Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Fe-рецептор активация тромбоцитов моноклональными антителами против мембранных гликопротеинов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Fe-рецептор активация тромбоцитов моноклональными антителами против мембранных гликопротеинов"

V о 09 2 >

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНГР

На правах рукописи

ВИНОГРАДОВ ДМИТРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Рс-рецептор-завнсимая активация тромбоцитов моноклональными антителами против мембранных гликопротеинов

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа ныполнена в лаборатории культур клеток и тканей Института экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР.

Научный рукополитель: кандидат биологических наук.

нсл.н с. Мазурон A.B.

Официальные оппоненты:

доктор биологических паук, профессор Леницкии Л.О кандидат медицинских наук Тспцопа И.А.

Ведущее учреждение: Институт биологической и медицинской химии АМН СССР.

Защита состоится Zr.-fi&TAÍ/ZД. i ч ч i года и часом па

заседании специализированного ученого сонета К 001.22.02 по Всесоюзном кардиологическом научном центре АМН СССР по адресу: Москва. 3-я Черепковская улица, д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться н библиотеке Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР.

Автореферат разослан

99 1 года

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук ^—Венгерова Т.И.

,;: ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ч -Актуальность темы исслепопания. Тромбоциты играют ключевую роль в процессах гемостаза и тромбоза. Эта роль определяется двумя основными свойствами тромбоцитов - способностью к адгезии на поврежденной сосудистой стенке, что приводит к закрытию и последующей репарации места повреждения, и к агрегации. т.е.. к образованию крупных конгломератов, приводящему п конце концов к формированию тромба и выключению сосуда из кровотока. Способность к алгезии и агрегации опосрелуется гликопротепмами наружной мембраны тромбоцитоп. Мембранные гликопротеины служат рецепторами как индукторов тромбоцитарпой активности. так и ад|езивных белков, участвующих о процессах алгезии и агрегации (.Телк1ПБ М а1. 1976).

В последнее время лля изучения мембранных гликопротеипов тромбоцитов широко используются моиоклональные ангпгсла (чАТ). В различных лабораториях мира получено очень большое количество маТ против целого ряда гликопротенпен тромбоцитарпой мембраны. С помощью этих мАТ было получено множество новых сведении о структуре и механизмах функционирования поверхностных белкоп тромбоцп-> тов. Как правило, мАТ либо никак не влияют па функциональную активность тромбоцитов, либо подавляют се. экранируя какой-либо рецептор от связывания с лиганлом. Однако, в литературе имеется ряд сообщений о моноклональиых антителах. способных активировать тромбоциты (см. напр. ВоисЬе1х е1 а1. 19Х.1). Хотя эти антитела направлены против различных мембранных антигенов, вызываемая ими активация тромбоцитов имеет ряд общих черт, что указывает на существование общего пути активации тромбоцитов моноклопальпыми антителами. До сих пор механизм этого явления изучен не был.

.Феномен активации тромбоцитов антителами наблюдается не только в экспериментальных условиях, но и в клинической практике. В литературе имеется ряд сообщений о том, что при некоторых гематологических и аутоиммунных заболеваниях в крови пациентов обнаруживаются антитела, способные активировать тромбоциты (см. напр. Kel-- ton ct al, 1986). Свойства этих иммуноглобулинов весьма схожи со свойствами активирующих моноклональных антител. Таким образом, изучение механизма активации тромбоцитов моноклональными антителами является важным как с общебиологической, так и с практической точки зрения.

Цель и папдчи иг.г.лелоиания Целью настоящей работы явилось изучение механизма активации тромбоцитов моноклональными антителами против гликопротеинов их наружной мембраны. В задачи исследования входило:

1) Охарактеризовать полученное автором моноклональное антитело VM58, обладающее способностью активировать тромбоциты.

2) Используя мАТ VMS8, а также еще дна активирующих мАТ (а-мАТ) -LeoAl и FMC56, которые были получены н других лабораториях, выяснить механизм активации тромбоцитов антителами против антигенов тромбоцитарной мембраны.

3) Выяснить природу обнаруженной гетерогенности реакции тромбоцитов разных доноров на действие а-мАТ.

4) Изучить механизм ингибирования а-мАТ-инлуцирооамной активации тромбоцитов моноклональными антителами против комплекса гликопротеинов Ilb-IIIa тромбоцитарной мембраны.

Новизна результатов. Впервые показано, что активация тромбоцитов антителами против мембранных гликопротеинов не зависит от

приролы антигена а-мАТ. Обнаружено. что а-м*Т-ипм>пиронанпая активация опосрелопана связыванием Fe-фрагмента анттсн с ичеп-тимся на мембране тромбоцитоп рецептором Fe-фра! ченюн нчч>по-глобулннов G. Показано, что а-мАТ сначала связывасгея с помощью Fab-фрагментоп с антигеном. а затем - через Fe-фра! mcmi - с Fr-рецептором tромбоцитов. и что именно связывание Fe-фрт чгмг я с Fe - рецептором прииолит к активации тромбоппi он

Впервые обнаружена i oTopoi еиноо11> релкинм i рочбопи т ом на леПстпис ак типнру кмких моноклоналкных niiuiici i пой i .nf«>v ct л1. 1400) п пролемонстрнронана ее епян. с известим поличорфмпю« fe-рецептора тромбоцитоп. являющимся причиной i с i е рш енпоеi и реакции тромбоцитоп на действие некоторых Jtpyiп\ Г с - рецептор-зависимых инлуктороп (Mazurov et al. 1491).

Показано. что активация тромбомиron Fe-ренепгор-зависимыми иилукторамп ингибпруется моноклопат.ними ап t п юлами прошв i лико-п[5отеиноного комплекса I Ib-II la тромбоциi арном мембраны. п чго это ингибиронание не является слслпнпсм конк.ргпнни мАТ прогни ГППЬ-IIIa и а-мАТ ни за антиген, пи за Fe - рецеп гор (Bnnoi ралов и соавт. . I'ioi). Прелполагается. что м\Т прошв ГППЬ-IIIa ппгиби-руют связывание Fc-фрагментов а-мАТ с Fe-рецептором стернчсскп. в силу топографической ассоциации ГППЬ-IIIa и Fe-рецептора на мембране тромбоцитов.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные позволяют понять неизвестный ранее механизм активации тромбоцитов моноклональными антителами против гликопротеинов тромбоцитарной мембраны. Из результатов работы слелует, что а-мАТ относятся к Рс-рецептор-зависимым индукторам активации тромбоцитов, и что действие их на тромбоциты разных лоноров зависит от

структуры тромбоцитарного Fc-рецептора. Полученные данные указы-' вают на то, что Fc-рецептор ассоциирован в мембране тромбоцитов с комплексом ГППЬ-IIIa. Таким образом, основные положения диссертации расширяют представления о функционировании тромбоцитарного звена гемостаза. Данные о механизме активации тромбоцитов антителами позволяют объяснить этиологию и патогенез тромбоцитопеничес-ких и тромботических осложнений некоторых аутоиммунных и гематологических заболеваний, при которых в крови пациентов обнаруживаются активирующие антитела.

Апробация работы Основные результаты работы были представлены на 3-м Эрфуртском рабочем совещании по тромбоцитам (Эрфурт, 1989) и на XIII конгрессе межлуларолного общества по тромбозу и гемостазу (Амстердам, 1991). Диссертация была апробирована на межлабораторном семинаре во Всесоюзном кардиологическом научном центре (Москва, 1991 г.).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Структура и об-ьем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Вынолы" и "Список литературы". Объем работы 155 страниц машинописного текста, она содержит 30 рисунков и 1 таблицу. Библиография включает 207 ссылок на отечественные и зарубежные работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Кровь для выделения тромбоцитов брали у эдороных добровольцев, не принимавших лекарств в течение двух недель перси взятием крови, а также у двух ранее описанных пациентом с тромбастснисй Гланцманна (Meycr et al, 1983). Для получения обогащенной тромбо-

цитами плазмы (ОТП) кровь собирали п З.Я1? нитрат натрия п центрифугировали 10 мин. при 180 g. Отбирали 2/3 слоя ОТП. Для получения отмытых тромбоцитов (ОТ) кровь собирали в кислый-цитрат-декстрозу (КЦД) (65 мМ лимонной кислоты, 85 мМ цитрата натрия. D-глюкоэы) и центрифугировали 15 мин при 180 g для получения ОТП. Отмывку тромбоцитов от плазмы производили по методу Patcheke (1981) с незначительными изменениями. Поело отмывки тромбоциты суспендировали в модифицированном растворе Тироле {Тироле-HEPES)

Для получения моноклопальных антител самцов мышей линии BALB/c иммунизировали тромбоцитами внутрибрюшинно п течение 2 месяцем с интервалом н ? недели. Слияние спленоцнтон иммунизированных мышей с мышиной миеломой Xfi3-AgK-h5 3 и клонирование гибридных клеток проводили по Koehler и Milstein (1975). Для получения препаративных количеств мАТ гибридные клетки выращивали в брюшной полости мышей линии BALB/c. Антитела из аснитпых жидкостей выделяли с помощью прсципнт-ацпп Na,S<)4 н последующей ионообменной хроматографии. Чистоту препаратом мАТ промеряли с помощью электрофореза в 7.51 ПААГ по Laemmli (1470).

Для определения содержания антител в сыморогках. культу-ральпых средах и хроматографичеекпх фракциях был разработан специальный вариант иммуноферментного анализа (11ФА) с использованием не фиксированных. как это принято в мировой практике, а ингактпых тромбоцитов. (Mazurov et al, 1991). Суспензию отмытых тромбоцитов вносили в лунки культуралыгых пластин. осаждали при 1000 g и инкубировали в течение 30 мин. при 3 7°С для прикрепления тромбоцитов к пластику. После инкубации лунки осторожно но тщательно промывали пипеткой для удаления неприкрепившихся тромбоцитов. Все последующие отмывки тоже производит! с помощью пипетки.

Определение изотипов полученных мАТ проводили методом дот-, блоттинга, используя набор антисывороток для определения изотипов мышиных IgG фирмы Amersham (Великобритания). Все описываемые в настоящей работе мАТ принадлежали к подклассу IgGl( ).

F(ab')^-фрагменты антите/j получали путем обработки мАТ пепсином по методу Coller и'соавт. (1983). Для удаления нерасщепив-шихся IgG и Fc-фрагментов препараты инкубировали с заведомым избытком Протеин-А-Сефарозы. Чистоту полученных F(ab')^-фрагмен-тов контролировали с помощью SDS-электрофореза в 7.5% ПААГ.

Агрегированные мышиные и человеческие IgG (arp-IgG) получали по методу Fhueller и Lusher (1972), добавляя к очищенным IgG равный объем холодного ацетона, с последующей инкубацией на льду и многократным диализом против фосфатно-солевого буфера (ФСБ).

Для исследования связывания с тромбоцитами мАТ метили йодом-125 с помощью йодогена по Fracker и Speck (1978). 12^1-мАТ инкубировали с суспензией тромбоцитов в течение 30 мин. при

37 С. Для

отделения несвязавшихся антител тромбоциты центрифугировали при 9800 g в течение 4 мин. через 20"3f. сахарозу. После центрифугирования пробирки замораживали, отрезали попытки и определяли связанную с тромбоцитарным осадком радиоактивность. Для определения несвязанной радиоактивности просчитывали верхние части пробирок.

Исследование агрегации тромбоцитов проводили в агрегометрах

Aggregation Analyzer (с/п Астек, СССР-Австралия) и Payton ("Scar-

8 H

borough", США) при концентрации тромбоцитов 2x10 -3x10 /мл. при температуре 3 7°С и при перемешивании со скоростью 900 об/мин. Агрегацию индуцировали ADP, ^ристоцотином. тромбином, arpIgG и активирующими моноклональными антителами.

Определение секреции тромбоцитами АТФ проводили в ОТП, полу-

ченной из крови. антикоагулированной .1.81 цитратом Nn. и мючи-агрегометре Payton 1000. Повышение концентрации Са~ п ниiонлатмс-тромбоцитов определяли по метолу Popov и соант. (198.4) с помощью флуоресцентного зонда Индо-IAM в многоканальном лазерном фл\орсс-центном анализаторе.

Для определения антигенов мАТ поверхность трочбопиI он мгг или йолом-125 с помощыо лактопероксипазы по чстол\ Fhillips м'»'; ). с незначительными модификациями. Затем грочЛопнты солгСшнишронлли Тритоном Х-1П0 и выдерживали 10 чин н попянш! Ляпе Moine пою провопили иммунопрецнпнтапию по Berndt и соант м'>.ч\|, <• пгноль-зовапием суспензии Staphi lococcus aureus (пямсорбпн) и лппмгл козы против мышиных иммуноглобулином ПрсципнIмроиаииые 1ромбони-тарные белки анализировали с помощью SDS-iлекiрофореэа по Laemmli ( 1 970) в 71 ПААГ 11 невосстанавлинашннх и носстапаплинатших < >'! 2-меркаптоэтанол) условиях. После электрофореза получали ангорално-граммы высушенных гелей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Свойства мАТ VMSq

В результате гибридизации сплсноннтоп пмм>пнзнронанной тромбоцитами мыши с клетками мышиной миеломы мы получили несколько гибридных клонов, синтезирующих антитела протип антигенов тромбо-цитарной -поверхности. Ориентируясь на уровень связывания культу-ральных сред клоков с тромбоцитами, мы выбрали для дальнейших исследований 4 гибридомных клена. Антитела. синтезируемые этими клонами, были получены в препаративных количествах (по 50-100 mi-чистых мАТ). Чистота полученных мАТ контролировалась метолом SDS-ПААГ-электрофореза.

Для определения влияния полученных мАТ на функциональную

активность тромбоцитов были проведены эксперименты по агрегомет-рии. В результате этих экспериментов выяснилось, что. в отличие от большинства описанных в литературе мАТ к антигенам тромбоци-тарной поверхности, которые либо никак не влияют на функциональную активность тромбоцитов, либо ингибируют ее, одно из полученных нами мАТ - VM58 - само по себе является индуктором тромбопн-тарной активности и вызывает агрегацию тромбоцитов. Агрегация начиналась при добавлении в кювету агрегометра очень малых лоз VM58 - менее О.5 мкг/мл. Увеличение концентрации мАТ сокращало лаг-фазу агрегации, но максимальный уровень агрегации при этом практически не изменялся (рис. 1). Ингибитор активности тромбоцитов простагландин Е1 полностью предотвращал VM58-HimynnpoBaHHyio агрегацию. Этот результат свидетельствовал о том, что наблюдаемый нами эффект есть истинная агрегация, а не пассивная агглютинация тромбоцитов.

Антитело VMS8 было способно вызывать агрегацию тромбоцитов как в ОТП (рис. I и 2А), так и в суспензии ОТ (рис. 2Б). Одновременно с агрегацией наблюдалась секреция тромбоцитами АТФ. свидетельствующая о высвобождении содержимого плотных гранул (рис. 2А), а также повышение концентрации в тромбоцитах цитоплазмати-ческого Са^+ (рис. 2Б). Эти результаты доказывали, что антитело VM58 является полноценным индуктором, способным вызывать истинную активацию тромбоцитов.

Изучая связывание VM58, меченого йодом-125, с тромбоцитами в

суспензии, мы определили, что константа связывания VM58 с тромбо-_ g '

цитами Kd - 1.2 х 10 М, а максимальное число мест связывания VM58 на одном тромбоците Вшах = 11400 (рис 3). Следует отметить, что концентрационные зависимости уровня связывания l2^I-VM58 с

^МИЕШИИНИ.....*.....l'^Pff***^

1 МИН.

LArperZU"" tP°m6°U"tob. индуцированная MAT VM58. У добавляли до конечной концентрации 0.5 мкг/мл (1), 1 мкг/мл S (3) и 20 мкг/ил (4,5) к интактной ОТП (1-4), или к ОТП

прединкубированной с 200 нг/мл ПГЕ1 (5). Момент добавления VM58 отмечен стрелкой.

>.100 оГ

Я 80

о £

8

во

40 20

~г 0

~г 2

I

4

Время, мин.

оГ

100 80 60 40 20

в

о

0.0 ©

Е-"

с

05

10

15

~1 8

«

го cS

о

~г 2

~г 4

~г 6

100

О

8

Время, мин.

Рис. 2. Секреция АТФ и повышение концентрации цитоплазматического Са , индуцированные мАТ VMS 8.

К тромбоцитам добавляли VM5 8 до концентрации 20 мкг/мл. Секрецию АТФ регистрировали в ОТП (А), а повышение концентрации цитоплазматического Саг* - в ОТ (Б) одновременно с агрегацией, как описано в разделе 'Материалы и методы". Момент добавления VM5 8 отмечен стрелками.

тромбоцитами и длительности лаг-фазы УМ58-индуцированной агрегации тромбоцитов хорошо коррелировали друг с другом.

Для определения природы антигена MAT VM58 мы провели опыты

12 5.

по иммунопреципитации антителом VM5 8 его антигена из лизата I-меченных тромбоцитов. В преципитатах VM58 обнаруживался один белок, мол. вес которого составлял 90 кДа как в невосстанавливаю-щих, так и в восстанавливающих условиях. На основании характера электрофоретической миграции антнгена и количества его молекул'на поверхности одного тромбоцита мы предположили, что антигеном VM58 является гликопротеин IV (ГП1У) - белок с мол. весом 91000 кДа. представленный на тромбоците в количестве 12000-14000 копий (Asch et al, 1987). Похожий молекулярный вес имеет еще один ГП тромбо-цитарной мембраны - ГПП1а (Pidard et al, 1983), однако, некоторые факты свидетельствовали против того. что VM5 8 связывается с

4

этим ГП. Во-первых, мол. вес ГП111а, определяемый при электрофорезе в невосстанавливающих условиях ранен 90 - 95 кДа. а в восстанавливающих условиях увеличивается до 100 - 110 кДа. Во-вторых. ГП111а отсутствует на мембране тромбоцитов пациентов с тромбастс-нией Гланцманна (Peerschke et al, 1980). и мАТ против этого ГП не способны к связыванию с такими тромбоцитами. Однако, VM58 связывалось с тромбоцитами лвух пациентов, страдающих тромбастенией Гланцманна, даже несколько эффективнее, чем с тромбоцитами здоровых доноров. Кроме того, количество копий антигена на мембране одного тромбоцита, определенное по метолу Скэтчэрда. тоже соответствовало rniV, а не ГШМа, который представлен на мембране примерно 50000 копий (Phillips, Agin, 1977). Таким образом. в этой части работы было получено и охарактеризовано моноклоналыюе антитело VM58, связывающееся с гликопротеином IV тромбоцитарной

8?

8

50

25

0

8 в

5 10 15 ^ЬУМбв, мкг/мл

2

0 I-

3 6 9 и

Связанное ^ЬУМбв, 10 молекул на 1 тромбоцит

Рис. 3. Связывание 1-УМ58 с тромбоцитами.

А - к ОТ добавляли различные концентрации ,251-УМ58 и определяли связывание, как описано в разделе "Материалы и методы". Б - Кривая связывания УМ58 с тромбоцитами, преобразованная по методу Скэтчарда.

- \S -

мембраны и способное актипиронап. тромбоциты Лейсипю V4<x при-полило к агрегации тромбоцитои. секреции плотных гранул и мобилизации внутриклеточного кальция.

Изучение механизма а-мАТ-иппупироиаппоП яктиияпни громбошпои

Следующая сталия работы была посвящена выяснению вопроса о том, каким образом мАТ к антигенам наружной мембраны тромбоцитов могут ■активировать последние. На этом этапе предметом нашего исследования было уже не только антитело VM58. полученное нами, но и еще два мышиных моноклональпых антитела. Эти антитела, способные. как и VM58. вызывать агрегацию тромбоцитов. были любезно прслостаплены нам д-ром М. Бсрнлтом (Австралия). Антитело LeoAl направлено против антигена тромбоппгарной мембраны РТА I с мол. весом 67 кДа (Scott et al. 1ЧЯ9). Антитело FMC"5ft распознает гликопротеин CD9, который весит 2 4 кДа, и пстречается на поверхности мног их типов клеток (Gorman et al. 1 •>М5 ) . Оба этих мАТ. также как и MAT VM58. относились к подклассу Igiilf ).

В опытах по агрегометрни выяснилось. чю F<ab'),-фрагменты активирующих мАТ. в отличие от интактпих Ig(l. не способны пплупи-ровать агрегацию тромбоцитов. Более того. после прелппкубанпи тромбоцитов с F(ab'),-фрагментами а-мАТ добавление соответствующего интактного а-мАТ тоже не приводило к arpei aiiim (рис. 4). Эти результаты позволили сделать два важных вывода. Во-первых, неспособность F(аЬ')^-фрагментов а-мАТ вызывать агрегацию тромбоцитов указывала на то, что в активации тромбоцитов моноклокальным антителом как-то участвует его Fc-фрагменч-. Во-вторых, невозможность вызвать активирующими мАТ агрегацию тромбоцитов, прелинкубирован-ных с F(ab')^-фрагментами этих а-мАТ, говорила о том, что просто-

и | »«III тр 4

•-1

1 мин.

Рис. 4. Влияние Р(аЬ ' )2-фрагментов а-мАТ на а-мАТ-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

К ОТП. прединкубированной в течение 5 мин. с ФСБ (1-3) или с 20 мкг/мл Р(аЬ')г-фрагментов а-мАТ УМ58 (4). ЬеоА1 (5) и РМС56 (6) добавляли 20 мкг/мл интактных УМ58 (1.4), 1.еоА1 (2.5) и

РМС56 (3.6). Момент добавления а-мАТ отмечен стрелкой.

- IS -

го присутствия Fc-фрагмента а-мАТ, по-видимому,,недостаточно для активации. Кроме этого необходимо чтобы Fab-фрэгмемт а-мАТ был связан с антигеном-мишеныо.

Из литературных данных известно. что некоторые индукторы способны активировать тромбоциты, взаимодействуя с имеющимися па их поверхности рецепторами Fc-фрагментов иммуноглобулинов О (Fc RII) (Israels et al, 1973). Для того чтобы проверить. не задействован ли в изучаемой нами а-мАТ-инлуцированной агрегации тромбоцитов их Fc-рецептор, мы использовали мышиное моноклональ-ное антитело IV.3 против Fc-рецептора тромбоцитов, любезно предоставленное нам д-ром К. Андерсоном (США). Агрсгометричсские исследования показали, что ни одно из а-мАТ не способно вызнать агрегацию тромбоцитов, прелинкубированных с антителом IV.3. Чтобы исключить- возможность объяснения этих результатов конкуренцией мАТ IV. 3 и а-мАТ за связывание с антигеном, мы изучили связывание а-мАТ с тромбоцитами в присутствии IV.3 па примере а-мАТ VM58.

Несмотря на то что IV. 3 полностью блокировало УМ58-инлуцнроваппую

I ' ^

агрегацию тромбоцитов. оно не влияло на связывание "'I-VM5.4 с

I 1 ^

ОТ. При концентрации 0.5 мкг/мл связывание "I-VM5-4 составляло 4 2 иг и 39 нг па 107 тромбоцитов соответственно п отсутствие и в присутствии ЯО мкг/мл IV.3.

Изложенные результаты позволили нам прийти к выводу о том. что а-мАТ, , взаимодействуя с тромбоцитами. сначала связываются Fab-фрагментами с антигенами-мишенями. а затем происходит связывание Fc-фрагмента мАТ с Fc-рецоптором тромбоцитов. что и приводит к их активации (рис. 5). Косвенным подтверждением этого вывода может служить тот факт, что F(ab')2-фрагменты всех описанных в литературе а-мАТ тоже не способны активировать тромбоциты.

Рис. 5. Схема, иллюстрирующая механизм активации тромбоцитов активирующими мАТ. После связывания со своим антигеном (АГ) а-мАТ связывается через Рс-фрагмент с тромбоцитарным Рс-рецептором (РсЮ. что и приводит к активации тромбоцитов.

20%

О

1 шш.

Рис. 6.. Три типа реакции тромбоцитов на действие а-мАТ.

VM58 добавляли до концентрации 20 мкг/мл к ОТП (А) или к ОТ (Б) доноров Р-типа (1). PN-типа (2) и N-типа (3). Момент добавления VM5 8 отмечен стрелками.

Гетерогенность реакции тромбоцитом на JlCliCTU11C

активирующих мАТ

Исследуя агрегацию, вызываемую а-мАТ. мы обнаружили. что реакция тромбоцитов разных доноров на их действие неодинакова. Тромбоциты доноров Р-типа (Р - positive) агрегировали иод действием VM5 8 как в виде ОТП, так и в виде ОТ. тромбоциты N-nnia (N - negative) не реагировали на а-мАТ ни в одном из двух случаев; что же касается доноров третьего. промежуточного (PN) типа, то приготовленный из их крови препарат ОТП не обнаруживал реакции на а-мАТ, в то время как те же тромбоциты в виде препарата ОТ агрегировали в отпет на эту стимуляцию (рис. 6). В то же время обычные дозы такого индуктора как АДФ (около 5 мкМ) вызывали нормальную агрегацию тромбоцитов всех доноров.

Связывание VM58 и IV. 3 с ОТП доноров всех типов было одинаковым, т.е., качественное различие в способности тромбоцитов разных типов агрегировать в ответ па действие а-мАТ по зависело от количества молекул антигена а-мАТ и Fc-рснснтора на их поверхности. Процентное соотношение доноров разных типов выглядело как 5596: I 91: 25%. что близко к отношению 2:1:1.

Добавляя к отмытым тромбоцитам каждого типа равный объем плазмы крови доноров всех трех типов иди буфера Тироле-HEPES. мы выяснили, что тромбоциты Р-типа агрегируют пол действием а-мАТ как в присутствии плазмы донора любого типа. так и без плазмы, тромбоциты N-типа не реагируют на а-мАТ ни в отмытом состоянии, ни после добавления плазмы любого типа, а тромбоциты PN-типа агрегируют под действием а-мАТ в види ОТ, но теряют эту способность, будучи суспендированы в плазме донора любого из трех типов (табл. 1).

Таблица 1. Зависимость УМ58-инлуцированной агрегации тромбоцитов от присутствия плазмы крови или человека.

Плазма | Отмытые тромбоциты

тип | Р PN N

Р 1 РЫ | N 1 + + +

Буфер | ♦ +

1864 | - -----1. + -

К ОТ доноров Р-. РЛ- и Ы-типа (концентрация 4 ч 10 клеток/мл) добавляли во всех возможных сочетаниях равный объем плазмы кропи тех же доноров, суммарной фракции человеческих плазменных |р('. (концентрация 8.4 мг/мл) или буфера Тироле-НЕРЕ.Ч. После пятиминутной инкубации добавляли 20 мкг/мл УМ58 и записывали кривую агрегации. Знаком (♦) отмечены сочетания, н которых агрегация наблюдалась, а знаком (-) - отсутствие агрегации.

Эти результаты свидетельствовали о том. что способность или неспособность тромбоцитов разных типом реагировать на действие а-мАТ определяется не особенностями состава плазмы у разных допоров, а особенностями самих тромбоцитом. Неспособность тромбоцитов РМ-типа агрегировать под действием а-мАТ в присутствии плазмы определялась их взаимодействием с каким-то плазменным компонентом, однако этот компонент содержался н плазме доноров всех трех типов. Добавляя а-мАТ к отмыты\* тромбоцитам различных типов, прединкубированным с 8.4 мг/мл суммарной фракции человеческих плазменных (^Сч), мы выяснили, что как и плазма, не

влияют на реакцию тромбоцитов Р- и |М-типов, но ингибируют а-мАТ-индуцированную агрегацию тромбоцитов РЫ-типа (см. табл. 1).

Поскольку принадлежность тромбоцитов к тому или иному типу реакции на а-мАТ не коррелировала ни с полом, ни с группой крови

донора, не была обусловлена различиями в количестве антигенных детерминант а-мАТ или Рс-рецепторов на поверхности тромбоцитов и не зависела от состава плазмы крови доноров, мы предположили, что наблюдаемая нами гетерогенность определяется различиями в структуре Рс-рецептора. Основанием для этого предположения послужило сообщение 1_оопеу и соавт. (1983) о структурном полиморфизме Рс-рецептора тромбоцитов разных доноров, сопровождающемся различной реакцией тромбоцитов на активирующее действие Рс-рецептор-зависимого индуктора - иммобилизованных ^01 мыши. Сравнив реакцию тромбоцитов разных типов на действие а-мАТ и агрегированных мышиных (агр^С1м), использованных вместо иммобилизованных ^С1м, мы выяснили, что действие обоих индукторов на тромбоциты разных типов совершенно одинаково (табл. 2).

Таблица 2. Действие а-мАТ и агр^С на тромбоциты разных типов

1 Индуктор I 1 ОТП | ОТ

______________ Р РМ N | Р РЫ N

а-мАТ | + - - | 4 * -

1 агр1вС | ---- 1 + | ---- 1 + + -

К ОТП и ОТ доноров Р-. РМ- и М-типа добавляли а-мАТ или агр^О и записывали кривую агрегации. Знаком (+) отмечены случаи, в которых агрегация наблюдалась, а знаком (-) - отсутствие агрегации.

Таким образом, мы показали, что обнаруженная нами гетерогенность действия активирующих мАТ на тромбоциты разных доноров полностью совпадает с гетерогенностью действия на тромбоциты агр^С1м, и следовательно, как и последняя, определяется структурными различиями тромбоцитарпого Рс-рецептора у разных доноров.

Ннгибиропяпнс Рг-репептор-зависимых пропеггпп монок поиалышми антителами протип комплекса 1I И-III а трпмбопитариой мембраны.

Исслелуя влияние полученных нами антитромбоцитарных мАТ на функциональную активность тромбоцитов, мы обнаружили, что олно из них - мАТ УМ16а - облапает способностью ингибировать Рс-рецептор-зависимую агрегацию тромбоцитов, индуцированную как а-мАТ так и агр^б (рис. 7 и 8, кривые 1 и 3). При зтом УМ 1Л а не влияло на агрегацию тромбоцитов, инлуцироианную тромбином, АДФ или ристоцс-тином. Антигеном мАТ УМ16а был не Рс-рецептор, а гликопротенно-вый комплекс тромбоцитарной мембраны ПЬ-Н1а. являющийся рецептором фибриногена. УМ16а но препятствовало связыванию а-мАТ с тромбоцитами.

Помимо мАТ УМ16а в нашем распоряжении было еще олно монокло-нальное антитело против ГППЬ-П1а - АР-.З. полученное нами от доктора Т. Куники (США). Как и УМ16а. АР-3 было способно ингибировать Рс-рецептор-зависимую агрегацию тромбоцитов, но ве влияло на АДФ-, тромбин- и ристоцстин-нплуциропанную агрегацию и не ингибировало связывания а-иАТ с тромбоцитами.

Неспособность мАТ УМ 16а и АР-3 нпгибиропагь действие па тромбоциты таких индукторов как АДФ и тромбин свидетельствовала о том, что эпитопы УМ16а и АР-3 отличны от сайта связывания фибриногена с ГП11Ь-111а. Следовательно, способность УМ16а и АР-3 ингибировать Рс-рецептор-зависимую агрегацию тромбоцитов не была связана с блокированием фибриногенового рецептора ГП11Ь-П1а.

Поскольку ингибирующее действие УМ16а и АР-3 па рс-рсцсптор-зависимую агрегацию тромбоцитов нельзя было объяснить конкуренцией этих мАТ ни с фибриногеном, пи с а-мАТ, мы предположили, что Рс-фрагменты мАТ против ГППЬ-1 На, конкурируют с Рс-рсцептор-

Рис. 7. Влияние мАТ УМ16а на УМ58- и 1_еоА1 -индуцированную агрегацию тромбоцитов.

К ОТ, прединкубированным в течение 5 мин. с 20 мкг/мл интак-тных УМ1ба (1), Р(аЬ' ),-фрагментов УМ16а (2) или контрольного

мАТ (3) добавляли 5 мкг/мл УМ58 (А) или 1-еоА 1 (Б). Моменты добавления индукторов отмечены стрелками.

Рис. 8. Влияние мАТ УМ16а на агрIgG-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

К ОТ, прединкубированным в течение 5 мин. с 20 мкг/мл интак-тных УМ16а (1), Р(аЬ')г-фрагментов УМ16а (2) ^или контрольного

мАТ (3) добавляли 20 мкл агр1еСч (А) или 50 мкл агр^С1м (Б). Моменты добавления индукторов отмечены стрелками.

Рис. 9. Возможное взаимное расположение Рс - рецептора. антигенов а-мАТ и ГП11Ь-111а на тромбоцитарной мембране.

Каждый из антигенов а-мАТ (СЭ9. ГГИУ и РТА1) расположен так. что связанное с ним а-мАТ может связаться Рс-фрагментом с Гс-рецептором. Заштрихована молекула мАТ против ГП11Ь-111а. стерически препятствующая этому процессу. ГП11Ь-111а и Рс-рецептор изображены рядом, однако, ассоциация между ними на рисунке не отражена, т.к. природа ее пока неизвестна.

зависимыми индукторами за связывание с Fc-рецептором. Однако, оказалось, что F(ab')2-фрагменты VM16a тоже способны ингибиро-вать Fc-рецептор-зависимую агрегацию тромбоцитов, хотя и в меньшей степени, чем интактные IgG VM16a (рис. 7 и 8, кривые 1 и 2). Таким же свойством обладали и F(ab')^-фрагменты мАТ АР-3.

Объяснить обнаруженный нами эффект ингибирования Fc-рецептор-зависимой активации тромбоцитов антителами против ГШ Ib-I 11а можно следующим образом. Возможно, мАТ против ГШ Ib-I 11а, связываясь со своими эпитопами, создают стерическое препятствие связыванию Fc-фрагментов а-мАТ или arpIgG с Fc-рецептором тромбоцитов (рис. 9).

ВЫВОДЫ:

1. Получено и охарактеризовано моноклональное антитело VM58, направленное против гликопротеина IV тромбоцитарной мембраны и являющееся индуктором активации тромбоцитов. VM5 8 стимулирует агрегацию тромбоцитов, секрецию содержимого плотных гранул и увеличение концентрации кальция в цитоплазме тромбоцитов.

2. Обнаружено. что способность моноклопальных антител активировать тромбоциты не зависит от того, против каких антигенов тромбоцитарной мембраны эти антитела направлены. Связавшись сначала с антигеном, активирующие моноклональные антитела взаимодействуют затем с Fc I I-рецептором тромбоцитов с помощью своих Fc-фрагментов, что и приводит к активации тромбоцитов.

3. Обнаружено, что реакция тромбоцитов разных доноров на действие активирующих моноклональных антител неодинакова. Тромбоциты доноров Р-типа агрегируют под действием а-мАТ как в присутствии, так и в отсутствие плазмы крови, тромбоциты доноров N-типа не чувствительны к действию а-мАТ. а тромбоциты доноров PN-типа реагируют на стимуляцию а-мАТ только в отсутствие плазмы. Добавление плазмы или суммарной фракции человеческих плазменных IgG к этим тромбоцитам подавляет их способность активироваться под действием а-мАТ.

4. Сходство реакции тромбоцитов разных типов на стимуляцию а-мАТ и агрегированными IgGl мыши указыиает на то. что гетерогенность реакции тромбоцитов разных доноров на действие а-мАТ определяется полиморфизмом Fc II-рецептора у человека.

5. Обнаружены моноклокальные антитела против комплекса гликопро-теинов 11Ь-НГа тромбоцитарной мембраны, способные специфически ингибировать действие Рс-рецептор-зависимых индукторов. Это указывает на возможность топографической ассоциации ГП11Ь-П1а и Рс II-рецептора на тромбоцитарной мембране.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Vinogradov D.V., Mazurov А.V., Vlasik Т.N., Trakht I. N. , Repin V.S. Stimulation of platelet aggregation by monoclonal antibody 5C8. Heterogeneity of SC8 effect in healthy donors // Abstr. 3rd Erfurt Workshop on Platelets, Erfurt, 1989 / Platelets.- 1990.-V. 1. - P. 109.

2. Виноградов Д.В., Власик Т-Н.. Агафонова О.Г., Васильев С.А., Лагутина Н.Я., Макаров В.А., Бернлт М., Мазуров А.В. Ингибирова-ние Fe-рецептор-зависимой агрегации тромбоцитов моноклоиальным антителом против комплекса гликопротеинов Ilb-IIIa // Биохимия.-1991.- No5.- С.787-797.

3. Mazurov А.V. , Vinogradov.D^ V., Vlasik Т.N., Burns G.F., Berndt M.C. Heterogeneity of platelet Fc-receptor-dependent response to activating monoclonal antibodies // Platelets - 1991.- (in press).

4. Mazurov A. V. , Vinogradov D. V. . Vlasik T. N. , Burns G. F. , Berndt M.C. Heterogeneity of platelet Fc-receptor-dependent response to activating monoclonal antibodies // Abstr. XIII Congr. Thrombos. Haemostas., Amsterdam.- Thromb.Haemostas.- 65.- 657,- 1991.

5. Mazurov A.v., Vinogradov D.V.. Vlssik T.N., Repin V.S., Booth W.J., Berndt M.C. Characterization of an antiglycoprotcin lb monoclonal antibody that specifically inhibits platelet-thrombin interaction //Thromb. Res.- 62,- 673-684,- 1991.