Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль аналога аденозина в изменении фенотипических свойств дендритных клеток человека моноцитарного происхождения при бронхиальной астме

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль аналога аденозина в изменении фенотипических свойств дендритных клеток человека моноцитарного происхождения при бронхиальной астме"

005002240

ГОРЕМЫКИН Константин Викторович

РОЛЬ АНАЛОГА АДЕНОЗИНА В ИЗМЕНЕНИИ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА МОНОЦИТАРНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

03.01.04 - биохимия 14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 НОЯ 2011

Томск-2011

005002240

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Томск)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Серебров Владимир Юрьевич докшр медицинских наук Сазонов Алексей Эдуардович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Усынин Иван Федорович

доктор медицинских наук, профессор Цырендоржиев Довдок Дамдинович

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Челябинск).

Защита состоится « декабря 2011 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.034.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2; тел. 8(383)333-54-81; факс: 8(383)333-67-58.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2. Автореферат разослан « ноября 2011 года

Ученый секретарь

диссертационного совета / / / Русских Г.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящий момент повышенный интерес исследователей во всем мире вызывают аденозин и аденозиновые рецепторы (АР), как ключевые регуляторы множества тканевых функций.

Аденозин - эндогенный нуклеозид, продукт метаболизма АТФ (Kunapuli, S. Р., Daniel, J. L., 1998), в повышенных количествах высвобождается из клеток в различных ситуациях, включая гипоксию, воспаление и повреждение клеток (Fredholm В.В., 2007). Действуя паракринно на АР типов Аь А2д, А2в, Аз окружающих клеток, аденозин вызывает ряд эффектов, как про-, так и противовоспалительного характера (выброс медиаторов воспаления, изменение направления дифференцировки клеток). Тем самым, аденозин является своего рода «сигнализацией», сообщающей окружающим клеткам о патологическом состоянии ткани. В ответ на сигнал клетки развивают приспособительные реакции (Hasko G., 2008).

Дисбаланс в системе взаимоотношений аденозин - АР может способствовать возникновению и развитию ряда различных заболеваний с резко выраженным воспалительным компонентом в патогенезе: бронхиальной астме (Spicuzza L, 2006), ревматоидному артриту (Montesinos, М.С., 2007), болезни Крона (Kolachala V.L., 2008; Hasko G., 2008).

Для установления механизмов развития процесса воспаления одним из центральных звеньев является рецепторная передача сигнала. Важным моментом является установление связи между активностью тех или иных рецепторов на клетках иммунной системы с их дифференцировкой, а также секрецией ими про- и противовоспалительных медиаторов. Важнейшими клетками при развитии воспалительных реакций, наряду с нейтрофилами, макрофагами, лимфоцитами и прочими клетками иммунной системы, являются дендритные клетки (ДК) (Duez С, 2006; Fransen JH, 2010). Данные клетки для исследований in vitro получают главным образом из моноцитов путем культивирования с интерлейкином 4 (ИЛ-4) и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ), что соответствует происходящему in vivo процессу. На животных моделях было показано, что провоспалительным действием обладают главным образом ДК именно моноцитарного происхождения (Peters JH, 1993; Yona S, 2010; Clark G, 2010).

Влияние активации АР на дифференцировку моноцитов в ДК (в том числе: изменение уровней мРНК АР разных типов, мРНК цитокинов, поверхностной экспрессии рецепторов, секреции цитокинов в окружающие клетки среду) на данный момент изучено слабо (Hasko G., 2008; Novítskiy SV, 2008).

ДК моноцитарного происхождения, дифференцированные в присутствии аденозина, никогда ранее не изучались на начальном этапе их дифференцировки (38 часов), тогда как именно этот этап характеризуется высокой синтетической активностью (Novitskiy SV, 2008). Вместе с тем, было показано, что действие высоких концентраций аденозина (30 цМ) на АР типа

Л2в при дифференцировке моноцитов в ДК приводит к формированию на шестые сутки клеток, характеризующихся одновременным присутствием как рецепторов, свойственных для ДК, так и рецепторов, свойственных для моноцитов. Также для этих клеток была характерна высокая продукция шггерлейкина б (ИЛ-6), интерлейкина 8 (ИЛ-8) и фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) (значительно более высокая, по сравнению как с «обычными» ДК, дифференцированными в отсутствие аденозина, так и по сравнению с моноцитами) (Novitskiy SV, 2008). Перечисленные цитокины обладают провоспалительным и фибротическим действием, способны поддерживать воспаление и вызывать ремоделирование (Eddahibi S, Chaouat А, 2006; Papaioannou AI, 2006; Tuder RM, 2008; Геренг E.A., 2011).

Для изучения процесса воспаления используют экспериментальные модели, реализованные на животных (Doganci А, 2005; Zaynagetdinov R, 2010; Alcorn JL, 20И). В то же время, данные, полученные па таких моделях, нельзя переносить на человека, так как иммунная система человека имеет существенные отличия от иммунной системы любого животного (Hasko G., 2008). Течение воспалительных процессов у человека изучают в рамках заболеваний, в которых воспалительный компонент является ведущим: хронической обструктивной болезни легких, бронхиальной астмы, ревматоидного артрита, болезни Крона.

Участие аденозина в патологических процессах при бронхиальной астме не вызывает сомнений в силу ряда фактов. Повышенный уровень аденозина обнаружен в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и конденсате выдыхаемого воздуха у больных БА (Driver et al, 1993; Iluszar et al, 2002; Csoma ct al, 2005). Аденозин провоцирует бронхоконстрикцию у астматиков, но не у практически здоровых людей (R. Polosa, S. Т. Holgate, 2006). Действие аденозина на АР типа Агв легочных фибробластов способствует их дифференцировке в миофибробласты, которые продуцируют избыточное количество внеклеточного матрикса, приводя в конечном итоге к фиброзу и ремоделированию ткани легких при астме и ХОБЛ (Zhong Н., 2005).

Таким образом, дифференцированные в присутствии высоких концентраций аденозина ДК предположительно могут в значительной степени опосредовать развитие и поддержание воспаления, приводя к наиболее тяжелому течению бронхиальной астмы, характеризующемуся ремоделированием, устойчивой обструкцией, нейтрофильной инфильтрацией.

Изучение связи действия аденозина на дендритные клетки человека с секрецией ими перечисленных выше цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8 и ФРЭС) поможет раскрыть фундаментальные механизмы развития воспаления и обозначить критические точки механизмов, необходимых для разработки лекарственных препаратов, в том числе для терапии БА. Такое исследование будет иметь большое значение для медико-биологической науки.

При высоких концентрациях аденозина, наблюдаемых в очаге воспаления (до ~30-100 рМ), свою активность проявляют не только высокоаффинные рецепторы типов Аь Агл, А3, но и низкоаффинные - типа А2в- Интерес представляют многие аспекты функционирования данных рецепторов, в том

числе механизмы взаимодействия аденозина и других известных лигандов с лиганд-связывающим центром АР Л2в- Расчеты лиганд-рецепторных взаимодействий удобно производить при помощи компьютерного моделирования (Baxevanis, A.D., 2001). Наименее затратными и в то же время качественными методами расчетов являются молекулярно-механические методы (Беленикин М. С., 2002). Построение моделей АР типа Aja возможно сделать на основании моделирования по гомологии с рецептором типа A2a (существует точная компьютерная модель последнего, полученная при помощи рентгеноструктурной кристаллографии) (Jaakola V. Р., 2008).

В связи с перечисленными выше фактами была поставлена цель исследования.

Цель исследования

Изучить роль аналога аденозина в изменении фенотипических свойств дендритных клеток человека моноцитарпого происхождения при бронхиальной астме.

Задачи исследования

1. Оценить количества CDla, CD14, CD209 на дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции аналогом аденозина.

2. Исследовать уровни мРНК аденозиновых рецепторов (Аь Агд, А2в, Аз) в дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции аналогом аденозина.

3. Установить количество мРНК интерлейкина 6, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов в дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции аналогом аденозина, а также концентрации этих цитокинов в кулыуральной среде данных клеток.

4. Оценить взаимосвязи между количеством CDla, CD14, CD209 на дендритных клетках, содержанием в данных клетках мРНК аденозиновых рецепторов (Аь А2а, А2В, Аз), интерлейкина, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов, количеством белка этих цитокинов в среде указанных клеток и интенсивностью воспалительного процесса у больных бронхиальной астмой.

5. При помощи компьютерного моделирования изучить взаимодействие аминокислотных остатков, образующих лиганд-связывающий центр аденозинового рецептора А2в, с известными активаторами и ингибиторами аденознновых рецепторов.

Научная новизна работы

Впервые дана функциональная характеристика дифференцированных в присутствии аналога аденозина дендритных клеток моноцитарного происхождения человека на начальной стадии их дифференцировки.

Получены данные о влиянии аналога аденозина на уровни экспрессии поверхностных маркеров (CDla, CD14, CD209) на ДК, количестве мРНК аденозиновых рецепторов (Аь А2А, А2в, Аз) и цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8, ФРЭС) в ДК, а также о содержании белка этих цитокинов в культуральной среде ДК.

Установлены взаимосвязи между интенсивностью воспалительного процесса при бронхиальной астме и вышеперечисленными показателями.

Впервые обнаружены межиндивидуальные различия в степени чувствительности дендритных клеток к действию аналога аденозина (NECA). Чувствительность к NECA выражается в аденозин-зависимом увеличении накопления клеток с сочетанием рецепторов CDla '"cwCD 14+CD209+. Частота встречаемости лиц с высокой чувствительностью ДК к NECA зависит от степени тяжести бронхиальной астмы.

Отмеченное в исследовании повышение уровня мРНК АР типа А?л У больных БА под действием NECA в научной литературе ранее не встречалось.

При помощи компьютерного моделирования установлено, что активаторы образуют водородные связи с остатками аминокислот 11е67, Phel73 и Glul74 чаще, чем ингибиторы. Взаимодействие этих аминокислотных остатков преимущественно с активаторами обнаружено впервые. Возможно, именно ош в первую очередь ответственны за активацию АР типа Агв-

Научно-практическая значимость работы

Полученные сведения о влиянии аналога аденозина на фенотипические и функциональные характеристики дендритных клеток моноцитарного происхождения на ранней стадии их дифференцировки могут быть использованы при разработке новых противовоспалительных средств -блокаторов аденозиновых рецепторов, а также при разработке новых схем лечения на основании таких срсдств-блокаторов.

Положения, выносимые на защиту

1. Дендритные клетки человека моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки обладают различной способностью к изменению фенотипа под действием аналога аденозина - NECA, зависящей от наличия или отсутствия БА, степени тяжести БА и индивидуальных особенностей. Изменение фенотипа под действием NECA у больных БА отличается от такового у практически здоровых людей повышением количества м РНК аденозинового рецептора типа АгА; у больных БА легкой и средней степеней тяжести - повышением количества мРНК интерлейкина 8; у практически здоровых людей происходит понижение секреции интерлейкина 8.

2. Аминокислотные остатки Ие67, Phel73 и GIul74 лиганд-связывающего центра аденозинового рецептора типа A2ei образуют водородные связи с активаторами аденозиновых рецепторов, в то время как для ингибиторов не удастся выделить специфичные к ним аминокислотные остатки.

Апробация работы

Материалы данного исследования доложены и обсуждены на научных семинарах кафедры биохимии и молекулярной биологии СибГМУ (2011 г.); на научных семинарах центральной научно-исследовательской лаборатории СибГМУ (2009-2011 гг.); на XI и XII научных конференциях (2010 и 2011 гг.)

«Конгресс Молодых ученых с международным участием «Науки о человеке»»; на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (2011); на III Международной Студенческой Научной Конференции с участием молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины", посвященной 50-летию Медицинского Факультета РУДН (2011).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 работ в центральной и местной печати, из них 2 - в журналах из списка ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация содержит 191 страницу машинописного текста, иллюстрирована 31 таблицей и 9 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Указатель литературы содержит 173 работы, из которых 157 принадлежат зарубежным авторам.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Процесс воспаления изучался на примере бронхиальной астмы человека.

Исследование проведено с сентября 2010 г. по март 2011 г. на базе ЦНИЛ СибГМУ (зав. ЦНИЛ - профессор, д.м.н. А.Н. Банков), кафедры биохимии и молекулярной биологии СибГМУ (зав. каф. - профессор, д.м.н. В.Ю. Серебров) при финансовой поддержке гранта ФЦП 1.5 № 02.740.11.5150.

Было обследовано 60 человек в возрасте от 18 до 50 лет. В число обследуемых были включены практически здоровые люди (п=20), больные легкой и среднетяжелой БА (п=20), а также больные тяжелой БА (п=20). В контрольную группу включали обследуемых в возрасте от 18 до 50 лет, обоего пола, при условии отсутствия атопических заболеваний (аллергический ринит, атонический дерматит, бронхиальная астма) и атопии по данным анамнеза, а также отсутствия острых заболеваний бронхолегочной системы и обострения хронических заболеваний в течение 4-х недель до визита. Включение в исследование больных БА проводилось при условии соответствия международным стандартным критериям GINA 2006 (Global Initiative for Asthma, 2006). До участия в исследовании от всех обследуемых получали письменное информированное согласие, подписанное с указанием даты.

Методы культивирования п исследования дендритных меток

У всех обследуемых забирали по 20 мл крови из локтевой вены при помощи систем вакуумного забора крови «Vacutest KIMA» с гепаринатом лития, по 9 мл каждая («ИМА«, Италия). У практически здоровых людей кровь забирали на базе ЦНИЛ, у больных БА кровь - на базе кафедры госпитальной терапии с курсом спортивной медицины и реабилитации СибГМУ. Из крови на градиенте Фиколла выделяли мононуклеарные клетки крови (Boyum А., 1968); затем из их массы выделяли моноциты на градиенте Перколла (Ulmer A., Fiad Н., 1979). Процентное содержание CD14+ клеток (моноцитов) в выделенной фракции оценивали при помощи проточного цитофлюориметра FACSCalibur.

Моноциты дифференцировали в дендритные клетки в среде RPMI-1640,. содержащей 10% ЭБС («Sigma-Aldrich», США), 50 мкМ ß-меркаптоэтанола («Sigma-Aldrich», США), 2мМ L-глутамина («Панэко», Россия), 50 ООО ед./литр пенициллина («Панэко», Россия), 50 мг/л стрептомицина («Панэко», Россия), 1 ¡ мг/л пирувата натрия («Панэко», Россия) с добавлением ИЛ-4 и ГМ-КСФ (Novitskiy S.V. et al., 2008). К половине культур также добавляли аналог аденозина (NECA). По прошествии 38 часов культивирования дендритные клетки анализировали на уровни экспрессии поверхностных маркеров: CD 1а, CD14, CD209 при помощи проточной цитофлюориметрии (Novitskiy S.V. et al., 2008); оценивали содержание мРНК аденозиновых рецепторов всех 4 типов: А,, Aîa, А2в, А3, а также цитокинов: интерлейкина б, интерлейкина 8 и фактора роста эндотелия сосудов с помощью иолимеразной цепной реакции в реальном времени (Porcher С. et al., 1992) с обратной транскрипцией (Gerard G.F., 1997). Супернатанты, собранные с культур, анализировали на содержание белка перечисленных цитокинов при помощи твердофазного иммунофермептного анализа (Tijssen Р., 1985).

Сотрудниками кафедры госпитальной терапии с курсом спортивной медицины и реабилитации СибГМУ проводился объективный осмотр больных БА, сбор анамнеза, клиническое и аллергологическое обследование, лабораторная диагностика, исследование функции внешнего дыхания и степени обратимости обструкции в тесте с вентолином. Компьютерные методы исследования

Компьютерные модели аденозинового рецептора типа Агв были созданы на основе известной аминокислотной последовательности, опубликованной в открытом доступе в банке данных NCBI (ID: NP_000667.1). Шаблоном для построения третичной структуры рецептора А2в по гомологии при помощи программы «Modeller» (Eswar N, 2006). послужила компьютерная модель рецептора Агд, находящаяся в свободном доступе на сайте молекулярного банка данных RCSB PDB (ID: 3eml.pdb).

Компьютерные модели активаторов и ингибиторов аденозиновых рецепторов были созданы в программном пакете «ACD/ChemSketch» (Li Z., 2004).

Моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий производилось при помощи программы AutoDock 4.0 (основанной на принципах молекулярной механики) в составе программного комплекса MGL Tools 1.4.5 (Morris G., 2008) с использованием суперкомпьютера «СКИФ-Киберия».

Методы статистической обработки полученных результатов

Обработка первичных данных, полученных в результате клинико-лабораторного и инструментального обследования людей, страдающих бронхиальной астмой, а также первичных данных, полученных в результате лабораторного исследования дендритных клеток, равно как и полученных при компьютерном моделировании производилась в пакете статистических программ "SPSS 17.0". Для проверки нормальности распределения всех анализируемых случайных величин использовался критерий Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса (Гланц, 1998). В случае соответствия

распределения нормальному выборочные средние независимых выборок сравнивались по непарному Т-критерию Стьюдента, выборочные средние зависимых выборок сравнивались при помощи парного Т-критерия Стьюдента. В случае, когда между собой сравнивались 3 независимые выборки, вначале использовался однофакторный дисперсионный анализ. В случае обнаружения статистически значимых различий между выборками использовался непарный Т-критерий Стьюдента (Гланц, 1998). Независимые случайные величины, не распределенные по нормальному закону, сравнивались при помощи U-критерия Манна-Уитни; зависимые случайные величины, не распределенные по нормальному закону, сравнивались при помощи критерия Вилкоксона. В случае, когда между собой сравнивались 3 независимые выборки, использовался критерий Краскела-Уоллиса. В случае обнаружения статистически значимых различий между выборками использовался U-критсрий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони (Гланц, 1998). В результате компьютерного моделирования взаимодействия аденозикового рецептора типа Агв с известными активаторами и ингибиторами аденозиновых рецепторов были получены данные о том, образует ли тот или иной лиганд (активатор или ингибитор) водородные связи с тем или иным аминокислотным остатком. На основе этих данных для расчета частот образования водородных связей между лигандами и аминокислотными остатками лиганд-связывающего центра рецептора строились таблицы сопряженности (Гланц, 1998). Для определения уровней статистической значимости различий частот взаимодействия лигандов и остатков аминокислот использовали односторонний точный критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В соответствии с поставленными задачами, исследование было проведено в два этапа.

Первый этап включал оценку изменения количества рецепторов CDla и CD14 на поверхности ДК моноцитарного происхождения на ранней стадии их дифференцировки (38 часов) под действием метаболически стабильного аналога аденозина - N-этаикарбоксамидоаденозина (NECA) в экспериментах in vitro, а также уровней продукции мРНК и белка интерлейкина б, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов этими клетками в сходных условиях.

Предположительно, АР тина Агв оказывают решающее влияние на изменение экспрессии и секреции указанных молекул ДК моноцитарного происхождения.

В большом числе исследований по изучению различных болезней и патологических состояний (артрита, воспалительных болезней кишечника, бронхиальной астмы, сепсиса, ишемии) было показано, что именно АР типа Агв обладают провоспалительным действием, в отличие от остальных АР (Hasko G, 2008). По этой причине разработка селективных ингибиторов АР типа А2в представляется весьма важной.

На втором этапе были проведены компьютерные исследования по установлению аминокислотных остатков лиганд-связывающего центра АР типа А2в, ответственных за взаимодействие с известными активаторами и

ингибиторами данного рецептора. Полученные данные должны позволить подобрать в последующих компьютерных экспериментах новые селективные ингибиторы АР типа А2в - потенциальные противовоспалительные лекарственные средства.

В данной работе был использован способ получения моноцитов из крови при помощи разделения на градиенте плотности Фиколла и Перколла (Boyum А., 1968; Ulmer A., Fiad П., 1979). Это позволило выделить моноциты с чистотой 74,2±5,5% (рис, 1). Выделенная фракция почти не содержала лимфоцитов.

Рис. 1. Популяции клеток во фракции, собранной с границы раздела фаз после разделения МНК ПК на градиенте Перколла. Овалами выделены моноцитарная (R1: 71.88%) и лимфоцитарная (R2: 10,43%) популяции.

При культивировании моноцитов в среде с добавлением ИЛ-4 и ГМ-КСФ в течение 38 часов они дифференцировались в ДК с преобладающим фенотипом CDla^CD14"CD209+. Известно, что при многих заболеваниях с воспалительным компонентом (в том числе при БА) в тканях наблюдаются повышенные концентрации аденозина (Driver et al, 1993; Huszar et al, 2002; Csoma et al, 2005; Hasko G, 2008) (рис. 9). Добавление метаболически стабильного аналога аденозина (NECA) при культивировании ДК приводило к появлению у части из них альтернативного фенотипа CDla"/lowCD14+CD209+ (рис. 2). что согласуется с проведенными ранее исследованиями на ДК с большим сроком культивирования (5-6 суток) (Novitskiy, 2008). Было показано, что ДК с таким фенотипом характеризуются повышенной секрецией ИЛ-6, ИД-8, ФРЭС ("Novitskiy, 2008). Этот феномен наблюдался и в нашем исследовании уже после 38 часов культивирования. ДК с фенотипом CDla"/kwCD14+CD209+ появлялись и в культурах, не подвергавшихся действию NEC.A, что вполне объяснимо. Известно, что, помимо аденозина и NECA, появление ДК с указанным фенотипом вызывают активаторы аденилатциклазы: простагландин Е2, ИЛ-6, ИЛ-ip, холерный токсин, форсколин (Giordano ü, Magaletti DM, 2003; Veglia F, Sciaraffia E, 2011). В данном исследовании во всех культурах ДК наблюдалась спонтанная продукция ИЛ-6 - вероятно, по причине активации моноцитов/ДК в результате адгезии к пластику культуральных планшетов, что

рассматривается многими исследователями как аналог прохождения моноцитами через стенку сосуда in vivo, например, в очаг воспаления. В том и в другом случае активируются рецепторы, опосредующие адгезию моноцитов -CDllb (Navarro S, Debili N, 1989) (рис. 9). Очевидно, что ИЛ-6 мог вызывать изменение дифференцировки части анализируемых клеток в направлении CDlavtowCD14+CD209+ ДК (Giordano D, 2003) (рис. 9). При этом наблюдался также и эффект NECA на изменение фенотипа: наблюдалось статистически значимое повышение процентного содержания клеток с фенотипом CD 1а "OWCD14+CD209+ под действием этого аналога аденозина во всех ipynnax сравнения (рис. 2, рис. 9).

ш о

& Е £

flj os ж a- es _

D.Q ^ ■5 U s"

« * =r

5 05

я Q 5.

Iii

o I;

у ss щ

¡5 и

о

et

p<0,01

p < 0,05

p<0,01

" NECA Тяжелая БА

NECA Контроль

NECA Легкая и средняя БА

Рис. 2. Процентное содержание CD14+/CDla'/CD209+ клеток на начальных этапах дифференцировки моноцитов в дендритные клетки у больных БА и здоровых доноров при отсутствии стимуляции аналогом аденозина NECA и при стимуляции аналогом аденозина NECA, M±m.

Примечание:

БА - бронхиальная астма;

контрольная группа - практически здоровые люди;

NECA - данные культуры дендритных клеток стимулировали растворенным в диметилсульфоксиде (DMSO) N-этилкарбоксамидоаденозином (метаболически стабильным аналогом аденозина, NECA) в концентрации 30 ¡J.M;

- - данные культуры дендритных клеток не стимулировали N-этилкарбоксамидоаденозином (NECA), но к ним добавляли растворитель -

диметилсульфоксид (DMSO) в том же количестве, что был использован для растворения NECA в параллельном эксперименте.

Существуют данные, согласно которым эффект аденозина и NECA на изменение сочетания поверхностных маркеров на ДК с CDla+CD14"CD209+ на CDIa"/lmvCD¡4+CD209+ обусловлен активацией АР типа А2В (Novitskiy, 2008). Полученные в нашем исследовании данные позволяют предположить, что данный феномен может быть обусловлен также и действием АР типа А2А, т.к. количество мРНК АР типа А2А преобладало над количеством мРНК АР типа А2в (равно как и мРНК остальных АР) во всех группах сравнения (рис. 3). Это предположение требует проверки в экспериментах с селективными активаторами и ингибиторами АР типа А2д.

р< 0,001

NECA " NECA ~ NECA ~ NECA

А1 А2д А2в А3

Рис. 3. Уровни мРНК аденозиновых рецепторов типов Аь А2а, А2В, Аз в дендритных клетках обследуемых, М±т

Примечание:

NECA - данные культуры дендритных клеток стимулировали растворенным в диметилсульфоксиде (DMSO) N-этилкарбоксамидоадснозином (метаболически стабильным аналогом аденозина, NECA) в концентрации 30 цМ;

™ - данные культуры дендритных клеток не стимулировали N-этилкарбоксамидоаденозином (NECA), но к ним добавляли растворитель -диметилсульфоксид (DMSO) в том же количестве, что был использован для растворения NECA в параллельном эксперименте.

* - р < 0,001 по сравнению с нестимулированным уровнем мРНК АР А2А">

# - р < 0,001 по сравнению со стимулированным NECA уровнем мРНК АР

А2а

Внутри всех анализируемых групп (больные БА разных степеней тяжести, практически здоровые люди) наблюдались значительные межиндивидуальные различия в приросте количества ДК с альтернативным фенотипом под действием NECA. На основании различий в приросте все обследуемые, вне зависимости от наличия БА и ее тяжести, были разделены на 2 группы: «слабо реагирующие на NECA» и «сильно реагирующие на NECA» (рис. 4). При этом процент «сильно реагирующих» среди астматиков (26,7% и 33,3%) был значительно выше, чем среди практически здоровых людей (9,5%). Это явление обнаружено впервые. Было установлено, что культуры клеток выделенных групп различаются не только по выраженности изменений фенотипа, но и по разностям уровней экспрессии мРНК АР типа А2а и ИЛ-6. По разностям уровней белка какого-либо из цитокинов в среде различий не наблюдалось.

легкая и средняя БА

контроль

Рис. 4. Процентное отношение числа обследуемых, которые характеризовались повышением CDla'/lowCD14+CD209+ клеток на начальных этапах дифференцировки ДК моноцитарного происхождения в ответ на метаболически стабильный аналог аденозина (NECA), к числу обследуемых в данной группе.

Примечание: легкая и средняя БА - данные для группы больных БА легкой и средней степени тяжести; тяжелая БА - данные для группы больных тяжелой БА, контроль - данные для группы практически здоровых доноров.

Каждая точка соответствует разности между процентным содержанием CDla "СШ4 CD209* ДК в общем числе ДК при стимуляции NECA и содержанием CDia OUCD14"CD2094 ДК без стимуляции у одного обследуемого. Значения разностей между содержанием CDla""owCD14+CD209+ ДК при стимуляции и без стимуляции отложены по оси ординат.

Яда Ра^кой обведены точки, соответствующие разнице в содержании CDla" CD14 CD209' ДК при стимуляции NECA и без стимуляции выше 5 %. Над рамкой указана доля обследуемых, для которых эта разница была больше 5 %.

Следует отметить, что в данном исследовании под действием NECA уровень мРНК АР типа А2А повышался в ДК больных БА - как легкой и средней, так и тяжелой степени (рис. 5), но не у практически здоровых людей Повышение уровня мРНК АР типа А2Л (в группах 1 и 2 - у обследуемых с активно протекающим воспалительным процессом при БА) под действием аналога адснозина NECA обнаружено впервые.

0.8-,

р < 0,05

р < 0,05

NECA Тяжелая БА

NECA Контроль

NECA Легкая и средняя БА

Рис. 5. Уровни экспрессии мРНК аденозинового рецептора типа А2Л в дендритных клетках больных бронхиальной астмой легкой и средней степеней тяжести, больных бронхиальной астмой тяжелой степени, а также в группе практически здоровых людей, М±т

Примечание:

БА - бронхиальная астма;

контроль - контрольная группа, практически здоровые люди;

ÑECA - данные культуры дендритных клеток стимулировали растворенным в диметилсульфоксиде (DMSO) N-этилкарбоксамидоаденозином (метаболически стабильным аналогом аденозина, NECA) в концентрации 30 цМ;

~ - данные культуры дендритных клеток не стимулировали N-этилкарбоксамидоаденозином (NECA), но к ним добавляли растворитель -диметилсульфоксид (DMSO) в том же количестве, что был использован для растворения NECA в параллельном эксперименте.

Известно, что активация АР типа А2а (в том числе А2а, экспрессированных на ДК) обладает защитным действием при патологических процессах воспалительного генеза (Ohta A. ct al., 2001; Hasko G. et al., 2008). Защитное действие реализуется посредством увеличения наработки противоспалительных (ИЛ-10) цитокинов и уменьшения наработки провоспалительных (ИЛ-6, ИЛ-12, ИНФу, ФНОа) (Panther, Е. et a!. 2003; Grinberg S, Hasko G, 2009). Возможно, отмеченное в данном исследовании повышение содержания мРНК АР типа А2а в ДК происходит уже после повышения экспрессии мРНК ИЛ-б, ИЛ-8, ФРЭС, а также после усиления секреции этих цитокинов и является реакцией на эти события: ограничивает провоспалительную активность ДК и, таким образом, является защитным механизмом, действующим угнетающе на распространение воспаления (рис. 9). Подобные предположения относительно роли АР типа А2а, экспрессированного на клетках иммунной системы, уже выдвигались ранее несколькими исследователями (Hasko G., 2000; Khoa N. 2001; Abbracchio М., 2007; Ryzhov, 2008).

Количество мРНК АР типа Л2А в нашем исследовании превышало количество мРНК АР типа Л2в как по всем обследуемым в сумме (рис. 3), так и по большинству групп в отдельности. В исследованиях других коллективов на дендритных клетках, напротив, наблюдалось преобладание рецептора типа А2В над рецептором типа А2А - как при стимуляции аденозином или NECA, так и без стимуляции.

Активация А2В на иммунных клетках, как правило, приводит к усилению секреции ИЛ-6 и ИЛ-8, а также ФРЭС (Novitskiy, 2008) (рис. 9). Активация А2а, напротив, понижает продукцию ИЛ-6 и ИЛ-8 (Panther, Е. et al. 2003; Grinberg S, 2009), что наблюдалось и в данном исследовании в группе практически здоровых людей (рис. 7). Отрицательное действие активации А2А на количество секретирусмого ФРЭС в литературных источниках не упоминается (рис. 9). Напротив, для макрофагов показано усиление секреции ФРЭС, опосредованное этим рецептором (Grinberg S, 2009) (рис. 9).

Полученные в нашем исследовании результаты согласуются с приведенными фактами о регуляции уровней ИЛ-6, ИЛ-8 и ФРЭС аденозиновыми рецепторами (АР) типов А2л и A2ß-

да х

s £

«5 1S" f

- ca

I ~

с; x x ^

v¿ 2 10

X к

А X 5 й Q.

>. 5-

p< 0,05

Ир

Ifc

I

SSL

NECA Контроль

NECA " NECA

Легкая и средняя БА Тяжелая БА

Рис. 6. Уровни мРНК ИЛ-8, наблюдаемые в дендритных клетках больных бронхиальной астмой легкой и средней степеней тяжести, больных бронхиальной астмой тяжелой степени, а также в группе практически здоровых людей, М±т

Примечание:

БА - бронхиальная астма;

контроль - контрольная группа, практически здоровые люди;

NECA - данные культуры дендритных клеток стимулировали растворенным в диметилсульфоксиде (DMSO) N-этилкарбоксамидоаденозином (метаболически стабильным аналогом аденозина, NECA) в концентрации 30 рМ;

" - данные культуры дендритных клеток не стимулировали N-этилкарбоксамидоаденозином (NECA), но к ним добавляли растворитель -диметилсульфоксид (DMSO) в том же количестве, что был использован для растворения NECA в параллельном эксперименте.

Секреция ИЛ-б и ИЛ-8 под действием NECA не повышалась ни в одной из исследуемых rpyim (рис. 7): видимо, преобладание экспрессии АР А2а над экспрессией АР А2В приводило к преобладанию ингибирующего эффекта А2А на продукцию этих цитокинов над активирующим эффектом А2В (рис. 3).

При этом концентрация мРНК ИЛ-8 в ДК в нашем исследовании под действием аналога аденозина повышалась, но не в группе практически здоровых людей, для которых было показано повышение белка ИЛ-8, а в группе больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой (рис. 6). Это

может свидетельствовать о принципиально разных реакциях на аналог аденозина дендритных клеток, полученных от больных легкой и среднетяжелой БА, и дендритных клеток, полученных от практически здоровых людей. Но не следует забывать, что не существует обязательной прямой зависимости между уровнем мРНК в клетке и количеством произведенного этой клеткой соответствующего белка.

40

р< 0,05

NECA Тяжелая БА

NECA Контроль

NECA Легкая и средняя БА

Рис. 7. Уровни белка ИЛ-8, наблюдаемые в культуральной среде, собранной с дендритных клеток больных бронхиальной астмой легкой и средней степеней тяжести, больных бронхиальной астмой тяжелой степени, а также в группе практически здоровых людей, М±ш

Примечание:

БА - бронхиальная астма;

контроль - контрольная группа, практически здоровые люди;

NECA - данные культуры дендритных клеток стимулировали растворенным в диметилсульфоксиде (DMSO) N-этилкарбоксамидоаденозином (метаболически стабильным аналогом аденозина, NECA) в концентрации 30 цМ;

-- _ данные культуры дендритных клеток не стимулировали N-этилкарбоксамидоаденозином (NECA), но к ним добавляли растворитель -диметилсульфоксид (DMSO) в том же количестве, что был использован для растворения NECA в параллельном эксперименте.

Секреция ФРЭС без стимуляции NECA была невысока во всех исследуемых группах и колебалась в пределах 0,01-0,35 нг/мл. Стимуляция NECA приводила к многократному увеличению секреции ФРЭС - до 0,1-0,65 нг/мл (рис. 8). Вероятно, АР А2А и А2в обладают синергичным действием на секрецию ФРЭС дендритными клетками раннего срока дифференцировки. Этот факт согласуется с известными литературными данными.

р<0,01

р< 0,05

р< 0,05

NECA " NECA " NECA Легкая и

средняя БА Тяжелая БА Контроль

Рис. 8. Уровни продукции фактора роста эндотелии сосудов в дендритных клетках больных бронхиальной астмой легкой и средней степеней тяжести, больных бронхиальной астмой тяжелой степени, а также в группе практически здоровых людей, М±т

Примечание:

БА - бронхиальная астма;

контроль - контрольная группа, практически здоровые люди;

NECA - данные культуры дендритных клеток стимулировали растворенным в диметилсульфоксиде (DMSO) N-этилкарбоксамидоаденозином (метаболически стабильным аналогом аденозина, NECA) в концентрации 30 рМ;

~ - данные культуры дендритных клеток не стимулировали N-этилкарбоксамидоаденозином (NECA), но к ним добавляли растворитель -диметилсульфоксид (DMSO) в том же количестве, что был использован для растворения NECA в параллельном эксперименте.

<6Р" "О'*«*^

Диффер^нщфоька е д| в течение 38 часов Аденозин

Воспаление

V

а* фиброз

о

а

° ИЯ-8

фУЕбР—^Ангиогенез

Рис. 9. Схема, отражающая установленные в данном исследовании и предполагаемые на основе анализа литературы механизмы патогенеза БА, связанные с активацией ааенозиновых рецепторов на ДК моноцитарного происхождения на раннем этапе их дифференцировки.

Сплошные жирные стрелки - положительная взаимосвязь между двумя феноменами и/или сигнальными молекулами, штриховая жирная стрелка -отрицательная взаимосвязь. Сплошные тонкие стрелки - положительные взаимосвязи, подлежащие дальнейшей проверке; пунктирные тонкие стрелки -отрицательные взаимосвязи, подлежащие дальнейшей проверке.

Широкие стрелки - секреция цитокинов.

Перечеркнутая надпись «I CDla» обозначает ингибирование повышения экспрессии CDla на клеточной поверхности под действием аденозина или же его аналога - NECA. Перечеркнутая надпись «J. CD14» обозначает ингибирование понижения экспрессии CD14 на клеточной поверхности под действием аденозина или же его аналога — NECA.

ИЛ-4 Р - рецептор интерлейкина 4;

ИЛ-6 Р - рецептор интерлейкина 6;

ИЛ-8 Р - рецептор интерлейкина 8;

ГМ-КСФ Р - рецептор гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирзтощего фактора;

ИЛ-6, ИЛ-8 и ФРЭС обладают провоспалительным и фибротическим действием, способны поддерживать воспаление и вызывать ремоделирование (Eddahibi S, Chaouat А, 2006; Papaioannou AI, 2006; Tuder RM, 2008; Геренг E.A., 2011), осложняя течение БА (рис. 9). Таким образом, дифференцированные в присутствии высоких концентраций аденозина ДК могут в значительной степени опосредовать развитие и поддержание воспаления.

В соответствии с целью и задачами, поставленными в исследовании, было проведено компьютерное моделирование взаимодействия АР типа А2в с его известными агонистами и антагонистами.

Установлено, что активаторы и ингибиторы образуют водородные связи преимущественно с несколькими остатками аминокислот из множества остатков, находящихся в сайте связывания, причем некоторые остатки обладают сродством как к активаторам, так и к ингибиторам: А1а82, Glul74, Asnl86, Asn254. Помимо этого, активаторы образуют водородные связи с аминокислотными остатками Ile67, Leu81, Cysl71, Phel73, Glul75, Val250, a ингибиторы образуют водородные связи с остатками А1а60, А1а64, Ser68, Thr89, Ser92, Arg269, Ser279, His280, Ser283 (рис. 10).

2% 2%

Рис. 10. Процентное соотношение аминокислотных остатков аденозииового рецептора типа А2в, образующих водородные связи: с активаторами - слева, с ингибиторами - справа.

Взаимодействие Ser283 преимущественно с ингибиторами согласуется с данными компьютерного моделирования взаимодействия АР типа Л2А, имеющего сходное с Л2В строение, с активаторами и ингибиторами (Ijzerman АР, 1994).

Выяснено, что активаторы образуют водородные связи с остатком аминокислоты 11е67 чаще, чем ингибиторы. Phel73 и Glul74 также чаще связываются с активаторами. Роль данных аминокислотных остатков в активации АР типов Л,, А2а, А3 в выполненных ранее работах не была установлена (Jiang Q, 1996). Взаимодействие Ile67, Phel73 и Glul74 преимущественно с активаторами обнаружено впервые. Возможно, именно они в первую очередь ответственны за активацию АР типа А2В-

Внесение мутации первого типа не привело к статистически значимым различиям в образовании водородных связей в лиганд-связывающем центре рецептора.

Внесение мутации второго типа почти не приводило к статистически значимым различиям в образовании водородных связей в лиганд-связывающем центре рецептора. Действительно, ни одна из произведенных аминокислотных замен не затронула лиганд-связывающий центр. Единственное статистически значимое следствие замены - отсутствие связывания с 11е67 (рис. 11). Вероятно, смена аминокислот вне лиганд-связывающего uefrrpa, тем не менее, слегка изменила его конформацшо в аллостерической манере, приведя к изменению характера связывания лигандов с аминокислотным остатком Пе67.

Дикий тип

Н мутация

д :

лй« 1

■¡■¡Г

VsS25C __—-2% AsolS6 _/ 2% SUs

Ser283 Уисс^кой

HisiSO

Рис. И. Процентное отношение образования водородных связей с различными аминокислотными остатками при взаимодействии лигандов с А2В рецептором дикого типа (слева) и с несущим мутацию второго типа рецептором А2В (справа).

Одна из замен, 1,уз269->-Аг£269, характерная для мутации второго типа, затронула лиганд-связывающий центр. Однако такая замена не привела к

изменению связывания с остатком Arg269 (рис. 11), вероятно, по причине того, что положительно заряженный аминокислотный остаток был заменен на также положительно заряженный.

ВЫВОДЫ

1. При действии аналога зденозина NECA на дендритные клетки начального этапа их дифференцировки (у больных бронхиальной астмой, равно как и у практически здоровых доноров), наблюдается повышение количества бежа фактора роста эндотелия сосудов в культуральной среде указанных клеток, а также увеличение количества клеток с сочетанием рецепторов CDla' "°"CD14+CD209+. При этом в группе больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой количество пациентов с высоким индивидуальным ответом дендритных клеток на аналог аденозина, выраженном в NECA-зависимом увеличении накопления клеток с сочетанием рецепторов CDla" /towCD14+CD209+, в 2,5 раза больше по сравнению с группой здоровых доноров. В группе больных тяжелой бронхиальной астмой число пациентов с высоким индивидуальным ответом дендритных клеток на NECA больше в 3,3 раза по сравнению с группой здоровых доноров.

2. Стимуляция аналогом аденозина (NECA) дендритных клеток начального этапа их дифференцировки (полученных от больных бронхиальной астмой, но не от практически здоровых доноров), приводит к повышению в этих клетках количества мРНК аденозинового рецептора типа А2Л.

3. Действие аналога аденозина (NECA) на дендритные клетки (полученные от практически здоровых доноров, но не от больных бронхиальной астмой) на начальном этапе их дифференцировки приводит к понижению секреции интерлейкина 8 этими клетками. При этом в дендритных клетках, полученных от больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой, NECA вызывает повышение количества мРНК интерлейкина 8.

4. Дендритные клетки начального этапа их дифференцировки, в которых наиболее сильно повышено число клеток с профилем CDla"/lowCD14+CD209+ в ответ на стимуляцию NECA, характеризуются более значительным увеличением количества мРНК аденозиновых рецепторов типа А2д при стимуляции.

5. В результате компьютерного моделирования установлено, что часть аминокислотных остатков лиганд-связывающего центра аденозинового рецептора типа А2В (TIe67, Phel73 и Glul74) образует водородные связи с активаторами аденозиновых рецепторов.

Практические рекомендации:

1. Установленная в ходе исследования ассоциация активации аденозиновых рецепторов на дендритных клетках моноцитарного происхождения на раннем сроке их диф ференцировки (38 часов) с повышенной секрецией фактора роста эндотелия сосудов этими клетками у больных легкой, среднетяжелой и тяжелой бронхиальной астмой, а также у практически здоровых людей, позволяет рекомендовать к применению антагонисты аденозиновых рецепторов для ограничения степени активности воспаления и ремоделирования.

2. С целью поиска новых молекулярных мишеней, ингибирование которых приведет к понижению активности воспаления и ремоделирования при бронхиальной астме, следует изучить внутриклеточные сигнальные пути, связывающие актавацшо аденозиновых рецепторов на дендритных клетках и секрецию ими фактора роста эндотелия сосудов.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование взаимодействия лигандов с аденозиновыми рецепторами типа А2В in silico // Вестник НГУ. Серия Биология, Клиническая медицина. - 2010. -Т. 8, 1. - С. 11-16 (Соавт. Ивлев И. В., Королева Ю. А., Рыжов С. В., Шилов Б. В., Серебров В. Ю., Сазонов А. Э.).

2. Аденозин-зависимая регуляция экспрессии паракринных факторов в моноцитах венозной крови человека // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - Ni 3. - С. 54-62 (Соавт. Рыжов С. В., Юрьева К.С., Короткая Е.В., Салтыкова И.В., Яковлева Ю.А., Куликов Е.С., Федорова О.С., Кремер Е.Э., Фаттахов Н.С., Сазонов А. Э.).

3. Исследование in silico влияния аминокислотных замен в аденозиновом рецепторе подтипа А2В на его взаимодействие с лигандами // Сборник статей XI Конгресса Молодых ученых с международным участием «Науки о человеке». -Томск. -2010. - С. 108-109 (Соавт. Королева Ю.А.).

4. Секреция паракринных факторов стимулированными аналогом аденозина дендритными клетхами человека // Сборник статей XII Конгресса Молодых ученых с международным участием «Науки о человеке». - Томск. - 2011. - С. 21-23 (Соавт. Юрьева К.С., Яковлева Ю.А., Короткая Е.В., Сазонов А.Э., Рыжов C.B.).

5. Экспрессия мРНК аденозиновых рецепторов и паракринных факторов на начальном этапе дифференцировки дендритных клеток у больных бронхиальной астмой // Сборник статей III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск. - 2011. - С. 41-43 (Соавт. Короткая Е.В., Яковлева Ю.А., Юрьева К.С., Салтыкова И.В., Куликов Е.С., Федорова О.С., Сазонов А.Э., Рыжов C.B.).

6. Роль аденозиновых рецепторов в дифференцировке дендритных клеток с провоспалительньши свойствами // Сборник статей III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза гиповых патологических процессов». - Новосибирск. - 2011. - С. 54-55 (Соавт.

Яковлева Ю.А., Короткая Е.В., Юрьева К.С., Салтыкова И.В., Куликов Е.С., Федорова О.С., Сазонов А.Э., Рыжов C.B.).

7. Антигенный фенотип и секреция паракринных факторов на начальном этапе дифференцировки дендритных клеток больных бронхиальной астмой // Сборник тезисов III Международной Студенческой Научной Конференции с участием молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины", посвященной 50-летию Медицинского Факультета РУДН. - Москва. - 2011. - С. 178-179 (Соавт. Яковлева Ю.А., Короткая Е.В., Юрьева К.С., Салтыкова И.В., Куликов Е.С., Федорова О.С.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АР - аденозиновый рецептор

АТФ - аденозинтрифосфат

ДК - дендритные клетки

БА - бронхиальная астма

ИЛ-4 - интерлейкин 4

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ИЛ-6 - интерлейкин 6

ИЛ-8 - интерлейкин 8

ФРЭС - фактор роста эндотелия сосудов

СибГМУ - Сибирский государственный медицинский университет

РУДН - Российский университет дружбы народов

ЦНИЛ - Центральная научно-исследовательская лаборатория

ФЦП - Федеральная целевая программа

GINA - Global Initiative for Asthma

ЭБС - Эмбриональная бычья сыворотка

NCBI — National Center for Biotechnology Information

RCSB PDB - Research Collaboration for Structural Biology Protein Data Bank

NECA - N-этилкарбоксамидоаденозин

MHK ПК — мононуклеарные клетки периферической крови

DMSO - диметилсульфоксид

ИЛ-1р - интерлейкин ip

ИЛ-10 - интерлейкин 10

ИЛ-12 - интерлейкин 12

ИНФу - интерферон гамма

ФНОа - фактор некроза опухоли альфа

ИЛ-4 Р - рецептор интерлейкина 4

ИЛ-6 Р - рецептор интерлейкина 6

ИЛ-8 Р - рецептор интерлейкина 8

ГМ-КСФ Р - рецептор гранулоцитарно-макрофагального

колониестимулирующего фактора

НГУ - Новосибирский государственный университет

CD - cluster of differentiation

IgE - иммуноглобулин E

Arg - аминокислота аргинин или же ее остаток

Glu - глутаминовая кислота или же ее остаток

Thr - аминокислота треонин или же ее остаток

Не - аминокислота изолейции или же ее остаток

Val - аминокислота валин или же ее остаток

Asn - аминокислота аспарагин или же ее остаток

Ser - аминокислота серии или же ее остаток

Cys - аминокислота цистеин или же ее остаток

Ala - аминокислота аланин или же ее остаток

Phe - аминокислота фенилаланин или лее се остаток

Leu - аминокислота лейцин или же ее остаток

His - аминокислота гистидин или же ее остаток

Отпечатано в ООО "Байер" . Томск, Московский тракт, 2г. Тел./факс: 52-98-11 Тираж 50 экз. Заказ №296 от 03 ноября 2011 г.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Горемыкин, Константин Викторович

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Роль аденозиновых рецепторов в процессе воспаления.

1.1.1. Функции аденозина в организме.

1.1.2. Строение и функции аденозиновых рецепторов.

1.1.2.1. Классификация аденозиновых рецепторов.

1.1.2.2. Эффекты активации аденозиновых рецепторов типа Ai.

1.1.2.3. Эффекты активации аденозиновых рецепторов типа А2а.

1.1.2.4. Эффекты активации аденозиновых рецепторов типа Аз.

1.1.2.5. Эффекты активации аденозиновых рецепторов типа А2в.

1.1.3. Роли аденозиновых рецепторов при различных патологических состояниях и болезнях

1.1.3.1. Роли аденозиновых рецепторов при ишемии.

1.1.3.2. Роли аденозиновых рецепторов при артрите.

1.1.3.3. Роли аденозиновых рецепторов при сепсисе.

1.1.3.4. Роли аденозиновых рецепторов при воспалительных болезнях кишечника.

1.1.3.5. Роли аденозиновых рецепторов в развитии и поддержании бронхиальной астмы.

1.1.4. Лиганды аденозиновых рецепторов.

1.2. Дендритные клетки: разновидности и роль в воспалении.

1.2.1. Классификации моноцитов и дендритных клеток.

1.2.1.1. Субпопуляции моноцитов.

1.2.1.2. Субпопуляции дендритных клеток.

1.2.3. Наличие аденозиновых рецепторов на моноцитах.

1.2.4. Наличие аденозиновых рецепторов на дендритных клетках.

1.3. Бронхиальная астма как пример воспалительного процесса.

1.3.1. Недостатки современных схем лечения бронхиальной астмы при помощи фармацевтических препаратов.

1.3.2. Биохимические факторы развития бронхиальной астмы.

1.3.3. Участие клеток воспаления в развитии бронхиальной астмы.

1.3.4. Роль медиаторов воспаления при бронхиальной астме.

1.4. Использование компьютерного моделирования для изучения лиганд-рецепторных взаимодействий.

1.4.1. Компьютерное молекулярное моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий.

1.4.1.1. Квантовая механика.

1.4.1.2. Молекулярная механика.

1.4.2. Компьютерные модели молекул белка.

1.4.3. Компьютерные модели аденозиновых рецепторов и их применение для изучения взаимодействия с известными лигандами.

1.4.4. Построение компьютерной модели аденозинового рецептора типа Агв.

1.4.5. Построение компьютерных моделей низкомолекулярных веществ.

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Организация исследования.

2.2. Клиническая характеристика обследованных пациентов.

Критерии включения во все группы:.

Критерии включения в группу 1 (больные БА легкой и среднетяжелой степеней тяжести):.

Критерии включения в группу 2 (больные БА тяжелой степени тяжести):.

Критерии включения в группу 3 (контрольная):.

Критерии исключения для всех групп:.

2.3. Лабораторные методы культивирования и исследования дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови людей, страдающих бронхиальной астмой различной степени тяжести, а также практически здоровых людей.

2.3.1. Взятие периферической крови у обследуемых.

2.3.2. Выделение мононуклеаров из периферической крови обследуемых на градиенте плотности фиколла.

2.3.3. Выделение моноцитов из мононуклеарной фракции.

2.3.4. Контроль чистоты выделения моноцитов — С014+ клеток.

2.3.5. Дифференцировка моноцитов в дендритные клетки in vitro.

2.3.6. Определение экспрессии клеточных маркеров CDla, CD14, CD209.

2.3.7. Выделение суммарной РНК клетки (общей РНК).

2.3.8. Синтез комплементарной ДНК (кДНК).

2.3.9. Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени.

2.3.10. Определение синтеза ИЛ-8, ИЛ-6, ФРЭС, культурами дендритных клеток посредством твердофазного иммуноферментного анализа.

2.4. Компьютерные методы исследования.

2.4.1. Аминокислотные последовательности рецепторов.

2.4.2. Моделирование рецепторов по гомологии при помощи программного пакета MODELLER.

2.4.3. Построение и оптимизация трехмерных компьютерных моделей низкомолекулярных веществ - лигандов аденозинового рецептора.

2.4.4. Расчет лиганд-рецепторных взаимодействий.

2.5. Методы статистической обработки полученных результатов.

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1. Цитофлуориметрическая характеристика моноцитарной фракции, выделенной из периферической крови обследуемых.

3.2. Экспрессия антигенного фенотипа (CDla'CD14+CD209+) на дендритных клетках обследуемых.

3.3. Уровни мРНК аденозиновых рецепторов типов Аь Агд» Агв» Аз и паракринных факторов (интерлейкина 6, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов) в дендритных клетках обследуемых.

3.4. Уровни паракринных факторов (интерлейкина 6, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов) в культуральной среде дендритных клеток, полученных от обследуемых.

3.5. Сопоставление количеств мРНК аденозиновых рецепторов в дендритных клетках с функциональными характеристиками обследуемых (больных бронхиальной астмой).

3.6. Сопоставление уровней мРНК паракринных факторов в дендритных клетках с характеристиками обследуемых, больных бронхиальной астмой.

3.7. Сопоставление количества паракринных факторов в культуральной среде дендритных клеток с функциональными характеристиками обследованных (больных бронхиальной астмой)

3.8. Уровни мРНК аденозиновых рецепторов в дендритных клетках больных бронхиальной астмой с различной чувствительностью к триггерным факторам.

3.9. Уровни мРНК паракринных факторов (интерлейкина 6, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов) в дендритных клетках больных бронхиальной астмой с различной чувствительностью к триггерным факторам.

3.10. Концентрации паракринных факторов (интерлейкина 6, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов) в кулыуральной среде дендритных клеток, полученных на основе крови больных бронхиальной астмой с различной чувствительностью к триггерным факторам.

3.11. Взаимодействие активаторов и ингибиторов аденозиновых рецепторов с различными аминокислотами лиганд-связывающего центра аденозинового рецептора подтипа Агв.

3.11.1. Модели лигандов - активаторов и ингибиторов аденозиновых рецепторов.

3.11.2. Модели аденозиновых рецепторов подтипа Агв.

3.11.3. Компьютерное моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий.

Глава 4. Обсуждение результатов исследований

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль аналога аденозина в изменении фенотипических свойств дендритных клеток человека моноцитарного происхождения при бронхиальной астме"

Актуальность проблемы

В настоящий момент повышенный интерес исследователей во всем мире вызывают аденозин и аденозиновые рецепторы (АР) как ключевые регуляторы множества тканевых функций.

Аденозин - эндогенный нуклеозид, продукт метаболизма АТФ [Kunapuli S. Р., 1998], в повышенных количествах высвобождается из клеток при повреждении тканей в различных ситуациях, включая гипоксию и воспаление [Fredholm В. В. et al, 2007]. Действуя паракринно на АР типов Аь А2а, А2в> А3 окружающих клеток, аденозин вызывает ряд эффектов, как про-, так и противовоспалительного характера (выброс медиаторов воспаления, изменение направления дифференцировки клеток). Тем самым,, аденозин является своего рода «сигнализацией», сообщающей окружающим клеткам о патологическом состоянии ткани. В ответ на сигнал клетки .развивают

V't/1 <' приспособительные реакции [Hasko G., 2008]. ffe

Дисбаланс в системе взаимоотношений аденозин -!^АР/ может

- к« . способствовать возникновению и развитию ряда различных заболевании с резко выраженным воспалительным компонентом в патогенезе: бронхиальной астме (БА) [Spicuzza L. et al, 2006], ревматоидному артриту [Montesinos М. С., 2007], болезни Крона [Kolachala V. L., 2008;, Hasko G., 2008].

Для установления механизмов развития процесса воспаления одним из центральных звеньев является рецепторная передача сигнала. Важным моментом является установление связи между активностью тех или иных рецепторов на клетках иммунной системы с их дифференцировкой, а также секрецией ими про- и противовоспалительных медиаторов. Важнейшими клетками - участниками воспалительных реакций, наряду с моноцитами, макрофагами, лимфоцитами и прочими клетками иммунной системы, являются дендритные клетки (ДК) [Duez С. et al, 2006; Fransen J. H. et al,

2010]. Данные клетки для исследований in vitro получают главным образом из моноцитов путем культивирования с интерлейкином 4 (ИЛ-4) и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ), что соответствует происходящему in vivo процессу [Peters J. Н., 1993; Yona S., 2010; Clark G., 2010].

Влияние активации АР на дифференцировку моноцитов в ДК (в том числе: изменение уровней мРНК АР разных типов, мРНК цитокинов, поверхностной экспрессии рецепторов, секреции цитокинов в окружающие клетки среду) на данный момент изучено слабо [Hasko G., 2008; Novitskiy S. V. et al, 2008].

ДК моноцитарного происхождения, дифференцированные в присутствии аденозина, никогда на начальном этапе их дифференцировки ранее не изучались, тогда как этот этап во многих случаях характеризуется i высокой продукцией провоспалительных цитокинов [Novitskiy S. V. et al, tif i i X

2008]. Вместе с тем, было показано, что действие высоких концентраций

Mt*f(J<' аденозина (30 мкМ) на АР типа А2в при дифференцировке моноцитов в ДК nf f-f. приводит к формированию на шестые сутки клеток, характеризующихся i одновременным присутствием как рецепторов, свойственных для ДК, так и рецепторов, свойственных для моноцитов. Также для этих клеток была

V/ характерна высокая продукция интерлейкина 6 (ИЛ-6), интерлейкина 8 (ИЛ-8) и фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) (значительно более высокая, по сравнению как с «обычными» ДК, дифференцированными в отсутствие аденозина, так и по сравнению с моноцитами) [Novitskiy S. V. et al, 2008]. Перечисленные цитокины обладают провоспалительным и фибротическим действием, способны поддерживать воспаление и вызывать ремоделирование [Eddahibi S. et al, 2006; Papaioannou A. I., 2006; Tuder R. M., 2008; Геренг E. A., 2011]. Таким образом, дифференцированные в присутствии высоких концентраций аденозина ДК могут в значительной степени опосредовать развитие и поддержание воспаления.

Для изучения процесса воспаления используют экспериментальные модели, реализованные на животных Ц^апа А. е1 а1, 2005; гаупа§е1с!тоу Я. е1 а1, 2010; Ре&ога М. е1 а1, 2011]. В то же время, данные, полученные на таких моделях, нельзя переносить на человека, так как иммунная система человека имеет существенные отличия от иммунной системы любого животного [Наэко в., 2008]. Течение воспалительных процессов у человека изучают в рамках заболеваний, в которых воспалительный компонент является ведущим: хронической обструктивной болезни легких, бронхиальной астмы, ревматоидного артрита, болезни Крона.

Изучение связи активации аденозиновых рецепторов на дендритных клетках человека и секреции плейотропных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8 и ФРЭС) этими клетками поможет раскрыть фундаментальные механизмы развития воспаления и обозначить критические точки механизмов, необходимых для разработки лекарственных препаратов. Такое исследование будет иметь большое значение для медико-биологической науки. -г

При высоких концентрациях аденозина, наблюдаемых <7 в очаге воспаления (до ~30-100 мкМ), свою активность проявляют ; не только высокоаффинные рецепторы типов Аь А2а, Аз, но и низкоаффинные - типа А2в- Интерес представляют многие аспекты функционирования данных рецепторов, в том числе механизмы взаимодействия аденозина и других известных лигандов с лиганд-связывающим центром АР А2в- Расчеты лиганд-рецепторных взаимодействий удобно производить при помощи компьютерного моделирования [Вахеуашз А. Б., 2001]. Наименее затратными и в то же время качественными методами расчетов являются молекулярно-механические методы [Беленикин М. С., 2002]. Построение моделей АР типа Агв возможно сделать на основании моделирования по гомологии с рецептором типа А2а (существует точная компьютерная модель последнего, полученная при помощи рентгеноструктурной кристаллографии) |7аако1а V. Р., 2008].

Цель: Изучить роль аналога аденозина в изменении фенотипических свойств дендритных клеток человека моноцитарного происхождения при бронхиальной астме.

Задачи исследования:

1. Оценить количества CDla, CD14, CD209 на дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции аналогом аденозина.

2. Исследовать уровни мРНК аденозиновых рецепторов (Аь Агд, А2в> А3) в дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции аналогом аденозина.

3. Установить количество мРНК интерлейкина 6, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов в дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции У аналогом аденозина, а также концентрации этих цитокинов в культуральной среде данных клеток.

1. >

4. Оценить взаимосвязи между количеством CDla, CD14, CD209 на дендритных клетках, содержанием в данных клетках мРНК аденозиновых рецепторов (А1} А2а, Агв5 Аз), интерлейкина, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов, количеством белка этих цитокинов в среде указанных клеток и интенсивностью воспалительного процесса у больных бронхиальной астмой.

5. При помощи компьютерного моделирования изучить взаимодействие аминокислотных остатков, образующих лиганд-связывающий центр аденозинового рецептора А2в, с известными активаторами и ингибиторами аденозиновых рецепторов.

Научная новизна работы

Впервые дана функциональная характеристика дифференцированных в присутствии аналога аденозина дендритных клеток моноцитарного происхождения человека на начальной стадии их дифференцировки.

Получены данные о влиянии аналога аденозина на уровни экспрессии поверхностных маркеров (CDla, CD14, CD209) на ДК, количестве мРНК аденозиновых рецепторов (Аь А2а, А2В, А3) и цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8, ФРЭС) в ДК, а также о содержании белка этих цитокинов в культуральной среде ДК.

Установлены взаимосвязи между интенсивностью воспалительного процесса при бронхиальной астме и вышеперечисленными показателями.

Впервые обнаружены межиндивидуальные различия в степени чувствительности дендритных клеток к действию аналога аденозина (NECA). Чувствительность к NECA выражается в аденозин-зависимом увеличении накопления клеток с сочетанием рецепторов CD 1 a'/l0WCD 14+CD209+. Частота встречаемости лиц с высокой чувствительностью ДК к NECA зависит от

1 (■[ I ' степени тяжести бронхиальной астмы. '</ ■ »i" *

• > 4 Ч V V

Отмеченное в исследовании повышение уровня мРНК АР, типа А2а у больных Б А под действием NECA в научной литературе f ранее не встречалось.

При помощи компьютерного моделирования установлено, что активаторы образуют водородные связи с остатками аминокислот 11е67, Phel73 и Glul74 чаще, чем ингибиторы. Взаимодействие этих аминокислотных остатков преимущественно с активаторами обнаружено впервые. Возможно, именно они в первую очередь ответственны за активацию АР типа А2в

Научно-практическая значимость работы

Полученные сведения о влиянии аналога аденозина на фенотипические и функциональные характеристики дендритных клеток моноцитарного происхождения на ранней стадии их дифференцировки могут быть использованы при разработке новых противовоспалительных средств -блокаторов аденозиновых рецепторов, а также при разработке новых схем лечения на основании таких средств-блокаторов.

Положения, выносимые на защиту

1. Дендритные клетки человека моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки обладают различной способностью к изменению фенотипа под действием аналога аденозина - NECA, зависящей от наличия или отсутствия БА, степени тяжести БА и индивидуальных особенностей. Изменение фенотипа под действием NECA у больных БА отличается от такового у практически здоровых людей повышением

5 h Í количества мРНК аденозинового рецептора типа А2а; У больных БА1 легкой и средней степеней тяжести - повышением количества мРНК интерлейкина 8; у практически здоровых людей происходит понижение i секреции интерлейкина 8.

2. Аминокислотные остатки Ile67, Phel73 и Glul74 лиганд-связывающего центра аденозинового рецептора типа А2в образуют водородные связи с активаторами аденозиновых рецепторов, в то время как для ингибиторов не удается выделить специфичные к ним аминокислотные остатки.

Апробация работы

Материалы данного исследования доложены и обсуждены на научных семинарах кафедры биохимии и молекулярной биологии СибГМУ (2011 г.); на научных семинарах центральной научно-исследовательской лаборатории

СибГМУ (2009 - 2011 гг.); на XI и XII научных конференциях (2010 и 2011 гг.) «Конгресс Молодых ученых с международным участием «Науки о человеке»»; на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (2011); на III Международной Студенческой Научной Конференции с участием молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины", посвященной 50-летию Медицинского Факультета РУДН (2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ в центральной и местной печати, из них 2 - в журналах из списка ВАК.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Горемыкин, Константин Викторович

ВЫВОДЫ

1. При действии аналога аденозина NECA на дендритные клетки начального этапа их дифференцировки (у больных бронхиальной астмой, равно как и у практически здоровых доноров), наблюдается повышение количества белка фактора роста эндотелия сосудов в кулыуральной среде указанных клеток, а также увеличение количества клеток с сочетанием рецепторов CD1 а"ЛстСО 14+CD209+. При этом в группе больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой количество пациентов с высоким индивидуальным ответом дендритных клеток на аналог аденозина, выраженном в NECA-зависимом увеличении накопления клеток с сочетанием рецепторов CDla"/lowCD14+CD209+, в 2,5 раза больше по сравнению с группой здоровых доноров. В группе больных тяжелой бронхиальной астмой число пациентов с высоким индивидуальным ответом дендритных клеток на NECA больше в 3,3 раза по сравнению с группой здоровых доноров.

2. Стимуляция аналогом аденозина (NECA) дендритных клеток начального этапа их дифференцировки (полученных от больных бронхиальной астмой, но не от практически здоровых доноров), приводит к повышению в этих клетках количества мРНК аденозинового рецептора типа а2а.

3. Действие аналога аденозина (NECA) на дендритные клетки (полученные от практически здоровых доноров, но не от больных бронхиальной астмой) на начальном этапе их дифференцировки приводит к понижению секреции интерлейкина 8 этими клетками. При этом в дендритных клетках, полученных от больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой, NECA вызывает повышение количества мРНК интерлейкина 8.

4. Дендритные клетки начального этапа их дифференцировки, в которых наиболее сильно повышено число клеток с профилем CD 1 a"/IowCD 14+CD209+ в ответ на стимуляцию NECA, характеризуются более значительным увеличением количества мРНК аденозиновых рецепторов типа А2а при стимуляции.

5. В результате компьютерного моделирования установлено, что часть аминокислотных остатков лиганд-связывающего центра аденозинового рецептора типа А2в (Не67, Phel73 и Glul74) образует водородные связи с активаторами аденозиновых рецепторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе был использован способ получения моноцитов из крови при помощи разделения на градиенте плотности Фиколла и Перколла. Это позволило выделить моноциты с чистотой 74,2±5,5%. Выделенная фракция почти не содержала лимфоцитов.

При культивировании моноцитов в среде с добавлением ИЛ-4 и ГМ-КСФ в течение 38 часов они дифференцировались в дендритные клетки с преобладающим фенотипом CDla+CD14"CD209+. Известно, что при многих заболеваниях с воспалительным компонентом (в том числе при бронхиальной астме) в тканях наблюдаются повышенные концентрации аденозина. Добавление стабильного аналога аденозина - NECA при культивировании дендритных клеток приводило к появлению у части из них альтернативного фенотипа CD1 a/l0WCD 14+CD209+, что согласуется с проведенными ранее исследованиями на дендритных клетках с большим сроком культивирования (5-6 суток). Из литературных источников известно, что дендритные клетки с таким фенотипом характеризуются повышенной уровнями производимых ИЛ-6, ИЛ-8, ФРЭС. Этот феномен наблюдался и в нашем исследовании уже после 38 часов культивирования. Дендритные клетки с фенотипом CD 1 a'/lowCD 14+CD209+ появлялись и в культурах, не подвергавшихся действию NECA, что вполне объяснимо. Известно, что, помимо аденозина и NECA, появление дендритных клеток с указанным фенотипом вызывают активаторы аденилатциклазы: простагландин Е2, ИЛ-6, ИЛ-ip, холерный токсин, форсколин. В данном исследовании во всех культурах дендритных клеток наблюдалась спонтанная продукция ИЛ-6 -вероятно, по причине активации моноцитов/дендритных клеток в результате адгезии к пластику культуральных планшетов. Очевидно, что ИЛ-6 мог вызывать изменение фенотипа части анализируемых клеток. При этом наблюдался также и эффект NECA на изменение фенотипа: наблюдалось статистически значимое повышение процентного содержания клеток с альтернативным фенотипом под действием этого аналога аденозина в группе практически здоровых людей и в группе больных бронхиальной астмой легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой.

Существуют литературные данные, согласно которым эффект аденозина и NECA на изменение сочетания поверхностных маркеров на дендритных клетках с CDla+CD14-CD209+ на CDla"/lowCD14+CD209+ обусловлен активацией аденозинового рецептора типа А2В. Полученные в нашем исследовании данные позволяют предположить, что данный феномен может быть обусловлен также и действием аденозинового рецептора типа А2а. Это предположение требует проверки в экспериментах с селективными активаторами и ингибиторами аденозинового рецептора типа А2д.

Внутри всех анализируемых групп (больные БА разных степеней тяжести, практически здоровые люди) наблюдались значительные межиндивидуальные различия в приросте количества ДК с альтернативным фенотипом под действием NECA. На основании различий в приросте все 40 обследуемых, вне зависимости от наличия бронхиальной астмы и ее тяжести, были разделены на 2 группы: «слабо реагирующие на NECA» и «сильно реагирующие на NECA». Было установлено, что культуры клеток выделенных групп различаются не только по выраженности изменений фенотипа, но и по разностям количеств мРНК АР типа А2а и ИЛ-6 (таб. 7). По разностям уровней белка какого-либо из цитокинов различий не наблюдалось.

Следует отметить, что в данном исследовании под действием NECA уровень мРНК АР типа А2а повышался в ДК больных бронхиальной астмой -как легкой и средней, так и тяжелой степени (таб. 5), но не у практически здоровых людей. Повышение уровня мРНК АР типа А2а (в группах 1 и 2 - у обследуемых с активно протекающим воспалительным процессом при БА) под действием аналога аденозина NECA обнаружено впервые.

Известно, что активация АР типа А2а (в том числе на дендритных клетках) обладает защитным действием при патологических процессах воспалительного генеза. Возможно, отмеченное в данном исследовании повышение уровня мРНК АР типа А2а происходит уже после повышения уровня мРНК ИЛ-6, ИЛ-8, ФРЭС, после усиления секреции белка этих цитокинов и является реакцией на эти события: ограничивает провоспалительную активность ДК и, таким образом, является защитным механизмом, действующим угнетающе на распространение воспаления. Подобные предположения относительно роли аденозинового рецептора типа А2д, на клетках иммунной системы, уже выдвигались ранее несколькими исследователями.

Уровни мРНК АР типа А2а в нашем исследовании превышали уровни мРНК АР типа А2в как по всем 40 обследуемым в сумме, так и по большинству групп в отдельности. В исследованиях других коллективов на дендритных клерсах, напротив, наблюдалось преобладание рецептора типа А2в над рецептором типа А2а - как при стимуляции аденозином или NECA, так и без стимуляции.

Активация А2В на иммунных клетках, как правило, приводит к усилению секреции ИЛ-6 и ИЛ-8, а также ФРЭС. Активация А2А, напротив, понижает продукцию ИЛ-6 и ИЛ-8. Отрицательное действие активации А2А на количество секретируемого ФРЭС в литературных источниках не упоминается. Напротив, для макрофагов показано усиление секреции ФРЭС, опосредованное этим рецептором.

Полученные в нашем исследовании результаты согласуются с приведенными фактами о регуляции ИЛ-6, ИЛ-8 и ФРЭС аденозиновыми рецепторами типов А2А и А2в.

Содержание белка ИЛ-6 и ИЛ-8 не была повышено ни в одной из исследуемых групп: видимо, преобладание мРНК АР А2а над мРНК АР А2В приводило к преобладанию ингибирующего эффекта А2А на продукцию этих цитокинов над активирующим эффектом А2В.

Концентрации ФРЭС без стимуляции NECA были невысоки во всех исследуемых группах и колебались в пределах 0,01-0,35 нг/мл. Стимуляция NECA приводила к многократному увеличению секреции ФРЭС - до 0,1-0,65 нг/мл. Вероятно, аденозиновые рецепторы А2А и А2в обладают синергичным действием на секрецию ФРЭС дендритными клетками.

В соответствии с целями, поставленными в исследовании, было проведено компьютерное моделирование взаимодействия АР типа А2в с его известными агонистами и антагонистами.

Было установлено, что активаторы и ингибиторы образуют водородные связи преимущественно с несколькими аминокислотами из множества аминокислот, находящихся в сайте связывания, причем некоторые аминокислоты обладают сродством как к активаторам, так и к ингибиторам: Ala82, Glu 174, Asnl86, Asn254. Помимо этого, активаторы образуют водородные связи с аминокислотами Ile67, Leu81, Cysl71, Phel73, Glu 175, Val250, a ингибиторы образуют водородные связи с аминокислотами А1а60, Ala64, Ser68, Thr89, Ser92, Arg269, Ser279, His280, Ser283.

Взаимодействие Ser283 преимущественно с ингибиторами согласуется с данными компьютерного моделирования взаимодействия аденозинового рецептора типа А2А, имеющего сходное с А2в строение, с активаторами и ингибиторами.

Выяснено, что активаторы образуют водородные связи с аминокислотой Ие67 чаще, чем ингибиторы. Phel73 и Glu 174 также чаще связываются с активаторами. Роль данных аминокислот в активации аденозиновых рецепторов типов Аь А2А, Аз в выполненных ранее работах не была установлена. Возможно, именно они в первую очередь ответственны за активацию аденозинового рецептора типа А2в.

Внесение мутации первого типа не привело к статистически значимым различиям в образовании водородных связей в лиганд-связывающем центре рецептора.

Внесение мутации второго типа почти не приводило к статистически значимым различиям в образовании водородных связей в лиганд-связывающем центре рецептора. Действительно, ни одна из произведенных аминокислотных замен не затронула лиганд-связывающий центр. Единственное статистически значимое следствие замены - отсутствие связывания с Ие67. Вероятно, смена аминокислот вне лиганд-связывающего центра, тем не менее, слегка изменила его конформацию в аллостерической манере, приведя к изменению характера связывания лигандов с аминокислотой Ие67.

Одна из замен, Ьуз269—>Аг§269, характерная для мутации второго типа, затронула лиганд-связывающий центр. Однако такая замена не привела к изменению связывания с остатком Аг§269 (рис. 8), вероятно, по причине того, что положительно заряженная аминокислота была заменена также на положительно заряженную.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Горемыкин, Константин Викторович, Новосибирск

1. Азимов, Р. И. Влияние комплексной терапии на показатели функции внешнего дыхания и диффузионную способность легких у лиц пожилого возраста / Р. И. Азимов // Фундаментальные исследования. -2009.-№7-С. 5-12.

2. Беленикин, М. С. Молекулярный докинг лигандов глутаматных рецепторов / М. С. Беленикин, А. Маккиаруло, Г. Костантино // Вестник Московского Университета. Химия. -2002. Т.43, № 4. - С. 221-230.

3. Бельтюков, Е. К. Медико-экономическая эффективность современных технологий диагностики и лечения бронхиальной астмы на региональном и локальном уровнях (Экспериментальное исследование) : автореф. дис. докт. мед. наук/Е. К. Бельтюков. -М., 2003. -48 с.

4. Галактионов, В. Г. Иммунология / В. Г. Галактионов. М. : Академия, 2004. - 520 с.

5. Геренг, Е. А. Молекулярные маркеры воспаления в бронхиальном содержимом при различных фенотипах тяжелой бронхиальной астмы / Е. А. Геренг, И. В. Суходоло, Р. И. Плешко и др // Бюллетень сибирской медицины. 2011. - № 3.

6. Гланц, С. А. Медико-биологическая статистика / С. А. Гланц. М.: Практика, 1998.-459 с.

7. Иванов, А. С. Интегральная платформа «От гена до прототипа лекарства» in silico и in vitro / А. С. Иванов, А. В. Веселовский, А. В. Дубанов и др // Российский химический журнал. 2006. - Т. L, № 2. -С. 18-35.

8. Иванов, А. С. Основные принципы молекулярного конформационного анализа для медико-биологов / А. С. Иванов // Биомедицинская химия. 2007. - Т. 53, № 6. - С. 713-728.

9. Наследникова, И. О. Молекулярные основы противовирусной стратегии организма / И. О. Наследникова, Н. В. Рязанцева, В. В. Новицкий Томск: Из-во Том. ун-та, 2005. - 128 с.

10. Ю.Овчаренко, С. И. Бронхиальная астма: диагностика и лечение / С. И. Овчаренко // Русский Медицинский Журнал. 2002. - Т. 10, № 17. - С. 766.

11. Федосеев, Г. Б. Бронхиальная астма / Г. Б. Федосеев. Санкт-Петербург: Медицинское информационное агентство, 1996. - 160 с.

12. Физиология человека : учебное пособие / ред.: Г. И. Косицкий. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1985. - 559 с.

13. Харкевич, Д. А. Фармакология: учебник для студентов медицинских вузов / Д. А. Харкевич. 9-е изд., перераб., доп. и испр. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 736 с.

14. Черняк, Б. А. Агонисты Ье1а2-адренергических рецепторов в терапии бронхиальной астмы: вопросы эффективности и безопасности / Б. А. Черняк, И. И. Воржева // Consilium Medicum. 2006. - Т. 8, № 10. - С. 15-18.

15. Чучалин, А.Г. Тяжелые формы бронхиальной астмы / А. Г. Чучалин // Тер. архив. 2003. -№ 3. - С. 5-10.

16. Babu, А. N. Microvascular destruction identifes murine allografts that cannot be rescued from airway fibrosis / A. N. Babu, T. Murakawa, J. M. Thurman et al // J. Clin. Invest. 2007. - Vol. 117, № 12. - P. 3774-3785.

17. Baggott, J. E. Urinary adenosine and aminoimidazolecarboxamide excretion in methotrexate-treated patients with psoriasis / J. E. Baggott, S. L. Morgan, W. M. Sams, J. Linden // Arch Dermatol. 1999. - Vol. 135, № 7. - P. 813817.

18. Barnias, G. Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease: current concepts / G. Bamias, F. Cominelli // Curr. Opin. Gastroenterol. 2007. -№23. -P. 365-369.

19. Berreiro, E. Dyspnoea at rest and at the end of different exercises in patients with near-fatal asthma / E. Barreiro, J. Gea, C.J. Sanjuas et al. // Eur.i Respir. J. 2004. - Vol. 24. - P. 219-225.

20. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom, C. J. Sol, M. M. Salimans et al // J. Clin. Microbiol. 1990. - № 3. -P. 495-503.

21. Boyum // Scandinavian journal of clin. lab. invest. 1968. - Vol. 21 (Suppl. ? 97).-P. 77.

22. Brooks, B. R. CHARMM a program for macromolecular energy,minimization and dynamics calculations / B. R. Brooks, R. E. Bruccoleri, B. D. Olafson et al // J Comp Chem. 1983, № 4. - P. 187.

23. Bucchioni, E. Adenosine 5'-monophosphate increases levels of leukotrienes in breath condensate in asthma / E. Bucchioni, Z. Csoma, L. Allegra et al // Respir. Med. 2004. - № 98. - P. 651-655.

24. Burrows, B. Association of asthma with serum IgE levels and skin-test reactivity to allergens / B. Burrows, F. D. Martinez, M. Halonen et al // N.

25. Engl. J. Med. 1989. - Vol. 320, № 5. -P. 271-277.f

26. Caux, C. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF alpha / C. Caux, B. Vanbervliet, C. Massacrier et al // J. Exp. Med. 1996. - № 184. - P. 695-706.f.