора N0 (рис. 6). Hsp90 Для этой цели рГЦ преинкубировали в течение указанного времени в присутствии или в отсутствие Hsp90 и определяли NO-зависимую активность фермента.

Как видно из рисунка 6, преинкубация приводила к значительному снижению синтеза cGMP, величина которого зависела от температуры. Оказалось, что в присутствии Hsp90 снижение активности фермента происходит в 2-2,5 раза медленнее. Однако прямой активации фермента в присутствии Hsp90 не наблюдается. Из литературных данных известно, что высокоочищенные препараты рГЦ характеризуются высокой конформационной лабильностью, что, по всей видимости, и является причиной инактивации. Поэтому обнаруженный эффект можно объяснить общей стабилизацией молекулы рГЦ в комплексе с Hsp90, и, как следствие, сохранением способности эффективно связывать молекулу N0.

В отличие от эффекта Hsp90 на активность рГЦ в присутствии SNP, протопорфирина ГХ и комбинации SNP и аллостерического активатора рГЦ BAY 41-2272, эффект Hsp90 на Мп2+-зависимую активность фермента был выражен, по меньшей мере, в 5 раз сильнее (рис. 5). В первую очередь, это указывает на принципиальное различие механизмов действия используемых активаторов рГЦ. Для дальнейшего изучения влияния Мп2+ на активность рГЦ и механизма стимулирующего действия Hsp90 был использован частично очищенный препарат фермента из легких быка (рис. 7). Из литературных данных известно, что преинкубация очищенных препаратов рГЦ в присутствии Mni+ приводит к инактивации фермента. Поэтому был использован препарат, сохраняющий специфическую активность в течение часа при 37°С в присутствии или отсутствие ДТТ и не содержащий примесей эндогенного Hsp90.

Было изучено влияние преинкубации рГЦ с МпС1г на активность фермента в присутствии и отсутствие ДТТ и Нр90 (рис. 7). Данные этого эксперимента показывают, что

преинкубация рГЦ с 5 мМ хлоридом марганца в отсутствие ДТТ приводит к снижению активности фермента, которое развивается во времени (рис. 7а, —6г~ ). По-видимому, такое ингибирование носит необратимый характер, поскольку добавление ДТТ после преинкубации ( ) не приводит к заметному восстановлению активности фермента.

Однако присутствие ДГТ в ходе преинкубации рГЦ с 5 мМ хлоридом марганца (-0-) блокирует ингибирование фермента. Включение Нф90 в концентрации 0,1 мг/мл в среду для преинкубации рГЦ с 5 мМ хлоридом марганца приводит к 2 - 2,5 кратному восстановлению активности фермента, по сравнению с пробами, не содержащими Нр90 (рис. 76).

В то же время добавление ДТТ после преинкубации рГЦ с 5 мМ хлоридом марганца лишь незначительно снижает степень ингибирования фермента, но не влияет на величину защитного эффекта Нф90 (рис. 76). Следовательно, Нр90 даже в присутствии 5 мМ ДТТ не способен восстановить активность рГЦ после необратимого ингибирования под действием ионов марганца.

Изучение Мп2+-зависимой активности рГЦ позволяет в определенной степени делать выводы о регуляции базальной активности фермента, поскольку фермент в присутствии

по-видимому, не претерпевает конформационных изменений, происходящих при связывании N0. По-видимому, ингибирование рГЦ в присутствии ионов марганца происходит за счет окислительной инактивации фермента, так как ДТТ способен ее блокировать в ходе совместной преинкубации, а эффект Нр90 заключается в защите фермента от окислительной инактивации.

Следующая группа экспериментов была посвящена детальному исследованию механизмов окислительной инактивации рГЦ под действием различных оксидантов и соединений, способных модифицировать 8Н-группы белков, и выяснению роли Нф90 в защите фермента от такого воздействия.

Известно, что также как и ионы других переходных металлов, ионы марганца могут участвовать в образовании активных форм кислорода или катализировать реакции окисления в аэробных условиях. В присутствии ионов марганца 8Н-группы рГЦ могут быть окислены или модифицированы. Также известно, что сульфгидрильные группы необходимы для каталитической активности рГЦ. Возможно, что преинкубация рПД с ионами марганца вызывает окисление функциональных 8Н-групп рГЦ и, таким образом, ингибирование фермента. Исходя из представленных выше данных, можно предположить, что Нф90 защищает рГЦ от такой инактивации, подавляя модификацию функциональных 8Н-грулп фермента. Однако этот механизм действия Нф90 может быть неспецифичным в отношении рГЦ.

Роль тиолов в процессе инактивации рГЦ под действием ионов Мп * выяснить достаточно сложно, так как Мп3* способен активировать рГЦ, а активация рГЦ может быть связана с частичным окислением SH-rрупп фермента. Поэтому была изучена модификация

8Ы-групп низкомолекулярных тиолов цистеина и ДТТ в присутствии хлорида марганца и другого известного 8Ы-реагента, хлорида кадмия, и влияние Нвр90 на эту реакцию (рис. 8).

Как видно из рисунка 8а, б, инкубация цистеина в присутствии хлорида марганца вызывает уменьшение концентрации свободных 8Ы-групп, которое развивается во времени. Увеличение концентрации хлорида марганца сопровождалось ускорением снижения концентрации свободных 8Ы-групп цистеина и ДТТ, которое, по-видимому, связано с их окислением. Однако Нф90 не влиял на окисление тиолов, индуцированное хлоридом марганца (рис. 8в). Принимая во внимание этот результат, можно заключить, что Нф90 в комплексе с рГЦ пространственно защищает функциональные 8Н-группы фермента от модификации под действием хлорида марганца. То есть, Нвр90 может предотвращать инактивацию рГЦ, вызванную модификацией этих 8Н-групп.

В ходе следующего эксперимента (рис. 8г) было обнаружено, что хлорид кадмия, вызывает значительно более интенсивное снижение концентрации свободных 8Н-групп глутатиона, чем хлорид марганца. Оказалось, что Нф90 также не влияет на снижение концентрации свободных 8Н-групп, вызванное хлоридом кадмия. Существенным отличием ионов кадмия от ионов марганца оказалось отсутствие стимулирующего эффекта на базальную активность фермента. Это дало возможность изучить механизм ингибирования КО-зависимой активности рГЦ, вызванного модификацией функциональных 8Н-групп фермента.

Нф90 является цитозольным белком клеток в нестрессорных условиях, но его концентрация может значительно увеличиваться в ответ на стрессы различной природы. Поэтому было необходимо выяснить в каких концентрациях Нвр90 влияет на активность рГЦ. В следующем эксперименте была изучена концентрационная зависимость для эффекта Нф90 на ингибирование КО-зависимой активности рГЦ под действием 60 мкМ хлорида кадмия. Была также изучена зависимость стимуляции Мп2+-зависимой активности рГЦ от концентрации Нвр90 представлена (рис. 9).

В ходе данного эксперимента было обнаружено, что ионы кадмия эффективно блокируют активацию рГЦ оксидом азота. Ингибирование КО-зависимой активности рГЦ эффективно блокируется в присутствии Нвр90 (рис. 9а). Достоверное увеличение N0-зависимой активности рГЦ в присутствии 60 мкМ СсЮг наблюдается уже при концентрации Нф90 0,01 мг/мл и развивается при увеличении концентрации Нзр90. Как видно из рисунка 96, оптимальная концентрация Нвр90, в которой он максимально стимулировал Мп2+-зависимую активность рГЦ, составляла 0,1 мг/мл, тогда как минимальная концентрация, в которой Нф90 проявляет стимулирующий эффект, составляет 0,05 мг/мл. Согласно данным

поверхностного плазмонного резонанса, большая часть молекул рГЦ в этом диапазоне концентраций находится в комплексе с Нр90.

а

б

120-

Ь-н+н

ж"

О......

в Контрол» -О-СйОг. 70мкМ

С

0

ООО 005 010 015 0.20 концентрация НзрЗО, мт/ыл

0

концентрация НзрЭО, мг/мл

0001

001

01

Рис. 9. Влияние Нвр90 на Мп2*-зависимую активность рГЦ и ингибирование N0-зависнмой активности фермента под действием СйСЬ. (а) Препарат гемсодержащей рГЦ из легких быка (25 мкг/мл) преинкубировали в присутствии №р90 в указанных концентрациях в объеме 25 мкл в течение 15 мин при 37°С. Пробы преинкубировали в присутствии 5 мМ МпСЬ в отсутствие ДТТ. После преинкубации в пробы добавляли стандартную инкубационную смесь без ДГТ, содержащую 5 мМ МпСЬ. (б) Препарат гемсодержащей рГЦ из легких свиньи (74 мкг/мл) преинкубировали в присутствии 5 мМ ДГТ и Шр90 в указанных концентрациях в объеме 25 мкл в течение 5 мин при 25°С. После преинкубации в пробы добавляли стандартную инкубационную смесь, содержащую 5 мМ ДГТ, 25 мкМ спермин-КОИОат и 70 мкМ СИСЬ, как указано на рисунке. Инкубационная смесь содержала [а-32Р]ОТР в качестве субстрата. Количество образовавшегося [32Р]сСМР определяли, как описано в разделе «Материалы и методы». Данные представлены как среднее±ошибка среднего по результатам трёх независимых экспериментов.

В литературе описано вляние Нф90 на активность другого гем-содержащего фермента, КО-синтазы. Было показано, что Нф90 может облегчать фолдинг молекулы фермента, в ходе которого происходит встраивание свободной гемовой группы в гемдефицитный фермент. Аналогичная возможность была проверена и для гем-дефицитной рГЦ- Как видно из рисунка 10, в оптическом спектре гем-дефицитного фермента отсутствует пик Соре в районе 430 нм, характерный для гем-содержащих белков.

Инкубация фермента с 10 мкМ раствором гемина сопровождается появлением в спектре пика Соре, что свидетельствует о нормальном встраивании гемина в молекулу рГЦ. Однако добавление Hsp90 в концентрации 0,1 мг/мл в инкубационную смесь не повышает интенсивность пика Соре. Следовательно, Hsp90 не может облегчать реконструкцию гем-дефицитной рГЦ. По-видимому, влияние Hsp90 на NO-зависимую активность рГЦ непосредственно не связано с процессами, происходящими в области гемовой группы, а проявляется в поддержании конформационных перестроек, происходящих в пространственно удалённых от гема доменах фермента.

Таким образом, Hsp90 способен регулировать не только процессы синтеза оксида азота различными изоформами NO-синтаз, но и, принимая во внимание полученные нами результаты, оказывать влияние на основной рецептор N0 — рГЦ- Комплексы рГЦ и Hsp90 постоянно существуют в ткани, что было выяснено в ходе наших экспериментов и согласуется с данными других авторов (Venema et э1., 2003). Исходя из этого, отсутствие непосредственного стимулирующего эффекта Hsp90 по отношению к NO-зависимой активности рГЦ представляется оправданным с точки зрения регуляции сигнального каскада NО-рГЦ-cGMP. По данным, полученным при помощи метода поверхностного плазменного резонанса, комплекс рГЦ и Hsp90 характеризуется низкими скоростями ассоциации и

диссоциации. Поэтому регуляция синтеза сОМР за счет непосредственного влияния Hsp90 на КО-зависимую активность рГЦ не смогла бы обеспечить необходимую реактивность таких физиологических процессов, как расслабление гладкомышечных клеток кровеносных сосудов и передача нервного импульса. С другой стороны, поддержание КО-компетентной конформации рГЦ в комплексе с Hsp90 может иметь большое значение в стабилизации и регуляции ЫО/сОМР-зависимых процессов в нормально функционирующей клетке, а также в условиях окислительного стресса.

ВЫВОДЫ:

1. Методом поверхностного плазмонного резонанса показано взаимодействие очищенных препаратов Взаимодействие характеризуется высокой аффинностью с константой диссоциации Ко = 5,04 нМ. Показано, что комплекс рГЦ и Hsp90 иммунопреципитируется из легких кролика специфическими моноклональными антителами к а-субъединице рГЦ.

2. Установлено, что Н$р90 стабилизирует активированную конформацию рГЦ, а также защищает фермент от ингибирования под действием ионов марганца и кадмия.

3. Показано, что другие белки теплового шока, включая Нзр70, НБрбО, Н$р40 и Нзр25 не образуют комплекс с Hsp90 в легких кролика, а также не оказывают заметного влияния на активность что указывает на возможность специфической регуляции активности фермента под действием Hsp90.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПЕЧАТНЫХ РАБОТАХ:

1. Постников А.Б., Бетин ВЛ., Буларгина Т.В, Murad F., Коц АЛ. Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы под действием белка теплового шока Hsp90. Материала: 3-й всероссийской конференции по физиологии кровообращения, Москва, 2004, стр. 86.

2. Postnikov A.B., Betin V.L., Bulaigina T.V., Murad F., Kots AY. Protection of soluble guanylate cyclase from oxidative inactivation by 90 kD heat shock protein Hsp90. Abstracts of Physiological Society Spring Workshop "Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress", Budapest, Hungary, 2003, p. 50.

3. Постников А.Б., Коц А.Я. Зашита растворимой формы гуанилатциклазы от окислительной инактивации под действием белка теплового шока Hsp90. Тезисы докладов и стендовых сообщений XIV зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2002, стр. 99.

4. Severina I.S., Pyatakova N.V., Postnikov A.B., Preobrazhenskaya M.N., Khropov Y.V. Antitumor antibiotic streptonigrin and its derivatives as inhibitors of nitric oxide-dependent activation of soluble guanylyl cyclase. Eur J Pharmacol. 2004 Jan 12; 483(2-3): 127-132.

5. Постников А.Б., Коц АЛ., Буларгина Т.В. Влияние белка теплового шока Hsp90 на активность растворимой формы гуанилатциклазы. Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ», Москва, 2001, Выпуск 6, стр. 35.

6. V. Betin, A. Postnikov, M. Grafov, S. Gavrilova, S. MeFnikona, S. Pirogov, T. Bulargina, A. Kots Derivatives of 3,4-bis(furazan-3-yl)furoxan - novel NO-donors, activators of soluble guanylate cyclase and vasodilatory agents. Abstracts of 13th European Meeting on Hypertension, Workshop ofthe Young Investigator Initiative Group, Milan, Italy, 2003, p. 4.

7. Постников А.Б., Ивлин В П., Хропов Ю.В., Бетин ВЛ., Бонарцев А.П., Гаврилова СА, Королев В.Л., Топоров В.В., Даниленко В.М., Пятакова Н.В., Северина И.С., Буларгина Т.В. Имидазобензодифуроксаны - новый класс NO-генерируюших соединений, активирующих растворимую гуанилатциклазу, обладающих гипотензивным действием и ингибирующих агрегацию тромбоцитов. Материалы III биохимического съезда, Санкт-Петербург, 2002, стр.

8. Мельникова С.Ф., Коц АЛ., Пирогов СВ., Постников А.Б., Бетин В.Л., Пятакова Н.В., Графов МА, Гаврилова СА, Селиверстов В.О., Хропов Ю.В., Медведева НА, Северина И.С., Целинский И.В, Буларгина Т.В. Донор оксида азота, активирующий растворимую бсгому гуанилатциклазы. шгибируюшцй агрегацию тромбоцитов и обладающий

205.

IM и сосудорасдиряюшим действием, Патент РФ №2208438,2003.

Подписано в печать 25.08.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 121 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102

$ 17091

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Постников, Александр Борисович

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

1. Свойства растворимой гуанилатциклазы.

1.1. Роль растворимой гуанилатциклазы в системе передачи сигнала NO-рГЦcGMP.

1.2. Структура растворимой гуанилатциклазы и её экспрессия в тканях.

1.2.1. Изоформы растворимой гуанилатциклазы: распределение в тканях и регуляция экспрессии.

1.2.2. Доменная организация растворимой гуанилатциклазы.

1.2.2.1. Гем-связывающий домен.

1.2.2.2. Каталитический домен.

1.2.2.3. Димеризационный домен.

1.3. Каталитическая активность растворимой гуанилатциклазы и способы её регуляции.

1.3.1. Активация растворимой гуанилатциклазы оксидом азота (NO): роль гемовой группы.

1.3.2. Деактивация растворимой гуанилатциклазы.

1.3.3. NO-независимые регуляторы активности растворимой гуанилатциклазы.

1.3.3.1. Регуляция растворимой гуанилатциклазы порфиринами и металлопорфиринами.

1.3.3.2. Активация растворимой гуанилатциклазы полиненасыщенными жирными кислотами.

1.3.3.3. Окислительно-восстановительная регуляция активности растворимой гуанилатциклазы.

1.3.4. Регуляция чувствительности растворимой гуанилатциклазы к NO в различных физиологических и патофизиологических состояниях.

2. Защита белков от стрессорного повреждения. Белок теплового шока Hsp90.

2.1. Механизмы стрессорного повреждения белков.

2.1.1. Клеточные источники активных форм кислорода и окислительный стресс

2.1.2. Окислительная модификация белков.

2.1.3. Окислительная инактивация растворимой гуанилатциклазы в некоторых патологических состояниях.

2.2. Белки теплового шока.

2.2.1. Общие свойства белков теплового шока.

2.2.2. Строение и функции Hsp90.

2.2.2.1. Внутриклеточные субстраты Hsp90.

2.2.2.2. Смена белков-партнёров Hsp90 при фолдинге.

2.2.2.3. Hsp90 как мишень противоопухолевых препаратов, гельданамицина и радщикола.

2.2.2.4. Шаперонные свойства Hsp90.

2.2.2.5. Участие Hsp90 в регуляции синтеза NO.

2.2.2.6. Протекторные свойства Hsp90 при окислительном повреждении белков.

Материалы и методы.

1. Реактивы и оборудование.

2. Радиохимический метод определения активности рГЦ.

3. Выделение рГЦ из легких свиньи.

4. Реконструкция рГЦ с активирующими факторами.

5. Аффинная очистка моноклональных антител к Hsp90 на колонке с иммобилизованным Hsp90.

6. Изучение характеристик взаимодействия рГЦ и Hsp90 при помощи метода поверхностного плазмонного резонанса.

7. Изучение влияния Hsp90 на различные способы активации рГЦ в клетках линии

PC-12.

8. Коиммунопреципитация рГЦ и взаимодействующих с ней белков из ткани легких кролика. Анализ состава преципитированных комплексов рГЦ.

9. Электрофорез в полиакриламидном геле.

10. Иммуноблоттинг.

11. Определение свободных сульфгидрильных групп при взаимодействии ДТТ или цистеина с ионами Мп2+ и Cd +.

12. Определение белка по методу Лоури.

13. Статистическая обработка результатов.

Результаты исследования.

1. Выделение из печени кролика факторов, регулирующих Мп2+-зависимую активность рГЦ легких, и их идентификация.

1.1. Экстракция и фракционирование сульфатом аммония гомогената печени кролика.

1.2. Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе.

1.3. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Тойоперл 650М.

1.4. Адсорбционная хроматография на гидроксиапатите.

2. Доказательства идентичности фактора, стимулирующего Мп2+ -зависимую активность рГЦ, и Hsp90.

2.1. Совпадение пиков стимулирующего Мп2+-зависимую активность рГЦ фактора и Hsp90 при хроматографической очистке фактора.

2.2. Изучение влияния моноклональных антител, специфичных к нативному

Hsp90, на Мп2+-зависимую активность рГЦ в присутствии Hsp90.

3. Изучение взаимодействия рГЦ и Hsp90 методом поверхностного плазмонного резонанса.

3.1. Изучение физико-химических характеристик взаимодействия рГЦ и Hsp90.

3.2. Изучение биохимических особенностей взаимодействия рГЦ и Hsp90.

4. Идентификация комплексов рГЦ и Hsp90 в ткани методом коиммунопреципитации.

5. Изучение влияния Hsp90 на активность рГЦ в присутствии различных регуляторов.

5.1. Изучение специфичности влияния Hsp90 на активность рГЦ в сравнении с другими белками теплового шока.

5.2. Изучение влияния Hsp90 на NO-зависимую активность рГЦ и стабильность фермента.

5.3. Изучение влияния Hsp90 на различные способы активации рГЦ в клетках линии PC-12.

5.4. Изучение влияния Hsp90 на ингибирование активности рГЦ под действием MnCl2HCdCl2.

5.5. Изучение влияния Hsp90 на активность рГЦ в присутствии соединений, окисляющих атом железа в составе гемовой группы.

6. Влияние Hsp90 на взаимодействие рГЦ и гемовой группы.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы под действием белка теплового шока Hsp90"

Растворимая гуанилатциклаза (рГЦ) является гетеродимерным гемсодержащим ферментом, который представляет собой основной рецептор оксида азота (N0). Молекула N0 - универсальный регулятор состояния сердечнососудистой, иммунной и нервной систем организма. Синтез NO в клетке осуществляется несколькими специализированными изоформами ферментов NO-синтаз из молекулы аргинина. N0 связывается с гемовой группой рГЦ, активируя синтез циклического гуанозинмонофосфата (cGMP) из GTP. Этот внутриклеточный мессенджер в свою очередь модулирует активность cGMP-завиеимых протеинкиназ, cGMP-завиеимых ионных каналов и cGMP-регулируемых фосфодиэстераз, которые участвуют в запуске таких клеточных процессов как расслабление гладкомышечных клеток, ингибирование агрегации тромбоцитов, модуляция синаптической передачи нервного импульса и экспрессия генов. N0 является самым эффективным физиологическим активатором рГЦ. Тем не менее, спектр эндогенных активаторов рГЦ довольно широк и включает в себя низкомолекулярные соединения различной природы. В число этих соединений входят как активаторы, так и ингибиторы рГЦ, которые действуют на различные регуляторные участки фермента. рГЦ подвержена ингибированию различными окислителями, которые переводят гемовое железо из степени окисления +2 в +3, блокируя связывание NO, как, например, производные оксадиазолохиноксалинона, или модифицируют сульфгидрильные группы, ответственные за нормальное функционирование фермента. В литературе описана принципиальная возможность стимуляции рГЦ под действием факторов белковой природы, однако эти факторы не были идентифицированы и не была доказана их способность специфично связываться с рГЦ. Недавно было обнаружено взаимодействие одной из изоформ рГЦ с белком постсинаптической плотности синаптосом мозга (PSD-95), что может быть связано с формированием функциональных многокомпонентных белковых комплексов, в которых синтез сигнальных молекул и ответные реакции ферментов-эффекторов пространственно сопряжены. Однако в этом исследовании не было выявлено непосредственное влияние взаимодействия рГЦ и PSD-95 на синтез cGMP. Таким образом, несмотря на единичные сведения о взаимодействии рГЦ с другими белками клетки, не существует ясных представлений о регуляции активности фермента за счёт белок-белковых взаимодействий.

Синтез, стабильность и связывание оксида азота с рГЦ, а также функционирование фермента в клетке зависят от ее окислительно-восстановительного состояния. Таким образом, внутриклеточная система передачи сигнала ЫО-рГЦ-сОМР может быть повреждена в ходе окислительного стресса, который сопровождает многие патологические состояния, такие как ишемия/реперфузия, диабет и атеросклеротическое повреждение кровеносных сосудов. В нормальной клетке существует специальная антиоксидантная система, функцией которой является нейтрализация различных активных форм кислорода - основных повреждающих агентов окислительного стресса. Известно, однако, что умеренный непродолжительный стресс может в значительной мере защитить NO-зависимые пути передачи сигнала от последующего острого стресса. В результате такого защитного стресса индуцируется синтез ряда белков теплового шока (Hsp). Помимо основной функции Hsp, заключающейся в осуществлении фолдинга и поддержании функционального взаимодействия белков, для некоторых из них характерна способность к защите различных ферментов от окислительной инактивации подобно внутриклеточным низкомолекулярным тиолам. Например, повышенная экспрессия Hsp90 может быть связана с уменьшением чувствительности некоторых ферментов к окислительной инактивации, вызванной ионами металлов. Однако точный механизм защитного действия Hsp не известен.

Недавние исследования показали роль Hsp90 в регуляции системы NO-рГЦ-сОМР. Например, Hsp90 может регулировать активность эндотелиальной и нейрональной изоформ NO-синтаз. Hsp90 стимулирует синтез N0 и подавляет образование супероксид-аниона, осуществляемые NO-синтазой. Hsp90 связывается с эндотелиальной NO-синтазой и стимулирует активацию фермента кальмодулином. Также как и рГЦ NO-синтаза является гем-содержащим ферментом. Оказалось, что Hsp90 значительно облегчает встраивание гемовой группы в молекулу NO-синтазы, участвуя в формировании активного фермента.

В настоящем исследовании был осуществлен широкий поиск белковых факторов, способных регулировать активность рГЦ. На основании существующих теоретических предпосылок была сформулирована и проверена гипотеза о том, что помимо NO-синтаз, Hsp90 может взаимодействовать с рГЦ и регулировать ее активность.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было исследовать влияние Hsp90 как одного из эндогенных белковых факторов на синтез cGMP, катализируемый рГЦ, в присутствии гем-зависимых, гем-независимых и аллостерических активаторов фермента, а также в модельных условиях окислительного стресса.

В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. идентифицировать Hsp90 как один из эндогенных белковых факторов, регулирующих активность рГЦ.

2. охарактеризовать взаимодействие Hsp90 и рГЦ с использованием очищенных белков, а также показать возможность образования комплекса Hsp90 и рГЦ в ткани.

3. показать специфичность эффектов Hsp90 по сравнению с другими белками теплового шока.

4. изучить влияние Hsp90 на гем-зависимую и гем-независимую активность рГЦ.

5. исследовать возможность конформационной стабилизации рГЦ под действием Hsp90 в условиях, моделирующих окислительный стресс.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Постников, Александр Борисович

ВЫВОДЫ:

1. Методом поверхностного плазмонного резонанса показано взаимодействие очищенных препаратов рГЦ и Hsp90. Взаимодействие характеризуется высокой аффинностью с константой диссоциации Кц = 5,04 нМ. Показано, что комплекс рГЦ и Hsp90 иммунопреципитируется из легких кролика специфическими моноклональными антителами к а-субъединицы рГЦ.

2. Установлено, что Hsp90 стабилизирует активированную конформацию рГЦ, а также защищает фермент от ингибирования под действием ионов марганца и кадмия.

3. Показано, что другие белки теплового шока, включая Hsp70, Hsp60, Hsp40 и Hsp25 не образуют комплекс с рГЦ в легких кролика, а также не оказывают заметного влияния на её активность, что указывает на возможность специфической регуляции активности фермента под действием Hsp90.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Постников, Александр Борисович, Москва

1. Болдырев А.А. Парадоксы окислительного метаболизма мозга. Биохимия. 1995; 60(9): 1536-42.

2. Болдырев А.А., Куклей M.J1. Свободные радикалы в нормальном и ишемическом мозге. Нейрохимия. 1996; 13(4):78-85.

3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972.

4. Осипов А.Н., Якутова Э.Ш., Владимиров Ю.А. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа. Биофизика. 1993; 38(3):390-6.

5. Северина И. С. Роль растворимой гуанилатциклазы в молекулярном механизме физиологических эффектов оксида азота. Биохимия. 1998; 63(7):794-801.

6. Скулачев В.П. Возможная роль активных форм кислорода в защите от вирусных инфекций. Биохимия. 1998; 63(12):1438-40.

7. Скулачев В.П. Кислород и явления запрограммированной смерти: I Северинское чтение. М.: Биохим. об-во РАН, 1999. 48.

8. Скулачев В.П. НгОг-сенсоры легких и кровеносных сосудов и их роль в антиоксидантной защите организма. Биохимия. 2001; 66(10):1153-6.

9. Aizawa, Т.; Wei, Н.; Miano, J. М.; Abe, J.; Berk, В. С., and Yan, С. Role of phosphodiesterase 3 in NO/cGMP-mediated antiinflammatory effects in vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2003 Sep 5; 93(5):406-13.

10. Aktas, В.; Honig-Liedl, P.; Walter, U., and Geiger, J. Inhibition of platelet P2Y12 and alpha2A receptor signaling by cGMP-dependent protein kinase. Biochem Pharmacol. 2002 Aug 1; 64(3):433-9.

11. Alderton, W. K.; Cooper, С. E., and Knowles, R. G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J. 2001 Aug 1; 357(Pt 3):593-615.

12. Andrew, C. R.; George, S. J.; Lawson, D. M., and Eady, R. R. Six- to five-coordinate heme-nitrosyl conversion in cytochrome c' and its relevance to guanylate cyclase. Biochemistry. 2002 Feb 19; 41(7):2353-60.

13. Bayguinov, O. and Sanders, К. M. Dissociation between electrical and mechanical responses to nitrergic stimulation in the canine gastric fundus. J Physiol. 1998 Jun 1; 509 (Pt 2):437-48.

14. Bayraktutan, U.; Draper, N.; Lang, D.; Shah, A. M. Expression of functional neutrophil-type NADPH oxidase in cultured rat coronary microvascular endothelial cells. Cardiovasc Res. 1998; Apr; 38(1 ):256-62.

15. Becker, J. and Craig, E. A. Heat-shock proteins as molecular chaperones. Eur J Biochem. 1994 Jan 15; 219(l-2):ll-23.

16. Bellamy, Т. C. and Garthwaite, J. The receptor-like properties of nitric oxide-activated soluble guanylyl cyclase in intact cells. Mol Cell Biochem. 2002a Jan; 230(1-2): 165-76.

17. Bellamy, Т. C. and Garth waite, J. Pharmacology of the nitric oxide receptor, soluble guanylyl cyclase, in cerebellar cells. Br J Pharmacol. 2002b May; 136(1):95-103.

18. Bellamy, Т. C.; Wood, J.; Goodwin, D. A., and Garth waite, J. Rapid desensitization of the nitric oxide receptor, soluble guanylyl cyclase, underlies diversity of cellular cGMP responses. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Mar 14; 97(6):2928-33.

19. Bender, А. Т.; Silverstein, A. M.; Demady, D. R.; Kanelakis, К. C.; Noguchi, S.; Pratt, W. В., and Osawa, Y. Neuronal nitric-oxide synthase is regulated by the Hsp90-based chaperone system in vivo. J Biol Chem. 1999 Jan 15; 274(3): 1472-8.

20. Benjamin, I. J. and McMillan, D. R. Stress (heat shock) proteins: molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. Circ Res. 1998 Jul 27; 83(2): 117-32.

21. Borkovich, K. A.; Farrelly, F. W.; Finkelstein, D. В.; Taulien, J., and Lindquist, S. hsp82 is an essential protein that is required in higher concentrations for growth of cells at higher temperatures. Mol Cell Biol. 1989 Sep; 9(9):3919-30.

22. Bose, S.; Weikl, Т.; Bugl, H., and Buchner, J. Chaperone function of Hsp90-associated proteins. Science. 1996 Dec 6; 274(5293): 1715-7.

23. Brandish, P. E.; Buechler, W., and Marietta, M. A. Regeneration of the ferrous heme of soluble guanylate cyclase from the nitric oxide complex: acceleration by thiols and oxyhemoglobin. Biochemistry. 1998 Dec 1; 37(48): 16898-907.

24. Brandwein, H. J.; Lewicki, J. A.; Waldman, S. A., and Murad, F. Effect of GTP analogues on purified soluble guanylate cyclase. J Biol Chem. 1982 Feb 10; 257(3): 1309-11.

25. Braughler, J. M. Oxidative modulation of soluble guanylate cyclase by manganese. Biochim Biophys Acta. 1980 Nov 6; 616(1):94-104.

26. Braughler, J. M. Soluble guanylate cyclase activation by nitric oxide and its reversal. Involvement of sulfhydryl group oxidation and reduction. Biochem Pharmacol. 1983 Mar 1; 32(5):811-8.

27. Braughler, J. M.; Mittal, С. K., and Murad, F. Effects of thiols, sugars, and proteins on nitric oxide activation of guanylate cyclase. J Biol Chem. 1979 Dec 25; 254(24): 12450-4.

28. Brugge, J. S. Interaction of the Rous sarcoma virus protein pp60src with the cellular proteins pp50 and pp90. Curr Top Microbiol Immunol. 1986; 123:1-22.

29. Buchner, J. Supervising the fold: functional principles of molecular chaperones. FASEB J. 1996 Jan; 10(1): 10-9.

30. Bui, L.; Rish, K.; Jaronczyk, K.; Bourque, S.; McLaughlin, В. E.; Brien, J. F.; Marks, G. S.; Smith, A., and Nakatsu, K. The source of heme for vascular heme oxygenase I: heme uptake in rat aorta. Can J Physiol Pharmacol. 2004 Apr; 82(4):209-l 7.

31. Burette, A.; Petrusz, P.; Schmidt, H. H.; Weinberg, R. J. Immunohistochemical localization of nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase in the ventral cochlear nucleus of the rat. J Comp Neurol. 2001 Feb 26; 431(1): 1-10.

32. Busse, R.; Pohl, U.; Mulsch, A., and Bassenge, E. Modulation of the vasodilator action of SIN-1 by the endothelium. J Cardiovasc Pharmacol. 1989; 14 Suppl 1 l:S81-5.

33. Calabrese, V.; Bates, Т. E., and Stella, A. M. NO synthase and NO-dependent signal pathways in brain aging and neurodegenerative disorders: the role of oxidant/antioxidant balance. Neurochem Res. 2000 Oct; 25(9-10): 1315-41.

34. Carney, J. M.; Starke-Reed, P. E.; Oliver, C. N.; Landum, R. W.; Cheng, M. S.; Wu, J. F., and Floyd, R. A. Reversal of age-related increase in brain protein oxidation, decrease in45,4647,48