Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимический анализ конформационных изменений и наследственных нарушений экспрессии гликопротеидов IIb-IIIa тромбоцитов человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хаспекова, Светлана Георгиевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Структура и функциональные реакции тромбоцитов.

2.2.Характеристика главных мембранных гликопротеидов тромбоцитов человека.

2.3. Комплекс гликопротеидов ПЬ-Ша (аПЬ|33-интегрин).

2.3.1. Семейство интегринов.

2.3.2. Структура и особенности функционирования комплекса ГП ПЬ-Ша.

2.3.3. Механизмы проведения активирующих сигналов через ГП ПЬ-Ша.

2.3.4. Использование моноклональных антител против ГП ПЬ-Ша в изучении конформационных изменений комплекса ГП ПЬ-Ша.

2.4. Тромбастения Глацманна - наследственные нарушения экспрессии ГП ПЬ-Ша.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1.Реактив ы.

3.2. Методы.

3.2.1. Выделение тромбоцитов.

3.2.1.1. Получение обогащенной тромбоцитами плазмы.

3.2.1.2. Получение отмытых тромбоцитов.

3.2.1.3. Получение фиксированных тромбоцитов.

3.2.1.4. Мечение тромбоцитов 51Сг.

3.2.2. Моноклональные антитела.

3.2.2.1. Скрининг моноклональных антител.

3.2.2.2. Получение препаративных количеств мономоноАТ.

3.2.2.3. Получение Fab фрагментов IgG.

3.2.2.4. Иммунопреципитация.

3.2.2.5. Иммуноблоттинг.

3.2.4. Связывание антител с тромбоцитами.

3.2.4.1. Мечение белков с помощью I.

3.2.4.2. Связывание с тромбоцитами моноАТ и Fab фрагментов.

3.2.4.3. Связывание моноклональных антител с тромбоцитами, адгезированными на пластике.

3.2.4.4. Связывание фибриногена с тромбоцитами.

3.2.4.5. Связывание ГП Ilb-IIIa из лизата тромбоцитов с иммобилизованными антителами.

3.2.4. Функциональные тесты тромбоцитов.

3.2.4.1. Адгезия тромбоцитов.

3.2.4.2. Агрегация тромбоцитов.

3.2.4.3. Секреция из плотных гранул тромбоцитов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Характеристика моноклонального антитела CRC54.

4.1.1. Определение антигена моноАТ CRC54.

4.1.2. Локализация эпитопа CRC54 в ГП Ilb-IIIa.

4.1.3. Связывание моноАТ CRC54 с ГП Ilb-IIIa в различных конформационных состояниях.

4.1.3.1. Связывание CRC54 с ГП Ilb-IIIa на поверхности тромбоцитов в присутствии ЭДТА.

4.1.3.2. Связывание моноАТ CRC54 с LIBS-эпитопом ГП Ilb-IIIa.

4.1.3.3. Связывание Fab фрагментов моноАТ CRC54 с ГП Ilb-IIIa.

4.1.4. Сравнение эпитопа CRC54 с эпитопами других известных конформационно зависимых антител.

4.2. Исследования конформационных изменений в комплексе ГП Ilb-111а с помощью антител, направленных против конформационно зависимых эпитопов.

4.2.1. Связывание конформационно зависимых антител с тромбоцитами, адгезированными на пластик.

4.2.2. Связывание ГП Ilb-IIIa из лизата тромбоцитов с иммобилизованными моноАТ.

4.3. Исследование конформационных изменений комплекса ГП Ilb-IIIa, индуцируемых связыванием с конформационно зависимым антителом CRC54.

4.3.1. Агрегация тромбоцитов, индуцированная CRC54.

4.3.2. СЯС54-зависимое связывание тромбоцитов с лигандами ГП Ilb-IIIa.

4.3.2.1. Связывание фибриногена с тромбоцитами в суспензии.

4.3.2.2. Влияние CRC54 на адгезию тромбоцитов к фибриногену и фибронектину.

4.3.3. Изучение конформационных изменений, индуцированных CRC54, с помощью других конформационно зависимых антител.

4.4. Исследование нарушений экспрессии ГП Ilb-IIIa при тромбастении

Гланцманна.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Иммунохимический анализ конформационных изменений ГП Ilb-IIIa с помощью моноАТ.

5.1.1. Характеристика конформационно зависимого моноАТ CRC

5.1.2. Конформационные изменения комплекса ГП Ilb-IIIa при адгезии тромбоцитов.

5.1.3. Изменения конформационно зависимых эпитопов после обработки тромбоцитарной мембраны детергентами.

5.2. Стимуляция конформационных изменений комплекса ГП ПЬ-Ша и агрегации тромбоцитов антителом С11С54.

5.2.1. Влияние СЯС54 на агрегацию тромбоцитов.

5.2.2. Активирующее влияние СЯС54 на комплекс ГП ПЬ-Ша.

5.2.3. Регистрация конформационных изменений комплекса ГП ПЬ-Ша.

5.3. Изучение дефекта ГП ПЬ-Ша при тромбастении Глацманна с помощью моноклональных антител.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунохимический анализ конформационных изменений и наследственных нарушений экспрессии гликопротеидов IIb-IIIa тромбоцитов человека"

Тромбоциты играют ключевую роль в процессах тромбоза и сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Эта роль определяется двумя основными свойствами тромбоцитов - способностью к адгезии на поврежденной сосудистой стенке, что приводит к закрытию и последующей репарации места повреждения, и к агрегации, т.е. к образованию крупных конгломератов, приводящему в итоге к формированию тромба и выключению сосудов из кровотока. Обе главные функции тромбоцитов опосредованы специальными мембранными рецепторами, получившими название молекул клеточной адгезии. Молекулы клеточной адгезии обеспечивают взаимодействия клеток друг с другом, с соединительнотканным матриксом и различными компонентами плазмы крови. Большинство молекул клеточной адгезии тромбоцитов и других клеток представляют собой мембранные гликопротеиды (ГП), состоящие из внеклеточного, мембранного и цитоплазматического доменов. Внеклеточный участок молекулы является рецепторным, мембранный домен фиксирует белок на поверхности мембраны, а цитоплазматическая часть молекулы обеспечивает проведение сигнала снаружи внутрь клетки, а также изнутри на поверхность тромбоцита.

Главным рецептором тромбоцитов является Са2+-зависимый комплекс ГП ИЬ-Ша (ацьРш-интегрин), принадлежащий к семейству интегринов и обеспечивающий способность тромбоцитов к агрегации. Комплекс ГП ПЬ-Ша представлен на мембране покоящихся тромбоцитов в неактивированной форме и не способен связывать лиганды. Однако при активации тромбоцитов такими агонистами как АДФ, тромбин, тромбоксан А2 передача сигнала через систему вторичных посредников приводит к конформационным изменениям в комплексе, переводящим его в активное состояние. При этом на происходит экспонирование лиганд-связывающего участка, и ГП Ilb-Ша приобретает способность к связыванию фибриногена и некоторых других молекул адгезии. Между тромбоцитами образутся фибриногеновые мостики, и, таким образом, возникают тромбоцитарные агрегаты.

Нарушения функционирования комплекса могут приводить к серьезным дефектам в системе гемостаза. Так, повышение агрегационной способности тромбоцитов увеличивает риск тромбообразования. Предполагают, что локальная агрегация и дезагрегация тромбоцитов в коронарных сосудах приводит к нестабильной стенокардии, а образование стабильного агрегата - к развитию инфаркта миокарда. Снижение же агрегационной способности тромбоцитов ведет за собой риск кровотечений. Наследственный дефицит или нарушение функционирования комплекса ГП Ilb-IIIa является причиной болезни Гланцманна. При этом у больных отсутствует агрегация, индуцированная АДФ, тромбином и другие виды фибриноген-зависимой агрегации, что приводит к тяжелым нарушениям гемостаза.

Эти свойства ГП Ilb-IIIa определяют интерес к изучению его структуры и механизмов функционирования. Кроме того исследование этого белка, относящегося к семейству интегринов, позволяет понять основные принципы функционирования других молекул -представителей этого семейства.

При исследовании структуры и механизмов функционирования ГП Ilb-IIIa большое распространение получило использование моноклональных антител (моноАТ). В начале 80-х годов Coller и соавт.

1982] получили моноАТ, способные блокировать связывание тромбоцитов с фибриногеном и показали, что это антитело связывается с ГП Ilb-IIIa. В последующие годы было получено большое количество разных моноАТ, направленных как против комплекса ГП Ilb-IIIa, так и его отдельных компонентов.

Особый интерес представляют антитела, направленные против эпитопов, специфических для разных конформационных состояний комплекса (так называемые конформационно зависимые антитела). Использование подобных антител помогает расширить представления о механизмах активации комплекса и регуляции связывания фибриногена. С помощью таких антител было доказано существование активированной и оккупированной лигандом конформаций комплеса. Однако многие вопросы, связанные с функционированием ГП Ilb-IIIa остаются неясными. Так, необходимо выяснить роль различных участков молекул ГП IIb и Ша в конформационных изменениях комплекса, неизвестны механизмы конформационных изменений ГП Ilb-IIIa при адгезии и распластывании тромбоцитов на поверхности субстрата,.

Применение моноклональных антител против ГП Ilb-IIIa позволило развить подходы для дифференциальной диагностики больных с тромбастенией Гланцманна. Иммунохимический анализ нарушений экспрессии ГП IIb и Ша являются необходимым этапом для понимания молекулярных основ патогенеза этого заболевания в каждом отдельном случае.

Целью настоящей работы явилось исследование конформационных изменений и наследственных нарушений экспрессии комплекса гликопротеидов Ilb-IIIa тромбоцитов человека с помощью иммунохимических методов.

Были поставлены следующие задачи.

1. Получить и охарактеризовать моноАТ, способное различать ГП ПЬ-Ша в различных конформационных состояниях.

2. Исследовать закономерности конформационных изменений ГП ПЬ-Ша и их взаимосвязь с функциональной активностью тромбоцитов.

3. Исследовать механизмы агрегации тромбоцитов, стимулированной моноАТ против конформационно-зависимых эпитопов ГП ПЬ-Ша.

4.Используя иммунохимические методы анализа, выявить и охарактеризовать наследственные нарушения экспрессии ГП ПЬ-Ша при некоторых вариантах тромбастении Гланцманна.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хаспекова, Светлана Георгиевна

6.ВЫВОДЫ

1. Получено и охарактеризовано моноАТ против конформационно зависимого эпитопа в ГП Ilb-IIIa. Участок связывания антитела экспонируется при переходе ГП Ilb-IIIa в активированное состояние и последующем взаимодействием рецептора с лигандом, т.е. по своим характеристикам относится к LIBS-эпитопам. Эпитоп CRC54 локализован в N-концевом участке ГП Illa (первые 100 аминокислот), и таким образом было установлено, что этот участок претерпевает конформационные изменения при функционировании ГП ИЬ-Ша.

2. С помощью моноАТ против различных конформационных эпитопов ГП Ilb-IIIa было показано, что конформационные перестройки этого белка происходят не только при активации тромбоцитов в суспензии, но и при их адгезии и распластывании на поверхности субстрата.

3. Обработка тромбоцитов ЭДТА приводит к стимулированию связывания антитела CRC54 с LIBS-эпитопом в N-конце ГП Illa. Таким образом было показано, что некоторые конформационно зависимые эпитопы ГП Ilb-IIIa могут экспонироваться в результате диссоциации комплекса при хелатировании двухвалентных катионов.

4. Характер взаимодействия некоторых моноАТ с LIBS-эпитопами ГП Ilb-IIIa изменялся после обработки мембраны тромбоцитов детергентами, что свидетельствует о зависимости конформационного состояния ряда участков ГП Ilb-IIIa от липидного окружения.

5. Взаимодействие антитела CRC54 и его Fab-фрагментов с N-концевым участком ГП Illa вызывает конформационные изменения

ГП Ilb-IIIa, стимулирует связывание лигандов с этим рецептором и последующую агрегацию тромбоцитов. На примере CRC54 установлен один из возможных механизмов стимуляции агрегации тромбоцитов с помощью анти-LIBS моноАТ: путем перевода неактивированного комплекса ГП Ilb-IIIa в активированное состояние и последующего связывания фибриногена.

6. С помощью методов иммунохимического анализа были выявлены различия в нарушении экспрессии комплекса ГП Ilb-IIIa и его отдельных компонентов у двоих больных с тромбастенией Гланцманна. Установлено, что у одного больного дефицит ГП Ilb-IIIa сочетается с низким содержанием ГП IIb и субнормальным общим содержанием ГП Illa.

5.4. Заключение

Механизм активации комплекса ГП Ilb-IIIa при рецепторно-опосредованном действии физиологических природных агонистов, результатом которой является связывание комплекса с лигандами и последующая агрегация тромбоцитов, остается до последнего времени неясным. В первую очередь это обусловлено тем, что до сих пор не известна природа вторичного посредника, передающего сигнал на цитоплазматические домены ГП IIb и/ил Ша и запускающего активацию комплекса (или снимающего ее торможение) с последующим связыванием лигандов и агрегацией тромбоцитов. В настоящее время предполагается, что конформационное состояние и афинность ГП Ilb-IIIa по отношению к своим лигандам может модулироваться с помощью как активирующего, так и отрицательного, тормозящего сигнала, действующих через цитоплазматические домены ГП IIb и/или Ilia [Ginsberg et al., 1995; Faull & Ginsberg, 1996].

Основным подходом для изучения конформационных изменений комплекса ГП Ilb-IIIa, ассоциированных с его активацией и связыванием с лигандами, является использование моноклональных антител, специфически узнающих различные конформации этого белка (рис. 21). Ряд антител узнает эпитопы внутри лиганд-связывающего участка, доступные только после активации комплекса [Shatill et al., 1985; Steiner et al., 1992]. Другие антитела направлены против LIBS-эпитопов и связываются преимущественно с ГП Ilb-IIIa после его оккупации лигандами, т.е. с оккупированной конформацией комплекса [Freiinder et al., 1988; 1990; Kouns et al., 1990; Steiner et al., 1993]. Некоторые анти-LIBS антитела способны стимулировать конформационные изменения комплекса, связывание лигандов и последующую агрегацию тромбоцитов [Kouns et al., 1990; Frelinder et al., 1991]

В настоящей работе было получено антитело CRC54, направленное против одного из LIBS-эпитопов ГП Ilb-IIIa. Используя это антитело, узнающее эпитоп, расположенный в N-концевом участке молекулы ГП Illa (первые 100 аминокислот), мы показали, что эта часть молекулы принимает участие в конформационных изменениях ГП Ilb-IIIa. Оказалось, что конформационные перестройки ГП Ilb-IIIa происходят не только при активации тромбоцитов в суспензии, но и при адгезии и распластывании тромбоцитов на поверхности субстрата.

Взаимодействие моноАТ CRC54 с антигеном также вызывало конформационные изменения ГП Ilb-IIIa. Связывание CRC54 с ГП Ilb-IIIa стимулировало адгезию тромбоцитов на поверхности субстрата. Конформационные изменения, стимулированные CRC54, были впервые зарегистрированны в настоящей работе с помощью других конформационно-зависимых антител, связывание которых с тромбоцитами стимулировалось в присутствии CRC54. Индуцированное CRC54 связывание конформационно-зависимых антител как качественно, так и количественно было аналогично повышению связывания в результате активации тромбоцитов тромбином или взаимодействия RGD-содержащего пептида с ГП Ilb-IIIa. Эти результаты позволили предположить, что конформационные изменения индуцированные CRC54, сходны с изменениями, вызываемыми физиологическими агонистами тромбоцитов и взаимодействием ГП Ilb-IIIa с RGD-содержащими лигандами. На сходство изменений ГП Ilb-IIIa, стимулируемых классическими агонистами и антителом CRC54, указывает также сходство конечных результатов этих воздействий - индукция связывания лигандов и последующая агрегация тромбоцитов. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что активация ГП Ilb-IIIa анти-LIBS антителами может служить моделью активационных изменений комплекса, происходящих при стимуляции тромбоцитов природными агонистами. Однако в случае агонист-индуцированной активации изменения в ГП Ilb-IIIa опосредуются сигналом поступающим изнутри клетки через систему вторичных посредников ("inside-out" signalling), а при действии активирующих анти-LIBS антител похожие изменения стимулируются взаимодействием антитела с ГП Ilb-IIIa снаружи клетки, не требующим участия внутриклеточных систем передачи сигнала. Нам удалось оценить вклад в агрегацию тромбоцитов внутриклеточных систем - около 70%. За счет непосредственно взаимодействия антитела с ГП Ilb-IIIa агрегация обеспечивается на 30%. Способность к повышению функциональной активности при взаимодействии с антителами не является уникальной особенностью ГП Ilb-IIIa (аПЬрШ-интегрина). Подобные эффекты описаны также для некоторых антител против pi-интегринов, способных стимулировать взаимодействие этих молекул, содержащихся на поверхности различных клеток, со своими лигандами - фибронектином, ламинином, коллагеном и другими адгезивными белками [Kovach et al., 1992; Kemenade et al., 1992].

Активирующее действие анти-LIBS антител по отношению к комплексу ГП Ilb-IIIa, в том числе и моноАТ CRC54, описанного в настоящей работе, может быть обусловлено: (1) стимуляцией конформационных изменений (активация) неактивированного комплекса ГП Ilb-IIIa в результате низкоаффинного связывания антител с покоющейся конформацией рецептора или (2) стабилизацией ("замораживанием") активированной/оккупированной конформации

ГП ПЬ-Ша в результате более высокоаффинного связывания антитела с этой конформацией рецептора. Очевидно, что оба воздействия будут приводить .к сдвигу равновесия между неактивной и активированной/оккупированной конформациями - в первом случае в результате стимуляции прямой реакции, т.е. ассоциации лиганда с рецептором, а во втором случае в результате ингибирования обратной реакции, т.е. диссоциации комплекса лиганд-рецептор. Очевидно, что воздействия, как по первому, так и по второму будут стимулировать связывание ГП ПЬ-Ша с лигандами и последующую агрегацию тромбоцитов. (См. также схему на рис. 21). В пользу существования первого механизма свидетельствуют результаты экспериментов, доказывающих возможность активации комплекса в отсутствие фибриногена (и других лигандов) и соответственно в отсутствие оккупированной формы ГП ПЬ-Ша. В настоящей работе было продемонстрировано, что: (1) отмытые от плазмы тромбоциты, фиксированные после инкубации с СБ1С54, способны агрегировать в ответ на добавление экзогенного фибриногена, и (2) антитело СКС54 способно переводить в активное состояние ГП ПЬ-Ша, экспрессированный в модельных клетках. Т.к. в обоих случаях СЯС54-индуцированная активация комплекса происходила в отсутствие фибриногена и других лигандов, очевидно, что оба эффекта обусловлены взаимодействием антитела не с активированной/оккупированной, а с покоющейся конформацией ГП ПЬ-Ша. Однако, необходимо отметить, что результаты этих экспериментов не отрицают существование и второго механизма, т.е. стимуляции перехода комплекса в оккупированное состояние в результате взаимодействия антитела именно с этой конформацией, ее стабилизацией и соответственно сдвигом равновесия в сторону связывания лиганда и последующей агрегации. Возможно, что сдвиг равновесия в сторону оккупированной конформации по этому механизму может происходить в присутствии экзогенного и/или секретируемого из тромбоцитов эндогенного фибриногена или других лигандов.

Наследственная патология, обусловленная дефицитом или качественным дефектом ГП Ilb-IIIa, носит название тромбастении Глацманна и была описана еще в 1918 году [Glanzmann, 1918]. Дефицит ГП Ilb-IIIa у этих больных был выявлен значительно позже [Nurden $ Caen, 1974]. Использование моноклональных антител, направленных против ГП Ilb-IIIa и/или его отдельных компонентов позволили проводить диагностику и выделить различные формы заболевания.

В нашей работе кроме классических индукторов в качестве агониста агрегации тромбоцитов мы использовали моноАТ CRC54, имея в виду его способность стимулировать агрегацию в результате прямого воздействия на ГП Ilb-IIIa без участия внутриклеточных систем передачи и усиления сигнала. Отсутствие CRC54-индуцированной агрегации дает возможность уже на основании данных агрегометрии заключить, что нарушения агрегации обусловлены дефицитом или дефектом ГП Ilb-IIIa, а не нарушениями в системе активации тромбоцитов. Применение иммунохимических методов позволило выявить различия в нарушении экспрессии ГП Ilb-IIIa и его компонентов у двоих больных тромбастенией Гланцманна. У одного из больных дефицит ГП Ilb-IIIa и его компонентов на поверхности тромбоцитов сочетался с субнормальным общим содержанием ГП Ша, что позволило предположить локализацию дефекта в гене ГП IIb. Таким образом, применение иммунохимических

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хаспекова, Светлана Георгиевна, Москва

1. Вызова Т.В., Власик Т.Н., Мазуров А.В. (1994) Ингибирование агрегации тромбоцитов моноклональными антителами к комплексу гликопротеидов Ilb-IIIa. Бюлл. Эксп. Виол. Мед., № 10, 402-405.

2. Васильев С.А., Жердева Л.В., Мазуров А.В. (1994) Наследственные дефекты мембранных гликопротеидов тромбоцитов. Гематол. Трансфузиол., 39, 34-39.

3. Мазуров А.В., Васильев С.А. (1994) Структура и функции мембранных гликопротеинов тромбоцитов. Гематол. Трансфузиол., 39, 29-34.

4. Миссельвитц Ф., Лейтин В.Л., Домогатский С.П., Мерзликина О.В., Новиков И.Д., Репин B.C. (1984) Адгезия и агрегация тромбоцитов на поверхностях, покрытых коллагенами человека I, III, IV и V типов. Бюлл. Эксп. Виол. Мед., 98, 359-364.

5. Abrams С., Shattil S.J. (1991) Immunological detection of activated platelets in clinical disorders. Thromb. Haemost., 65, 467-473.

6. Alemany M., Concord E., Grin J., et al. (1996) Sequence 274-368 in the |33 subunit of the integrin allbf33 provides a ligand recognition and binding domain for the y-chain of the fibrinogen that is independent of platelet activation. Blood, 87, 592-601.

7. Andrieux A., Rabiet M-J., Chapel A., Concord E., Marguerie G. (1991) A highly concerved sequence of the Arg-Gly-Asp-binding domain of theintegrin P3 subunit is sensitive to stimulation. J. Biol. Chem., 264, 1456614570.

8. Argraves W.S., Suzuki S., Arai H., Thompson K., Pierschbacher M.D., Ruoslahti E. (1987) Amino acid sequence of the human fibronectin receptor. J. Cell Biol., 105, 1183-1190.

9. Bajt M.L., Loftus J.C. (1994) Mutation of a ligand binding domain of (33 integrin. Integral role of oxygenated residues in allb(33 (GPIIb-IIIa) receptor function. J. Biol. Chem., 269, 20913-20919.

10. Beer J., Coller B. S. (1989) Evidence that platelet glycoprotein Ilia has a large disulfide-bonded loop that is susceptible to proteolitic cleavage. J. Biol. Chem., 264, 17564-17573.

11. Bennett J.S., Hoxie J.A., Leitman F., Valaire G., Cines D.B. (1983) Inhibition of fibrinogen binding to stimulated human platelets by a monoclonal antibody. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2417-2421.

12. Bennett J.S., Poncz M. (1995) Platelet glycoproteins lib and Ilia. In: Molecular Basis of Thrombosis and Haemostasis. (High K.A., Roberts Y.R. eds). Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong, 579-602.

13. Bennett J.S., Vilaire G., Cunningham M., Bedhnar B. (1998) The platelet cytosceleton regulates the affinity of aIIbp3 for fibrinogen. Blood, 92, 702a.

14. Bemdt M.C., Andrews R.K., McNally T. (1996) Platelet glycoproteins. In: Haematology 1996. Educational Programme of the 26th Congress of the International Society of Haematology. (McArthur J.R., Lee S.H., Wong J.E.L., Ong Y.W. eds.). 306-310.

15. Berndt M.C., Caen J.P. (1984) Platelet glycoproteins. Progress in Haemostasis Thrombosis, 7, 111-150

16. Bevilacqua M., Butcher E., Furie B., et al. (1991) Selectins: a family of adhesion receptors. Cell, 67, 233.

17. Bevilacqua M., Nelson R.M. (1993) Selectins. J. Clin. Invest., 91, 379-387.

18. Bray P.R., Barsh G., Rosa J-P., Luo X.Y., Magenis E., Shuman M.A. (1988) Physical linkage of the genes for platelet membrane glycoprotein lib and Ilia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8683-8687.

19. Bray P.F. (1994) Inherited diseases of platelet glycoproteins: considerations for rapid molecular characterisation. Thrombosis and Haemostasis, 72, 492502.

20. Caen J.P., Rosa J-P. (1995) Platelet-vessel wall interaction: from the bedside to molecules. Thromb. Haemost., 74, 18-24.

21. Calvette J.J., Henschen A., González-Rodrigues J. (1991b) Assignment of disulphide bonds in human platelet glycoprotein Ilia. Biochem. J., 274, 6371.

22. Charo I.F., Nannizzi L., Phillips D.R., Hsu M.A., Scarborough R.M. (1991) Inhibition of fibrinogen binding to GP Ilb-IIIa by a GPIIIa peptide. J. Biol. Chem, 266, 1414-1421.

23. Clemetson K.J. (1985) Glycoproteins of the platelet plasma membrane. In: Platelet Membrane Glycoproteins. (George J.N., Nurden A.T., Phillips D.R. eds.) New-York, Plenum, 51-85.

24. Clemetson K.J. (1995) Platelet activation: signal transduction via membrane receptors. Thromb. Haemost., 74, 111-116.

25. Clemetson K.J., Luscher E.F. (1988) Membrane glycoprotein abnormalities in pathological platelets. Biochim. Biophys. Acta, 947, 53-73.

26. Coller B.S. (1984a) Report of the working party on the hybridoma-derived monoclonal antibodies to platelets. Thromb. Haemost., 51, 169-173.

27. Coller B.S. (1984b) Platelets and their disoders. In Ratnoff O.D., Fobers C.D., eds, Disoders of Haemostasis/ Orlando: Grun and Startton, 73-177.

28. Coller B.S. (1985a) A new monoclonal antibody reports an activation-dependent change in the conformation and/or microenvironment of the platelet glycoprotein Ilb/IIIa complex. J. Clin. Invest., 76, 101-108.

29. Coller B.S., Cheresh D.A., Asch E., Seligsohn V. (1991) Platelet vitronectin receptor expression differentiates Iraqi-Jewish from Arab pstients with Glanzmann Thrombasthenia in Israel/ Blood, 77, 75-83

30. Coller B.S., Selingsohn V., Little P.A. Type I Glanzmann's thrombasthenia patients from the Iraqi-Jewish and Arab population in immunoblot analisis. (1987) Blood, 65, 1021-1024.

31. D'Souza S.E., Ginsberg M.H., Burke T.A., Lam C-T., Plow E.F. (1988) Localization of an Arg-Gly-Asp recognition site within an adhesion receptor. Science, 242, 91-93.

32. D" Souza S.E., Ginsberg M.H., Burke T.A., Plow E.F. (1990) The ligand binding site of the platelet integrin receptor GPIIb-IIIa is proximal to the second calcium binding domain of its a subunit. J. Biol. Chem., 265, 34403446.

33. D"Souza S.E., Ginsberg M.H., Matsueda G.R., Plow E.F. (1991) A discrete sequence in a platelet integrin is involved in ligand recognition. Nature, 350, 66-68.

34. Dupperay A., Berthier R., Changon E., et al. (1987) Biosynthesis and processing of platelet GPIIb-IIIa in human megakaryocytes. J. Cell Biol., 104, 1665-1673.

35. Farrell D.H., Thiagarajan P., Chung D.W., Davie E.W. (1992) Role of fibrinogen a and y chain sites in platelet aggregation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10729-10732

36. Faull R.J., Ginsberg M.H. (1996) Inside-out signalling in integrins. In: Haematology 1996. Educational Programme of the 26th Congress of the International Society of Haematology. (McArthur J.R., Lee S.H., Wong J.E.L., Ong Y.W. eds.). 105-110.

37. Fitzgerald L.A., Steiner B., Rail S.C., Lo S-S., Phillips D.R. (1987) Protein sequence of endothelial glycoprotein Ilia derived from a cDNA clone. Identity with platelet glycoprotein Ilia and similarity to "integrin". J. Biol. Chem., 262, 3936-3939.

38. Frelinger A.L. Ill, Cohen I., Plow E.F., et al. (1990) Selective inhibition of integrin function by antibodies specific for ligand-occupied receptor conformers. J. Biol. Chem, 265, 6346 -6352.

39. Frelinger, A.L. Ill, Du, X., Plow E.F., Ginsberg, M.H. (1991) Monoclonal antibodies to ligand-occupied conformers of integrin allb|33 (glycoprotein1.b-IIIa) alter receptor affinity, specificity and function. J. Biol. Chem., 266, 17106-17111.

40. Frelinger A.L. Ill, Lam S.C.T., Plow E.F., Smith M.A., Loftus J.C., Ginsberg M.H. (1988) Occupancy of an adhesive glycoprotein receptor modulates expression of an antigenic site involved in cell adhesion. J. Biol. Chem, 263, 12397 12402

41. Gabbasov Z.A., Popov E.G., Gavrilov I.Yu., Pozin E.Ya. (1989) Platelet aggregation: the use of optical density fluctuations to study microaggregate formation in platelet suspension. Thromb. Res., 54, 215-223.

42. George J.N., Caen J.P., Nurden A.T. (1990) Glanzmann's thrombasthenia: the spectrum of clinical disease. Blood., 75, 1383-1395.

43. Giancotti F.G., Languino L.R., Zanetti A., Peri G., Tarone G., Dejana E. (1987) Platelets express a membrane complex immunologically related to the fibroblast fibronectin receptor and distinct from GPIIb/IIIa. Blood, 69, 1535-1538.

44. Ginsberg M.H., Du X., O^Toole T.E., Loftus J.C. (1995) Platelet integrins. Thromb. Haemost., 74, 352-359.

45. Ginsberg M.N., Frelinger A.L., Lam S.C-T. (1990) Analisis of platelet aggregation disoders based on flow cytometric analysis of membrane glycoprotein GP Ilb-IIIa with conformation-specific monoclonal antibodies. Blood, 76, 2017-2023.

46. Ginsberg M.H., Loftus J.C., Plow E.F. (1988) Cytoadhesins, integrins, and platelets. Thromb. Haemost., 59, 1-6.

47. Glanzmann E. (1918) Hereditäre hamorragische Thrombasthenie. Ein Beitrag zur Pathologie der Blutplättchen. Jahr Kinderth., 88, 113-141.

48. Grinnel F., Phah T.V. (1985) Platelet attachment on polysterene surfaces: dependence on fibronectin and plasma concentrations. Thromb. Res., 39, 165-171.

49. Guilino D., Boudignon C., Zhang L., Concord E., Rabiet M-J., Marguerie G. (1992) Ca bindingproperties of the platelet glycoprotein lib ligand-interacting domain. J. Biol. Chem., 267, 1001-1007.

50. Haimovich B., Lipfert L., Brugge J.S., Shattil S.J. (1993) Tyrosine phosphorylation and cytosceleton reorganization in platelets are triggered by interaction of integrin receptors with their immobilized ligands. J. Biol. Chem., 268, 15868-15877.

51. Hawiger J. (1995) Mechanisms involved in platelet vessel wall interaction. Thromb. Haemost., 74, 369-372.

52. Hechler B., Leon C., Vial C., Vigne P., Frelin C., Cazenave J.P., Gachet C. (1998) The P2Yi receptor is necessary for adenosin 5 -diphosphate-induced platelet aggregation. Blood, 92,152-159.

53. Hemler M.E. (1998) Integrin assotiated proteins. Curr Opin Cell Biol., 10, 578-585.

54. Hemmings L., Barry S.T., Critchley D.R. (1995) Cell-matrix adhesion: structure and regulation, Biochem Soc Tans., 23, 619-626.

55. Hillery C.A., Smyth S.S., Parise L.V. (1991) Phosphorylation of human platelet glycoprotein Ilia (GPIIIa). J. Biol. Chem., 266, 14663-14669.

56. Holmsen H. (1994) Significance of testing platelet functions in vitro. Eur. J. Clin. Invest., 24 (suppl. 1), 3-8.

57. Horsewood P., Hayward C.P.M., Warkentin T.E., Kelton J.G. (1991) Investigation of the mechanisms of monoclonal antibody-induced platelet activation. Blood., 78, 1019-1026.

58. Huang M.M., Bolen J.B., Barnwell J.W., Shattil S.J., Brugge J.S. (1991) Membrane glycoprotein IV (CD36) is physically associated with the Fyn, Lyn, and Yes protein-tyrosine kinases in human platelets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7844-7848.

59. Huang M-M., Indik Z., Brass L.F., Hoxie J.A., Schreider A.D., Brugge J.S. (1992) Activation of FcyRII induces tyrosine phosphorylation of multiple proteins including FcyRII. J. Biol. Chem., 267, 5467-5473.

60. Hudhes P.E., Renshaw M.W., Pfaff M., Forsyth J., Keivens V.M., Schwartz M.A., Ginsberg M.H. (1996) Suppression of integrin activation: a novel function of a Ras/Raf-initiated MAAP-kinase pathway. Cell, 88, 521-530.

61. Hynes R.O. (1987) Integrins: A family of cell adhesion receptors. Cell, 48, 549-554.

62. Jandrot-Perrus M., Lagrue A.H., Okuma M., Bon C. (1997) Adhesion and activation of human platelet induced by convulxin involve glycoprotein VI and a2^1. J.Biol. Chem., 272, 27035-27041.

63. Jennings L.K., Phillips D.R. (1982) Purification of glycoproteins lib and Ilia from human platelet membrane and characterisation of a calcium dependent glycoprotein Ilb-IIIa complex. J. Biol. Chem., 257, 16637-16643.

64. Jin J.S., Kunapuli S.P. (1998) Coactivation of two different G proteincoupled receptor is essential for ADP-induced platelet aggregation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8070-8074.

65. Kahn M.L, Zheng Y.W., Huang W., Bigornia V, Zeng D.W., Moff S., Farese R.V.Jr., Tam C., Coughlin S.R. (1998) A dual thrombin receptor system for platelet activation. Nature, 394, 690-694.

66. Kashiwagi H., Shwartz M.A., Eigenthaler M.A., Davis K.A., Ginsberg M.H., Shatil S.J. (1997) Affinity modulation of platelet integrin allb{33 by p3-endonexin, a selective binding partner of the integrin cytoplasmic tail. J Cell Biol., 137, 1433-1443.

67. Keely P.J., Parise L.V. (1996) The a2Pi integrin is a necessary co-receptor for collagen-induced activation of Syk and the subsequent phosphorylation of phospholipase Cy2 in platelets. J Biol Chem., 271,26668-26676.

68. Kelton J.G. (1995) The serological investigation of patients with autoimmune thrombocytopenia. Thromb. Haemost., 74, 228-233.

69. Kemenade E. W., Kooyk Y., Boer A.J., et al. (1992) Adhesion of T and B lymphocytes to extracellular matrix and endothelial cells can be regulated through the |3 subunit of VLA. J. Cell Biol., 117., 461-470.

70. Kieffer N., Phillips D.R. (1990) Platelet membrane glycoproteins: functions in cellular interactions. Ann. Rev. Cell. Biol., 6, 329-357.

71. Koteliansky V.E., Leytin V.L., Sviridov D.D., Repin V.S., Smirnov V.N. (1981) Human plasma fibronectin promotes the adhesion and spreading of platelets on surfaces coated with fibrillar collagen. FEBS Lett., 123, 59-62.

72. Kouns W.C., Kristofer D., Hadvary P., et al. (1992) Reversible conformational changes induced in glycoprotein Ilb-IIIa by a potent and selective peptidomimetic inhibitor. Blood, 80, 2539-2547.

73. Kouns, W.C., Wall, C.D., White M.M., Fox C.F., Jennings L.K. (1990) A conformation-dependent epitope of human glycoprotein Ilia. J. Biol. Chem., 265,20594-20601.

74. Kovach N.L., Carlos T.M., Yee E., Harlan J.M. (1992) A monoclonal antibody to |31 integrin (CD29) stimulates VLA-dependent adherence of leukocytes to human umbilical vein endothelial cells and matrix components. J. Cell Biol., 116, 499-501.

75. Krissansen G.W., Elliott M.J., Lucas C.M. et al. (1990) Identification of a novel integrin (3 subunit expressed on cultured monocytes (macrophages): evidence that one a subunit can associate with multiple (3 subunits. J. Biol. Chem., 265, 823-830.

76. McMillan R. (1995) Clinical role of antiplatelet antibody assays. Sem. Thromb. Haemost., 21, 37-45.

77. Modderman P.W., Huisman H.G., von Mourik J.A., von dem Borne A.E.G.K. (1988) A monoclonal antibody to the human platelet membrane glycoprotein Ilb-IIIa complex induces platelet activation. Thromb. Haemost., 60, 68-74.

78. Moroi M., Jung S.M., Okuma M., Shinmiyozu K. (1989) A patient with platelets deficient in glycoprotein VI that lack both collagen-induced aggregation and adhesion. J Clin Invest., 84, 1440-1445.

79. Naik U.P., Patel P.M., Parise L.V. (1997) Identification of a novel calcium binding protein that interacts with the integrin abn cytoplasmic domain. J Biol Chem., 272, 4651-4654.

80. Newman P.J., Allen R.W., Kahn R.A., Kunicki T.J. (1985) Quantification of membrane glycoprotein Ilia on intact human platelets using the monoclonal antibody, AP3. Blood, 65, 227-232.

81. Newman P.J., Seligsohn V., Lyman S., Coller B.S. (1991) The molecular genetic basis of Glanzmann thrombasthenia in the Iraqi-Jewish populations in Israel, Proc Natural Academy Sciences, USA, 88, 3160-3164.

82. Newman P.J., Hillery C.A., Albrecht R., et al. (1992) Activation-dependent changes in human platelet PECAM-1: phosphorilation, cytoskeletal association, and surface membrane redistribution. J. Cell Biol., 119, 239246.

83. Niiya K., Hodson E., Bader R., et al. (1987) Increased surface expression of the membrane glycoprotein Ilb/IIIa complex induced by platelet activation. Relationship to the binding of fibrinogen and platelet aggregation. Blood, 70, 475-483.

84. Nurden A.T., Caen J.P. (1974) An abnormal glycoprotein pattern in 3 cases of Glanzmann's thrombasthenia. Brit. J. Haematol. 28, 253-260.

85. Nurden A.T., Caen J.P. (1975) Specific roles for platelet surface glycoproteins in platelet function. Nature, 255, 720-722.

86. Nurden A.T., Didry D., Kieffer N., McEver R.P. (1985) Residual amounts of glycoproteins lib and Ilia may be present in the platelets of most patients with Glanzmann's thrombasthenia. Blood, 65, 1021-1024.

87. Patcheke H. (1981) Shape and functional properties of human platelets washed with citrate. Haemostasis, 10, 14-27.

88. Phillips D.R., Agin P.P. (1977) Platelet membrane defects in Glanzmann's thrombasthenia. Evidence for decreased amounts of two major glycoproteins. J. Clin. Invest., 60, 535-545.

89. Phillips D.R., Charo I.F., Parise L.V., Fitzgerald L.A. (1988) The platelet membrane glycoprotein Ilb-IIIa complex. Blood, 71, 831-843.

90. Phillips D.R., Jennings L.K., Edwards H.H. (1980) Identification of membrane proteins mediating the interaction of human platelets. J. Cell Biol., 86, 77-86

91. Pidard D., Montgomery R.R., Bennet J.S., Kunicki T.J. (1983) Interaction of AP-2, a monoclonal antibody specific for the hyman platelet glycoprotein Ilb-IIIa complex, with human platelets. J. Biol. Chem. 258, 12582-12586.

92. Pidard D., Montgomery R.R., Kunicki T. (1982) Characterization of murine monoclonal antibodies specific for human platelet glycoproteins. Blood (suppl.), 60, 203 a (abstract).

93. Piotrowitcz R.S., Orchekowsky R.P., Nugent D.J., Yamada K.M., Kunicki T.J. (1988) Glycoprotein Ic-IIa functions as an activation-independent fibronectin receptor on human platelets. J. Cell Biol., 106, 1359-1364.

94. Poncz M., Eisman R., Heidereich R., et al. (1987) Structure of the platelet membrane glycoprotein lib. Homology to the alpha subunits of the vitronectin and fibronectin membrane receptors. J. Biol. Chem., 262, 84768482.

95. Pytela R., Pierschbacher M.D., Ruoslahti E., Marguerie G., Ginsberg M.H. (1986) Platelet membrane glycoprotein Ilb-IIIa: member of a family of arg-gly-asp-specific adhesion receptors. Science, 231, 1559-1562.

96. Qi W., Loh E., Vilaire G., Bennett J.S. (1998) Regulation of

97. Reddy K.B., Gascard P., Price M.G., Negrescu E.V., Fox J.E.B. (1998) Identification on an interaction between M-band protein skelemin and integrin subunits. J Biol Chem., 273, 35039-35047.

98. Rubinstein E., Boucheix C., Worthington R.E., Carroll R.C. (1995) Antiplatelet antibody interactions with Fey receptor. Semin. Thromb. Haemost., 21, 10-22.

99. Rubinstein E., Kouns W.C., Jennings L.K., Boucheix C., Carroll R.C. (1991) Interaction of two GPIIb/IIIa monoclonal antibodies with platelet Fc receptor (FcyRII). Br. J. Hamatol., 77, 80-86.

100. Ruggeri Z.M. (1993) Mechnisms of shear-induced platelet adhesion and aggregation. Thromb. Haemost., 70, 119-123.

101. Russel M.E., Seligsohn V., Coller B.S., Ginsberg M.N., Skoglund P. (1989) Quartermous T. Structural integrity of the glycoprotein lib and Ilia genes in Glanzmann thrombasthenia patients from Israel. Blood, 72,1833-1836.

102. Santoro S.A. (1995) Platelet integrins other than glycoprotein Ilb-IIIa (allb{33). In: Molecular Basis of Thrombosis and Haemostasis. (High K.A., Roberts Y.R. eds). Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong, 603619.

103. Shattil S.J., CTToole T., Eigenthaler M., Thon V., Williams M., Babiour B.M., Ginsberg M.H. (1995) p3-endonexin, a novel polypeptide that interacts specifically with the cytoplasmic tail on the integrin p3 subunit. J Cell Biol., 131, 807-816.

104. Shattil S.J. (1999) Signsling throught platelet integrin allbp3: inside-out, outside-in, and sideways. Thromb. Haemost., 82, 318-325

105. Shattil S.J. (1995) Function and regulation of the P3 integrins in haemostasis and vascular biology. Thromb. Haemost., 74, 149-155.

106. Shattil S .J., Brass L.F. (1987) Induction of the fibrinogen receptor on human platelets by intracellular mediators. J. Biol. Chem., 262, 992-1000.

107. Shattil S.J., Kashivagi H., Pampori N. (1998) Integrin signaling: the platelet paradigm. Blood, 91, 2645-2657.

108. Shattil S.J., Hoxie J.A., Cunnungham M., Brass L.F. (1985) Changes in the platelet membrane glycoprotein Ilb-IIIa complex during platelet activation. J. Biol. Chem., 260, 11107-11114.

109. Shattil S.J., OToole T., Eigenthaler M., et al. (1995) f33-endonexin, a novel polypeptide that interacts specifically with the cytoplasmic tail of the integrin P3 subunit. J. Cell Biol., 131, 807-816.

110. Smyth S.S., Hillery C.A. Parise V. (1992) Fibrinogen binding to purified platelet glycoprotein Ilb-IIIa (integrin allb|33) is modified by lipids. J. Biol. Chem., 267, 15568-15577.

111. Smyth S.S., Joneckis C.C., Parise V. (1993) Regulation of vascular integrins. Blood, 81, 2827-2843.

112. Sosnoski D.M., Emanuel B.S., Hawkins A.L. et al. (1988) Chromosomal localization of the genes for the vitronectin and fibronectin receptors a subunits and for platelet glycoproteins lib and Ilia. J. Clin. Invest., 81, 1993-1998.

113. Steiner B., Haring P., Kouns W., Hadvary P., Dembic Z. (1992) A monoclonal antibody interacting only with GPIIb-IIIa on activated platelets contain a novel recognition sequence. Circulation, 86,1-683 (abstract).

114. Steiner, B., Trzeciak, A., Pfenninger, G., Kouns, W.C. (1993) Peptides derived from a sequence within (33 integrin bind to platelet allb(33 integrin (GPIIb-IIIa) and inhibit ligand binding. J. Biol. Chem, 268, 6870-6873.

115. Stenberg P.E., McEver R.P., Shuman M.A., Jacques Y.V., Bainton D.F. (1985) A platelet alpha-granule membrane protein (GMP-140) is expressed on the plasma membrane during activation. J. Cell Biol., 101, 880-886.

116. Towbin H., Stachelin T., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 227, 680-685.

117. Ugarova T.P., Budzynski A.Z., Shattil S.J., Ruggeri Z.M., Ginsberg M.H., Plow E.F. (1993) Conformational changes in fibrinogen elicited by its interaction with platelet membrane glycoprotein Ilb-IIIa. J. Biol. Chem., 268,21080-21087.

118. Watson S.P., Gibbins J. (1998) Collagen receptor signalling in platelets: extending the role of the ITAM. Immunol Today, 19, 260-264.

119. Wheeler M.E., Cox A.C., Carroll R.C. (1984) Retention of the glycoprotein Ilb-IIIa complex in the isolated platelet cytoskeleton. Effects of separable assembly of platelet pseudopodal and contrctile cytoskeletons. J. Clin Invest., 74, 1080-1089.

120. Weiss H.J. (1995) Flow-related platelet deposition on subendothelium. Thromb. Haemost., 74, 117-122.

121. Wencel-Drake J.D., Plow E.F., Kunicki T.J., Woods V.L., Keller D.M., Ginsberg M.H. (1986) Localization of internal pools of membrane glycoproteins involved in platelet adhesive reactions. Am. J. Pathology, 124, 324-334.

122. Zimrin A.B., Eisman R., Vilaire G., Schwartz E., Bennett J.S., Poncz M. (1988) Structure of platelet glycoprotein Ilia. J. Clin. Invest., 81, 1470-1475.