Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм действия лизофосфатидилхолина на некоторые рецептор-зависимые процессы в сердце и тромбоцитах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм действия лизофосфатидилхолина на некоторые рецептор-зависимые процессы в сердце и тромбоцитах"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕИИЪШ

КОМПЛЕКС

- 2 'ИОН 1333

На правах рукописи

КОРОТАЕВА Александра Алексеевна

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ЛИЗОФОСФАТИДИЛХОЛИНА НА НЕКОТОРЫЕ РЕЦЕПТОР-ЗАВИСИМЫЕ ПРОЦЕССЫ В СЕРДЦЕ И ТРОМБОЦИТАХ

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических паук

Москва -1998

Работа выполнена в группе биохимии липидов и простаглаидинов Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научно-производственного комплекса Министерства Здравоохранения России

Научный руководитель Кандидат химических наук ГГ.В.Проказова

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук В.З.Лапкин Доктор биологических наук Т.Н. Тарховская

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина РАН.

Защита диссертации состоится "17" июня 1998 г. в 11 часов на заседании специализированного ученого совета К 074.22.02 в Кардиологическом научно-производственном комплексе МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ.

Автореферат разослан "16" мая 1998 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук " Т.И.Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Природный фосфолипид лизофосфатидилхолин (ЛФХ), как было установлено в последние годы, является важным медиатором атерогенных эффектов окисленных липопротеидов низкой плотности (Witztum et al., 1997, Steinberg et al., 1989, Pech-Fvsellem et al., 1996) . Этот лизофосфолипвд составляет до 40% суммарных липидов окисленных липопротеипов и его содержание повышается в атеросклеротических поражениях сосудов человека и экспериментальных животных, содержащихся на атеросклеротической диете [Langton et al., 1992, Mock et al., 1990]. В экспериментах in vitro были установлены его множественные атерогенные эффекты. ЛФХ оказывал митогенный эффект на макрофаги мышей и, как предполагают, играл критическую роль в формировании пенистых клеток при взаимодействии макрофагов с окисленными липопротеидами[8ака1 et al., 1994]. ЛФХ индуцировал экспрессию генов ростовых факторов, вовлеченных в атерогенез и воспалительные процессы, в эндотелиальных клетках [Kita et al., 1997, Zhu ey al., 1997, Chai et al., 1996]. Он мог регулировать экспрессию на поверхности эндотелиальных клеток молекул адгезии, ответственных за хемотаксис мононуклеарных лимфоцитов в артериальную интиму [Kume et al., 1992]. ЛФХ также проявлял вазоактивные свойства, модулируя эндотелий- зависимую артериальную релаксацию и нарушая эндотелий-регулируемый вазомоторный контроль [Kugiyama et al., 1990, Murohara et al., 1994, Freeman et al., 1996]. Этот фосфолипид мог влиять на агрегацию тромбоцитов.

Все найденные свойства ЛФХ, по-видимому, должны иметь сходный механизм. Мембрано-модулирующие свойства ЛФХ известны довно [Weltzien, 1979]. При концентрациях около 100 мкМ он оказывает цитолитический эффект, проявляя детергентные свойства В то же время в концентрациях 1-10 мкМ ЛФХ способен проявлять специфическое

воздействие на многие процессы с выраженной гормональной регуляцией; описанные выше.

ЛФХ образуется в клетках при активации цитозольной гормонрегулируемой фосфолипазы А2 наряду со свободными жирными кислотами [Ansell, 1982]. В то время как последние являются потенциальными вторичными посредниками и предшественниками эйкозаноидов, роль ЛФХ в клеточной физиологии остается неясной. В работах последних лет авторы все чаще рискуют присоединить ЛФХ к числу липидных вторичных посредников в передаче внутриклеточных сигналов через активацию клеточной фосфолипазы Аг [Yuan et al., 1996, Flavahan et al., 1993, Kugiyama et al., 1992]/

Недавно было установлено, что с ЛНП также связана одна из форм фосфолипазы Аг, которая, как полагают, несет протективную функцию -расщепляет фосфолипиды с окисленными жирными кислотами. Благодаря ее активности в окисленных ЛНП снижается концентрация перекисных соединений и уменьшается цитолитический эффект [Tew et al., 1996].

Таким образом, в настоящее время можно поставить два основных вопроса в изучении физиологической и патофизиологической роли ЛФХ. Первый - это выяснение механизма действия низких концентраций ЛФХ на клетки, и второй - атерогенную ли роль играет ЛФХ при накоплении в ЛНП. Целью настоящего исследования было выяснения закономерностей действия ЛФХ в свободном виде и в составе ЛНП на рецептор-зависимые процессы на тромбоцитах и мембранах сердца. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить влияние ЛФХ на начальный этап холинергической передачи сигнала - связывание мускаринового антагониста хинуклидинилбензилата с мускариновым холинорецептором мембран предсердия кролика.

2. Изучить влияние ЛФХ на активацию и агрегацию тромбоцитов под влиянием АДФ, тромбина и ФАТ.

3. Выяснить влияние накопления ЛФХ в ЛНП на иммунореактивность апо-В и связывание с ЛНП-рецептором.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено изучение функции и влияния ЛФХ на пути передачи сигналов в тромбоцитах, в которых идет его активное образование. Детально изучено влияние ЛФХ на системы обмена кальция в тромбоцитах. Применен достаточно надежный прием исследования влияния ЛФХ на агонисты различного механизма действия, что позволяет с достаточной степенью уверенности отнести эффект ЛФХ к влиянию на рецсптор-О-белковый комплекс тромбоцитов. Кроме того, показано, что подобным эффектом обладают ЛНП, у которых, по сравнению с нормой, содержание ЛФХ повышено на порядок. Исследование механизмов холинолитического действия ЛФХ показало, что и в этом случае эффект проявляется на стадии образования активного рецептор-О-белкового комплекса. Это явление представляет собой интерес, так как может лежать в основе хорошо известного, но пока не объясненного феномена - нарушения эндотелий-зависимого расслабления коронарных сосудов при гиперхолестеринемии.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на симпозиуме "Липопротеиды и атеросклероз" (Санкт-Петербург, 1995) и на межлабораторном семинаре ИЭК РКНПК МЗ РФ (Москва, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка

цитируемой литературы. Работа содержит ..... страниц машинописного

текста, 16 рисунков и 2 таблицы. Список литературы включает 163 источника.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение влияпня ЛФХ па связыоапое ¡3Н]-ХНБ с мускарииовым рецептором. Связывание [3Н]-ХНБ с мускариновым рецептором проводили по методу, описанному в работе [Ratner et al., 1989]. Связанную с мембранами радиоактивность просчитывали на ß-счетчиках. Специфическое связывание определяли как разность между величиной общего и неспецифического связывания, измеренного в присутствии 10 мкМ атропина. Полученные данные анализировали с помощью компьютерных программ "Ligand" [Munson et al., 1980] и "Bioutility" [Fedosov, Version 3.0]

Измерепие [Са:+]Ш1Т в тромбоцитах проводили по ранее описанному методу [Avdonin et al., 1985]. Тромбоциты, выделенные из крови здоровых доноров инкубировали с 1 мкМ раствора фура-2/AM или/и 1 мкл 10 мкМ раствора БАФТА/АМ. 30 мин при 37°С, центрифугировали в течение 10 мин при 900 g и отмывали в буфере, содержащем 150 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 0,37 мМ NaH2P04; 1 мМ глюкоза, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 1 мМ СаС12, 1,7 мг/мл БСА, pH 7,4; 0,1 мг/мл апиразы. Содержание внутриклеточного Са*+ в тромбоцитах определяли измерением флуоресценции зонда фура-2 на спектрофотометре Hitachi 3000 (Japan) при длине волны возбуждения 340 им и длине волны испускания 500 нм при 30°С . Калибровку сигнала и расчет [Са2"1"]^ осуществляли как описано ранее [Conrad et al., 1986, Grynkiewicz et al., 1985].

Измерепие агрегации тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов проводили при 37°С, используя 2-х канальный анализатор агрегации Biola Ltd (Moscow, Russia), методом оценки флуктуации оптической плотности. ЛФХ и другие фосфолипиды, фл-ЛНП и Л1Ш добавляли в кюветы за 2 мин до введения индукторов агрегации. Регистрацию и обработку

результатов проводили по методике Габбасова и coaBT.[Gabbasov et al., 1989].

Выделение липопротендов. ЛНП (d = 1,019 - 1,063 г/мл) выделяли из плазмы крови здоровых доноров методом последовательного ультрацентрифутирования в растворах NaBr различной плотности [Lindren, 1975]. Концентрацию белка ЛНП в растворе определяли по методу Лоури [Lowry et al., 1951 ].

Получение ЛНП с повышенным содержанием ЛФХ (фл-ЛНП). Фл-ЛНП получали по модифицированному методу [Aviram et al., 1992]. Раствор ЛНП (1 мг белка/мл) инкубировали с равным объемом буфера (180 мМ трис, 150 мМ NaCl, рН8.0; 3 мМ СаС12, 0.6 % БСА без жирных кислот) 10 мин при 37°С. Затем добавляли 0.25 ед/мл фосфолипазы А2 из пчелиного яда ("Sigma", США) и инкубировали 5 мин при 37°С. Липолиз останавливали добавлением раствора ЕДТА до концентрации 1.5 мМ и быстрым охлаждением до 0°С. ЛНП, обработанные фосфолипазой А2, выделяли повторным ультрацентрифугированием в растворе NaBr (d=l .09 г/мл).

Электрофорез ЛНП в агарозиом геле проводили на готовых пластинках с гелем агарозы (0,5%, Lipogel) на аппарате Paragon ("Beckman", США), как описано в работе [Austin etal., 1988].

Методом скоростной граннчион флотации определяли физические параметры фл-ЛНП. С помощью аналитической ультрацентрифуги (модель Е "Beckman", США), снабженной УФ-сканирующей оптической системой, ротор AN-G Ti, осуществляли регистрацию радиального распределения материала при длине волны 280 нм. Денситограммы регистрировали с помощью однокоординатного рекордера 110710-10005 (Houston Instruments, США). Фл-ЛНП, также как ЛНП, флотировали в растворах NaBr с плотностью 1,006- 1,17 г/мл при концентрации белка 0,01%, при 18°С. Анализ гетерогенности и определение скорости флотации проводили прямым разделением

интегральной границы флотации на отдельные компоненты без предварительного ее дифференцирования по методу описанному ранее [Morozkin et al., 1989]. Плотность частиц по фракциям оценивали графически по данным зависимости скорости флотации от плотности растворов NaBr, в которых проводили ультрацентрифугирование (1,090 и 1,170 г/мл для ЛНП и 1,006, 1,090 и 1,170 г/мл для фл-ЛНП), при данной вязкости среды. Радиус частиц дипопротеинов рассчитывали по формуле для частиц, имеющих форму шара по методу, описанному ранее [Bowen, 1970].

Спектры кругового дихроизма были получены на J-500 Спектрополяриметре ("JASCO", Япония) в интервате длин волн от 190 до 240 им с использованием разборных кварцевых гаовет с длиной оптического пути равной 0,01 см и 0,01 мм при 22°С. Концентрация белка в образцах составляла 0.8-1.5 мг/мл в 0,14 М NaCl. Молярная эллиптичность в единицах град.см2/децимоль рассчитывалась на средний молекулярный вес одного аминокислотного остатка, равный 120. Расчет содержания вторичных структур по спектрам кругового дихроизма проводили с помощью компьютерной программы "CONTIN" [Provencher, 1982].

Методом тонкослойной хроматографии определяли лшгадный состав фл-ЛНП. Для этого ЛНП и фл-ЛНП экстагировали смесыо хлороформа с метанолом (2:1 по объему) и фосфолипидный состав анализировали на готовых пластинках с силикагелем (DC, "Merck", ФРГ) по ранее описанному методу [Кейтс, 1975]. Количественное определение ЛФХ и ФХ в препаратах фл-ЛНП и ЛНП определяли как описано [Бергельсон и соавт., 1981].

Методом газо-жидкостной хроматографии определяли содержание свободных жирных кислот в фл-ЛНП. Липидный экстракт фл-ЛНП и ЛНП анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем (DC, "Merck", ФРГ) как описано [Кейтс, 1975].

Количественный анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили по методу, описанному ранее [Бергельсон и соавт., 1981], на газовом хроматографе, модель 5890 (Hewlett-Packard, США), с масс-спектрометрическим детектором, модель 5970, оборудованным капиллярной колонкой (12 м х 0.2 мм). В качестве внутреннего стандарта использовали метиловый эфир маргариновой кислоты.

Иммунофермептный анализ. Метод конкурентного иммуноферментного анализа проводили, как описано в работе [Valentinova et ai., 1994]. Были использовали моноклональные антитела к различным эпитопам апо-В: 2G8 - узнающее участок апо-В между 37284306 аминокислотами, 4С11 - 2377-2658 и 1D1 - 1297-3249. . Статистическая обработка была проведена "GraphPad Instat Version 1.12а".

Связывание JHffl с ЛНП-рецепторомом проводили как описано в работе [Tsibulsky et al., 1997]. В стандартных 96-луночных полистирольных планшетах с иммобилизованным ЛНП-рецептором определяли количество ЛИП, связывавшихся ЛНП-рецептором при различных концентрациях ЛНП в растворе. Для регистрации связанных липопротеинов использовали меченные пероксидазой поликлональные антитела к апо-В человека. В качестве меры количества связанных ЛНП использовали пероксидазную активность связанных анти-апо-В антител, выраженную в единицах оптической плотности при 490 нм (А490).

Препарат ЛФХ приготовляли в соответсвующем для каждого эксперимента буфере диспергированием в ультразвуковой водяной бане ("Finnsonic W181", Finland) при 20° С. ЛФХ (Харьковское предприятие биополимеров) был дополнительно очищен колоночной хроматографией, его гомогенность была оценена методом тонкослойной хроматографии в 3-х зроматографических системах. Жирнокислотный состав был проанализирован ГЖХ-масс-спекрометрией.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Влияние ЛФХ на начальный этап холииергпческон передачи сигнала. Ранее было показано, что ЛФХ плазмы крови в значительной степени снижает расслабляющий эффект ацетилхолина на перфорированном сердце различных животных [Турпаев, 1967; Звездина и сотр.,1978]. Ацетилхолин реализует свое действие на сердечной мышце через мускариновые рецепторы. Мы исследовали влияние ЛФХ на связывание высокоаффинного антагониста мускаринового холинорецептора [JH]-хинуклидинилбензилата ([JH]- ХНБ) с мембранами предсердия кролика. Предынкубация мембран предсердия кролика с 10 и 100 мкМ ЛФХ в течение 20 мин вызывала значительное изменение характера кривой равновесного связывния (рис. 1).

1400 -

1 1200 ■

я

а

S с 1000 ■

я 5

° -э

2 - »«О"

с U

йЦ боо-

400 ■

I 200,

и I

о "

о

[3Н]-ХНБ, нМ

Рис. 1. Влияние предынкубации ЛФХ (10 и 100 мкМ) в течение 20 мин на специфическое связывание [JH]-XHB с мембранами предсердия кролика. Мембраны предсердия кролика обрабатывали указанными концентрациями ЛФХ в течение 20 мин при 25°С, вносили [3Н]-ХНБ (0,04-2,2 нМ) и инкубировали 60 мин при 25°С. Неспецифическое связывание определяли в присутсвии 10 мкМ атропина. Специфическое связывание расчитывали, вычитая из величины общего связывания значения неспецифического связывания. Статистическую обработку данных проводили при помощи компьютерных программ "Ligand" и "Bio-utility", п - коэффициент Хилла

100 мкМ ЛФХ 11 = 7.5

10 мкМ ЛФХ

п = 4.9 контроль

П = 1

0.5

1.5

Оценка соответствия наших экспериментальных данных теоретической модели, включающей уравнение Хилла, показала, что под влиянием ЛФХ происходит скорее всего образование больших олигомерных комплексов мускаринового холинорецептора, способных проявлять положительную кооперативность. Кооперативность мускаринового холинорецептора для агонистов является необходимым условием нормального функционирования [Chidiac et al, 1997]. Однако она никогда не наблюдалась ранее для антагонистов. В проявлении кооперативное™ мускаринового холинорецептора подчеркивается особая роль G-белков [Green et al., 1997]. Поэтому мы предположили, что ЛФХ влияет на образование или стабилизацию одного из 3-х комплексов мускаринового рецептора с G-белком, которые характеризуются различной аффинностью. Благодаря воздействию ЛФХ нам удалось зарегистрировать гетерогенность аффинности даже для антагониста мускаринового рецептора. Иными словами, ЛФХ, вероятно, влияет на сопряжение мускаринового холинорецептора с G-белком.

Влияние ЛФХ на рецептор-зависимый подъем уровня [Са^щл в тромбоцитах. Нельзя было исключить, что ЛФХ влияет и на другие G-белок сопряженные рецепторы. Для проверки нашего предположения мы исследовали влияние ЛФХ на рецептор-зависимый подъем уровня [Са2*]^ в тромбоцитах под влиянием АДФ, тромбина и ФАТ, рецепторы которых сопряжены с различными G-белками. Тромбоциты нагружали флуоресцентным зондом фура-2 и кальциевым хелатором БАФТА для создания буферной емкости для Са2+. Оказалось, что инкубация тромбоцитов с ЛФХ (1-10 мкМ) в течение 2 мин почти полностью подавляла увеличение [Са^щп-, вызываемого этими индуктарами (рис. 2). Концентрация ЛФХ, при которой наблюдалось полумаксимальное ингибирование, составляла 4 мкМ.

« и

400 300

200 150

100

АДФ,

АДФ

ЛФХ

№

И*

тромбин

тромбин

ЛФХ

400 Е 300'

-I 200

О»

& 150 100

ФАТ

ФАТ

ЛФХ

И* • ^

щ

Рис. 2. Влияние ЛФХ (10 мкМ) на увеличение [Са 2+]щгг в тромбоцитах, вызванное АДФ (1 мкМ, а), тромбином (0,1 ед/мл, б) и ФАТ (0,02 мкМ, в). Тромбоциты (5 х 107 кл/мл) суспендировали в бескальциевом буфере Тироде. За 1 мин до эксперимента в суспензию вводили СаС12 до концентрации 1 мМ. Тромбоциты инкубировали с ЛФХ 2 мин при 30°С и добавляли АДФ, тромбин или ФАТ. Приведены данные одного типичного из 4 экспериментов, проведенных на тромбоцитах различных доноров. Стрелками указан момент введения вещества

Зависимость иигибирующего действия ЛФХ от структуры фосфолипида. Фосфатидилхолин - метаболический предшественник ЛФХ, арахидоновая кислота, которая также отщепляется от фосфатидилхолина при липолизе фосфолипазой А2, и лизофосфатидилэтаноламин не оказывали никакого воздействия на АДФ-активируемое увеличение [Са21"]^ в тромбоцитах и не влияли на ингибирующее действие ЛФХ (рис. 3).

а

б

100

АДФ|

I 1 аде

арахмдоноаая

КИСЛОТ! I

арахмдоноаая

КИСЛОТ! I

I

Рис. 3. Влияние ФХ (800 мкМ, а) и арахидоновой кислоты (40 мкМ, б) на увеличение [Са2*]^ в тромбоцитах, вызванное АДФ (1 мкМ). Условия приведены в подписи рис. 2. Представлены данные одного типичного из 4 экспериментов, проведенных на тромбоцитах различных доноров

Таким образом, для проявления ингибирующего эффекта, по-видимому, важно отсутствие жирнокислотного остатка во 2 положении, а также наличие остатка холина в гидрофильной части молекулы фосфолипида.

Влияние ЛФХ на мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо. Известно, что ФАТ, АДФ и тромбин реализуют свое агрегационное действие на тромбоциты через активацию фосфоинозитидного обмена, в результате чего резко возрастает внутриклеточная концентрация Са2+, причем это повышение осуществляется как за счет его входа снаружи, так и высвобождения из внутренних депо [Авдонин и соавт., 1994]. Мобилизацию Са2+ из депо эндоплазматического ретикулума определяли на тромбоцитах, нагруженных одним зондом фура-2/АМ без введения кальциевого хелатора БАФТА/АМ. На рис. 4 представлены результаты эксперимента, которые показывают, что в бескальциевой среде ингибирующее влияние ЛФХ (5 мкМ) на АДФ-зависимое повышение [Са2+]щгг сохраняется и сответствует эффекту тех же концентраций ЛФХ в среде с 1 мМ СаСЬ.

800 | 600

" 400

л

и

— 200 Ь

100

+ Са2+

АДФ

ЛФХ

800 600 2 400

я 200

и

100

- Са2+

ш

Рнс.4. Влияние ЛФХ (5мкМ) на АДФ-индунируемую (1 мкМ) мобилизацию [Са2^^ в тромбоцитах в среде, содержащей СаС12 (1 мМ) (а), и в бескальциевой среде (б). Условия приведены в подписи к рис. 2. Чтобы удалить Са2+, в инкубационную среду добавляли ЭГТА до конечной концентрации 1 мМ. Представлены данные одного типичного из 3 экспериментов с тромбоцитами различных доноров

Аналогичные результаты были получены для тромбина (данные не показаны). Эти данные свидетельствуют о том, что ЛФХ влияет как на гормонзависимый вход Са2+ я клетки, так и на гормонзависимое высвобождение Са2+ из внутриклетоных депо. Учитывая короткое время, необходимое для развития эффектов ЛФХ (1,5 - 2 мин), можно предположить, что ЛФХ оказывает свое влияние на белки плазматической

мембраны. С другой стороны, нельзя было исключить того, что ЛФХ

нарушает обмен Са2+ в тромбоцитах, связываясь с кальциевыми каналами

мембраны эндоплазматического ретикулума. Последнее предположение

было проверено на фура-2-нагруженных тромбоцитах, инкубированных со

специфическим ингибитором Са2^-АТФазы эндоплазматического

ретикулума - тапсигаргином (ТГ), который вызывает пассивный выход Ca2f

из внутриклеточных депо в цитоплазму. Оказалось, что ЛФХ не подавляет

полностью, но существенно снижает эффект ТГ в среде, содержащей Са2+

(рис.5 а, в) и лишь в незначительной степени - в бескальциевой среде (рис.5

б, г). Известно, что при действии ТГ происходит выброс Са2+ из

2+

внутриклеточных депо и по мере их опустошения активируется вход Са из внеклеточной среды [Putney, 1986]. Данные, приведенные на рис. 5, показывают, что ЛФХ подавляет именно вход Са2+ из внеклеточной среды.

+ Са3+ - Са2+

800 600400-

200-

Д 1001.

40С - ЛФХ

200-

10С-

тг

ТГ

I ЛФХ j

i >*** I V**

Рис. 5. Влияние ЛФХ (10 мкМ) на увеличение [Са ]шгг в тромбоцитах, вызванное ТГ (0,2 мкМ), в среде, содержащей 1 мМ СаСЬ (а,в) и в бескальциевой среде (б,г). Условия приведены в подписи к рис.2 и рис. 4.

Влияние ЛФХ на агрегацию тромбоцитов. Агрегация тромбоцитов, вызванная индукторами агрегации, прямо зависит от повышения [Са2"1"]^ [Авдонин и соав., 1994]. Следовало ожидать поэтому, что ЛФХ будет препятствовать этому процессу. Как свидетельствуют данные рис. 6 ЛФХ в концентрации 20 мкМ не вызывал агрегацию тромбоцитов, но полностью подавляли агрегацию , вызываемую АДФ и ФАТ.

1 -4>АТ + ЛФХ 2 -ЧЧТ

ФАТ ЛФХ

1

-1--

13315в7»9 мня

Рис. 6. Блокирование ЛФХ (20 мкМ) агрегации тромбоцитов, вызванной АДФ (2 мкМ,а) и ФАТ (0,5 мкМ, б). Представлены данные одного типичного из 4 экспериментов, проведенных на тромбоцитах различных доноров

Как показано на рис. 7 а, ЛФХ лишь замедлял, но не ингибировал агрегацию тромбоцитов, вызванную ТГ. Данные этого эксперимента находятся в соответствии с результатами, представленными на рис. 5, и подтверждают предположение о влиянии ЛФХ только на плазматическую мембрану. Задержка в ответе на ТГ в присутствии ЛФХ может объясняться ингибируюшим действием ЛФХ на вход Са2+ в клетки и блокированием тем самым триггерного механизма, лежащего в основе индукции агрегации тромбоцитов, вызываемой ТГ.

12 3 4 5 в 7 в

МИН

12 34 387 а

Рис. 7. Влияние ЛФХ (20 мкМ) на агрегацию тромбоцитов, вызванную ТГ (1 мкМ) и ФМА (0,1 мкМ). Представлены данные одного типичного из 4 экспериментов, проведенных на тромбоцитах различных доноров

Если агрегация тромбоцитов была индуцирована ФМА, который осуществляет свой эффект по механизму, несвязанному с активацией мембранных рецепторов, то предварительная инкубация клеток с 20мкМ ЛФХ вызывала лишь кратковременную задержку в ответе на ФМА, не устраняя агрегации под его влиянием (рис. 7 б). Полученные данные позволили высказать предположение, что ингибирующее влияние ЛФХ на гормон-зависимое повышение [Са2^]цит в тромбоцитах реализуется путем действия либо на сам кальциевый канал, либо путем разобщения рецепторов с О-белками.

Получение ЛНП с повышенным содержанием ЛФХ. К настоящему времени считается установленным факт, что ЛФХ накапливается в ЛНП при их окислении. Окисленные ЛНП обладают рядом атерогенных эффектов, которые в некоторых случаях подобны эффектам ЛНП на клетки и ткана. Естественно было проверить, сохраняется ли влияние ЛФХ в тех случаях, когда он входит в состав ЛНП. Для этого необходимо было получить ЛНП, содержащие ЛФХ, но минимально отличающиеся от нативных. Мы разработали условия кратковременной обработки ЛНП фосфолипазой А2 из

пчелиного яда, при которых только половина исходного фосфатидилхолина была превращена в лизоформу (табл. 1). Такие ЛНП (фл-ЛНП) сохраняли степень гетерогенности, обладали флотационными свойствами, молекулярной массой и радиусом, практически не отличающимися от нативных ЛНП. Заряд фл-ЛНП был близок к заряду нативных ЛНП. Анализ спектров кругового дихроизма не выявил изменений в структуре апо-В.

Таблица 1. Изменение содержания некоторых липидных компонентов в ЛНП после обработки фосфолипазой А2

Классы ЛНП фл-ЛНП

липидов мкм/мг белка

ФХ* 0.780 ±0.056 0.380 ±0.018

ЛФХ* 0.024 ±0.005 0.340 ±0.014

Свободные жирные

кислоты** 0.067 ±0.007 0.122 ± 0.012

ФХ + ЛФХ 0.800 ±0.056 0.720 ± 0.023

ЛФХ/ФХ 0.03 0.89

* приведены значения средних величин с их ошибками (п= 8) ** приведены значения средних величин с их ошибками (п=3)

Влияние обработки фосфолипазой А2 па иммунореактивность апобелка В100 в ЛНП. Для оценки изменений, вносимых обработкой фосфолипазой А2, было проведено изучение иммунореактивности фл-ЛНП к 3 моноклональным антителам, полученным к различным эпитопам апо-В100 в ЛНП [Уа1еп1то\'а еГ а1., 1994]. Как показано на рис.8 б., для антитела 2С8 к С-концевому участку апо-В 100 (интервал 3728-4306 аминокислот), не наблюдалось изменений связывания с фл-ЛНП. Константа сродства для ЛНП составляла 2,1хЮ"10 ± 0.07 М, а для фл-ЛНП - 2,4хЮ~10 ± 0.09 М.

Рис. 8. Конкурентный иммуноферментный анализ связывния ЛНП и фл-ЛНП с моноклональными антителами Ш1 (а), 2й8 (б) и 4С11 (в). 96-луночные планшеты покрывали ЛНП (20 мг/мл), блокировали 1% БСА, затем инкубировали с моноклональными антителами (0,53 х Ю-9 М), предварительно проинкубированными с различными концентрациями ЛНП или фл-ЛНП в качестве конкурента. Концентрация антител была выбрана как средняя точка кривой концентрационной зависимости связывания ЛНП-покрытых планшетов с моноклональными антителами. В качестве диагностических антител использовали козьи антитела против мыши, коньюгированные с пероксидазой. А и А0 - оптическая плотность в присутствии и отсутствии конкурента

Антитело 1D1 к большому центральному фрагменту апо-ВЮО (интервал 1297-3249 аминокислот) показало небольшое повышение иммунореактивности фл-ЛНП. Константы сродства ЛНП и фл-ЛНП к этому моноклональному антителу были близки: 11,3 и 12,8 M х IO'10 , соответственно (рис.8 а). Заметное различие в иммунореактивности ( примерно в 2 раза) фл-ЛНП наблюдалось для моноклонального тела 4С11, узнающего участок апо-В в относительной близости от рецепторного сай га (интервал аминокислот 2377-2658) ( рис. 8 в). Повышение экспрессии этого фрагмента апо-В считается показателем окисленности ЛНП [Valentinova et al., 1994]. Полученных нами экспериментальные данные свидетельствуют о более слабой экспонированности эпитопа 4С11 на поверхности обработанных фосфолипазой Аг, чем на нативных. Константа сродства антитела 4С11 к фл-ЛНП была почти в 2 раза ниже, чем к ЛНП ( 2,2 + 0,05 M хЮ"10и 4,0 ± 0,06 M хЮ"10соответственно).

Связывание фл-ЛНП с иммобилизованным ЛНП-ренептором.

Известно, что окисленные ЛНП утрачивают способность связываться с ЛНП-рецептором клеток. Мы исследовали способность фл-ЛНП связываться с иммобилизованным на полистерольной поверхности ЛНП-рецептором, выделенным из мембран надпочечников быка [Tsibulsky et al., 1997]. Данные рис.9 а, б показывают повышение специфического связывания фл-ЛНП с иммобилизованным рецептором.. Кд комплекса фл-ЛНП-рецептор почти в 2 раза ниже (1.47 ± 0.188 M х 10"и) Кл комплекса ЛНП-рецептор (2.8 ± 0.5 M х 10"п). Таким образом, на основании полученных данных можно утверждать, что превращение половины фосфатидилхолина ЛНП в лизоформу приводит к образованию липид-белковых частиц, значительно меньше отличающихся от окисленных ЛНП, и вызывает изменения, прямо противоположные наблюдаемым при окислении.

|

< 0,6

0.4

0,8

а.г

1,0

о

о

ю го зо *о [ЛШ1], мкг 1 мл

О 0.02 О.М 0.0® О.Ов 0.1 0.13 о.н

А „о / 1ЛПЩ

Рис. 9. Связывание ЛНП и фл-ЛНП с иммобилизованным ЛНП-рецептором (а), анализ связывания в координатах Скэтчарда (б). Для регистрации связывания использовали поликлональные антитела к апо-ВЮО человека, меченные пероксидазой. А490 - оптическая плотность

Влияние фл-ЛИП на рецептор-зависимую ашгивацию тромбоцитов.

Инкубация тромбоцитов с фл-ЛНП в течение 2 мин дозо-зависимым образом ингибировала увеличение [Са2+]шгг, вызываемое АДФ (рис. 10).

Эффекты фл-ЛНП (6 - 30 мкг белка/мл, 2-10 мкМ ЛФХ) и ЛФХ были подобны, проявлялись при близких концентрациях ЛФХ, если количество добавляемых фл-ЛНП нормировать на содержащийся в них ЛФХ. Концентрации ЛФХ, при которых наблюдалось полумаксималыюе ингибирование, близки для фл-ЛИП и ЛФХ и составляли 2 - 4 мкМ. Нативные ЛНП при концентрации 0,2 - 2 мг белка/мл не оказывали ингибирующего действия на подъем [Са21]^ под влиянием АДФ. Блокирующий эффект фл-ЛНП на АДФ индуцируемое увеличение [Са2+]1ИТ зависел от времени предынкубации с тромбоцитами. В полной мере эффект

200

я

и

150

" АДФ

АДФ

I

и мкМ

ЛФХ

[К К У* 1

"' у

ЛФХ

5 меМ ЛФХ

7.5 мкМ ЛФХ

ЮчкМ

ЛФХ

Рпс. 5. Зависимость иигибирования увеличения [Са2+]1[ИТ в тромоопитах, вызванного АДФ (2 мкМ), от концентрации фл-ЛНП (6-30 мкг белка/мл, 210 мкМ ЛФХ) . Тромбоциты (5 х 10 кл/мл) суспендировали в бескатьциевом буфере Тироде. За 1 мин до эксперимента в суспензию вводили СаСЬ до концентрации 1 мМ. Тромбоциты инкубировали сфл-ЛНП 2 мин при 30°С и добавляли АДФ. Приведены данные одного типичного из 4 экспериментов, проведенных на тромбоцитах различных доноров. Стрелками указан момент введения вещества

проявлялось после 4-х минутной предынкубации и более не изменялось при продлении предынкубации до 10-15 мин. Такой характер зависимости ингибируюшего эффекта от времени предынкубации, по-видимому, связан с обменом ЛФХ между фл-ЛНП и плазматической мембраной и встраиванием ЛФХ в последнюю [\Veltzien, 1979; Ве51егтпап е1 а1., 1992]. Как свидетельствуют данные рис. 12, фл-ЛНП (20 мкМ ЛФХ, 59 мкг белка/мл) полностью подавляли агрегацию тромбоцитов, вызванную АДФ. Нативные ЛНП в концентрации в 25 раз большей, чем действующая концентрация фл-ЛНП, наоборот, стимулировали АДФ-зависимую агрегацию. Блокирующий эффект фл-ЛНП сохранялся на ФАТ- и тромбин-индуцируемую агрегацию. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что ЛФХ, находясь в составе ЛНП, сохраняет свои эффекты.

Рис. 11. Блокирование фл-ЛНП (20 мкМ ЛФХ, 59 мкг белка/мл,) агрегации тромбоцитов, вызванной АДФ (2 мкМ). Представлены данные одного типичного из 4-5 экспериментов, проведенных на тромбоцитах различных доноров

ВЫВОДЫ:

1. Обработка мембран предсердия кролика лизофосфатидилхолином приводила к появлению множественности мест связывания на мускариновом холинорецепторе, что можно объяснить либо формированием его олигомерных комплексов, либо влиянием на его сопряжение с С-белками.

2. Предобработка тромбоцитов лизофосфатидилхолином подавляла рецептор-зависимое повышение [Са2+]1ИТ и препятствовала агрегации тромбоцитов, вызываемых АДФ, ФАТ и тромбином.

3. Кратковременная обработка ЛНП фосфолипазой А2 позволила получить липид-апо-В-частицы (фл-ЛНП), в которых половина фосфатидилхолина была превращена в лизофосфатидилхолин. фл-ЛНП по флотационной гетерогенности, заряду и составу липидов отличались от ЛНП в

значительно в меньшей степени, чем окисленные или подвергнутые длительной обработке фосфолипазой А2.

4. апо-В в фл-ЛНП сохранял неизменную иммунореактивность к моноклональным антителам против С-концсвого и большого центрального фрагментов апо-В в ЛНП. Моноклональные антитела к участку апо-В, сродство к которому повышается в зависимости от степени окисленности, наоборот, связывались с фл-ЛНП в два раза слабее.

5. фл-ЛНП имели более высокое сродство к иммобилизованному ЛНП-рецептору из надпочесников быка, чем нативные ЛНП.

6. фл-ЛНП, также как лизофосфатидилхолин, блокировали гормон-зависимое повышение [Са2^^ и агрегацию тромбоцитов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Суслова И.В., Коротаева A.A., Проказова Н.В. Изменение параметров равновесного связывания [3Н]-хинуклидинилбензилата на мембранах предсердия кролика под действием лизофосфатидилхолина. ДАН 1995; 342: 273-276.

2. Коротаева A.A., Чеглаков И.Б, Морозкин А.Д., Суслова И.В., Проказова Н.В. Влияние лизофосфатидилхолина на структуру и функцию липопротеинов низкой плотности. Биологии.мембраны 1996; 5: 484-496.

3. Korotaeva A.A., Cheglakov I.B., Prokazova N.V. Inhibitory effect of lysophosphatidylcholine and phospholipase A2-treated low density lipoproteins on receptor-dependent regulation of [Ca2+]; in platelets. Platelets 1997; 8: 43-51.

4. Проказова H.B.. Звездина Н.Д.. Коротаева A.A. Влияние лизофосфатидилхолина на передачу трансмембранног сигнала внутрь клетки. Биохимия 1998; 1: 38-46.

5. Коротаева A.A., Голованова Н.К., Власик Т.Н., Янушевская Е.В., Цибульский В.П., Якушкин В.В,, Творогова М.Г., Морозкин А.Д., Проказова Н.В. Иммунореактивность апобелка В-100 и связывание с ЛНП-рецептором липопротеинов низкой плотности, обработанных фосфолипазой А2. Физиол. Журнал им. И.М.Сеченова 1998 (принято к печати):

6. Проказова Н.В., Звездина Н.Д., Суслова И.В, Коротаева A.A., Турпаев Т.М. Влияние лизофосфатидилхолина на чувствительность сердечной мышцы к ацетилхолину и параметры связывания хинуклидинилбензилата с мембранами миокарда. Биохимия 1998 (принято к печати).