Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов

Топалов, Николай Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов"

На правах рукописи

ТОПАЛОВ Николай Николаевич

Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

1 0

005042753

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении Гематологический научный центр Министерства Здравоохранения и Социального Развития РФ и в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении Науки Центр Теоретических Проблем Физико-химической Фармакологии РАН

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Пантелеев

Михаил Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Дудченко

Александр Максимович

доктор биологических наук Сарбаш

Василий Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН.

Защита диссертации состоится «3А> '¿<1?сЯ 2012 года в [Г часов на заседании Диссертационного совета Д.002.252. Учреждении Российской академии наук Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН: 119991,1 Москва, ул. Косыгина, д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦТП ФХФ РАН.

Автореферат разослан «.1М» р"~п 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук И.С.Николаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Тромбоциты - это безъядерные клетки крови, основной функцией которых является участие в свертывании крови, процессе, предотвращающем кровопотерю при повреждении кровеносного сосуда. Повреждение кровеносного сосуда приводит к активации каскада реакций плазменного гемостаза и тромбоцитов. Основные активаторы тромбоцитов это коллаген, обнажающийся при повреждении сосуда, тромбин, основной белок каскада плазменного гемостаза, АДФ и тромбаксан А2, секретируемые тромбоцитами в процессе активации. При активации тромбоцит может изменять форму, адгезировать к месту повреждения, агрегировать с другими тромбоцитами, секретировать различные вещества, формировать прокоагулянтную поверхность, содержащую фосфатидилсерин, и отделять микровезикулы.

Известно, что любая сильная активация тромбоцитов приводит к разделению тромбоцитов на две субпопуляции. Это так называемые укутанные и неукутанные тромбоциты. Поверхность укутанных тромбоцитов, в отличие от неукутанных, содержит фосфатидилсерин, такая поверхность необходима для существенного ускорения реакций плазменного звена системы гемостаза. Укутанные тромбоциты также характеризуются наличием альфа-гранулярных белков, связанных с поверхностью таких тромбоцитов, и дезактивацией интегрина аНЬрЗа, основного трансмембранного белка, обеспечивающего агрегацию тромбоцитов.

Механизмы формирования субпопуляций активированных тромбоцитов изучены недостаточно хорошо. Известно, что различная активация ведет к формированию различного количества укутанных тромбоцитов, что говорит о том, что тромбоциты изначально являются гомогенной популяцией и разделяются на субпопуляции именно в процессе активации. Также было показано, что секреция АДФ, но не тромбаксана А2, регулирует формирование укутанных тромбоцитов. Также известно, что добавление кальциевого ионофора А23187 ведет к экспрессии фосфатидилсерина всеми тромбоцитами суспензии, что говорит о вероятной роли кальциевой сигнализации в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов.

В данной работе изучалась роль кальциевой сигнализации в формировании укутанных тромбоцитов. Была разработана методика детекции кальция в субпопуляциях тромбоцитов, произведен сравнительный анализ флуоресцентных красителей, чувствительных к концентрации кальция в цитоплазме тромбоцитов. Произведен анализ кинетики кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов при различной активации.

В большинстве работ, посвященных изучению субпопуляций активированных тромбоцитов, тромбоциты активировались в концентрации более чем на порядок ниже

физиологической. Такой подход позволяет упростить экспериментальную модель, сведя к минимуму вклад секреции тромбоцитов и межклеточных взаимодействий. Таким образом, в данный момент существует необходимость детального изучения процессов, происходящих в тромбоцитах при их активации в физиологической концентрации, что, возможно, позволит прояснить ряд противоречий и выявить дополнительные механизмы, ведущие к экспрессии фосфатидилсерина при активации тромбоцитов.

Цель работы: Изучить свойства и механизмы формирования фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов в физиологических концентрациях.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальный внутриклеточный Са2+-флуорофор, подходящий для достоверной оценки изменений концентраций кальция, характерных для сильной активации тромбоцитов.

2. Исследовать кальциевую сигнализацию в тромбоцитах при использовании различных активаторов.

3. Исследовать зависимость кальциевой сигнализации и экспрессии фосфатидилсерина от концентрации активированных тромбоцитов.

4. Выявить механизмы, регулирующие экспрессию фосфатидилсерина при активации тромбоцитов в физиологической концентрации.

Научная новизна. При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях (2х108/мл-4х108/мл) впервые выявлена гетерогенность среди фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов. Помимо известной ранее фосфатидилсерин-положительной субпопуляции с устойчиво повышенной концентрацией внутриклеточного кальция, выявлена новая, также фосфатидилсерин-положительная субпопуляция с низкой концентрацией внутриклеточного кальция. Для тромбоцитов новой фосфатидилсерин-положительной субпопуляции характерны высокие значения прямого и бокового светорассеяния, способность связывать фибриноген/фибрин и наличие активного интегрина аПЬрЗа. Показано, что секреция тромбоцитов в процессе активации увеличивает количество тромбоцитов в обеих фосфатвдилсерин-положительных субпопуляциях, но не влияет на соотношение между ними. Показано, что тромбоциты новой субпопуляции формируются в результате межклеточных взаимодействий с участием интегрина аПЬрЗа. При снижении концентрации активируемых тромбоцитов ниже 5х107/мл, вновь выявленная вторая фосфатидилсерин -положительная субпопуляция не образуется.

результаты по-новому раскрывают роль межклеточных взаимодействий в процессе активации тромбоцитов. Также результаты, полученные в работе, дают новое представление о возможном дополнительном влиянии на гемостаз антагонистов интегрина allbß3a, использующихся в терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1) Концентрации кальция, наблюдаемые в тромбоцитах при сильной активации, находятся в пределах динамического диапазона флуоресцентного Са2+-флуорофора Fura Red. В отличие от Calcium Green-1, она может использоваться для исследования кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов крови.

2) Экспрессия фосфатидилсерина укутанными тромбоцитами сопровождается продолжительным увеличением концентрации кальция в цитоплазме.

3) При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях формируется новая субпопуляция тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, которая характеризуется:

а) низким уровнем внутриклеточного кальция

б) более высоким сигналом прямого и бокового светорассеяния, чем у укутанных тромбоцитов

в) поверхностью, покрытой фибриногеном

г) наличием активированного интегрина allbß3, в отличие от ранее описанных укутанных тромбоцитов.

4) Формирование этой субпопуляции прокоагулянтных тромбоцитов при физиологической концентрации обусловлено межклеточными взаимодействиями через интегрин allbp3 в процессе активации.

Апробация работы. Работа прошла апробации: 26 марта 2012 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Результаты диссертационной работы были представлены: 12-я международная школа-конференция "Биология наука XXI века" (Пущино, Россия, 10-14 ноября 2008), 36th FEBS Congress, (Турин, Италия, 25-30 июня 2011), XXIII Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH) (Киото, Япония, 23-28 июля 2011).

Публикации. По материалы диссертационной работы опубликовано 6 научных работ. Статей в рецензируемых журналах - 1; публикаций в трудах конференций и съездов — 5

Объем и струю-ура диссертации. Диссертация изложена на 83 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 - описание экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 88 источников. Работа выполнена на базе

Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф., д.б.н. Атауллаханов Ф.И.) и Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией к.б.н. Пантелеев М.А.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность исследуемой темы, обозначены основные проблемы в данной области, сформулированы цели и задачи, дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Она содержит сведения об активации тромбоцитов и о формировании субпопуляций тромбоцитов в процессе активации. Рассмотрены основные сведения о свойствах и механизмах формирования субпопуляций активированных тромбоцитов. Изложены основные представления о внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах. Отдельно подробно изложены основные методы, применяемые для исследования субпопуляций активированных тромбоцитов.

В главе 2 описываются материалы и методы, используемые в работе. В том числе приводятся все реактивы, использовавшиеся при проведении экспериментов, методики забора крови у доноров, выделения тромбоцитов при помощи центрифугирования и гель-фильтрации, загрузки тромбоцитов флуоресцентными красителями, чувствительными к концентрации кальция в цитоплазме. Подробно изложены методы окраски тромбоцитов различными антителами, активации тромбоцитов. Изложены основные принципы настройки параметров проточного цитометра, а также обработки результатов, полученных в результате анализа. Отдельно рассмотрены специфические методы, используемые для анализа кинетики формирования субпопуляций, а также для изучения роли секреции и межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций.

Загрузка тромбоцитов флуоресцентными красителями, чувствительными к концентрации внутриклеточного кальция

Для изучения кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов использовали метод загрузки флуоресцентными красителями, чувствительными к концентрации кальция (внутриклеточными Са2+-флуорофорами). В данной работе использовались два таких Са2+"флуорофора - Calcium Green-1 и Fura Red. Загрузку тромбоцитов этими Са2+-флуорофорами производили путем инкубации суспензии тромбоцитов (концентрация красителей 10 мкМ) в течение 30 минут в присутствии простагландина El (1 мкМ) и апиразы (0.1 ед./мл) перед гель-фильтрацией.

Окраска тромбоцитов меченными антителами, активация тромбоцитов

Для анализа свойств тромбоцитарных субпопуляций использовали метод флуоресцентного мечения. В работе использовании следующие типы окраски.

1) Окраска флуоресцеин- и фикоэритрин- меченным аннексином V. Окраску производили путем добавления в пробу 1% аннексина V непосредственно перед активацией тромбоцитов.

2) Окраска флуоресцеин- меченным антителом РАС-1. Окраску данным антителом производили после активации тромбоцитов путем инкубации в течение 3 минут (объемная концентрация антитела 10%) непосредственно перед измерением.

3) Окраска флуоресцеин- меченным поликлональныым антителом к фибриногену. Аналогично окраске антителом РАС-1, окраску антителом к фибриногену производили путем инкубации с антителом в течение 3 минут (объемная концентрация антитела 5%).

В работе использовались следующие типы активации тромбоцитов:

а) 10 нМ тромбина и 100 нг/мл конвульксина.

б) 100 нМ тромбина.

в) 150 мкМ SFLLRN и 100 нг/мл конвульксина.

г) 150 мкМ SFLLRN.

д) 300 мкМ AYPGKF.

е) 10 мкМ ионофора А23187.

Изучение роли секреции в формировании субпопуляций

Для изучения роли секреции в формирование субпопуляций тромбоцитов производился следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Са2+-флуорофором Fura Red, взятые в концентрации 2х108 мл"1 или 0,2х108 мл"1, окрашивали флуоресцеин-меченным аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 20 минут и анализировали на проточном цитометре. Аналогичная проба, содержащая тромбоциты в концентрации 2х108 мл'1, после 20 минут активации центрифугировалась в течение 5 минут при 400 g для осаждения тромбоцитов. Отбирался супернатант, содержащий тромбин и вещества, секретированные тромбоцитами, к нему добавлялись интактные тромбоциты в концентрации 0,2х108 мл"1, через 15 минут пробу анализировали на проточном цитометре. О роли секреции судили по изменению соотношения между тромбоцитами разных субпопуляций.

Изучение роли межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций

Для изучения роли межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций выполнялся следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные краской Fura Red, взятые в концентрациях 0,2х108 мл"1 или 2х108 мл'1, окрашивали меченным аннексином V и активировали 100 нМ тромбина в течение 15 минут. Для ингибирования межклеточных взаимодействий через гликопротеин Ilb-IIIa к тромбоцитам перед активацией добавляли его селективный ингибитор монафрам (300 мкг/мл). Для

увеличения вероятности взаимодействия тромбоцитов друг с другом, проба, содержавшая тромбоциты в концентрации 0,2х108 мл"1, в процессе активации подвергалась перемешиванию на шейкере со скоростью 300 об/мин.

Глава 3 содержит результаты работы.

Выбор оптимального Ca2*-флуорофора. Тромбоциты загружали Са2+-флуорофорами Calcium Green-1 или Fura Red перед помещением суспензии на колонку. Тромбоциты окрашивали флуоресцеин-меченным (для краски Fura Red) или фикоэритрин-меченным (для краски Calcium Green-1) аннексином V, активировали смесью тромбина и конвульксина либо ионофором А23187 и анализировали на проточном цитометре. Также анализировались неактивированные тромбоциты. На рисунках 1А и 1Б представлены типичные гистограммы распределений тромбоцитов разных субпопуляций по флуоресценции Са2+-флуорофоров Calcium Green-1 (А) и Fura Red (Б). В случае использования краски Calcium Green-1 оказалось, что флуоресценция краски как в укутанных, так и в неукутанных тромбоцитах совпадает с флуоресценцией тромбоцитов, активированных ионофором А23187. Это означает, что концентрации кальция, характерные как для укутанных, так и для неукутанных тромбоцитов, лежат вне предела динамического диапазона Са2+-флуорофора Calcium Green-1. На рисунке 1Б приведены аналогичные кривые для краски Fura Red. Как и для Calcium Green-1, флуоресценция Fura Red в укутанных тромбоцитах совпадает с флуоресценцией Fura Red в тромбоцитах, активированных ионофором А23187. Флуоресценция Fura Red в неукутанных тромбоцитах при этом лежит в промежутке между флуоресценцией в неукутанных тромбоцитах и в тромбоцитах, активированных ионофором А23187. Это означает, что концентрации кальция, характерные для неукутанных тромбоцитов, лежат в пределах динамического диапазона Са2+-флуорофора Fura Red.

Рис. 1. Выбор Са2+-флуорофора, чувствительного к концентрации кальция. Тромбоциты загружались флуоресцентными красителями Calcium Green-1 (А) и Fura Red (Б), окрашивались аннексином V, оставались интактными, либо активировались 100 нг/мл конвульксина и 10 нМ тромбина, либо 10 мкМ ионофора А23187 в течение 10 минут и анализировались на проточном цитометре. Представлены гистограммы распределения флуоресценции красок в субпопуляциях тромбоцитов. Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

Кинетика капьция в субпопуляциях активированных тромбоцитов

Для исследования кинетики кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов производился следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Са2+-флуорофором Fura Red, окрашивали флуоресцеин-меченным аннексином V, активировали различными веществами. Через заданные промежутки времени часть пробы отбиралась, разбавлялась и анализировалась на проточном цитометре.

Кинетика кальция в субпопуляциях тромбоцитах зависит от используемого вещества-активатора. В данной работе тромбоциты активировались тромбином (рис. 2А), активатором тромбинового PAR-1 рецептора SFLLRN (рис. 2Б), смесью тромбина и конвульксина (активатора коллагенового рецептора гликопротеина VI, рис. 2В), а также смесью SFLLRN и конвульксина (рис. 2Г). На данных графиках представлены временные зависимости флуоресценции Fura Red в субпопуляциях тромбоцитов. При любом типе активации наблюдается быстрый рост уровня кальция во всех тромбоцитах. Далее начинается разделение тромбоцитов на субпопуляции. При любом типе активации в укутанных тромбоцитах устанавливается высокий и стабильный уровень кальция (рис. 2А-Г). Кинетика кальция в неукутанных тромбоцитах зависит от используемого вещества-активатора. При активации тромбоцитов тромбином или SFLLRN уровень кальция в неукутанных тромбоцитах возвращается к исходному значению соответственно за 10 или 4 минуты (рис. 2А,Б); при активации смесью тромбина с конвульксином или SFLLRN с конвульксином в неукутанных тромбоцитах происходит стабилизация уровня кальция на промежуточном уровне (рис. 2В,Г). Кинетика формирования укутанных тромбоцитов также зависит от типа активации. На рисунке 2Д представлены типичные зависимости количества укутанных тромбоцитов от времени с момента активации. При любом типе активации количество укутанных тромбоцитов наиболее быстро растет в течение первых 4 минут после активации, к 10 минуте эксперимента формирование укутанных тромбоцитов завершается. Общее количество укутанных тромбоцитов зависит от типа активации: при активации тромбином или SFLLRN формируется 5-10% укутанных тромбоцитов, в то время как при активации смесью тромбина с конвульксином или SFLLRN с конвульксином формируется до 70% укутанных тромбоцитов. На рисунке 2.Е представлены гистограммы распределения флуоресценции Fura Red в неактивированных тромбоцитах (черный столбец), укутанных тромбоцитах (белые столбцы) и неукутанных тромбоцитах (серые столбцы) через 10 мин после активации. Представлены средние значения ± стандартные отклонения для экспериментов, выполненных на образцах крови различных доноров.

Рис. 2. Кинетика кальция в субпопуляциях активированных

тромбоцитов. Тромбоциты загружались флуоресцентным красителем Fura Red, окрашивались меченным аннексином V и активировались указанными веществами. А-Г - зависимости от времени средней флуоресценции краски Fura Red для тромбоцитов до разделения на субпопуляции (А), укутанных тромбоцитов (■) и неукутанных тромбоцитов (•). Д -кинетика формирования укутанных тромбоцитов при разной активации. Представлены данные типичного эксперимента (п=3). Е - средняя флуоресценция краски Fura Red в тромбоцитах до разделения на субпопуляции (черный столбец), укутанных тромбоцитов (белые столбцы) и неукутанных тромбоцитов (серые столбцы).

Третья субпопуляция активированных тромбоцитов и ее свойства В ходе изучения кальциевой сигнализации в субпопуляциях активированных тромбоцитов было выяснено, что, при активации тромбоцитов в их физиологической концентрации 2x108 мл"', помимо известных субпопуляций укутанных и неукутанных тромбоцитов, формируется ранее не описанная третья субпопуляция активированных тромбоцитов. На рисунке ЗА изображена точечная диаграмма флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и краски Fura Red (ось ординат) для тромбоцитов, активированных 100 нМ тромбина в течение 10 минут (концентрация тромбоцитов 2х108 мл"'). Видны субпопуляции укутанных и неукутанных тромбоцитов, а также тромбоцитов третьей субпопуляции, которые экспрессируют фосфатидилсерин и содержат низкий уровень внутриклеточного кальция.

006 -triple. st-contfo!

este: PI Тр0Мб0ЦИТЫ

неукутанные тромбоциты \ i

третьей субпопуляции

укутанные тромбоциты

прямое светорассеяние

008 S3-Fg

1 Gale Pt except (R? in PI)

антитело к фибриногену

GO?S2-РАС1 _ Gate: Pi excepHR? iii PI)

GO? s2- PAC1 Gate: (R7 in PI)

Рис. 3. Свойства субпопуляций активированных тромбоцитов.

Тромбоциты (2x10° мл"') загружались флуоресцентным красителем Fura Red, окрашивались

аллофикоцианин-меченным аннексином V и активировались 100 нМ тромбина. За 2 мин до анализа на проточном цитометре тромбоциты окрашивались

флуоресцеин-меченным антителом к фибриногену или флуоресцеин-меченным антителом РАС-1. А -точечная диаграмма флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и Fura Red (ось ординат). Представлены точечные диаграммы

флуоресценции Fura Red (Б-Ж, ось ординат) и прямого светорассеяния (Б, В, ось абсцисс), флуоресценции антитела к фибриногену (Г, Д, ось абсцисс) и антитела РАС-1 (Е, Ж, ось абсцисс) для субпопуляций неукутанных тромбоцитов (Б, Г, Е), а также укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции (В, Д, Ж). Представлены данные типичного эксперимента. п=3.

антитело РАС-1

На рисунках ЗБ-Ж представлены точечные диаграммы распределения тромбоцитов по прямому светорассеянию (рис. ЗБ,В, ось абсцисс), флуоресценции антитела к фибриногену (рис. ЗГ,Д, ось абсцисс) и антитела РАС-1 (рис. ЗЕ,Ж, ось абсцисс). По оси ординат на рисунках ЗБ-Ж отложена флуоресценция Fura Red. На левых панелях (рис.ЗБ,Г,Е) представлены значения для неукутанных тромбоцитов, на правых (рис. ЗВ,Д,Ж) - для укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции. Из рисунка 3 Б,В видно, что укутанные тромбоциты и тромбоциты третьей субпопуляции существенным образом отличаются по параметру прямого светорассеяния, в то время как неукутанные тромбоциты сильно распределены по этому параметру. Из рисунка 3 Г,Д видно, что укутанные тромбоциты и тромбоциты третьей субпопуляции, в отличие от неукутанных тромбоцитов, одинаково хорошо связывают антитело к фибриногену. Из рисунка 3.5. Е,Ж видно, что тромбоциты третьей субпопуляции связывают антитело РАС-1 так же хорошо, как и неукутанные тромбоциты, в отличие от укутанных тромбоцитов. Таким образом, тромбоциты третьей субпопуляции отличаются по параметру прямого светорассеяния от укутанных тромбоцитов. Тромбоциты третьей субпопуляции покрыты фибриногеном (или фибрином), что роднит их с укутанными тромбоцитами, однако имеют активный интегрин аНЬрЗа, что роднит их с неукутанными тромбоцитами.

Исследование роли секреции АДФ в формировании субпопуляций

Для изучения роли секреции АДФ в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов тромбоциты активировались 100 нМ тромбина в течение 10 мин в присутствии различных концентраций апиразы. На рисунке 4А представлен график зависимости количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации апиразы. Представлены средние значения ± стандартные отклонения для экспериментов, выполненных на образцах крови различных доноров (п=3). Видно, что добавление апиразы приводит к дозо-зависимому снижению количества как укутанных тромбоцитов, так и тромбоцитов третьей субпопуляции. На рисунке 4Б представлен график зависимости количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации, в которой активировались тромбоциты. Видно, что при увеличении концентрации тромбоцитов количество укутанных тромбоцитов практически не меняется, в то время как количество тромбоцитов третьей субпопуляции значительно возрастает.

укутанные тромбоциты —•—тромбоциты третьей субпопуляции

г12

ю 2

% 8 О

~~Ф-~укутанные тромбоциты г~

—■—тромбоциты третьей субпопуляции

0.0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 концентрация апиразы, ед.акт./мл

40 80 120 160 200 концентрация тромбоцитов, Х103 мкп'1

Рис. 4. Роль секреции АДФ в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов.

Тромбоциты 2x10е мл"' загружались флуоресцентным красителем Fura Red, окрашивались флуоресцеин-меченным аннексином V и активировались 100 нМ тромбина в течение 10 мин. А - зависимость количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субполуляции от концентрации апиразы. Б - зависимость количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации тромбоцитов в пробе. Представлены средние величины между экспериментами, выполненными на образцах крови различных доноров. п=3.

Исследование роли секреции в формировании субпопуляций

Для изучения роли секреции в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов был выполнен следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные флуорофором Fura Red, взятые в концентрациях 2х108 мл"1, или 0,2х108 мл"1, окрашивали флуоресцеин-меченным аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 20 минут и анализировали на проточном цитометре. Также готовилась аналогичная проба, содержащая тромбоциты, активированные в концентрации 2х108 мл"1. Тромбоциты осаждались при помощи центрифугирования на 400 g в течение 5 минут, отбирался супернатант, содержавший тромбин и вещества, секретированные тромбоцитами в процессе активации. К супернатанту далее добавляли тромбоциты в концентрации 0,2х108 мл"1, через 20 минут проба анализировалась на проточном цитометре. На рисунке 5 представлена гистограмма распределения количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции при различной активации. Видно, что при активации тромбоцитов в концентрации 0,2x108 мл"', супернатантом, а не тромбином, происходит пропорциональное увеличение как количества укутанных тромбоцитов, так и количества тромбоцитов третьей субпопуляции. Вещества, секретируемые тромбоцитами в процессе активации, увеличивают количество тромбоцитов обеих аннексин-положительных субпопуляций. Таким образом, секреция тромбоцитов в процессе активации не способна объяснить феномен существования третьей субпопуляции тромбоцитов при их активации в высокой концентрации.

количество тромбоцитов, %

0. 5, 10, 15, 20, 25 30,

контроль-^

¡укутанные тромбоциты ¡тромбоциты третьей субпопуляции

2x108тГ1

0,2x108тГ1

0,2x108тГ1 + супернатант

Рис. 5. Роль секреции в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов. Тромбоциты загружались флуоресцентным красителем Fura Red, окрашивались флуоресцеин-меченным аннексином V, активировались 100 нМ тромбина в течение 20 мин в концентрациях 0,2x10® мл"1 и 2x10е мл"1 и анализировались на проточном цитометре. Проба, содержащая тромбоциты, активированные в концентрации 2x10В мл"1, центрифугировалась при 400 g в течение 5 мин. Отбирался супернатант, к нему добавлялись тромбоциты в концентрации 0,2x10е мл'1, инкубировались в течение 20 мин и анализировались на проточном цитометре. Представлены средние значения количеств укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции между экспериментами, выполненными на крови различных доноров. п=3.

Исследование роли межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций Поскольку секреция не способна объяснить формирование третьей субпопуляции тромбоцитов при их активации в высокой концентрации, была выдвинута гипотеза о роли межклеточных взаимодействий в формировании третьей субпопуляции активированных тромбоцитов. Для проверки этой гипотезы был выполнен следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Са2+-флуорофором Fura Red, взятые в концентрациях 2х108 мл'1 или 0,2х108 мл'1, окрашивали флуоресцеин-меченным аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 10 минут и анализировали на проточном цитометре. Аналогичная проба, содержавшая тромбоциты в концентрации 0,2х108 мл"1, подвергалась перемешиванию на шейкере на 300 об/мин в процессе активации, и/или перед активацией в нее добавлялся селективный блокатор интегрина

аПЬрЗа монафрам. На рисунке 6 представлена гистограмма распределения количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции при различной активации. Видно, что перемешивание тромбоцитов в процессе активации приводит к перераспределению тромбоцитов между субпопуляциями: число укутанных тромбоцитов снижается, а количество тромбоцитов третьей субпопуляции возрастает. Из рисунка 6 также видно, что добавление монафрама полностью блокирует эффект перераспределения тромбоцитов между субпопуляциями. Данный результат свидетельствует о роли сигнализации через интегрин аПЬрЗа в формировании тромбоцитов третьей субпопуляции. Таким образом, межклеточные взаимодействия через интегрин аПЬрЗа в процессе активации приводят к формированию тромбоцитов третьей субпопуляции при активации тромбоцитов в высокой концентрации.

Неактивированные

2x108ml"1

0.2x108тГ1 0.2x108ml"\ тряска 0.2x108тГ\ монафрам

0.2x108тГ1, тряска + монафрал

количество тромбоцитов, %

5 10 15, 20,

укутанные тромбоциты тромбоциты третьей субпопуляции

Рис. 6. Роль межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов. Тромбоциты загружались флуоресцентным красителем Fura Red, окрашивались флуоресцеин-меченным аннексином V, активировались 100 нМ тромбина в течение 10 мин в концентрациях 20000 мкл"1 и 200000 мкл"1 и анализировались на проточном цитометре. В пробу, содержащую тромбоциты в концентрации 20000 мкл"1 добавлялся монафрам и/или проба подвергалась встряхиванию на шейкере при 300 об/мин в процессе активации. Представлены средние значения количеств укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции между экспериментами, выполненными на крови различных доноров. п=3.

Глава 4 посвящена обсуждению основных результатов работы.

Целью данной работы было изучение свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов. Была разработана методика детекции кальция в цитоплазме сильно активированных тромбоцитов, изучена кинетика кальция в субпопуляциях тромбоцитов. Также в работе было показано существование третьей субпопуляции активированных тромбоцитов, изучены ее свойства и механизмы формирования.

В данной работе была разработана методика детекции кальция в тромбоцитах при их сильной активации. Выяснилось, что краска Calcium Green-1, идеально подходящая для изучения кальциевой сигнализации в тромбоцитах при активации АДФ, не подходит для случая сильной активации. Было доказано, что экспрессия фосфатидилсерина укутанными тромбоцитами всегда сопровождается сильным и продолжительным ростом уровня кальция в цитоплазме. Этот результат в совокупности с известными литературными данными позволяет предположить, что формирование укутанных тромбоцитов - процесс, по своей природе сходный с апоптозом и некрозом.

В данной работе впервые показано существование третьей субпопуляции активированных тромбоцитов, формирующейся при сильной активации тромбоцитов в их физиологической концентрации. Эта субпопуляция уникальным образом сочетает прокоагулянтную активность и способность к агрегации, что позволяет предположить ее исключительную важность в гемостазе и тромбозе. Важно отметить, что условия in vitro, в которых формируется эта субпопуляция, гораздо ближе к физиологическим, нежели условия, в которой эти тромбоциты не формируются. Тот факт, что формирование этой субпопуляции регулируется межклеточными контактами в процессе активации тромбоцитов, позволяет предположить, что в условиях in vivo, когда тромбоциты доставляются потоком и прикрепляются к растущему сгустку, третья субпопуляция тромбоцитов играет определяющую роль.

Еще одним важным аспектом работы является то, что тромбоциты третьей субпопуляции способны экспрессировать фосфатидилсерин, сохраняя низкий уровень внутриклеточного кальция. Этот факт позволяет предположить, что экспрессия фосфатидилсерина такими тромбоцитами происходит благодаря неизвестным ранее сигнальным процессам, запускаемым активированным интегрином allbß3a. Возможно, данный процесс имеет общие черты с запрограммированной клеточной гибелью вследствие апоптоза.

Изложенные в работе результаты позволяют по-новому взглянуть на процессы, происходящий при тромбообразовании. Межклеточные контакты, помимо возможности тромбоцитам формировать агрегат около места повреждения сосуда, также обеспечивают мощную поддержку росту тромба, поддерживая формирование тромбоцитов третьей субпопуляции. Таким образом, блокирование интегрина allbß3a

антагонистами, часто использующимися в клинической практике, может регулировать не только агрегацию тромбоцитов, но и генерацию тромбина благодаря снижению численности прокоагулянтных тромбоцитов третьей субпопуляции.

ВЫВОДЫ

а) низким уровнем внутриклеточного кальция

б) более высоким сигналом прямого и бокового светорассеяния, чем у укутанных тромбоцитов

в) поверхностью, покрытой фибриногеном

г) наличием активированного интегрина аНЬрЗ, в отличие от ранее описанных укутанных тромбоцитов.

4) Формирование этой субпопуляции прокоагулянтных тромбоцитов при физиологической концентрации обусловлено межклеточными взаимодействиями через интегрин аНЬрЗ в процессе активации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Топалов Н.Н., Котова Я.Н., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А., Роль кальциевой сигнализации в формировании "укутанных" тромбоцитов, Абстракт 12-й международной школы-конференции "Биология наука XXI века", Пущино, Россия, 1014 ноября 2008, стр. 109-110.

2. I. D. Tarandovskiy, М. A. Panteleev, Е. I.Sinauridze, N. N. Topalov, Е. О. Artemenko, N. A. Podoplelova and F. I. Ataullakhanov Appearance of the second thrombin peak on thrombin generation curve in platelet rich plasma depends on phosphatidylserine expression during platelet activation, Abstract of 36th FEBS Congress, Torino, Italy, 25-30 June 2011, p. 292.

3. N. N. Topalov, Y. N. Kotova, S. A. Vasil'ev and M. A. Panteleev, Identification of signal transduction pathwaysinvolved in the formation of platelet subpopulations during activation, Abstract of 36th FEBS Congress, Torino, Italy, 25-30 June 2011, p. 365.

4. Ivan Dmitrievitsh Tarandovskiy, Mikhail Panteleev, Elena Sinauridze, Nikolai

Topalov, Elena Artemenko, Nadejda Podoplelova, Fazoil Ataullakhanov, FORMATION OF THE SECOND PEAK IN PLATELET-RICH PLASMA THROMBIN GENERATION CURVE IS LINKED WITH PHOSPHATIDYLSERINE EXPRESSION DURING PLATELET ACTIVATION, Abstracts of XXIII Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH), Kyoto, July 23-28,2011.

5. Nikolay N. Topalov, Yana N. Kotova, Sergey A. Vasil'ev, Mikgail A. Panteleev, IDENTIFICATION OF SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAYS INVOLVED IN THE FORMATION OF PLATELET SUBPOPULATIONS DURING ACTIVATION, Abstracts of XXIII Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH), Kyoto, July 23-28,2011.

6. Nikolai N. Topalov, Yana N. Kotova, Sergey A. Vasil'ev, Mikhail A. Panteleev, Identification of signal transduction pathways involved in the formation of platelet subpopulations upon activation, British Journal of Haematology, Volume 157, Issue 1, pages 105-115, April 2012.

Подписано в печать:

20.04.2012

Заказ № 7241 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Топалов, Николай Николаевич, Москва

61 12-3/937

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ У ЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИИ РАН

На правах рукописи

ТОПАЛОВ Николай Николаевич

Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов

Специальность 03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор М.А. Пантелеев

Москва 2012

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................9

Тромбоциты..........................................................................................................9

Свертывание крови..............................................................................................9

Активация тромбоцитов..................................................................................10

Основные виды ответов тромбоцитов при активации................................11

Рецепторы тромбоцитов и основные пути внутриклеточной сигнализации

в тромбоцитах...................................................................................................15

Кальциевая сигнализация в тромбоцитах.......................................................19

Субпопуляции активированных тромбоцитов...............................................21

Методики изучения субпопуляций активированных тромбоцитов.............29

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................................35

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................................................36

Материалы. В работе использовались следующие материалы....................36

Выделение тромбоцитов..................................................................................37

Загрузка тромбоцитов флуоресцентными красителями, чувствительными

к концентрации внутриклеточного кальция...................................................37

Окраска тромбоцитов меченными антителами...........................................37

Активация тромбоцитов..................................................................................38

Проточная цитометрия. Настройка параметров прибора.........................39

Изучение кинетики формирования субпопуляций...........................................40

Изучение роли секреции в формировании субпопуляций................................40

Изучение роли межклеточных взаимодействий в формировании

субпопуляций.......................................................................................................41

Обработка полученных результатов..............................................................41

РЕЗУЛЬТАТЫ........................................................................................................44

Подбор краски, чувствительной к концентрации кальция...........................44

Кинетика кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов...........45

Существование третьей субпопуляции активированных тромбоцитов. ..49 Кинетика формирования субпопуляций активированных тромбоцитов....50

Исследование свойств тромбоцитарных субпопуляций...............................52

Исследование роли секреции АДФ в формировании субпопуляций...............53

Исследование роли секреции в формировании субпопуляций........................56

Исследование роли межклеточных взаимодействий в формировании

субпопуляций.......................................................................................................57

ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................................60

ВВЕДЕНИЕ

Тромбоциты - это безъядерные клетки крови, основной функцией которых является участие в свертывании крови, процессе, предотвращающем кровопотерю при повреждении кровеносного сосуда. Повреждение кровеносного сосуда приводит к активации системы гемостаза, включающей плазменное и тромбоцитарное звенья. Основные активаторы тромбоцитов это коллаген, высвобождающийся при повреждении сосуда, тромбин, ключевой белок каскада плазменного гемостаза, АДФ и тромбоксан А2, секретируемые тромбоцитами в процессе активации. При активации тромбоцит может изменять форму, подвергаться адгезии в месте повреждения, агрегировать с другими тромбоцитами, секретировать различные вещества, формировать прокоагулянтную поверхность, содержащую фосфатидилсерин, и отделять микровезикулы.

Интактные тромбоциты, как и большинство других клеток человека, поддерживают асимметрию плазматической мембраны. Отрицательно заряженные фосфолипиды фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин АТФ-зависимым образом переносятся с внешнего слоя мембраны на внутренний при помощи специфичных фосфолипидтранслоказ и флипазы. Однако в тромбоцитах эти ферменты не обнаружены. Также существуют указания на то, что в определенных условиях осуществляется обратный АТФ-зависимый перенос отрицательно заряженных фосфолипидов на внешний слой плазматической мембраны, однако фермент, который мог бы быть в этом задействован (уже названый скрамблазой), до сих пор не выявлен.

Способность тромбоцитов экспрессировать фосфатидилсерин на внешнем слое мембраны является чрезвычайно важной для сбалансированного функционирования всей системы гемостаза, поскольку фосфатидилсерин в составе мембраны обеспечивает нормальную работу многих белков плазменного гемостаза, значительно ускоряя их реакции. Пациенты с синдромом Скотта, врожденной патологией тромбоцитов, при

которой нарушаются механизмы экспрессии фосфатидилсерина, страдают от кровоточивости.в результате снижения активности теназного и протромбиназного комплексов. Таким образом, изучение процессов внутриклеточной сигнализации, регулирующих экспрессию фосфатидилсерина тромбоцитами, представляется важной и актуальной задачей.

Известно, что только сильные активаторы, такие как тромбин и коллаген, приводят к экспрессии фосфатидилсерина и разделению всех тромбоцитов на две субпопуляции, обладающие различными свойствами. Формируется субпопуляция так называемых укутанных тромбоцитов, которые экспрессируют фосфатидилсерин и связывают различные белки альфа-гранулярного происхождения. Именно укутанные тромбоциты обладают прокоагулянтными свойствами и существенно ускоряют реакции плазменного гемостаза.

Очень мало известно о механизмах формирования субпопуляций тромбоцитов. Показано, что добавление различных активаторов в различных дозах in vitro ведет к формированию разного числа укутанных тромбоцитов, что говорит о том, что гетерогенность тромбоцитов развивается именно в процессе активации. Существует ряд косвенных свидетельств участия различных митохохондриальных процессов и кальциевой сигнализации в экспрессии фосфатидилсерина. Одной важной и загадочной деталью, касающейся укутанных тромбоцитов, является тот факт, что интегрин аПЬрЗа, основной белок, обеспечивающий агрегацию тромбоцитов, в них, в отличие от неукутанных тромбоцитов, не активен. Несмотря на большое количество противоречивых данных об агрегации тромбоцитов различных субпопуляций, в настоящее время появляется все больше указаний на сниженную агрегационную способность укутанных тромбоцитов.

В большинстве работ, посвященных изучению субпопуляций активированых тромбоцитов, использовались достаточно сильно разбавленные препараты тромбоцитов, в которых концентрация тромбоцитов

составляла около 1х107/мл, что на порядок ниже их физиологической концентрации. Таким образом, в данный момент существует необходимость детального изучения процессов, происходящих в тромбоцитах при их активации в физиологической концентрации, что, возможно, позволит прояснить ряд противоречий и выявить дополнительные механизмы, ведущие к экспрессии фосфатидилсерина при активации тромбоцитов. В этой связи данная работа посвящена исследованию экспрессии фосфатидилсерина при активации тромбоцитов в физиологической концентрации.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальный внутриклеточный Са -флуорофор, подходящий для достоверной оценки изменений концентраций кальция, характерных для сильной активации тромбоцитов.

2. Исследовать кальциевую сигнализацию в тромбоцитах при использовании различных активаторов.

Научная новизна. При активации тромбоцитов в физиологических

Я Я

концентрациях (2x10 /мл-4><10 /мл) впервые выявлена гетерогенность среди ФС-положительных тромбоцитов. Помимо известной ранее ФС-положительной субпопуляции с устойчиво повышенной концентрацией внутриклеточного кальция, выявлена новая, также ФС-положительная субпопуляция с низкой концентрацией кальция, не превышающей уровня, характерного для неактивированных тромбоцитов. Для тромбоцитов новой

ФС-положительной субпопуляции характерны высокие значения прямого и бокового светорассеяния, способность связывать фибриноген/фибрин и наличие активного интегрина allbß3a. Показано, что секреция тромбоцитов в процессе активации увеличивает количество тромбоцитов в обеих ФС-положительных субпопуляциях, но не влияет на соотношение между ними. Показано, что тромбоциты новой субпопуляции формируются в результате межклеточных взаимодействий с участием интегрина allbß3a. При снижении

концентрации активируемых тромбоцитов ниже 5x107мл, вновь выявленная вторая ФС-положительная субпопуляция не образуется.

Научно-практическое значение. Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на роль активации тромбоцитов в свертывании крови. Тромбоциты вновь открытой субпопуляции, сочетающие прокоагулянтные и агрегационные способности, представляются наиболее важными участниками свертывания крови. Полученные результаты по-новому раскрывают роль межклеточных взаимодействий в процессе активации тромбоцитов. Также результаты, полученные в работе, дают новое представление о возможном дополнительном влиянии на гемостаз антагонистов интегрина allbß3a, использующихся в терапии сердечнососудистых заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

а) низким уровнем внутриклеточного кальция

б) более высоким сигналом прямого и бокового светорассеяния, чем у укутанных тромбоцитов

в) поверхностью, покрытой фибриногеном

г) наличием активированного интегрина аПЬрЗ, в отличие от ранее описанных укутанных тромбоцитов.

4) Формирование этой субпопуляции прокоагулянтных тромбоцитов при физиологической концентрации обусловлено межклеточными взаимодействиями через интегрин аПЬрЗ в процессе активации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Тромбоциты

Тромбоциты - это безъядерные клетки крови, циркулирующие в крови в концентрации 180 000-320 000 мкл"1. Тромбоциты имеют дисковидную форму с характерным диаметром 2-4 мкм. Тромбоциты формируются в красном костном мозге, отделяясь от клеток-предшественников мегакариоцитов, циркулируют в кровотоке в течение 2-10 дней с момента образования, после чего удаляются из кровотока посредством фагоцитоза в селезенке и печени.

Основной функцией тромбоцитов является препятствование кровопотере при повреждении кровеносного сосуда. Также тромбоциты участвуют в регенерации поврежденных тканей, секретируя факторы роста, стимулирующие рост и деление поврежденных клеток.

Свертывание крови

Свертывание крови - это комплекс ответов организма, препятствующих кровопотере при повреждении кровеносного сосуда. Этот процесс принято условно разделять на три составляющие: сосудистый гемостаз, обеспечивающий сужение кровеносного сосуда в месте повреждения, тромбоцитарный гемостаз, состоящий в активации тромбоцитов и их адгезии в месте повреждения, и плазменный гемостаз, состоящий в образовании фибринового сгустка \

Плазменный гемостаз представляет собой каскад реакций, в которых принимают участие растворимые белки плазмы крови, сериновые протеиназы, называемые факторами свертывания. Данный каскад реакций инициируется особым трансмембранным белком тканевым фактором, который присутствует на поверхности практически всех клеток организма, за исключением эндотелия, непосредственно контактирующего с кровотоком. Каскад реакций приводит к преобразованию неактивного белка протромбина в тромбин, являющийся центральным элементом плазменного гемостаза. Тромбин расщепляет растворимый белок фибриноген с образованием

нерастворимого фибрина, который, полимеризуясь, образует фибриновую сеть, препятствующую кровопотере.

Тромбоцитарный гемостаз состоит в активации тромбоцитов и их адгезии в месте повреждения. Повреждение сосуда приводит к высвобождению коллагена, который является сильнейшим активатором тромбоцитов. Новые тромбоциты, принесеные кровотоком к месту повреждения, участвуют в агрегации, что препятствует кровопотере.

Разделение гемостаза на отдельные составляющие является достаточно условным, все три системы неразрывно связаны друг с другом. Так, тромбин является сильным активатором тромбоцитов, а секреция тромбоцитов в процессе активации способствует сужению просвета сосуда. Кроме того, ключевую роль в плазменном гемостазе играют комплексы внутренней теназы (комплекс факторов 1Ха-ХШа) и протромбиназы (комплекс факторов Ха-Уа), ферментативная активность которых возрастает в 3-5 раз в присутствии мембранной поверхности, предоставляемой активированными тромбоцитами 2. Стоит также отметить, что различные звенья играют более или менее важную роль в гемостазе в зависимости от размера сосуда и скорости кровотока.

Активация тромбоцитов

В условиях целостности кровеносного сосуда тромбоциты циркулируют в крови в неактивированном состоянии, однако, по своей природе тромбоциты способны реагировать на малейшие нарушения целостности кровеносного русла. Существует огромное количество веществ и факторов, способных переводить тромбоцит в активированное состояние, вплоть до простого механического воздействия или изменения температуры .

Среди многообразия этих факторов можно выделить основные вещества, способные активировать тромбоциты. Выделяют четыре главных активатора тромбоцитов. Наиболее сильные из них - коллаген и тромбин, другие два -это АДФ и тромбоксан А2 . Коллаген - это основной белок соединительной ткани человека, обеспечивающий ее прочность и эластичность . При

повреждении кровеносного сосуда волокна коллагена приходят в контакт с кровью, что приводит к адгезии тромбоцитов и их последующей активации. Сериновая протеиназа тромбин представляет собой ключевой элемент всего гемостаза, поскольку соединяет в себе функции главного фермента плазменного свертывания, расщепляющего фибриноген с образованием фибрина, и сильного активатора тромбоцитов. АДФ в высочайшей концентрации содержится в плотных гранулах тромбоцитов и секретируется во внеклеточное пространство в процессе их активации. В крови присутствуют ферменты, которые в дальнейшем расщепляют АДФ до АМФ и, таким образом, предотвращают возможную активацию тромбоцитов вне места повреждения. Тромбоксан А2 синтезируется в тромбоцитах в процессе их активации из арахидоновой кислоты и в дальнейшем выбрасывается во внеклеточное пространство.

Помимо описанных выше физиологических активаторов существует большое количество нефизиологических, которые в основном применяются в экспериментах in vitro. Одно из таких веществ это конвульксин, выделяемый из яда змеи, который способен активировать главный коллагеновый рецептор тромбоцитов гликопротеина VI4. Также существуют пептиды SFLLRN и AY-NH2, активирующие отдельные тромбиновые PAR-рецепторы, стабильный аналог тромбоксана А2 U46619, а также кальциевые ионофоры, вызывающие вход ионов кальция через плазматическую мембрану в цитоплазму тромбоцитов 5"7.

Основные виды ответов тромбоцитов при активации

Активация тромбоцита - это сложный комплекс внутриклеточных

сигнальных процессов, которые в конечном счете приводят к тем или иным

ответам. Стоит отметить, что различная активация ведет к различным

ответам тромбоцитов. Эти ответы можно условно разделить на более и менее

значительные: некоторые из этих ответов проявляются и при относительно

2 ^

слабой активации, а какие-то требуют более сильной активации . При всей

условности такой градации, ответы тромбоцитов перечислены ниже в порядке увеличения значимости.

1) Изменение формы. В интактном состоянии тромбоцит имеет характерную дисковидн

Информация о работе