Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Растворимая гаунилатциклаза тромбоцитов. Роль гема в функционировании фермента

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Растворимая гаунилатциклаза тромбоцитов. Роль гема в функционировании фермента"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМВДИЦИНСЮЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.152.344 . 577.13

БУСЫГИНА С.ТЬГА ГЕОРГИЕВНА

РАСТВОРИМАЯ ГУАНШАТЦЖША ТР01/БОЦШОВ. РОЛЬ ГЕМА В ФУНБДИОНИРОВАНШ ФЕРМЕНТА.

03.00.04-Биологическая химия

Автореферат диссертации н& соискание ученой степени кандидата биологических ныук

Москва 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биомедицинской химии Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Северина И.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Нагр_дова Н.К. доктор биологических наук, профессор Петрович Ю.А.

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится ^/^сг^.^ 199Цг. на

заседании специализированного Ученого совета Д 001.10.01 Научно-исследовательского института биомедицинской химии Российской академии медицинских наук по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Науччо-исследо-вательского института биомепицинской химии РАМН.

Автореферат разослан Зг.

/

Ученый секретарь

специализированного совета // р

-кандидат биологических наук ^¿¿Сч • с -Ларионова Т.И.

-¡уии/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время известно, что лечебный эффект наиболее распространенных нитровазодилятаторов -таких как нитроглицерин, нитросорбид, нитронг, нитропруссид натрия и др. - связан со стимуляцией растворимой гуанилатциклазы (ГЦ }, катализирующей биосинтез циклического 3',5'- гуанозинмонофосфата С цГМФ ) и накоплением этого мощного регулятора функциональной активности клетки. Активирующее влияние перечисленных лекарственных препаратов обусловлено взаимодействием свободнорадикальной • группы N0 этих соединений с железом гема, йвляющегося простети-ческой группой ГЦ. Образующийся комплекс-нитрозилгем-представляет. собой истинный активатор фермента. Этот молекулярный механизм терапевтического действия приобрел особое значение после установления Konoada. в 1987 году эндогенной природы оксида азота. Было показано,что эндотелиальный фактор релаксации,. синтезируемый клет-каш сосудистого, эндотелия и участвующий в расширении сосудов, представляет собой оксид азота. Оксид азота образуется из - Ь -аргинина.. при- участии L- аргинин- N0 - синтазы. Этот фермент оказался широко распространенным,. Эндогенное образование ко . из аргинина показано, в разных, органах, и 'тканях.. Обнаружена важная роль оксида - азота; в, процессах: цитотоксичности, в осуществлении межклеточных ' коммуникаций в. нервной: системе, в поддержании сосудистого тонуса. • Эндогенный, ко является мощным фактором: гемостаза.( >В настоящее время оксид азота рассматривается, как, эндогенный вазодилятатор. Его антипгаертензиввне и- антиагрегационные свойства непосредственно связаны с- пршуйй-. стимуляцией растворимой'. ГЦ по гемзависимому механизму и: накоплением цЕМФ., ..-■'■-■..'

Таким: образом, гему ГЦ, принадлежит, ванная: роль. в. механизме сосудорасширяющего действия содержащих, соединен!®. Известно, что гем лабильно связан .с- белковой молекулой Щ к глсжэт отщепляться при понивении рНг хранении,.некоторых способах очистит и т.д. Прочность связи гема с ферментом зависит от источника фермента. • Данных о возможности существования растворимой. ГЦ изначально в гем-дефицитной форме в тканях в. литер'туре нет. В то же время очевидно, что гемдефнцитность будет приводить к царукешт эндогенной регуляции. ГЦ, процессов поддержания тонуса сосудистой стенки и регуляции просвета сосудов, нарушению процессов агрегации тромбоцитов, сшпсе-

нию эффективности действия сосудорасширяющих и антиагрегационных препаратов. В связи с этим изучение роли гема в функционировании ГЦ является актуальным не только в теоретическом плане, но и для решения задач практической медицины.

Цели и задачи исследования^

Объектом исследования била выбрана ГЦ тромбоцитов человека, так как этот фермент на 95-98^ находится в растворимой форме, обладает высокой активностью, содержит гем и потому высоко чувствителен к действию г)От содержащих соединений, и в том числе нитро-пруссида натрия. Ранее нами было показано, что ГЦ тромбоцитов крысы не активируется нитропруссиДОм,. что, в отличие от общепринятых представлений, могло указывать на возможную гемдефицитность этого фермента. В литературе мы не обнаружили сведений о растворимой ГЦ тромбоцитов крысы. Все это обусловило наш интерес к ферменту из этого источника. Целью настоящей работы явилось изучение ро.л гема в функционировании растворимой ГЦ тромбоцитов человека и красы, в проявлении гипотензивных свойств N0- содержащими соединениями на примере нитрозокомплексов переходных металлов,, а также изучение образования оксида азота в тромбоцитах человека с целью разработки новых подходов к поиску, эффективных антигипертензивных лекарственных препаратов на основе изучения растворимой ГЦ.

В связи с этим*необходимо было реппть следующие задачи:

1. Получить в гемдефицитной форме растворимую ГЦ.тромбоцитов человека и крысы и провести сравнительное исследование свойств этих ферментов до и после удаления гема.

2. Исследовать влияние водорастворимого антиокслданта р-аланин-1-гистидина (карнозина) ня активность у активацию нитропруссгюм натрия ГЦ тромбоцитов человека.

3. На примере нитрозокомлексов переходных металлов Ре, Со, Сг изучить связь между механизмом активации ГЦ тромбоцитов' человека

и крысы этими соединениями и их способностью проявлять гипотензивные свойства.

4. Выявить возможность эндогенного образования оксида азота в тромбоцитах человека и применить полученные данные для.разработки новых подходов к созданию эффективных сосудорасширяющих лекарственных средств на основе изучения растворимой ГЦ и n0 -сичтазы, используя соединения, содержащие в своей молекуле одновременно гуани-диновые и тиоловые группы.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые описаны некоторые основные свойства растворимой ГЦ тромбоцитов крысы и сделан вывод, что гем не является, в отличие от общепринятых представлений,, простетической группой этого фермента. В связи с этим ГЦ из этого источника не может служить моделью для изучения действия но-содержащих соединений на тромбоцитарный , фермент.

Впервые показано, чтр растворимая ГЦ тромбоцитов человека также может существовать изначально в гемдефицитной форме, что монет привести к нарушению гемостаза, обусловить недостаточную эффективность действия антиагрегационных препаратов и потребовать разработки новой стратегии в применении лекарственных средств в подобных случаях.

Установлено, что водорастворимый антиоксидант _р-аланин -I гибтидин (карнсзин) тормозит только специфическую гемзависимую активацию ГЦ нитропруссидом натрия л может быть использован в качестве теста на геыдефкцитнссть фермента и для выявления гемзави-симого характера активации ГЦ.

На примере изучения механизма активации ГЦ нитрозокомплексамя переходных металлов Ре, Со и Ог установлено, что для проявления гипотензивных свойств необходима активация только по гемзави-симому механизму.

Впервые показана активация ГЦ тромбоцитов человека соединениями, содержащими в молекуле одновременно гуанидиновне и тиоловые группы за счет образования внутримолекулярных нитрозотиолов.

Получецные данные позволяют предложить новый подход к раз^ч-ботке и созданию эффективных вазодилятаторов на основе изучений гуанилатциклазной и ИО-синтазной систем. Можно'ожидать, что при этом не будет развиваться толерантность, возникающая при применении органических нитратов и связанная с истощением эндоге ;ных тио-лов. '

Апробация работы состоялась на совместной научной конференции лаборатории экстремальных' состояний к лаборатории биохимии и патохи-мии гуанилатциклазной системы 18 мая 19СЗг.

Основные положения диссертации, докладывались на VI Всесоюзном Симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов* и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (3-7 октября 1988г.), Петрозаводск. По теме диссертации опубликовано II печатных работ.

Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, включая 15 рисунков и 17 таблиц. Состоит из введения и разделов: "Обзор литературы" ( главы "Свойства растворимой и мембранно-связанной форм гуанилатциклазы", "Оксид азота: биосинтез и биологическая роль" и "Биологическая роль циклического гуанозинмонофосфата^, "Материалы и методы исследований", "Результаты исследовалий", "Обсуждение", "Выводы" и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИМЫ И - МЕТОДЫ

Объектом исследования служили тромбоциты крови человека и крысы. Донорскую кровь получали в Гематологическом научном центре.

Выделение тромбоцитов из крепи человека и крысы. Тромбоциты человека выделяли из крови здоровых доноров в соответствии с описанной методикой (Чирков' и др., 1987), используя в качестве антикоагулянта 0,1М раствор ЭДТА в 0,9# НаС1, (рН 7,4 при 20°С ). Для получения тромбоцитов высокой степени чистоты из обогащенной плазмы применяли Р1со11-Ра^ие. Полученный промытый осадок тромбоцитов ресуспендировали в 50мМ трис- НС1, рН 7,6 при 0°С, содержавшем 0,2 мМ дитиотрейтол (ДТТ).

Выделение тромбоцитов из крови крысы проводили аналогично выделению тромбоцитов человека, согласно методике ( Г/ярошниченко и др.,1988) с некоторыми модификациями: а/ в качестве антикоагулянта использовали 0,2М ЭДТА в 0,9^НеС1,' ( рН 7,4 при 20°С ); б/ для получения богатой тромбоцитами плазмы гзльную кровь разводили 20мМ трис- НС1 буфером в 0,9$ N001 ( рН 7,4 при 20°С ) в равном соотношении е.'.буфером. Осадок промгтых тромбоцитов ресуспендировали в 20мМ трис-не 1 буфере, ( рН 7,6 при 0°С ), содержащем или не содержащем ДТТ в зависимости от задач эксперимента.

Тромбоциты разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе мбе 5-78 ( Великобритания) в течение 20 сек. при амплитуде 1бмкм на холоду и центрифугировали в течение I часа при 105000g на ультрацентрифуге Веокпап 1,5-65( Австрия). Супернатант использовали в качестве препарата растворимой ГЦ.

Определение активности ГЦ тромбоцитов человека и крысы. Определение активности ГЦ проводили в соответствии с описанной методикой (Чирков Ю.Ю. и др., 1987). В состав реакционной смеси объемом 150мкл входили: 50м?.! трис-НС1 ( рН 7,6 при 37°С ), 1мМ ГТФ,

4мМ KnCi2 либо Mgci2 , 4мМ креатинфосфат, 20мкг (120-160 ед) креатинфосфокиназы, ЮмМ теофиллин, супернатант IOSOOOg или злюат после ионно-обменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в количестве 10-20 мкг или 2-2,5. мкг по белку, соответственно, и необходимые добавки. Инкубацию проводили в течение 10-20 мин. в зависимости от задач эксперимента. Реакцию останавливали нагреванием проб в течение 2 мин. при 90°С с последующим, охлаждением во льду. Денатурированный белок отделяли центрифугированием при I500g в течение 15 мин. В полученном осадке определяли содержание образовавшегося цГМФ. Количество цГМФ в пробах определяли радиоимунным методом при помощи набора реактивов оОМР ria Kit ("Aneraham", Великобритания) по прилагаемой методике. Радиоактивность определяли на счетчике • Back-beta i2ii (1KB, Швеция ).

Ионно-обменная хроматография на ДЭАЭ-цвллюлозе 52.

Йонно-обменную'хроматографию супернатанта I05000g проводили на колонке с ДЗАЭ-целлю'лозой 52 («Whatman1} Великобритания). Колонку уравновешивали 50мМ трис- НС1 буфером, ( рН 7,6 при 4°С), содержащим 0,2Ш ДТТ. Супернатант I05000g в количестве 2-4 мкг белка в объеме 1-2 мл наносили на колонку, Элюцию проводили тем же буфером, содержащим градиент UaCl 0-г0„5 М или ступенчато, 0,22 М NeCZ. Наличие белка во фракциях региохрировали. с помощью измерения поглощения при 280 нм ( однолучевой датчик üt-i¡'Pharnmc la1; Швеция ')• Фракции, содержавшие гуанилатцикладвую активность, объединяли и использовали для дальнейших исследований.

• Другие методы.

Содержание белка" определяли по, методу Лоуря. ( Лоури et al* 195.Р. Спектры поглощения исследовали на спектрофотометре ш-50("вес!гаап? Австрия ),

/■-,,- ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 14 ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние дитиотрейтода на гушшлатциклазу тромбоцитов крысы.

Известно, что растворимая ГЦ содержит SH- группы, при окисле- ■ нии которых фермейт обычно активируется. Добавление восстановителя ДТТ спишет активацию ж возвращает величину базальной активности к исходному уровню. Для ГЦ тромбоцитов человека показано, что присутствие ДТТ в среде озвучивания предотвращает спонтг>иную самоактивацию фермента,, но пе влияет на величину базальной активности ( Чир-

ков Ю.Ю. и др., 1987 ). Результаты, полученные' для ГЦ тромбоцитов крыса, принципиально отличаются от данных для тромбоцитов человека ( см. Рис. I ).

Рис. I. Сопоставление влияния дитиогрейгола на активность

ГЦ тромбоцитов крысы /I/ и тромбоцитов человека /2/ Состав проб и условия инкубации описаны в Методах. Препарат ГЦ проинкубировали с ДТТ в течение 45 мйн. при О С до добавления субстрата. ? За 100% принята базальная активность в присутствии Щ . Озвучивание суспензии тромбоцитов: а/ - в присутствии 0,2 Ш ДТТ,

■б/ -бе3 т .

Следует отметить, что при озвучивании тромбоцитов в присутствии 0,2 мМ ДТТ в инкубационной пробе создается концентрация последнего порядка 0,01 мМ. Из рис.1 видно, что при дополнительном'внесении ДТТ в пробу активность ГЦ тромбоцитов красы увеличивается, достигая максимум - 450$ - при 2 мМ ГГТ, тогда как активность ГЦ тромбоцитов человека снижается, достигая 80% при 2 Ш ДТТ. (Рис.1, кривые 1а и 2а ).Степень активации ГЦ тромбоцитов крысы ДТТ не зависит от'присутствия последнего при озвучивании (кривые 1а и 16 )• Выявленные различия в действии ДТТ указывают на большую степень агжленностп ГЦ из тромбоцитов крысы.

Таким образом, степень окисленности и величина базальной активности ГЦ тромбоцитов крысы в значительной мере определяются кон-

- 9 -

центрацией ДТТ в среде озвучивания.

Влияние нитропруссида натрия на ГЦ тромбоцитов крысы. В отличие от ГЦ тромбоцитов человека, нитропруссид натрия С 0,1-1ыМ) не стимулировал фермент из тромбоцитов крисы ( см.Табл.1 ).

Таблица I. Влияние нитропруссида натрия на активность ГЦ тромбоцитов крысы супернатанта 105000е на фоке дитиотреитола ( ДТТ) и гемоглобина

ТС

Активность ГЦ с Ме ( пмоль цШФ в. минуту, на I мг балка

в присутствии:

Назальная нитропруссида 0,1 мМ ДТТ 0,2 М нитропруссида 0,1 мМ ДТТ 0,2 иМ нитропруссида 0,1 мМ ДТТ . 0,2 мМ гемоглобина 3 гш* гемогл 3 мкг эбина 9 мкг

23,7+3,3 ( Ю0$5) 22,0+4,4 С 938) ■ 62,3+7,4 ( 2 82%) 54,4+7,3 { 230$ ) 52,9+6,8 ( 222$) 21,3+5,0 ( 9о£) 23+2 ( 97%)

Состав проб й условия инкубации см. Методы, Препарат ГЦ преинкуби-ровали с гемоглобином в течениеп5 мин. при 0иС, с ДТТ и нитропрус-садом - в течение 45 мин. при О С до добавления субстрата. При одновременном присутствии в пробе перечисленных соединений нитропруссид вносили сразу после внесения гемоглобина и ДТТ.

На основании полученных данных было предположено, что ГЦ тромбоцитов краев существует в этих клетках изначально в гевдефицитноЯ форме.

Для более детального выяснения этого предположения бита использовала когто-обмегогая хроматография на ДЭЛЭ-цедлилозв 52.

Конно-обмэнная хроматография .ГЦ супернатанта 105000 в тромбоцитов человека и кшск ¡та ДЗАЭ-цедяаЗюаз 52.

Согласно литературным даянкм, иояво-обмениая хрглътогрофия является одним из способов очистка растворимой ГЦ, пря котором происходит удаление гема. Нага били исследоваш свойства растшршаоЯ ГЦ суперпатанта 105000 г тромбоцитов человека и крысы к активация

фермента нитропруссидом натрия до и после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе 52. Профили элюции обоих супернатантов 105000 g представлены на Рис. 2.

Рис..2, Хроматография на ДЭАЗ-целлюлозе супернатантов 105000g тромбоцитов человека ( А ) и тромбоцитов крысы ( В ) с использованием ступенчатой элюции 0', 22 М NaCl

Элюирующий буфер-50 мМ трис-нс! ( рН 7,6 при 0°С ), содержащий 0,2 мм ДТТ. fio оси абсцисс: номера фракций. По оси ординат: про-

?иль белка в мкг/мл л сплошная линия; удельная активность ( УА ) Ц в присутствии % — пунктирная линия.

Из рис.2 видно, что профили'элюции обоих супернатантов одинаковы и представляют собой два белковых пика - 1-й, содержавший 5-10$ белка - и П-й,содержавший 20-25$ белка от общего количества, нанесенного на-колонку. Практически вся гуанилатциклазная активность •оказалась сосредоточенной во П-м пике (градиентlíaci 0,18-0,22 М). В случае тромбоцитов человека повышение удельной активности ГЦ П пика в присутствии Hg достигало6-10 раз, что .соответствовало литературным данным, и превышало увеличение активности в'присутствии мп+2 в 2-2,5 раза. При этом общая активность, элшруема^ с колонки, составила в присутствии Mg 170+14%, тогда как с Мп - не более 100$.от всей, нанесенной на колонку и принятой за 100$; В про-г цессе хроматографии активация ГЦ"0,1 мМ нитропруссидом упала с 2^,4+2,0 раз в супернатанте I05000gдо 3,6+0,3. раз во П-м пике,что составило 18$ «^исходной. Рззкое повышение общей,активности в присутствии Mg указывало на удаление какого-то эндогенного ингибитора, возможно, содержавшегося в I белковом пике.

В опытах с тромбоцитами крысы повышение удельной активности ГЦ П пика с %+2 и мп+2 было одинаковым- 5-6 раз-, выход по общей активности в. присутствии обоих катионов металлов не превышал 1005?. Активации нитропруссидом не наблюдалось ни до, ни после хроматографии. Действие пика I на препарат ГЦ из П пика также оказалось принципиально различным в опытах с ферментом из тромбоцитов . человека и крысы '( см. Табл.2).

Таблица 2. Влияние 1-го белкового пика на активность препарата ГЦ тромбоцитов человека и крысы ■ и активацию фермента нитропруссидом натрия.

Источник фермента Удельная с Мй+г- активность ( в % ) Степень активации нитропруссидом натрия

Элюат после ДЭАЭ-целлюлозы Супернатант■ ' 1050005 Элюат после ДЭАЭ-целлюлозы

-I пик + I пик - 1 пик - I пин + Г пик.

Тромбоциты человека 100 33+ 6 20,4; ¿2,0 3,6+0,3 13,4+2,

Тромбоциты, крысы > . ' 100 97+1? нет активации. нет активации

Состав проб и условия инкубации см. Метода. Препарат ГЦ выдерживали с 1-м пиком при равном соотношении балка I и П-го пиков ( 1,5-2,5 мкг в пробе ) в течение 10 глин, при О С, затем добавляли нитропруссид натрия и преинкубировали 45 мин. при 0°С до добавления субстрата.

Степень активации определена относительно принятой за единицу базальной активности.

Добавление к препарату ГЦ .'тромбоцитов человека С П пик ) I пика снижало активность фермента и одновременно восстанавливало.нитро-пруссиднуэ активацию до ?0/£ от исходной в супернатанте. Добавление же 1-го пика к ГЦ.тромбоцитов крысы ( П пика ) не оказывало ингиби-торного действия.на фермент и не' влияло на отсутствие активации нитропруссидом. ■ ■' , ■'

Полученнне даяние позволили.предположить, что в процессе ион-нообменной хроматография от ГЦ тромбоцитов человека, но не крысы, происходит отщепление тема, в результате чего фермент получается в гевдбфнцитной форме. " •

Известно, что для геглсо^ерЕащих белков, в том числе и для ГЦ, характерен ь&ксимун поглощения в области полосы.Соре ( 415-430 глин).

1 .

В

| %

о ПН г 8

' • ,) 8 В 8 8 8 8 ° ° -в

дшша волны ( нм)

■ Рис. 3. Спектры супернатантов 105000g тромбоцитов человека('.-А) и тромбоцитов крысы (В) до и после хроматографии на ДЭАЗ-целлюлозе.

А : I- супернатант 105000к, 0,58 мг белка в пробе;

2- I пик, 0,15 мг белка в пробе;

. 3- П пик, содержащий ГЦ, 0,58 мг белка в пробе.

В : I- супернатант 105000к, 0,45 мг белка в пробе;

2- I пик, 0,15 мг белка в пробе;

3- П пик, содержащий ГЦ, 0,28 ыг белка в пробе.

Как видно из рис.3, в опытах с ферментом тромбоцитов человека •максимум поглощения в области полосы Соре, присутствующий в супер-, натанте 105000г, исчезает из элюата после ДЗАЭ- целлюлозы ( пик П) и .появляется в.1-м пике ( см. Рио,ЗА ) В аналогичных опытах с тромбоцитами крысы при отсутствии загрязнения супернатанта 105000е эритроцитарным гемоглобином максимума поглощения в области полосы Соре не обнаружено ни в супернатанте, ни в обоих белковых пиках ( см. Рис.-ЗВ ).

• Таким образом, спектральные исследования подтверждают предположение об отщеплении тема от ГЦ тромбоцитов человека при ион-нообменной хроматографии, добавление 3 мкг гемоглобина в пробу приводило к снижению активности ГЦ тромбоцитов человека супернатанта 105000 б и пика П на 40$, активация же нитропруссидом при

этом возрастала, соответственно, в 1,5 и 3,5 раза. То есть, происходило восполнение гевдефицитности. Разная степень усиления активации гемоглобином указывала на/значительно меньшую степень гемдефи-цитностк 'супернатанта по сравнению с ферментом П пика.

Оставалась неизвестным, в какой форме-" свободной пли связанной с белком- находится отщепившийся от ГЦ тромбоцитов человека гем, обнаруживаемый в 1-м пике. Как видно из рис.3, в 1-м пике не обнаружено максимума поглощения в области 390 нм, характерного для свободного гема, что позволило предположить связанность отщепившегося гема с каким-то белком. На это_указывало также отсутствие различия в действии I пика'до и после ультрафильтрации в ячейке Ami-con ( фильтр 'PM-I0 ), на ГЦ тромбоцитов человека ,П пика. Активность в обоих случаях падала на 70$, активация нитропруссидом возрастала в 2,1-2,5 раза, достигая 40$ or исходной в супернатанте 105000g.

Различия, выявленные между-ТЦ тромбоцитов человека и крысы, и результаты, сопоставления влияния 1-х пиков, полученных при ион-но-обменной хроматографии фермента из этих двух источников, на час-тично-очищенную ГЦ тромбоцитов человека ( П пика), привели нес к предположению о присутствии в тромбоцитах человека специфического белкового регулятора ГЦ гемовой природы, отсутствующего в тромбоцитах крысы, однако его природа нуждается в дальнейшем изучении.

Таким образом, в результате иояно-обмеяной хроматографии ГЦ' . тромбоцитов человека получается в геадефяцитной форме. Полученные данные указывают также на то, что,в отличие от общепринятых представлений, гем не является просгетической группой ГЦ тромбоцитов крысы, и следовательно, не может использоваться в качестве модели для изучения действия на тромбоцптариу» ГЦ но- содержащих соединений, обладающих сосудорасширяющим и антиагрегадаовннм действием.

Влияние карнозииа на активность растворимой .ГЦ н активацию Фермента нитропруссидом натрия я протопорЬирийом IX

Растворимая ГЦ монет активироваться ненасыщенными гирндаа ккслотакз, продуктами пх.первкисного окисления и свободными рядя-' калами, вклшая гидрсксаг»ввй. При этом роль антиоксидаптов з функционирования ГЦ изучена недостаточно, р-аланян- ь -гястидшг (кариозна 5 представляет собой водораствордадай аптиоксндант, способный взаимодействовать с продуктами перекасного окисления лапидов я активктш форггшя кислорода. Однако иолвкуляршЗ нехакизн его действия !г биологическая родь изучены иэхо.

Нами было исследовано действие карнозина на растворимую ГЦ тромбоцитов человека. Результаты представлены в табл.3.

Таблица 3. Влияние карнозина на активность ГЦ тромбоцитов человека и активируемость фермента нитропрус-сидом натрия и протопорфирином IX.

Ферментный . препарат Супернатант 105000 в Элюат после ДЭАЭ-целлюлозы

Условия опыта -карнозин +карнозин'. I мМ -карнозин +карнозин I мМ

Активность с Ыв ■ Спмоль цГМу? мин. на I мг белка) 183+10 (100$) ' 177+10 ( 97% ) 1185 1195.

Сте- нитрог пень прусси-акти- дом ■ вации натрия 29,0+1,0 (1002 ) 10,1+1,6 (Ж): 4,1+0,9 ' {100%) 4,4+1,0 (105$ )

прото-порфи- . |ИНОМ .6,8+0,4 (100$) 6,5+0,2 (97% ) 7,5+1,0 , (100% ) 7,9+0,5 (105% 3

Состав проб и условия инкубации см.„Методы. п '

Препарат ГЦ выдерживали с карнозином в течение 10 мин.- при О С, затем добавляли нитропруссид натрия и преинкубировали 45 мин. при 0°С до добавления субстрата. Протопорфирин IX вносили в инкубационную среду непосредственно перед добавлением субстрата. Степени активации определены относительно принятой за единицу базальной активности в отсутствие добавок. ; .

Видно, что в присутствии карнозина в концентрации, не влияющей на активность ГЦ супернатанта 105000 е, наблюдается резкое снижение стимуляции фермента.нитропруссидом натрия - о 29 до 10 раз, то есть, на 70$. Протопорфирин IX, отличающийся от тема только от--сутствием.железа, активирует ГЦ тромбоцитов человека в одинаковой степени до и после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, то есть, вне зависимости от степени, насыщенности фермента гемом. Карнозин не оказывает влияния на активирующий эффект протопорфирина как в слу»-чСе гемсодержащего, так и гемдефицитного фермента (см.табл.З ). Полученные данные указывают на' то, что карнозин, видимо, взаимодействует с гемом. Хорошо известна его способность образовывать

хелатные комплексы с металлами: N1, Со, Ре, Сг (Гуляева Н.В.,1387 ). Хотя комплексы с железом нестабильны, возможно, что взаимодействие карнозина с железом в составе тема приводит к образованию устойчивого комплекса.

Степень торможения нитролруссидной активации зависит от порядка добавления карнозина и нитропруссида в пробу, что указывает на' возможность конкуренции меаду обоими соединениями за обаяй участок связывания на ферменте, возможно, тем. Так, при добавлении карнозина после 45-минутной преинкубации ГЦ с нитропруссидом активация последним составляет 62+3% от контроля ( без карнозина ) в сравне*-нии, с 34,0+1,6/о при обратном порядке внесения добавок.

Таким образом, ингибиторное действие карнозина обусловлено его взаимодействием с гемом ГЦ. Эти данные позволяют заключить, что активирующее действие нитропруссида на фермент складывается • из двух эффектов: незначительного, неспецифического, не связанного с гемом повышения активности, обусловленного, возможно, окислением лабильных эн- групп ГЦ,.и стимуляцией активности за счет взаимодействия свободно-радикальной группы N0 с гемом фермента с образованием нитрозилгема. Карнозин ингибирует только гемзависимув активацию ГЦ нитропруссидом натрия.

. В связи с выявленной изначальной гемдефицитностью ГЦ тромбоцитов крысы было обращено особое внимание на то, что в ряде опытов с супернатантом 105000 в тромбоцитов человека ГЦ оказалась мало-чузствительной к йитропруссиду- активация составила всего 5-6 раз против обычных 20. При ионяо-обменной хроматографии этот фермент вел себя- так же, как гевде&щитная ГЦ тромбоцитов крысы, то есть, повышение активности с и мп+2. практически не различалось и составило 5-6 раз, выход по общей активности не превышал 100$ в присутствии обоих катионов металлов, активация до и после хромато- ' графии не менялась, составляя 6,1 и 5,0 до и после хроматографии, соответственно. Добавление 1-го пика не влияло ни на базальную активность, ни на.активируемость нитропруссидом. Было предположено, что растворимая ГЦ тромбоцитов человека присутствует в этих клетках изначально в гевдефицитной форме, что, вероятно, может быть обусловлено особенностями организмов доноров, от которых была получена кровь. Это предположение было подтверждено опытами с использованием карнозина. Результаты приведены в табл.4.'

Таблица 4. Влияние карнозина на степень активации "гемсодержа-щей" и "гемдефицитной" ГЦ тромбоцитов человека нитропруссидом натрия '

Ферментный препарат Супернатант 105000 в Элюат после Д5АЭ-целлюлозы

-карнозин +карнозин ГмМ -карнозин +карнозин I «М

"гемсод^ржащая" 29,0+1,0 (100% ) 10,1+1,6 _ ( 34% ) 4,1+0,9 '■(100% ) 4,4+1,0 ( 105% )

"гевдеобицитная" ГЦ . 6,0+0,6 (100$') 4,8+0,8 <80% ) 5,0+0,3 (100?/° ) 5,5+0,2 (110# )

Состав проб и условия опыта см. подпись к таблице 3. Степень активации определена относительно принятой за единицу базальной активности ГЦ в отсутствие добавок.

Из таблицы видно, что, в то время как активация "гексодержа-щей* ГЦ суперпатанта 105000 е нитропруссидом в присутствии карнозина падает с 29 до 10 раз, добавление карнозина к препарату "гемдефицитной" ГЦ не влияет на стимуляцию нитропруссидом, которая составляет, соответственно, 6,0 и 4,8 без карнозина и в его присутствии. Отсутствие ингнбирующего эффекта карнозина на небольшую стимуляцию ГЦ нитропруссидом натрия указывает на то, что эта стимуляция не связана с гемои фермента, п что в этих супернатантах ГЦ, по-видимому, изначально гекдефюзитна.'Следовательно, существуют люди, тромбоцитарная ГЦ которых малочувствительна к но и но-содераащЕМ соединениям. • 1 ,

Зависимость гипотензивного действия нитрозокомплексов пераход-иих металлов о? свойств свободно-радикальной группы но.

Для того, чтобы выяснить, каюта ко образом активирующее действие нитропруесида натрия связано с проявлением атим соединением гипотензивных свойств, было исследовано влияние на растворимую ГЦ • тромбоцитов человека и крысы аналогов китропруссида-нптрозокомг/лек-. сов кобальта ж хрома, отличающихся от него'зарядом и легкостью вы- ' свобоздения группы но е не обладаисшх гипотензивна® свойства?-®'

Нктро зокомплексы Со и Сг были синтезированы Някольскпг.: Л.Б., Санкт-Петербургский Гневерситег,.ц любезно,предоставлены нам для исследований. -

В молекуле нитропруссида Иа2 [ргй^сЮз] группа N0 несет по-

ложительный заряд, в двух исследованных аналогах к^ [сгНО(СН)53 ( I), и [соЫОСлНзЭд] эо4 (XI) группа но нейтральна. Результаты представлены в Табл.5. Приведенная в таблице концентрация соединений 1иП-0,1мМ - выбрана для удобства сравнения с нитропрусси-дом-; для которого эта концентрация является оптимальной. -

Таблица 5. Влияние нитропруссида натрия ( НШДЗ [егКОСей)^] (1),и [соио(ннз)5] Э04 ( П ) на активность растворимой ГЦ супернатантов 105000е тромбо- -цитов человека и крысы.

Добавки без добавок НП 0,1 мМ I 0,1 мМ П 0,1 мМ

Источник фермента

Тромбоциты человека 100$ 1623+280 546+120 \ 175+21 г->

Тромбоциты крысы 100% 100 . ббОьЮО 470+50

Состав проб и условия инкубации см. Методы.

Препарат ГЦ првинкубировали с НП и соединениями I и П в течение

45 мин. при ОаС до добавления субстрата.

Величина удельной активности выражена в % относительно принятой за 100% базальной активности.

Видно, что .степень активации ГЦ суперяатанта 105000 в тромбоцитов человека соединениями 1 и П ниже, чем нитропруссидом. В то время как нитропруссид не влияет на активность гемдефицитной ГЦ тромбоцитов крысы, эти соединения активируют фермент практически в той^яе степени, как и ГЦ тромбоцитов человека ( соеданение П -даже сильнее ). То есть, отсутствие гема не влияет на действие используемых нитрозокомплексов кобальта и хрома. Этот вывод подтверждается также результатами опытов по влиянию соединений I и П на ГЦ тромбоцитов человека до и после исняо-обменной хроматографии ( см.' рис.4 ).

Рис. 4. Влияние нитропруссида натрия (1),кзГсгио(ся)5](2) и [СоМО(МНз )5] 304 (3) на ГЦ тромбоцитов человека поел: ионнообменной хроматографии . на ДЭАЭ-целлюло-зе.

За 100£ принята активация ГЦ исследуемыми соединения- I ш в супернатанте 105000е,

На рис.4 видно, что степени активации соединениям I и.П не ! снижаются при удалении тема, в отличие от нитропруссида.\Карнозин, специфически ингибирующий только гемзавксимую-активацию растворимой ГЦ тромбоцитов человека нитропруссидом, практически не влияет. . на степень активации фермента соединениями 1-й П. Результаты.представлены в табл. 6. :

Таблица 6. Влияние карнозина: (1мМ) на активацию ГЦ супер-натанта 105000б тромбоцитов человека нитропрус-

Щ^Щв^к ^осс^Ш и

Добавки Без добавок НП 0,1 мМ I ■- , * . 0,1 кМ '■ -•. п 0,1 кМ . '

-карно- 8ен- +карно- 8кн ; -карно-зин +каркс-зшг -карно зин +карнс-зив

Удельная активность ' в % , 100 1ЕГ73+13 '100* 466+100 34& 402+20 10052 318^52 т 155+15 • 1Ш 156+10! шя

Состав проб и условия опыта см.подпись к табл.3 и 5.

Таким образом, в отличие от нитропруссида, активация растворимой ГЦ нитрозокомплексами кобальта к хрома не связана с гемом фермента. Следовательно, можно заключить, что для проявления сосудорасширяющих свойств нитрозокомплексами переходных металлов сущест- ■ венным является способность этих соединений активировать фермент только по гемзависимому механизму. Весьма важным являются- также электроноакцепторные свойства группы N0.

Эндогенное образование оксида азота в тромбоцитах человека.

Известно, что сосудорасширяющий эффект органических нитратов • ( N0- содержащих соединений) связан со взаимодействием свободной-радикальной группы N0 с ге.мом ГЦ. Хотя эти соединения широко применяются в клинике, они обладают и рядом побочных эффектов, а также могут быть недостаточно эффективными в связи с развитием толерантности. Наличие побочных эффектов существующих препаратов органических нитратов диктует необходимость поиска новых сосудорасширяющих средств, :

Учитывая, что все органические нитраты оказывают терапевтический эффект благодаря биотрансформации до оксида азота, обнаружение эндогенного образования но открывает возможности создания новых сосудорасширяющих средств на основе изучения гуанилатциклаз-ной и ио-синтазной системДли разработки новых подходов в этом направлении была исследована возможность эндогенного образования оксида азота из аргинина в неактивированных тромбоцитах человека,- что ранее не было показано. Активность но- синтазы выявлялась по активации ГЦ в присутствии I- аргинина- субстрата I- аргиннн-N0 - синтазы. Чтобы подобрать условия для выявления активности ио-синтазы, варьировали содержание белка в пробе, время и температуру преинкубации и концентрацию х- аргинина. 'Эффект,оказываемый ь - аргинином на активность ГЦ, оказался нестабильным. Наиболее. выраженным он был при добавлении в пробу- ОД мМ 1- аргинина при содержании белка 40-50 мкг в 'пробе при проведении - ко -синтазной реакции с дальнейшим снижением его до 20-25 мкг при проведении , ' гуанилатциклазной. Стимулирующий эффект ь- аргинина зависел также от степени насыщенности ГЦ гейоы, условно определяемой по чувствительности к нитропруссиду натрия: чем выше была степень активации нитропруссидом, тем более выраженным был и эффект ъ - аргини- • на. Добавление кофакторов но- синтазной реакшга-0,1 мМ НАДФ.Н и

0,1 мкМ Са4^- повышало стимуляцию ГЦь- аргинином не более чем на .,30$, что могло быть связано с присутствием эндогенных НАДФ-Н и кальция в тромбоцитах в концентрациях, достаточных для проявления -активности N0- синтазы. Различий при проведении совместной ( одновременной ) и раздельной инкубации препарата, супернатанта 105000 е тромбоцитов человека с субстратами для гуанилатциклазной и ко-син-тазной реакции не выявлено ( данные не приводятся ). На основании полученных данных был сделан вывод, что в неактивированных тромбоцитах человека происходит эндогенное ферментативное образование оксцда азота из 1- аргинина. Полученные данные были использованы для разработки подходов к созданию новых антигипертензивных лекарственных препаратов.

Образование N0 из ь- аргинина высокоспецифично, и в настоящее , время не описан биосинтез КО из каких-либо производных или анало-. гов I,- аргинина. Согласно литературным данным, основным акцептором ВО 1п у1то являются эндогенные тиолы-цистеин, глутатион- в результате взаимодействия с которыми образуются нестойкие, нитрозотиолы, способствующие переносу оксвда азота на ГЦ. Развитие! толерантности' < к нитроглицерину при его длительном применении связывают с нехваткой эндогенных тиолов. Поэтому была поставлена задача использовать, соединения, содержащие в своей молекуле одновременно гуанидиновую и тиоловую группы. N0, генерируемый гуанидиновой группой, мог бы образовывать при взаимодействии с эн- группой внутримолекулярный нитрозотиол, способствующий переносу но на ГЦ и активации фермента. В качестве модели такого возможного вазодилятатора использова-', ли ашноэтилтиуроний , -применяемый в клинике как радиопротектор.■ Амияоэтилтиуроний обладает способностью в результате траногуаниди-новой перегруппировки в щелочных условиях превращаться в меркапто-этилгуанидин { Григорьев Н.Б..неопубликованные данные ) согласно схеме:

н^ -снг-снг-з-с^ нз^н^-тиц

ашноэтилтиуроний ' мзркаптоэтилсуанидет

■ Было обнаружено, что ашноэтилтиуроний обладает антигипертея-завным действием, .механизм-которого неизвестен. -В таблице 7 праве--дены результаты опытов по исследованию влияния а&жноэтилтиуронЕЯ на ГЦ супернатанта 105000с тромбоцитов человека.

* Аминоэтилтиуроний бил синтезирован1 Виноградом ЛД.,в' Химпкофар-гацевтнческом институте и любезно представлен нам для исследований .

Таблица 7. Влияние атноэтилтяурония на активность ГЦ тромбоцитов человека.

Активность ГЦ в % в присутствии добавок' в концентрации:

без добавок 0,001мМ О,ОМ О,МЛ 0,5мМ

Аминоэтилтиуроний 100 172+15 204+18 309+52 183+17

Состав инкубационной пробы см. Методы. Препарат ГЦ инкубировали с -аминоэтилтиуронием одновременно с субстратом для ГЦ в течение 15 мин. при 37®С. Аминоэтилтиуроний предварительно выдерживали 30 глин, при 37°С в 50 мМ трис-ОН, рН 10.

В сравнении с аминоэтилтиуронием активирующий эффект I- аргинина был всегда ниже ( данные не приводятся). На основании полученных результатов было предположено, что продукт трансгуанидиновой перегруппировки аминоэтилтиурония-меркаптозтилгуанидин~ может быть использован в качестве субстрата для генерирования эндогенного оксида азота, который в своп очередь реагирует с бн- группой меркап-тоэтилгуанидина с образованием внутримолекулярного нитрозотиола основного переносчика ко на ге?л ГЦ. Мы полагаем, что образование внутримолекулярного нитрозотиола обусловило больший стимулирующий эффект аминоэтилтиурония в сравнении с ъ- аргинином. Полученные данные позволяют также объяснить ранее неизвестный механизм сосудорасширяющего действия аминоэтилтиурония.

По-видимому, аминоэтилтиуроний - это один из первых лекарственных препаратов, сосудорасширяющий эффект которого реализуется согласно следующему механизму: •

вн ' о

.н5-сн2-сн2-нн-с/' но-синтеза нз-сно-ся^-нн-с^ +но -—-

— (Ш-с н2 -с Но -нн-с ^ ГЦ —- активация релансирующий эффект

ин2

Таким образом, полученные дан'ныэ позволяют цредлоаить новый подход к разработке и созданию сосудорасширяющих лекарственных средств с использованием разных структурных аналогов меркаптоэтялгуанидаяа и основанный на изучении растворимой ГЦ и но-синтазы.

Можно предположить, что применение подобных лекарственных препаратов не будет приводить к развития^ толерантности, возникающей К' органическим нитратам при их. длительнш применении и связанной с истощением эндогенных тилов.

ВЫВОДЫ

1. В результате ионнообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе 52 супернатанта 105000 % тромбоцитов человека получена растворимая гуанилатциклаза в гемдефицитной форме.

В процессе очистки выявлен гемсодержащий ингибитор белковой природы, снижающей активность частично-очищенного препарата гуани-латциклазы и восстанавливающий утерянную последним способность к • активации нитропруссидом натрия.

2. Растворимая гуанилатциклаза тромбоцитов, крысы присутствует в этих клетках изначально в геедефицитной форме. В отличие от,-обще-принятых представлений, гем не является простетической группой этого фермента. Гуанилатциклаза тромбоцитов крысы не может использоваться в качестве модели для изучения влияния ЫО-содеркащих соединений на тромбоцитарный фермент. .

3. Гуанилатциклаза тромбоцитов человека может изначально существовать и в гемдефицитной форме, это следует учитывать в случае недостаточной эффективности антиагрегационного действия нитровазсь-дилятаторов.

4. Установлено, что водорастворимый антиоксидант карнозин специфически тормозит только гемзависимую активацию растворимой ГЦ тромбоцитов нитропруссидом и не влияет на неспецифическую, не свя-

' занную с гемом активацию фермента. Карнозин может быть использован для выявления степени насыщенности фермента гемом.

5. Активация ГЦ нитрозокошлексаыи Со исг, не обладающими антигипертензивным действием, не связана с присутствие^ геш.

Для проявления гипотензивных свойств нитрозокомплексами переходных металлов необходим гемзависимый характер активации фермента и определенный заряд группы N0.

6. Аминоэтилтиуроний - известный радиопротектор, обладающий вазодалятаторным действием - активирует растворимую гуанилатцикла-зу в результате перегруппировки в ыеркаптоэтилгуанидан с последующий генерацией но и образованием внутримолекулярного нитрозотиола, Производные меркаптоэтилгуанйдина могут быть использованы в качестве основы для создания новых эффективных антигипертензивних лекарственных препаратов. ' -

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРГДИИ

1. Бусыгина О.Г., Лебедева Е.Л., Северина И.С. Эндогенный регулятор активности гуанилатциклазы тромбоцитов.-Тезисы У1 Всесоюзного симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций", Петрозаводск, 1988,-С.64.

2. Мирошниченко В.П., Бусыгина 0.1., Северина И.С. 'Сопостав-. ление сгойств гуанилатциклазы сердца и тромбоцитов крысы. - Тезисы У1 Всесоюзного симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций", Петрозаводск,-I&88, C.8I. '

3. Мирошниченко В.П., Бусыгина О.Г., Северина И.С. Аналогия и различие в свойствах растворимых форм гуанилатциклазы сердца и тромбоцитов крови красы// Вопр. мед. химий.-1989.-№4.-С.60-66.

4. Бусыгина О.Г., Северина И.,С. Эндогенный регулятор гуани-латщ-хлагчой активности тромбоцитов человека// Биохимия.-1990.-Т.55. ÂI0.-C.I8I2-Î8I8.

5. Бусыгина О-Г., Лебедева Е„Л», Себерина Й.С. Гуанилатцик-лаза тромбоцитов крысы при экспериментальной ишемии миокарда// . Вопр. мед. химии,-1990.-С.24-26. '

6. Severina I.F., Busygina O.G. Effect of carno s ine. on the activation of human platelet soluble guanylate cyclase by sodium

troprusside ana protoporphyrin 12 // Biochem.Inte'rnational. -I990.tV.22, ЯЗ.-P..455-465.

7. Бусыгина О.Г. . Северина й.С. Гевдефицитность растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов крысы// Биохимия,- 1991.- Т.56.

С.487-494.

8. Sevarîna I.S., Bueygina 0.0. Role of heme in the regulation of human and rat platelet soluble guanylate eyclaeeö// Biochem. International.-1991.-V.23. H6.-P.II43-II54.

■ 9. Мирощциченко В.П.. Бусыгина О.Г.. Демуров Е.А., Колосков КЗ. Б. Растворимая гуанилатцякяаза тромбоцитов а сердца крысы при экспериментальной ишемии миокарда// Кардиология.-1992.-Т.32.-С.64-66.

10. Северина И.С.» Бусыгина О.Г. Роль карйозина в функционировании растворимой гуанилатциклазы// Биохимия.-1992.-Т.57. ®3,-C.I330-I336.

11. Severine I.S., Bueygina O.G., Grîgorjev N.B. Effect of nitroso complexes of sorae transition netela on the activity of Boluble guanylate cyclase// Biochen.International.-1992.-V.26.H4.-P.695-705. •

1

Подпибано в печать«?£/0.43 3atu Щ-Форнат 60x84/16, Тир. (СО

Москва. Типография РЛСХН