Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Растворимая гуанилатциклаза тромбоцитов. Роль гема в функционировании фермента

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Растворимая гуанилатциклаза тромбоцитов. Роль гема в функционировании фермента"

г а

. Г"'.'-«

.„ -РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦШСЮЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.152.344 . 577.13

БУСЫГИНА ОЛЬГА ГЕОРГИЕВНА

РАСТВОРИМАЯ ГУАНИМТЦИШЗА ТРОМБОЦИТОВ. РОЛЬ ГЕМА В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ФЕРМЕНТА.

03.00.04-Биологическая химия

Автореферат диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических н*ух

Москва 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биомедицинской химии Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Северина И.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Нагр-дова Н.К. доктор биологических наук, профессор Петрович Ю.А.

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится " 1994г. на

заседании специализированного Ученого совета Д 001.10.01 Научно-исследовательского института биомедицинской химии Российской академии медицинских наук по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского иаститута биомедицинской химии РАМН.

Автореферат разослан 1593г.

Ученый секретарь специализированного совета

:кандидат биологических наук Ларионова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время известно, что лечебный эффект наиболее распространенных нитровазодилятатороз -таких как нитроглицерин, натросорбид, нктронг, нмтропруссид нат~-рия и др. - связан со стимуляцией растворимой гуанилатциклазы (ГЦ ), катализирующей биосинтез циклического 3',5'- гуанозинмонофосфата С цШФ ) и накоплением этого мощного регулятора функциональной активности клетки. Активирующее влияние перечисленных лекарственных препаратов обусловлено взаимодействием свободнорадикальной ■ группы N0 этих соединений с железом гема, йвлявдегося простети-ческол группой ГЦ. Образующийся комплекс-нитрозилгем-представляет. собой истинный активатор фермента. Этот молекулярный механизм терапевтического действия приобрел особое значение после установления Копсаба . в 1987 году эндогенной природы оксида азота. Было показано,что эндотелиальный фактор релаксация,. синтезируемый клетками'сосудистого эндотелия и участвующий в расширении сосудов, представляет собой оксид азота. Оксид азота образуется из L -аргинина при-участии L- аргинин-N0 -синтазы. Этот фермент оказался широко распространенным,. Эндогенное образование N0 из L-.аргинина показано, в разных органах, и ' тканях. Обнаружена важная роль оксида азота- в. процессах: цитотокскчноати, в осуществлении межклеточных ' коммуникаций в.нервной: системе, в поддержании сосудистого тонуса. -Эндогенный но является мощным фактором: гемостаза.11В настоящее время оксид азота рассматривается: как, эндогенный вазодилятатор. Его антигипертензивнне- и антиагрегационные свойства непосредственно связаны- с- прямой стимуляцией растворимой ГЦ по гемзависимому механизму и: накоплением цГШ>. ., - ..

Тагам образом, 'гему ГЦ принадлежит важная: роль в. механизме сосудорасширяющего действия но- содержащих соединений. Известно, что гем. лабильно связан .с- белковое молекулой" ГЦ и может- отщепляться при повигеяии рН, хранении,, некоторых способах очистки и т.д. Прочность связи гема с ферментом зависит от источника фермента. • Данных о возможности существования, растворимой.ГЦ изначально в геи-дефицитной форме в тканях в литер'туре нет. В то ке время очевидно, что гемдефицитность будет приводить к царупешго эндогенно!': регуля-. цш ГЦ, процессов поддержания тонуса сосудистой стенки и регуляции просвета сосудов, нарушению процессов агрегации тромбоцитов, сниже-

нию эффективности действия сосудорасширяющих и антиагрегационных препаратов. В связи с этим изучение роли гема в функционировании ГЦ является актуальным не только в теоретическом плане, но и для решения задач практической медицины.

Цели и задачи исследования.

Объектом исследования била выбрана ГЦ тромбоцитов человека, так как этот фермент на 95-98$ находится в растворимой форме, обладает высокой активностью, содержит гем г потому высоко чувствителен к действию но- содержащих соединений, и в том числе нитро-пруссида натрия. Ранее наш было показано, что ГЦ тромбоцитов крысы не активируется нитропруссидом,. что, в отличие от общепринятых представлений, могло указывать на возможную гевдефицитность этого фермента. В литературе мы не обнаружили сведений о растворимой ГЦ тромбоцитов крысы. Все это обусловило наш интерес к ферменту из этого источника. Целью настоящей работы явилось изучение ро.л гема в функционировании растворимой ГЦ тромбоцитов человека и крысы, в проявлении гипотензивных свойств N0- содержащими соединениями на примере нитрозокомплексов переходных металлов,, а тайке изучение образования оксида азота в тромбоцитах челоз.ка с целью разработки новых подходов к поиску эффективных антигипертензивных ."екарствев-ных препаратов ка основе изучения растворимой ГЦ.

В связи с этим-необходимо было рег'-гть следующие задачи:

1. Получить в гевдефицитной форме растворимую ГЦ тромбоцитов человека и красы и провести сравнительное исследование свойств этих ферментов до и после удаления гема.

2. Исследовать влияние водорастворимого антиокс.;данта р-аланин-Ь-гистидина (карнозина) н°. активность и активацию нитропрусспом натрия ГЦ тромбоцитов человека.

3. На примере нитрзокомлексов переходных металлов Ро, со, сг изучить связь мевду механизмом активации ГЦ тромбоцитов' человека

и крысы этими соединениями и их способностью проявлять гипотензивные свойства.

4. Выявить возможность эндогенного образования оксида азота в тром боцитах человека и применить полученные данные для.разработки новых подходов к созданию эффективных сосудорасширяющих лекарственных средств на основе изучения растворимой ГЦ и КО -сичтазы, используя соединения, содержащие в своей молекуле одповременно гуанг дииовые и тиоловне группы.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые описаны некоторые основные свойства растворимой ГЦ тромбоцитов крысы и сделан вывод, что гем не является, в отличие от общепринятых представлений, простетической группой этого фермента. В связи с этим ГЦ из этого источника не может служить моделью для изучения действия но-содержащих соединений на тромбоцитарный фермент.

Впервые показано, что растворимая ГЦ тромбоцитов человека такие может существовать изначально в гемдефицитной форме, что мо- • нет привести к нарушению гемостаза, обусловить недостаточную эффективность действия антиаг'регационных препаратов и потребовать разработки новой стратегии в применении лекарственных средств в подобных случаях.

Установлено, что водорастворимый антиоксвдант _р-аланин -I гистидин (карнгзин) тормозит только специфическую гемзависимую активацию ГЦ нитропруссидом натрия и может быть использован з качестве теста на гевдефицитность фермента и для выявления гемзави-симого характера активации ГЦ.

На примере изучения механизма активации ГЦ нитрозокомплексаш переходных металлов ре, Со и Сг установлено, что для проявления гипотензивных свойств необходима активация только по гемзави-симому механизму.

Впервые показана активация ГЦ тромбоцитов человека соединениями, содержащими в молекуле одновременно гуаншшновые и тиоловые группы за счет образования внутримолекулярных нитрозотиолов.

Полученные данные позволяют предложить новый подход к разработке и созданию эффективных вазодилятаторов на основе изучена! гуанилатциклазной и И0-синтазной систем. Можно'ожидать, что при этом-не будет развиваться толерантность, возникающая при применении органических нитратов и связанная с истощением эндсге ных тио-лов-

Апробация работы состоялась на совместной научной конференции таборатории экстремальных' состояний и лаборатории биохимии и патохи-таи гуанилатциклазной системы 18 мая 19£3г.

Основные положения диссертации, докладывались на VI Всесоюзном Симпозиуме "Роль циклических нуклсотидов-и вторичных посредников в зегуляции ферментативных реакций" (3-7 октября 1988г.), Петрозаводск.

По теме диссертации опубликовано II печатных работ.

Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, включая 15 рисунков и 17 таблиц. Состоит из введения и разделов: "Обзор литературы" ( главы "Свойства растворимой и мембранно-связанной форм гуанилатциклазы", "Оксид азота: биосинтез и биологическая роль" и "Биологическая роль циклического гуанозинмон »фосфата",), "Материалы и методы исследований", "Результаты исследований", "Обсуждение", "Выводы" и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили тромбоциты крови человека и крысы. Донорскую кровь получали в Гематологическом научном центре.

Выделение тромбоцитов из кропи человека и крысы. Тромбоциты человека выделяли из крови здоровых доноров в соответствии с описанной методикой (Чирков'и др., 1987), используя в качестве антикоагулянта 0,Ш раствор ЭаТА в О,Э°/. НаС1, (рН 7,4 при 20°С ). Для получения тромбоцитов высокой степени чистоты из обогащенной плазмы применяли Р1со11-Ра^ие. Полученный промытый осадок тромбоцитов ресуспендировали в 50мМ трис-не 1, рН 7,6 при 0°С, содержавшем 0,2 мМ дитиотрейтол (ДТТ).

0 Выделение тромбоцитов из крови крысы проводили аналогично выделению тромбоцитов человека, согласно методике ( Мирошниченко и др.,1988) с некоторыми модификациями: а/ в качестве антикоагулянта использовали 0,2М ЭДТА в 0,95? НаС1,' ( рН 7,4 при 20°С ); б/ для получения богатой тромбоцитами плазмы гэльную кровь разводили 20мМ трис- НС1 буфером в 0,9% НоС1( рН 7,4 при 20°С ) в равном соотношении е.,буфером. Осадок промгтых тромбоцитов ресуспендировали в 20мМ трис-не 1 буфере, ( рН 7,6 при 0°С ), содержащем или не содержащем ДТТ в зависимости от задач эксперимента.

Тромбоциты разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе ызЕ 5-78 ( Великобритания) в течение 20 сек. при амплитуде 16мкм на холоду и центрифугировали в течение I часа при 105000 в на ультрацентрифуге Веоктап 1/5-65( Австрия). Супернатант использовали в качестве препарата растворимой ГЦ.

Определение активности ГЦ тромбоцитов человека и крысы. Определение активности ГЦ проводили в соответствии с описанной методикой (Чирков Ю.Ю. и др., 1987). В состав реакционной смеси объемом 150мкл входили: 50м!" трис-НС1 ( рН 7,6 при 37°С ), 1мМ ГТФ,

4мМ MnClg либо Mgci2 , 4мМ креатинфосфат, 20мкг (120-160 ад) креатинфосфокиназа, ЮмМ теофиллин, супернатант 105000g или злюат после ионно-обменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в количестве 10-20 мкг или 2-2,5. мкг по белку, соответственно, и необходимые добавки. Инкубацию проводили в течение 10-20 мин. в зависимости от задач эксперимента. Реакцию останавливали нагреванием проб в течение 2 мин. при 90°С с последующим,охлаждением во льду. Денатурированный белок отделяли центрифугированием при 1500g в течение 15 мин. В полученном осадке определяли содержание образовавшегося цГМФ. Количество цГМФ в пробах определяли радиоимунным методом при помощи набора реактивов сСМР RIA'Kit ("Aneraham", Великобритания) по прилагаемой методике. Радиоактивность определяли на счетчике Rack-beta I2XI (1KB, Швеция ).

Ионно-обменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 52.

Йоняо-обменнуга'хроматографию супернатанта 105000g проводили на колонке с ДЭАЭ-целлю'лозой 52 («Whatman1« Великобритания). Колонку уравновешивали 50мМ трис-'HCl буфером, ( рН 7,6 при 4°С), содержащим 0, 2мМ ДТТ. Супернатант 105000s в количестве 2-4 мкг белка в объеме 1-2 мл наносили на колонку, Элюцию проводили тем ае бу-.фером, содержащим градиент ЯаС1 0Т0,5 M или ступенчато, 0,22 M N801. Наличие белка во фракциях регистрировали с помощью'измерения поглощения при 280 нм ( одно лучевой датчик от-1;'РЬагтас1а';Швеция '). Фракции, содержавшие гуанилатциклазную активность, объединяли и использовали для дальнейших исследований.

■Другие методы. .

Содержание белка' определяла по методу Лоури. ( Лоури et al ,1955). Спектры поглощения исследовали на спектрофотометре DU-50(BBeckman" Австрия ). '

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЯДЕНИЕ

Влияние диткотрейтола па гуанилатциклазу тромбоцитов кркс.ы.

Известно, что растворимая ГЦ содержит SB- группы, при окисле- • нии которых фермент обычно авизируется. Добавление восстановителя ДТТ. снимает активации и возвращает величину базальной активное?*: к исходному уровню. Для ГЦ тромбоцитов человека показано, что присутствие ДТТ в среде оззучппакия предотвращает спснтг>"ную самоактп-вацию фзрмента,, но не влияет tífi величину базальной активности ( Чир-

ков Ю.Ю. и др., 1987 ). Результаты, полученные для ГЦ тромбоцитов крысы, принципиально отличаются от данных для тромбоцитов человека ( см. Рис. I ).

а оо

400 ! у»1Ь

900, ! \1а

200,

100,

•9 М О

0,02 0,2 2 20 . концентрация ДТТ( мМ)

Рис. I. Сопоставление влияния жтиотрейтола на активность ГЦ тромбоцитов крысы /I/ и тромбоцитов человека /2/

Состав проб и условия инкубации описаны в Методах. Препарат

ГЦ преинхубирсвали с ДТТ в течение 45 мин, при О С до добавления субстрата. ,

За 100% принята банальная активность в присутствии 1% .

Озвучиьание суспензии тромбоцитов: а/ - в присутствии 0,2 кй

■бУ- без ДТТ

Следует отметить, что при озвучивании тромбоцитов в присутствии 0,2 мМ ДТТ в инкубационной пробе создается концентрация последнего порядка 0,01 мМ. Из рис.1 видно, что при дополнительном'внесении ДТТ в пробу активность ГЦ тромбоцитов крысы увеличивается, достигая максимум - 450% - при 2 мМ ДТТ, тогда как активность ГЦ тромбоцитов человека снижается, достигая 80% при 2 Л ДТТ. (Рис.1, кривые 1а и 2а ). Степень активации ГЦ тромбоцитов крысы ДТТ не зависит от'присутствия последнего при озЕучивании (кривые 1а и 16 ). Выявленные различия в действии ДТТ указывают на большую степень окисленности ГЦ из тромбоцитов крысы.

Таким образом, степень окисленности и величина базальной активности ГЦ тромбоцитов крысы в значительной мере определяются кон-

- 9 -

центрацией ДТТ в среде озвучивания.

Влияние нитропруссида натрия на ГЦ тромбоцитов крысы. В отличие от ГЦ тромбоцитов человека, нитропруссид натрия ( 0,1-М ) не стимулировал фермент из тромбоцитов крысы ( см.Табл.1 ).

Таблица I. Влияние нитропруссида натрия на активность ГЦ тромбоцитов крысы супернатанта 105000 в на фоке дитиотреитола ( ДТТ ) и гемоглобина

Активность ГЦ с % , пмоль цГТ® в. минуту, на I мг белка

в присутствии:

Назальная нитропрус- ДТТ нитропрус- нитропрус- > гемоглобина

сида 0,2 мМ сида сида

0,1 мМ ОД мМ 0,1 мМ

ДТТ ДТТ

0,2 кМ 0,2 гяМ

гемогло-

бина

• 3 мкг 3 мкг 9 мкг

23,7+3,3 22,0+4,4 62,3+7,4 54,4+7,3 52,9+6,8 21,3+5,0 29+2

( ) ( 9 358) ■ (262^) ( 230$ ) ( 2231) ( 30?! ) ( 95% >

Состав проб и условия инкубации см. Методы. Препарат ГЦ преинкубп-ровали с*гемоглобином в течениеп5 млн. -при О С, с ДТТ и нитропруссидом - в течение 45 мяк. пш О С до добавления субстрата. При одновременном присутствии в пробе перечисленных соединений нптропруссвд вносили сразу после внесения гемоглобина и ДТТ.

На основании получениях данных было предположено, что ГЦ тромбоцитов крысы существует у этих метках изначально п гецдофицитной форме.

Для более детального выяснения этого предположения била попользована кокио-обменная хроматография на ДЭЛЭ-целлюлозе 52.

Иоино-обменпая хроглатограЗая .ГЦ супернатанта 105000 я тромбоцитов человека и красы ка ДЭАЭ-целявлоте 52.

Согласно литературном даншггл, яокво-обменная хк.лтгогдоФйл является одним аз способов очистка растворимой ГЦ, при кагором происходит удаление гека. Накн бшш псследояанн свойства растворимой ГЦ супернатанта 105000 етромбоцитов человека й крысы и ак-тпацил

фермента нитропруссидом натрия до и после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе 52. Профили элюции обоих супернатантов 105000 & представлены на Рис. 2.

УЯ

Б ШК

и

Рис..2. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе супернатантов 105000 g тромбоцитов человека ( А ) и тромбоцитов крысы ( В) с использованием ступенчатой элюции (У,22. М НаС 1

Элюиртащий буфер-50 м.4 трис-нс1 ( рН 7,6 при 0°С ), содержащий 0,2 мМ ДТТ. По оси абсцисс: номера фракций. По оси ординат: про-

Й!лъ белка в мкг/мл.-^ сплошная линия; удельная активность ( УА ) I в присутствии % — пунктирная линия.

Из рис.2 видно, что профили'элюции обоих супернатантов одинаковы и представляют собой два белковых пика - 1-й, содержавший 5-10$ белка - и П-й,содержавший 20-25$ белка от общего количества, нанесенного. на колонку. Практически вся гуанилатциклазная активность •оказалась сосредоточенной во П-м пике (градиентНаС1 0,18-0,22 М)• В случае тромбоцитов человека повышение удельной активности ГЦ И пика в присутствии достигало6-10 раз, что соответствовало литературным данным, и превышало увеличение активности в'присутствии мп+2 в 2-2,5 раза. При этом общая активность, элюируема^ с колонки, составила в присутствии Же 170+14$, тогда как с Мп - не более 100$ от всей, нанесенной на колонку и принятой за 100$. В про- цессе хроматографии активация ГЦ 0,1 мМ нитропруссидом упала с 2^,4+2,0 раз в супернатанте 105000е до 3,6+0,3 раз во П-м пике,что составило 18$ ^ исходной. Рззкое повышение общей активности в присутствии указывало на удаление какого-то эндогенного ин-

гибитора, возможно, содержавшегося в I белковом пике.

В опытах с тромбоцитами крысы повышение удельной активности ГЦ П пика с М8+2 и мп+2 было одинаковым- 5-6 раз-, выход по общей активности в. присутствии обоих катионов металлов не превышал 100%. Активации нитропруссидом не наблюдалось ни до, ни после хроматографии. Действие пика I на препарат ГЦ из П пика также оказалось принципиально различным в опытах с ферментом из тромбоцитов человека и крысы ( см. Табл.2).

Таблица 2. Влияние 1-го белкового пика на активность препарата ГЦ тромбоцитов человека и крысы ■ и активацию фермента нитропруссидом натрия.

Источник фермента Удельная с Mg • активность ( в % ) Степень активации нитропруссидом натрия

Элюат после ДЗАЭ-целлюлозы Супернатант• 105000е Элюат после ДЭАЭ-целлюлозы

-I пик + I пик - 1 пик - I пик + ■ I пик.

Тромбоциты шловека 100 20,4+2,0 3,6+0,3 13,4+2,

Тромбоциты срысы '' 100 97+17 нет активации нет активации

!остав проб и условия инкубации см. Методы. 1репарат ГЦ выдерживали с 1-м пиком при равном соотношении белка : и П-го пиков ( 1,5-2,5 мкг в пробе ) в течение 10 мин. при О С, ¡атем добавляли нитропруссид натрия и преинкубировали 45 мин. при гС до добавления субстрата.

!тепень активации определена относительно принятой за единицу ¡азальной активности.

Добавление к препарату ГЦ .тромбоцитов человека С П пик ) I пика ' ¡питало активность фермента и одновременно восстанавливало нитро-груссидную активацию.до 70% от исходной в супернатапте. Добавление :е 1-го пика к ГЦ. тромбоцитов' крысы ( П пика ) не оказывало ингиби-■срного действия на фермент и не' влияло на отсутствие активации гитропруссвдом. . ,

Полученные данные позволили предполагать, что в процесса ионообменной хроматографии от ГЦ тромбоцитов человека, но па крысы, гроисходит отщепление гегл, в результате чего фермент получается I гемдефицитной форме. ' • .

'Известно, что для гексорвряащяс белков, в тогд числе и для ГЦ, арактереп максимум поглощения в области полосы Соре ( 415-430 мин).

3, птш ■

О ИНН 8 1 8 8 8 8 в 8 =

< 2 В

длина волны ( нм}

Рис. 3, Спектры супернатантов 105000е тромбоцитов человек^ А и тромбоцитов крысы ( В) до и после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

А : I- супернатант 105000е, 0,58 мг белка в пробе;

. 2- I пик, 0,15 мг белка в пробе;

3- П пик, содержащий ГЦ, 0,58 мг белка в пробе.

В : I- супернатант 105000в, 0,45 мг белка в пробе;

2- .1 пик, 0,15 мг белка в пробе;

3- П пик, содержащий ГЦ, 0,28 мг белка в Пробе.

Как видно из рис.3, в опытах с ферментом тромбоцитов человека •максимум поглощения в области полосы Соре, присутствующий в супер-, натанте 105000е, исчезает из элюата после ДЭАЭ- целлюлозы ( пик П) и появляется в.1-м пике ( см. Рио.ЗА ) В аналогичных опытах с тромбоцитами крысы при отсутствии загрязнения супернатанта 105000 к аритроцитарным гемоглобином максимума поглощения в области полосы Соре не обнаружено ни в супернатанте, ни в обоих белковых пиках ( см. Рис.-ЗВ ). •

! Таким образом, спектральные исследования подтверждают предположение об отщеплении гема от ГЦ тромбоцитов человека при ион-нообменной хроматографии, добавление 3 мкг гемоглобина в пробу приводило к снижению активности ГЦ тромбоцитов человека супернатанта 105000 е и пика П на 40$, активация-же нитропруссидом при

этом возрастала, соответственно, в 1,5 и 3,5 раза. То есть, происходило восполнение гемдефицитности. Разная степень усиления активации гемоглобином указывала наг, значительно меньшую степень гевдефи-цитностисупернатанта по сравнению с ферментом П пика.

Оставалось неизвестным, в какой форме-" свободной или связанной с белком- находится отщепившийся от ГЦ тромбоцитов человека гем, обнаруживаемый в 1-м пике. Как видно из рис.3, в 1-м пике не обнаружено максимума поглощения в области 390 нм, характерного для свободного гема, что позволило предположить связанность отщепившегося гема с каким-то белком. На" это указывало также отсутствие различия в действии I пика до и после ультрафильтрации в ячейке аи1-соп ( фильтр 'РМ-Ю ), на ГЦ тромбоцитов человека ,П пика. Активность в обоях случаях падала на 70$, активация нитропруссидом возрастала в 2,1-2,5 раза, достигая 4052 о? исходной в супернатанте 105000в.

Различия, выявленные мепдуГЦ тромбоцитов человека и крысы, и результаты сопоставления влияния 1-х пиков, полученных при ион-но-обменной хроматографии фермента из этих двух источников, на час-тично-очияенную ГЦ тромбоцитов человека ( П пика), привели нас к предположению о присутствии в тромбоцитах человека специфического белкового регулятора ГЦ гемовой природы, отсутствующего в тромбоцитах крысы, однако его природа нуждается в дальнейшем изучении.

Татшл образом, в результате ионно-обмениой хроматографии ГЦ' тромбоцитов человека получается в гемдефиштной форме. Полученные данные указывают также на то, что,в отличие от общепринятых представлений, гем но является простетической группой ГЦ троибоцитоп крысы, и следовательно, не может использоваться в качестве модели для изучения действия на трокбоцитарную ГЦ ио- содержащих соединений, обладающих сосудорасширяющим и антиагрегацконннм де2Эствием.

Нпкявие карнозика на активность растворимой ГЦ и активации фермента нитропруссидом натрия и протопорфиркпогл IX

Растворимая ГЦ кокет активироваться ненасыщенными жирными кислотами, продуктами их.перекисного окисления и свободными ради-' калакл, включая гидрокбцаный. При этом роль антиоксидантов в функционировании ГЦ изучена недостаточно. р-алатш- ь -гистидшг (кариозна ) представляет собой водорастворимой антиоксидант, способный взаимодействовать с продуктами переклского окгслекия липидоз п аятившгя! форглаш кислорода. Однако молекулярный механизма его действия и биологическая роль изучены мало.

Наш было исследовано действие карнозина на растворимую ГЦ тромбоцитов человека. Результаты представлены в табл.3.

Таблица 3. Влияние карнозина на активность ГЦ тромбоцитов человека и активируемость фермента нитропрус-сидом натрия и лротопорфирином IX.

Ферментный препарат Супернатант 105000 в Элюат после ДЭАЭ-целлюлозы

Условия опыта -карнозин +карнозин'. I мМ -карнозин +карнозин I мМ

Активность с Ые* (пмоль цШе мин. на I мг белка) 183+10 С10055) ' 177+10 ( 97% ) 1185 1195.

Сте- нитро-пень прусси-акти- дом • вации натрия 29,0+1,0 (100% ) 10,1+1,6 (34© , 4,1+0,9 (100® 4,4+1,0 (105% )

прото-порфи- . |ИНОМ .6,8+0,4 (1005? ) 6,5+0,2 ' (97% ) 7,5+1,0 . (100% ) 7,9+0,5 (105% )

Состав проб и условия инкубации :см. .Методы. п '

Препарат ГЦ выдерживали с карнозином в течение 10 мин. при 0°С, затем добавляли нитропруссид натрия й преинкубировали 45 мин. при 0°С до добавления субстрата. Протопорфирин IX вносили в инкубационную среду непосредственно перед добавлением субстрата. Степени активации определены относительно принятой за единицу базальной •активности в отсутствие добавок. .

Видно, что в присутствии карнозина в концентрации, не влияющей на активность ГЦ супернатанта 195000 в, наблюдается резкое снижение стимуляции фермента, нитропруссидом натрия - о 29 до 10 раз, то есть, на 70$. Протопорфирин IX, отличающийся от тема только от-^ сутствием. железа, активирует ГЦ тромбоцитов человека в одинаковой степени до и после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, то есть, вне зависимости от степени насыщенности фермента гемом. Карнозин не оказывает влияния па активирующий эффект протопорфирина как в слуг-чСе гемсодержащего, так и геаддефицитного фермента (см.табл.3 ). Полученные данные указывают на' то, что карнозин, видимо, взаимодействует с гемом. Хорошо известна его способность образовывать

хелатные комплексы с металлами: ги, Со, Ре, Сг (Гуляева Н.В. ,1987 ). Хотя комплексы с железом нестабильны, возможно, что взаимодействие карнозина с железом в составе гема приводит к образованию устойчивого комплекса.

Степень торможения нитропруссидной активации зависит от порядка добавления карнозина и нитропруссида в пробу, что указывает на' возможность конкуренции между обоими соединениями за общий участок связывания на ферменте, возмохчо, гем. Так, при добавлении карнозина после 45-минутной преинкубации ГЦ с нитропруссидом активация последним составляет 62+3$ от контроля ( без карнозина ) в сравнении!?; с 34,0+1,6$ при обратном порядке внесения добавок.

Таким образом, ингибиторное действие карнозина обусловлено его взаимодействием с гемом ГЦ. Эти данные позволяют заключить, что активирующее действие нитропруссида на фермент складывается • из двух эффектов: незначительного, неспецифического, не связанного с гемом повышения активности, обусловленного, возможно, 'окислением лабильных БН- групп ГЦ, и стимуляцией активности за счет взаимодействия свободно-радикальной группы N0 с гемом фермента с образованием нитрозилгема. Карнозин ингибирует только гемзависимую активацию ГЦ нитропруссидом натрия.

. В связи с выявленной изначальной гевдефицитностью ГЦ тромбоцитов крысы было обращено особое внимание на то, что в ряде опытов с супернатантом 105000 в тромбоцитов человека ГЦ оказалась малочувствительной к йитропруссиду- активация составила всего 5-6 раз против обычных 20. При ионно-обменной хроматографии этот фермент вел себя- так же, как гевдефицитная ГЦ тромбоцитов крысы, то есть, повышение активности с и Мп+2.практически не различалось и составило 5-6 раз, выход по общей активности не превышал 100$ в присутствии обоих катионов металлов, активация до и после хромато- ' графии не менялась, составляя 6,1 к 5,0 до и после хроматографии, соответственно. Добавление 1-го пика не влияло ни на базальную активность, ни на.активируемость нитропруссидом. Было предположено, что растворимая ГЦ тромбоцитов человека присутствует в этих клетках изначально в гевдефицитной форме, что, вероятно, может быть обусловлено особенностями организмов доноров, от которых была получена кровь. Это предположение было подтверждено опытами с исполь-вованием карнозина. Результаты приведены в табл.4.

Таблица 4. Влияние карнозина на степень активации "гемсодержа-щей"' и "гемдефицитной" ГЦ тромбоцитов человека нитропруссидом натрия ■

Ферментный препарат Супернатант 105000 g Элюат после ДЭАЭ-целлюлозы

-карнозин +карнозин I мМ -карнозин +карноэин I т

"гемсодержащал" 29,0+1,0 (100% ) 10,1+1,6 . ( 34^ ) 4,1+0,9 ' (100% ) 4,4+1,0 (10552 )

"гевдеФицитная" ГЦ 6,0+0,6 (ГОД-) 4,8+0,8 (8 0% ) 5,0+0,3 ( im) 5,5+0,2 . (110$ )

Состав проб и условия опыта см. подпись к таблице 3. Степень активации определена относительно принятой за единицу базальной активности ГЦ в отсутствие добавок.

Из таблицы видно, что, в то. время как активация "гемсодергА-щей*ГЦ супернатанта 105000 g нитропруссидом в присутствии карнозина. падает с 29 до 10 раз, добавление карнозина к препарату "гемдефицитной" ГЦ не влияет на стимуляции нитропруссидом,.которая составляет, соответственно, 6,0 и 4,8 без карнозина и в его присутствии. Отсутствие ннгибирующего эффекта карнозина на небольшую стимуляцию ГЦ нитропруссидом натрия указывает на то, что эта стимуляция не связана с гемом фермента, ,е что в этих сувернатаптах ГЦ, по-видимому, изначально гемдефицитна. Следовательно, существуют люда, тромбоцитарная ГЦ которых малочувствительна к ко к во-содергайрш соединениям. •

Зависимость гипотензивного действия нитрозокомплексов переходных металлов от свойств свободно-радикальной группы ко.

Для того» чтобы выяснить, каким Ее образом активирующее действие нитропруссида натрия связано с проявлением этим соединением гипотензивных свойств, было исследовано влияние на растворимую ГЦ тромбрцитов человека и крысы аналогов нигропруссида-нктрозоховдек-сов кобальта и хрока, отличающихся от него зарядом и легкостью высвобождения группы по и не обладающих гипотензивными свойствами.""'

■к ■ .

Нитрозокомплексы Со к Cr была синтезированы Никольским A.B., Санкт-Петербургский Университет, и любезно предоставлены нагл для исследований.

В молекуле нитропруссида Ыа2 [кябСсЮэ] группа но несет по-

ложительный заряд, в двух исследованных аналогах К^ [сгНОСсЮ^] ( I), и !сош(1Шз)5] зо4 (ii) группа n0 нейтральна. Результаты' представлены в Табл.5. Приведенная в таблице концентрация соединений 1иП-0,1мМ - выбрана для удобства сравнения с нитропрусси-дом'; для которого эта концентрация является оптимальной. •

Таблица 5. Влияние нитропруссида натрия ( НП),кз (сгЖКСЮз] (1),и [сош (N113)5] ( П ) на активность растворимой ГЦ супернатантов ЮБОООг тромбо- • цитов человека и крысы.

Добавки без добавок НП 0,1 мМ I ОД мМ П ОД мМ

Источник фермента

Тромбоциты человека 100% 1623*280 546+120 .175+21

Тромбоциты' крысы " 100% 100 560+100 470+50

Состав проб и условия инкубации см. Методы.

Препарат ГЦ псвинкубировали с НП и соединениями I и П в течение

45 мин. при О С до добавления субстрата.

Величина удельной активности выражена в % относительно принятой за , 100% базальной активности.

Видно, что .степень активации ГЦ суперяатанта 105000 е тромбоцитов человека 'соединениями I и П ниже, чем нитропрусеидом. В то время как нитропруссид не влияет на активность гемдефяцитной ГЦ тромбоцитов крысы, эти соединения активируют фермент практически в той же степени, как и ГЦ тромбоцитов человека ( соединение П -даже сильнее ).• То есть, отсутствие гема не влияет на действие используемых нитрозокомплексов кобальта и хрома. Этот вывод подтверждается тагсхе результатами оштов по влиянию соединений I и П на ГЦ тромбоцитов человека до и после исняо-обменной хроматографии ( см. рис.4 ). .

%

1009080706050 403020 10

Лт

1

3

Рис. 4. Влияние нитропруссида натрия (1),кз[сгНО(си)5](2) и [СоМО(ИНз Б04 (з) на Щ тромооцитов человека поело ионнообменной хроматографии . на ДЭАЭ-целлюло-зе *г

За'100$ принята активация ГЦ исследуемыми соединениями в супернатанте Ю5000е.

На рис.4 видно, что степени активации соединениями I п.П не снижаются при удалении тема, в отличие от нитропруссида. Карнозин, специфически ингибирующий только гемзависимую -активацию растворимой ГЦ тромбоцитов человека нитропруссидом; практически не влияет . на степень активации фермента соединениями I и П. Результаты представлены в табл. 6.

Таблица 6. Влияние карнозина (1мМ) на активацию ГЦ супер-натапта ЮБОООз тромбоцитов человека нитропруссидом натрия (НП). к-5[Сг110(СК)£-](1) и [сово<ин355] зо4 ^

Добавки Без добавок НП 0,1 мМ Т .0,1 ь£3 П 0,1 га ■

-карно-аяи- +карно-зин -карнозин +карно-ЗЯИ -карко зш> +карнс- 32Ш

Удельная активность В /9 . 100 1373+13 10СЙ 466+100 34% 402+20 1002 318+52 80£ 155+15 ■ 100$ 156+10 100$

Состав проб и условия опыта с ¡л,подпись к табл.3 н 5.

Таким образом, в отличие от нитропруссида, активация растворимой ГЦ нитрозокомплексами кобальта и хрома не связана с гемом фермента. Следовательно, можно заключить, что для проявления сосудорасширяющих свойств нитрозокомплексами переходных металлов сущест- • венным-является способность этих соединений активировать фермент только по гемзависимому механизму. Весьма важным являются' также электроноакцепторные свойства группы N0.

Эндогенное образование оксида азота в тромбоцитах человека.

Известно, что сосудорасширяющий эффект органических нитратов -< N0-содержащих соединений) связан со взаимодействием'свободно--радикальной группы N0 с гемом ГЦ. Хотя эти соединения широко применяются в клинике, они обладают и рядом побочных эффектов, а также могут быть недостаточно эффективными в связи с развитием толерантности. Наличие побочных эффектов существующих препаратов органических нитратов диктует необходимость поиска новых сосудорасширя- " ющих средств, •

Учитывая, что все органические нитраты оказывают терапевтический эффект благодаря биотрансформации до оксида азота, обнаружение эндогенного образования N0 открывает возможности создания новых сосудорасширяющих средств на основе изучения гуанилатциклаз-ной и ио-синтазной системДля разработки новых подходов в этом направлении была исследована возможность эндогенного образования оксида азота из ъ~ аргинина в неактивированных тромбоцитах человека, что ранее не было показано. Активность но- синтазы выявлялась по активации ГЦ в присутствии ъ- аргинина- субстрата ь- аргинин-N0 - синтазы. Чтобы подобрать условия для выявления активности Н0-синтазы, варьировали содержание белка в пробе, время и температуру преинкубации и' концентрацию ь- аргинина. Эффект, оказываемый ъ - аргинином на активность ГЦ, оказался нестабильным. Наиболее, выраженным он был при добавлении в пробу 0,1 мМ X,- аргинина при содержании белка 40-50 мкг в "Пробе при проведении - ко -синтазной реакции с дальнейшим снижением его до 20-25 мкг при проведении гуанилатциклазной. Стимулирующий эффект 1- аргинина зависел также от степени насыщенности ГЦ гейом, условно определяемой по чувствительности к нитропруссиду натрия: чем выше была степень активации нитропруссидом, тем более выраженным был и эффект ь - аргини- • на. Добавление кофакторов но- синтазной реакции-0,I мМ НАДФ.Н и

0,1 мкМ повышало стимуляцию ГЦL- аргинином не более чем на

3<Ж, что могло быть связано с присутствием эндогенных НАДФ-Н и кальция в тромбоцитах в концентрациях, достаточных для проявления -активности N0- синтазы. Различий при проведении совместной ( одновременной ) и раздельной инкубации препарата супернатанта 105000 g тромбоцитов человека с субстратами для гуанилатциклазной и ио-еин-тазной реакции не выявлено ( данные не приводятся). На основании полученных данных был сделан вывод, что в неактивированных тромбоцитах человека происходит эндогенное ферментативное образование оксида азота из I- аргинина. Полученные данные были использованы для разработки подходов к созданию новых антигипертензивных лекарственных препаратов.

Образование но из 1- аргинина высокоспецифично, и в настоящее время не описан биосинтез но из каких-либо производных или анало-. гов L- аргинина. Согласно литературным данным, основным акцепторов во in Vivo являются эндогенные тиолы-цистеин, глутатион- в резулг тате взаимодействия с которыми образуются нестойкие нитрозотиолы, способствующие переносу оксида азота на ГЦ. Развитие толерантности ( к нитроглицерину при его длительном применении связывают с нехваткой эндогенных тиолов. Поэтому была поставлена задача использовать соединения, содержащие в своей молекуле одновременно гуанидиновую и тиоловую группы, ко, генерируемый гуанидиновой группой, мог бы образовывать при взаимодействии с SH- группой внутримолекулярный нитрозотиол, способствующий переносу ко на ГЦ и активации фермента. В качестве модели такого возможного вазодилятатора использовали аминоэтилтиуроний , .применяемый е клинике как радиопротектор.• Аминоэтилтиуроний обладает способностью'в результате траногуаниди-новой перегруппировки в щелочных условиях превращаться,в ыеркапто-этилгуанвдин ( Григорьев Н.Б.«неопубликованные данные ) согласно схеме:

Н-Н -CiU-CIU-S-o' ОН „ ПЗ-СН2-0Н -1Ш-С

аминоэтилтиуроний * мзркапгоэтющушгвдин

Шло обнаружено, что аминоэтилтиуроний обладает антигкпертен-аивннм действием, механизм которого иекзвзстон. В таблице 7 приведены результаты опытов по исследовании влияния акшоэтклтауронил на ГЦ супернатаыта 105000с тромбоцитов человека.

« .Аминоэтилтиуроний был синтезирован- Виноградом Л Л. ,в" Хготексфф<-кацевтическом институте и любезно представяегг нам для исследований.

Таблица 7. Влияние аминоэтилтиурония на активность ГЦ тромбоцитов человека.

Активность ГЦ в % в присутствии добавок в концентрации:

без добавок 0,001мМ 0,01мМ о, мл 0,5мМ

Аминоэтилтиуроний 100 172+15 204+18 309+52 183+17

Состав инкубационной пробы см. Метода. Препарат ГЦ инкубировали с .аминоэтилтиуронием одновременно с субстратом для ГЦ в течение 15 мин. при 3?хС. Аминоэтилтиуроний предварительно выдерживали 30 мин. при 37 С в 50 мМ трис-ОН, рН 10.

В сравнении с аминоэтилтиуронием активирующий эффект ь- аргинина был всегда ниже ( данные не приводятся). На основании полученных результатов было предположено, что продукт трансгуанидияовой перегруппировки аминоэтилтиурония-меркаптоэтилгуанидин- может быть использован в качестве субстрата для генерирования эндогенного оксида азота, который в свою очередь реагирует с Зн- группой меркап-тоэтилгуанидина с образованием внутримолекулярного' нитрозотиола 'основного переносчика но на гем ГЦ. Мы полагаем, что .образование внутримолекулярного нитрозотиола обусловило больший стимулирущкй эффект аминоэтилтиурония в сравнении с г.- аргинином. Полученные данные позволяют также объяснить ранее неизвестный механизм сосудорасширяющего действия аминоэтилтиурония.

По-видимому, аминоэтилтиуроний - это один из первых лекарственных препаратов,, сбсудораешряющий эффект которого реализуется согласно следующему механизму: *

.нн ' о

нз-сн2-сн2-11н-с^ но- синтаза ш-сн^-ся^-нн-ст +по —-

ч1?нг м.'Кг

<ж-сн2-сЦ2-11н-с нн—ГЦ —- активация —релаксирующай эффект

Таким образом, полученные данйые позволяет предложить аовий подход, к разработке и созданию сосудорасширяющих лекарственных средств с использованием разных структурных аналогов меркаптоэтилгуанидина и основанный на изучении растворимой ГЦ и но-синтазы.

Можно предположить, что применение подобных лекарствепных препаратов не будет приводить к развитию, толерантности, возникающей К'' органическим нитратам при их даительнга применении и связанпой с истощением эндогенных тилов.

ВЫВОДЫ

1. В результате ионнообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе 52 супернатанта 105000g тромбоцитов человека получена растворимая гуанилатциклаза в гевдефицитной форме.

В процессе очистки выявлен гемсодеркащий ингибитор белковой природы, сникающий активность частично-очищенного препарата гуани-латциклазы и восстанавливающий утерянную последним способность к активации нитропруссидом натрия.

2. Растворимая гуанилатциклаза тромбоцитов, крысы присутствует в этих клетках изначально в гевдефицитной форме. В отличие от .'Общепринятых представлений, гем не является простетической группой этого фермента. Гуанилатциклаза тромбоцитов крысы не может использоваться в качестве модели для изучения влияния ЫО-содеряащих соединений на тромбоцитарный фермент. ...

3. Гуанилатциклаза тромбоцитов человека может изначально существовать и в гемдефицитной форме, это следует учитывать в случае недостаточной эффективности антиагрегационного действия нитровазо-дилятаторов.

4. Установлено, что водорастворимый ант'иоксидант карнозин специфически тормозит только гемзависимую активацию растворимой ГЦ тромбоцитов нитропруссидом и не влияет на неспецифическую, не связанную с гемом активацию фермента. Карнозин могет быть использован для выявления степени.насыщенности фермента гемом.

5. Активация ГЦ китрозокомплексами Со исг, не обладающими антигипертензивным действием, не связана с присутствием гегд.

Для проявления -гипотензивных свойств нитрозокомплексащ переходных металлов необходим гемзависимый характер активации фермента и определенный заряд группы N0.

6. Аминоэтилтиуроний - известный радиопротектор, обладающий вазодилятаторным действием - активирует'растворимую гуанилатцикла-зу в результате перегруппировки в меркаптоэтилгуанидин с последуэ-щий генерацией по и образованием внутримолекулярного нитрозотирла. Производные мерхаптоэтилгуанвдкиа могут быть использованы в качестве основы для создания новых эффективных антигипер-гензивных лекарственных препаратов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРГДИИ

1. Бусыгина О.Г., Лебедева Е.Л;, Северина И.С. Эндогенный регулятор активности гуанилатциклазы тромбоцитов.-Тезисы У1 Всесоюзного симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций", Петрозаводск, 1988,-С.64.

2. Мирошниченко В.П., Бусыгина 0.1., Северина И.С. Сопостав-. ление сгойств гуанилатциклазы сердца и тромбоцитов крысы. - Тезисы У1 Всесоюзного симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляция ферментативных реакций", Петрозаводск.-1988, С. 81.

3. Мирошниченко В.П., Ьусыгина О.Г., Северина И.С. Аналогия и различие в свойствах растворимых форм гуанилатциклазы сердца и тромбоцитов крови крысы// Вопр. мед. химии.-1989.-С.60-66.

4. Бусыгина О.Г., Северина Й„С. Эндогенный регулятор гуани-латщ.&лагчой активности тромбоцитов человека// Биохимия.-1990,-Т.55, M0.-C.I8I2-I8I8. . ' 1

5. Бусыгина О.Г., Лебедева ЕЛ», Сейерина И.С. Гуанилатцкк-лаза тромбоцитов крысы при экспериментальной ишемии миокарда// ■ Вопр. мед. химии.-1990.-35.-С.24-26.

6. Severina I.P., Buaygina 0.0. Effect of carnosine on the activation of human platelet soluble guanylate cyclase by sodium iH.troprusaiae and protoporphyrin IX // Biochen.International.-1996.-rV.22, НЭ.-Р..455-465. ,

7. Бусыгина О.Г., Северина Л.С. Гевдефицитность растворжйой гуанилатциклазы тромбоцитов крысы// Биохимия.- 1991.- Т.56. ЯЗ.-С.487-494.

8. Sevarina I.S., Buaygina 0¿0. Role of heme in the regulation of human and rat platelet soluble guanylate cyclases// Biochenu Internetional.-1991. -V. 23. Кб. -P. II43<-II54.

9. Мирощниченко Е.П., Бусыгина О.Г., Демуров Е.А., Колосков ю.Б. Растворимая гуанилатциклаза тромбоцитов а сердца крысы при экспериментальной ишемии миокарда// Кардиология.-1992.-Т.32.«С.64-66.

10. Северина И.С., Бусыгина О.Г. Роль карйозина в функционировании растворимой гуанилатциклазы// Биохимия.-1992.-Т.5?. C.I330-I336.

11. Severina I.S., Buaygina O.G., Grigorjev Я.В. Effect of nitroso complexes of some transition aetals on the activity of soluble guanylate cyclase// Biochem.Im,ernational.-I992.-V.26.H4.-

P.695-705.

л

Подписано в печатьЗак. $37-Форма? 60x84/15. Тир. /СО

Мооква. Типография РАСШ