Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние аденозина на рецептор-опосредованную регуляцию функциональной активности тромбоцитов человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние аденозина на рецептор-опосредованную регуляцию функциональной активности тромбоцитов человека"

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ ^ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ

им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

СХОЛЛЬ-ЭНГБЕРТС Андрей Дмитриевич

влияние аденозина на рецептор-опосредованную регуляцию функциональной активности тромбоцитов человека

03.00.04 — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1992

Работа выполнена в лаборатории биохимии системы кровообращения Ленинградского НИИ кардиологии МЗ РСФСР.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Гуревич В. С.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Маслова М. Нм доктор медицинских наук, профессор Долго-Сабуров В. Б.

Ведущая организация: Институт Мозга Человека РАН.

Защита диссертации состоится " ¡7—1992 г.

в часов на заседании специализированного совета

К.002Г89.01. Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан „ _ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

ЗУЕВА Л. В.

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Кзучеггае молокулярннх механизмов регуляции функциональной активности тромбоцитов человека является одной из наиболее актуальных задач современной теоретической и прикладной биохимии. Это утверждение основывается па следующих обстоятельствах: во-первых, кровяные пластинки - это полифункциональная возбудимая клеточная популяция крови, ответственная за обеспечение процессов гемостаза, депонирование и транспорт биологически активных соединений, осуществление защитных реакций организма (влючая иммунный и воспалительный процессы); во-вторых, нарушения в деятельности систем регуляции тром-боцитарной активности являются одной из основных и непосредственных причин возникновения и прогрессировали разнообразных патологических состояний, среда которых, в первую очередь, следует выделить заболевания сердечно-сосудистого профиля, кзк наиболее опасные для здоровья и жизни людей; и, наконец, к настоящему моменту установлено, что состояние некоторых рецэптор-ных популяций тромбоцитов коррелирует с состоянием аналогичных структур в ряде других, главным образом секреторных тканей, таких как эндокринные железы, пресинаптические мембраны центральной нервной системы, а это, наряду с относительной легко-достушостъю кровяных пластинок, превращает их в удобную и адекватную биологическую модель, особенно необходимую при изучении средств фармакологической коррекции аномалышх состояний систем регуляции клеточной активности.

К настоящему моменту на клеточной поверхности тромбоцитба человека выявлено сколо тридцати типов участков рецептсриого связывания биологически активных соединений разнообразной хими-

ческой природа. 'Фармакологические исследования с использованием структурных аналогов эндогенных рецепторшх лигандов позволили обнаружить значительное количество тромбоцитоактивньх соединений, среди которых наиболее известными являются производные иатехоламинов, аденозина, тромбоксанв и простацшслина. Эксперименты, проведенные с 'применением этих препаратов, существенно уточнили функциональную значимость некоторых рецепторпых популяций и создали предпосылки для дальнейшего, более целенаправленного поиска соединений, способных эффективно корректировать функциональную активность тромбоцитов. Вместе с тем, на данный момент достаточно отчетливо установлены лишь наиболее,общие мо- ' менты деятельности механизмов регуляции тромбоцитзрной активности, тогда как подробности процессов "тонкой настройки" кровяных пластинок остаются неясными.

Таким образом, необходимость дальнейшего изучения организации' и функционирования рецепторного аппарата и связанных с ним . трансмиг-смоннх систем тромбоцитов' определяется существенностью роли, которую они играют в обеспечении нормальной жязпедеятельности организма, их вовлеченностью в возникновение и развитие ряда патологических состояний, а также возможностью использования кровяных пластинок в качестве доступной л адекватной биологической модели некоторых функционально важных, но труднодос.-тушшх тканей.

Адэнозин - эндогенный биологически активный нуклеозид, облада ющий очень широк™ спектром воздействия на различные ткани организм;] . Например, в кардио-васкулярной системе, это вещество является отрицательным модулятором силы сокращений сердца при гипер-

рютропии, гуморальным модулятором при ишемии, эффективным вазо-вллататором, супрессором синтеза сушроксид-радикалов, повреждающее эндотелиальную выстилку сосудов, стимулятором хемотаксиса ней-ррофияов,. отрицательным модулятором проведения нервного импульса. Громе того, яденозин является одним из двух, известных в настоящее время зндогешшх супрессоров активации тромбоцитов. Однако, рецепторы аденозина тромбоцитов человека изучены крайне слабо. Попытки охарактеризовать ати структуры при помощи синтетических лигандов к успеху не привели. Не известны также внутриклеточные механизмы, эпосредуемые рецепторами аденозина и влияние нуклеозида на один та эсновных путей активации тромбоцитов - распад фосфатидилинозмтолов. Не предпринималось попыток исследования влияния аденозина на проте-иякиназу С (РКС) - фермент, который акт!Ш1фуется при воздействии на кровяные пластинки большинства индукторов агрегации. К настоящему времени тщательнее других изучено влияние аденозина на агрегации тромбоцитов, однако механизм антиагрегантного действия нуклеозида во многом остается неясным.

Исследование рецепторов аденозина тромбоцитов человека и механизмов его влияния на активированные кровяные пластинки проводятся в рамках плановой темы НИР Ленинградского НИИ кардиологии N 014 "Разработать индивидуализированные патогенетические методы профилактики дестабилизации хронических форм ИБС, предупреждение развития инфаркта и основных его течений."(Гос.регистрация .»Ю1900024522 от 15.06.90). ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью настоящей работы являлось изучение ряда характеристик рецепторов аденозина тромбоцитов человека, структуры этих рецепторов и рецептор-опосредованного влияния аденозина на фосфоршшрование ряда внутриклеточных белков.

задействованных в процессе активации тромбоцитов. В конкретные задачи исследования входило:

1. Изучение рецепторов аденозина тромбоцитов человека при помощи эндогенного лиганда и сравнение полученных кинетических характеристик адопозиксвязышшгдо структур с таковыми, полученными при использовании синтетического лиганда 5'-и~атилкарбоксамидоаденозина (Ш5СА).

2. Кзученио влияния двухвалентных катионов и ряда биологичвмси-активннх веществ, и частности специфических антагонистов аденозина, на параметры специфического связывания эндогенного и синтетического ллгешдов с мембрана.™ тромбоцитов человека.

3. Выделение, частичная очистка и определение молекулярных масс аденозиновых рецепторов тромбоцитов человека.

4. Изучепио влияния аденозина на транслокацию РКС, опосредованную различными механизмами.

5. Исследование воздействия аденозина на фосфорллирование белков тромбоцитов человека, вызванное различными индукторами.

6. Сравнение воздействия аденозина на агрегацию тромбоцитов, индуцированную прямыми активаторами РКС и активаторами фосфолшазы С. НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведенных исследований на наружной поверхности мембраны тромбоцитов обнаружены два типа участков связывания аденозина. Характеристики одного из участков связывания притщипиально совпадают с характеристиками ранее описанного сайта связывания икса. Другой участок связывания ранее не был характеризован с помощью синтетических или эндогенного лиганда и описывается впервые.

Впервые осуществлена частичная очистка и определены молекулярные массы аденозиновых рецепторов тромбоцитов человека.

Впервые изучено влияние аденозина на транслокацию РКС, индуцированную двумя независимыми путями. Установлено, что нуклеозид не воздействует на транслокацшэ фермента, вызванную его непосредственным активатором, ко предотвращает траяслокацию РКС, стимулированную распадом фосфатидшпшозитолдафосфатя.

Впервые изучено воздействие аденозина на фосфорилировэние белков тромбоцитов, вызванное, как непосредственой активацией РКС, так и активацией этого фермента вследствии распада фосфатидшшнозитол-дифосфате. В соответствии с полученными результатами аденозин не влияет непосредственно на активность РКС, а блокирует каскад фосфа-тидилинозитолов.

Впервые.изучено воздействие аденозина на агрегации тромбоцитов, вызванную форболовым эфиром. Нуклеозид существенно тормозит и частично блокирует форбол-индуцированную агрегацию тромбоцитов. научно-практическое значение полученных результатов. Полученные результаты свидетельствуют о наличии на наружной мембране тромбоцитов человека двух участков високоаффшшого связывания [Зн]аденозина, различаюицссся по своим кинетическим характеристикам. Выполненные эксперименты позволяют предположить, что оба исследоватшх сайта имеют рецэпторную природу. Также показано, что использование для изучения рецепторов адвнозинв тромбоцитов человека синтетического лиганда [3Я№са нецелесообразно, т.к. доминирующий участок связывания этого лиганда, имеющий нзрецепторную природу, отличается от аденозинового рецептора но кинетическим и фармакологическим характеристикам. Эксперименты, проведенные на интактных кровяных пластинках показали, что аденозин, вероятно, предотвращает активацию тромбоцитов, блокируя каскад фосфатвдалинозитолов. Эти результаты опре-

деллют высокую практическую значимость полученных данных, поскольку позволяют вести целенаправленный поиск новых тромбоцитоактившх соединений среди стабильных структурных аналогов аденозина, обладающих способностью модулировать скорость метаболизма фосфатидилинозитолов. СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 129 страницах и состоит из введения, обзора литературы (главы 1-6), материалов и методов исследования (глава 7), собственных исследований (главы 8-II), обсуждения результатов (главы 12-13) и выводов. Работа иллюстрирована 31 рисунком и содержит 10 таблиц. Список литературы содержит 267 названий работ на русском и иностранных языках. ПОЛОЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫНОСЯТСЯ НА ЗАЩИТУ.

1. На поверхности тромбоцитов человека обнаружено два участка связывания аденозина, имеющие рецепторную природу.

2. Один из рецепторов описан впервые и отличается от участков связывания, выявляшшх при помощи синтетического лигавда. Молекулярные массы лиганд-связывагащих участков рецепторов аденозина тромбоцитов человека равны 13,5 и 56 kD.

3. Аденозин не влияет на базовую активность РКС ,но предотвращает транс-локацию и активацию фермента, вызванную распадом фосфатидил-гоюзитолдафосфата, не влияя на транслокацию, вызванную форболовым эфиром.

4. Аденозин не влияет на фосфорнлирование белков тромбоцитов, стимулированное непосредственными активаторами РКС, но подавляет фос-форилирование белков, индуцированное распадом фосфатидашшозитолди-

фосфата.

йиТюсфхлрилироваше основного субстрата РКС тромбоцитов - плекст-рлня не являотся необходимым звеном агрогационного каскада; 'плекс-

трин не относится к семейству эндогенных ингибиторов фосфолилазы А2 - лигюкортинов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Апробация состоялась 14 июня 19Э1 года на научном заседании проблемной комисии Ленинградского НИИ кардиологии (Директор института член-корреспондент АМН СССР, профессор В.А. Алмазов). ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явились тромбоциты человека, полученные из венозной донорской крови методом дифференциального центрифугирования с использованием в качестве антикоагулянга 3,8% раствора цитрата, натрия.

Для радаолигандных исследований мембранную фракцию тромбоцитов получали гель-фильтрацией гомогената кровяных пластинок на Sepharoae съ 6В (Гуревич и др.,1990).

Бри проведении радиолигандных экспериментов мембраны тромбоцитов инкубировали с [3н]аденозином (конечная концентрация 25-6000 пЫ) или [3H]NECA (конечная концентрация ю-6000 rjí) в TRIS-HCI буфере (50 шм, рН 7,35). Для определения величины неспецяфического связывания в инкубационную смесь вводили немечешшй лиганд в 1000-кратном избытке или .'специфический антагонист аденозшовых рецепторов теофилдин. Реакцию инициировали добавлением радиоактивного лиганда. Эффекторы вводили в инкубационную смесь до начала реакции в объеме, не превышающем 10% от конечного объема проби. Инкубацию проводили при 37°С в точение 120 минут в случае аденозина и 40 минут при 0°С в случае ÑECA (Hutte-man et al.,1984). Объем инкубационной смеси составлял во всех экспериментах, .100 (j.1. В каждом эксперименте производили по 4 параллельных измерения специфического и неспецнфяческого связывания лнганда в каждой

точке. После окончания инкубации аликвоту, составлявшую 90% от объома пробы, переносили на фильтры "Whatman" Gi'/B, предварительно обработанные 0,1% раствором детергента (CHAPS) для уменьшения неспецифического связывания метки с материалом фильтра и фильтровали под вакуумом. Фильтры промывали 15-кратным объемом ледяного TRIS-HC1 буфера. Радиоактивность экспериментальных- проб определяли на сцштилляционяом счетчике с использованием стандартного сцинтиллятора на основе толуола.

Анализ параметров связывания проводили по методу Скэтчард (Scat-ohard, 1949).

Содержание белка в экспериментальных образцах определяли по методу Лоури (bowry et al.,1951) ИЛИ Бредфорд (Bradford, 197b)•

Аффнншй сорбент - синтезировали на основе агарозио-акриламидно-го гранулированного геля uitrogel а«А 44, который активировали гду-таровым альдегидом в соответствии с рекомендациями фярмн-производи-теля (Boshetti. ,1983). Элюцию связавшихся 'с аффинной матрицей 'белкой мембран тромбоцитов осуществляли линейным градиентом NaCI(0,0-1,5 ы) в присутствии 0,1% chaps. Изучение характеристик специфического связывания [эн]аденозина фракция,та э.шоата проводили аналогично процедуре описанной выше для мембранных препаратов тромбоцитов, однако, бор-сшшкатнш фильтры обрабатывали полиэтиленимином в соответствии 'с рекомендациями по изучению радиолигандного связывания растворимых белков (Bruna et al.,1983).

Вестерн-блоттинг белков мембран тромбоцитов вели с пластин градиентного (4-22,5%) полиакриламидного геля на нитроцеллвлозные мембраны в 20 шм фосфатном буфере, рН 8,0 в течеше трех часов при силе тока I А. Далее нитроцелладозные мембраны■переуравновешивали в OTUS-HC.I буфер, рН 7,5 и инкубировали с [3Н]аденозином в течение 2-х

часов. Контрольные треки инкубировали в присутствии тоофшигана. Мембраны высушивали, обрабатывали эвторадиографическим сщштиллятором Amplify и экспонировали при -70°С.

Транслокацш» протвинкиназы. С в тромбоцитах изучали, по • методу Пе-леха (Pelech et al., 1906).

Для изучения фосфорилировэния плвкстрина' и. легкой цепи миозина

Ч'Р

белки тромбоцитов, после создания в клетке пула радиоактивных ( Р) фосфатов и воздействия эффекторов, разделяли электрофорезом в градиентном (4,0-22,5 %} полиокриламидном геле в буферной- системе Леммли (Laemmli, >970). Зош, соответствующе подвижности; 47 kD и 20 и вырезали, солюбилизировали в 33% Включившуюся^ радиоактивность оценивали по черепковскому излучению.

Оценку функциональной активности тромбоцитов производили определяя их агрогационную активность методом Борна (Born 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

К настоящему времени было предпринято три попытки охарактеризовать аденозшювые рецепторы тромбоцитов человека методом радиолиган-дного связывания. Во всех работах использовались радиоактивные синтетические лиганды, причем в качестве агониста только [%]ШЗА. Применение этого лигаяда для решения поставлешюй задачи имеет ряд недостатков. Во-первых, исследовать связывание этого лиганда с мембранами тромбоцитов человека можно только в нефизиологическях условиях - при 0°С. Не вызывает сомнения, что физико-химические свойства мембран прк этой температуре значительно отличаются от таковых при 37°С. Во-вторых, было показано, что только один из NECA-связиваыщих участков мембран тромбоцитов человека является рецептором аденозина.а второй, на долю которого приходится около 80% всего связываемого лиганда, имеет

нерецепторную природу. Результаты, полученные при использовании синтетического ксантина. [3НЩС близки к результатам, полученным при изучении связывания MECA.

Использование в радиолигандном анализе мембранных препаратов аде-нозина имеет безусловные преимущества перед использованием синтетических лигвндов именно в силу того, что аденозин является.эндогенным лигандом. Радйолйгандные исследования с использованием Ршвденозяна и [3h]nEca позволили установить, что связывание обоих дигандов было обратимым, насыщаемым й лйне&Шм по отношения к концентрации мембранного бэлка fe пробе. Зависимость связывания лигандов от температуры было различным: удельное' связывание {^П]адонозина увеличивалось при повышений температур!! й предёЛах от 0°С До 37°С, а удельное связывание [3НШКСА в 8тих пределах было обратнопронорциональйо повышении температуры, что явлйетол характерным для этого лиганда(Hutteman et al.,1984). Анализ параметров связывания методом Boatchard позволил' установить наличие двух участков связывания вденозииа на наружной мембране тромбоцитов человека (Рис.1.А). Высокоаффинный участок связывания характеризуется Kd=159±26 пЫ и Bn)aI=620Í30 ímol/mg белка. Соответствущио характеристшси низковффигогого участка составляют: Kd=833-39 riü и Bma£=2- 0,07 pmol/mg бежа. Полученные в наших экспериментах характеристики связывания [3н]КЕСА (Рис.1.Б) мембранами тромбоцитов человека близки к описанным в литературе (Hutteman et al., 1984). Высокоаффинный сайт характеризуется Kd=i90^59 пМ и 1?п,ах= 8,8-0,09 pmol/mg белка. Такие.же характеристики низкоаффинного сайта составили: Kd=3,1-0,04>М и Втги£=09,7-0,9 prnol/mg белка.

Как видно из приведенных данных, Кд высокоаффитшх участков связывания (3Н]гшза и [Зн]адонооина на мембранах тромбоцитов человека,

полученные одинаковым методом, имеют близкие, фактически идентичные значения; однако величина В , отражающая концентрацию участков

Рис.1.Анализ параметров связывания [3Шадешзшш (А) и t h1neca (Б) мембранами тромбоцитов да методу Scatohard; по оси абсцисс -концентрация связшшого лиганда (r.fmoi/mgh по оси ординат -отношение уровня связывания лиганда к его концентрации в инкубационной среда (г/С, íraol/mg на 1 пМ).

связывания, для аденозина в 13 раз ниже, чом для ñeca. Можно предположить, что сайты обоих лигандов идентичны:■ более "стабильные" характеристики Kd совпадают, а различие в значениях "лабильной" характеристики В ,■ по нашему мнешш, может являться следствием значительного различия в температурах исследования реакции связывания, так как концентрация участков связывания твшературозависимая величина (это показано для рецепторов различных веществ белковой и небелковой природы и связывается с потоком мембран, янтернализацией и др.).

Возможно и другое предположение: neca вследствие большей гид-рофобности демаскирует аденозиновыэ рецепторы мембран тромбоцитов. Такой эффект этого вещества показан для синоптических рецепторов аденозина (Dunwiddie, Predholm, 1985). Это предположение косвенно подтверждается данными По изучению влияния NBCA на активность аде-

нилатциклазы: как активатор аденилатциклазы это вещество на порядок активнее аденозина(Haslam, Rosaon.,1975, 1981). Оптимальная температура изучения этого процесса 37°С, что говорит о том, что связывание ñeca с рецепторами на интактных клетках имеет неинвер-тировамну-ю температурную зависимость, в отличие от мембранных препаратов (см. выше). Это обстоятельство подтверкдает преимущество аденозина перед жеА в радиолигандных экспериментах, так как позволяет получать результаты и на мембранах и на интактных клетках в идентичных условиях.

Низкоаффинные участки связывания аденозина и NECA. отличаются по обеим кинетическим характеристикам. К^ аденозина в 3,5 раза ниже, <• чем Кй NE0Á, а Вшат аденозина приблизительно в 20 раз ниже концентрации участков связывания NFCA. Значительное отличие констант связывания позволяет предположить, что в этом случае лиганды связываются с сайтами разных типов. Эти данные подтверждаются влиянием Mg4^ на аФ1®ктивность связывания лигандов. Согласно литературным данным (Klotz et al., 1986), введение в инкубационную среду двухвален-чшх катионов, в особенности иона Mg+t может воздействовать на связыванш аналогов аденозина с рецепторами, причем присутствие ионов магния в инкубационной среде разнонаправленно влияет на' эффективность связывания аденозина и кеса мембранами тромбоцитов человека (Табл.1).

Концентрация в Уровень связывания в % от контроля

среде Mg++(niM) [II]NBCA [ H]аденозин

0,1 100±7 101 ±6

1,0 83-8 113^

10,0 70±6 132-8

Таете различно воздействие этого катиона на время наступления равновесия связывания лигандов с мембранами тромбоцитов: в присутствии

10 яМ щр* в инкубационной сре.\э равновесие связывапля [3и]адзкозина наступает в полтора раза быстрее, а 1^Я]КЕСА - мздлепнее, чем в отсутствии что также наводит на мысль о связывании лигандов с различными сайтами.

Фармакологический профиль (сравнительная эффективность воздействия антагонистов) показывает, что участки связывания обоих лигандов относятся к Ал, типу здекозиновых рецепторов: А^-сэлективкый антагонист 8-фонилтвофиллин гораздо эффективнее блокирует связывание лигандов, чем А-рселектавный актегошст даотрогш»!® нгаксантан. Неселективный теофиллин также блокирует связывание обоих лигендов (Табл.2). В пользу высказанного предположения свидетельствует также

и то, что оба вещества стимулирувт накопление цАШ> в тромбоцитах. Таблица 2.Воздействие антагонистов на специфическое связывание

[3Н]НЕСА и [3н]аденозина мембранам! тромбоцитов человека.

Вещество Концентрация в среде (¡¿М) Уоовоыь связнваштя в % от контроля

[3П]КЗЗСА [ЭН]«!Д6Я03Ш{

100,0 86±6 84-7

Теофшшш 1000,0 53±3 42-3

Ю000х0 6-2 ' 0

>0,1 80±б' 759-7

8-фенил-теофиллин 1,0 67-5 31-3

100х0 66±6 0

Дшропил- 100,0 94-8 5?±8

фешшссантин 1000,0 83-7 80-9

10000,0 74-7 69-7

К изложенному выше следует добавить, что свясиваяив адеаозина с ты-бранами тромбоцитов полностью блокируется конконавалияом А (лектшом, взаимодействующим С а-О-М0ННОЗИЛ-, И а-в-глшозйл-групшфовкамя) 13

концентрации 5 7/па. Это наблюдений позволяет предположить, что активный центр рецепторов адено&ина тромбоцитов человека имеет глпкопроте-идаую природу.

Дда определения молекулярной массы рецепторов аденозина в настоящей работе было использовано два подхода: частичная очистка рецепторов аденозина методой аффинной хроматографии с последующим определением их молекулярных масс и техника вэетерн-блоттинга. ВШ-але-ктрофорез аделозин-свя.зывандшс фракций очищенных аФ1&ганой хроматографией (очистка в Z 900 раз) позволяет обнаружить две белковых полосы с подвшностями, соответствущими молекулярным массам 13,6 кВ и 56 КБ. Электрофорез этих да образцов, нэ обработашшх првдваритель-но р-мерквптоэтанолом позволяет выявить еще одну полосу, соответствующую белку, с молекулярной массой 140 Ю. Белки 13,5' и 56 из в этих условиях не исчезают. Техникой блоттинга в мембранном препарате, как обработащюм, так и не обработанном восстанавливающим агентом, выявляются только две едэнозш-связывашцяо полосы, соответствующе белкам с молекулярными массами 13,5 ко и Б6 кП. На основании этих данных нам кажется возможным высказать следующие предположения. Во-первых, не исключено, что ати белки принадлежат к различным типам рецопторных молвкул и, видимо,- являются лиганд-свлзывающими субъединицами атих рецепторов. Равновероятно и другое предположение: оба выявленных белка обладают аденозин-связывающими сайтами и являются компонентами одной молекулы. Так как электрофоретическая картина не изменяется в отсутствии р-мэркаптоэтанола, видимо, эти субъединицы связаны не дисульфидными мостиками, а электростатически и легко разделяются в электрическом поле. Общая молекулярная масса этих белков составляет приблизительно 70 кв. в отсутствии восстанавливающего агента появляется дополнительная полоса - белок с молекулярной массой 140 ко. По данным блоттинга аденозин не связывается с этим белком. Весьма возможно, что 140 кВ~белок является неактивным димером рецеп-

тора аденозина тромбоцитов. Однако, против этого предположения говорит то, что при появлишл высокомолекулярной полосы низкомолекулярные ко исчезают. Все высказанные предположения равновероятны. На основании получении* в настоящей работе результатов трудно сделать более аргументированные выводы.

Как было отмечено выше, адетозин является универсальным эндогенным янтиагрегвнтом. Однако механизм воздействия нушгоозида на активации кровяных пластинок до настоящего времени не изучались. Поэтому следующей задачей настоящей работы было попытаться исследсвать воздействие аденозина на одну аз центральных систем, отвэчащих за активацию тромбоцитов: .-каскад фосфатмдалинозитолов. Известно, что в результате распада шгозитол-1,4-дифосфата образуются два вещества: инози-толтрифосфат и дяацилглицэрол (DAG), ответственные за мобилйза-

44

цшо внутриклеточного Ca и транслоквцию из цитозольной в мвмбрашю-связанпую (активную) форму Са^/фосфолипид-зависимой протеинкин'азц (РКС), соответственно. При воздействии аденозина, взятого в различных концентрациях, на нестимулированные тромбоциты человека изменений в локализации Зермеяга нам обнаружить на удалось. Большая Часть'активности обнаруживалась в цитозольной фракции, тогда как иа долю мембра-шюй фракции приходилось около 203 от общей активности фермента.Такое же соотношение активностей можно было наблюдать и в контрольных пробах, не подвергавшихся воздействию пуклеорида. Иная картина наблюдается в актявиропашшх тромбоцитах. Результаты Проведенных исследований однозначно показывают, что аденозин снижает или полностью.блокирует активации FKC. индуцированную такими стимуляторами: активности тромбоцитов, как тромбин и. коллаген. Эти естества, воздействуя на .специфические -рвцегтторы, расположенный на поверхности- кровяных пластинок, в'к-

тивирушт фосфолип&зу С, в результате чего из И1Юзитол-1,4-дафосфата

образуются пая, вызывающий транслокадшо РКО. В то же время аденозив,

даже в высокой концентрации (40 цМ) но способен предотвратить трансТаблица 3. Воздействие оденозина ца траислокацим РКС, вызванную

.....*..... Вещество Концентрация Распределение активности РКС ме:адг фракциями в %

Контроль Штозоль 81,2/84,8 мемораны 18,8/15,2

Тромбин 0,2 Ы'£Н/ш1 10,6/67,3 89,4/33,7

Коллаген 5,0 35,5/80,4 03,5/19,6

ТРА 10,0 т-/гг«1 7,1/ 6,9 92,9/93,1

локацию фермента, индуцированную форболовым эфиром 12-0-тетрадекано-илфорбол-13-ацетатом (ТРА), который непосредственно активирует фермент, не вызывая распада фосф&тидшшнозитолов (Табл.3). Таким образом, аденозта, сам не воздействуя на транслокацшо РКС, предотвращает этот аффект, индуцированный стимуляторами фосфолипазы С, но не влияет на транслокацию, вызванную непосредственным активатором РКС.

3 целях дальнейшего изучения влияния аденозина на активность РКС нами была предпринята попытка исследовать воздействие нуклео-зида на фооЗюрширование основного субстрата этого фермента - плек-стрина (белок р47). Известно, что вещества, стимулирующие каскад фосфатидштнозитолов. а также прямые активаторы РКС вызывают быстрое |}осфорилироваше этого белка. При воздействии первой группы веществ одновременно фосфоршгируется еще один белок - легкая цепь миозина (белок с молекулярной массой 20 из). В настоящей работе мы изучали влияние аденозина на фосфорилирование этих белков, вызываемое четырьмя веществами первой группы: тромбином, коллагеном, серотони-ном и нрахидоновой кислотой и двумя веществами второй группы:вндо-

гвннш активатором РКС, образумимся при гидролизе зетозятоя-1,4-д»-фосфата - даащшчицеролом и форболовым зфлром - ТРА. Кате показали эксперименты, зденозия полностью или частично предотвращает фосфорили-рование плекстрина и легкой цепи миозияп, вызванное веществами, стимулирующими инозитольный каскад. На фосфорллированиэ плекстрина, ваз-ванное воздействием на тромбоциты непосредственных активаторов РКС, аденозин не влияет. Иллюстрацией к этой серии экспериментов может являться воздействие аденозина на фосфорилирование изучаемых белков, индуцированное наиболее мощными стимуляторами тромбоцитарпой активности, активирующим! РКС различными путями - тромбином и ТРА (рис.2 А и Б, рис.3).

На основании изложенных данных, а также результатов исследования влияния аденозина на транслокацию РКС, нам представляется возможным предположить, что аденозин не способен непосредственно влиять на активность РКС. Влияние нуклеозида проявляется только в тех случаях, когда активация фермента индуцирована распадом фосфатидилинозитолов.

По современным представлениям пршято считать, что большинство, если не все, физиологические эффекты аденозина опосредуются рецепторами нуклеозида, энспрессированнымя на нару:шой поверхности клеточной мембраны. Для -того, чтобы проверить это предположение на используемой наш модели, было исследовано воздействие теофяллина и датшридамола на адеиозин-модулированное фосфорилирование плекстрина и легкой цепи миозина.

Дтгаридамол, блокатор транспорта нуклеозидов, уже в когадентра-ции 10 иМ полностью подавляет проникновение аденозина через клеточную оболочку в обоих направлениях. Обычно введение блокаторсв транспорта нуклеозидов потенцирует эффект аденозина за счет поддор-

жатая постоянной локальной коицаитрзцяа нуклеозвдз с наружной стороны мембрана клетки, т.е. ад&нозин остается доступным для рецепто-

ров в течение Солее длительного отрезка времени. Результаты исследо-

вания совместного влияния дипиридамола и аданозина на тромбин- и ара-хэдонат-индуцированное фосфорилирование белков р47 и р20 показали, что

дштаридамол, как и предполагалось, потенцирует о*ф?кт аденозина: влияет на динамику процесса, усиливая эффект нуклеозидэ, а также снижает его концентрацию, необходимую для заметного подавления аффекта тромбина. В отсутствии аденозина дипиридамол, в прлмоняшзЯся концентрации, не оказывал влияния на изучавшиеся процессы. Потенцирование дшырада-молом эффектов аденозина на процессы, индуцированные коллагеном и се-ротоаином не исследовалось, так как в условиях наших экспериментов нуклеозкд и без дипяридамола практически полностью подавлял фосфорилирование исследуемых белков, индуцированное этими веществами. Воздействие' аденозина на фосфорилирование плекстрина, вызванное ТРА я DAG, дипиридамол не изменял. Описанные данные подтверждают предположение о том, что изучаемые зффзкты опосредованы одешзин-чувствйге-льными сайтами, расположенными на наружной поверхности тромбоцитов. Влияние на изучаемые процессы специфического антагониста рецепторов аденозина - теофнллинатакже подтверждает роцепторную природу наблюдаемых эффектов: индуцированное фосфорилирование плекстрина и легкой цепи миозина, подавленное аденозином, в присутствии теофиллииа восстанавливается.

Таким образом, результаты проделайных экспориментов показывает1, что аденозин, воздействуя на специфические экстрвклбточные рецептора тромбоцитов человека, подавляет процессы, индуцированные активаторами каскада фосфэтидилинозитолов. но на воздействует непосредственно на активность ГКО. Это наблюдение позволяет предположить, что аденозин тормозит распад фосфатидал;шозитолдифосфата. Возможны два варианта ответа на вопрос- о том, на каком этапе нуклеозид тормозит этот процесс: либо нуклсозад ингибирует фосфолипазу С (каталитическую субъединицу непосредственно ила рзгудяторшю G-бедки), либо аденозин де-

сенситизарует специфические рецепторы вддукторов, расположенные на наружной поверхности мембраны. Более вероятным нам кажется первое предаоложешв. Действительно, для кзздого из использованных в экспериментах веществ на тромбоцитах человека существуют специфические рецепторы , и способность адекозша десенситкзировать по меньшей мэре четыре типа рецепторов кажется нам маловероятной, хотя исключить ее, без проведения допохнительнах исследований, не представляется возможном. Возникает вопрос: каким образом ад&нозин способен шгибировать, фосфэлилаау С или десенслтизировать рецепторы, связашше с инози-такьнга каскадом ? Из литературы известно, и в настоящей работе еще раз подтверзд&но, что аденозш1 активирует аденилатциклазу, воздействуя на рецепторы А^ тина. Эксперименты по фссфорилированию были построены так, чтобы введение аффектора приходилось на пик накопления цАМФ, вызванного аденозином. Наиболее вероятным кажется предположение о том, что действие вденозина обусловлено повышением внутриклеточного уровня цАШ. Кроме того, в наших экспериментах показано, что проникающий в клетку дибутлрил-цАМФ влияет однотипно с аденозином на изучаемые процессы. Однако возможно, что активирование аденилатциклазы является не единственным механизмом воздействия аде-нозина на каскад фосфатидишшозитолов. Во-первых, в экпе'риментах показано, что дибутирил-цАШ: в концентрации I шМ действует на 30% менее эффективно, чем аденозин в концентрации 10 цМ. Во-вторых, известно, что обработка тромбоцитов человека стимуляторами аденилатциклазк приводит к подавлению действия тромбина только в присутствии ингибиторов фосфодиэстеразы. А аденозин в отсутствии таких ингибиторов способен блокировать тромбин-индуцировашое фосфорилировавие тромбовд-тарных белков. На исключено, что, если обнаруженные нами участки свя-

зывания аденозина являются разными молекулами, только один из этих сайтов связан с аденилатциклазой, тогда как другой - несет еще не выясненную функцию.

Из литературы известно, что аденозин является мощным атггиаг-регантом. Нуклеозид способен предотвращать агрегацию, вызванную практически любыми индукторами этого процесса. Обычно этот эффект связывают с повышением внутриклеточного уровня цАМФ. На основашш результатов экспериментов, описанных в предыдущей главе, оказалось возможным предположить, что нуклаозид должен ингибировать агрегацию кровяных пластинок, индуцированную стимуляторам;! распада фзс-фатидилинозитолдифосфэта, но нэ должен воздействовать на процесс, вызванный форболовнм эфиром - ТРА. Эксперименты показали, что аденозин в концентрации от I до 10 микромолей подавляет агрегации тромбоцитов, вызванную пороговыми концентрациями тромбина, коллагена, се-ротонина и арахидоновой'кислоты. Процесс имеет дозозявигакый характер. Неожиданной оказалась способность аденозина значительно увеличивать лаг-пэриод и общее время ТРА-шдуцировапной агрегации. Следует отмо-тить, что хотя нуклеозид и увеличивает время, необходимое для индукции форболовым эфиром агрегационного каскада, и тормозит уже начавшийся процесс, полного подавления ТРА-индуцированноЙ эгрегащш не происходит даже в присутствии высоких (40 ¡¿М) концентраций аденозина. Аналогичное воздействие оказывает и цАМФ, но эффект этого вещества значи-значительно слабее. То, что аденозин, также как и цАМФ но препятствуют фосфорилировашга шгекотрша, вызванному непосредственной активацией РКС, но в то же время значительно тормозят процесс агрегации, вызванный ТРА, свидетельствует о том, что основной субстрат РКС в тромбоцитах и других гсматоноэтических клетках - плекстрин но явля-

;ч

ется необходимым звеном агрегации кровяных пластинок. Исходя из того, что ТРА активирует каскад арэхидоновой кислоты [Peinstein, Halenda, 1988], на основании полученных данных можно предположить, что шгек-стрин нв относится к семейству липокортщов - айдогешшх ингибиторов фосфолипазы А9, проявляющих свой ингибирущий аффект в дефоефорилиро-ванаом состоянии, как это предполагалось ранее [íDougi et al., 1986].

выводы

1. В тромбоцитах человека методом прямого радиолигаНдного анализа . с использованием эндогенного лиганда обнаружены два типа участков связывания аденозина. Выявленные участки расположены на наружной поверхности клетки и по данным фармакологического анализа и способности аденозина повышать уровень цАШ> в тромбоцитах относятся« к А ^ типу рецепторов аденозина.

2. Анализ кинетических характеристик показывает, что один из участков связывания аденозина отличен от выявленных ранее с помощью синтетического лиганда 5•-М-этепкарбсксамидоаденозина' и описывается, впервые.

3. Из мембранной фракции-тромбоцитов человека методом-аффинной хроматографии выделены и частично очищены аденозин-связывающие белки. Двумя альтернативными методами показано, что эти белки имеют рецеп-торнув природу; молекулярные массы активных центров рецепторов аденозина равны 13,5 и 56 кн.

4. Аденозин блокирует процессы транслокации РКС и фосфорилировашя основного субстрата РКС в тромбоцитах - плекстрина и легкой цепи миозина, вызванные активаторами фос^олипазы С, но влияя на эти процессы, индуцированные непосредственными активаторами РКС, что указывает на гипотетическую мишень рецептор-опосредованного воздействия адено-

зина в каскаде фосфатиди.пшюзито.тов - фосфодипзэу С. 5. Аденозин ггода&ляег агрегацию тромбоцитов, шдуцировеннуо активаторами фосфолипазы С, и 'тормозит этот процесс, вызнанный прямим активатором РКС, что наряду с данными по воздействию яденогила на индуцированное фосфорилировашю тромбоцитарпых белков позволяет сделать вы-еод о том, что основной субстрат РКС в гематопоетических клетках -.плвкстрин не является эндогенным иотибитором фосфолипазы А0 - липокор-тином, как это предполагалось ранее.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1.Алмазов В.А., Гуревич B.C., Елисеев В.В., Крылова И.В., Схолль-Энгбертс А.Д., Полтавченко Г.М. Влияние аденозина на уровень прос-тагландинов в крови и агрегацию тромбоцитов при экспериментальном инфаркте миокарда.-Бюлл.Эксп.Биол.Мод.-1991.-Т.CXII. ,Jf 7.-С.37-39.

2.Алмазов В.А., Гуревич B.C., Попов В.Г., Михайлова И.Л., Схолль-Энгбертс А.Д. Структура" и фупкнди рецепторов тромбоцитов человека. -Гематология и трансфузиология.-1990.-Т.35.-й 10.-С.25-29.

3.Гуревич B.C., Михайлова И.А., Схолль-Энгбертс А.Д. Тромбоциты и антитромбоцитарная терапия при ишемической болезни сердца.-В сб. научн.трудов.ЛНИИК N3 РСФСР "Профилактика и лечение атеросклероза коронарных артерий.-СПб.-1992.-С.35-42.

4.Гуревич B.C., Схолль-Энгбертс А.Д., Попов Ю.Г. Быстрый метод получения клеточных•мембран тромбоцитов для радиолигандных и энзи-матических исследований. - Биохимия.-1990.- Т.55.-Вып.5.-С.808-813.

5.Елисеев В.В., Гуревич B.C., Прокопенко Г.М., Овчинникова А.Г., Слободская В.В., Снопков В.Н., Схолль-Энгбертс А.Д. Влияние инозина на активность аденозиндезамипазы крови.-Хим.-фарм журнал.-1992.-М 4, С.-