Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов"

На правах рукописи

¿¿а

Абаева Анастасия Александровна

МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ БЕЛКОВОГО ПОКРЫТИЯ НА ПОВЕРХНОСТИ ПРОКОАГУЛЯНТНЫХ ТРОМБОЦИТОВ

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

|с >.г:6 2015

005557473

005557473

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской

академии наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

Пантелеев Михаил Александрович

Официальные оппоненты: Васильев Сергей Александрович,

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, заведующий научно-клинической лаборатории клинической коагулологии

Нечипуренко Дмитрий Юрьевич, кандидат физико-математических наук, кафедра биофизики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, старший научный сотрудник

Ведущая организация: ФГБУН «Институт биохимической

физики им. Н. М. Эмануэля» Российской академии наук

Защита диссертации состоится «05» февраля 2015 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.252.01 при ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН по адресу: г. Москва, ул. Саморы Машела, д.1, ГСП-7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН.

Автореферат разослан « 1С » 7 _2014 года

Ученый секретарь диссертационнрго совета,

доктор медицинских наук ¿^¡¿¿¿¿-¿р,^ Николаева Ирина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Свертывание крови представляет собой сложную сеть биохимических реакций, активирующихся при нарушении целостности сосудистой системы. Целью работы системы свертывания является остановка кровотечения.

Неотъемлемыми участниками свертывания крови являются специализированные клетки крови - тромбоциты, способные к активации. Будучи активированными, они участвуют в процессе свёртывания посредством формирования тромбоцитарного агрегата в месте повреждения, а также в ускорении плазменного свертывания, путем предоставления своей отрицательно заряженной фосфолипидной поверхности для сборки ферментативных комплексов.

Не так давно было обнаружено, что при активации тромбоцитов двумя физиологическими агонистами (тромбином и коллагеном), образуются две отличные группы тромбоцитов, одна из которых характеризуется появлением на внешней мембране фосфатидилсерина и плотного слоя из а-гранулярных белков [Dale G.L. et al. 2002; Dale G.L. 2005]. Рядом ученых было показано, что основные реакции свертывания крови, такие как сборка комплекса протромбиназы и внутренней теназы, происходят на поверхности именно этой субпопуляции тромбоцитов, то есть они более прокоагулянтны. Несмотря на то, что гетерогенность тромбоцитов была открыты более 10 лет назад [Alberio L. et al. 2000; Dale G.L. et al. 2002] механизмы формирования и удерживания белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, как и его функции, до сих пор слабо изучены.

Недавние исследования показали, что именно благодаря фибриногену, входящему в состав этого покрытия, прокоагулянтные тромбоциты способны встраиваться в агрегаты [Yakimenko, А. О. et al. 2012], несмотря на отсутствие на их поверхности активной формы интегрина allbp [Dale G.L. et al. 2002, Mattheij N.J. et al. 2013]. Поэтому изучение механизмов формирования прокоагулянтных тромбоцитов, а также удерживания белкового покрытия на их поверхности становится чрезвычайно важным. Одним из главных механизмов формирования белковой покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов предполагалась трансглутаминазная реакция [Dale G.L. et al. 2002]. Так, Дж. JI. Дейл с коллегами продемонстрировали в своей работе, что а-гранулярные белки являются субстратами для тромбоцитарных трансглутаминаз (тканевая трансглутаминаза и фактор ХШа). Они показали, что использование ингибиторов трансглутаминаз приводит к блокированию образования прокоагулянтных тромбоцитов, что свидетельствует о возможной роли фактора XIHa и тканевой трансглутаминазы в формировании прокоагулянтных тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002].

Кроме того, также существует основание полагать, что белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов возникает за счет полимеризации фибрина под действием тромбина и пассивного вовлечения остальных белков в нити фибрина [Munnix I.C. et al. 2009].

Цель данной работы: исследование механизмов формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов.

Задачи исследования:

1. Исследовать роль трансглутаминаз, а также полимеризации фибрина в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, ответственной за их вовлечение в агрегаты;

2. Разработать метод, позволяющий количественно характеризовать прокоагулянтную активность тромбоцитов;

3. Исследовать роль тканевой трансглутаминазы в формировании прокоагулянтной активности тромбоцитов.

Научная новизна. В настоящей работе был выявлен механизм формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Показано, что определяющую роль в формировании этого покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, играет полимеризация фибрина. Тканевая трансглутаминаза способна формировать покрытие из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако значимость этого механизма при активации тромбоцитов тромбином меньше, чем роль полимеризации. Также было разработано два метода количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов. Их суть заключалась в сборке ферментативных комплексов на поверхности активированных тромбоцитов: внутренней теназы или протромбиназы и измерении концентраций факторов Ха или Па, соответственно, активированных этими комплексами из предшественников. С помощью метода, основанного на сборке комплекса внутренней теназы, было показано, что добавление тканевой трансглутаминазы при активации или после нее не меняет прокоагулянтную активность тромбоцитов. При этом количество прокоагулянтных тромбоцитов при добавлении тканевой трансглутаминазы во время их активации остается неизменным.

Научно-практическим значением результатов данной работы является вклад в понимание свойств субпопуляций активированных тромбоцитов и их (пато)физиологической роли. Результаты данной работы могут быть использованы для создания новых методов антитромботической терапии, в диагностике тромбоцитопатий, а также иных нарушений гемостаза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полимеризация фибрина играет определяющую роль в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов.

2. Трансглутаминазы способны формировать белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако значимость этого механизма при активации тромбоцитов тромбином меньше, чем роль полимеризации.

3. Разработано два метода, позволяющих количественно характеризовать прокоагулянтную активность тромбоцитов, основанных на сборке ферментативных комплексов протромбиназы и внутренней теназы на поверхности активированных тромбоцитов.

4. Тканевая трансглутаминаза не влияет на прокоагулянтную активность тромбоцитов, а также не влияет на количество прокоагулянтных тромбоцитов.

Апробация работы состоялась 11 августа 2014 года на заседании межлабораторного семинара Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской академии наук.

Результаты диссертационной работы были представлены на International conference «54th Congress of the Gesellschaft für Thrombose und Hämostaseforschung» (Нюрнберг, Германия, 24 - 27 февраля, 2010), IV Съезде Биофизиков России (Нижний Новгород, Россия, 20-26 августа, 2012), XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Амстердам, Голландия, 29 июня - 4 июля, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 публикаций. Статей в рецензируемых журналах - 5; публикаций в трудах конференций и съездов - 3.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 88 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 - описания экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 74 источника. Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской академии наук в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией проф., д.ф.-м.н. Пантелеев М.А.).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность исследуемой темы, сформулированы цели и задачи исследования, дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Приведены основные сведения о гемостазе, функциях тромбоцитов и видах их ответов на активацию. Описаны феномен гетерогенности активированных тромбоцитов и основные свойства субпопуляций активированных тромбоцитов, а также возможные механизмы формирования и удерживания покрытия из белков на их поверхности. Кратко рассмотрены основные реакции свертывания, происходящие на поверхности активированных тромбоцитов. Также описано влияние температуры на ферментативную активность этих реакций. Описан класс белков — трансглутаминаз, а также подробно рассмотрены трансглутаминазы, секретируемые тромбоцитами -тканевая трансглутаминаза и фактор XIII.

В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в работе. Помимо специфических методов, использующихся в работе и кратко изложенных ниже, приведены все реактивы, использовавшиеся при проведении экспериментов, методика выделения тромбоцитов из крови доноров с помощью центрифугирования и гель-фильтрации, методика получения свободной от тромбоцитов плазмы, процедура титрования активных сайтов тромбина. Описаны принципы проточной цитометрии.

Проточная цнтометрня

Исследование формирования покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов.

Тромбоциты в указанных концентрациях активировались путем инкубации с агонистами в буфере А с 2,5 мМ СаС12 в течение 15 мин. в присутствии флуоресцентно меченных антител, разводили в 10 раз буфером А с 2,5 мМ СаС12 и анализировали на проточном цитометре Accuri С6 (Accuri Cytometers, Ann Arbor, MI, USA) или FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Полученные данные затем обрабатывались в программе CFlow software (Accuri Cytometers) или WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Для каждой пары используемых вместе флуоресцентных меток проводили процедуру компенсации.

Планшетный спектрофотометр

Метод измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов по ускорению активации фактора X комплексом внутренней теназы

Тромбоциты в концентрации 100тыс/мкл активировали путем инкубации с агонистами в буфере А с 2,5 мМ СаСЬ в течение 14 мин.

Для выяснения роли тканевой трансглутаминазы в формировании прокоагулянтной активности тромбоциты активировались конвульксином (100 нг/мл) в присутствии или отсутствии тканевой трансглутаминазы (500 нМ) сразу, либо она добавлялась через 9 мин после начала активации тромбоцитов.

Далее на поверхности активированных тромбоцитов, для того чтобы наблюдать изменение прокоагулянтной активности тромбоцитов в зависимости от активатора тромбоцитов, собирался комплекс внутренней теназы - смесь со следующими концентрациями компонентов: активированные тромбоциты - 8тыс/мкл, СаС12 - 2.5 мМ, фактор Villa - 27.5 нМ, фактор 1Ха - 10 нМ, фактор X - 400 нМ, РРАСК - 2000 нМ (1). Вышеуказанная смесь состояла из трех подсмесей: смесь 1 - активированные тромбоциты, СаС12; смесь 2 - фактор VIII, тромбин, РРАСК (фактор VIII активировался 1 мин. тромбином, непосредственно перед сборкой комплекса, после окончания активации добавлялся РРАСК); смесь 3 - Ф1Ха, ФХ. Концентрации подсмесей рассчитывались с учётом (1). Доведение до нужной концентрации производили буфером А.

Комплекс внутренней теназы собирался следующим образом: смесь 1 добавлялась в смесь 2, затем добавлялась смесь 3. Далее происходила активация фактора X этим комплексом в течение 4 мин. в объеме 30 мкл при температуре 37°С. Затем добавляли 30 мкл EDTA (50 мМ), чтобы остановить активацию фактора X и затем 140 мкл хромогенного субстрата S2765 рабочая концентрация 0.4 мМ.

Изменение оптической плотности при расщеплении фактором Ха субстрата регистрировалось с помощью планшетного спектрофотометра Thermomax (Molecular Devices, США) в течение 30 мин с интервалом 0,6 сек на длине волны 405 нм при температуре 37°С.

Обработка результатов с планшетного спектрофотометра

Для обработки данных со спектрофотометра было выведено теоретическое уравнение изменения оптической плотности от времени при расщеплении субстрата (2).

Р(0 = ^ * (1 - е~р2'с) + РЗ (2), где Р1 - скорость изменения оптической плотности в начальный момент времени, P2=k*Xa, Р3= const.

С помощью которого в программе OriginPro 7.5 полученные данные аппроксимировали, и находили скорость изменения оптической плотности в начальный момент времени.

Метод измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов по ускорению активации фактора II комплексом протромбиназы

Тромбоциты в концентрации 50 тыс/мкл активировались кальциевым ионофором в концентрации 5мкМ в присутствии 2,5 мМ СаС12. Тромбоциты и активатор доводились до нужной концентрации буфером А. Активация тромбоцитов производилась 10 минут при комнатной температуре.

Далее на поверхности активированных тромбоцитов собирался комплекс протромбиназы - смесь со следующими концентрациями компонентов: активированные тромбоциты -5 тыс/мкл, СаСЬ - 2.5 мМ, фактор Ха - 10 нМ, фактор II - 1,4 мкМ (3). Вышеуказанная смесь состояла из двух подсмесей: активированные тромбоциты, СаСЬ; смесь 2 - фактор Ха, фактор II. Концентрации подсмесей рассчитывались с учётом (3). Доведение до нужной концентрации производили буфером А.

Фактор II активировался этим комплексом в течение 5 мин. при температуре 37°С в объеме 20 мкл. Затем добавляли 20 мкл EDTA (10 мМ), чтобы остановить активацию ФП и затем 140 мкл хромогенного субстрата СТН рабочая концентрация 0.3 мМ. Далее проводился анализ на планшетном спектрофотометре и обработка полученных данных аналогично методу, описанному выше.

Сборка комплекса внутренней теназы и протромбина на искусственных поверхностях

Для выяснения работы методов в искусственных условиях брали следующие образцы: буфер А, пленка без фибробластов /без тканевого фактора, пленка с фибробластами/с тканевым фактором (4), фосфолипиды (2 мкМ, 400 нМ) ((4) Пленки 2x2 мм2 содержали иммобилизованный тканевой фактор или фибробласты со средней поверхностной площадью 120 пмоль/м )

Далее в этих образцах собирался либо комплекс внутренней теназы, либо протромбиназы.

• Сборка комплекса внутренней теназы

Сборка комплекса, анализ и обработка данных производилась аналогичным образом, описанным выше. Концентрация компонентов при сборке комплекса была: СаС12 - 2.5 мМ, фактор Villa - 20 нМ, фактор 1Ха - 0.1 нМ, фактор X - 400 нМ, фосфолипидов 0, 1, 200 мкМ.

Для выявления влияния температуры на ферментативную активность комплекса внутренней теназы, активация фактора X этим комплексом производилась при температурах 20°С, 28°С, 37°С, 43°С в водяных банях, на поверхности фосфолипидов в концентрации 2.5 мкМ

• Сборка комплекса протромбиназы

Сборка комплекса, анализ и обработка данных производилась аналогичным образом, описанным выше. Концентрация компонентов при сборке комплекса была: СаСЬ - 2.5 мМ, фактор Va - 2 нМ, фактор Ха - 10 нМ, фактор II - 1.4 мкМ, фосфолипидов 0, 1, 200 мкМ

Фактор V предварительно был активирован до концентрации 100 нМ: путем инкубации V (120 нМ) в течение 50 мин с RVV-V (10 нМ) при комнатной температуре.

Метод измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов по влиянию их на свертывание плазмы

Для активации тромбоцитов в 96-луночном планшете готовились по 5 мкл активационной смеси в необходимом количестве лунок. Активационные смеси содержали вещества-активаторы, доведенные до нужной концентрации буфером А. Далее в каждую лунку с активатором, добавлялись по 5 мкл тромбоцитов, разбавленных до нужной концентрации буфером А содержащим СаС12. Концентрации в суспензиях после добавления активационной смеси были: 100тыс/мкл тромбоцитов, 2,5 мМ СаСЬ- Тромбоциты активировались 15 минут. Для активации тромбоцитов использовался конвульксин в концентрациях Юнг/мл и 100 нг/мл.

Далее, для того чтобы наблюдать изменение прокоагулянтной активности тромбоцитов в зависимости от активатора, в суспензию активированных тромбоцитов добавлялось по 90 мкл свободной от тромбоцитов плазмы, содержащей СаСЬ такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (100 мкл) его концентрация была 20 мМ.

После этого с помощью планшетного спектрофотометра в течение 1,5 часов с интервалом 6 сек на длине волны 405 нм при температуре 37°С регистрировалось изменение оптической плотности при сворачивании плазмы. По полученным данным находилось время, за которое плазма сворачивается наполовину, т.е. когда оптическая плотность достигает половины от максимального значения.

Статистический анализ результатов

Все эксперименты проводились по крайней мере три раза с тромбоцитами от разных доноров. Статистический анализ производился в программе OriginPro 7.5 (OriginLab Corporation, Northampton, Massachusetts, США) с помощью парного критерия Стьюдента или однофакторного теста ANOVA. Различие считалось статистически значимым при Р<0,05. Представлены усредненные величины ± стандартные ошибки среднего.

Глава 3 содержит результаты работы.

Изучение механизмов формирования покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов

Изучение кинетики формирования двух субпопуляций тромбоцитов и покрытия из фибриногена на их поверхности

На рис. 1 представлена типичная картина формирования покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. В согласии с литературными данными с течением времени выделяется субпопуляция прокоагулянтных тромбоцитов, на поверхности которых присутствует большое количество фибриногена (здесь и далее количество прокоагулянтных тромбоцитов измерялось по связыванию флуоресцентно меченного аннексина-У с фосфатидилсерином экспонированном на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов).

Фосфатидилсерин

Рисунок 1. Кинетика формирования покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Тромбоциты активировались в концентрации 50 тыс/мкл тромбином (ЮОиМ) и были помечены флуоресцентно меченными антителом к фибриногену и аннексином-У. На точечных диаграммах представлено распределение тромбоцитов по связыванию аннексина V (ось абсцисс) и фибриногена (ось ординат) в указанные моменты времени после начала активации (шкала представлена в логарифмическом масштабе). Прокоагулянтные тромбоциты выделены рамкой. Представлены результаты типичного эксперимента из трех, проведенных с кровью разных доноров.

Кроме того, аспирантом ФГБУН ДТП ФХФ РАН С.И. Обыденным было показано, что вопреки ожиданиям покрытие из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов было не равномерно распределено по поверхности, а локализовалось в виде "шапки".

Тестирование существующих гипотез, используя фармакологические агенты • Влияние трансглутаминаз на формирование покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов

Чтобы проверить гипотезу, что трансглутаминазы способны пришивать фибриноген к поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, перед активацией

9

тромбином к тромбоцитам был добавлен пан-трансглутаминазный ингибитор Т101 (Рис. 2А,В).

Рисунок 2. Тестирование трансглутаминазной гипотезы (А-Г). Тромбоциты активировались в концентрации 20 тыс/мкл (А,В) тромбином (ЮОнМ) в присутствии или отсутствии ингибитора трансглутаминаз Т101(200мкМ); (Б-Г) СКР(20чкг/мл) в присутствии или отсутствии ТТГ (500нМ). Тромбоциты были помечены флуоресцентно меченными аннексином-V и антителом к фибриногену и проанализированы на проточном цитометре. На гистограммах представлено (А, Б) количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов в зависимости от присутствия или отсутствия фармакологических агентов во время активации. Для каждого типа активации, все результаты были нормированы на значение флуоресценции антитела к фибриногену связавшегося с фибриногеном на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, полученных стимуляцией одним активатором; (В,Г) процент прокоагулянтных тромбоцитов полученных в зависимости от типа активации. Представлены усредненные по 3-м донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Звездочками отмечена статистическая достоверность.

Как видно из графика, это привело к незначительному уменьшению фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов (статистически не достоверному, Р=0.14) и не повлияло на процент прокоагулянтных тромбоцитов. Однако добавление ТТГ во время активации тромбоцитов CRP привело к значительному увеличению количества фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов (рис. 2Б,Г), их количество при этом не изменилось.

Влияние полимеризации на формирование покрытия из фибрина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов.

I » Р<0.05 « «g 1

¡|ji. „ ¿i i};; , ± I с о -^НИ—ilili WHL ¡ i

^x**

в г

X 801 t М1

Pili |i Й ^ ■

" „-»б*«

л t

I s 6 p<0'05 * 30 ^^^

¡- '- ¡ i] §t" ¡IoU^lBL Г

r **

Рисунок 3. Тестирование гипотезы о полимеризации фибрина (А-Е). Тромбоциты активировались в концентрации 20 тыс/мкл (А,В) тромбином (ЮОнМ) с С!*Р(20мкг/мл), ( Б,Г) тромбином (ЮОнМ) в присутствии или отсутствии ингибитора полимеризации фибрина GPRP(ISmM) или отрицательного контроля GPPP(15mM); (Д-Е) СКР(20мкг/мл) в присутствии или отсутствии анцистрона (концентрация эквивалентна 15 ед. NIH тромбина). На гистограммах представлено (А,Б,Д) количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов в зависимости от присутствия или отсутствия фармакологических агентов во время активации. Для каждого типа активации, все результаты были нормированы на значение флуоресценции антитела к фибриногену связавшегося с фибриногеном на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, полученных стимуляцией одним активатором; (В,Г,Е) процент прокоагулянтных тромбоцитов полученных в зависимости от типа активации. Представлены усредненные по 3-м донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Звездочками отмечена статистическая достоверность.

Для того чтобы проверить приводит ли полимеризация фибрина к формированию белкового покрытия, тромбоциты активировались в присутствии или отсутствии ингибитора полимеризации фибрина-GPRP, используя GPPP как отрицательный контроль (рис. 3 А-Г).

Присутствие ингибитора полимеризации значительно уменьшало количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, активированных как тромбином с CRP (рис. 3 А), так и одним тромбином (рис. 3 Б), в то время как отрицательный контроль никак не влиял на количество фибриногена (рис. 3 А, Б). В случае активации тромбоцитов тромбином количество прокоагулянтных тромбоцитов значительно уменьшалось при добавлении ингибитора полимеризации (рис. 3 Г).

Также были проведены эксперименты с анцистроном-протеазой, сворачивающей фибриноген (рис. 3 Д-Е). Как видно на гистограммах, анцистрон драматически увеличивает количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, полученных путем стимуляции CRP, в то время как обычно активация тромбоцитов CRP не приводит к появлению белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов (рис. 3 Д). Анцистрон сам по себе не вызывает появление прокоагулянтных тромбоцитов и не влияет на их количество во время стимуляции CRP (рис. 3 Е).

Таким образом, можно сделать вывод, что полимеризация фибрина играет ключевую роль в формировании покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов.

Тестирование существующих гипотез, используя тромбоциты пациентов с наследственными нарушениями свертывания крови

Также для проверки состоятельности этих двух механизмов, были проведены эксперименты с использованием тромбоцитов от доноров с наследственными нарушениями свертывания крови, приводящих к дисфибриногенемии и дефициту ФХШ. Пациент с дисфибриногенемией имел гомозиготную фибриногеновую МЕТЦ мутацию (p.Arg 16Cys) в цепи Аа, которая предотвращала отщепление фибринопептида А, таким образом формирование фибринового сгустка не наблюдалось, хотя отщепление фибринопептида В было в норме. Тромбоциты агрегировали нормально. Пациент страдал от тяжелого кровотечения и была история переливания фибриногена (последнее было 2 года назад до нашего исследования). Пациент с тяжелой формой ФХШ дефицита (FXIII <1%) имел гомозиготную вставку Т866 в экзоне 6 (p.Pro255SerfsX16). Тромбоциты от здоровых доноров и пациентов с дисфибриногенемией и дефицитом ФХШ были стимулированы тромбином (рис. 4 А-Б) или тромбином с CRP (рис. 4 В-Г). Количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов у пациента с дисфибриногенемией было значительно снижено при обоих типах активации. В то время как на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов у пациента с дефицитом ФХШ наблюдалось нормальное количество фибриногена (рис. 4 А-Г).

Тромбин

Фосфатиди лсерин

ФХШ деф

в

Рисунок 4. Тестирование существующих, используя тромбоциты пациентов с наследственными нарушениями свертывания крови. (А-Б) Тромбоциты здоровых доноров и пациентов с генетическими заболеваниями, активировались в концентрации 20 тыс/мкл тромбином (100 нМ) в течение 15 мин. Тромбоциты были помечены флуоресцентно меченными аннексином-V и антителом к фибриногену и проанализированы на проточном цитометре. Сокращения: здоровый-здоровые доноры, ДФ - днсфибрнногенемия, ФХШ деф - дефицит ФХШ. (А) На точечных диаграммах представлено связывание флуоресцентно меченных аннексина-V (ось абсцисс) и антитела к фибриногену (ось ординат) с активированными тромбоцитами здоровых доноров и пациентов с генетическими заболеваниями (шкала логарифмическая) (Б) количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов здоровых доноров, пациентов с дисфмбриногенемией и дефицитом ФХШ. (В-Г) Тромбоциты здоровых доноров и пациентов с генетическими заболеваниями, активировались в концентрации 20 тыс/мкл тромбином (100 нМ) с CRP (20 мкг / мл) в течение 15 мин. (Г) То же, что и в панели А, для активации тромбином (100 нМ) с CRP (20 мкг / мл). (Д) Так же, как на панели Б, для активации с тромбином (100 нМ) с CRP (20 мкг / мл). Все результаты были нормированы на значение флуоресценции антитела к фибриногену связавшегося с фибриногеном на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов здоровых доноров, полученных стимуляцией одним тромбином (Б), тромбином с CRP (Г). Данные для здоровых доноров представлены усреднёнными по трем донорам величины ± стандартные ошибки среднего.

Данные вестерн-блоттинга подтвердили, что общий уровень фибриногена и фактора XIII в лизатах тромбоцитов от здорового донора и пациента с дисфибриногенемией были неотличимы, в то время как у пациента с дефицитом ФХШ не хватало ФХШ, но уровень фибриногена был в норме.

Таким образом, этот результат подтверждает исключительную важность полимеризации фибрина для формирования белкового покрытия, в то время как роль ФХШ не кажется критической. Тем не менее, вклад ТТГ не может быть исключен.

Роль трансглутаминаз в формировании прокоагулянтной активности активированных тромбоцитов

Разработка методов измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов

В данной работе было разработано два метода измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов. Первый метод основан на измерении количества активного фактора X, наработанного комплексом внутренней теназы, второй - на измерении количества тромбина, наработанного комплексом протромбиназы. Проблемы связанные с большим количеством разных агонистов тромбоцитов в условиях одного эксперимента, большого числа манипуляций за короткий промежуток времени, которые необходимо было произвести для активации тромбоцитов и сборки на их поверхности комплекса внутренней теназы/протромбиназы, а также крайней нестабильности фактора Villa (в случае комплекса внутренней теназы) были решены введением нескольких типов подсмесей, которые затем собирались в одну в определенном порядке в момент сборки комплекса внутренней теназы/протромбиназы на поверхности активированных тромбоцитов. Подробно методика описана в разделе Материалы и методы). Кроме того, для оптимизации работы данных методов был выполнен ряд экспериментов.

Разработка метода измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов по ускорению активации фактора X комплексом внутренней теназы • Выбор линейной области

Для того чтобы метод работал корректно необходимо было выбрать область где он работает линейно, т.е. где ФХ/ФП ещё не успел весь связаться и активироваться на поверхности активированных тромбоцитов. Для выбранной нами концентрации фактора X/ фактора II поверхность тромбоцитов должна быть лимитирующим фактором.

Как видно из графика (рис.5) для наших экспериментов нам подходят концентрации тромбоцитов от 0 до 10 тыс/мкл для комплекса внутренне теназы и 0 до 8 тыс/мкл, для выбрана концентрация тромбоцитов 8 тыс/мкл при сборке комплекса внутренней теназы и 5 тыс/мкл для протромбиназы. Тромбоциты активировались в 100 тыс/мкл в первом случае и в 50 тыс/мкл во втором.

0.4

0.3-

1 0.2

2 о

0.1

30 60 90 120 Тромбоциты, тыс/мкл

150

0.0

0 12 3 'Линейная область

5 10 15 20 25 30 Тромбоциты, тыс/мкл

Рисунок 5. Зависимость наработки ФХа/ФП от концентрации тромбоцитов. (А) (■) На поверхности тромбоцитов, активированных тромбином (100 нМ) с конвульксином (10 нг/мл) был собран комплекс внутренней теназы. (Б) (■) На поверхности тромбоцитов, активированных 5 мкМ кальциевого ионофора, был собран комплекс протромбиназы. На внутреннем графике показана линейная область метода. Представлены усредненные по 2-м экспериментам величины ± стандартные ошибки среднего. Предполагаемый вид кривой наработки ФХа/ФП от концентрации тромбоцитов показан красной кривой.

• Построение калибровочной кривой

Для метода основанного на сборке комплекса внутренней теназы была получена экспериментальная кривая зависимости скорости расщепления субстрата от концентрации фактора Ха, которая связала скорость расщепления субстрата и концентрацию активировавшегося фактора X (рис.6). Полученная кривая была аппроксимирована прямой пропорциональностью.

В дальнейшем все полученные результаты представляются в количестве активировавшегося фактора X в нМ.

0 200 400 600

Фактор X активированный, нМ

Рисунок 6. Калибровочная кривая расщепления субстрата 82765 Ха фактором.

(■) Представлены усредненные по 2-м экспериментам величины ± стандартные ошибки среднего, красная кривая - аппроксимация прямой пропорциональностью Х= У/Р1, где Р1=0,00042, а X и У соответственно концентрация

фактора Ха и скорость расщепления субстрата 82765.

• Влияние температуры на активацию фактора X комплексом внутренней теназы

Для комплексов внешней теназы и протромбиназы было показано, что при повышении температуры на 10°С их активность возрастает в 2 раза и достигает максимума при температуре 37°С [Meng Z.H. et al. 2003]. Однако об активности внутренней теназы таких данных нет, поэтому для понимания работы данного комплекса была измерена его ферментативная активность при температурах от 20 до 43 °С, в качестве отрицательно заряженной поверхности выступали фосфолипиды (Рис. 7).

1.5-,

1.2

ф

>

ге 0.9-

X

о.

о к 0.6-

i£

(0

Ö 0.3-

0.0-

15 20 25 30 35 40 Температура, °С

Рисунок 7. Зависимость активности комплекса внутренней теназы от температуры. Представлены

усредненные по 3-м экспериментам величины ± стандартные ошибки среднего.

45

Как видно из результатов, комплекс внутренней теназы ведет себя качественно иначе, чем протромбиназа и внешняя теназа. Максимум ферментативной активности достигается в районе 28°С, а при повышении температуры с 28°С до 37°С активность падает практически в 2 раза. В нашей работе сборка комплекса внутренней теназы проводилась при комнатной температуре из соображений удобства.

Сравнение работы 2-х методов измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов

Чтобы понять, работают ли описанные методы в искусственных условиях, и не вносит ли добавление тромбоцитов артефакты была измерена прокоагулянтная активность фосфолипидов, а также пленок с фибробластами(ФБ)/тканевым фактором (ТФ) (рис. 8). Как можно заметить оба метода чувствуют присутствие фосфолипидов в системе, а также их различную концентрацию. Видно, что пленка с ТФ имеет более высокую прокоагулянтную активность по сравнению с ФБ в тесте с внутренней теназой. Однако этот эффект достаточно слабый и сравним с прокоагулянтной активностью фосфолипидов в концентрации 200 нМ.

1- буфер

2- фосфопипиды 1мкМ

3- фосфолипиды 200н1У

4- пленка без ТФ

5- пленка без ФБ

6- пленка с ТФ

7- пленка с ФБ

Рисунок 8. Способность метода чувствовать присутствие фософолипидов, а также локальную концентрацию ТФ. (А) Наработка ФХа комплексом внутренней теназы. (Б) Наработка тромбина комплексом протромбиназы. Представлены усредненные но 3-м экспериментам величины ± стандартные ошибки среднего.

Таким образом, видно, что оба метода работают достаточно хорошо. Однако, в условиях данной работы метод, основанный на сборке комплекса внутренней теназы, наиболее подходит для данной работы. Чтобы оценить прокоагулянтную активность тромбоцитов необходимо получать различные количества прокоагулянтных тромбоцитов и добиться этого можно используя различные активаторы, в том числе и тромбин. Поэтому в случае сборки комплекса протромбиназы на поверхности активированных тромбоцитов, разделить тромбин, наработанный из протромбина этим комплексом и тромбин, добавленный в систему для активации тромбоцитов, представляется достаточно сложной задачей.

Разработка метода измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов по влиянию на свертывание плазмы

Помимо изучения работы прокоагулянтной активности тромбоцитов на отдельных комплексах была предпринята попытка создать метод, работающий в плазме. Тогда бы мы смогли оценить, как разное количество прокоагулянтных тромбоцитов влияет на работу всей системы плазменного свертывания целиком. Однако в ходе проведения экспериментов стало понятно, что данный метод практически не чувствителен к разным концентрациям тромбоцитов при данных условиях активации (рис. 9).

с 3

г ш

с о

ш ^

о о

а. с

о га

п

га н

« ш

30

15-

о. га 00 о. о ш и

Рисунок 9. Время за которое плазма свернулась наполовину в зависимости от концентрации активированных тромбоцитов. Все образцы тромбоцитов были активированы конвульксином (100 нг/мл). Результаты усреднены для 3 доноров величины ± стандартные ошибки среднего.

30 60 90 120 150 180 Тромбоциты, тыс/мкл

Кроме того, в ряде экспериментов было показано, что при активации тромбоцитов различными активаторами метод также слабо чувствителен и существенно зависит от доноров. Поэтому был сделан вывод о том, что данный метод не может быть использован для дальнейших исследований в данной работе.

Зависимость прокоагулянтной активности тромбоцитов от степени активации

После того как метод измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов был разработан, мы остановились более детально на изучении прокоагулянтного ответа тромбоцитов в зависимости от степени активации (рис. 10).

1- контроль

2- тромбин ЮнМ

3- тромбин ЮОнМ

4-тромбин 100нМ+конвульксин 1 нг/мл

5-тромбин 100нМ+ конвульксин 5нг/мл

6- тромбин 100нМ+ конвульксин 100нг/мл

Рисунок 10. Зависимость количества активировавшего фактора X от степени активации тромбоцитов. Представлены усредненные по 3-м донорам величины ± стандартные ошибки среднего.

Ожидалось, что с увеличением степени активации тромбоцитов их прокоагулянтная активность будет возрастать (т.е. количество активировавшего фактора X). Однако видно, что при активации тромбоцитов тромбином 100 нМ с конвульксином 1нг/мл прокоагулянтная активность тромбоцитов достигает максимума, при дальнейшем увеличении концентрации конвульксина прокоагулянтная активность тромбоцитов резко падает.

Влияние тканевой трансглутаминазы на регуляцию прокоагулянтной активности тромбоцитов

Для выяснения роли тканевой трансглутаминазы (ТТГ) в формировании прокоагулянтной активности тромбоцитов комплекс внутренней теназы собирался на поверхности тромбоцитов стимулированных конвульксином (100 нг/мл) в отсутствии или присутствии тканевой трансглутаминазы (500 нМ) сразу, либо через 9 минут после начала активации (рис. 11).

Видно, что количество активировавшегося фактора X при добавлении ТТГ к тромбоцитам через 9 мин после начала активации в пределах погрешности совпадает с результатами, полученными просто при активации тромбоцитов конвульксином. При добавлении ТТГ сразу при активации тромбоцитов результат также в пределах погрешности совпадает с этими результатами. Количество активировавшегося фактора X в этих трёх образцах значительно больше, чем в контрольном образце с неактивированными тромбоцитами.

Рисунок П. Влияние тканевой 18] ТТГ-тканевая трансглутаминаза трансглутаминазы на

Кнв- конвульксин | прокоагулянтную активность

тромбоцитов. Тро\|боциты активировались в

конвульксином (100 нг/мл) в ^ присутствии таканевой

я трансглутаминазы (500 нМ)

сразу, либо через 9 мин. после начала активации, либо без

° 'оо^ТТ ^ лЛ^®9^ нее' также бь,л взят

контрольный образец,

тромбоциты не активировались. Представлены усредненные по 2-м донорам величины ± стандартные ошибки среднего.

Этот результат свидетельствует, что добавление внешней ТТГ не влияет на прокоагулянтную активность тромбоцитов.

Глава 4 посвящена обсуждению.

В данной работе было впервые показано, что механизм полимеризация является наиболее значимым механизмом формирования фибринового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Эти результат согласуется с полученными ранее: активация тромбоцитов одним конвульксином или агонистом PAR-1 рецептора SFLLRN, а также кальциевым ионофором А23187, без тромбина, ведет к формированию субпопуляции тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, но без альфа-гранулярных белков на поверхности [Dale G.L. 2005; Jobe S.M. et al. 2005; Jobe S.M. et al. 2008; Topalov N.N. et al. 2012]. Кроме того, сотрудником ФГБУН ЦТП ФХФ РАН Я.Н. Котовой совместно с аспирантом ФГБУН ЦТП ФХФ РАН С.И. Обыденным были получены данные свидетельствующие в пользу того, что полимеризация фибрина может играть важную роль для удержания тромбоспондина, также, как и для фибриногена, на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, что частично подтверждает предположение Мюнникса И.С, что белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов возникает за счет полимеризации фибрина под действием тромбина и пассивного вовлечения остальных белков в нити фибрина [Munnix I.C. et al. 2009]. В данной работе также показано, что механизм, обусловленный трансглутаминазной реакцией, способен формировать покрытие из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако он представляется второстепенным. Эти результаты также согласуются с данными полученными Д.Дейлом и коллегами, которые показали, что добавление дансилкадаверина-конкурирующего амино-донора для трансглутаминаз, а также специфических антител к фактору ХШа доз зависимо снижает количество а-гранулярных белков на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Однако, возможно, что роль трансглутаминазной реакции может увеличится in vivo, где секреции тромбоцитов является более значимой в связи с увеличением локальной концентрации тромбоцитов в пределах тромба. Кроме того, не стоит исключать наличия других дополнительных механизмов формирования фибринового покрытию.

Для изучения влияния трансглутаминаз на формирование прокоагулянтной активности тромбоцитов было разработано два метода измерения прокуаголянтной активности тромбоцитов. Один был основан на измерении количества фактора Ха, активированного из предшественника комплексом внутренней теназы, второй - на измерении количества тромбина, активированного комплексом протромбиназы. Ранее ученые применяли подобные подходы для изучения прокоагулянтной активности тромбоцитов. Ф.С. Лондон и коллеги собирали на поверхности тромбоцитов, стимулированных в разных концентрациях либо тромбином, либо SFLLRN комплекс внутренней теназы [London F. S. et al. 2004]. Кемптон С.Л. и коллеги в своей модельной системе измеряли прокоагулянтную активность тромбоцитов, стимулированных тромбином с конвульксином, по генерации тромбина и фактора Ха комплексами протромбиназы и внутренней теназы соответственно [Kempton C.L. et al. 2005]. Однако существенным недостатком данных методов являлось то, что ни один из них до конца не учитывал, что разные комбинации активаторов приводят к

разному количеству прокоагулянтных тромбоцитов и соответственно к разному прокоагулянтному ответу системы. В данных методах были учтены все недостатки. Для каждого из разработанных методов были подобраны такие концентрации тромбоцитов, при которых они ведут себя линейным образом. Кроме того, для комплекса внутренней теназы мы дополнительно исследовали влияние температуры на его ферментативную активность, т.к. в отличие от комплекса протромбиназы, сведений о его активности в литературных данных не нашлось. Оказалось, что комплекс внутренней теназы ведет себя несколько иначе, чем протромбиназа. Максимум ферментативной активности для это комплекса достигается в районе 28°С, а при повышении температуры с 28 °С до 37 °С активность падает практически в 2 раза.

Из соображений удобства было решено остановиться на методе, основанном на измерении количества фактора Ха, наработанного комплексом внутренней теназы.

Также был сделан ряд попыток создать метод, работающий в свободной от тромбоцитов плазме. Однако оказалось, что этот метод слабо чувствителен к разным концентрациям активированных тромбоцитов, что не позволило в дальнейшем использовать этот метод.

С помощью полученного метода исследован вопрос о влиянии трансглутаминаз на формирование прокоагулянтной активности тромбоцитов. Было показано, что добавление внешней трансглутаминазы сразу при активации либо после нее не влияет на их прокоагулянтную активность. Однако стоит отметить, что тромбоциты сами секретируют ТТГ и ее влияние на прокоагулянтную активность тромбоцитов может оказаться решающим. В пользу этого свидетельствую результаты, полученные Д.Дейлом, которые показали, что добавление ингибиторов трансглутаминаз приводит к блокированию образования белкового покрытия у прокоагулянтных тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002]. Также тромбоциты секретируют фактор XIII, который также является транглутаминазой, однако в данной работе его влияние на прокоагулянтную активность тромбоцитов не исследовалось. Таким образом, влияние трансглутаминаз на прокоагулянтную активность тромбоцитов является открытым вопросом и требует дальнейшего изучения.

В данной работе также впервые было показано, что с увеличением степени активации тромбоцитов, прокоагулянтный ответ тромбоцитов доз зависимо возрастает (что согласуется с предыдущими результатами [London F. S. et al. 2004]), достигая своего максимума, и при дальнейшем увеличении концентрации активатора оно резко падает и становится в пределах погрешности равным образцу с неактивированными тромбоцитами. Резкое снижение прокоагулянтного ответа может быть обусловлено появлением большой площади прокоагулянтной поверхности, за счет увеличения концентрации прокоагулянтных тромбоцитов, что способствует связыванию компонентов комплекса внутренней теназы в ее разных местах, что может тормозить сборку комплекса внутренней теназы. Данный результат также напрямую подтверждает, что основные реакции свертывания крови происходят именно на поверхности прокоагулянтных, т.к. с увеличением степени активации их

количество в суспензии возрастает [Alberio L, et al. 2000; London F.S et al. 2004;

P ante lee v M.A. et al. 2005].

ВЫВОДЫ

1. Полимеризация фибрина играет определяющую роль в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов

2. Трансглутаминазы способны формировать белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако значимость этого механизма при активации тромбоцитов тромбином меньше, чем роль полимеризации

3. Разработано два метода, позволяющих количественно характеризовать прокоагулянтную активность тромбоцитов, основанных на сборке ферментативных комплексов протромбиназы и внутренней теназы на поверхности активированных тромбоцитов. Для каждого из методов выбрана линейная область работы. Погрешность при воспроизведении составляет 11% для комплекса внутренней теназы и 10% для протромбиназы

4. Тканевая трансглутаминаза не влияет на прокоагулянтную активность тромбоцитов, а также не влияет на количество прокоагулянтных тромбоцитов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Abaeva А.А., Canault М., Kotova Y.N., Obydennyy S.I., Yakimenko А.О., Podoplelova N.A., Kolyadko V.N., Chambost H., Mazurov A.V., Ataullakhanov F.I., Nurden A.T., Alessi M.C., Panteleev M.A., "Procoagulant platelets form an a-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates". J Biol Chem. 2013 Oct 11;288(41):29621-32

2. Кудрявцев K.B., Подоплелова H.A., Новикова A.A., Пантелеев М.А., Заболотнев Д.В., Зефиров Н.С., "Ингибирование прокоагулянтной активности тромбоцитов крови винил-сульфонилпроизводными пирролидин-2-карбоновой кислоты", Известия Академии наук. Серия химическая, 20116 №4, с. 665-670 [К. V. Kudryavtsev, N. A. Podoplelova, A. A. Novikova, М. A. Panteleev, D. V. Zabolotnev, and N. S. Zefirova, "Inhibition of the procoagulant activity of blood platelets by vinylsulfonyl derivatives of pyrrolidine-2-carboxylic acid", Russian Chemical Bulletin, International Edition, Vol. 60, No. 4, pp. 679—684, April, 2011]

3. Balandina A.N., Shibeko A.M., Kireev D.A., Novikova A.A., Shmirev 1.1., Panteleev M.A., Ataullakhanov F.I., "Positive feedback loops for factor V and factor VII activation supply sensitivity to local surface tissue factor density during blood coagulation", Biophys J. 2011 Oct 19; 101 (8): 1816-24

4. Topalov N.N., Yakimenko A.O., Canault M., Artemenko E.O., Zakharova N.V., Abaeva A.A., Loosveld M., Ataullakhanov F.I., Nurden A.T., Alessi M.C., Panteleev M.A. "Two types of procoagulant platelets are formed upon physiological activation and are controlled by integrin a(IIb)P(3)", Arterioscler Thromb Vase Biol. 2012; 32(10): 24752483

5. Щербина И.А., Липец E.H., Абаева A.A., Баландина А.Н., Атауллаханов Ф.И., "Изучение влияния температуры на состояние плазменного гемостаза in vitro с помощью метода тромбодинамики", Биомедицинская химия 2014; 60(4), 493-502 [Shcherbina I.A., Lipets E.N., Abaeva A.A., Baiandina A.N., Ataullakhanov, F.I. "Influence of temperature on spatial fibrin clot formation process in thrombodynamics assay", Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 7(4), 311318]

6. Novikova A.A., Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. "Influence of tissue transglutaminase on procoagulant activity of platelets", 1 Joint Meeting GTH & NVTH (54rd Annual Meeting of Society of Thrombosis and Haemostasis Research and Symposium of the Netherlands Society of Thrombosis and Haemostasis), Nürnberg, Germany, February 24 - 27, 2010, Hämostaseologie, 1, 2010, p. A94-95.

7. Абаева A.A., Колядко B.H., Якименко A.O., Котова Я.Н., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А. "Механизмы формирования шубы из фибрина/фибриногенатна поверхности фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов", IV Съезд Биофизиков России, Нижний Новгород, Россия, 20-26 августа, 2012, материалы конференции, стр.7.

8. Panteleev М.А., Abaeva A.A., Canault M., Kotova Y.N., Obydennyi S.I., Yakimenko A.O., Kolyadko V.N., Ataullakhanov F.I., Nurden A., Alessi M.C. "Alpha-granule proteins are localized in a "cap" on the surface of procoagulant platelets to promote their incorporation into aggregates". XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Амстердам, Голландия, 29 июня - 4 июля, 2013

Подписано в печать 08.12.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая.

Тираж 100 Экз. Типография ООО "ПринтСайдАп" 115093, г. Москва, ул. Большая Серпуховская, д.31 к.1 Тел. 8-495-587-71-31 www.printside.ru