Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение эколого-физиологического влияния тучных клеток и нейронов интрамуральных ганглиев на сокращения гладкой мускулатуры трахеи и бронхов крыс

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Изучение эколого-физиологического влияния тучных клеток и нейронов интрамуральных ганглиев на сокращения гладкой мускулатуры трахеи и бронхов крыс"

На правах рукописи

Смирнова Любовь Евгеньевна

ИЗУЧЕНИЕ ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ВЛИЯНИЯ ТУЧНЫХ КЛЕТОК И НЕЙРОНОВ ИНТРАМУРАЛЬНЫХ ГАНГЛИЕВ НА СОКРАЩЕНИЯ ГЛАДКОЙ МУСКУЛАТУРЫ ТРАХЕИ И БРОНХОВ КРЫС

Специальности - 03.02.08 - Экология

03.03.01 - Физиология

15 АПР 2015

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

_ Петрозаводск - 2015

005567206

005567206

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии имени И. М. Сеченова Российской академии наук

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный педагогический университет имени А. И. Герцена», г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «5» мая 2015 г. в 11 часов в ауд. 117 на заседании диссертационного совета Д 212.190.01 при Петрозаводском государственном университете по адресу: 185910, Республика Карелия, г. Петрозаводск, пр. Ленина, д. 33, эколого-биологический факультет, тел. факс: 8(8142)763864.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Петрозаводского государственного университета http://www.petrsu.ru/, с авторефератом - на сайте http://vak.ed.gov.ru/ и http://www.petrsu.ru/

Автореферат разослан «03»_04_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Научные руководители: доктор биологических наук

Федин Анатолий Николаевич;

кандидат биологических наук, доцент Кирилина Валентина Михайловна

Официальные оппоненты: Илюха Виктор Александрович, доктор

биологических наук, доцент, ФГБУН Институт биологии Карельского научного центра РАН, лаборатория экологической физиологии животных, заведующий лабораторией; Хилков Тимур Николаевич, кандидат биологических наук, ФГБОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет», Медицинский институт, кафедра пропедевтики внутренних болезней и гигиены

канд. биол. наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

В условиях современной экологической обстановки все большее количество людей подвержено влиянию негативных факторов среды, способных привести к нарушению функции дыхания и развитию патологии респираторного тракта. Такие заболевания как бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) во многом связаны с воздействием негативных факторов среды на респиратрный тракт, с последующим развитием повышенной чувствительности афферентных нервных окончаний или развитием сенсибилизации организма. Сенсибилизированный организм при воздействии на него определенного антигена запускает реакцию дегрануляции тучных клеток, сопровождающуюся выбросом медиаторов быстрой и медленной фаз реакции, оказывающих мультинаправленное действие на ткани, окружающие тучные клетки. Тучные клетки, локализованные в тканях респираторного тракта, при их дегрануляции оказывают влияние на все структуры респираторно тракта. Важнейшим медиатором быстрой фазы дегрануляции является гистамин, оказывающий влияние на локализованные здесь нервные структуры (афферентные нервы - С-волокна и стреч-рецепторы, эфферентные нервы), эпителий, гладкую мышцу и сами тучные клетки. Однако механизмы воздействия эндогенного тучно-клеточного гистамина на сегодняшний день являются малоизученными. Так же недостаточно сведений о взаимном влиянии тучных клеток и нейронов интрамурального ганглия. Кроме того, большинство исследований по данной теме направлены на изучение тонуса гладкой мышцы. Преимуществом данного исследования является применение электрической стимуляции постганглионарных нервов, вызывающей эндогенное выделение медиаторов, что приближает исследуемую систему к естественным условиям и позволяет более точно раскрыть нейро-иммуннные влияния на гладкую мускулатуру трахеи и бронхов. Еще одной особенностью данной работы является то, что в настоящем исследовании применялась экспериментальная модель влияния аналогов внешних факторов среды - аденозина и капсаицина на нервные и иммунные компоненты стенки респираторного тракта. Аденозин и капсаицин соответствуют таким факторам внешней среды как табачный дым, пылевые загрязнения, оксиды азота, серы и др.

Цель исследования:

Изучение, вызванного воздействием факторов внешней среды, совместного влияния тучных клеток и нейронов интрамуральных ганглиев на сокращения гладкой мышцы трахеи и бронхов крысы

Задачи:

1. Исследовать влияние экспериментальных аналогов негативных факторов внешней среды - аденозина и капсаицина - на сократительную активность гладкой мышцы трахеи и бронхов крысы, вызванную эндогенным ацетилхолином, при стимуляции нервов и мышцы.

2. Исследовать роль блокады синтеза эпителиальных простагландинов в реакции гладкой мышцы при действии аденозина и капсаицина.

3. Выявить значение блокады гистаминовых рецепторов в сокращении гладкой мышцы в условиях действия аденозина и капсаицина.

4. Исследовать сокращения гладкой мышцы различных отделов дыхательных путей крысы при блокаде С-волокон, ганглиев и тучных клеток.

Объект исследования:

Объектом исследования являлись изолированные препараты трахеи и бронхов 72 крыс линии Вистар обоего пола с массой тела 250-400 г.

Предмет исследования:

Исследовались влияния тучных клеток и нейронов интрамуральных ганглиев на сократительную активность гладкой мышцы различных отделов дыхательных путей крысы в условиях экспериментальной модели - воздействия негативных факторов внешней среды на респираторный тракт.

Научная новизна:

Впервые проведено комплексное исследование влияния аналога внешнего фактора - аденозина, активирующего иммунную систему, представленную тучными клетками, и нервную систему, представленную С-волокнами, на сократительную активность гладкой мышцы респираторного тракта, вызванную эндогенным выделением медиатора ацетилхолина из постганглионарных нервов.

Показано, что аденозин в низких концентрациях влияет на активность гладкой мышцы трахеи и бронхов, вызванную эндогенным ацетилхолином, главным образом, опосредованно через активацию тучных клеток с выделением гистамина и С-волокон с выделением тахикининов, а также рефлекторным путем через нейроны интрамурального ганглия. В низких концентрациях

действие аденозина непосредственно на гладкую мышцу практически отсутствует.

Показано, что капсаицин, активируя С-волокна, действует на гладкую мышцу непосредственно, выделяя тахикинины, рефлекторно через нейроны интрамуральных ганглиев и опосредованно через активацию тучных клеток с выделением гистамина.

Показано, что эпителий усиливает действие низких доз аденозина на ответы трахеи и бронхов, вызванные эндогенным медиатором, и не влияет на фазу снижения ответов. Эпителий не влияет на эффект С-волокон, активированных низкими дозами капсаицина, на эндогенно вызванные сокращения гладкой мышцы трахеи и бронхов.

Теоретическое и практическое значение работы Результаты позволяют раскрыть механизмы участия тучных клеток и метасимпатических нервных структур в управлении гладкомышечной стенкой трахеи и бронхов, способствуют пониманию нейро-иммунных взаимодействий в нижних дыхательных путях при умеренном воздействии внешних факторов среды. Результаты исследований используются в циклах лекций «Нормальная физиология» в Петрозаводском государственном университете и могут быть использованы в других университетах биологического и медицинского профиля, а также при разработке новых лекарственных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Медиаторы тучных клеток, экзоцитируемые при их частичной дегрануляции, оказывают влияние на сокращения гладкой мышцы трахеи и бронхов крысы непосредственно и через нейроны интрамуральных ганглиев.

2. Нейроны интрамурального ганглия оказывают влияния на гладкую мышцу через парасимпатическую и НАНХ систему, а также через активацию тучных клеток.

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на 11 Международной конференции «Актуальные проблемы современной науки», г. Томск, 2013 г.; IV Всероссийской Интернет-конференции с международным участием «Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных», г. Казань, 2013 г.; IV Международной научно-практической конференции «Современные концепции научных исследований, г. Москва, 2014 г., III международной научно-практической конференции «Science in the modern

information societye», North Charleston, USA. По теме диссертации опубликовано 7 работ, три из которых напечатаны в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 123 страницах и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания методов исследования, экспериментальной части, обсуждения результатов исследования, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 31 источник на русском и 102 источника на иностранных языках. Работа содержит 1 таблицу и 38 рисунков.

Методы исследования

Опыты проводили на изолированных препаратах трахеи и бронхов 72 крыс линии Вистар обоего пола с массой тела 220-350 г. в возрасте двух -трех месяцев. Эвтаназию животных производили путем помещения животного в камеру с хлороформом. Препараты помещали в термостатируемую ванночку с проточным сложным физиологическим раствором Кребса-Хензелайта (в дальнейшем — физиологический раствор). Изучали сокращения гладкой мышцы, вызванные эндогенным выделением ацетилхолина, при воздействии фармакологическими препаратами. На каждом препарате проводили 3-4 серии экспериментов. Каждая серия предполагала исследование влияния аденозина или капсаицина на препараты трахеи или бронхов, обработанные фармакологическими веществами, блокирующими ту или иную структуру дыхательных путей или различные рецепторы, модулирующие активность нервов и мышцы. После каждой серии производили отмывание препаратов физиологическим раствором в течение 30 мин. Учитывая, что внешние воздействия в первую очередь оказывают влияние на тучные клетки и С-волокна, в своих экспериментах мы применили для активации этих структур дыхательных путей аденозин и капсаицин.

Эксперименты были разбиты на четыре этапа. Во время первого этапа исследовались сокращения гладкой мышцы трахеи и бронхов, вызванные стимуляцией пре- и постганглионарных нервов и мышцы, при частичной активации тучных клеток 10 мкг аденозина или возбуждении С-волокон 1 мкг капсаицина, а так же при блокаде тучных клеток и С-волокон. На втором этапе изучалась роль эпителиальных простагландинов в реакции гладкой мышцы при активации тучных клеток и С-волокон. Применялась блокада синтеза простагландинов 10 мкг/мл индометацина на фоне действия аденозина и капсаицина. На третьем этапе исследования выяснялась роль гистаминовых 6

рецепторов в реакции гладкой мышцы при активации тучных клеток и С-волокон. Применялись блокатор Н1-рецепторов 100 мкг/мл супрастина и блокатор Н2-рецепторов 100 мкг/мл циметидина. На четвертом этапе исследования выяснялась роль афферентного и эфферентного звеньев интрамуральных ганглиев и тучных клеток в реакции гладкой мышцы трахеи и бронхов на действие аденозина и капсаицина. В экспериментах применяли блокаду афферентных рецепторов перфузией 10 мкг/мл новокаина, блокаду С-волокон перфузией в течение 30 минут 1 мкг/мл капсаицина и стабилизацию мембраны тучных клеток постоянным протоком 100 мкг/мл кромогликата натрия.

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние аденозина и капсаицина на препараты гладкой мышцы трахеи и бронхов

Активность гладкой мышцы трахеи и бронхов при действии аденозина Аппликация в ванночку 10 мкг аденозина вызывала двухфазное изменение ответов, вызванное стимуляцией нервов или мышцы, у изолированных препаратов трахеи и бронхов (рис. 1). При стимуляции преганглионарных нервов среднее усиление ответов гладкой мышцы трахеи до 106,0 ± 2,5 % происходило на 3,1 ± 1,0 минуте после введения аденозина в ванночку с препаратами, а снижение ответов до 90,3 ± 2,5 % - на 5,3 ± 0,8 минуте. При стимуляции постганглионарных нервов аденозин усиливал сократительные ответы трахеи до 110,4 ± 4,8 %. Снижение ответов трахеи во вторую фазу реакции достоверно (Р<0,05) не отличались от контроля (97,7 ± 4,0 %). При стимуляции мышцы первая фаза усиления ответов гладкой мышцы трахеи на аденозин практически не выявлялась (105,2 ± 2,0 %). Во вторую фазу реакции (на 6,7 ± 0,3 минуте) величины сократительных ответов достоверно понижались (Р < 0,05) для трахеи до 90,3 ±3,2 %.

120 ■ 115 -110 105 100 -95

90 -85 80 —

Трахея

* I

й-' й-' ¿Г

Бронхи

1Г

*

I

I

<5? А"

□ Контроль

□ 1 Фаза О 2 фаза

Рис. 1. Влияние аденозина на сократительную активность гладкой мышцы трахеи и бронхов. По оси абсцисс обозначены виды электрической стимуляции; «Прегангл.ст..» - стимуляция преганглионарных нервов, «Постгангл.ст.» - стимуляция постганглионарных нервов, «Мышечн.ст.» - стимуляция мышцы. По оси ординат обозначены изменения ответов гладкой мышцы в %; За 100 % принят ответ гладкой мышцы без действия аденозина.

«1» - первая фаза действия аденозина; «2» - вторая фаза действия аденозина. * - достоверное отличие (Р<0,05) от контроля.

При стимуляции преганглионарных нервов усиление ответов гладкой мышцы бронхов до 108,4 ± 3,0 % наблюдалось на 2,5 ± 0,9 минуте после введения аденозина, а снижение до 91,5 ± 3,0 % - на 5,5 ± 0,9 минуте (рис. 1). При стимуляции постганглионарных нервов аденозин на 2,8 ± 0,4 минуте достоверно (Р<0,05) усиливал сократительные ответы бронхов до 111,7 ± 1,2 %. Снижение ответов бронхов во вторую фазу реакции на 4,0 ± 0,32 минуте доходило до 95,2 ± 0,8 % (Р<0,05). При стимуляции мышцы первая фаза усиления ответов гладкой мышцы бронхов на аденозин практически не выявлялась (103,8 ± 2,5 %). Во вторую фазу реакции величины сократительных ответов достоверно понижались (Р < 0,05) до 89,9 ± 2,8 %. При стимуляции мышцы время снижения сокращения у бронхов наступало на 5,3 ± 0,8 мин. Различий между изменениями амплитуды сокращения и наступлением первой и второй фазами реакции гладкой мышцы трахеи и бронхов не наблюдалось.

Таким образом, аденозин оказывал двухфазное действие на препараты трахеи и бронхов. Первая фаза - увеличение ответов регистрировалась при стимуляции преганглионарных нервов, вторая фаза - снижение ответов больше была выражена при стимуляции мышцы. Различия между ответами трахеи и бронхов касались только количественной стороны: аденозин в большей степени усиливал сокращение на бронхах, чем на трахее.

Влияние капсаицина

При всех видах электрического раздражения добавление в ванночку 1 мкг капсаицина вызывало двухфазный характер изменения ответов трахеи и

бронхов. Сокращения трахеи при стимуляции преганглионарных нервов достигали максимума 112,7 ± 0,9 % (Р<0,01) на 3,56 ± 0,36 мин после аппликации капсаицина в ванночку (рис. 6). К 5,10 ± 0,26 минуте эксперимента ответы возвращались к норме. При стимуляции постганглионарных нервов или мышцы усиление ответов было меньше (107,9 ± 2,1 % и 110,5 ± 1,6 %, соответственно), но зато была выражена вторая фаза реакции - снижение ответа, которое при стимуляции мышцы достигало 90,6 ± 1,8 % (Р<0,05) (рис. 2).

На препаратах бронхов при раздражении преганглионарных нервов эффект действия капсаицина наступал на 2,75 ± 0,44 мин и составлял 115,1 ± 1,4 % (Р<0,01), а фаза снижения сокращения практически отсутствовала (95,9 ± 2,2 %). При стимуляции постганглионарных нервов или мышцы усиление ответов было меньше (108,1 ± 1,6 %) и наступало на 2,62 ± 0,62 мин. При стимуляции мышцы первая фаза практически отсутствовала (104,3 ± 1,7 %). Вторая фаза реакции - снижение ответа при стимуляции постганглионарных нервов на 5,41 ± 0,42 мин составляла 91,4 ± 2,9 % (Р<0,05), при стимуляции мышцы - 88,7 ± 1,9 % (Р<0,01) на 5,25 ± 0,72 мин (рис. 2).

Таким образом, препараты трахеи и бронхов практически одинаково реагировали на капсаицин. Более того, время эффекта капсаицина, связанного с повышением или снижением ответов, у этих препаратов достоверно не различалось. Наибольший эффект капсаицина проявлялся при преганглионарной стимуляции, а аденозина - при постганглионарной. Это связано с тем, что капсаицин действует на афферентные окончания С-волокон, а аденозин, вероятно, в большей степени влияет на выделение медиатора из постганглионарных холинергических нервов.

При преганглионарной стимуляции капсаицин оказывал дилатационный эффект с наибольшими показателями расслабления на препаратах гладкой мышцы трахеи (с 11,3 ±1,3 мг до 21,3 ±3,1 мг; Р<0,01). На бронхах дилатационный эффект был выражен в меньшей степени, но зато он прявлялся при преганглионарной (с 8,6 ± 1,3 мг до 15,5 ± 2,8 мг; Р<0,05) и постганглионрной стимуляции (с 10,6 ± 1,4 мг до 14,3 ± 2,1 мг; ; Р<0,05). При стимуляции мышцы достоверных изменений расслабления не наблюдалось.

Рис. 2. Влияние капсаицина на сокращение трахеи и бронхов

По оси абсцисс обозначены виды электрической стимуляции. По оси ординат обозначены изменения ответов гладкой мышцы в %. За 100 % принят ответ гладкой мышцы без действия капсаицина. «1» - первая фаза; «2» - вторая фаза действия капсаицина; «Прегангл.ст.» -стимуляция преганглионарных нервов, «Поетгангл.ст.» - стимуляция постганглионарных нервов. «Мышечн.ст.» - стимуляция мышцы. * - достоверное отличие (Р<0,05) от контроля.

Предварительная экспозиция препаратов трахеи и бронхов в растворе

1 мкг капсаицина в течение 30 минут приводила к истощению запасов тахикининов в нервных окончаниях С-волокон и к потере ими чувствительности к капсаицину. После инактивации (блокады) С-волокон препараты трахеи и бронхов практически не изменяли величины сокращения и расслабления, вызванного стимуляцией электрическим полем нервов или мышцы.

Влияние аденозина на трахею и бронхи при инактивации С-волокон

На фоне инактивации С-волокон при стимуляции нервов аденозин вызывал двухфазное изменение сократительных ответов (рис. 3). На обоих препаратах трахеи и бронхов наибольший эффект наблюдался при стимуляции постганглионарных нервов. Так, на трахее на 3,14 ± 0,79 минуте амплитуда сокращения достигала 110,1 ± 3,6 % (Р<0,05) от ответов, полученных на фоне блокады С-волокон без аппликации аденозина. После этого величина ответов уменьшалась до 93,6 ± 0,9 % (Р<0,05). При стимуляции гладкомышечных клеток аденозин не изменял амплитуды сокращения.

Рис 3 Влияние аденозина на сокращения гладкой мышцы трахеи и бронхов на фоне блокады С-волокон капсаицином

По оси абсцисс обозначены виды электрической стимуляции. По оси ординат обозначены изменения ответов гладкой мышцы в %. За 100 % принят ответ гладкой мышцы без действия капсаицина. «1» - первая фаза; «2» - вторая фаза действия капсаицина. «Прегангл.ст.» -стимуляция преганглионарных нервов, «Постгангл.ст.» - стимуляция постганглионарных нервов, «Мышечн.ст.» - стимуляция мышцы. * - достоверное отличие (Р<0,05) от контроля.

На препаратах бронхов влияние аденозина на фоне инактивации С-волокон во многом было аналогично влиянию на трахею (рис. 3). Аденозин вызывал двухфазное изменение амплитуды сокращения и максимальный эффект, достигающий 111,7 ± 1,2 %, регистрировался на 4,0 ± 0,7 минуте при стимуляции постганглионарных нервов. Этот эффект аденозина был равен эффекту, показанному при действии одного аденозина. При стимуляции мышцы, в отличие от трахеи, аденозин на фоне блокады С-волокон вызывал снижение амплитуды сокращения до 90,7 ± 3,0 % (Р<0,05), но величина этого снижения не отличалась от снижения, вызванного при применении одного аденозина.

Блокада нервных окончаний С-волокон капсаицином не влияла на эффект аденозина в препаратах трахеи и бронхов при стимуляции нервов.

Влияние аденозина при блокаде С-волокон и тучных клеток На препаратах трахеи аденозин на фоне блокады С-волокон и тучных клеток не вызывал изменений при преганглионарной и мышечной стимуляциях, но увеличивал ответы при стимуляции постганглионарных нервов. В препаратах бронхов аденозин вызывал увеличение ответов при стимуляции нервов (рис. 4).

Рис 4. Влияние аденозина при блокаде С-волокон и тучных клеток

По оси абсцисс обозначены виды электрической стимуляции. По оси ординат обозначены изменения ответов гладкой мышцы в %. За 100 % принят ответ гладкой мышцы без действия аденозина. «Прегангл.ст.» - стимуляция преганглионарных нервов, «Постгангл.ст.» - стимуляция постганглионарных нервов, «Мышечн.ст.» - стимуляция мышцы. * - достоверное отличие (Р<0,05) от контроля.

На препаратах бронхов под влиянием аденозина на фоне блокады С-волокон и тучных клеток регистрировалось небольшое усиление сократительных ответов гладкой мышцы, вызванных постганглионарной стимуляцией, до 115,2 ± 1,1 % против 111,7 ± 1,2 (Р<0,05) в опытах без кромогликата натрия. Изменение ответов, вызванных стимуляцией преганглионарных нервов или мышцы, практически отсутствовало в экспериментах со стабилизации тучных клеток.

Можно заключить, что аденозин и капсаицин вызывали двухфазное действие на препараты трахеи и бронхов. Первая фаза - увеличение ответов регистрировалась, главным образом, при стимуляции нервов. Наибольшее усиление ответов отмечалось при стимуляции постганглионарных нервов. Вторая фаза - снижение - ответов в большинстве случаев наблюдалась при стимуляции мышцы. Различия между ответами трахеи и бронхов касались только количественной стороны: аденозин усиливал сокращение на бронхах больше, чем на трахее.

На фоне блокады чувствительных нервных окончаний С-волокон капсаицином и стабилизации тучных клеток кромогликатом натрия аденозин также вызывал увеличение ответов трахеи и бронхов, которое по величине практически не отличалось усиления, имевшего место в опытах без добавления блокаторов. Возможно, что наблюдаемый эффект аденозина в данных условиях эксперимента был максимальным.

Учитывая, что наибольший эффект аденозина проявлялся при стимуляции электрическим полем постганглионарных нервов, а активация гладкой мышцы дыхательных путей в естественных условиях определяется выделением ацетилхолина из постганглионарных холинергических нервов, в дальнейшем при анализе механизмов действия аденозина, влияния тучных клеток, нейронов

интрамуральных ганглиев и С-волокон на работу трахеи и бронхов, в экспериментах мы будем применять только стимуляцию постганглионарных нервов.

Роль эпителия в реакции гладкой мышцы

Роль эпителия при действии аденозина Блокада синтеза простагландинов достоверно понижала величины сократительных ответов на фоне физиологического раствора. На фоне действия аденозина наблюдалась более сложная картина действия индометацина. На фоне ингибирования синтеза простагландинов аденозин оказывал двухфазный эффект на сокращение гладкой мышцы, вызванное стимуляцией постганглионарных нервов. Первая фаза у всех препаратов характеризовалась незначительным усилением сокращения гладкой мышцы до 103,7 - 105,8 % (Р<0,05). На препаратах трахеи фаза усиления сокращения наступала на 2,50 ± 0,39 минуте, на бронхах - на 1,82 ± 0,36. Вторая фаза - снижение сокращения у всех препаратов трахеи и бронхов была примерно одинакова по величине и составляла 89,7 - 93,9 %. Она наступала достоверно (Р<0,05) позже, чем первая фаза - на 4,8 + 0,66 минуте у трахеи и на 5,75 + 0,51 минуте у бронхов. На фоне ингибирования синтеза простагландинов аденозин не изменял величины расслабления у всех используемых препаратов.

Роль эпителия при активации С-волокон

На фоне ингибирования синтеза простагландинов индометацином активация С-волокон увеличивала сократительные ответы гладкой мышцы трахеи, на 2,91 ± 0,80 минуте они составляли 107,9 ± 2,0 % от ответов на индометацин, а ответы бронхов на 3,10 ± 0,74 минуте достигали 108,1 ± 1,6 %. Вторая фаза снижение сокращения до 91,4 ± 2,9 % на трахее наступала на 4,82 ± 0,56 минуте, на бронхах снижение сокращения до 94,4 ± 2,4 % регистрировалось на 5,20 ± 0,63 минуте.

Таким образом, эпителий усиливал сократительные ответы гладкой мышцы трахеи и бронхов, и при его блокаде эти ответы уменьшались. Вероятно, его бронхоконстрикторное действие связано с синтезом простагландинов, усиливающих сокращение гладкой мускулатуры (ПГР2а и других).

В предыдущей главе было показано, что действие аденозина на препараты трахеи и бронхов вызывало двухфазную реакцию. В данной серии экспериментов установлено, что при блокаде эпителия индометацином,

констрикторный эффект аденозина достоверно (Р<0,05) уменьшался, что указывает на то, что блокада синтеза простагландинов влияет на действие аденозина, уменьшая ответы.

Применение блокады эпителия при активации С-волокон капсаицином не вызывало достоверных изменений сократительных ответов, по сравнению с ответами, вызванными действием одного только капсаицина, что указывало на то, что блокада синтеза простагландинов не оказывает влияния эффект капсаицина.

Роль блокады гистаминовых рецепторов в реакции гладкой мышцы

Роль блокады гистаминовых рецепторов при действии аденозина При блокаде Н2-рецепторов циметидином и блокады эпителия аденозин оказывал двухфазный эффект на ответы гладкой мышцы, вызванные эндогенным ацетилхолином: сначала наблюдалось увеличение сокращения, а затем - уменьшение (рис. 5). Ответы трахеи на 3,00 ± 0,91 минуте повышались до 108,9 + 1,4 %, что было достоверно (Р < 0,05) выше действия одного аденозина (98,8 ± 3,2 %). Фаза снижения сокращения на трахее при действии аденозина практически отсутствовала (96 ± 2,4 %), в то время как при действии одного аденозина она равнялась 85,9 ± 3,7 %.

Рис. 5

А Влияние блокады Н2-рецепторов циметидином на сократительные ответы гладкой мускулатуры трахеи и бронхов, обработанных аденозином при постганглионарной стимуляции.

Б Влияние блокады Н1—рецепторов супрастином на сократительные ответы ГМ трахеи и бронхов, вызванные постганглионарной стимуляцией, на фоне блокады Н2 рецепторов циметидином при аппликации аденозина

По оси абсцисс обозначены используемые препараты. По оси ординат обозначены изменения ответов гладкой мышцы в %. За 100 % приняты ответы гладкой мышцы, полученные при стимуляции постганглионарных нервов на фоне действия аденозина.

«Трахея с/г.» - трахея с ганглиями, «Трахея б/г» - трахея без ганглиев, «Бронхи с/г.» - бронхи с ганглиями, «Бронхи б/г.» - бронхи без ганглиев. «1» - первая фаза действия аденозина «2» -вторая фаза действия аденозина. * - достоверное отличие (Р<0,05) от физиологического раствора.

При действии адеиозина на фоне блокады Н2-рецепторов бронхи показывали усиление сократительных ответов до 116,1 ± 4,9, которое было больше по величине, чем на трахее (рис. 5). Время максимального ответа у этих препаратов составляло 2,00 ± 0,58 минуты. Фаза снижения сокращения на бронхах отсутствовала (94,9 + 2,8 %), хотя при действии аденозина на препараты, не обработанные циметидином снижение сокращений имело место.

На препаратах трахеи аденозин на фоне блокады гистаминовых Н2-рецепторов достоверно не изменял величины расслабления при стимуляции постганглионарных нервов.

Блокада гистаминовых Н1-рецепторов супрастином на фоне постганглионарной стимуляции с применением блокады Н2-рецепторов уменьшала сократительные ответы гладкой мышцы всех используемых препаратов при аппликации аденозина (рис. 5). Ответы трахеи с ганглиями на 6,00 ± 0,53 минуте снижались до 42,9 ± 1,9 %, что было достоверно (Р < 0,01) ниже, чем при действии одного аденозина (85,9 ± 3,7 %).

Действие аденозина при блокаде Н1-рецепторов на бронхи с ганглиями оказывало практически такой же эффект на сократительные ответы (39,5 ± 3,4). Время ответа наступало на 7,0 ± 0,1 минуте.

Таким образом, блокада Н1 -рецепторов достоверно уменьшает эффект аденозина на гладкую мышцу трахеи и бронхов (Р<0,01 для снижения амплитуды сокращения и Р<0,05 для времени наступления снижения).

Роль блокады гистаминовых рецепторов при активации С—волокон При блокаде Н2-рецепторов циметидином при постганглионарной стимуляции аппликация в ванночку 1 мкг капсаицина вызывала двухфазный эффект: сначала наблюдалось увеличение сократительных ответов гладкой мышцы, сменяемое их уменьшением (рис. 6). Ответы трахеи на 2.29 + 0,82 минуте повышались до 108,6 ± 2.8 % (Р < 0,05). Фаза снижения сокращения на трахее при действии капсаицина на фоне блокады Н2-рецепторов на 4,43 + 0,72 минуте составляла 90,5 ± 1,8 % (Р<0,05).

Ответы препаратов бронхов при блокаде Н2-рецепторов и активации стимуляцией постганглионарных нервов и капсаицином были аналогичны ответам трахеи: 107,2 ± 1,0 % на 1,0 ± 0,1 минуте для бронхов. Средняя

величина снижения сокращения у бронхов регистрировалась на 6,1 ± 0,51 минуте и составляла 83,5 ± 5,1 %.

Рис. 6

А Влияние блокады Н2-рецепторов на сократительные ответы гладкой мышцы трахеи и бронхов, вызванные стимуляцией постганглионарных нервов и активацией С—волокон Б Влияние блокады Н1-рецепторов на сократительные ответы гладкой мышцы трахеи и бронхов, вызванные стимуляцией постганглионарных нервов и активацией С—волокон По оси абсцисс обозначены используемые препараты. По оси ординат обозначены изменения ответов гладкой мышцы в %. За 100 % приняты ответы гладкой мышцы, полученные при постганглионарной стимуляции на фоне индометацина, циметидина и аппликации 1 мкг капсаицина. «Трахея с/г.» - трахея с ганглиями, «Бронхи с/г.» - бронхи с ганглиями. «1» - первая фаза действия капсаицина «2» - вторая фаза действия капсаицина. * - достоверное отличие (Р<0,05) от физиологического раствора.

На фоне блокады эпителия индометацином и активации С-волокон капсаицином, блокада Н1 рецепторов супрастином оказывала достоверный (Р<0,01) дилатационный эффект на препараты трахеи и бронхов (рис 6). При постганглионарной стимуляции активация С-волокон 1 мкг капсаицина блокада Н1-рецепторов супрастином вызывала достоверное (Р<0,05) снижение сократительных ответов трахеи до 53,3 ± 1,5 %, бронхов до 62,8 ± 3,5 %.

Таким образом, можно сделать следующие заключения о роли Н1 и Н2-рецепторов. Блокада Н1-рецепторов супрастином на приводила к снижению сократительных ответов трахеи и бронхов. Блокада Н2-рецепторов циметидином приводила к увеличению сокращения трахеи и бронхов. При влиянии блокады Н2-рецепторов на фоне действия аденозина сначала во всех препаратах наблюдалось увеличение сократительных ответов, сменяющееся их понижением, что, вероятно связано с наличием других гистаминовых Н1- и НЗ-рецепторов, соответственно. Блокада Н1-рецепторов на фоне действия аденозина вызывала однофазный дилатационный ответ. При сравнении

аналогичных результатов, но без блокады Н1-рецепторов, наблюдалась двухфазная реакция - увеличение и снижение сокращений.

Блокада Н2-рецепторов на фоне активации С-волокон капсаицином и блокаде эпителия индометацином давала двухфазный ответ - увеличение сокращения сменялось его уменьшением. Такой же результат наблюдался в экспериментах, но без блокады Н2-рецепторов. Блокада Н1-рецепторов на фоне активации С-волокон капсаицином и блокаде эпителия индометацином вызывала однофазное понижение сократительных ответов.

Роль блокады С-волокон, тучных клеток и ганглиев в реакции гладкой

мышцы

Роль блокады С-волокон в реакции гладкой мышцы на аденозин Инактивация чувствительных нервных окончаний С-волокон длительной (30 мин) обработкой 1 мкг/мл капсаицина не изменяла ответов трахеи и бронхов, вызванных стимуляцией постганглионарных нервов, но увеличивала амплитуду расслабления препаратов бронхов с 10,6 ± 1,4 мг до 19,7 ± 3,7 мг (Р<0,05). При блокаде С-волокон аппликация 10 мкг аденозина на 4,5 ± 1,1 минуте усиливали сокращения трахеи до 110,4 ± 2,4 %, а препаратов бронхов на 5,29 ± 0,56 минуте - до 112,1 ± 1,1 % (рис. 7). То есть различий в реакциях между трахеей и бронхами после длительной обработки капсаицином на аппликацию аденозина не наблюдалось.

120

Трахея Бронхи

Рис. 7 Сократительные ответы гладкой мускулатуры трахеи и бронхов на фоне блокады С-волокон капсаицином.

По оси абсцисс обозначены препараты: «трахея с/г.» - трахея с ганглиями, «бронхи с/г.» - бронхи с ганглиями. По оси ординат обозначены изменения ответов гладкой мышцы в %. За 100 % приняты ответы гладкой мышцы, полученные при постганглионарной стимуляции в физиологическом растворе; «1» - блокада С-волокон; «2» - влияние аденозина на фоне блокады С-волокон. * - достоверное отличие (Р<0,05) от препаратов, не обработанных аденозином.

Роль блокады С-волокон и блокады Н2-гистаминовых рецепторов на активность гладкой мышцы трахеи и бронхов при активации тучных клеток После перфузии через ванночку с препаратами индометацина (ингибитора синтеза простагландинов) и блокатора Н2-гистаминовых рецепторов циметидина аденозин снижал амплитуду сокращения у препаратов с инактивированными С-волокнами: у трахеи до 85,6 ± 1,9 %, у бронхов эффект отсутствовал (97,9 ± 3,5%) (рис. 8).

* * I I

□ Контроль ■ Капсаицин

Трахея

Бронхи

Рис. 8. Сократительные ответы гладкой мускулатуры трахеи и бронхов при активации тучных клеток аденозином на фоне блокады С-волокон капсаицином, эпителия и Н2-рецепторов.

По оси абсцисс обозначены препараты. По оси ординат обозначены изменения ответов гладкой мышцы в %. За 100 % приняты ответы гладкой мышцы, полученные при постганглионарной стимуляции на фоне блокады эпителия индометацином, Н2 рецепторов циметидином и активации тучных клеток аденозином. * - достоверное (Р<0,05) отличие от физиологического раствора

Роль блокады С-волокон, блокады Н2-гистаминовых рецепторов и блокады стретч рецепторов на активность гладкой мышцы трахеи и бронхов при активации тучных клеток Быстро и медленно адаптирущиеся стреч-рецепторы, располагающиеся в эпителие, способны воспринимать раздражения от эпителиального слоя и, как следствие, реализовывать рефлекторные цепочки, замыкающиеся на центральном и периферическом уровнях, способных привести к развитию реакции сокращения гладкой мускулатуры. Чувствительные к капсаицину С-волокна также локализованы вблизи эпителиальных клеток. Возможные влияния эпителия на С-волокна вызывает их возбуждение, способное привести к развитию сокращения гладкой мускулатуры. С-волокна тесно сопряжены с парасимпатическими вагальными волокнами, что приводит к возбуждению парасимпатического звена, ответственного за развитие констрикторного эффекта. На препаратах, у которых заблокированы С-волокна, эпителий и Н2-гистаминовые рецепторы и которые активируются стимуляцией постганглионарных нервов и аденозином, блокада трахео-бронхиальных

рецепторов новокаином совсем незначительно уменьшала сократительные ответы гладкой мускулатуры трахеи и бронхов с ганглиями. Ответы трахеи изменялись от 85,6 ± 1,9 % до 84,1 ± 1,7 %, а бронхов - от 86,4 ± 2,9 % до 79,0+ 1,3 %.

Активность гладкой мышцы трахеи и бронхов при стабилизации тучных клеток

Обработка препаратов трахеи и бронхов кромогликатом натрия приводит к стабилизации тучных клеток, снижению их дегрануляции и, соответственно, к блокированию выделения медиаторов. Активация С-волокон капсаицином на фоне блокады тучных клеток, эпителия и Н2-рецепторов приводила к достоверному (Р<0,05) увеличению сократительных ответов гладкой мышцы трахеи, вызванных стимуляцией постганглионарных нервов, до 120,6 ± 3,0 % (Р<0,01) по сравнению с экспериментами без добавления кромогликата натрия (рис. 9). На бронхах в этих условиях величина сокращения увеличивалась до 114,9 ±1,9%. В данных экспериментальных условиях достоверного изменения амплитуды расслабления не регистрировалось.

А Б В

Рис. 9 Влияние стабилизации мембран тучных клеток и блокады нервно-мышечной передачи на сокращения гладкой мышцы трахеи и бронхов.

По оси абсцисс обозначены используемые препараты. По оси ординат обозначены изменения ответов гладкой мышцы в %. * - достоверное отличие (Р<0,05) от контроля

А - Сокращения гладкой мышцы при блокаде тучных клеток, на фоне блокады Н2-рецепторов и активации С-волокон

За 100 % приняты ответы гладкой мышцы, полученные при постганглионарной стимуляции на фоне блокады Н2-рецепторов и активации С-волокон капсаицином

Б - Влияние блокады нервно-мышечной передачи на сокращения гладкой мышцы при активации С-волокон.

За 100 % приняты ответы гладкой мышцы, полученные при постганглионарной стимуляции и активации С-волокон капсаицином без обработки атропином.

В - Сокращения гладкой мышцы при блокаде тучных клеток, изоляции интрамуральных ганглиев и активации С-волокон

За 100 % приняты ответы гладкой мышцы, полученные при постганглионарной стимуляции на фоне блокады эпителия индометацином, блокады интрамуральных ганглиев и активации С-волокон капсаицином

Таким образом, капсаицин, активируя чувствительные нервные окончания С-волокон, на препаратах трахеи и бронхов, рефлекторно через нейроны ганглиев снижал сокращения.

Активность гладкой мышцы трахеи и бронхов при блокаде нервно-мышечной передачи

При постганглионарной стимуляции и активации С-волокон капсаицином, атропин вызывает достоверное снижение (Р < 0,05) сократительных ответов гладкой мышцы трахеи и бронхов. Среднее значение величины сокращения трахеи с ганглиями составляло 19,4 ± 3,4 %, бронхов - 24,8 ± 2,8 %. Активация С-волокон капсаицином после обработки препаратов атропином практически не изменяла величины сокращения. Капсаицин на фоне атропина не изменял величины расслабления препаратов.

Блокада Н1-рецепторов на фоне блокады нервно-мышечной передачи и активации С-волокон уменьшала ответы по сравнению с действием капсаицина и атропина. Блокада Н2 рецепторов напротив вызывала их увеличение.

Активность гладкой мышцы трахеи и бронхов при совместной блокаде тучных клеток и нервно-мышечной передачи

Совместная блокада тучных клеток кромогликатом натрия и ганглиев атропином при активации С-волокон капсаицином и постганглионарной стимуляции, оказывала достоверное (Р<0,01) увеличение сократительных ответов гладкой мускулатуры трахеи и бронхов относительно препаратов, необработанных кромогликатом натрия.

Различия в ответах, вызванных активацией С-волокон с участием интрамурального ганглия и без него существенно различаются, что указывает на ведущую роль нервного пути через ганглий в сократительном ответе.

При дополнительной блокаде Н1-рецепторов ответы понижались, что связано с устранением основного рецептора бронхоконстрикторного действия. По-видимому, тахикинины оказывают активирующее действие на Н1 рецепторы.

При блокаде Н2-рецепторов в аналогичном эксперименте наблюдалось повышение ответов, что связано с устранением основного бронходилатирующего рецептора Н2. Вероятно, на Н2 рецепторы тахикинины так же оказывают активирующее действие.

В экспериментах с одновременной блокадой тучных клеток и прерыванием

увеличения ответов, что по всей видимости, свидетельствует об определенном действии С-волокон на тучные клетки. Вероятно, тахикинины, выбрасываемые в ходе активации С-волокон вызывают частичную дегрануляцию тучных клеток с выбросом низких концентраций гистамина, оказывающего дилатационное действие через Н2-рецепторы. Так же возможно в ходе дегрануляции тучные клетки высвобождают какие-то вещества, обеспечивающие расслабление и играющие роль в механизмах саморегуляции системы.

Заключение

Таким образом, можно заключить, что изучение особенностей эколого-физиологического взаимодействия внешних факторов среды, тучных клеток, нейронов интрамуральных ганглиев, эпителия и гладкой мускулатуры нижних дыхательных путей представляет большое значение для раскрытия подробных механизмов бронхоконстрикции, лежащей в основе патогенеза астмы и обструктивных болезней легких. Данное исследование позволило установить некоторые особенности нейро-иммунного воздействия на сокращения гладкой мускулатуры трахеи и бронхов крысы в условиях физиологической нормы с учетом моделирования умеренного воздействия внешнего фактора (влияние аденозина). Нам удалось показать роль тучных клеток с сокращении гладкой мускулатуры, а также обозначить возможные пути взаимодействия лаброцитов с нейронами метасимпатического ганглия. Тем не менее, обозначенная проблема на сегодняшний день не изучена в полной мере, не раскрыты на молекулярном уровне все особенности взаимодействия медиаторов тучных клеток с рецепторами метасимпатического отдела автономной нервной системы, эпителием и гладкомышечной клеткой. Эти вопросы являются предметом дальнейших исследований в области нейро-иммунных отношений.

Выводы

1. Аденозин и капсаицин - активируют структуры нервной и иммунной систем в нижних дыхательных путях, вызывая двухфазные реакции, в которых увеличение сокращения сменяется его снижением. Действие аденозина неоднозначно и связано с активацией им С-волокон, тучных клеток и гладкой мышцы.

2. Блокада синтеза простагландинов снимает фазу усиления ответов в действии аденозина при постганглионарной стимуляции и не влияет на сокращения, индуцированные активацией С-волокон капсаицином. Эпителиальные простагландины повышают сокращения гладкой мускулатуры при активации тучных клеток, но не при активации С-волокон.

3. Гистаминовые Н1-рецепторы опосредуют увеличение сокращения и их блокада супрастином вызывает снижение ответов гладкой мышцы, вызванных эндогенным ацетилхолином, при действии аденозина и капсаицина. Гистаминовые Н2-рецепторы опосредуют дилатационный эффект и их блокада вызывает возрастание ответов в препаратах бронхов при стимуляции нервов на фоне действия аденозина; однако в препаратах трахеи подобного эффекта не наблюдалось. На фоне активации С-волокон капсаицином блокада Н2-рецептров не изменяла величину сокращения.

4. Активация С-волокон аналогами отрицательных экологических факторов приводит к их возбуждению и увеличению сокращения. Блокада С-волокон вызывает снижение ответов. Блокада нервно-мышечной передачи вызывает сильное снижение ответов, но одновременная стабилизация мембран тучных клеток и прерывание нервно-мышечной передачи приводили к их увеличению, что может свидетельствовать о провокационном действии аденозина и капсаицина на тучные клетки, опосредующие дилатирующий эффект.

5. Аналоги факторов внешней среды - аденозин и капсаицин - активируют тучные клетки и С-волокона нижних дыхательных путей. Аденозин влияет на гладкую мышцу как непосредственно, так и опосредованно через активацию тучных клеток с выделением гистамина и активацию С-волокон с выделением тахикининов, а так же рефлекторным путем через нейроны интрамурального ганглия. Капсаицин действует на гладкую мышцу, активируя С-волокна с высвобождением ими тахикининов, и рефлекторно через нейроны интрамуральных ганглиев, а так же через активацию тучных клеток с выделением гистамина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Кивер Е. Н., Смирнова Л. Е., Кирилина В. М., Федин А. Н., Влияние тормозных гистаминовых рецепторов на активность гладкой мышцы нижних дыхательных путей крысы. Сборник материалов IV Всероссийской научной Интернет-Конференции с международным участием. Казань, 2013 г., стр.58-62

Федин А. Н., Постникова Т. Ю., Кивер Е. Н., Кирилина В. М., Смирнова JI. Е., Дилатируюгцее действие гистамина и серотонина на дыхательные пути крысы. Сборник материалов 11-ой международной телеконференции. Томск, 2013, т. 2, номер 2, стр. 74-75

Федин А. Н., Кивер Е. Н., Смирнова Л. Е., Кирилина В. М„ Кривченко А. И., Роль интрамуральных ганглиев дыхательных путей в действии гистамина, Россиийский физиологический журнал имени И. М. Сеченова, 100, №9, 2014, стр. 1059-1067.

Кивер Е. Н„ Смирнова Л. Е. , Кирилина В. М„ Взаимодействие гистамина с НАНХ-системой дыхательных путей крысы Современные концепции научных исследований г. Москва 2014 г. номер 4, часть 3, стр. 72 - 77.

Смирнова Л.Е., Кивер E.H., Кирилина В.М., Влияние аденозина и гистамина на сократительную активность гладкой мускулатуры трахеи и бронхов крысы Современные концепции научных исследований г. Москва 2014 г. номер 4, часть 2, стр. 6-8.

Кивер E.H., Смирнова Л. Е., Кирилина В. М., Федин А. Н., Действие низких доз гистамина в НАНХ-системе нижних дыхательных путей крысы Сборник «Наука и образование в XXI веке», г. Тамбов 2014, т.16, стр. 59-62.

Кирилина В. М., Смирнова Л. Е., Кивер Е. //., Федин А. Н., Взаимодействия тучных клеток и гладкой мускулатуры в нижних дыхательных путях. Сборник материалов III международной научно-практической конференции. North Charleston, USA, 2014, т. 2, стр. 6-11.

Подписано в печать 24.03.2015. Формат 60x84 !/i«. Бумага офсетная. 1 уч.-изд. л. Тираж 100 экз. Изд. № 84

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования ПЕТРОЗАВОДСКИМ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Отпечатано в типографии Издательства Петр ГУ 185910, г. Петрозаводск, пр. Ленина, 33