Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы

Пятакова, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы"

На правах рукописи

Пятакова Наталья Владимировна

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ РАСТВОРИМОЙ ГУАШ1ЛАТЦИКЛАЗЫ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 НОЯ 2012

Москва-2012

005055254

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ» РАМН)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Северина Ирина Сергеевна

Официальные Прозоровский Владимир Николаевич

оппоненты: доктор биологических наук, ФГБУ «ИБМХ» РАМН,

главный научный сотрудник

Реутов Валентин Палладневич доктор биологических наук, ФГБУН Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, ведущий научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное образовательное Ведущее учреждение учреждение высшего профессионального образования

«Российский университет дружбы народов», медицинский факультет

Защита состоится «13» декабря 2012г. в 12:30 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01. при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН.

Автореферат разослан «_»_ 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Е.А. Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эндогенный оксид азота (NO) оказавшийся эидотелиапьным фактором релаксации (ЭДФР), является одним из основных сосудорасширяющих факторов, регулирующих деятельность сердечно-сосудистой системы. Он образуется из L-арппшна под действием Ь-аргинин-ЫО-синтазы (Palmer et al., 1988). Оксид азота участвует во многих жизненно важных процессах; он является мощным фактором гемостаза, ингибирует агрегацию тромбоцитов и рассматривается в настоящее время как эндогенный вазодилататор (Ignarro et al., 2002).

Основным внутриклеточным рецептором оксида азота является растворимая гуанилатциклаза (Poulus, 2006), катализирующая биосинтез циклического 3',5'-гуанозинмонофосфата (цГМФ). цГМФ - мощный регулятор метаболизма клетки в значительной степени определяющий ее функции (Hoffmann et al., 2006). Большинство физиологических эффектов оксида азота (в том числе антигипертензивный и антиагрегантный) осуществляется через стимуляцию растворимой гуанилатциклазы и накопление цГМФ (Bellamy et al., 2002). Важная роль внутриклеточной сигнальной системы NO - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ в регуляции функции клетки и нарушение активности этой системы при многих патологических состояниях (гипертония, астма, сепсис и др.) требует создания препаратов, которые направленно бы регулировали активность этой системы и таким образом устраняли бы возникшие нарушения.

Наиболее известными лекарственными препаратами, которые используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с недостатком образования эндогенного NO - являются органические нитраты (нитроглицерин и др.). Несмотря на большое количество уже существующих нитровазодилататоров поиск новых NO-доноров продолжается. Это обусловлено возникновением нежелательных побочных эффектов при их длительном применении (в том числе развитие толерантности) и потому необходимостью создания более эффективных и менее токсичных препаратов. При патологических состояниях, связанных с избытком образования эндогенного NO в организме (астма, сепсис, септический шок) наблюдается другая картина. Соединений, способных ингибировать NO-зависимую активацию гуанилатциклазы пока единицы и все они токсичны, а подобные лекарственные препараты - просто отсутствуют.

Цель исследования. Изучение механизмов направленной регуляции растворимой гуанилатциклазы новыми активаторами и ингибиторами фермента.

Задачи исследования.

1. Выявить в качестве активаторов растворимой гуанилатциклазы новые потенциальные доноры оксида азота, относящиеся к различным классам химических соединений:

- производные Ы-ннтропнразола

- производные бензатетразин-1,3-диоксида

- бензодифуроксан

- производные фуроксана, конденсированные с пиридазин-ди-Ы-оксидным циклом

2. Изучить способность соединений генерировать оксид азота, активировать растворимую гуанилатциклазу и ингибировать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

3. Выявить и исследовать в качестве ингибиторов МО-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы новые соединения, в том числе некоторые лекарственные препараты:

- карнозин - эндогенный дипептид (Р-аланил-Ь-гнстидин)

- амброксол - муколитический препарат

- артемизинин - антамалярийный препарат

Научная новизна. В ходе выполнения работы впервые:

-показана способность новых доноров оксида азота активировать растворимую гуанилатциклазу и ингибировать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов с эффективностью пропорциональной степени активации фермента; т.е. на основании величины стимулирующего эффекта соединений могла прогнозироваться фармакологическая активность новых доноров N0 (гипотензивный и антиагрегантный эффекты);

-показано, что карнозин - эндогенный дипептид (Р-аланил-Ь-гистидин) является селективным ингибитором МО-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы;

- установлено, что амброксол - муколитический препарат, ингибирует активацию растворимой гуанилатциклазы из тромбоцитов человека и легких крысы >Ю-донорами, а артемизинин - антималярийное средство, тормозит МО-зависимую активацию гуанилатциклазы тромбоцитов человека в пределах его терапевтических концентраций. Оба лекарственных препарата не влияют на активацию фермента протопорфирином IX;

-сделано заключение о вовлечении сигнальной системы N0 - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ в механизм терапевтического действия амброксола и

артемизинина, что расширяет представление о физиологической значимости этой сигнальной системы.

Научно-практическая значимость исследования. На основании анализа полученных данных по исследованию новых доноров оксида азота были сформулированы молекулярные основы для направленного поиска и создания новых эффективных вазодилататоров и антиагрегантов. Выявлены соединения, оказавшиеся мощными ингибиторами АДФ-индуцировшшой агрегации тромбоцитов: 3,5-диметил-М-нитропиразол с величиной Ю50 равной 7-Ю"' М и бензодифуроксан с 1Ся 6-Ю"8 М. Отличительной чертой этих антиагрегантов является их способность не только снижать гиперагрегацию тромбоцитов, но и предупреждать (или устранять) спонтанную агрегацию, а, следовательно, предупреждать возникновение и развитие сосудистых осложнений.

Выявленная способность карнозина - эндогенного дипентида - селективным образом ингибировать Ж)-зависимую активацию растворимой гуанилатциклазы позволяет предложить это соединение в качестве лекарственного средства для лечения патологических состояний, связанных с избытком генерирования эндогенного N0. Следует подчеркнуть, что карнозин не токсичен, полностью метаболизируется, не накапливается в организме человека при длительном использовании. Известно, что карнозин уже используется в качестве лекарственного средства в офтальмологии.

Представленные результаты о торможении амброксолом МО-зависимой активации гуанилатциклазы впервые указывают на возможность создания новых более эффективных муколитических средств на основе ингибиторов МО-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы. Преимуществом такого подхода является снижение только избыточного образования эндогенного N0 и при этом не подавляется его синтез, который необходим для регуляции нормальных физиологических функций дыхательного тракта.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены: на Международной научной конференции «Сигнальные нейропептиды и конформация макромолекул» (г.Москва, 2000), на Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва 2000, 2003), на Зем Международном биохимическом конгрессе (г. Санкт-Петербург, 2002), на Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимолопш» (г.Москва, 2002), на научных конференциях и межлабораторных семинарах Научно-исследовательского института биомедицинской химии им.В.Н.Ореховича РАМН (г.Москва, 2001,2003,2010,2011,2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных статей в периодических изданиях, включенных в перечень ВАК, получен патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 118 страницах, иллюстрирована 18 рисунками и 13 таблицами. Список литературы включает 177 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве источника растворимой гуанилатциклазы использовали: тромбоциты человека, выделенные из крови здоровых доноров и легкие крыс.

Выделение тромбоцитов из крови человека. Тромбоциты выделяли in венозной крови здоровых доноров. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор трехзамещенного цитрата натрия в соотношении с кровью по объему 1:9. Кровь центрифугировали 7 мин. при 450g. Обогащенную тромбоцитами плазму (4мл) наслаивали на Ficoll-Paque (2мл) и центрифугировали 25 мин при 650g. Концентрат тромбоцитов (на границе раздела фаз) отбирали, суспендировали в равном объеме, 50 мМ трис-HCI буфере (pH 7,6), содержащего 0,9% NaCI, 5 мМ ЭДТА и центрифугировали 15 мин при 1000g. Для окончательного удаления Ficoll-Paque и белков плазмы осажденные тромбоциты ресуспендировали в 1 мл этого же буфера и центрифугировали 10 мин. при 750g. Полученный осадок тромбоцитов ресуспендировали в 1 мл 50 мМ трис-HCI буфере (pH 7,6), содержащего 0,2 мМ дитиотрейтола.

Получение препарата растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека.

Суспензию отмытых тромбоцитов озвучивали при 4°С на ультразвуковом дезинтеграторе MSE 5-78 (Великобритания) в течение 20 секунд при амплитуде 16 мкм. В результате происходило разрушение мембран тромбоцитов и выход цитозольного содержимого тромбоцитов в раствор.

Разрушенные тромбоциты центрифугировали в течение 1 часа при 105000g (при 4°С) на ультрацентрифуге Beckman Optima LE 90-К. Супернатант 105000g использовали в качестве ферментного препарата растворимой гуанилатциклазы. Белок определяли по методу Бредфорда (Bradford, 1976).

Получение препарата растворимой гуанилатциклазы легких крысы. Крыс

убивали декапитацией. Полученные легкие промывали 0,9% NaCI, измельчали ножницами н готовили 10% гомогенат. Гомогенизировали ткань в 50 мМ трис-НС1 буфере (рН 7,6). содержащем 0,5 мМ ДГТ. Полученный гомогенат центрифугировали в течение 1 часа при 105000g на ультрацентрифуге Beckman Optima LE 90-К. Надосадочную жидкость использовали в качестве препарата растворимой гуанилатциклазы.

Определение активности гуанилатциклазы. Определение активности гуанилатциклазы проводили согласно (Garbers D., Murad F., 1979).

Реакцио1шая смесь (общий объем 150 мкл) содержала 50 мМ трис-HCI буфер (рН 7,6), 1 мМ ГТФ, 4 мМ MgCIz, 4 мМ креатинфосфат, 20 мкг креатинфосфокиназы, 10 мМ теофиллин, 15 - 20 мкг белка тромбоцитов человека или 50 мкг легких крысы (супернатант 105000g) и другие добавки при необходимости.

Гуанилатциклазную реакцию проводили при 37°С в водяном термостате в течение 15 мин. Реакцию останавливали нагревашгем проб в водяной бане в течение 2 мин. при 90°С. Затем пробы охлаждали во льду и центрифугировали в течение 10 минут при lOOOg. В полученном супернатанте определяли содержание образовавшегося цГМФ методом иммуноферментного анализа. Активность гуанилатциклазы выражали в пмоль ферментагивно образовавшегося цГМФ за 1 минуту инкубации при 37°С на 1 мг белка ферментного препарата.

Проведение агрегации тромбоцитов. Для получения тромбоцитов использовали венозную кровь здоровых доноров. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор трехзамещенного цитрата натрия в соотношении с кровью 1:9 по объему. Кровь центрифугировали 7 минут при 450g и отбирали богатую тромбоцитами плазму. При необходимости исходную концентрацию тромбоцитов в плазме разбавляли безтромбоцигарной плазмой, до содержания тромбоцитов 2,5-Ю8 клеток в 1 мл плазмы.

Агрегацию тромбоцитов изучали с использованием турбидиметрического метода Борна, который основывается на изменении пропускания света (540 нм) через исследуемую плазму при ее постоянном перемешивании (1000 об/мин) при 37°С. Степень светопропускания через безтромбоцитарную плазму принимали за 100%-ную агрегацию тромбоцитов (Чирков Ю.Ю. с соавт., 1991).

В качестве индуктора агрегации использовали раствор АДФ в конечной концентрации от 0,5 до 10,0 мкМ в 120 мМ растворе NaCI. Получаемые агрегограммы представляют собой зависимость степени агрегации от времени, прошедшего после добавления индуктора агрегации.

Статистическая обработка результатов. Результаты экспериментов обрабатывали статистически. Достоверность различий оценивали по ^критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Новые доноры оксида азота (N0) - активаторы гуанилатциклазы и ингибиторы агрегации тромбоцитов.

1У-Нитропиразолы. Ы-Нитропиразолы с общей формулой:

также как и нмроэфиры, оказывают антигипертензивное действие благодаря разрыву связи N-N02 и генерированию N0. Ценность этих соединений обусловлена возможностью направленного изменения доиорно-акцепторных свойств связи N-N02 за счет природы заместителей в пиразольном кольце. Исследованные соединения представлены в табл.1.

По легкости и интенсивности образования N0 соединения можно было разделить на 2 группы. В одной - соединения 1 - 3, у которых генерирование N0 было невелико (порядка 1 - 3%), в другой - соединение 4 характеризующееся значительным (до 40%) образованием оксида азота. В полном соответствии с этими результатами находятся и полученные нами данные по влиянию соединений на активность гуанилатциклазы (табл.1).

Таблица 1. Влияние производных Ы-нитрониразолов на активность растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека.

№ соедине ний Название Химическая формула Степень активации гуанилатциклазы

Концентрация соединений (М)

10~7 Ю-6 Ю-3 10"4

1 1-нитропиразол У 1,00±0,02 1,00±0,03 1,00±0,05 0,95±0,02

2 1 -нитро-3-метилпиразол пГ 1,00±0,03 1,10±0,03 1,31±0,04 0,91±0,02

3 1-нитро-5-метилпиразол 1,00*0,03 1,20±0,03 1,73±0,04 0,98±0,02

4 1-нитро-3,5-диметилпиразол шдГ сна у N0: 1,13±0,02 1,75±0,0б 4,03±0,01 4,26±0,02

Примечание. Базальная удельная активность составила 124±12 пмоль цГМФ в минуту на 1 мг белка. Приведены средние величины из 8 независимых экспериментов.

где Я иЯ1-Н или СНз,

Наиболее активным донором N0 и активатором гуанилатцикпазы оказалось соединение 4 (3,5-диметил-"М-нитропиразол) (табл.1). Легкость разрыва связи определялась стабильностью пиразольного радикала (Рг). Интересно, что согласно результатам квантово-механических расчетов, наиболее стабильным оказался именно 3,5-диметилпиразольный радикал.

40 -

111 I Соединение 1 — Соединение 2

- е - - Соединение 3

- Л' - - Соединение 4

Л'

.л-

А-

■А

-9 -в -7 -6

Концентрация соединения, 1д[М]

Рисунок 1. Зависимость ингибироваиия АДФ- индуцированной агрегации тромбоцитов человека от концентрации ]\-нитропиразолов. Приведены средние значения из 5 независимых экспериментов.

На рис.1 представлены результаты по предотвращению АДФ- индуцированной агрегации тромбоцитов соединениями 1-4.

Наиболее эффективным оказалось соединение 4 (3,5-диметил-Ы- нитропиразол), ингибирующее агрегацию с величиной ГС50 равной 7"10"9 М (рис.1). Следует отметить, что 3,5-диметил-Ы- нитропиразол обладал и наиболее выраженным спазмолитическим свойством.

Таким образом, исследованные новые производные Ы-нитропиразолов генерировали оксид азота, активировали растворимую гуанилатциклазу и ингибировали агрегацию тромбоцитов, с интенсивностью пропорциональной степени активации фермента.

Производные бензотетразин-13-Диоксида. Следующие новые доноры оксида азота и активаторы растворимой гуанилатциклазы были выявлены нами при исследовании производных бензотетразин-1,3-диоксида (ранее не исследованного

нового класса возможных потенциальных доноров N0), общей формулой

Были исследованы следующие нитрозамещенные бензотетразин-

К-н-^" 1,3-диоксиды:

5 |

5-нитробензотетразин-диоксид (Я] =N02, Яг^Н) (5-НБТДО),

\ 7-нитробензотетразин-диоксид (Я] = Н, Яг =N02) (7-НБТДО) и

5,7-диншробензотетразин-диоксид (Я^ =N02) (5,7-ДНБТДО).

Впервые показано, что исследованные бензотетразин-1,3-диоксиды являются тиолзависимыми донорами оксида азота. Наиболее эффективным донором N0 оказался 7- нитробензотетразин-диоксид (5,8±4% от теоретически возможного), 5-НБТДО и 5,7-ДНБТДО генерировали N0 в меньших количествах 1,0±2 и 1,4±3%, соответственно.

ЫО-донорные свойства использованных бензотетразин-диоксидов предопределили и их способность активировать растворимую гуанилатциклазу (табл.2).

Таблица 2. Влияние глутатиона (100 мкМ) на активацию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека 5-НБТДО 10 мкМ, 7-НБТДО ЮмкМ и 5,7-ДНБТДО 10 мкМ.

Добавленные соединения

Активность Без в отсутствие глутатиона в присутствии глутатиона

рГЦ добавок 5- НБТДО 7- НБТДО 5,7-ДНБТДО — 5- НБТДО 7- НБТДО 5,7-ДНБТДО

Удельная

активность рГЦ, нмоль с цГМФ/мин на 1 мг белка 94±9 424±34 1415±109 771±59 92±8 1060±81 2972±242 1928±148

Степень активации рГЦ 1,0 4,5 15,6 8,2 — 11,3 31,6 20,5

Примечание. Приведены средние величины из 4 - 5 независимых экспериментов

Сравнительно невысокая степень активации фермента в присутствии в пробе 20 мкМ дитиотрейтола значительно увеличивалась (более чем в 2 раза) при добавлении 100 мкМ восстановленного глутатиона, что подтверждало тиолзависимый механизм акгивации гуанилатциклазы.

Наиболее мощным активатором гуанилатциклазы в данной группе соединений оказался 7-нитробензотетразин-1,3-диоксид, являющийся в свою очередь и наиболее эффективным донором оксида азота. >ТО-зависимый механизм активации гуанилатциклазы, исследованными соединениями подтверждался снижением стимулирующего эффекта 7-нигропроизводного в присутствии стандартной «ловушки» N0 СагЬоху-РТЮ (табл.3). Как видно из таблицы 3, СагЬоху-РТЮ (50мкм) тормозит

активацию гуанилатциклазы на 78%.

Таблица 3. Влияние 50 мкМ 2-(4-карбоксифенил)-4,4, 5,5-тетраметилимидазолин-1-оксил-З-оксида (СагЬоху-РТЮ) на активацию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека 10 мкМ 7-нитробензотетразин-1,3-диоксидом (7-НБТДО)_

Добавленные соединения

Активность рГЦ Без добавок СагЬоху-РТЮ 7-НБТДО 7-НБТДО + СагЬоху-РТЮ

с глутатионом (100 мкМ) с глутатионом (100 мкМ)

Удельная активность рГЦ, пмоль цГМФ/мин на 1 мг белка 91±10 110±7 3636±89 800±58

Степень активации рГЦ I 1Д 40,0 8,8

Торможение активации рГЦ, % — — — 78

Примечание. Приведены средние величины из 3 - 4 независимых экспериментов.

Способность исследованных нитробензотетразин-1,3-диоксидов активировать гуанилатциклазу обусловило и их ингибирующее действие на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (рис.2).

100Т

-8-7-6-5 Концентрация соединений, !д[М]

Рисунок 2. Зависимость ингибнронания АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека от концентраций 5-НБТДО, 7-НБТДО и 5,7-ДНБТДО.

Приведены данные из 6 независимых экспериментов .

Интенсивность их тормозящих эффектов находилась в полном соответствии с количеством N0, образовавшегося из этих соединений и степенью активации гуанилатциклазы. Наиболее эффективный донор N0 и активатор гуанилатциклазы (7-

НБДТО) оказался и наиболее сильным ингибитором АДФ-индуцированной агрегации с величиной ГС50 равной 1мкМ. Для 5,7-ДНБТДО и 5-НБДТО величины Ю50 составляли 2 и ЮмкМ, соответственно (рис.2).

Бензодифуроксан. Производные фуроксана (1,2,5-оксадиазол-2-оксида) привлекли к себе внимание, так как многие из этих соединений обладали фармакологической активностью, имитирующей действие оксида азота. Было показано, что эти соединения взаимодействуют с БН-группами и генерируют N0. Химическая формула соединения:

Бензодифуроксан был впервые синтезирован в 1974г. и изучены его антигипертензивные свойства, которые превосходили по эффективности аналогичные свойства нитроглицерина. В то же время биохимические свойства бензодифуроксана не исследовались. Мы более подробно изучили механизм его антигипертензивного действия. Представленные на рис.3 данные впервые показали, что бензодифуроксан является эффективным стимулятором гуанилатциклазной активности, превосходящим по эффективности активацию фермента гаггропруссидом натрия.

1400 -i 1200 •

1000 -

g 800 ■

та ш

g 600 • <

400 -200 -0 ■

-8 -7-6-5-4

Концентрация соединений, lg[М]

Рисунок 3. Влияние бензодифуроксана (БДФ) и нитропруссида натрия (НН) на активность растворимой гуанилатциклазы. Представлены средние значения из 4 независимых экспериментов.

NO-зависимый механизм активации гуанилатциклазы бензодифуроксаном

подтверждался торможением его стимулирующего эффекта в присутствии СЮ<3 (0,3 мкМ) на 75%, а с нитропруссидом натрия на 80%.

Способность бензодифуроксана активировать туанилатциклазу обусловила и антиагрегантные свойства соединения. Как видно из рис.4 и 5, эффективность антиагрегантных свойств определялась интенсивностью стимулирующего влияния на фермент. Более сильный стимулирующий эффект бензодифуроксана по сравнению с нитропруссидом натрия объяснял и более резко выраженную способность бензодифуроксана ингибировать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (рис. 4) и более сильное дезагрегационное действие (рис.5).

Кроме того, впервые показано, что бензодифуроксан является высокоэффективным ингибитором агрегации тромбоцитов, с величиной ГС50 равной б'10"8М; для нитропруссида натрия 1Сзо составляет 5-10"5М.

Производные фуроксана, конденсированные с пнридазнн-ди-М-оксидным циклом. Фуроксаны рассматриваются как пролекарства и фуроксановое кольцо часто вводят в молекулу других доноров N0 для усиления их биологической активности. В институте органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН было синтезировано новое производное фуроксана в котором фуроксановое кольцо конденсировали с пиридазин-ди-Ы-оксидной группировкой: 4,7-диметил- 1,2,5-оксадиазол[3,4-с1]-пиридазин-1,5,6-

0 1 3 £ 7 В НИН

Рисунок 5. Агрегограмма АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека (контроль, К) и деза! регацнонный эффект

бензодифуроксана (БДФ 0,01 мМ) и нитропруссида натрии (НН 0,1 мМ) Время добавления соединений указано стрелкой. По оси абсцисс время после добавления АДФ, мин.

-8 -7 -в -5 -4 „ Концентрация соединения. 1д[М1

Рисунок 4. Зависимость ингибирования АДФ-нндуцированной агрегации тромбоцитов человека от концентрации бензодифуроксана (БДФ) и нитропруссида натрия (НН). Приведены средние величины из трех независимых экспериментов.

триоксид (ОГТТО).

Мы сравнили свойства этого соединения с его структурным аналогом, но производным фуразана - 4,7-диметил-1,2.5-оксадиазол-[3,4-с!]-пиридазин-5,6-диоксид (ОПДО). Химические формулы соединений:

производное производное фуразана

'"'У/""' фуроксана (ОПТО) *"' УЧ ' (ОПДО)

чЛ.

Известно, что фуроксановое кольцо генерирует оксид азота, тогда как фуразановое - не обладает такой способностью. Оба соединения взаимодействуют с тиолами. В опытах с ОПТО при этом генерируется оксид азота. В случае же ОПДО не образуется сколько-нибудь значительных количеств N0. Таким образом, фуроксановое кольцо действительно необходимо для генерирования N0.

Результаты исследований способности ОПТО и ОПДО активировать растворимую гуанилатциклазу представлены на рис.6.

Рисунок 6 Влияние ОПТО, ОПДО и нитропруссида натрия (НН) на активность растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека. Базальная удельная активность составила 118 ± 9 пмоль цГМФ в минуту на 1 мг белка. Представлены средние значениягсГТ независимых экспериментов.

Из рисунка видно, что оба соединения (ОПТО и ОПДО) являются более мощными активаторами гуанилатциклазы, чем нитропруссид натрия. При 10 мкМ концентрациях ОПТО, ОПДО и нитропруссида натрия активация гуанилатциклазы составляла 1820;

960 и 450% , соответственно. Более высокий стимулирующий эффект ОПТО по сравнению с ОПДО вполне объясним, поскольку первое соединение генерирует оксид азота, в отличие от ОПДО.

Однако отсутствие ЫО-донорных свойств у ОПДО не согласовывалось с достаточно высокой (960%) степенью активации гуанилатциклазы этим соединением (рис.6). Поэтому мы исследовали влияние на стимуляцию гуанилатциклазы ОПТО, ОПДО и нитропруссида натрия известного ингибитора МО-зависимой активации фермента ОБО (табл.4).. Из таблицы видно, что ОБО (0,3 мкМ) с практически одинаковой интенсивностью тормозит стимуляцию фермента ОПТО и ОПДО на 40 и 49%, соответственно, но на 75% ингибирует активацию гуанилатциклазы нитропруссидом натрия. Следует заметить, что ООО на самом деле является гемзависимым ингибитором, т.е. он окисляет Ре2+ гема гуанилатциклазы в Ре3\ препятствуя тем самым взаимодействию N0 с гсмом.

Таблица 4. Влияние ООО на активацию гуанилатциклазы тромбоцитов человека ОПТО, ОПДО и нитропруссида натрия (НН).

Добавки Без добавок В присутствии

ОПТО (10'5 М) ОПДО (10"5 М) НН(10"5М)

УА УА Активация % УА Активация % УА Активация %

Без 00<2 61,5±9 1700±273 27,6 935±156 15,5 517±82 8,4

В присутствии ООО (0,3 мкМ) 1025±161 16,7 458±71 7,4 123±18 2,0

Торможение, % 40 49 75

Примечание. В таблице представлены величины удельной активности (УА) растворимой гуанилатциклазы в пмоль цГМФ в минугу на 1 мг белка. Приведены средние величины из 7 независимых экспериментов.

На рис.7 сопоставлены данные о способности ОПТО, ОПДО и нитропруссида натрия ингибировать АДФ-индуцированиую агрегацию тромбоцитов.

Концентрация соединения, lg[M]

Рисунок 7. Зависимость ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека от концентрации ОПТО, ОПДО и НН. Приведены средние величины из 5 независимых экспериментов.

Из рисунка видно, что оба соединения (ОПТО и ОПДО) являются мощными ингибиторами агрегации тромбоцитов. В конечной концентрации (по ЮмкМ) они тормозят АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов на ее обратимой стадии с одинаковой интенсивностью и величиной IC50 равной 5-10"7М.

Здесь уместно отметить, что ОГГГО, генерирующий NO , обладает и вазорелаксантной активностью. Эти исследования были проведены на кафедре физиологии МГУ им. М.В. Ломоносова (Kotz et al., 2000). Антигипертензивный эффект ОПТО проявлялся уже при 10"9М и усиливался при увеличении концентрации до 10"бМ. ОПДО не обладал вазодилататорным свойством в этих условиях. Отсюда можно заключить, что для проявления гипотензивного эффекта соединение должно быть NO-донором. С другой стороны, оба соединения являются мощными ингибиторами АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, обладающими одинаковой интенсивностью (рис.7). Эти данные позволяют заключить, что для проявления антиагрегантных свойств NO-зависимый механизм активации фермента необязателен. По-видимому, основными причинами, которые отвечают за биологическую активность ОПТО и ОПДО является наличие в их молекулах пиридазин-ди-!М-оксидной группировки. Она взаимодействует с тиолами (включая цистеин и глутатион) и способствует генерированию NO из ОПТО, но не ОПДО. Кроме того, эта группировка является

акцептором электронов и может реагировать с металлопорфиринами, в том числе и с гемом гуанилатциклазы окисляя Fe2'" тема в Fe3+ (Kotz et al., 2000). В связи с такой способностью пиридазин-ди-М-оксидной группировки становится понятным почему интенсивность торможения ODQ активации гуанилатциклазы ОГТГО и ОПДО является одинаковой (на 40 и 49%, соответственно) (табл.4). Не исключено, что оба соединения взаимодействуют с Fe2+ гема, по аналогии с тем как это имеет место при взаимодействии NO с Fe2+ гема при активации фермента NO-донорами. При этом механизм активации будет NO-независимым. Но поскольку ОПТО является NO-донором, механизм активации гуанилатциклазы этим соединением будет также и NO-зависимым. Более сильный гипотензивный эффект ОПТО по сравнению с ОПДО (Kotz et al., 2000) и практически одинаковая интенсивность антиагрегантного действия соединений (рис.7), позволяет заключить, что для реализации вазодилататорного действия необходима NO-зависимая активация гуанилатциклазы, а для ингибирования агрегации тромбощггов механизм активации фермента несущественен.

Итак, результаты, полученные при исследовании свойств ОПТО и ОПДО позволяют сделать вывод о том, что для создания эффективных вазодилататоров - активаторов гуанилатциклазы, являющихся NO-донорами - необходимо введение в молекулу NO-донора дополнительной группировки, способной активировать гуанилатциклазу по NO-независимому механизму. Это резко усилит стимулирующий эффект NO-донора и вызовет мощное антишпертензивное действие. В то же время, значительно меньшее стимулирующее действие на гуанилатциклазу за счет NO-донорных свойств соединения, снизит возможность возникновения и развития толерантности.

Изучение ингибиторов NO-зависимой активации тромбоцитарной гуанилатциклазы.

Карнозин - эндогенный дипептид. Карнозин (Р-аланил-Ь-гистидин) природный дипептид, был открыт В.С.Гулевичем в составе экстрактивных соединений мышечной ткани в начале XX века. К настоящему времени установлены важные биологические функции, выполняемые этим природным дипептидом, в частности, проявление им антиоксидантных свойств. Эти свойства реализуются за счет связывания продуктов окисления липидов, взаимодействия с активными формами кислорода, гидроксильными радикалами. С процессом перекисного окисления липидов -и

свободнорадикальными реакциями непосредственно связана и растворимая гуанилатциклаза. Более того, полагают, что свободные радикалы являются эндогенными регуляторами этого фермента.

О взаимодействии карнозина с оксидом азота - данных пег. В то же время, известна способность карнозина образовывать хелашые комплексы с ионами двухвалентных металлов в том числе и с Рег+. Активация гуанилатциклазы оксидом азота обусловлена взаимодействием N0 с Ре2+ гема, входящего в молекулу фермента. Не исключено, что шггиоксидантные свойства карнозина, а также его способность образовывать хелатные комплексы с двухвалентным железом могут модулировать функционирование растворимой гуанилатциклазы.

Мы исследовали влияние карнозина на активность гуанилатциклазы тромбоцитов человека и активацию фермента нитропруссидом натрия. Данные представлены в табл.5. Из данных таблицы видно, что в опытах с супернатантом 1050008, полученным из озвученной суспензии тромбоцитов, карнозин в конечной концентрации 1мМ не влияет на активность гуанилатциклазы, а в концентрации 5 мМ снижает базальную активность на 22%.

Таблица 5. Влияние карнозина на активность гуанилатциклазы тромбоцитов человека и активацию фермента нитропруссидом натрия (НН, ЮОмкМ) и протопорфирином IX (ЛТП, 5 мкМ).

Фермент Добавки Активность, пмоль цГМФ/мин/мг белка Степень активации

НН ПТП

Супернаштг 105 000& без карнозина 183 ±10 29 ±2,0 6,8 ±0,4

с карнозином 1мМ 177 ± 10 10± 1,6 6,5 ± 0,2

с карнозином 5мМ 142 ± 11 5,7 ± 1,7

Элюат ДЭАЭ-целлюлозы без карнозина 1185 4,1 ± 0,9 7,5 ± 1,0

с карнозином 1мМ 1195 4,4 ± 1,0 7,9 ±0,5

Примечание. Приведены средние величины из 5 независимых экспериммггов.

Также видно, что карнозин подавляет способность тромбоцитарной гуанилатциклазы активироваться нитропруссидом натрия. При концентрации

карнозина 1мМ активация нитропруссидом натрия снижается в 3 раза, а при 5мМ - в 5 раз.

Поскольку действие ншропруссида натрия обусловлено взаимодействием N0-группы с железом тема гуанилатциклазы, мы исследовали влияние карнозина на активацию гуанилатциклазы нитропруссидом натрия при развитии гемдефицитности фермента. Ранее было показано, что 7 - 8-кратная очистка тромбоцитарной гуанилатциклазы человека, при хроматографии суперпатанта 105000§ через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, сопровождалась снижением способности фермента активироваться нитропруссидом натрия на 70 - 80%. Из УФ спектра такого препарата гуанилатциклазы исчезал максимум поглощения при 415 - 420нм (полоса Сорэ), присутствующий в исходном супернатанте 10500С^. Другими словами, частично очищенный препарат гуанилатциклазы находился в гем-дефицитной форме.

Из результатов, представленных в табл. 5 видно, что степень активации нитропруссидом натрия такого препарата гуанилатциклазы снижалась на 86% (с 29 до 4,1). Также видно, что карнозин в концентрации 1мМ не влияет на базальную активность фермента и на его способность активироваться нитропруссидом натрия. Таким образом, карнозин не тормозит активацию нитропруссидом натрия гем-дефицитного препарата гуанилатциклазы.

Стимулирующий эффект протопорфирина К не связан с гемом. Из табл.5 видно, что в опытах с супернатаптом 105000§ добавление карнозина (1мМ) на 66% снижает стимулирующий эффект нитропруссида натрия, но не влияет на активацию фермента протопорфирииом IX. В опытах с частично очищенным гем-дефицитным препаратом активация фермента нитропруссидом натрия снижается и этот уровень уже не изменяется при добавлении карнозина (1 мМ). Интенсивность активирующего действия протопорфирина IX на гем-дефищшшй препарат фермента остается той же, что и в опытах с супернатантом 10501^. и степень активации не меняется при добавлении карнозина.

Мы изучили влияние карнозина на стимуляцию гуанилатциклазы тромбоцитов человека производного фуроксана, конденсированного с пиридазин-ди-М-оксидной группировкой: 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазол[3,4-(1]пиридазин1,5,6-триоксазида

(ОПТО), Ж)-донора, а также соответствующего производного фуразана: 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазол[3,4-с1]пиридазин5,6-диоксида (ОПДО), не генерирующего N0.

Полученные результаты представлены в табл.6.

Таблица 6. Влияние карнозина и ODQ на активацию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека нитропруссидом натрия, ОПТО и ОПДО

Добавки Удельная активность ГЦ (пмоль cGMP/мин/мг белка) Активация (%) Торможение (%)

НН (0,1 мМ) без карнозина] 1256 ±100 1570

с карнозином (1 мМ) 326 ±26 408 74

с ODQ (0,ЗмкМ) 314 ±20 392 75

ОПТО (0,01 мкМ) без карнозина 1961±137 2451

с карнозином (1 мМ) 736 ±60 954 61

с ODO (0,3 мкМ) 1176 ±80 1470 40

ОПДО (0,01 мкМ) без карнозина 1504 ±140 1880

с карнозином (1 мМ) 1530 ±137 1912 0

с ODO (0,3 мкМ) 797 ±47 996 47

Примечание. Приведены средние значения из 3-4 независимых экспериментов.

Из таблицы видно, что карнозин (1мМ) резко тормозит активацию гуанилатциклазы нитропруссидом натрия и ОПТО на 74 и 61%, соответственно. Однако карнозин (1мМ) в тех же условиях не изменяет стимуляцию гуанилатциклазы ОПДО (0,01мМ), не являющегося донором оксида азота (0%). Из таблицы также видно, что ОЕНЗ (0,3мкМ) подавляет на 75% активацию гуанилатциклазы нитропруссидом натрия и с одинаковой интенсивностью (40 и 47%) тормозит стимуляцию фермента ОПТО (донора N0) и ОПДО (не генерирующего N0). Эти результаты позволяют рассматривать карнозин в качестве селективного ингибитора МО-зависимой активации гуанилатциклазы.

На это указывают и выявленные нами конкурентные отношения между карнозином и нитропруссидом натрия за связывание с гемом гуанилатциклазы, потеря тормозящего эффекта карнозина в опытах с гемдефицитпой гуанилагциклазой, а также отсутствие торможения карнозином активации фермента протопорфиршюм IX.

Способность карнозина взаимодействовать с гемом гуанилатцшслазы имеет особое значение, поскольку позволяет использовать этот дипепгид для выявления степени насыщенности фермента гемом или его гемдефицитиости, а следовательно, и нарушения эндогенной регуляции туанилапшклазы.

Вывод о том, что карнозин является селективным ингибитором МО-зависимой активации гуанилатциклазы, открывает возможность использования карнозина в качестве лечебного средства при патологических состояниях, связанных с избытком

образования N0 в организме, например, астма, сепсис, мигрень.

Лмброксол-муколитичеекий препарат. Отсутствие в настоящее время в качестве лекарственных средств ингибиторов ЫО-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы, побудило нас выяснить возможную роль сигнальной системы N0 -растворимая гуанилатциклаза - цГМФ в действии лекарств, которые применяются при лечении заболеваний, связанных с избыточным генерированием N0 - например, при астме. Таким лекарством является муколитический препарат - амброксол (1азо1уап) -производное алкалоида визицина, являющегося активным метаболитом бромгексина (Ы5о1уап). Интенсивное образование N0 при этих патологических состояниях обусловлено экспрессией индуцибельной ЫО-синтазы, которая сопровождается резким повышением активности растворимой гуанилатциклазы и накоплением I¡ГМФ.

1201

100-

га X

X 1_

80-

60-

К -7 -6 -5

Амброксол, 1од[М]

Рисунок 8. Влияние амброксола на стимулированную нитронруссидом натрия (НН) активность растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека и легких крысы. Активность гуанилатциклазы определена в отсутствие (К) и присутствии амброксола (0,1 - 50 мкМ). За 100% принята активность гуанилатциклазы в отсутствие амброксола. Приведены средние величины йз 3 независимых экспериментов.

Для исследования возможного биохимического механизма терапевтического действия амброксола, было изучено влияние амброксола на активность растворимых

гуанилатциклаз из тромбоцитов человека и легких крыс, а также стимуляцию обоих ферментов КО-донорами (шггропруссидом натрия и сиднонимином (8т-1)).

На рис.8 представлены данные по влиянию амброксола на индуцированную нитропруссидом натрия активацию растворимой гуанилатциклазы из тромбоцитов человека и легких крысы. Амброксол в диапазоне концентраций от 0,1 до ЮмкМ ингибирует стимуляцию ферментов нитропруссидом натрия с величинами Юзо равными 3,9 и 2,1мкм для гуанилатциклаз из тромбоцитов человека и легких крысы, соответственно.

Амброксол тормозит также (на 73,0*6,3%) активацию гуанилатциклазы тромбоцитов человека 5т-1 (10°М) - другого Ж)-донора, однако добавление амброксола (10 мкМ) не влияет на активацию растворимой гуанилатциклазы протопорфирином IX (5 мкМ). Эти данные указывают, что молекулярный механизм терапевтического действия амброксола включает в себя ингибирование ГЮ-зависимой активации гуанилатциклазы.

В результате проведенных исследований была впервые выявлена способность амброксола избирательно тормозить МО-зависимую активацию растворимой гуанилатциклазы, а также обнаружена аналогия в интенсивности ингибировашя амброксолом активации Ж)-донором (нитропруссидом натрия) двух гуанилатциклаз (из тромбоцитов человека и легких крыс, рис.9). Эти данные показали, что исследование активности фермента в тромбоцитах больных астмой и ингибирование этой активности амброксолом может быть использовано для разработки нового биохимического теста для определения тяжести заболевания и эффективности лечения амброксолом используя тромбоциты.

Полученные нами данные о торможении амброксолом М'О-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы впервые указывают на возможность создания новых эффективных муколитических средств на основе ингибиторов МО-зависимой активации гуанилатциклазы. Преимуществом подобных лекарственных препаратов было бы подавление только избыточного образования N0 и при этом не нарушался бы синтез оксида азота необходимый для регуляций нормальных физиологических функций дыхательного тракта.

Артемизипин - антималярийный препарат. Роль гуанилатциклазы при малярийной интоксикации изучена недостаточно. Есть данные, что цГМФ может

участвовать в индукции эксфлагеляции (образование микрогамет у малярийного токсина). Фармакологический эффект препарата связывают с взаимодействием соединения с гемином или гемом. Следует заметить, что целый ряд соединений способных связываться с гемом, обладают антималярийной активностью. Для изучения возможной роли гуанилатциклазы в механюме фармакологического действия артемизинина мы исследовали влияние последнего на активацию растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека ЬЮ-генерирующими соединениями относящихся к различным классам химических соединений: нитропруссидом натрия, сиднонимином (5т-1) и производным фуроксана-3,4-дициано-1,2,5-оксадиазол-2-оксидом.

Мы показали, что артемизинин концентрациоиио зависимым образом ингибирует индуцированную нитропруссидом натрия (100 мкМ) активацию гуанилатциклазы с величиной 1Сзо равной 5,6 мкМ (рис. 9).

110

-О

0 100 -

| 90 -£ 80

5=Г 60

1 о. 50 га

8 40 Н

о.

5 зо •

| 20 •

О 10 • 01

-4-

К -7 -6 -5 -4

Артемизинин, 1од[М]

Рисунок 9. Торможение артемизинипом стимулированной нитропруссидом натрия активности растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека.

Активность гуанилатциклазы определена в отсутствие (К) и присутствии артемизинина (0,1 -100 мкМ). За 100% принята активность гуанилатциклазы в отсутствие артемизинина. Приведены средние величины из 4 независимых экспериментов.

Артемизинин в конечной концентрации 10 мкМ тормозит также активацию фермента и другими МО-донорами: Бт-1 (10 мкМ) на 87 ± 7% и 3,4-дициано-1,2,5-

оксадиазоло-2-оксидом (Ю мкМ) на 71 ± 4%. В то же время артемизинин не влияет на активацию фермента протопорфирином IX, активация которым не связана с гемом. Эти результаты предполагают участие гема гуанилатциклазы в механизме торможения артемизинином МО-зависимой активации фермента. •

С другой стороны, возможно, что выявлеш!ый эффект артемизинина обусловлен взаимодействием N0 с кислородными радикалами, образующимися из артемизинина при его реакции с гемом гуанилатциклазы. Однако отсутствие влияния супероксиддисмутазы и каталазы на ингибиторный эффект артемизинина исключает такую возможность. Торможение артемизинином (10 мкМ) активации гуанилатциклазы нитропруссидом натрия без и в присутствии супероксиддисмутазы (167 ед/мл) или каталазы (127 ед/мл) составляет 60 ± 3,6%, 58 ± 2,9% и 63 ± 4%, соответственно.

Данные о роли N0 при малярии не позволяют сделать окончательный вывод о биохимическом механизме, ответственным за терапевтическое действие артемизинина. В то же время следует заметить, что ингибирование >Ю-зависимой активации фермента артемизинином наблюдается при его терапевтических концентрациях в интервале от 0,2 до 12,8 мкМ. Величина ГС50 для артемизинина, определенная нами, (5,6 мкМ) как раз находится в интервале этих концентраций. Это предполагает, что действие этого антималярийного средства включает в себя ингибирование МО-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы.

выводы

1. Новые, ранее не исследованные потенциальные доноры оксида азота: производные М-нитропиразола, различающиеся заместителями в 3, 4 и 5 положениях пиразольного кольца, 5-нитро, 7-ннтро, и 5,7-динитробензотетразин-1,3 диоксиды, бензодифуроксан генерируют оксид азота (N0), активируют растворимую гуанилатциклазу и ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека с интенсивностью находящейся в полном соответствии со способностью соединений генерировать N0 и активировать гуанилатциклазу.

2. Производное фуроксана, конденсированное с пиридазин-ди-М-оксидной группировкой - 4,7 -диметил-1,2,5-оксадиазол-[3,4-сАпиридазин-1,5,б-триоксид (ОПТО), являющийся МО-донором и его структурный аналог, производное фуразана -4,7-диметил-1,2,5-оксадиазол-{3,4-сА пирццазин-5,б-диоксид (ОПДО), не генерирующего N0 являются мощными активаторами гуанилатциклазы и тормозят АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов с одинаковой интенсивностью (ГС50 равной 5 • 10'7 М). Сделано заключение, что для проявления гипотензивных свойств механизм активации гуанилатциклазы должен быть (хотя бы частично) МО-зависимым, тогда как эффективность антиагрегшгтного действия не зависит от механизма активации фермента

3. Карнозин (эндогенный дипептид) является селективным ингибитором МО-зависимой активации гуанилатциклазы. Он тормозит активацию фермента МО-донорами, но не влияет на стимуляцию гуанилатциклазы соединениями не генерирующими N0. Ингибирование карнозином N0 -зависимой активации гуанилатциклазы обусловлено взаимодействием карнозина с Ре2ь гема фермента.

4. Амброксол (муколитический препарат) и артемизинин (антималярийное средство) - ингибируют МО-зависимую активацию гуанилатциклазы и не влияют на активацию фермента протопорфирином IX. Выдвинуто представление, что молекулярный механизм терапевтического действия этих препаратов включает в себя ингибирование N0 -зависимой активации растворимой гуанилатциклазы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пятакова Н.В., Северина И.С. Растворимая гуанилатциклаза в молекулярном механизме действия лекарственных средств.// Биомед.химия. 2012. Т. 58(1). С. 3242.

2. Северина И.С., Пятакова Н.В., Щеголев А.Ю., Сидорова Т.А. YC-1-аналогичное потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы ааренохромом. // Биомед. химия. 2008. Т. 54(6) С. 679-686.

3. Severina I.S., Pyatakova N.V., Postnikov A.V., Preobrazhenskaya M.H., Khropov Yu.V. Antitumor antibiotic streptonigrin and its derivatives as inhibitors of nitric oxide-dependent activation of soluble guanylate cyclase.// Eur. J.Pharmacol. 2004. V. 483. P. 127-132.

4. Severina I.S., Bussygina O.G., Pyatakova N.V., Malenkova I.V., Vanin A.F. Activation of soluble guanylate cyclase by NO donors - S-nitrosothioIs and dinitrosyl-iron complexes with thiol containing Iigands.// NitricOxide. Biology and Chemistry. 2003.V. 8. P. 153-163.

5. Severina I.S., Pyatakova N.V., Bussygina O.G., Mikhailitsin F.S., Khropov Y.V., Inhibition of nitric oxide-dependent activation of soluble guanylate cyclase by the antimalarial drug, artemisinin.// Eur. J.Pharmacol. 2002. V. 438. P. 69-73.

6. Пятакова H.B., Хропов Ю.В., Чураков A.M., Тарасова Н.И., Сережегасов В.А., Ванин А.Ф., Тартаковский В.А., Северина И.С. Производные бензотетразин-1,3-диоксида- новые доноры оксида азота, активаторы растворимой гуанилатциклазы и ингибиторы агрегации тромбоцитов.//Биохимия 2002. Т. 67(3). С. 396-402.

7. Северина И.С., Бусыгина О.Г., Пятакова Н.В. Активация растворимой гуанилатциклазы новыми донорами NO-как основа направленного поиска новых эффективных вазодилататоров и антиагрегантов.// Вестник РАМН. 2000. №4. С. 25-30.

8. Бусыгина О.Г., Пятакова Н.В., Хропов Ю.В., Овчинников И.В., Махова Н.Н., Северина И.С. Бензодифуроксан как NO-зависимый активатор растворимой гуанилатциклазы.// Биохимия. 2000. Т. 65(4). С. 540-546.

9. Северина И.С., Бусыгина О.Г., Пятакова Н.В. Карнозин как регулятор растворимой гуанилатциклазы. // Биохимия. 2000. Т. 65(7). С. 921-927.

10. Severina I.S., Bussygina O.G., Pyatakova N.V., Khropov Yu.V., Krasnoperov R.A. Ambroxol as an inhibitor of nitric oxide-dependent activation of soluble guanylate cyclase // Eur. J.Pharmacol. 2000. V. 407. P. 61-64.

11. Хропов Ю.В., Пятакова H.B., Гаврилова C.A., Бусыгина О.Г., Красноперое Р.А., Северина И.С. Ингибитор NO-зависимой активации растворимой формы гуанилатциклазы. Патент 2189392 РФ. №2001101366/13; заявл. 16.01.2001; опубл. 20.09.2002.

Подписано в печать:

02.11.2012

Заказ № 7788 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пятакова, Наталья Владимировна

Введение

Цель и задачи исследования

Обзор литературы

Глава 1. Растворимая гуанилатциклаза

1. Основные свойства растворимой гуанилатциклазы

2. Гетеродимерная структура растворимой гуанилатциклазы

3. Функциональные характеристики субъединиц фермента

- ]\-концевой регуляторный домен

- Центральный димеризационный домен

- С-каталитический домен

4. Механизм каталитической активности растворимой гуанилатциклазы

Глава 2. Эндогенный оксид азота - активатор растворимой гуанилатциклазы

1. Образование эндогенного оксида азота

2. Активация фермента оксидом азота

3. Антигипертензивное действие оксида азота

4. Антиагрегантное действие оксида азота

5. Роль растворимой гуанилатциклазы в агрегации тромбоцитов 23 Материалы и методы исследований

1. Использованные реактивы и материалы

2. Объект исследования

3. Выделение тромбоцитов из крови человека

4. Получение препарата растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов 32 человека

5. Получение препарата растворимой гуанилатциклазы легких крысы

6. Определение концентрации белка

7. Определение активности гуанилатциклазы

8. Определение количества цГМФ

9. Проведение агрегации тромбоцитов

10. Статистическая обработка результатов

Результаты исследований и их обсуждение

Глава 1. Новые доноры оксида азота (N0)) - активаторы гуанилатциклазы и 39 ингибиторы агрегации тромбоцитов.

1. Производные ]\-нитропиразола

2. Производные бензотетразин-1,3-диоксида

3. Бензодифуроксан

4. Производные фуроксана, конденсированные с пиридазин-ди-1Ч- 63 оксидным циклом

Глава 2. Новые ингибиторы 1ЧО-зависимой активации растворимой 70 гуанилатциклазы

1. Карнозин - эндогенный дипептид

2. Амброксол (1а$о1уап) - муколитический препарат

3. Артемизинин - антималярийный препарат 86 Заключение 93 Выводы 99 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы"

Эндогенный оксид азота (N0), оказавшийся эндотелиальным фактором релаксации (ЭДФР), является одним из основных сосудорасширяющих факторов. В 1998 г. американским ученым Роберту Ферчготту, Луису Игнарро и Фериду Мураду за открытие роли оксида азота, как сигнальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине.

Эндогенный N0 образуется из Ь-аргинина за счет окисления азота аминогруппы гуанидинового фрагмента под действием Ь-аргинин-ИО-синтазы [1]. Он участвует во многих жизненно-важных процессах [2, 3], является мощным фактором гемостаза. Оксид азота ингибирует агрегацию тромбоцитов [4] и рассматривается в настоящее время как эндогенный вазодилататор [5]. Основным внутриклеточным рецептором N0 является растворимая гуанилатциклаза (гуанозин-5-трифосфатлиаза (циклизующая) ЕС.4.6.1.2.).

Фермент катализирует биосинтез циклического 3',5'-гуанозинмонофосфата (цГМФ) из гуанозин-5-трифосфата (ГТФ). Циклический ГМФ является вторичным посредником, мощным регулятором метаболизма клетки, в значительной степени определяющим ее функции. Биологические эффекты цГМФ опосредуются тремя основными типами внутриклеточных эффекторов: цГМФ-зависимыми протеинкиназами [6], регулируемыми цГМФ - ионными каналами и фосфодиэстеразой [7]. Антиагрегантные свойства и сосудорасширяющее действие оксида азота связаны с активацией растворимой гуанилатциклазы и накоплением цГМФ [8]. Гидролиз цГМФ осуществляет фосфодиэстераза [7]. Однако, основным ферментом обмена цГМФ является гуанилатциклаза, и за накопление цГМФ в клетках отвечает именно этот фермент.

Гуанилатциклаза существует в двух формах: мембраносвязанная и растворимая. Эти формы представляют собой не только разные белки, но и ферменты с различными механизмами регуляции [9]. Мембраносвязанная гуанилатциклаза - это мономер, представляющий собой единую полипептидную цепь [9]. Эта форма фермента служит рецептором для натрийуретических пептидов [10]. Растворимая гуанилатциклаза является гетеродимером, состоящим из двух иммунологически различных субъединиц

И].

В данной работе будет рассматриваться только растворимая форма гуанилатциклазы, поскольку именно этот фермент лежит в основе молекулярных механизмов действия оксида азота. Растворимая гуанилатциклаза является широко распространенным ферментом и обнаружена в цитозольной фракции практически всех клеток млекопитающих. Однако интерес к ней резко возрос только в конце 80-х гг. прошлого века, после установления эндогенной природы оксида азота и идентификации его в качестве эндотелиального фактора релаксации (ЭДФР) [12]. Именно тогда появилась новая внутриклеточная сигнальная система - оксид азота - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ.

Важная роль повсеместно распространенной сигнальной системы N0 - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ в функции клеток, нарушение активности этой системы при многих патологических состояниях (гипертония, астма, сепсис, злокачественные новообразования) требуют создания препаратов, которые направленно регулировали активность этой системы и таким образом устраняли бы возникшие нарушения. Подобные модуляторы активности гуанилатциклазы способствовали бы выяснению физиологической значимости этого фермента и могли бы использоваться в качестве терапевтических средств [13].

Оксид азота опосредует многочисленные физиологические и патофизиологические процессы в сердечно-сосудистой системе. Дисфункция эндотелия, выполняющего защитные функции, наблюдается при различных сердечно-сосудистых заболеваниях, включающих атеросклероз, гипертонию, сердечную недостаточность, инсульт. Нарушение функции эндотелия сопровождается дефицитом оксида азота, который приводит к возникновению и развитию различных патологических состояний. В этих условиях замена эндогенного N0, введением соединений, способных генерировать его в организме обеспечивает основу для широкого использования фармакологических средств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Наиболее известными лекарственными средствами, которые долгие годы используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, таких как стенокардия, тяжелые формы гипертонии, комплексного лечения инфаркта миокарда и сердечной недостаточности и связанных с дефицитом образования эндогенного оксида азота, являются органические нитраты (нитроглицерин и др.). Механизм действия этих соединений был установлен только в конце 70-х гг., когда было обнаружено, что в результате их метаболизма образуется оксид азота, активирующий гуанилатциклазу, что приводит к накоплению цГМФ и вазодилатации. Физиологичность действия органических нитратов привлекла к себе пристальное внимание исследователей. Усилия многих ученых во всем мире были направлены на синтез соединений, которые могли бы стать источником N0 при введении в живой организм и таким образом оказаться эффективными вазодилататорами.

Однако, нежелательные побочные эффекты, возникающие при длительном применении органических нитратов, в том числе развитие толерантности, ограничивают их использование. Тем не менее, несмотря на накопленное к настоящему времени большое число активаторов гуанилатциклазы, генерирующих оксид азота, поиск новых доноров N0, способных быть использованными в качестве лекарственных средств, но более эффективных и менее токсичных - продолжается.

Нарушение активности сигнальной системы N0 - растворимая гуанилатциклаза -цГМФ возникает не только при патологических состояниях связанных с недостатком образования эндогенного N0 в организме, но и при его избытке (астма, сепсис, септический шок). При септическом шоке наблюдается значительное снижение артериального давления и снижение чувствительности к сосудосуживающим агентам. В этих случаях в качестве терапевтических средств необходимо использовать ингибиторы ИО-зависимой активации гуанилатциклазы. Однако, такие соединения, в отличие от МО-доноров, практически отсутствуют. Такие известные ингибиторы, как метиленовая синь, Ь483583 неспецифичны и могут быть источником образования токсичных продуктов [14]. Известные ингибиторы ЫО-зависимой активации ОБС^ {1Н-[1,2,4]оксадиазол-[4,3-а]хиноксалин-1} и N82028 {4Н-бром-1,2,4-оксадиазол-(4,3-с1)(б)(1,4)оказин-1} оказались гем-зависимыми ингибиторами [15,16, 17].

В связи с вышеизложенным поиск новых ЫО-доноров, способных активировать гуанилатциклазу, оказывать гипотензивный эффект и проявлять антиагрегантные свойства, а также выявление и исследование новых соединений, селективно ингибирующих 1чЮ-зависимую активацию фермента является важным и актуальным не только для выяснения физиологической значимости внутриклеточной сигнальной системы N0 -растворимая гуанилатциклаза - цГМФ, но и для решения задач практической медицины.

Цель исследования

Изучение механизмов направленной регуляции растворимой гуанилатциклазы новыми активаторами и ингибиторами фермента.

Задачи исследования

- производные 1Ч-нитропиразола

- производные бензотетразин -1,3-диоксида

- бензодифуроксан

- производные фуроксана, конденсированные с пиридазин-ди-Ы-оксидным циклом

2. Изучить способность соединений генерировать оксид азота, активировать растворимую гуанилатциклазу и ингибировать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов

- карнозин - эндогенный дипептид ((З-аланил-Ь-гистидин)

- амброксол - муколитический препарат

- артемизинин - антималярийный препарат.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пятакова, Наталья Владимировна

выводы

1. Новые, ранее не исследованные потенциальные доноры оксида азота: производные И-нитропиразола, различающиеся заместителями в 3, 4 и 5 положениях пиразольного кольца, 5-нитро, 7-нитро, и 5,7-динитробензотетразин-1,3 диоксиды, бензодифуроксан генерируют оксид азота (N0), активируют растворимую гуанилатциклазу и ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека с интенсивностью находящейся в полном соответствии со способностью соединений генерировать N0 и активировать гуанилатциклазу.

2. Производное фуроксана, конденсированное с пиридазин-ди-Ы-оксидной группировкой - 4,7 -диметил-1,2,5-оксадиазол-[3,4-а?]пиридазин-1,5,6-триоксид (ОПТО), являющийся МО-донором и его структурный аналог, производное фуразана - 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазол-{3,4-£/] пиридазин-5,6-диоксид (ОПДО), не генерирующего N0, являются мощными активаторами гуанилатциклазы и тормозят АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов с одинаковой интенсивностью (ГС50 равной 5*10"7 М). Сделано заключение, что для проявления гипотензивных свойств механизм активации гуанилатциклазы должен быть (хотя бы частично) МО-зависимым, тогда как эффективность антиагрегантного действия не зависит от механизма активации фермента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из основных задач данной работы было исследование способности новых доноров оксида азота активировать растворимую гуанилатциклазу и проявлять антиагрегантные свойства - ингибировать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

Ранее нами было показано [77], что функционирование тромбоцитарной гуанилатциклазы и агрегационная способность тромбоцитов взаимосвязаны. Активация гуанилатциклазы тормозит агрегацию тромбоцитов и регуляторная роль гуанилатциклазы проявляется на самой ранней (обратимой) стадии агрегационного процесса. Поэтому, активаторы фермента будут не только ослаблять гиперагрегацию тромбоцитов, но и (что особенно важно) предупреждать (или ослаблять) спонтанную агрегацию, следовательно, предупреждать возникновение и развитие сосудистых осложнений.

При изучении новых доноров оксида азота особое внимание обращалось на способность активаторов фермента ингибировать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Полученные результаты показали, что все исследованные >Ю-доноры активировали гуанилатциклазу пропорционально количеству образовавшегося оксида азота и ингибировали АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов с интенсивностью полностью соответствующей величине стимулирующего эффекта соединения на активность гуанилатциклазы.

В этой связи особого внимания заслуживает выявленный нами мощный антиагрегантный эффект исследованного производного Ы-нитропиразола - 3,5-диметил-Ы-нитропиразол. Соединение оказалось наиболее активным стимулятором гуанилатциклазной активности, а также мощным ингибитором АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов с величиной Ю50 равной 7'10"9М. Для сравнения величина ГС50 для нитропруссида натрия составляла 5*10"5М.

Из производных бензотетразин-1,3-ди-Ь[-оксида (ранее не исследованных классов доноров N0) наиболее эффективным активатором гуанилатциклазы оказался 7-нитробензотетразин-ди- И-оксид. Величина Ю50 ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов этим соединением составляла на порядок ниже чем для нитропруссида натрия.

Впервые установлено, что известный вазодилататор (генерирующий оксид азота) бензодифуроксан, оказался мощным ингибитором агрегации тромбоцитов с величиной 1С5о равной 6-10"8М.

Эти результаты подтверждают полученные нами ранее данные при изучении различных МО-доноров [163 - 166], когда было показано, что внутри каждого класса исследованных МО-доноров наиболее активный донор N0 был наиболее мощным активатором гуанилатциклазы и наиболее сильным ингибитором АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.

Таким образом, на основании величины стимулирующего эффекта соединения на гуанилатциклазу могла прогнозироваться фармакологическая активность (гипотензивная и антиагрегантная) исследованных доноров N0.

Известно, что основным недостатком использования нитровазодилататоров (генерирующих оксид азота) является возникновение нежелательных побочных эффектов, в том числе развитие толерантности, которое связывают с истощением эндогенных тиолов, необходимых для генерирования оксида азота из исследуемых N0-доноров [167 - 170]. В связи с этим, большое внимание уделяется соединениям, активирующим гуанилатциклазу по МО-независимому механизму. Именно поэтому в настоящее время в качестве новых МО-доноров часто исследуют производные фуроксана, которые нередко являются тиол-независимыми донорами оксида азота [95, 171, 172]. В дальнейших работах различных авторов были представлены данные о способности новых синтезированных фуроксанов быть не только вазодилататорами, но и эффективными антиагрегантами [173, 174].

В этом отношении особого внимания заслуживают полученные нами результаты по исследованию нового ИО-донора - ОПТО (4,7-диметил-1,2,5-оксадиазол[3,4-с1]-пиридазин-1,5,6-триоксид). Как уже указывалось выше, ОПТО генерирует оксид азота благодаря присутствию в его молекуле фуроксановой группировки. Однако, интенсивность активации гуанилатциклазы этим соединением была значительно выше, чем это соответствовало количеству образовавшегося оксида азота. Это обусловлено тем, что в молекуле ОПТО помимо фуроксановой группировки присутствует также пиридазин-ди-М-оксидная группа. Последняя резко усиливала активацию растворимой гуанилатциклазы благодаря своей способности взаимодействовать с Бе2* тема гуанилатциклазы независимо от N0, экстрагировать Ре из плоскости порфиринового кольца и вызывать сильный стимулирующий эффект по МО-независимому механизму. В результате совместного действия обеих группировок происходило резкое стимулирование гуанилатциклазной активности, которое вызывало мощное вазорелаксантное и антиагрегантное действие. Таким образом, ОПТО обладает цепными физиологическими свойствами, которые могут быть использованы при создании новых эффективных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

На основании данных полученных с ОПТО можно заключить, что для создания эффективных вазодилататоров соединение должно быть ИО-донором в молекуле которого дополнительно присутствует группировка, активирующая гуанилатциклазу по Ж)-независимому механизму. В результате, резко усиливается стимулирующий эффект использованного МО-донора и осуществляется мощное гипотензивное действие.

Сопоставление же свойств ОПТО (являющегося 1ЧО-донором) с его структурным аналогом ОПДО (производного фуразана, не генерирующего оксид азота) позволило дополнительно сделать и другие важные выводы. Если для проявления гипотензивных свойств исследуемыми соединениями механизм активации ими гуаиилатциклазы должен быть (хотя бы частично) ЫО-зависимым, то эффективность антиагрегантного действия активаторов гуаиилатциклазы не зависит от механизма активации фермента. Кроме того, как уже отмечалось выше, отличительной чертой антиагрегантов, являющихся активаторами гуаиилатциклазы, будет способность соединений не только снижать гиперагрегацию тромбоцитов, но и предупреждать спонтанную агрегацию а, следовательно, предупреждать возникновение и развитие сосудистых осложнений.

Таким образом, синтез новых доноров оксида азота, исследование их влияния на растворимую гуанилатциклазу, выявление среди них наиболее активных стимуляторов фермента для фармакологических исследований, является молекулярной основой для направленного поиска и создания новых, эффективных, антигипертензивных и антиагрегантных препаратов, а представленные данные являются важными для решения задач практической медицины.

Впервые выявленная способность карнозина - эндогенного дипептида ((З-аланил-Ь-гистидина) избирательно блокировать >Ю-зависимую активацию растворимой гуаиилатциклазы заслуживает особого внимания. Благодаря полученным результатам возникает возможность использования карнозина в качестве лечебного средства при патологических состояниях, связанных с избытком генерирования эндогенного оксида азота в организме и усилением активности внутриклеточной сигнальной системы N0 -растворимая гуанилатциклаза - цГМФ (например, при астме). Следует подчеркнуть, что карнозин нетоксичен, удобен для применения в клинической практике [121], соединение полностью метаболизируется в организме человека и не накапливается в органах млекопитающих при длительном применении. Известно, что карнозин уже используется в качестве лекарственного средства в офтальмологии [175,176].

Представленные результаты о вовлечении сигнальной системы N0 - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ (прямо или косвенно) в механизм терапевтического действия амброксола (муколитического препарата) и артемизинина (антималярийного средства) имеет важное значение как для создания новых эффективных лекарственных препаратов, так и для уточнения (а возможно и пересмотра) существующих представлений о механизме действия известных лекарств [177].

Известные данные, что воспалительные процессы в дыхательных путях у людей больных астмой сопровождаются экспрессией индуцибельной NO-синтазы, привели к представлению о возможном создании новых муколитических препаратов на основе ингибиторов NO-синтазы [131]. С другой стороны, полученные нами данные о торможении амброксолом NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы, впервые указывают на возможность создания новых муколитических средств на основе ингибиторов NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы. Последнее обстоятельство имеет преимущество, поскольку при этом снижается в основном только избыточное образование N0 и не подавляется его синтез, который необходим для регуляции нормальных физиологических функций дыхательного тракта.

Молекулярный механизм выявленной и изученной нами ингибиторной активности артемизинина требует дальнейшего изучения. Однако, сам факт торможения артемизинином NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы позволяет предположить перспективность поиска новых антималярийных средств среди ингибиторов NO-зависимой активации гуанилатциклазы. На это свойство артемизинина следует обратить особое внимание еще и потому, что как уже указывалось выше, в ряде случаев протекания малярии вызванной P. Falciparum возникает патологическое состояние, выражающееся в сильной системной легочной вазодилатации, что может приводить к летальным исходам [160]. Данное патологическое состояние имеет много общего с септическим шоком, который сопровождается резким усилением NO-зависимой активации гуанилатциклазы .[14]. Гипотензия при септическом шоке купировалась метиленовым синим, который повышал давление у каждого пациента [161, 162]. Не исключена возможность аналогичного действия артемизинина. Таким образом, представленные данные предполагают перспективность поиска новых антималярийных средств среди ингибиторов МО-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы и обосновывают необходимость учета влияния антипротозойных и противопаразитных препаратов на активность растворимой гуанилатциклазы.

Итак, представленные в настоящей работе данные о механизмах направленной регуляции активности растворимой гуанилатциклазы, представляют значительный интерес не только в плане широких энзимологических исследований, но и для решения задач практической медицины.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пятакова, Наталья Владимировна, Москва

1. Palmer R.M.J., Ashton D.S., Moncada S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine.//Nature. 1988. V. 333. P. 664-666.

2. Snyder S.M. Nitric oxide: first in class of neurotransmitters.// Science. 1992. V. 257. P. 494496.

3. Hibbs J.B., J, Taintor R.R. and Vavrin Z. Macrophage cytotoxicity: role for L-arginine deiminase and imino nitrogen oxidation to nitrite.// Science. 1987. V. 235. P. 473-476.

4. Busse R. Luckhoff A. Bassenge E. Endothelium-derived relaxing factor ingibits platelet activation.//Naunyn Schmieberks Arch. Farmacol. 1987. V. 336. P. 566-567.

5. Moncada S., Higgs E.A. Molecular mechanism and therapeutic strategis related to nitric oxide.// FASEB J. 1995. V. 9. P. 1319-1330.

6. Hoffmann F., Feil R., Kleppisch T., Schlossmann J. Function of cGMP-dependent proteinkinases as revealed by gene deletion.//Physiol. Pev. 2006 V. 86. P. 1-23.

7. Beavo J.A. Cyclic nucleotide phosphodiesterases: functional implications of multiple isoforms.// Physiol. Rev. 1995. V. 75. P. 725-748.

8. Северина И.С. Растворимая гуанилатциклаза тромбоцитов: значение тема в регуляции ферментативной активности, роль фермента в агрегации тромбоцитов.// Биохимия. 1994. V. 59(3). Р. 325-339.

9. Lucas К. A., Pitari G.M., Kazeronian A., Ruitz-Stewart I., Park J., Schultz S., Chepenik K.P., Waldman S.A. Guanylyl cyclase and signaling by cyclic GMP.// Pharmacol. Rev. 2000. V. 52. P. 375-413.

10. Castro L.R., Verde I., Cooper D.M., Fischmeister R. Cyclic guanosine monophosphate compartmentation in rat cardiac myocytes.// Circulation. 2006. V. 113. P. 2221-2228.

11. Zabel U., Hausler G., Weeger M., Schmidt H.H. Homodimerization of soluble guanylyl cyclase affinity tag.// J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 18149-18152.

12. Ignarro L.J., Napoli C., Loscalso J. Nitric oxide donors and cardiovascular agents modulating the bioactivity of nitric oxide. An overview.// Circ.Res. 2002. V. 90. P. 21-28.

13. Hobbs A.J., Ignarro L.J. Nitric oxide-cyclic GMP-signal transduction system.// Methods Enzymol. 1996. V. 269. P. 134-148.

14. Hobbs A. J. Soluble guanylate: the forgotten sibling.// TiPS. 1997. V. 18. P. 484 491.

15. Schrammel A., Behrends S., Schmidt K., Koesling D., Mayer B. Characterization of 1H-l,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-l-one (ODQ) as a heme site inhibitor of nitric oxidesensitive guanylyl cyclase.// Mol. Pharmacol. 1996. V. 50. P. 1-5.

16. Zhao Y., Brandish P.E., Di Valentin M., Schelvis J.P., Babcock G.T., Marietta M.A. Inhibition of soluble guanylate cyclase by ODQ. / Biochemistry. 2000. V. 39. P. 10848-10854.

17. Olesen S.P., Drejer J., Axelsson O., Moldt P., Bang L., Nielsen-Kudsk J.E., Busse R., Mulsch A. Characterization of NS2028 as a specific inhibitor of soluble guanylyl cyclase.// Br. J. Pharmacol. 1998. V. 123. P. 299-309.

18. DerbystrireE.R., Fernhoff N.B., Deng S., Marietta M.A. Nusleotede regulation of soluble guanylate cyclase substrate specificity.// Biochemestry.2009. V. 48 P. 7519-7524.

19. Gerzer R., Bohme E., Hofman F., Schultz G. Soluble guanylate cyclase purified from bovine lung contain heme and copper.// FEBS Lett. 1981. V. 132. P. 71-74.

20. Poulos T.L. Soluble guanylate cyclase.// Curr. Opin. Strukt. Biol. 2006. V. 16. P. 736-743.

21. Bellamy T.C., Wood K.S., Garthwaite J. On the activation of soluble guanylyl cyclase by nitric oxide.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99(1). P. 507-510.

22. Negrerie M., Bouzhir L., Martin J.L., Liebl U. Control of nitric oxide dynamics by guanylate cyclase in its activated state.// J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 46816-46821.

23. Ignarro L.J., Adams J.B., Horwitz P.M., Wood K.S. Activation of soluble guanylate cyclase by NO-hemoproteins involves NO-heme exchange: comporison of heme-containing and heme-deficient enzyme forms.// J. Biol.Chem. 1986. V. 261. P. 4997-5002.

24. Северина И.С. Оксид азота. Роль растворимой гуанилатциклазы в механизмах его физиологических эффектов.// Вопр. мед. Химии. 2002. №. 48. С. 3-35.

25. Stone J.R., Marietta М.А. Soluble guanylyl cyclase from bovine lung: activation with nitric oxide and carbon monoxide and spectral characterisation of the ferrous and ferric states.// Biochemistry. 1994. V. 33. P. 5636-5640.

26. Braughler J. Soluble guanylate cyclase activation by nitric oxide and its reversal Involvement of sulfhydryl group oxidation and reduction.// Biochem. Pharmacol. 1983. V. 32. P. 811-818.

27. Wu X.B., Brune В., von Appen F., Ulrich V. Reversible activation of soluble guanylate cyclase by oxidizing agents.// Arch. Bioch. Biophys. 1992. V. 294. P. 55-82.

28. Murad F., Mittal C.K., Arnold W.P., Katsuki S., Kimura H. Guanylate cyclase activation by azide, nitrocompounds, nitric oxide and hydroxyl radical fnd inhibition by hemoglobin and mioglobin.//Adv. Cycl.Nucl. Res. 1978. V. 9. P. 145-158.

29. Graff G., Stephenson J.H., Glass D.B., Haddox M.K., Goldberg N.D. Activation of soluble splenic cellguanylate cyclase by prostaglandin endoperoxides and fatty acid hydroperoxides.// J. Biol.Chem. 1978. V. 10(253). P. 7662-7676.

30. Северина И.С., Бусыгина О.Г. Роль карнозина в функционировании растворимой гуанилатциклазы.//Биохимия. 1992. Т. 57. С. 1330-1336.

31. Koesling D., Herz J., Causepohl H., Niroomand F., Hinsch K.D., Mulsch A., Böhme E., Shultz G., Frank R. The primary structure of the 70 kDa subunit of bovine soluble guanylate cyclase.// FEBS Lett. 1988. V. 239. P. 29-34.

32. Yuen P.S., Potter L.R., Garbers D.L. A new form of guanylyl cyclase is preferentially expressed in rat kidney.//Biochemistry. 1990. V. 29. P. 10872-10878.

33. Gupta G., Azam M., Yang L., Danziger R.S. The beta2 subunit inhibits stimulation of the alpha 1 /beta 1 form of soluble guanylyl cyclase by nitric oxide. Potential relevance to regulation of blood pressure.// J.Clin.Invest. 1997. V. 100. P. 488-492.

34. Mayer B., Koesling D. cGMP signalling beyond nitric oxide.// Trends Pharmacol. Sci. 2001. V. 22. P. 546-548.

35. Lyer L.M., Anantharaman V., Aravind L. Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclase and bacterial signaling proteins.// BMS Genomics. 2003. 4,5.

36. Nioche P., Berka V., Vipond J., Mintin N., Tsai A.L., Raman C.S. Fentomolar sensitivity of a NO sensor from Clostridium butulinum.// Science. 2003. V. 306. P. 1550-1553.

37. Buechler W.A., Nacane M., Murad F. Expression of soluble guanylate cyclase activity requires both enzyme subunits.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 174. P. 351-357.

38. Wedel B., Harteneck C., Foerster J., Friede A., Shultz G., Koesling D. Functional domains of soluble guanylyl cyclase.// J. Biol. Chem. 1995. Y. 270. P. 24871-24875.

39. Foerster J.,Harteneck C., Malkewitz J., Shultz G., Koesling D. A functional heme-binding site of soluble guanylyl cyclase requires intact N-terminal of alpha 1 and beta 1 subunits.// Eur.J.Biochemistry. 1996. V. 240. P. 380-386.

40. Koglin M., Behrends S. A functional domain of the alpha 1 subunit of soluble guanylyl cyclase is necessary for activation of the enzyme by nitric oxide, YC-1 but is not involved in heme binding.// J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 12590-12597.

41. Pellicena P.,Karow D.S., Boon E.M., Marietta M. Cristal structure of an oxygen-binding heme domain related to soluble guanylate cyclases.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 12854-12859.

42. Sohmidt R.M., Schramm M., Sohroder Н., Wunder F., Stasch J.P. Identification of residues crucially involved in the binding of the heme moiety of soluble guanylate cyclase.// J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 3025-3032.

43. Wedel В., Humbert P., Harteneck C., Foerster J., Malkewitz J., Böhme E., Shultz G. Mutation of His-105 in the beta 1 subunit yields a nitric oxide insensitive form of soluble guanylyl cyclase.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. V. 91. P. 2592-2596.

44. Friede A., Wedel В., Harteneck С., Foerster J., Shultz G., Koesling D. Functions of conserved cysteines of soluble guanylyl cyclase.// Biochemistry. 1997. V. 36. P. 1194-1198.

45. Tesmer J. J., Sunahara R.K., Gilman A., Sprang S.R. Crystal structure of the catalytic domains of adenylyl cyclase in a complex with Gsalpha.GTPgammaS.// Science. 1997. V. 278. P. 1907-1916.

46. Liu Y., Ruoho A.E., Rao V.D., Harley J.H. Catalytic mechanism of the adenylyl and guanylyl cyclases: modeling and mutational analisis.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. P. 13414-13419.

47. Sunahara R.K., Beuve A., Tesmer J. J., Sprang S.R., Garbers D.L., Gilman A.G. Exchange of substrate and ingibitor specifities between adenylyl and guanylyl cyclases.// J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 16332-16338.

48. Waldman S.A., Murad F. Cyclic GMP synthesis and function.// Pharmacol. Rev. 1987 V. 39. P. 163-196.

49. Мирошниченко В.П., Бусыгина О.Г., Северина И.С. Аналогия и различие растворимых форм гуанилатциклазы сердца и тромбоцитов крови крысы.// Вопр. мед. химии. 1989. №4. С. 60-66.

50. Palmer R.M.J., Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium derived relaxing factor.//Nature. 1987. V. 327. P. 5524-5526.

51. Sase K., Mishel T. Caveolin versus calmodylin. Caunterbalancing allosteric modulators of endothelial nitric oxides synthase.// J. Biol. Chem. 1997 V. 272. P. 25907-25912.

52. Bellamy T.C.,Griffits C., Garthwaite J. Differential sensitivity of guanylyl cyclaseand mitochondrial respiration to nitric oxide measured using clamped concentration.// J. Biol. Chem. 2002. V. 777. P. 31801-31807.

53. Zhang H., Lu M., Zhang Y., Li Z. Primary response of the sGC heme binding domain to the cleavage of the Fe-His bond.// Bioinformation. 2008. V. 2. P. 296-300.

54. Capece L., Estrin D.A., Marti M.A. Dynamical characterization of the heme oxygen binding (HNOX) domain. Insight into soluble guanylate cyclase allosteric transition.// Biochemistry. 2008. Y. 47. P. 9416-9427.

55. Goodrich L.E., Paulat F., Praneeth V.K., Lehnert N. Electronic structure of heme-nitrosyls and significance for nitric oxide reactivity, sensing, transportand toxicity in biological systems.// Inorg. Chem. 2010. V. 49 (14). P. 6293-6316.

56. Ignarro L.J. Haem dependent activation of cytosolic guanylate cyclase by nitric oxide: a widespread signal transduction mechanism.// Bioch. Society Transactions. 1993. V. 20. P. 465469.

57. Ignarro L.J., Adams J.B., Horwitz P.M., Wood K.S. Activation of soluble guanylate cyclase by NO-heme proteins involves NO-heme change comparison of heme-containing and heme-deficient enzyme.// J. Biol. Chem. 1995. V. 261. P. 4997-5002.

58. Ignarro L.J., Napoli C., Loscalso J. Nitric oxide donors and cardiovascular agent modulating the bioactivity of nitric oxide.// Circ. Res. 2002. V. 90. P. 21-28.

59. Mason R.P., Cockcroft J.R. Fargeting nitric oxide with drug therapy.// J. Clin. Hypertens (Greenwich). 2006. (12Suppl 4). P. 40-52.

60. Gerzer R., Karrenbrock В., Siess W., Heim J.M. Direct comparison of the effect of SNP, Sin-1 and various nitrates on platelet aggregation and sGC activity.// Tromb. Res. 1988. V. 9(4). P. 341-353.

61. Zhou Q., Hellermann G.R., Solomonson L.P. Nitric oxide release from resting human platelets.// Tromb. Res. 1995. V. 77. P. 87-96.

62. Waldman R., Walter U. Cyclic nucleotides elevating vasodilators inhibit platelet aggregation at an early step of the activation cascade.// Eur. J. Pharmacol. 1989. V. 159(3) P. 317-321.

63. Born G.V. Adenosine diphosphate as a mediator of platelet aggregation in vivo; an editorial view.// Curculation. 1985. V. 72(4). P. 741-746.

64. Чирков Ю.Ю., Белушкина H.H., Тыщук И.А., Северина И.С. Роль гуанилатциклазы в регуляции агрегации тромбоцитов.// Вестник АМН СССР. 1991. №10. С. 51-54.

65. Severina I.S., Belushkina N.N. Increase in activating ability of human platelet guanylate cyclase during aggregation.// Biochem. Internat. 1992. V. 28(4). P. 621-631.

66. Чирков Ю.Ю., Белушкина H.H., Тыщук И.А., Северина И.С. Изменение гуанилатциклазной активности тромбоцитов человека при АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.// Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1991. Т. Ill (2).С. 152-154.

67. Chirkov Yu.Yu., Belushkina N.N., Severina I.S. Increase in reactivity of human platelet guanylate cyclase during aggregation potentiates the disaggregation capacity of sodium nitroprusside.//Clinic. Exptl. Pharmacol. Physiol. 1991. V. 18. P. 517-524.

68. Chirkov Yu.Yu., Tyshchuk I.A., Severina I.S. Guanylate cyclase in human platelets with different aggregability.// Experrientia. 1990. V. 46. P. 697-699.

69. Чирков Ю.Ю., Тыщук И.А., Северина И.С., Старосельцева JT.K. Гуанилатциклаза тромбоцитов человека при сахарном диабете.// Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1989. №3. С. 300302.

70. Kitagawa S., Kotani К., Kametani F. Inhibitory mechanism of cis-polyunsaturated fatty acids on platelet aggregation and membrane fluidity.// Biochem. Biophys. Acta.1990. V. 1054. P. 114-118.

71. Severina I.S. Soluble guanylate cyclase of platelets: function and regulation in normal and pathological states.// Edv. Enzyme Reg. 1992. V. 32 P. 35-56.

72. Severina I.S., Belushkina N.N., Grigoryev N.B. Inhibition of ADP-induced human platelet aggregation by a new class of soluble guanylate cyclase activators capable of nitric oxide generation.// Biochem. Molec. Biol. Internat. 1994. V. 33. P. 957-967.

73. Белушкина H.H., Григорьев Н.Б., Северина И.С. Ингибирование агрегации тромбоцитов человека новым классом активаторов гуанилатциклазы, генерирующих оксид азота.//Биохимия. 1994. Т. 59. С. 1689-1699.

74. Северина И.С. Тромбоцитарная гуанилатциклаза: роль гема в регуляции ферментативной активности и роль фермента в агрегации тромбоцитов.// Биохимия. 1994. Т. 59(3). С. 325-337.

75. Severina I.S., Bussygina O.G., Belushkina N.N., Grigoryev N.B. Guanidine thiol a new activator of soluble guanylate cyclase with antihypertensive and antiaggregatory properties.// Biochem. Molec. Biol. Internat. 1995. V. 36(4). P. 913-925.

76. Северина И.С. Растворимые формы гуанилатциклазы, механизм активации оксидом азота. Роль в агрегации тромбоцитов.// Вестник Российской Акад. Мед. Наук. 1995. №2. С. 41-46.

77. Белушкина Н.Н., Северина И.С. Ингибирование АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека гуанидинотиолами новым классом активаторов гуанилатциклазы и субстратов NO-синтазы.// Биохимия. 1996. Т. 61. С. 12-16.

78. Chirkov Yu.Yu., Horowitz J.D. Impaired tissue responsiveness to organic nitrates and nitric oxide: a new therapeutic frontier.// Pharmacol. Ther. 2007. V. 116 (2). P. 287-305.

79. Chirkov Yu.Yu. Platelet hyperaggregability: impaired responsiveness to nitric oxide ("platelet NO resistance") as a therapeutic target. // Cardiovasc.Drug Ther. 2008 -22, 193-203.

80. Mergia E., Koesling D., Friebe A. Genetic mouse models of the NO-receptor soluble guanylyl cyclases.// Handb. Exp. Pharmacol. 2009. V. 191. P. 33-46.

81. Dangel O., Mergia E., Karlisch K., Groneberg D., Koesling D., Friebe A. Nitric oxide -sensitive guanylyl cyclase is the only nitric oxide receptor mediating platelet inhibition.// J. Tromb. Haemost. 2010. V. 8(6). P. 1343-1352.

82. Bradford H.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.// Analytical Biochemistry. 1976. V. 72. P. 248-254.

83. Garbers D.L., Murad F. Guanylate cyclase assay: methods. // Adv. Cycl. Nucleotide Res. 1979. V. 10. P. 57-67.

84. Чирков Ю.Ю., Тыщук И.А., Белушкина H.H., Северина И.С. Гуанилатциклаза тромбоцитов крови человека.// Биохимия. 1987. Т. 52. С. 956-963.

85. Bayer J.H. The C-nitro derivatives of five-membered N-and N,0 heterocycles.// VCH Nitroazoles. 1986. V. 1. P. 368.

86. Левина В.И., Григорьев Д.А., Григорьев Н.Б. Использование реакции образования нитропруссид-иона для непрямого полярографического детектирования соединений, генерирующих окись азота.// Хим. Фарм. Журн. 1995. № 8. С. 56-59.

87. Koikov L.N., Alekseeva V.V., Lisitza E.A., Krichevsky E.S.,Grigoryev N.B.,Danilov A.V., Severina I.S., Pyatakova N.V., Granik V.G. Amidoximes and hidroxamic acids as nitric oxides donors.// Mendeleev Commn. 1998. P. 165-168.

88. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств.// М. «Вузовская книга» 2004. С. 58-196.

89. Курбанов И.С., Мордвинцев П.И., Алиев Д.И., Ванин А.Ф. Влияние тиоловых соединений железа на продукцию окиси азота из нитропруссида и нитроглицерина// Вопр.Мед.химии. 1989. Т. 35(6). С. 87-91.

90. Garthwaite J., Southam E., Boulton C.L., Nielsen E.B., Schmidt K., and Mayer B. Potent and selective inhibition of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase by l-H-l,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-l-one.//Mol.Pharmacol. 1995. V. 48. P. 184-188.

91. Граник В.Г., Рябова С.Ю., Григорьев Н.Б. Экзогенные доноры N0 и ингибиторы его образования.// Успехи химии. 1997. Т.66(8). С. 792-807.

92. Ferioli R., Folko С.С., Ferriti A., Gasco A.M., Medana С., Fruttero R., Cerelli M., Gasko A. A new class of furoxan derivatives as NO-donors: mechanism of action and biological activity.// Br. J. Pharmacol. 1995. V. 114. P. 816-820.

93. Cerecetto H., Porcal W. Pharmacological properties of furoxans and bensofuroxans: recent development.//Mini Rev. Med. Chem. 2005. V. 5(1). P. 57-71.

94. Hecker M., Vorhoff W., Вага A.T., Mordvintceb P.I., Busse R. Characterization of furoxans as a new class of tolerance-resistent nitrovasodilators.// Naynyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1995. V. 351(4). P. 426-432.

95. Овчинников H.B., Хропов Ю.В., Бусыгина О.Г., Коц А.Я., Украинцев К.Э., Махова Н.Н., Буларгина Т.В., Северина И.С. Патент РФ №2123046. 1998.

96. Kamisaki Y., Waldman S.A., Murad F. The involvement of catalytic site tiol group in the activation of soluble guanylate cyclase by sodium nitroprusside.// Arch. Biochem. Biophys. 1986. V. 251. P. 709-714.

97. Reddy D.,Reddy N.S., Chandrashekar Т.К., van Willigen N. Oxidation of cobalt (II) tetrapyrroles in the presence of an electron acceptor.// Chem. Soc. Dalton Trans. 1991. P. 20972101.

98. Boldyrev A.A., Severin S.E. The fristidine-containingdipeptides,carnosine and anserine: distribution, properties and biological significance.// Advances in enzyme regulation. 1990. V. 30. P. 175-193.

99. Boldyrev A.A. Does carnosine possess direct antioxidant activity.// Int.J. Biochem. 1993. V. 25. P. 1101-1107.

100. Болдырев А.А. Антиоксидантное действие карнозина в экспериментах in vivo.// В Кн. Карнозин. Биологоическое значение и возможности применения в медицине. Из-во МГУ. 1998. С. 252-269.

101. Северина И.С. Гуанилатциклаза функции в норме и при патологии.// Вестник академии мед. наук. 1987. №7. С. 41-47.

102. Severina I.S., Bussygina O.G. Pole of heme in the regulation of human and rat plateletsoluble guanylate cyclase.// Biochem. Internat. 1991. V. 8. P. 1143-1154.

103. Tsai S., Adamik R.A.,Manganiello V., Vaughan M. Regulation of activity of purifiedguanylate cyclase from liver that is unresponsive to nitric oxide. // Biochem.J. 1985. V. 215. P.447.455.

104. Бусыгина О.Г., Северина И.С. Гемдефицитная растворимая гуанилатциклаза тромбоцитов крысы.//Биохимия. 1991. Т. 56. С. 487-493.

105. Северина И.С., Бусыгина О.Г., Пятакова Н.В. Карнозин как регулятор растворимой гуанилатциклазы.// Биохимия. 2000. Т. 65. С. 921-927.

106. Kharitonov S.A., Yates D.H., Robbins R.A., Logan-Sinclar R., Sinebourne E., Barnes P.J. Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients.// Lancet. 1994. V. 343. P. 133135.

107. Nowak D., Antczak A., Krol M., Bialasiewicz P., Pietras T. Antioxidant properties of ambroxol.// Free Radical Biol. Med. 1994. V. 16. P. 517-522.

108. Dondorp A.M., Planche T., De Bel E.E., Angus B.J., Chotivanich K.T., Silamut K., Romijn J.A. Nitric oxides in plasma, urine and cerebrospinal fluid in patients with severe falciparum malaria.// Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998. V. 59. P. 497-502.

109. Sinden R.E. Nitric oxide synthase activity in malaria-infected mice.// Parasite Immunol. 1996. V. 18. P. 535-538.

110. Jacobs P., Radzioch D., Stevenson M.M. Nitric oxide expression in the spleen, but not in the liver, correlates with resistance to blood-stage malaria in mice.// J. Immunol. 1995. V. 155. P. 5306-5313.

111. Goldberg D., Slater A.F., Cerami A., Henderson G.B. Hemoglobin degredation in the malaria parasite Plasmodium falciparum: an ordered process in a unique organelle.// Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. V. 87. P. 2931-2935.

112. Robert A., Meunier B. Characterization of the first covalent adduct between artemisinin and heme model.// J. Am. Chem. 1997. V. 119. P. 5968-5969.

113. Ignatushchenko M.V., Winter R.W., Bachinger H.P., Hinrichs D.J., Riscol M.K. Xanthenes as antimalarial agents; studies of a possible mode of action.// FEBS Lett. 1997. V. 409. P. 67-73.

114. Gruetter C.A., Kadovitz P.J., Ignarro L.J. Methylene blue inhibits coronary arterial relaxation and guanylate cyclase activation by nitroglycerine, sodium nitrite and amyl nitrite.// Can. J. Physiol. Pharmacol. 1981. V. 59. P. 150-156.

115. Jefford C.W., Vicente M.G.H., Jacquier V.,Favarger F., Mareda J. The deoxygenation and isomerization of artemisinin and artemether and their relevance to antimalarial action.// Helv. Chim. Acta. 1996. V. 79. P. 1475-1487.

116. Cumming J.N., Ployradith P., Posner G.H. Antimalarial activity of artemisinin (qinghaosu) and related trioxanes: mechanism(s) of action.// Adv. Pharmacol. 1997. V. 37. P. 293-297.

117. Charoenpan P., Indrapasit S., Kiatboonsri S., Suvachitanant O., Tanomsup S. Pulmonary edema in severe falciparum malaria. Hemodynamic study and clinicophysiologic correlation.// Chest. 1990. V. 97. P. 1190-1197.

118. Bruneel F., Gachot B., Timist J.F., Wollf M., Bedos J.P., Regnier B.,Vacon F. Shock complicating severe falciparum malaria in European adults.// Intemsive Care Med. 1997. V. 23. P. 698-701.

119. Ряпосова И.К. Григорьев Н.Б. Северина И.С. Новый класс активаторов пастворимой гуанилатциклазы генерирующих оксид азота.// Биохимия. 1994. Т. 59(4). С. 537-542.

120. Severina I.S., Bussygina O.G., Vinograd, L.H., Grigoryev N.B. Mechanism of activation of soluble guanylate cyclase by guanidine thiols a new class of enzyme activators.// Biochem.Mol. Biol.Internat. 1996. V. 58. P. 501-511.

121. Koukov L.N., Alexeeva, N.V., Grigoryev, N.B.,. Levina V.I., Turchin, K.F., Filipenko, T.Ya., Severina, I.S., Ryaposova, I.K., Granik, V.G. Oximed of qinuclidine-3-oned as nitric oxide donors.// Mendeleev Commun. 1996. V. 3. P. 94-96.

122. Scatena R., Bottoni P., Martorana G.E., Giardina B. Nitric oxide donor drugs: an update on pathophysiology and therapeutic potential.// Expert.Opin.investing.Drug. 2005. V. 14(7). P. 835-846.

123. Munzel T. Recent findungs on nitrates: their action, bioactivation and development of tolerana.// Dtsch.Med.Wochenschr. 2008. V. 133(44). P. 2277-2282.

124. Hoenicka M., Schmid C. Cardiovasculareffects of modulators of soluble guanytyl cyclaseactivity cardiovasce. Hematol. Agents.// Med.Chem. 2008. V. 6(4). P. 287-301.

125. Van Bortel L.M., Tici F., Mascagni F. Efficacy and tolerability of nebivolol comparedwith other antihypertensive drugs: a meta-analysis.// Am.J.Cardiovasc.Drugs. 2008. V. 8(1). P.35.44.

126. Scatena R., Battoni P., Pontoglio A., Giardina B. Pharmacological modulation of nitric oxide release: new pharmacological perspectives, potential benafits and risks.// Curr.Med.Chem. 2010. V. 17(1). P. 61-63.

127. Turnbull C.M., Cena C., Truterro R., Gasco A., Rossi A.G., Megson I.L. Mechanism of action of novel NO-releasing furoxan derivatives of aspirin in human platelets.// Br.J.Pharmacol. 2006. V. 148(4). P. 517-526.

Информация о работе

Пятакова, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы