Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации"

□□3481250

На правах рукописи

КОТОВА Яна Николаевна

Исследование механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наух

Москва 2009

003481250

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический научный центр РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Атауллаханов

Фазоил Иноятович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Васильев

Сергей Александрович

доктор биологических наук, профессор

Ягужинский Лев Сергеевич

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится «»/-/0$ 2009 года в ^^ часов на заседании Диссертационного совета Д.001.642.02. при Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН. Автореферат разослан « года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из фундаментальных задач медицины, биофизики, биохимии, молекулярной биологии и медицинской химии является исследование закономерностей функционирования системы гемостаза человека н, как следствие, возможное предотвращение таких патологических состояний, как инсульты, инфаркт, спонтанный тромбоз и др. Гемостаз является защитной реакцией организма, выражающейся в остановке кровотечения при повреждении стенки сосуда. Он возникает в результате спазма кровеносных сосудов и появления закупоривающего сосуд кровяного сгустка. В гемостатической реакции человека принимают участие окружающая сосуд ткань, стенка сосуда, плазменные факторы свертывания крови и клетки крови, в первую очередь тромбоциты, которые представляют собой безъядерные клеточные структуры неправильной округлой формы диаметром 1-4 мкм. Они образуются в костном мозге путем отщепления от мегакариоцитов. Главной функцией тромбоцитов является образование «белого тромба», закрывающего первичное повреждение стенки сосуда.

Активация тромбоцита может вызываться множеством стимулов, включая химические и механические. Основными физиологическими активаторами считаются коллаген (главный белок внеклеточного матрикса) и тромбин, которые относятся к сильным эффекторам, а также АДФ (адеиозипдифосфат, появляющийся из разрушенных клеток сосуда или секретируемый самим тромбоцитами) и тромбоксан Аг (вторичный активатор, секретируемый тромбоцитами). Активаторы, взаимодействуя с соответствующими мембранными рецепторами тромбоцита, способствуют его переходу в активированное состояние, которое характеризуется изменением формы, адгезией, агрегацией, секрецией содержимого гранул, формированием прокоагулянтной поверхности.

В норме мембрана тромбоцита асимметрична, благодаря работе транслоказы, которая АТФ-зависимым образом осуществляет перенос фосфолипидов (фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина) во внутренний слой мембраны. При активации эта асимметричность нарушается, активируются ферменты, действие которых приводит к выравниванию концентраций фосфолипидов между внешней и внутренней поверхностями мембраны. Это ведет к появлению во внешнем слое мембраны отрицательно заряженного фосфатидилсерина, что способствует сборке нрокоагулянтных комплексов, таких как теназный и протромбиназный. [2\уаа1 Я.Р.А. й а]. 1997]. Было обнаружено, что по данному параметру (уровень фосфатидилсерина на поверхности клетки) тромбоциты разделяются на две группы. Кроме того, в ходе активации тромбоциты секретируют и содержание своих гранул (альфа и плотные

гранулы), что играет важную роль в свертывании крови.

В настоящее время было показано, что сильная физиологическая активация тромбоцитов (например, тромбином в сочетании с коллагеном или конвульксином, агоиистом коллагенового рецептора гликопротеина VI) может привести к развитию неоднородности в ответе тромбоцитов. В работе [Alberio L., et al. 2000] впервые было показано, что комбинированная активация тромбоцитов двумя физиологическими агонистами, тромбином и коллагеном, способствовала экспрессии высокого уровня а-гракулярного фактора V на поверхности части тромбоцитов. Они назвали данную фракцию клеток «укутанными» тромбоцитами. Было также доказано, что в данных клетках экспрессируется высокий уровень фосфатидилсерина на поверхности. В работе [Dale G.L., et al. 2002] было показано, что помимо а-гранулярного фактора V на поверхности «укутанных» тромбоцитов экспрессируются и другие а-гранулярные белки (фибриноген, фактор фон Виллебранта, тромбоспондин, фибронектин и аг-антиплазмин). Таким образом, новая обнаруженная субпопуляция тромбоцитов, названная «укутанными» тромбоцитами, характеризуется высоким уровнем фосфатидилсерина и альфа-гранулярных белков на своей поверхности.

В ходе изучения свойств новой фракции тромбоцитов, было определено, что предшественника данной субпопуляции «укутанных» тромбоцитов не существует и доля этих клеток зависит только от условий активации. [Alberio L, et al. 2000; London F.S. et al. 2004; Panteieev M.A. et al. 2005]. Было показано возможное участие коллагеновой рецептор-связанной молекулы Felly, митохондриальной поры в формирование «укутанных» тромбоцитов. [Jobe S.M. et al. 2005; Remenyi G. et al. 2005]

Важным и пока не разрешенным вопросом в исследовании свойств «укутанных» тромбоцитов остаются механизмы, приводящие к их образованию.

Тромбин, а также тромбин с коллагеном или конвульксином, активируют тромбоцит, приводя к секреции гранул, с выделением тромбоксана А2 и АДФ. АДФ, как и тромбоксан А?, являются физиологическими активаторами тромбоцитов. Выброс последних важен для формирования и развития тромба при повреждении. Однако их возможная роль в формировании «укутанных» тромбоцитов не совсем понятна. Предполагая, что АДФ через свои адренергические рецепторы, а тромбоксан А2 через собственный рецептор участвуют в активации тромбоцитов. Они активируют различные сигнальные пути, которые приводят к активации гликопротеина Ilb/IIIa, агрегации, а также секреции.

В работе [Dale G.L. et al. 2002] было показано, что альфа-гранулярные белки являются субстратами для трансглутаминаз тромбоцитов (тканевая трансглутаминаза и фактор XHIa), ферментов, катализирующих образование в-(у-глутамил)-лизиновых сшивок. Результаты экспериментов с антителами к тканевой трансглутаминазе и

фактору ХШа показали, что обе трансглутаминазы присутствуют на поверхности «укутанных» тромбоцитоя, а использование ингибиторов трапсглутаминаз приводит к блокированию образования «укутанных» тромбоцитов. Это свидетельствует о возможной роли данных ферментов (фактор ХШа и тканевая трансглутаминаза) в формировании «укутанных» тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002].

Существуют данные, предполагающие, что ведущую роль в формировании «укутанных» тромбоцитов может играть фактор ХШа. [Сох A., D Devine. 1994; Dale G.L. et al. 2002; Kulkami S., et al. 2004] Однако, в работе [Jobe S.M. et al. 2005] было продемонстрировано, что мыши дефицитные по фактору ХШа не имели трудностей в образовании «укутанных» тромбоцитов. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что фактор ХШа не является необходимым для образования «укутанных» тромбоцитов, и предполагают, что другая клеточная трансглутаминаза, а именно тканевая трансглутаминаза, может компенсировать отсутствие фактора ХШа. Вопрос о роли данных ферментов до сих пор открыт.

«Укутанные» тромбоциты являются очень интересным и важным подклассом тромбоцитов. Имея высоко прокоагулянтную поверхность, они способны поддерживать протромбиназную активность. Есть указания на то, что «укутанные» тромбоциты могут быть критическим звеном, как в нормальном гемостазе, так и при тромбозе. Однако, их точное значение в физиологии и патофизиологии, а также механизмы формирования такой гетерогенности тромбоцитов при активации неизвестны. Поэтому изучение сигнальных механизмов, ведущих к формированию данной субпопуляции тромбоцитов очень важно.

Цель работы: Экспериментальное исследование механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов при их активации in vitro.

Задачи исследования:

1. Определение роли секреции тромбоцитов в образовании «укутанных» тромбоцитов

2. Исследование внутриклеточных путей сигнализации, регулирующих формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации

3. Определение роли тканевой трансглутаминазы и фактора ХШа в формировании гетерогенности тромбоцитов

Научная новизна. В работе показано, что на образование «укутанных» тромбоцитов влияет АДФ, секретируемый из плотных гранул тромбоцитов, через адренершческий рецептор P2Y12. Установлено, что в формировании гетерогенности тромбоцитов участвуют внутриклеточные пути сигнализации, идущие от рецептора P2Y12 и связанные с действием аденилатциклазы, фосфоинозитид-3-киназы и Src-тирозинкиназы. Установлено, что фактор ХШа и, особенно, тканевая трансглутаминаза

вносят существенный вклад в формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации.

Научно-практическое значение. Данная работа является фундаментальным исследованием, позволяющим понять механизмы формирования гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации, а также предполагаемую роль «укутанных» тромбоцитов. Результаты данной работы могут быть полезны как для понимания происходящих процессов тромбообразования, так и для создания на основе имеющихся знаний новых методов антитромботической терапии.

Положения, выносимые на защиту.

1. АДФ из плотных гранул регулирует формирование гетерогенности тромбоцитов человека.

2. Сигнализация от АДФ, регулирующая образование «укутанных» тромбоцитов, идет через пуринэргический рецептор P2Y12.

3. Пути внутриклеточной сигнализации, ведущие к формированию «укутанных» тромбоцитов: аденилатциклаза, фосфоинозитид-3-киназа и Src-тирозинкиназа.

4. Показано, что тканевая трансглутаминаза и фактор ХШа участвуют в формировании гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описание экспериментальных результатов, главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 99 источников. Работа выполнена на базе Учреждения Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф., д.б.н. Атауллаханов Ф.И.).

Апробация работы состоялась 16 сентября 2009 года на заседании проблемной комиссии "Биохимия, биофизика и реология крови" в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН. Материалы диссертации докладывались на 11-й и 12-й Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука ХХ1века» (Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 года, 10 - 14 ноября 2008 года); на 33rd FEBS Congress & 1 Ith IUBMB Conference (Athens, 28 June - 3 July 2008); 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research (Vienna, February 04 - 07,2009).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 публикациях. Статей в рецензируемых журналах: 3; публикациях в трудах конференций и съездов: 4

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты: тромбин, фактор XlIIa человеческий (Haematologic Technologies, США); конвульксин (Pentapharm, Швейцария); простагландин El (MP Biochcmicals, США); R-фикоэритрин(РЕ)- и флуоресцсин(РГТС)-конъюгированный аннексии V (Molecular Probes, США); U012б, SCH-23390, форсколин (Tocris Cookson, США); РР2, вортманнин, FITC- конъюгированное анти-мышиное иммуноглобулиновое антитело, мышиное антитело к тромбоспондину человека (Calbiochera, США); U46619 (Cayman Chemicals, США); ингибиторы цистеинопых протешш, любезно предоставленные Костановой Е.А. из института биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН [Костанова Е.А. и др. 2007]; ингибирующие пептиды Т26 (HQSYVDPWMLDH) и F11KA (DQMMLPWPAVAL), синтезированные в лаборатории белковой инженерии института биологической и медицинской химии им. B.II. Ореховича РАМН [Sugimura Y., et al. 2006]. Остальные реагенты были из Sigma (США)

Используемые в работе буферные растворы: (1) Буфер для работы с тромбоцитами, рН 7.4 (Буфер А): 150 мМ NaCl; 2.7 мМ КС1; 1 мМ MgCl2; 0.4 мМ NaH2P04; 20 мМ HEPES; 5 мМ глюкозы; 0.5% бычий сывороточный альбумин; (2) циггратный буфер, рН 5.5: 111 мМ цитрат натрия; (3) Фосфатный буфер, рН 7.4 фирмы Sigma.

Выделение тромбоцитов

Тромбоциты изолировали из крови здоровых доноров, которую заготавливали на 3.8 % циггратном буфере (111 мМ цитрат натрия, рН 5.5), соотношение кровь : цитрат составляло 9 : 1, с добавлением простагландина EI (1 мкМ) и апиразы (0.1 ед./мл) для предотвращения активации. Кровь центрифугировали при комнатной температуре при 100g в течение 8 минут. После центрифугирования крови отбирали слой богатой тромбоцитами плазмы и добавляли в нее 3.8 % раствор цитрата натрия (111 мМ цитрат натрия, рН 5.5) (в соотношении плазма : цитрат - 3:1) для предотвращения агрегации. Тромбоциты осаждали при 400g в течение 5 минут при комнатной температуре, затем ресуспендировали в 300 мкл буфера А. Очищали от белков плазмы крови прохождением суспензии клеток через гель-хроматографическую колонку (длина х ширина = 6x1 см) с использованием в качестве носителя сефарозу CL-2B и применением в качестве элюента буфера А.

Анализ гетерогенности тромбоцитов на проточном цитометре

Анализ субпопуляций тромбоцитов производился на проточном цитометре типа FACSCalibur (BD Biosciences, США) при помощи программы WinMDI 2.8 software (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, С A, США).

7

Эксперименты на проточном цитометре проводили с использованием нескольких видов красителей и активаторов по следующей методике постановки.

Методика постановки эксперимента. Гель-фильтрованные тромбоциты в определенной концентрации активировали требуемым активатором (тромбин, тромбин в сочетании с конвульксином, SFLLRN и т.д.) в буфере А с добавлением 2.5 мМ СаС12 и 0.5 % РЕ-конъюгированного аннексина V. Время активации составляло 15 минут при комнатной температуре без перемешивания, затем образец разбавляли до 200мкл буфером А с 2.5 мМ СаС12. Измерения пробы проводили на проточном цитометре в течение 20 секунд при высокой скорости подачи пробы в прибор.

Анализ секреции плотных гранул тромбоцитов

Пробу объемом ЗООмкл, содержащую гель-фитрованные тромбоциты в концентрации 20тыс./мкл или ЮОтыс./мкл в конечном содержании пробы, инкубировали с 10 мкМ мепакрина в конечном объеме. Весь образец инкубировали в течение 30 минут при 37°С без доступа света. По истечении времени инкубации из образца отбирали по 10 или 5 мкл проинкубированных с мепакрином тромбоцитов в зависимости от исходной концентрации клеток в пробе (20тыс./мкл или ЮОтыс./мкл, соответственно). Затем проводили активацию путем добавления равного объема буфера А в присутствии 2.5 мМ СаС12, 0.5 % РЕ-конъюгированного аннексина V и активатора (тромбин, тромбин в сочетании с конвульксином) в конечном содержании пробы. Время активации составляло 15 минут при комнатной температуре без перемешивания. По истечении времени активации каждую пробу разводили буфером А с 2.5 мМ СаС12 до 200мкл и сразу же измеряли на проточном цитометре в течение 20 секунд при высокой скорости подачи пробы в прибор.

Окраска активированных тромбоцитов антителами на тромбоспондин, фибриноген, факгорУ, РАС-1, CD62P.

Окраска активированных тромбоцитов проводилась двумя различными способами. Выбор способа окрашивания зависел от вида антител. Если первичное антитело не было конъюгировано с флуоресцентной меткой и, следовательно, требовалось использование вторичного антитела конъюгированного с флуоресцентной меткой, то использовали первый способ окраски (измененная методика из работы G.L. Dale et al. 2002). Если же антитела были сразу конъюгированы с флуоресцентной меткой, то использовали второй способ окраски, который является более простым и удобным.

Способ первый. Для выполнения данного вида эксперимента использовали измененную схему окраски антителами из статьи Дейла Дж. JI. с соавторами [Dale G.L. et al. 2002].

Гель-фильтрованные тромбоциты в концентрации 50 тыс./мкл активировали

8

активатором (тромбин, тромбин в сочетании с конвульксином, БРЬЬКЫ и т.д.) в буфере А в присутствии 2.5 мМ СаСЬ и 1 % РЕ-конъюгированного аннексина V. Объем каждой пробы составлял 20 мкл. Время активации 15 минут при комнатной температуре в стационарном состоянии, после этого каждую пробу метили неконътогированным антителом (первичное) на тромбоспондин человека (0.2мкл). Время инкубации с антителом 5 минут при комнатной температуре без перемешивания. Далее пробу, меченную первичным антителом на тромбоспондин человека, окрашивали РГГС-конъюгированным аити-мышиным антителом (вторичное) (1мкл). Время инкубации с вторичным антителом составляло 5 минут при комнатной температуре. По истечении времени инкубации с антителами все реакции останавливали добавлением в пробу 40мкл 1,5% формалина в фосфатном буфере (рН 7.4), время остановки реакции составляло 20 минут. После этого весь образец разводили добавлением 800мкл фосфатного буфера (рН 7.4) с 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и сразу же измеряли на проточном цитометре в течение 1 минуты на высокой скорости подачи пробы.

Способ второй. Гель-фильтрованные тромбоциты в концентрации 100 тыс./мкл активировали в буфере А в присутствии 2.5 мМ СаСЬ и 1 % РЕ-конъюгированного аннексина V и требуемого активатора (тромбин, тромбин в сочетании с конвульксином и т.д.). Объем каждой пробы составлял 10 мкл. Время активации 15 минут при комнатной температуре без перемешивания, после каждую пробу метили одним из Р1ТС-коныогированных антител: на фактор V (0.1 мкл), фибриноген (0.2 мкл), РАС-1 (0.5 мкл), С062Р (0.5 мкл). Время инкубации с антителами составляло 5 минут при комнатной температуре. Затем пробы разводили до 0.2 мл буфером А с 2.5 мМ СаСЬ и анализировали в течение 20 секунд на проточном цитометре при высокой скорости подачи пробы.

Статистическая обработка данных

Статистический анализ производили в программе О^тРго 7.5. Данные представляли как среднее ± стандартное отклонение среднего. Был проведен анализ статистической значимости полученных результатов с помощью критерия Стыодента и дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Выявление роли секреции и внутриклеточной сигнализации в формировании «укутанных» тромбоцитов

В нашей работе все эксперименты выполнялись на тромбоцитах активированных как тромбином с конвульксином, так и только тромбином. Хорошо описано, что для двойной активации тромбоцитов тромбином и конвульксином (агонистом

коллагенового рецептора GPVI) характерно появление субпопуляции «укутанных» тромбоцитов, которая экспрессирует фосфатидилсерин и сохраняет а-гранулярные белки на поверхности клетки [Dale G.L., et al. 2002; Dale G.L. 2005; Alberio L., et al. 2000]. Тромбоциты, активированные только одним тромбином, меньше охарактеризованы: было показано, что при этом виде активации образуется субпопуляция тромбоцитов с высокой экспрессией фосфатидилсерина и способностью связывать коагуляционные факторы [Panteleev М.А., et al. 2005; London F.S., et al. 2004; London F.S., et al. 2006; Feng P., et al. 1998]. Не ясно, являются ли данные тромбоциты в действительности «укутанными» [Dale G.L. 2005; Alberio L., et al. 2000; Kempton C.L., et al. 2005], имеющие высокий уровень фосфатидилсерина и содержание а-гранулярных белков на поверхности клетки, хотя [Jobe S.M., et al. 2005] сообщали об образовании субнопуляции тромбоцитов положительной по связыванию фибриногена при активации тромбином. Для того чтобы лучше охарактеризовать тромбоциты в наших экспериментах, мы проводили двойное окрашивание клеток аннексином V и антителами на а-гранулярные белки. На рисунке 1 представлены контурные плоты тромбоцитов окрашенных как на а-гранулярные белки: тромбоспондин (рис. 1 А,Б) или фибриноген (рис. 1 В,Г), так и на фосфатидилсерин; как для активации только тромбином (рис. 1 А,В), так и двойной активации тромбином с конвульксином (рис. 1 Б,Г). Оба вида стимуляции приводят к разделению тромбоцитов на две различные субпопуляции, одна из которых положительна как на фосфатидилсерин, так и на а-гранулярные белки.

Рисунок 1. Образование тромбоцитов позитивных как на а-грануляные белки, так и фосфатидилсерин либо одиночной, либо двойной стимуляции агонистамн. Представлены типичные контурные плоты связывания тромбоспондина (FL1 на рисунке А,Б) или фибриногена (FL1 на рисунке В;Г) против аннексина V (FL2) для тромбоцитов (50тыс./мкл) активированных с 1 ООнМ тромбина одного (А,В) или тромбином (ЮнМ) с конвульксином (Юнг/мл) (Б,Г). На всех представленных контурных плотах верхняя правая область, выделенная прямоугольником, является субпопуляцией двойных позитивных тромбоцитов, которые являются «укутанными» тромбоцитами.

Тогда как окрашивание на фибриноген фосфатидилсерин-экспрессирующих

100 mW тромбина

10 нМ тромбина и 10 Hrfun конвулькеши

Флуоресценция аннексинаV

тромбоцитов могло быть объяснено образованием фибрина из секретируемого фибриногена и вплетением тромбоцитов в фибриновую сеть, подобные результаты для тромбоспондина (т.е. положительная окраска на антитело к тромбоспондину) делают такое объяснение маловероятным. Кроме того, эти эксперименты показывают, что фосфатидилсерин-положительныс тромбоциты, наблюдаемые при стимуляции одним тромбином, действительно являются «укутанными» тромбоцитами.

Можно сказать, что, исследуя образование «укутанных» тромбоцитов при двух видах активации (тромбин плюс конвульксин и просто одним только тромбином), мы «моделируем» возможные варианты локализации тромбоцитов in vivo. Так, например, активация тромбоцитов тромбином с конвульксином (агонистом коллагенового рецептора GPVI) служит моделью тромбоцитов адгсзировавшихся к коллагену в месте повреждения сосудистой стенки и стимулированных одновременно как коллагеном, так и тромбином, образованным выше места свертывания. Тогда как стимуляция одним только тромбином является моделью для активации тромбоцитов свободно циркулирующих в крови и рекрутирования последних к месту повреждения, и встраивания данных тромбоцитов в растущий тромб, так как только тромбин является доступным сильным активатором. Как видно, из наших кинетических экспериментов (рис. 2) по образованию «укутанных» тромбоцитов, которые определяли как популяцию клеток с высоким содержанием прокоагулянтного фосфатидилссрина на поверхности, получается, что данная субпопуляция появляется в первые полторы минуты от начала активации, что можно связать с фазой инициации свертывания [Бутенас С., Манн К.Г. 2002], которая характеризуется образованием с относительно низкой скоростью небольшого количества тромбина, а также факторов Vila, IXa, Xa и XIa. Затем наступает фаза распространения тромбина, которая хорошо согласуется с достаточно высоким уровнем «укутанных» тромбоцитов, что может предполагать, их роль в тромбообразовании, тем, что они предоставляют свои прокоагулянтные поверхности для таких реакций свертывания, как протромбиназная.

О 5 Ю 15 20 35 30 36

Время, мин

Рисунок 2. Кинетика образованна «укутанных» тромбоцитов при активации ЮОиМ тромбина или ЮпМ тромбина с 10пг/мл конвульксииа. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для п=3 экспериментам с тромбоцитами от трех здоровых доноров.

Данная фракция тромбоцитов важна для свертывания, что подтверждается многими работами, однако до сих пор открыт вопрос о механизмах возникновения такой «загадочной» субпопуляции. Работы [Alberio L, et al. 2000; London FS, et al. 2004; Panteleev MA, et al. 2005], в которых говорилось о том, что данная фракция тромбоцитов не является предсуществующей и что количество клеток зависит только от силы и количества активатора при активации, натолкнули нас на гипотезу о том, что тромбоцитарная секреция может быть одним из контролирующих элементов в формировании «укутанных» тромбоцитов.

Так как мы предполагаем, что тромбоцитарная секреция может быть одним из контролирующих элементов образования «укутанных» тромбоцитов, то, чтобы подтвердить эту гипотезу были проведены эксперименты по активации тромбоцитов при различной их концентрации. Тромбоциты активировали в увеличивающейся концентрации либо тромбина, либо конвульксина в присутствии 10 нМ тромбина. Обнаружили, что фракция «укутанных» тромбоцитов является возрастающей функцией, как от концентрации тромбоцитов, так и от активатора (рис. 3). Эти данные дают подтверждение, что одним из контролирующих механизмов в формировании «укутанных.» тромбоцитов является тромбоцитарная секреция при активации.

-100 нМ тромбина ■ 10 нМ тромбина -1 нМ тромбина

| 80-

X 60S м

5 3 t

40

10 нМ тромбина и: - о-100 нг/мл конвульксина —о—10 нг/мл конвульксина —Д— 1 нг/мл конвульксина-i

20 40 60 80 100 120 140

Тромбоциты (103/мкл)

4 8 12 16

Тромбоциты (Ю'/мкп)

Рисунок 3. Увеличение образования «укутанных» тромбоцитов от концентрации тромбоцитов.

Тромбоциты активировали либо тромбином (А), либо тромбином с конвульксином (Б), и анализировали на проточном питометре. Количество «укутанных» тромбоцитов представлено как функция от концентрации тромбоцитов. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для п=4 экспериментам с тромбоцитами от четырех здоровых доноров.

Хотя, ранее сообщали, что увеличение количества тромбоцитов приводит к повышению экспозиции фосфатидилсерина тромбоцитами, активированными тромбином, и этот феномен приписывали к эффекту тромбоцит-тробоцитарных взаимодействий [Боттапп В., й а1. 2000], наши эксперименты выполнялись без постоянного перемешивания или встряхивания в отличие от того, что было описано в работе рЭогспапп Б., е1 а1. 2000], что исключает возможность тромбоцит-тробоцитарных

взаимодействий в наших опытах, и оставляет только объяснение наблюдаемого нами эффекта зависимостью от секреции.

Для ответа на вопрос, какие вещества секретируемые тромбоцитами при их активации могут участвовать в образовании «укутанных» тромбоцитов, мы в данной своей работе исследовали два физиологических тромбоцитарных активатора: АДФ и тромбоксан А2. Эти эксперименты выполняли при очень низкой концентрации тромбоцитов (4 тыс./мкл), которая является не насыщающейся, как видно из рисунка 3, для обоих видов активации, так что эффекты агонистов, так же как и антагонистов должны хорошо наблюдаться. Было обнаружено, что ни ингибитор тромбоксанового синтеза ацетилсалициловая кислота, ни добавление аналога тромбоксана А2 Ш6619 не имели никакого эффекта на образование «укутанных» тромбоцитов (рис. 4), что согласуется с данными, сообщенными в работе [Ргос1ап С.1., й а1. 2007], что только постоянное и непрерывное использование ацетилсалициловой кислоты имеет иншбиторный эффект на образование «укутанных» тромбоцитов, возможно, из-за ее эффекта на развитие мегакариоцитов.

I 1100 нМ тромбина

lf&';i 10нМ тромбина. Юнг/мл конвульксина

ДЦЕТИЛСйЛЦИПОвйЯ кююта

Рисунок 4. Тромбоксан \2 не регулирует образование «укутанных» тромбоцитов. Суспензия тромбоцитов (4тыс./мкл) преинкубировали в течение 1часа в присутствии или отсутствии ацетилсалициловой кислоты (ЮОмкМ), затем активировали ЮОнМ тромбина или ЮнМ тромбина с Юнг/мл конвульксина в отсутствии или присутствии стабильного аналога тромбоксана А2 Ш6619 (5мкМ). Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для п=5 экспериментам с тромбоцитами от пятерых здоровых доноров. Данные статистически достоверно не различны между контролем, преинкубацией с ацетилсалициловой кислотой и добавлением Ш6619 (р>0.05).

Добавление апиразы, наоборот, дозо-зависимо снижает появление «укутанных» тромбоцитов (рис. 5А), тогда как добавление АДФ в повышающейся концентрации

увеличивает их долю (рис. 5Б). Контролируя кинетику высвобождения плотных гранул напрямую (флуоресценция мепакрина) (рис. 6), получили, что все тромбоциты в течение первых 30 секунд после стимуляции выбрасывают содержимое плотных гранул, а вот разделение на субпопуляции происходит несколько минут позднее. Это, тем самым, поддерживает ранее сообщенные данные, что у субпопуляции «укутанных» тромбоцитов нет предшественников [Aiberio L, et al. 2000; London FS, et al. 2004; Panteleev MA, et al. 2005], а так же подтверждает наши данные, что АДФ играет контролирующую роль в развитии данной гетерогенности.

1 «

-100 нМ тромбина

-10 нМ тромбина, 10 нг/мл конвульксииа

•—100 нМ тромбина

о--10 нМ тромбина, 10 нг/мл конвульксииа

-г.....f

Апираза (ед./мл)

АДФ (мкМ)

Рисунок 5. АДФ регулирует образование «укутанных» тромбоцитов. А) Образование «укутанных» тромбоцитов как функция от концентрации апиразы; Б) образование «укутанных» тромбоцитов как функция от концентрации АДФ. Тромбоциты (4тыс./мкл) активировали тромбином или тромбином с конвульксином в указанных на панелях концентрациях в присутствии либо апиразы, либо АДФ, анализировали на проточном цитометре. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для п=4 экспериментам с тромбоцитами от четырех здоровых доноров.

ь и ^ Рисунок б. Секреция плотных гранул

во время образования «укутанных» тромбоцитов. Представлены типичные контурные дот плоты выделения плотных гранул при активации тромбоцитов (20 тыс./мл) тромбином (ЮнМ) с конвульксином (Юнг/мл). Панели с А по Е являются временными промежутками после активации: 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 минут, соответственно, где по оси ординат (РЬ1) флуоресценция мепакрина (секреция плотных гранул), а по оси абсцисс флуоресценция аннексина V (связывание фосфатидилсерина). «Укутанные» тромбоциты выделены прямоугольником на панели Е.

R-фикоэритрин - конъюгированный аннексии V (Фосфатидилсерин)

Как известно, АДФ действует на тромбоциты через свои адренергические рецепторы. Чтобы определить специфический рецептор, ответственный за эффект АДФ на формирование гетерогенности тромбоцитов, нами были выполнены эксперименты по активации тромбоцитов в присутствии специфических антагонистов АДФ рецепторов Р2У1 и Р2У12, N№52179 и 2-Ме8-5'-АМР, соответственно. МЯ82179 не имел никакого эффекта, тогда как 2-Ме8-5'-АМР ингибировал образование I «укутанных» тромбоцитов в 2раза (рис. 7), а при сравнении с положительным контролем, где добавляли АДФ, различия были 3-х и 4-х кратными, предполагая преобладающую роль рецептора Р2У12 в АДФ эффекте.

Рисунок 7. Вклад подтипов АДФ рецепторов в формирование «укутанных» тромбоцитов.

Суспензию тромбоцитов (4тыс./мкл) активировали ЮОнМ тромбина или ЮнМ тромбина с Юнг/мл конвульксина в отсутствии (контроль) или присутствии специфических антагонистов адренергических рецепторов MRS2179 (ЮмкМ) или 2-MeS-5'-AMP (ЮОмкМ), или в присутствии насыщенной концентрации АДФ (ЮмкМ). Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для п=4 экспериментам с тромбоцитами от четырех здоровых доноров. Данные статистически достоверны (* Р< 0.05, and #Р< 0.01).

Эти наблюдения согласуются с предыдущими сообщениями, что рецептор P2Y12 играет важную роль в развитии прокоагулянтной активности тромбоцитов активированных тромбином. [Dorsam RT, et al. 2004; Behan MW, et al. 2005; Leon C, et al. 2003; Storey RF, et al. 2000; van der Meijden PE, et al. 2008]

Подводя итог, наши результаты показывают, что количество «укутанных» тромбоцитов, появляющихся при активации, регулируются комплексом механизмов вовлекающих положительную обратную связь тромбоцитарной секреции: активация первых тромбоцитов приводит к выбросу содержимого плотных гранул, а именно АДФ, который через свой адренергический рецептор P2Y12 усиливает сигнал при дальнейшей активации, приводя к повышению образования «укутанных» тромбоцитов.

3

! 1100 нМ тромбина

Кк I ЮнМ тромбина. Юнг/мл конвульксина

#

КОНТРОЛЬ MRS 2179 2-MeS-5%«,MP АДФ

Известно, что Р2У12 связан с вгбелком, при активации которого происходит изменение содержания цАМФ и активация различных клеточных эффекторов, таких как фосфоинозитид-3-киназы, Ак1/протеин киназы В, Ь'гс-тирозинкиназ, в-белок управляемых калиевых каналов и др. [КаЬпег В.1\!. с1 а1. 2006].

Мы предположили, что возможные внутриклеточные механизмы, участвующие в развитии гетерогенности тромбоцитов, идут от адренергического рецептора Р2У12 (рис. 8). Было решено исследовать вклад данных путей в формировании «укутанных» тромбоцитов.

Первым из таких сигнальных механизмов был путь, связанный с уровнем цАМФ, так как известно, что аденилациклаза и связанный с ней уровень цАМФ важны для активации тромбоцита. Была выдвинута гипотеза о том, что аденилатциклаза важна для регулирования формирования «укутанных» тромбоцитов. Чтобы это проверить использовали как агоиист (форсколин), так и антагонист (8922536) для данного фермента. Для ингибирования действия аденилатциклазы тромбоциты преинкубировали в течение 30 минут с 8(322536 (ЗОмкМ), а для активации аденилатциклазы преинкубировали с форсколином (20мкМ) в течение 30 минут, затем клетки активировали либо тромбином, либо тромбином с конвульксином. Было получено, что форсколин снижает образование «укутанных» тромбоцитов в семь-десять раз, тогда как ингибитор аденилатциклазы не оказывает никакого влияния на формирование гетерогенности (рис 9.А) как при активации только одним тромбином, I так и при активации тромбином с конвульксином. Это говорит о том, что аденилатциклаза необходима для формирования гетерогенности тромбоцитов при их

]

активации, но не является регулирующей в этом механизме развития.

Следующими внутриклеточными путями, которые мы исследовали, были фосфоинозитид-3-киназа и Згс-тирозинкиназа, которые активируются при сигнализации через Р2У12.

Активация через Р2У12 приводит к стимуляции в; белка, в результате чего г происходит активация фосфоинозитид-3-киназы (РОК), поэтому для исследования данного сигнального пути проводили эксперименты по активации тромбоцитов тромбином или тромбином в сочетании с конвульксином, проинкубированных с

[&к2(МАР киназакиназы) ]

Рисунок 8. Схема исследуемой внутриклеточной сигнализации. Основана на данных [Кайпег В.И. е1 а1. 2006]

антагонистом фосфоинозитид-3-киназы (500нМ вортманнина). Обнаружили, что при ингибировании фосфоинозитид-3-киназы при обоих видах активации доля «укутанных» тромбоцитов снижается в три раза по сравнению с контролем (рис. 9.Б). В работе [Hardy A.R., et al. 2004] показано, что Src-тирозинкиназа имеет ингибирующее влияние на фосфоинозитид-3-киназный путь, идущий от P2Y12. Поэтому было предположено, что, заингибировав Src-тирозинкиназу, доля «укутанных» тромбоцитов либо не изменится, либо увеличится. Однако, наблюдали совершенно иную картину -при использований антагониста Src-тирозинкиназы РР2, доля «укутанных» тромбоцитов снижалась в четыре раза по сравнению с контролем (рис. 9.Б). На основе полученных данных можно заключить, что Src-тирозинкиназа осуществляет свое влияние па формирование «укутанных» тромбоцитов не через фосфоинозитид-3-киназу, а через какие-то еще сигнальные пути. Все эти данные говорят в пользу того, что данные пути задействованы в формировании гетерогенности тромбоцитов и могут играть ведущую роль в этом процессе.

В работе [Shankar Н., et al. 2004] показано, что G-белок управляемые К+ каналы (далее по тексту просто К+ каналы) являются важными функциональными эффекторами рецептора P2Y12 тромбоцитов человека. Было решено проверить влияние ¡С каналов на формирование гетерогенности тромбоцитов. Для исследования этого пути был использован антагонист К+ каналов SCH23390 в концентрации 200мкМ и не обнаружили достоверных различий по сравнению с контролем в изменении количества «укутанных» тромбоцитов (рис. 9.В). Следовательно, данный внутриклеточный путь не важен для образования «укутанных» тромбоцитов.

Киназа Erk2 (MAP киназа киназы) активируется рецепторами P2Y через механизм, вовлекающий Src-тирозинкиназу [Garcia A., et al. 2007]. Поскольку нами было показано выше, что Src-тирозинкиназа влияет на формирование «укутанных» тромбоцитов, то можно предположить, что ее действие осуществляется через Erk2. Для исследования роли данной внутриклеточной сигнализации был использован селективный ингибитор Erk2 U0126. При ее ингибировании не обнаружили статистически значимых различий с контролем (рис. 9.В). Следовательно, Src-тирозинкиназа не опосредует свое действие через Erk2.

Суммируя изложенные выше результаты, можно сказать, что на формирование гетерогенности тромбоцитов влияют пути внутриклеточной сигнализации, связанные с действием аденилатциклазы, фосфоинозитид-3-киназы и Src-тирозинкиназы; тогда как не оказывают никого эффекта на появление «укутанных» тромбоцитов К+ каналы и MAP киназа киназа (Erk2).

I_I 100нМ тромбина

контрсп. cmso «сеаюгж saas*

10 нМ тромбина, 10 нг/мл конвулыдажа ■ ;

I I 1С0нМ тромба

ПП

KDHTPQfb CMSO PP2 K*TM«*MH

3 10 нМ тромбина, 10 нг/Мл конвульксина

г

«я ■

в

Г 3 ЮОнМтромбинв

s 1 i

3 10 нМтрсмбима, 10 нг/мл конвульксина

нял?сл> »so ида satHMo

KWTTOIb СМ» имзй

Ряс 9. А) Аденилатциклаза влияет на формирование «укутанных» тромбоцитов. Тромбоциты преинкубировали в течение 30 минут с антагонистом (ЗОмкМ SQ22536) и агонистом (20мкМ форсколина) адеяилатциклазы, а затем активировали и анализировали на проточном цитометре. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для п=3 экспериментам с тромбоцитами от трех здоровых доноров, "-достоверное различие при р<0,05. Б) Фосфоннозитид-3-киназа и Src-тирозинкиназа регулируют формирование «укутанных» тромбоцитов. Тромбоциты инкубировали в течение 30 мипут с или без специфических антагонистов фосфоинозитид-3-кинзы (500нМ вортманнина) и Src-тирозинкиназы (ЮмкМ РР2), затем активировали и анализировали на проточном цитометре. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для п=3 экспериментам с тромбоцитами от трех здоровых доноров. Данные статистически достоверны (* р<0.05). В) MAP киназа книазы и К+ каналы ис вовлекаются в формирование гетерогенности суС/иопулнинй тромбоцитов крови ири их активации. Тромбоциты стимулировали в присутствии или отсутствии специфических антагонистов MAP кияазы киназы (20мкМ U0126) и К* каналов (200мкМ SCH23390) и анализировали на проточном цитометре. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для п=4 экспериментам с тромбоцитами от четырех здоровых доноров. Данные статистически достоверно не различны по сравнению с контролем (р>0.05).

в формировании

Роль тромбоцитарных трансглутаминаз гетерогенности тромбоцитов при их активации.

В ходе наших экспериментов было замечено, что при использовании активационной смеси, содержащей вРШ^Ы, на тромбоцитах положительных по аннексину V не обнаруживаются альфа-гранулярные белки, т.е. они не пришиваются к поверхности, тогда как в стандартной активации мы их наблюдаем (рис. 10).

Рисунок 10. Двойная окраска тромбоцитов на тромбоспопдин и фосфатидилссрин как при двойной, так и при одиночной активации. А)

активация ЮнМ тромбина с Юнг/мл конвульксина; Б) активация 150мкМ ЗРШКЫ (агонист РАЛ-1 тромбинового рецептора тромбоцитов) с Шнг/мл коквульксина, В) активация ¡ООнМ тромбина; Г) активация 150мкМ ЭРШИМ. Прямоугольником выделены тромбоциты положительные по аннексину V.

R-фикозритрин - конъюгированный аннексии V (фосфатидилсерин)

Одним из ответов на данный вопрос, что может влиять на пришивку данных белков, была идея о воздействии тромбоцитарных трансглутаминаз на данный эффект. Как известно, в работах [Dale G.L. et al. 2002; Dale G.L. 2005] показано, что a-гранулярные белки могут пришиваться к поверхности клетки через серотонин посредством трансглутаминазной реакции.

Выделяют два вида трансглутаминаз у тромбоцитов: фактор ХШа и тканевую трансглутаминазу. Для исследования вклада каждой из трансглутаминаз использовали соответствующие ингибиторы.

Используя ингибиторы цистеиновых протеиназ (ИЦП), любезно предоставленных Костановой Е.А. из института биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН, которая с коллегами показала, что данные ИЦП способны подавлять ферментативную активность фактора ХШа [Костанова Е.А. и др. 2007], мы обнаружили, что в присутствии различных концентраций препарата ИЦП при активации клеток разными агонистами доля «укутанных» тромбоцитов снижается дозо-зависимо (рис.11).

■ 10 нМ тромбина - 10 нг/мл конвульксина (1) —о— ЮО нг/мл конвульксина (2) * 100 нМ тромбина (3)

1

0,1 0,2 0,3

Концентрация ИЦП, мЛмл

Рисунок 11. Влияние ИЦП на образование «укутанных» тромбоцитов.

Тромбоциты активировали в отсутствие (контроль) или в присутствии разных концентраций ИЦП (0.05; 0.1; 0.2; 0.4 мг/мл). Активацию тромбоцитов проводили: 1 - тромбином (ЮнМ) в присутствии конвульксина (Юнг/мл); 2 -конвульксином (100нг/мл); 3 - тромбином (ЮОнМ). Представлены средние величины ± стандартные отклонения (п=4). Данные статистически значимы при Р<0.05

Для выявления участия тканевой трансглутаминазы в механизмах формирования «укутанных» тромбоцитов мы использовали ингибирующее антитело к данной трансглутаминазе в возрастающей концентрации. Добавление данного антитела к тромбоцитам до активации приводило к возникновению иншбирующего эффекта на тканевую трансглутаминазу, который наблюдался при некоторых видах активации, как снижение образования «укутанных» тромбоцитов (рис.12). Максимальный ингибирующий эффект в 4 и 3 раза по сравнению с контролем обнаружен при активации как одним конвульксином, так и при сочетании конвульксина с БИЛЛАМ, соответственно. Тогда как активация тромбином или БРЬЫШ не имела никакого эффекта при использовании иншбирующего антитела в тех же самых концентрациях, что и для других типов активации

Рисунок 12. Влияние ингибиругощего ~ антитела к тканевой трансглутаминазе

на образование «укутанных» тромбоцитов. Тромбоциты преинкубировались с возрастающей концентрацией ингибирующе1 о антитела с шагом 2 от 0 мкг/мл до 40мкг/мл Активацию тромбоцитов проводили: 1 -тромбином (ЮнМ) в присутствии конвульксина (Юнг/мл); 2 -тромбином (ЮОнМ); 3 - конвульксином (100нг/мл), 4 - конвульксином (Юнг/мл) в сочетании с ЗБОЛШ (150мкМ); 5 - вРШЫ* (150мкМ). Представлены средние величины ± стандартные отклонения (п=4). Данные статистически значимы при Р<0.05

Наши данные показывают, что и фактор ХШа, и тканевая трансглутаминаза,

55-,

ь 50 3

О 45

25 20 15-

—■— ЮнМ тромбина + Юнг/мг конвульксина (1) ------ ЮОнМ тромбина (2)

--а-- 100нг/мг конвульксина (3) —<>— Юнг/мг конвульксина +150 мкМ SFLLRN (4) -й- 150 мкМ SFLLRN (5)

О 5 10 15 20 25 30 35 41

Концентрация ингибирующего антитела на тканевую трансглутаминазу, мкг/мл

важны в ходе формирования «укутанных» тромбоцитов. Хотя при использовании | ингибирующих пептидов (рис. 13) видно, что ингибирование тканевой трансглутаминазы приводит к большему снижению доли «укутанных» тромбоцитов (в ' 2-4 раза по сравнению с контролем), из чего можно предположить, что она играет более ведущую роль в процессе развития гетерогенности тромбоцитов при их активации.

Рисунок 13. Ингибирование тканевой трансглутаминазы (1ТС-2) и фактора ХШа (К11КА) при образовании «укутанных» тромбоцитов. Тромбоциты преинкубировались в течение 30 минут с 1мМ Т26 или Р11КА, а затем активировались 5 типами активационных смесей: 1 - тромбином (ЮнМ) в присутствии конвульксина (1нг/мя); 2 - тромбином (ЮОнМ); 3 - конвульксином (Юнг/мл); 4 -конвульксином (1нг/мл) в сочетании с ЗРШШ (150мкМ); 5 - БРИ,^ (150мкМ). Представлены средние величины ± стандартные отклонения (п=2).

ВЫВОДЫ

I I. Установлено, что тромбоциты, стимулированные одним только тромбином, образуют две субпопуляции, одна из которых является «укутанными» тромбоцитами, то есть имеет высокий уровень фосфатидилсерина и содержит на поверхности альфа-гранулярные белки.

2. Доказано, что АДФ, выделяемый из плотных гранул тромбоцитов при их активации, регулирует развитие гетерогенности тромбоцитов, тогда как тромбоксан Аг не оказывает никакого влияния на этот процесс.

3. Выявлено, что АДФ опосредует свое влияние на образование «укутанных»

21

тромбоцитов при их активации через адренергический рецептор P2Y12.

4. Показано, что внутриклеточные пути сигнализации, регулирующие формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации, связаны с ингибированием аденилатциклазы, активированием фосфоинозитид-3-киназы и Src-тирозинкиназы.

5. Показано, что и фактор XlIIa и тканевая трансглутаминаза важны в ходе формирования «укутанных» тромбоцитов. Ингибирование обоих трансглутаминаз приводит к 3-7 кратному снижению количества «укутанных» тромбоцитов при разных видах активации по сравнению с контролем. Выявлено при использовании ингибирующих пептидов, что ингибирование тканевой трансглутаминазы приводит к большему снижению доли «укутанных» тромбоцитов по сравнению с ингибированием фактора XlIIa, из чего делается предположение, что она играет более ведущую роль в процессе развития гетерогенности тромбоцитов при их активации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Котова Я.Н., Костанова Е.А., Розенфельд М.А., Синауридзе Е.И., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Влияние ингибиторов цистеиновых протеиназ на тромбоцитарное и плазменное звенья системы свертывания крови. Биол.мембраны, 2009. т. 26 (5): 1-7.

2. Пантелеев М.А., Котова Я.Н., Токарев А.А., Атауллаханов Ф.И. Механизмы регуляции свертывания крови. Тер. архив, 2008. №7:88-91.

3. Koto va Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M. A. Coated platelets formation is regulated by the dense granule secretion of ADP acting via the P2Y12 receptor. J Thromb Haemost 2008; 6:1603-1605.

4. Котова Я.Н., Пантелеев M.A., Атауллаханов Ф.И. Секреция АДФ регулирует формирование гетерогенных субпопуляций при активации тромбоцитов крови. 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 года (Труды...,стр. 148)

5. Котова Я.Н., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Механизмы внутриклеточной сигнализации в формировании гетерогенных субпопуляций при активации тромбоцитов крови. 12-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 10 - 14 ноября 2008 года (Труды... ,стр. 89).

6. Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev М.А. Role of P2Y12 receptor at formation of heterogeneous platelet subpopulations. 33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference, Athens, 28 June - 3 July 2008 (Proceedings of..., p. 325).

7. Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Identification of signal transduction pathways controlling formation of heterogeneous subpopulations during platelet activation. 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research, Vienna, February 04 - 07,2009 (Proceedings of..., p. A59).

22

Подписано в печать:

14.10.2009

Заказ № 2715 Тираж - 85 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Котова, Яна Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Тромбоциты.

Рецепторы тромбоцитов.

Рецептор для коллагена.

Тромбиновые рецепторы.

Рецептор для тромбоксана А2.

Пуринэргические рецепторы (Р2 рецепторы).

Рецептор Р2У1.

Рецептор Р2У12.

Р2Х1 рецептор.

Внутриклеточная сигнализация в тромбоците.

Фосфолипаза С.

Фосфоинозитид-З-киназный путь.

Бгс-тирозинкиназа.

Митоген-активируемый протеин киназный путь (МАРК).

О-белок управляемые калиевые каналы.

Циклический аденозин монофосфат (цАМФ).

Трансглутаминазы и тромбоциты.

Тканевая трансглутаминаза 7Х?-2').

Фактор ХШа.

Плазменный фактор XIII.

Тромбоцитарный фактор XIII.

Укутанные» тромбоциты.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Выделение тромбоцитов.

2.2.2 Титрование активных сайтов тромбина.

2.2.3 Анализ гетерогенности тромбоцитов на проточном цитометре.

2.2.4 Анализ секреции плотных гранул тромбоцитов.

2.2.5 Окраска активированных тромбоцитов антителами на тромбоспондин, фибриноген, факторУ, РАС-1, CD62P.

2.2.6 Анализ агрегации и гетерогенности субпопуляций тромбоцитов на флуоресг{ентном микроскопе.

2.2.7 Окраска фибриногена флуоресцеином (FITC).

2.2.8 Электрофоретический анализ фибриногена, казеина и активностей фактора XHIa и тканевой трансглутаминазы по отношению к их субстатам.

2.2.9 Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

Характеристика тромбоцитов стимулированных как тромбином, так и тромбин с конвульксином.

Выявление роли вторичной секреции.

Внутриклеточная сигнализация, приводящая к формированию укутанного» тромбоцита.

Выявление типа тромбинового PAR рецептора тромбоцита, участвующего в формировании «укутанного» тромбоцита. роль тромбоцитарных трансглутаминаз в формировании гетерогенности тромбоцитов при их активации.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации"

Фундаментальной задачей медицины, биофизики, биохимии, молекулярной биологии и медицинской химии является исследование закономерностей функционирования системы гемостаза человека и, как следствие, возможное предотвращение таких патологических состояний, как инсульты, инфаркт, спонтанный тромбоз и др. Гемостаз является защитной реакцией организма, выражающейся в остановке кровотечения при повреждении стенки сосуда. Он возникает в результате спазма кровеносных сосудов и появления закупоривающего сосуд кровяного сгустка. В гемостатической реакции человека принимают участие окружающая сосуд ткань, стенка сосуда, плазменные факторы свертывания крови и клетки крови, в первую очередь тромбоциты. Тромбоциты - двояковыпуклые клетки дисковидной формы диаметром 1-4 мкм. Они образуются в костном мозге путем отщепления от мегакариоцитов. Концентрация тромбоцитов в крови здорового человека составляет 180 ООО - 320 ООО в 1 мкл. Главной функцией тромбоцитов является образование «белого тромба», закрывающего первичное повреждение стенки сосуда: при повреждении сосудистой стенки тромбоциты приклеиваются к месту повреждения (адгезия) и друг к другу (агрегация), создавая механический барьер, перекрывающий повреждение.

В неактивированном тромбоците мембранный бислой ассиметричен, что поддерживается работой транслоказы. Однако, при активации нарушается ассиметричность мембраны тромбоцита, активируются такие ферменты, как скрамблаза, которая кальций-зависимо приводит к фосфолипидному выравниванию между внешней и внутренней поверхностями мембраны. Это ведет к появлению во внешнем слое мембраны отрицательно заряженного фосфатидилсерина. Поверхность становится более прокоагулянтной, на ней начинают собираться прокоагулянтные комплексы свертывания. [Zwaal R.F.A. et al. 1997] Было обнаружено, что по данному параметру (уровень фосфатидилсерина на поверхности клетки) тромбоциты разделяются на две группы. Кроме того, в ходе активации тромбоциты секретируют и содержание своих гранул, альфа и плотные гранулы, которые играют важную роль в свертывании крови.

В настоящее время было показано, что сильная физиологическая активация тромбоцитов (например, тромбином в сочетании с коллагеном или конвульксином, агонистом коллагенового рецептора гликопротеина VI) может привести к развитию неоднородности в ответе тромбоцитов. Альберио JI. с соавторами первыми показали, 4 что комбинированная активация тромбоцитов двумя физиологическими агонистами, тромбином и коллагеном, способствовала экспрессии высокого уровня а-гранулярного фактора V на поверхности части тромбоцитов, кроме того эти клетки обладали высоким уровнем фосфатидилсерина на своей поверхности. Они назвали данную фракцию клеток «укутанными» тромбоцитами. [Alberio L., et al. 2000] Дейл Дж.Л. и его соавторы затем показали, что помимо а-гранулярного фактора V на поверхности «укутанных» тромбоцитов экспрессируются и другие а-гранулярные белки (фибриноген, фактор фон Виллебранта, тромбоспондин, фибронектин и а.2-антиплазмин). [Dale G.L., et al. 2002] Таким образом, новая обнаруженная субпопуляция тромбоцитов, названная «укутанными» тромбоцитами, характеризуется высоким уровнями фосфатидилсерина и альфа-гранулярных белков на своей поверхности.

В ходе изучения свойств новой фракции тромбоцитов, определили, что предшественника «укутанных» тромбоцитов не существует и количество этих клеток зависит только от условий активации. [Alberio L, et al. 2000; London F.S. et al. 2004; Panteleev M.A. et al. 2005]. Однако, важным и пока не совсем разрешимым вопросом в исследовании свойств «укутанных» тромбоцитов остаются механизмы, приводящие к их образованию.

Тромбин, а также тромбин с коллагеном или конвульксином, активируют тромбоцит, приводя к вторичной секреции, с выделением тромбоксана А2 и из плотных гранул АДФ, которые являются физиологическими активаторами тромбоцитов и их выброс важен для формирования и развития тромба при повреждении. Однако их возможная роль в формировании «укутанных» тромбоцитов не совсем понятна. Предполагая, что АДФ через свои пуринэргичсские рецепторы, а тромбоксан Аг через собственный рецептор участвуют в активации тромбоцитов. Они активируют различные сигнальные пути, которые приводят к активации гликопротеина Ilb/IIIa, агрегации, а также секреции

Дейл Дж.Л. с коллегами продемонстрировали в своей работе, что а-гранулярные белки являются субстратами для тромбоцитарных трансглутаминаз, которых выделяют у тромбоцита два вида: тканевая трансглутаминаза и фактор XHIa. Данной группой исследователей было показано, что использование ингибиторов трансглутаминаз приводит к блокированию образования «укутанных» тромбоцитов, что свидетельствует о возможной роли фактора XIHa и тканевой трансглутаминазы в формировании укутанных» тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002]. Кроме того, данная группа и еще некоторые исследователи предполагают, что ведущую роль в формировании 5 укутанных» тромбоцитов может играть фактор XHIa [Сох A., D Devine. 1994; Dale G.L. et al. 2002; Kulkarni S., et al. 2004]. Однако, Джоб C.M. с коллегами в своей работе установили [Jobe S.M. et al. 2005], что мыши дефицитные по фактору XHIa не имели трудностей в образовании «укутанных» тромбоцитов. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что фактор XlIIa не является необходимым для образования «укутанных» тромбоцитов, и предполагают, что другая клеточная трансглутаминаза, а именно тканевая трансглутаминаза, может компенсировать отсутствие фактора XlIIa. Вопрос о роли данных ферментов до сих пор не решен.

Можно сказать, что «укутанные» тромбоциты являются очень интересным и важным подклассом тромбоцитов. Имея очень прокоагулянтную поверхность, «укутанные» тромбоциты способны поддерживать протромбиназную активность. Есть указания на то, что они могут быть критическим звеном, как в нормальном гемостазе, так и при тромбозе. Однако, их точное значение в физиологии и патофизиологии, а также механизмы формирования такой гетерогенности тромбоцитов при активации не известны на сегодняшний день. Поэтому изучение сигнальных механизмов, ведущих к формированию «укутанных» тромбоцитов важно.

Цель работы: Экспериментальное исследование механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов при их активации in vitro.

Задачи исследования:

1. Определение роли секреции тромбоцитов в образовании «укутанных» тромбоцитов

2. Исследование внутриклеточных путей сигнализации, регулирующих формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации

3. Определение роли тканевой трансглутаминазы и фактора XlIIa в формировании гетерогенности тромбоцитов

Научная новизна. В работе показано, что на образование «укутанных» тромбоцитов влияет АДФ, секретируемый из плотных гранул тромбоцитов, через адренергический рецептор P2Y12. Установлено, что в формировании гетерогенности тромбоцитов участвуют внутриклеточные пути сигнализации, идущие от рецептора P2Y12 и связанные с действием аденилатциклазы, фосфоинозитид-3-киназы и Src-тирозинкиназы. Установлено, что фактор XlIIa и, особенно, тканевая трансглутаминаза вносят существенный вклад в формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации.

Научно-практическое значение данной работы является фундаментальным. Она вносит вклад в понимание механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов 6 крови человека при их активации, а также о предполагаемой роли «укутанных» тромбоцитов. Результаты данной работы могут быть полезны как для понимания происходящих процессов тромбообразования, так и для создания на основе имеющихся знаний новых методов антитромботической терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. АДФ из плотных гранул регулирует формирование гетерогенности тромбоцитов человека.

2. Сигнализация от АДФ, регулирующая образование «укутанных» тромбоцитов, идет через пуринэргический рецептор Р2У12.

3. Пути внутриклеточной сигнализации, ведущие к формированию «укутанных» тромбоцитов: аденилатциклаза, фосфоинозитид-3-киназа и 8гс-тирозинкиназа.

4. Показано, что тканевая трансглутаминаза и фактор ХШа участвуют в формировании гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Котова, Яна Николаевна

выводы

1. Установлено, что тромбоциты, стимулированные одним только тромбином, образуют две субпопуляции, одна из которых является «укутанными» тромбоцитами, то есть имеет высокий уровень фосфатидилсерина и содержит на поверхности альфа-гранулярные белки.

2. Доказано, что АДФ, выделяемый из плотных гранул тромбоцитов при их активации, регулирует развитие гетерогенности тромбоцитов, тогда как тромбоксан Аг не оказывает никакого влияния на этот процесс.

3. Выявлено, что АДФ опосредует свое влияние на образование «укутанных» тромбоцитов при их активации через адренергический рецептор Р2У12.

4. Показано, что внутриклеточные пути сигнализации, регулирующие формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации, связаны с ингибированием аденилатциклазы, активированием фосфоинозитид-3 киназы и Эгс тирозинкиназы.

5. Показано, что и фактор ХШа и тканевая трансглутаминаза важны в ходе формирования «укутанных» тромбоцитов. Ингибирование обоих трансглутаминаз приводит к 3-7 кратному снижению количества «укутанных» тромбоцитов при разных видах активации по сравнению с контролем. Выявлено при использовании ингибирующих пептидов, что ингибирование тканевой трансглутаминазы приводит к большему снижению доли «укутанных» тромбоцитов по сравнению с ингибированием фактора ХШа, из чего делается предположение, что она играет более ведущую роль в процессе развития гетерогенности тромбоцитов при их активации.

Благодарности

Я глубоко признательна руководителю лаборатории клинической коагулологии д.м.н. С.А. Васильеву за его помощь в рекрутировании и работе с больными тромбастенией Гланцмана. Благодарю к.ф-м.н. A.B. Пичугина за поддержку и предоставление оборудования в Институте иммунологии РАМН. За предоставленные ингибиторы цистеиновых протеиназблагодарю руководителя лаборатории термодинамики биосистем д.б.н. М.А. Розенфельда и к.х.н. Е.А.Костанову.

Глубоко признательна за помощь, поддержку, советы в работе Пантелееву Михаилу Александровичу

Огромная благодарность научному руководителю д.б.н.Ф.И. Атауллаханову.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Котова, Яна Николаевна, Москва

1. Бутенас С., Манн К.Г. «Свертывание крови», Биохимия 2002, 67(1): 5-15.2. под редакцией Козинца Г.И. и Макарова В.А. «Исследование системы крови в клинической практике», Триада-Х, Москва 1998.

2. Костанова Е.А., Розенфельд М.А., Ревина Т.А., Валуева Т.А. «Белковые ингибиторы фибринстабилизирующего фактора (XIII)», Известия академии наук 2007, 3: 347—353

3. Abrams C.S., Brass L.F. «Platelet signal transduction», In: Hemostasis and Thrombosis, edited by Colman R.W., Hirsh J., Marder V.J., Clowes A.W., George J.N. Philadelphia, PA: Lippincott William & Wilkins 2001, p.541-559

4. Adam F., Verbeuren T.J., Fauchere J.-L., Guillin M.-C., Jandrot-Perrus M. «Thrombin-induced platelet PAR4 activation: role of glycoprotein lb and ADP», Journal of Thrombosis and Haemostasis 2002, 1: 798-804

5. Akimov S.S., Krylov D., Fleischman L.F., Belkin A.M. «Tissue transglutaminase is an integrin-binding adhesion coreceptor for fibronectin», The Journal of Cell Biology 2000, 148(4): 825-838

6. Alberio L, Safa O, Clemetson KJ, Esmon CT, Dale GL. «Surface expression and functional characterization of alpha-granule factor V in human platelets: effects of ionophore A23187, thrombin, collagen, and convulxin», Blood 2000, 95: 1694-1702

7. Brass L.F., Joseph S.K. «А role for inositol triphosphate in intracellular Ca2+ mobilization and granule secretion in platelets», Journal of Biological Chemistry 1985, 260(28): 15172-15179

8. Brass L.F. «Thrombin and platelet activation», CHEST 2003, 124:18S-25S

9. Cooke R.D., Holbrook J.J. «Calcium and the assay of human plasma clotting factor XIII», Biochemical Journal 1974, 141: 71-78.

10. Covic L., Gresser A. L., Kuliopulos A. «Biphasic kinetics of activation and signaling for PARI and PAR4 thrombin receptors in platelets», Biochemistry 2000, 39: 54585467

11. Cox A.D., Cevine D.V. «Factor XHIa binding to activated platelets is mediated through activation of glycoprotein Ilb-IIIa», Blood 1994, 83(4): 1006-1016

12. Dale G.L. «Coated-platelets: an emerging component of procoagulant response», Journal of Thrombosis and Haemostasis 2005, 3: 2185-2192

13. Dale GL, Friese P, Batar P, Hamilton SF, Reed GL, Jackson KW, Clemetson KJ, Alberio L. «Stimulated platelets use serotonin to enhance their retention of procoagulant proteins on the cell surface», Nature 2002;415:175-179.

14. Dangelmaier C., Jin J., Smith J.B., Kunapuli S.P. «Potentiation of thromboxane A2-induced platelet secretion by Gi signaling through the phosphoinositide-3 kinase pathway», Thrombosis and Haemostasis 2001, 85:341-348

15. Daniel J.L., Dangelmaier C., Jin J., Kim Y.B., Kunapuli S.P. «Role of intracellular signaling events in ADP-induced platelet aggregation», Thrombosis and Haemostasis 1999, 82:1322-1326

16. Dormann D, Clemetson KJ, Kehrel BE. «The GPIb thrombin-binding site is essential for thrombin-induced platelet procoagulant activity», Blood 2000; 96: 2469-2478

17. Dorn G.W.D. «Distinct platelet thromboxane A2/prostaglandin H2 receptor subtypes. A radioligand binding study of human platelets», Journal of Clinical Investigation 1989,84:1883-1891

18. Dorsam R.T., Kunapuli S.P. «Central role of the P2Y12 receptor in platelet activation», Journal of Clinical Investigation 2004, 113(3): 340-345.

19. Dorsam RT, Tuluc M, Kunapuli SP. «Role of protease-activated and ADP receptor subtypes in thrombin generation on human platelets», Journal of Thrombosis and Haemostasis 2004; 2: 804-812.

20. Erhardt J.A., Toomey J.R., Douglas S.A., Johns D.G. «P2X1 stimulation promotes thrombin receptor-mediated platelet aggregation», Journal of Thrombosis and Haemostasis 2006, 4: 882-890

21. Feng P, Tracy PB. «Not all platelets are equal procoagulants?», Blood 1998; 98: Suppl. 350a, 1441 (abstr.).

22. Fung C.Y.E., Cendana C., Farndale R.W., Mahaut-Smith M.P. «Primary and secondary agonists can use P2X1 receptors as a major pathway to increase intracellular Ca2+ in the human platelet», Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007, 5: 910-917

23. Garcia A., Shankar H., Muragappan S., Kim S., Kunapuli S.P. "Regulation and functional consequences of ADP receptor-mediated ERK2 activation in platelets", Biochemical Journal 2007, 404: 299-308

24. Gorman J.J., Folk J.E. «Structural features of glutamine substrates for human plasma factor XHIa (activated blood coagulation factor XIII)», Journal of Biological Chemistry 1980, 255(2): 419--427.

25. Greenberg C.S., Birckbichler P.J., Rice R.H. «Transglutaminases: multifunctional cross-linking enzymes that stabilize tissue», FASEB Journal 1991, 5: 3071-3077

26. Griffin M., Casadio R., Bergamini C.M. «Transglutaminases: nature's biological glues», Biochemical Journal 2002, 368: 377-396

27. Habib A., FitzGerald G.A., Maclouf J. «Phosphorylation of the thromboxane receptor a, the predominant isoform expressed' in human platelets», Journal of Biological Chemistry 1999, 274(5): 2645-2651

28. Hamilton SF, Miller MW, Thompson CA, Dale GL. «Glycoprotein Ilb/IIIa inhibitors increase COAT-platelet production in vitro», Journal of laboratory and clinical medicine 2004; 143: 320-326.

29. Hardy A.R., Jones M.L., Mundell S.J., Poole A.W. «Reciprocal cross-talk between P2Y1 and P2Y12 receptors at the level of calcium signaling inhuman platelets», Blood 2004, 104: 1745-1752

30. Hechler B., Cattaneo M., Gachet C. «The P2 receptor in platelet function», Seminars in thrombosis and hemostasis 2005, 31(2): 150-161

31. Hollopeter G.J.H., Vincent D., Li G. et al. «Identification of the platelet ADP receptor targeted by antithrombotic drugs», Nature 2001, 409: 202-207

32. Israels E.D., Paraskevas F., Israels L.G.» Immunological studies of coagulation factor XIII», Journal of clinical investigation 1973, 52(10): 2398--2403.

33. Janiak A., Zemskov E.A., Belkin A.M. «Cell surface transglutaminase promotes RhoA activation via integrin clustering and suppression of the Src-pl90RhoGAP signaling pathway», Molecular Biology of the Cell 2006, 17: 1606-1619

34. Jayo A., Conde I., Lastres P., Jimenez-Yuste V., Gonzalez-Manchon C. «New insight into the expression and role of platelet factor XIII-A», Journal of Thrombosis and Haemostasis 2009, 7(7): 1184-1191

35. Jin J., Daniel J.L., Kunapuli S.P. «Molecular basis for ADP-induced platelet activation. II. The P2Y1 receptor mediates ADP-induced intracellular calcium mobilization and shape chance in platelets», Journal of Biological Chemistry 1998; 273: 2030-2034

36. Jobe S.M., Leo L., Eastvold J.S., Dickneite G., Ratliff T.L., Lentz S.R., Di Paola J. «Role of FcRy and factor XHIa in coated platelet formation», Blood 2005, 106(13): 4146-4151.

37. Kahner B.N., Dorsam R.T., Kunapuli S.P. «Role of P2Y receptor subtypes in platelet-derived microparticle generation», Bioscience 2008, 13: 433-439

38. Kahner B.N., Shankar H., Murugappan S., Prasad G.L., Kunapuli S.P. «Nucleotide receptor signaling in platelets», Journal of Thrombosis and Haemostasis 2006, 4:2317-2326

39. Kempton C.L., Hoffman M., Roberts H.R., Monroe D.M. «Platelet heterogeneity: variation on coagulation complex on platelet subpopulations», Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2005, 25: 861-866.

40. Kim S., Jin J., Kunapuli S.P. «Relative contribution of G-protein-coupled pathways to protease-activated receptor-mediated Akt phosphorylation in platelets», Blood 2006, 107(3): 947-954

41. Kulkarni S., Jackson S.P. «Platelet factor XIII and calpain negatively regulate integrin allbp3 adhesive function and thrombus growth», Journal of Biological Chemistry 2004, 279(29): 30697-30706

42. Lee K.N., Birckbichler P.J., Patterson M.K, Jr. «GTP hydrolysis by guinea pig liver transglutaminase», Biochemical and biophysical research communications 1989, 162: 1370-1375

43. Leon C, Ravanat C, Freund M, Cazenave JP, Gachet C. «Differential involvement of the P2Y1 and P2Y12 receptors in platelet procoagulant activity», Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2003; 23: 1941-1947

44. Leon C., Alex M., Klocke A., Morgenstern E., Moosbauer C., Eckly A., Spannagl M., Gachet C., Engelmann B. «Platelet ADP receptors contribute to the initiation of intravascular coagulation», Blood 2004, 103: 594-600

45. Lian L., Wang Y., Draznin J., Eslin D., Bennett J.S., Poncz M., Wu D., Abrams C.S. «The relative role of PLC p and PI3Ky in platelet activation», Blood 2005, 106(1): 110-117

46. London F.S., marcinkiewicz M., Walsh P.N. «A subpopulation of platelets responds to thrombin- or SFLLRN-stimulation with binding site for factor IXa», Journal of Biological Chemistry 2004, 279(19): 19854-19859

47. London FS, Marcinkiewicz M, Walsh PN. «PAR-1-stimulated factor IXa binding to a small platelet subpopulation requires a pronounced and sustained increase of cytoplasmic calcium», Biochemistry 2006; 45: 7289-7298.

48. Lorand L., Parameswaran K.N., Velasco P.T., Hsu L.K., Siefring G.E. Jr. «New colored and fluorescent amine substrates for activated fibrin stabilizing factor (Factor XHIa) and for transglutaminase», Analytical biochemistry 1983, 131(2): 419-425.

49. Lorand L. «Factor XIII: structure, activation and interaction with fibrinogen and fibrin», Annals New York academy of Sciences 2001, 936: 291-311

50. Maroney S.A., Haberichter S.L., Friese P., Collins M.L., Ferrel J.P., Dale G.L., Mast A.E. «Active tissue factor pathway inhibitor is expressed on surface of coated platelets», Blood 2007, 109(5): 1931-1937

51. McDonach J., McDonach R.P., Jr., Delage J.-M., Wagner R.H. «Factor XIII in human plasma and platelets», Journal of Clinical Investigation 1969, 48: 940-946

52. Murugappan S., Shankar H., Kunapuli S.P. «Platelet receptors for adenine nucleotides and thromboxane A2», Seminars in thrombosis and hemostasis 2004, 30(4): 411-418

53. Norgard NB, Hann CL, Dale GL. «Cangrelor attenuates coated-platelet formation.», Clinical and applied thrombosis/hemostasis 2009; 15(2): 177-182.

54. Norgard NB, Saya S, Hann CL, Hennebry TA, Schechter E, Dale GL. «Clopidogrel attenuates coated-platelet production in patients undergoing elective coronary catheterization», Journal of cardiovascular pharmacology 2008; 52(6): 536-539.

55. Offermanns S. «Activation of platelet function through G protein-coupled receptors», Circulation Research 2006, 99: 1293-1304

56. Oury C., Toth-Zsamboki E., Vermylen J., Hoylaerts M.F. «P2X(l)-mediated activation of extracellular signal-regulated kinase 2 contributes to platelet secretion and aggregation induced by collagen», Blood 2002, 100(7):2499-2505

57. Oury C., Toth-Zsamboki E., Vermylen J., Hoylaerts M.F. «The platelet ATP and ADP receptors», Current Pharmaceutical Design 2006, 12: 859-875

58. Paul B.Z.S., Jin J., Kunapuli S.P. «Molecular mechanism of thromboxane A2-induced platelet aggregation. Essential role for P2Tac and a2A receptors», Journal of Biological Chemistry 1999, 274(41): 29108-29114

59. Polgar J., Hidasi V., Muszbek L. «Non-proteolytic activation of cellular protransglutaminase (placenta macrophage factor XIII) », Biochemical Journal 1990, 267: 557-560

60. Prodan CI, Joseph PM, Vincent AS, Dale GL. «Coated-platelet levels are influenced by smoking, aspirin, and selective serotonin reuptake inhibitors», Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007; 5: 2149-2151

61. Quinter P.G., Dangelmaier C.A., Quinton T.M., Kunapuli S.P., Daniel J.L. «Glycoprotein VI agonists have distinct dependences on the lipid raft environment», Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007, 5:362-368

62. Rebecchi M.J., Pentyala S.N. «Structure, function and control of phosphoinositide-specific phospholipase C», Physiological Reviews 2000, 80(4): 1291-1335

63. Reed G.L., Matsueda G.R., Haber E. «Platelet factor XIII increase the fibrinolytic resistance of platelet-rich clots by accelerating the crosslinking of ci2-antiplasmin to fibrin», Thrombosis and Haemostasis 1992, 68(3): 315-320

64. Reed G.L. «Platelet secretion». In: , edited by A.D. Michelson, Elsever, 2007, chapter 15, pp. 309-318

65. Remenyi G, Szasz R, Friese P, Dale GL. Role of mitochondrial permeability transition pore in coated-platelet formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2005;25:467-471.

66. Rittenhouse S.E. «Phosphoinositide 3-kinase activation and platelet function», Blood 1996, 88(12): 4401-4414; L.C. Cantley. «The phosphoinositide 3-kinase pathway», Science 2002, 296: 1655-1657

67. Sane D.C., Kontos J.L., Greenberg C.S. «Roles of transglutaminases in cardiac and vascular diseases»,. Bioscience 2007, 12: 2530-2545

68. Schwartz M.L., Pizzo S.V., Hill R.L., McKee P.A. «The Subunit structure of human plasma and platelet factor XIII (Fibrin-stabilizing factor)», Journal of Biological Chemistry 1971, 246(18): 5851-5854

69. Shankar H., Murugappan S., Kim S., Jin J., Ding Z., Wickman K., Kunapuli S.P. «Role of G protein-gated inwardlyrectifying potassium channels on P2Y12 receptor-mediated platelet functional responses», Blood 2004, 104: 1335-1343.

70. Shapiro M. J., Weiss E. J., Faruqi T. R. et al. «Protease-activated receptors 1 and 4 are shut off with distinct kinetics after activation by thrombin», Journal of Biological Chemistry 2000, 275: 25216-25221

71. Szasz R. & Dale G.L. «Thrombospondin and fibrinogen bind serotonin-derivatized protein on COAT-platelets», Blood (2002) 100:2827-2831

72. Takahara K, Murray R, FitzGerald GA, Fitzgerald DJ. «The response to thromboxane A2 analogues in human platelets. Discrimination of two binding sites linked to distinct effector systems», Journal of Biological Chemistry 1990; 265: 6836 6844

73. Voss B., McLaughlin J.N., Holinstat M., Zent R., Hamm H.E. «PARI, but not PAR4, activates human platelets through a Gi/0/Phosphoinositide-3 kinase signaling axis», Molecular Pharmacology 2007, 71:1399-1406

74. Wang D.S., Dickson D.W., Malter J.S. «Tissue Transglutaminase, protein cross-linking and Alzheimer's Disease: Review and Views», International journal of clinical and experimental pathology (2008) 1: 5-18

75. Watson S.P. «Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor?», Blood 2003, 102(2):449-461

76. Watson S.P., Auger J.M., McCarty O.J.T., Pearce A.C. «GPVI and integrin allbp3 signaling in platelets», Journal of Thrombosis and Haemostasis 2005, 3:1752-1762

77. Webber A. J., Firkin B.G. «Two Populations of Platelets» Nature 205, 1332 (27 March 1965)

78. Wettschureck N., Offermanns S. «Mammalian G proteins and their cell type specific function», Physiological Reviews 2005, 85: 1159-1204

79. Zhang W., Colman R.W. «Thrombin regulates intracellular cyclic AMP concentration in human platelets through phosphorylation/activation of phosphodiesterase 3A», Blood 2007, 110(5): 1475-1482

80. Zwaal R.F.A., Comfurius P., Bevers E.M. «Lipid-protein interaction in blood coagulation», Biochimica et Biophysica Acta 1998, 1376: 433-453

81. Zwaal R.F.A., Schroit A.J. "Pathophysiologic implications of membrane phospholipids asymmetry in blood cells", Blood 1997; 89(4): 1121-1132