Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Fe-рецептор-зависимая активация тромбоцитов моноклональными антителами против мембранных гликопротеинов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Fe-рецептор-зависимая активация тромбоцитов моноклональными антителами против мембранных гликопротеинов"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНУР

На правах рукописи

ВИНОГРАДОВ ДМИТРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Рс-рецептор-зависимая активация тромбоцитов моноклональными антителами против мембранных гликопротеинов

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа нынолнсна в лаборатории культур клеток и ткаисЛ Института экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР.

Научный руководитель: кандидат биологических паук.

нсл. Ii. с. Мазуров A.B.

Официальные оппоненты:

доктор биологических паук, профессор Лениикий ДО. кандидат медицинских наук Тепцопа И. А.

Ведущее учреждение: Институт биологической и медицинской химии АМН СССР.

Защита состоится "....' ............ 1941 года и .... часон па

заседании специализированного ученого сонета К 00 1.22.02 по Всесоюзном кардиологическом научном центре АМН СССР по адресу: Москва. 3-я Черепковская улица, д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться н библиотеке Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР.

Автореферат разослан "...."............ 1991 года

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Венгерова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исслепопяния. Тромбоциты играют ключевую роль о процессах гемостаза и тромбоза. Эта роль определяется двумя основными свойствами тромбоцитов - способностью к адгезии на поврежденной сосудистой стенке, что приводит к закрытию и последующей репарации места поврежления. и к агрегации. т.е.. к образованию крупных конгломератов. приводящему н конце концов к формированию тромба и выключению сосуда из кретотока. Способность к адгезии и агрегации опосредуется гликопротеннами наружной мембраны тромбоцитов. Мембранные гликопротсины служат рецепторами как индукторов тромбоцитарной активности. так и адгезивных белкоп, участвующих в процессах адгезии и агрегации . (Депктв а1. 1976).

В последнее время для изучения мембранных гликопротенпон тромбоцитов широко используются тоноклопальпне антитела (маТ). В различных лабораториях мира получено очень большое количество мАТ против целого ряда гликопротеинсн тромбоцитарной мембраны. С помощью этих мАТ было получено множество ноша сведении о структуре и механизмах функционирования ионср\ностны\ белкоп тромбоци-> тов. Как правило, мАТ либо никак не влияют на функциональную активность тромбоцитов. либо поланляют се. экранируя какой-либо рецептор от связывания с лигандом. Однако, в литературе имеется ряд сообщений о моноклональных антителах, способных активировать тромбоциты (см. напр. ВоисЬе1х ег а1, 1<>8Л). Хотя зти антитела направлены против различных мембранных антигенов. вызываемая ими активация тромбоцитов имеет ряд общих черт. что указывает на существование общего пути активации тромбоцитов моноклональными антителами. До сих пор механизм зтого явления изучен не был.

Феномен активации тромбоцитов антителами наблюдается не только а экспериментальных условиях, но и в клинической практике. В литературе имеется ряд сообщений о том, что при некоторых гематологических и аутоиммунных заболеваниях в крови пациентов обнаруживаются антитела, способные активировать тромбоциты (см. напр. Kcl-ton et al, 1986). Свойства этих иммуноглобулинов весьма схожи со свойствами активирующих моноклональных антител. Таким . образом, изучение механизма активации тромбоцитов моноклональными антител лами является важным как с общебиологической, так и с практической точки зрения.

Цель и запячи исслепования. Целью настоящей работы явилось изучение механизма активации тромбоцитов моноклональными антителами против гликопротеинов их наружной мембраны. В задачи исследования входило:

1) Охарактеризовать полученное автором моноклональнос антитело VM58, обладающее способностью активировать тромбоциты.

2) Используя мАТ VMS8, а также еще дна активирующих мАТ (а-мАТ) -LeoAl и FMC56, которые были получены в других лабораториях, выяснить механизм активации тромбоцитов антителами против антигенов тромбоцитарной мембраны.

3) Выяснить природу обнаруженной гетерогенности реакции тромбоцитов разных доноров на действие а-мАТ.

4) Изучить механизм ингибирования а-мАТ-иплуцирооанной активации тромбоцитов моноклональными антителами против комплекса гликопротеинов lib-II la тромбоцитарной мембраны.

Новизна результатов. Впервые показано, что активация тромбоцитов антителами против мембранных гликопротеинов не зависит от

природы антигена а-мАТ. Обнаружено. что а-инл\инронапная активация опосредована связыианием Рс-фрагмента анпмся с имеющимся на мембране тромбоцитоп рецептором Рс-фра1 менюн иммчпо-глобулиноп О. Показано, что а-мАТ сначала спязынзегся с помош.п РаЬ-фрагментоп с антигеном. а затем - через Рг-фрзгмеш - с Ре-рецептором Iромбоннтон. н что именно спязыпаиио -фрш МОП I л с Яс-рецептором приводит к актинацин трочбопн1 он

Впервые обнаружена Iетеротсппос ч. рглииш I ромРшш Iни на лсПстпие ак тимирчюших монок понят.них ямгнюч I * I пои I ,и1т с 1 л1. 1940 1 н продемонстрирована ее снял, с шнпмнич полнморфп )моч I г • рецептора тромбоцитов. янляпшимся нрпчнион I с I ерш спнос I и реакции тромбоцитом на действие некоторых других Гс - рецептор -зависимых инлукторон (Магигоу е1 з1. 1<191).

Показано. что активация тромбон»юн Рс-ренепюр-зависимыми индукторами ингибпрустся моноклона лишни анш голами прогпн I «нко-протеиноного комплекса 11Ь-М1а тромбоцн'арном мембраны. н чго это ннгпбнропание не является спснсишем кочк,ренкпп мАТ прогни ГП Г IЬ - 1 I 1а и а-мАТ ни за антиген, пи та Рс-рецсптор ( Вино! радон и соапт. . 1')<И), Предполагается, что мАТ прогни ГП11Ь-1Мэ ннгнби-руют связывание Рс-фрагментоп а-мАТ с Рс-рсцентором стерически. н силу топографической ассоциации ГППЬ-П1а и Рс-рецептора на мембране тромбоцитов.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные позволяют понять неизвестный ранее механизм активации тромбоцитов моноклональными антителами против гликопротсинои тромбоцитарной мембраны. Из результатов работы слелует, что а-мАТ относятся к Рс-рецептор-зависимым индукторам активации тромбоцитов, и что действие их на тромбоциты разных доноров зависит от

структуры тромбоцитарного Fc-рецептора. Полученные данные указы-' вают на то, что Fc-рецептор ассоциирован в мембране тромбоцитов с комплексом ГППЬ-IIIa. Таким образом, основные положения диссертации расширяет представления о функционировании тромбоцитарного звена гемостаза. Данные о механизме активации тромбоцитов антителами позволяют объяснить этиологию и патогенез тромбоцитопеничес-ких и тромботических осложнений некоторых аутоиммунных и гематологических заболеваний, при которых в крови пациентов обнаруживаются активирующие антитела.

Апробация рабптм Основные результаты работы были представлены на 3-м Эрфуртском рабочем совещании по тромбоцитам (Эрфурт, 1989) и на XIII конгрессе междулародного общества по тромбозу и гемостазу (Амстердам, 1991). Диссертация была апробирована на межлабораторном семинаре во Всесоюзном кардиологическом научном центре (Москва, 1991 г.).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Структура и об-ьам работы. Диссертация состоит из разделоп: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы". "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выноды" и "Список литературы". Объем работы 155 страниц машинописного текста, она содержит 30 рисунков и 1 таблицу. Библиография включает 207 ссылок на отечественные и зарубежные работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Кровь для выделения тромбоцитов брали у здоровых добровольцев, не принимавших лекарств в течение двух недель перед взятием крови, а также у двух ранее описанных пациентов с тромбастеписй Гланцманна (Mcyer et al, 1983). Для получения обогащенной тромбо-

цитами плазмы (ОТП) кровь собирали в 1.81 нитрат натрия и центрифугировали 10 мин. при 180 g. Отбирали 2/3 слоя ОТП. Для получения отмытых тромбоцитов (ОТ) кровь собирали в, кислый-питрат-декстроэу (КОД) (65 мМ лимонной кислоты. 85 мМ цитрата натрия. 27 D-глюкоэы) и центрифугировали 15 мин при 180 g для получения ОТП. Отмывку тромбоцитов от плазмы производили по метолу Patcheke (1981) с незначительными изменениями. После отмывки iрочбопиты суспендировали в модифицированном растворе Тироле (Тироле -HEPES).

Для получения моноклональных антител самцов мышей линии BALB/c иммунизировали тромбоцитами внутрибрюшинно в течение 2 месяцеп с интервалом в ? нелели. Слияние спленоцитов иммунизированных мышей с мышиной миеломой X63-Ag8-ft5> п клонирование гибридных клеток проводили по Koehler и Milstein (1975). Для получения препаративных количеств мАТ гибридные клетки выращивали и брюшной полости мышей линии BALB/c. Антитела из асцитны\ жидкостей выделяли с помощью прецннйт-апин Na,S(>4 и последующей ионообменной хроматографии. Чистоту препаратов мАТ промеряли с помощью электрофореза в 7. S1 ПААГ по Laemmli (1470).

Для определения содержания антител н олюратках. культу-ральных средах и хроматографическнх фракциях был разработай специальный вариант иммупоферментного анализа (НФА) с использоиаиисм не фиксированных, как это принято в мировой практике, э интактных тромбоцитов. (Mazurov et al, 1991). Суспензию отмытых тромбоцитов вносили в лунки культуральных пластин. осаждали при 1000 g и инкубировали в течение 30 мин. при 37°С для прикрепления тромбоцитов к пластику. После инкубации лупки осторожно но тщательно промывали пипеткой для удаления непринрепиншихся тромбоцитов. Все последующие отмывки тоже производили с помощью пипетки.

Определение изотипов полученных мАТ проводили методом дот-, блоттинга, используя набор антисывороток для определения изотипов мышиных IgG фирмы Amcrsham (Великобритания). Все описываемые в

настоящей работе мАТ принадлежали к подклассу IgCl( ).

О

F(ab')^-фрагменты антитез получали путем обработки мАТ пепсином по методу Coller и соаат. (1983). Для удаления нерасщепив-шихся IgG и Fc-фрагментов препараты инкубировали с заведомым избытком Протеин-А-Сефарозы. Чистоту полученных F(ab')^-фрагмен-тов контролировали с помощью SDS-электрофореза в 7.5% ПААГ.

Агрегированные мышиные и человеческие IgG (arp-IgG) получали по методу Fhueller и Lusher (1972), добавляя к очищенным IgG равный объем холодного ацетона, с последующей инкубацией на льду и многократным диализом против фосфатно-солевого буфера (ФСБ).

Для исследования связывания с тромбоцитами мАТ метили йодом-125 с помощью йодогена по Frackcr и Speck (1978). ,25I-mAT инкубировали. с суспензией тромбоцитов в течение 30 мин. при 3 7°С. Для /

отделения несвязавшихся антител тромбоциты центрифугировали при 9800 g в течение 4 мин. через 20% сахарозу. После центрифугирования пробирки замораживали, отрезали донышки и определяли связанную с тромбоцитарным осадком радиоактивность. Для определения : несвязанной радиоактивности просчитывали верхние части.пробирок.

Исследование агрегации тромбоцитоп провопили в агрегометрах

Aggregation Analyzer (с/п Астек, СССР-Австралия) и Payton ("Scar-

8 8

borough", США) при концентрации тромбоцитоп 2 х 10- - 3 х 10 /мл. при температуре _ 37°С и при перемешивании со скоростью 900 об/мин. Агрегацию индуцировали ADP, ристоцетином, тромбином. arpIgG и активирующими моноклональными антителами.

Определение секреции тромбоцитами АТФ проводили в ОТП. иолу-

ченной из крови. антикоагулиропанной 1. S'i цитратом Na. и шочн-агрегомстре Payton 1000. Повышение концентрации Са" н щи онлазме тромбоцитов определили по метолу Popov и соант. (198К) с почошыо флуоресцентного зонда Индо-IAM п многоканальном лазерном фл>орсс-центном анализаторе.

Для определения антигенов мАТ поверхность трочйониюи «с тли йодом-125 с помощью лактопероксилазы по метолч rhillips М •> ? 2 ) с незначительными модификациями. За тем грочЛошнм гилшЛнпитронами Тритоном Х-1Л0 и пылержинали УО чин » поляной Ciaup Поо лг iioro проводили иммуповрецшштапию но Berndt н соант (1'>.ч1). г nninni.-эопанисм суспензии St aph i lococcus aureus InaiicopPinil и аниигл КОЗЫ Против мышиных иммуиоглобу ЛИКОМ Прсцшшт Проианпыс IpOMOOIIII-тариые белки анализировали с помоип.ю SDS-злектрофореза по Laemmli (1970) в 14 ПААГ и испосстанаплинающнх и восстанавливающих <>'< 2-меркавтоэтанол) условиях. После электрофореза получали ангорално-грамми высушенных гелей.

РЕЗУЛЬТАТЫ К ОБСУЖДЕНИЕ

Спойстча мАТ VMSq

В резуд|»татс гибридизации сплснокитоп пмм>визированной тромбоцитами мыши с клетками мышиной мисломы мы получили несколько гибридных клонов, синтезирующих антитела против антигенов тромбо-цитарной поверхности. Ориентируясь на уровень связывания культу -ральных сред клоков с тромбоцитами, мы выбрали для дальнейших исследований 4 гибридомных клена. Антитела, синтезируемые этими клонами, были получены в препаративных количествах (по 50-100 мг чистых мАТ). Чистота полученных мАТ контролировалась метолом SDS-ПААГ-электрофореза.

Для определения влияния полученных мАТ на функциональную

- в -

активность тромбоцитов были проведены эксперименты по агрегомет~ рии. В результате этих экспериментов выяснилось, что. в отличие от большинства описанных в литературе мАТ к антигенам тромбоци-тарной поверхности, которые либо никак не влияют на функциональную активность тромбоцитов, либо ингибируют се, одно из полученных нами мАТ - VM5 8 - само по себе является индуктором тромбоци-тарной активности и вызывает агрегацию тромбоцитов. Агрегация начиналась при добавлении в кювету агрегометра очень малых лоз VM58 - менее 0.5 мкг/мл. Увеличение концентрации мАТ сокращало лаг-фазу агрегации, но максимальный уровень агрегации при этом ' практически не изменялся (рис. . Ингибитор активности тромбоцитов простагландин El полностью предотвращал VM58-индуцированную агрегацию. Этот результат свидетельствовал о том, что наблюдаемый нами эффект есть истинная агрегация, а не пассивная агглютинация тромбоцитов.

Антитело VMS8 было способно вызывать агрегацию тромбоцитов как в ОТП (рис. I и 2А), так и в суспензии ОТ (рис. 2Б). Одновременно с агрегацией наблюдалась секреция тромбоцитами АТФ. свидетельствующая о высвобождении содержимого плотных гранул (рис. 2А), а также повышение концентрации в тромбоцитах' цитоплазмати-ческого Са*+ (рис. 2Б). Эти результаты доказывали, что антитело VM58 является полноценным индуктором, способным вызывать истинную активацию тромбоцитов.

Изучая связывание VM58, меченого йоцом-125, с тромбоцитами в

суспензии, мы определили, что константа связывания VM58 с тромбо-- 9

цитами Kd - 1.2 х 10 М, а максимальное число мест связывания

VM58 на одном тромбоците Вгоах•« 11400 (рис 3). Следует отметить,

125

что концентрационные зависимости уровня связывания I-VM58 с

- о

20%

Рис. I. Агрегация тромбоцитов, индуцированная мАТ VMS8.

VM58 добавляли до конечной концентрации 0. 5 мкг/мл (1),. I мкг/мл (2), 5 мкг/мл (3) и 20 мкг/мл (4,5) к интактной ОТП (1-4), или к ОТП, прединкубированной с 200 нг/мл ПГЕ1 (5). Момент добавления VM58 отмечен стрелкой.

Т 0

~г 4

п 6

Время, мин.

Время, мин.

Рис. 2. Секреция АТФ и повышение концентрации цитоплазматического Са , индуцированные MAT VM5 8.

К тромбоцитам добавляли VM58 до концентрации 20 мкг/мл. Секрецию АТФ регистрировали в ОТП (А), а повышение концентрации цитоплазматического Саг* - в ОТ (Б) одновременно с агрегацией, как описано в разделе "Материалы и методы". Момент добавления VM58 отмечен стрелками.

тромбоцитами и длительности лаг-фазы УМ58-индуцированной агрегации тромбоцитов хорошо коррелировали друг с другом.

Для определения природы антигена мАТ VM58 мы провели опыты

125,

по иммунспреципитации антителом VM58 его антигена из лизата -I-меченных тромбоцитов. В преципитатах VM58 обнаруживался один белок, мол. вес которого составлял 90 кДа как в невосстанавлипаю-щих, так и в восстанавливающих условиях. На основании характера злектрофоретической миграции антигена и количества его молекул на поверхности ояногс тромбоцита мы предположили, что антигеном VM58 является гликопротеин IV (miV) - белок с мол. весом 91000 кДа, представленный на тромбоците в количестве I2000-14000 копий (Asch et al, 1987). Похожий молекулярный вес имеет еще олин ГП тромбо-цитарной мембраны - ГПП1а (Pidard et а 1. 1983), однако, некоторые факты свидетельствовали против того. что VM5 8 связывается с этим ГП. Во-первых, мол. вес ГПШа, определяемый при электрофорезе в невосстанавливающих условиях равен 90 - 95 кДа, а в восстанавливающих условиях увеличивается до 100 - 110 кДа. Во-вторых, ГПШа отсутствует на мембране тромбопптоп пациентом с тромбасте-нией Гланпманна (Peerschke et al. 1980). и мАТ.против этого ГП не способны к связыванию с такими тромбоцитами. Однако, VM58 связывалось с тромбоцитами двух пациентов, страдающих тромбастенисй Гланцманна, даже несколько эффективнее, чем с тромбоцитами здоровых доноров. Кроме того, количество копий антигена на мембране одного тромбоцита, определенное по методу Скэтчарда, тоже соответствовало miV, а не rnilla, который представлен на мембране примерно 50000 копий (Phillips, Agin, 1977). Таким образом. в этой части работы было получено и охарактеризовано моноклональное антитело VM5 8, связывающееся с гликопротеином IV тромбоцитарной

8

8 1

о т о

►Н Ь-4 §

25

0

5 10 15 ^ЬУМбв, мкг/мл

8

в

4 -

Б

10~3 молекул на 1 тромбоцит

Связанное ^1-УМ58,

Рис. 3. Связывание 1-УМ58 с тромбоцитами.

, А - к ОТ добавляли различные концентрации ,251-УМ58 и определяли связывание, как описано в разделе "Материалы и методы". Б - Кривая связывания УМ58 с тромбоцитами, преобразованная по методу Скзтчарда.

- lí -

мембраны и способное активировать тромбоциты. Лонстпо VM'.s приводило к агрегации тромбоцитов, секреции плотных гранул и мобилизации внутриклеточного кальция.

Изучение механизма а-мАТ-инпупиропанпоП актинаиии тромбоцитов Следующая стадия работы была посиящсна пмяснсккю нопроса о том, каким образом мАТ к антигенам наружной мембраны тромбоцитом могут активировать последние. На этом этапе предметом нашего исследования было уже не только антитело VM5S. полученное нами, но и еще два мышиных моноклональных антитела. Эти антитела, способные. как и VM58. вызывать агрегацию тромбоцитов, были любезно предоставлены нам л-ром М. Берингом (Австралия). Антитело LeoAl направлено против антигена тромбоннтарной мембраны РТА 1 с мол. весом 67 кДа (Scott et al. 1ЧЯ9). Антитело FMC'56 распознает гликопротеин CD9. который весит 24 кДа. и встречается па поверх-' ности многих типов клеток (Gorman et al. 1ч я 5). Оба этих мАТ. также как и мАТ VM58, относились к подклассу Igt'.ll ).

• В опытах по агресометрии выяснилось. чю F< лЬ'),-фр.и менты активирующих мАТ. в отличие от интактпых IgC¡. но способны индуцировать агрегацию тромбоцитов. Более того. после предннкубаиии тромбоцитов с F(ab'),-фрагментами а-мАТ добавление соответствующего интактного а-мАТ тоже не приводило к aipciации (рис. 4). Эти результаты позволили сделать дна важных вывода. Во-первых, неспособность F(ab')^-фрагментов а-мАТ. вызывать агрегацию тромбоцитов указывала на то, что в активации тромбоцитов моноклональпым антителом как-то участвует его Fc-фрагменч-. Во-вторых, невозможность вызвать активирующими мАТ агрегацию тромбоцитов, прединкубирован-ных с F(ab')2-фрагментами этих а-мАТ, говорила о том, что просто-

14 г.

I-1 "

1 МИН.

Рис. 4. Влияние Р(аЬ* )г-фрагментов, а-мАТ на а-мАТ-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

К ОТП, прединкубированной в течение 5 мин. с ФСБ (1-3) или с 20 мкг/мл К(аЬ' )г-фрагментов а-мАТ УМ58 (4). ЬеоА1 (5) и РМС56 (6) добавляли 20 мкг/мл интактных 100 УМ58 (1.4), ЬеоА1 (2.5) и РМС56 (3,6). Момент добавления а-мАТ отмечен стрелкой.

- is -

го присутствия Fc-фрагмента а-мАТ, по-вияимому, .недостаточно для активации. Кроме этого необходимо чтобы Fab-фрагмент а-мАТ был связан с антигеном-мишенью.

Из литературных данных известно, что некоторые индукторы способны активировать тромбоциты, взаимодействуя с имеющимися на их поверхности рецепторами Fc-фрагментов иммуноглобулинов О (Fc RII) (Israels et al. 1973). Для того чтобы проверить. не задействован ли в изучаемой нами а-мАТ-инлуцпронаиной агрегации тромбоцитов их Fc-рспептор, мы нсмольэопали мышиное моноклопаль-ное антитело IV.3 против Fc-рецептора тромбоцитов, любезно предоставленное нам д-ром К.Андерсоном (США). Агрегомстрическпс исследования показали, 'что ни одно из а-мАТ не способно вызвать агрегацию тромбоцитов, прелинкубиронанных с антителом IV.3. Чтобы исключить возможность объяснения этих результатов конкуренцией MAT IV. 3 и а-мАТ за связывание с антигеном, мы изучили связывание а-мАТ с тромбоцитами в присутствии IV.3 па примере а-мАТ VM5X. Несмотря на то что4IV.3 полностью блокировало УМ^И-нндуцироваппую

I •> i;

агрегацию тромбоцитов, оно не влияло.на связывание "I-VM5R с

t 1 <

ОТ. При концентрации 0.5 мкг/мл связывание I-VM54 составляло 42 нг и 39 нг на Ю7 тромбоцитов соответственно в отсутствие и в присутствии R0 мкг/мл IV. 3.

Изложенные результаты позволили нам прийти к выводу о том. что а-мАТ, , взаимодействуя с тромбоцитами. сначала связываются Fab-фрагментами с антигенами-мишенями. а затем происходит связывание Fc-фрагмента мАТ с Fc-рецептором тромбоцитов. что и приводит к их активации (рис. 5). Косвенным подтверждением этого вывода может служить тот факт, что F(ab')2-фрагменты всех описанных в литературе а-мАТ тоже не способны актииировать тромбоциты.

Рис. 5. Схема, иллюстрирующая механизм активации тромбоцитов активирующими мЛТ. После связывания со своим антигеном (АГ) а-мАТ связывается через Рс-фрагмент с тромбоцитарным Яс-рецептором (РсЮ. что и приводит к активации тромбоцитов.

2

" 3

1 шш.

Рис. б.; Три типа реакции тромбоцитов на действие а-мАТ.

. УМ58 добавляли до концентрации 20 мкг/мл к ОТП (А) или к ОТ (Б) доноров Р-типа (1). Р^-типа (2) и М-типа (3). Момент добавления \/М58 отмечен стрелками.

Гетерогенность реакции тромбон» гон на uciic runc

активирующих MAT

Исследуя агрегацию, вызываемую а-мАТ. мы обнаружили. что реакция тромбоцитов разных донороп на их действие нсолинакона. Тромбоциты доноров Р-типа (Р - positive) агрегпропали пол действием VM58 как в виде ОТП, так и н виле ОТ. тромбоциты N-imta (N - negative) не реагировали на а-мАТ ни п одном из «пух случаев; что же касается донороп третьего. промежуточного (PN) типа, то приготовленный из их крови препарат ОТП не обнаруживал реакции на а-мАТ, в то время как те же тромбоциты в виле препарата ОТ агрегировали в ответ на эту стимуляцию (рис. 6). В то же время обычные дозы такого индуктора как АДФ (около 5 мкМ) вызывали нормальную агрегацию тромбоцитов всех доноров.

Связывание VM58 и IV. 3 с ОТП доноров всех типов было одинаковым, т.е.. качественное различие п способности тромбоцитов разных типов агрегировать п ответ па действие а-мАТ не зависело от количества молекул антигена а-мАТ и Fc-рецептора из их поверхности. Процентное соотношение донороп разных типов выглядело как 5 5%: 194-: 25%. что близко к отношении 2:1:1.

Добапляя к отмытым тромбоцитам каждого типа равный объем плазмы крови доноров всех трех типов или буфера Тироле-HEPES. мы выяснили. что тромбоциты Р-типа агрегируют пол действием а-мАТ как . в присутствии плазмы донора любого типа, так и без плазмы, тромбоциты N-типа не реагируют на а-мАТ ни в отмытом состоянии, ни после добавления плазмы любого типа, а тромбоциты PN-типа агрегируют под действием а-мАТ в види ОТ. но теряют эту способность, будучи суспендированы в плазме донора любого из трех типов (табл. 1).

Таблица I. Зависимость УМ58-индуцированной агрегации тромбоцитов от присутствия плазмы крови или IgC человека.

Плазма | Отмытые тромбоциты

тип I Р PN N

р 1 PN 1 N | ♦ ¥ ¥

Буфер | - ¥ -

Ig04 | + - ■ -

8

К ОТ доноров Р-. PN- и N-типа (концентрация 4 ч 10 клотоц/мл) добавляли во всех возможных сочетаниях равный объем плазмы кропи тех же доноров, суммарной фракции человеческих плазменных 1 (концентрация 8.4 мг/мл) или буфера Тироле-HEPES. Поспе пятиминутной инкубации ■ добавляли 20 мкг/мл VM58 и записывали кривую агрегации. Знаком (■» ) отмечены сочетания. и которых агрегация наблюдалась, а знаком (-) - отсутствие агрегации.

Эти результаты спилетельстнонали о том. что способность или неспособность тромбоцитов разных типов реагировать на действие а-мАТ определяется но особенностями состава плазмы у разных доноров, а особенностями самих тромбоцитов. Неспособность тромбоцитов PN-типа агрегировать под действием а-мАТ н присутствии плазмы

определялась их взаимодействием с каким-то плазменным компонент-

том, однако этот компонент содержался в плазме доноров всех трех типов. Добавляя а-мАТ к отмытые тромбоцитам различных типов, прединкубированным с 8.4 мг/мл суммарной фракции человеческих плазменных IgG (IgG4), мы выяснили, что IgG, как и плазма, не влияют на реакцию тромбоцитов Р- и N-типов, но ингибируют а-мАТ-индуцированную агрегацию тромбоцитов PN-типа (см. табл. 1).

Поскольку принадлежность тромбоцитов к тому или иному типу^ реакции на а-мАТ не коррелировала ни с полом, ни с группой крови

донора, не была обусловлена различиями в количестве антигенных детерминант а-мАТ или Гс-рецепторов на поверхности тромбоцитов и не зависела от состава плазмы крови доноров, мы предположили, что наблюдаемая нами гетерогенность определяется различиями в структуре Рс-рецептора. Основанием для этого предположения послужило сообщение Ьоопеу и соавт. (1983) о структурном полиморфизме Рс-рецептора тромбоцитов разных доноров, сопровождающемся различной реакцией тромбоцитов на активирующее действие Рс-рецептор-зааисимого индуктора - иммобилизованных IвС1 мыши. Сравнив реакцию тромбоцитов разных типов на действие а-мАТ и агрегированных мышиных ^01 (агр1дС1м), использованных вместо иммобилизованных 1йС1м, мы выяснили, что действие обоих индукторов на тромбоциты разных типов совершенно одинаково (табл. 2).

Таблица 2. Действие а-мАТ и агр^О на тромбоциты разных типов

1 Индуктор I 1 ОТП | ОТ

Р Р№ N | Р PN N

а-мАТ | + - 1 - -

1 агр^С. | ---------1 + - 1 + +

К ОТП и ОТ доноров Р-, и Ы-типа добавляли а-мАТ или агр^О и

записывали кривую агрегации. Знаком (+) отмечены случаи, в которых агрегация наблюдалась, а знаком (-) - отсутствие агрегации.

• Таким образом, мы показали, что обнаруженная нами гетерогенность действия активирующих мАТ на тромбоциты разных доноров полностью совпадает с гетерогенностью действия на тромбоциты агр18С1м, и следовательно, как и последняя, определяется структурными различиями тромбоцитарного Рс-рецептора у разных доноров.

Ингибиоопание Fr-pononTop-3anucnMM\ пропеггпп монокпоналышми антителами против комплекса I IЬ-Ilia тромбгиштярной мембоанц.

Исслелуя влияние полученных нами антитромбоцитарных мАТ на функциональную активность тромбоцитов, мы обнаружили, что олно из них - MAT VMl6a - облапает способностью ингибировать Fc-рецептор-зависимую агрегацию тромбоцитов, индуцированную как а-мАТ так и arp'IgG (рис. 7 и 8, кривые 1 и 3). При этом VMlfta не влияло на агрегацию тромбоцитов, индуцированную тромбином, АДФ или ристоце-тином. Антигеном мАТ VMI6a был не Fc-рецептор. а гликопротенпо-вый комплекс тромбоцитарной мембраны lib-II1а. являющийся рецептором фибриногена. VM16a не препятствовало связыванию а-мАТ с тромбоцитами.

Помимо мАТ VMlfta в нашем распоряжении было еше одно монокло-нальное антитело против ГППЬ-IIIa - АР-3. Полученное нами от доктора Т. Куники (США). Как и VM16a. АР-3 было способно ингибировать Fc-рецептор-зависимую агрегацию тромбоцитов. но не нлияло на АДФ-, тромбин- и ристонетин-индуциронаииую агрегацию и не ингибировало связывания а-мАТ с тромбоцитами.

Неспособность MAT VMlfta и АР-3 ингибировать лсПствне на тромбоциты таких индукторов как АДФ и тромбин свидетельствовала о том,' что зпитопы VM1Ла и АР-3 отличны от сайта связывания фибриногена с ГППЬ-IIIa. Следовательно, способность VM 16а и АР-3 ингибировать Fc-рецептор-зависимую агрегацию тромбоцитов не была связана с блокированием фибриногенооого рецептора ГППЬ-Itla.

. Поскольку ингибирующее действие VM16a и АР-3 на Fc-рецептор-зависимую агрегацию тромбоцитов нельзя было объяснить конкуренцией этих мАТ ни с фибриногеном, ни с а-мАТ. мы предположили, что Fc-фрагменты мАТ против ГППЬ-IIIa. конкурируют с Fc-рецептор-

20к

1 ит

Рис. 7. Влияние MAT VMl6а на VM58- и LeoAI-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

К ОТ, прединкубированным в течение 5 мин. с 20 мкг/мл интак-тных IgG VM16a (1). F(ab'),-фрагментов VM16a (2) или контрольного МАТ (3) добавляли i мкг/мл VMS 8 (А) или LeoА1 (Б). Моменты добавления индукторов отмечены, стрелками.

20%

1 МИН.

Рис. 8. Влияние мАТ УМ16а на агр1gG-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

К ОТ, прединкубированным в течение 5 мин. с 20 мкг/мл интак-тных УМ1ба (Г), Р(аЬ')2-фрагментов УМ16а (2) или контрольного

МАТ (3) добавляли 20 мкл агр1гСч (А) или 50 мкл агр I ¿С I м' (-Б) . Моменты добавления индукторов отмечены стрелками.

Рис. 9. Возможное взаимное расположение Fc-рецсптора. антигенов а-мАТ и ГППЬ-IIIa на тромбоцнтарной мембране.

Каждый из антигенов а-мАТ (CD9, ГГПУ и РТА1) расположен так. что связанное с ним а-мАТ может связаться Fc-фрагментом с Рс-рецептором. Заштрихована молекула мАТ против ГГЦ I b - I И а. стерически препятствующая этому процессу. ГШIb-II1а и Fc-рецептор изображены рядом, однако, ассоциация между ними на рисунке не отражена, т. к. природа ее пока неизвестна.

зависимыми индукторами за связывание с Fc-рецептором. Однако, оказалось, что F(ab')2-фрагменты VMI6a тоже способны ингибиро-вать Fc-рецептор-зависимую агрегацию тромбоцитов, хотя и в меньшей степени, чем интактные IgG VM16a (рис. 7 и 8, кривые 1 и 2). Таким же свойством обладали и F(ab')2-фрагменты MAT АР-3.

Объяснить обнаруженный нами эффект ингибирования Fc-рецептор-зависимой активации тромбоцитов антителами против ГП11Ь-111а можно следующим образом. Возможно, мАТ против ГП1Ib-I lia, связываясь со своими эпитопами, создают стерическое препятствие связыванию Fc-фрагментов а-мАТ или arpIgG с Fc-рецептором тромбоцитов (рис. 9).

ВЫВОДЫ:

1. Получено и охарактеризовано моноклональное антитело VM5 8, направленное против гликопротеина IV тромбоцитарной мембраны и являющееся индуктором активации тромбоцитов. VM58 стимулирует агрегацию тромбоцитов, секрецию содержимого плотных гранул и увеличение концентрации кальция в цитоплазме тромбоцитов.

2. Обнаружено. что способность моноклопалы-ых антител активировать тромбоциты не зависит от того, против каких антигенов тромбоцитарной мембраны эти антитела направлены. Связаошись сначала с антигеном, активирующие моноклонадьные антитела взаимодействуют затем с FcI I-рецептором тромбоцитов с помощью своих Fc-фрагментов, что и приводит к активации тромбоцитов.

3. Обнаружено, что реакция тромбоцитов разных доноров на действие активирующих моноклональных антител неодинакова. Тромбоциты доноров Р-типа агрегируют под действием а-мАТ как в присутствии, так и в отсутствие плазмы крови, тромбоциты доноров N-типа не чувствительны к действию а-мАТ, а тромбоциты доноров PN-типа реагируют на стимуляцию а-мАТ только в отсутствие плазмы. Добавление плазмы или суммарной фракции человеческих плазменных IgG к этим тромбоцитам подавляет их способность активироваться под действием а-мАТ,

4. Сходство реакции тромбоцитов разных типов на стимуляцию а-мАТ и агрегированными IgGI мыши указыиает на то. что гетерогенность реакции тромбоцитов разных доноров на действие а-мАТ определяется полиморфизмом Fc II-рецептора у человека.

5. Обнаружены моноклональные антитела против комплекса гликопро-теинов IIb-II1а тромбоцитзрной мембраны, способные специфически ингибировать действие Fc-рецептор-зависимых индукторов. Это указывает на возможность топографической ассоциации ГПИЬ-IIIa и Fe II-рецептора на тромбоцитарной мембране.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Vinogradov D.V., Mazurov A.V., Vlasik Т.N., Trakht I.N., Repin V.S. Stimulation of platelet aggregation by monoclonal antibody 5C8. Heterogeneity of 5C8 effect in healthy donors // Abstr. 3rd Erfurt Workshop on Platelets, Erfurt, 1989 / Platelets.- 1990.-V. 1. - P. 109.

2. Виноградов Д.В., Власик Т.Н., Агафонова О.Г., Васильев С.А., Лагутина Н.Я., Макаров В.А., Берндт М., Мазуров А. В. Ингибирова-ние Fc-рецептор-зависимой агрегации тромбоцитов моноклинальным антителом против комплекса гликопротеинов I lb-II1а // Биохимия.-1991.- No5.- С.787-797.

3. Mazurov А.V., Vinogradov D^V.. Vlasik Т.N., Burns G.F., Berndt M.С. Heterogeneity of platelet Fc-receptor-dependent response to activating monoclonal antibodies // Platelets - 1991,- (in press).

4. Mazurov A.V., Vinogradov D.V., Vlasik T.N., Burns G.F., Berndt M.C. Heterogeneity of platelet Fc-receptor-dependent response to activating monoclonal antibodies // Abstr. XIII Congr. Thrombos. Haemostas., Amsterdam.- Thromb.Haemostas.- 65.- 657,- 1991.

5. Mazurov A.V., Vinogradov D.V.. Vlasik T.N., Repin V.S., Booth W.J., Berndt M.C. Characterization of an antiglycoprotein lb monoclonal antibody that specifically inhibits platelet-thrombin interaction // Thromb. Res.- 62.- 673-684,- 1991.