Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-физиологическая роль нейронов интрамуральных ганглиев нижних дыхательных путей крысы в действии гистамина

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Эколого-физиологическая роль нейронов интрамуральных ганглиев нижних дыхательных путей крысы в действии гистамина"

На правах рукописи

Кивер Елена Николаевна

ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ НЕЙРОНОВ ИНТРАМУРАЛЬНЫХ ГАНГЛИЕВ НИЖНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ КРЫСЫ В ДЕЙСТВИИ ГИСТАМИНА

Специальности - 03.02.08 - Экология

03.03.01 - Физиология

15 АПР 2015

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0055673Ь/

Петрозаводск - 2015

005567362

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии имени И. М. Сеченова Российской академии наук

Научный руководитель доктор биологических наук

Федин Анатолий Николаевич, кандидат биологических наук, доцент Кирилина Валентина Михайловна.

Официальные оппоненты: Илюха Виктор Александрович,

доктор биологических наук, доцент, ФГБУН Институт биологии Карельского научного центра РАН, лаборатория экологической физиологии животных, заведующий лаборатории

Хилков Тимур Николаевич,

кандидат биологических наук, ФГБОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет», Медицинский институт, кафедра пропедевтики внутренних болезней и гигиены

Ведущая организация Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный педагогический университет имени А. И. Герцена», г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «05» мая 2015 года в 11 часов в ауд. 117 на заседании диссертационного совета Д 212.190.01 при Петрозаводском государственном университете по адресу: 185910, Республика Карелия, г. Петрозаводск, пр. Ленина, д. 33, эколого-биологический факультет, тел. факс: 8(8142)763864.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Петрозаводского государственного университета http://www.petrsu.ru/, с авторефератом — на сайте http://vak.ed.gov.ru/ и http://www.petrsu.ru/

Автореферат разослан « 0_Ъ »_____О У______2015 года

Ученый секретарь

диссертационного совета _____

канд. биологических наук Дзюбук И. М.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы:

Организм, как открытая биологическая система находится в постоянном взаимодействии с окружающей средой. При неблагоприятных обстоятельствах факторы среды могут оказывать на организм негативное влияние и при действии сильных или длительно действующих раздражителей реакция может приобретать роль патогенного фактора. Это имеет особое значение для дыхательной системы, находящейся в непосредственном и постоянном взаимодействии окружающей средой, которая может оказывать на органы дыхания как положительные, так и негативные влияния. Для осуществления своей основной функции - газообмена — вся система дыхательных органов должна своевременно реагировать на изменения потребностей внутренней среды и на различные воздействия со стороны внешней среды, обеспечивая необходимое поступление воздуха в респираторную часть легких и предотвращая проникновение в организм различных патогенов. В этом случае регулирование происходит благодаря взаимодействию интегрирующих систем организма - нервной и иммунной (Ноздрачев и др., 2000). Изменения чувствительности и реактивности органов дыхания могут возникать первично, при непосредственном воздействии агрессивных факторов внешней среды на органы дыхания и вторично - после патогенного воздействия факторов внешней среды на иммунную, нервную и другие системы. То есть, в качестве патогенов выступают как вредные влияния внешней среды, так и нарушения внутренней регуляции работы органов дыхания. Необходимо отметить, что на внешние воздействия в первую очередь реагирует нервная система, адаптивно меняющая характер функционирования дыхательных путей (Федин, Ноздрачев, Бреслав, 1997).

Нервная регуляция нижних дыхательных путей поддерживает тонус трахеи и бронхов в состоянии, необходимом для нормального жизнеобеспечения организма. Регуляция на уровне автономной нервной системы происходит при активном участии нейронов интрамуральных ганглиев, влияющих на реактивность гладкомышечной стенки трахеи и бронхов (Федин, Ноздрачев, Бреслав, 1997). Гладкая мышца нижних дыхательных путей может получать активирующие и тормозные импульсы от

нейронов функционального модуля, и от влияния различных биологически активных веществ непосредственно на гладкомышечные клетки. Процессы возбуждения и торможения гладкой мышцы осуществляются разнообразными медиаторными системами, поддержание равновесного баланса сокращения и расслабления является главной задачей автономной нервной регуляции. В литературе неоднократно отмечалось, что значительная часть заболеваний респираторной системы связана с изменением регуляторных механизмов гладкомышечной стенки воздухоносных путей. Нарушения нервной регуляции работы гладкой мышцы могут приводить к патологическим явлениям гиперреактивности трахеи и бронхов и их гиперчувствительности к воздействию внешних и собственных провоцирующих физиологических агентов. Бронхиальная гиперреактивность является одним из главных внутренних факторов, вызывающих развитие хронической обструктивной болезни легких, бронхиальной астмы и ряда других заболеваний, сопровождающихся обструкцией дыхательных путей.

Большую роль в поддержании нормального тонуса гладкой мышцы трахеи и бронхов играет гистамин, высвобождающийся в процессе дегрнуляции тучных клеток. Постоянное выделение тучными клетками гистамина в очень низких дозах является нормальным физиологическим фоном для естественной релаксации гладкомышечных клеток. Однако при воздействии патогенных факторов дегрануляция тучных клеток усиливается и концентрация выделяемого гистамина в просвете дыхательных путей повышается, что приводит к усилению сократительной реакции гладкомышечных клеток и, вследствие этого, к бронхоконстрикции. (Абросимов, 1990, Cohn, Adler, 1992, Sato et al., 1998).

При изучении действия гистамина на гладкую мышцу, как правило, исследовалось влияние высоких концентраций вещества на тонус гладкомышечных клеток, то есть реакции, связанные с патологией. Влияние низких доз гистамина, близких к естественному фоновому уровню в организме, практически не рассматривалось. К тому же, в имеющихся работах совершенно не учитывается роль нейрональных интрамуральных структур метасимпатической нервной системы. Между тем именно нейроны функционального модуля являются своеобразными нервными

центрами, осуществляющими нервную регуляцию гладкомышечной стенки на локальном уровне. Поэтому нашей целью являлось рассмотрение реакций гладкой мышцы нижних дыхательных путей (трахеи и бронхов) на предъявление низких доз экзогенного гистамина, соответствующих естественному физиологическому фону организма, а также выявление роли нейронов интрамуральных ганглиев в этих реакциях. Для этого в данном исследовании мы изучили влияние гистамина в низких концентрациях (0,9х10"ш М - 0,9х10"7 М) на гладкую мышцу трахеи и бронхов с учетом роли периферических нервных структур.

Цель исследования:

Изучение роли нейронов интрамуральных ганглиев дыхательных путей в реакциях гладкой мышцы трахеи и бронхов при воздействии низких доз гистамина.

Задачи исследования:

1. Рассмотреть действие гистамина на гладкомышечные клетки трахеи и бронхов крысы.

2. Изучить эффекты гистамина, связанные с эфферентными нейронами ганглия.

3. Изучить эффекты гистамина, связанные с афферентными нейронами ганглия.

4. Исследовать механизмы дилатационного действия гистамина в системе неадренергической-нехолинергической регуляции (НАНХ-системе) нижних дыхательных путей.

Объект исследования:

Объектом исследования являлись изолированные препараты трахеи и бронхов 68 крыс линии Вистар обоего пола с массой тела 250-400 г, в возрасте двух — трех месяцев.

Предмет исследования:

Исследовали влияние нейронов интрамуральных ганглиев на сократительную активность гладкой мышцы различных отделов дыхательных путей крысы на фоне действия низких концентраций гистамина.

Научная новизна:

На основании исследования действия гистамина в низких (0,9х10~10 М - 0,9х10~7 М) концентрациях на гладкую мышцу дыхательных путей крысы выявлено, что гистамин в зависимости от вида применяемой стимуляции оказывает разные, часто противоположные эффекты. При стимуляции мышцы гистамин снижает сократительные ответы гладкой мышцы, а при постганглионарной стимуляции - повышает. При стимуляции преганглионарных нервов наблюдается двухфазность ответа — самые низкие дозы снижают, а высокие повышают сокращения гладкой мышцы. Впервые показано, что эффекторные нейроны интрамуральных ганглиев связаны с активирующими гистаминовыми Н1-рецепторами, которые располагаются на постганглионарных холинергических нервных окончаниях. Они усиливают выход ацетилхолина и, соответственно, повышают сократительную активность гладкомышечных клеток, их представительство сильнее выражено на трахее, чем на бронхах. Чувствительность этих Н1-рецепторов на 3 - 4 порядка выше, чем Н1 -рецепторов гладкомышечных клеток. Показано, что на афферентных нервных структурах, связанных с быстро и медленно адаптирующимися рецепторами, присутствуют Н1- гистаминовые рецепторы, усиливающие сократительный ответ гладкой мышцы при стимуляции преганглионарных нервов. Впервые показано, что НЗ-рецепторы, связанные с тормозной НАНХ системой, расположены на чувствительных нервных окончаниях С-волокон и на постганглионарных тормозных терминалях, последние более чувствительны к гистамину.

Теоретическая и практическая значимость работы:

В результате исследования реактивности гладкомышечной стенки нижних дыхательных путей на фоне влияния физиологически низких концентраций гистамина получены новые данные, расширяющие знания о механизмах нервной регуляции трахеи и бронхов на уровне центральной и автономной нервной системы. Сопоставление реакций гладкой мышцы при естественно-фоновых концентрациях гистамина и при их повышении предоставляет картину физиологических сдвигов, происходящих в нижних дыхательных путях при воздействии ряда патогенных факторов и вызывающих активацию тучноклеточной сиситемы

дыхательных путей и усиленное выделение гистамина. Определение локализации разных подтипов гистаминовых рецепторов, связанных с афферентными и эфферентными нервными структурами нижних дыхательных путей, проясняет характер воздействия медиатора тучных клеток гистамина на органы дыхания и позволяет делать прогноз возможных реакций гладкой мышцы трахеи и бронхов на негативные воздействия внешней среды, Полученные результаты вносят вклад в развитие представлений о механизмах нервной регуляции активности гладкой мышцы дыхательных путей в условиях нормы и патологи и могут помочь определить перспективные направления поиска новых способов фармакологической коррекции заболеваний респираторной системы, сопровождающихся гиперреактивностью дыхательных путей и бронхоконстрикцией. Результаты исследования внедрены в педагогический процесс в преподавании курсов «Физиология системы дыхания» и «Нормальная физиология» в Петрозаводском Государственном университете и могут быть использованы при чтении лекций в учебных заведениях биологического и медицинского профиля.

Положения, выносимые на защиту:

1. Действие гистамина в низких концентрациях на гладкую мышцу дыхательных путей в значительной степени определяется нейронами интрамуральных ганглиев.

2. Наблюдается гетерогенность ответов гладкой мышцы трахеи и бронхов на фоне низких доз гистамина.

Апробация работы:

Материалы диссертации докладывались на 11-ой Международной телеконференции «Актуальные проблемы современной науки», г. Томск, 2013 г.; на IV Всероссийской научной Интернет-конференции с международным участием «Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных», г. Казань, 2013 г.; на III Международной научно-практической конференции «Science in the modern information society III», North Charleston, USA, 2014 г.; на IV Международной научно-практической конференции «Современные концепции научных исследований», г. Москва, 2014 г; на Международной

научно-практической конференции «Наука и образование в XXI веке», Тамбов, 2014 г.

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 - в рецензируемых изданиях.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 135 страницах и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания методов исследования, экспериментальной части, обсуждения результатов исследования, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 52 источника на русском и 106 источников на иностранных языках. Работа содержит 3 таблицы и 46 рисунков.

Методы исследования:

Опыты проводили на изолированных препаратах трахеи и бронхов 68 крыс линии Вистар обоего пола с массой тела 220-350 г в возрасте двух — трех месяцев. Эвтаназию животных производили путем помещения животного в камеру с хлороформом. Изучали сокращения гладкой мышцы, вызванные электрической стимуляцией и воздействие фармакологических веществ. На каждом препарате проводили 3-4 серии экспериментов. Каждая серия предполагала исследование нового фармакологического вещества. После каждой серии производили отмывание препаратов физиологическим раствором в течение 30 мин. Эксперименты были разбиты на четыре этапа. Во время первого этапа исследовались влияние 0,01-100 мкг гистамина на тонические сокращения гладкой мышцы трахеи и бронхов и сокращения, вызванные стимуляцией мышцы. Также рассматривалось действие гистамина на фоне блокаторов гистаминовых рецепторов 100 мкг супрастина, 100 мкг/мл циметидина, 100 мкг бетагистина. На втором этапе изучалась активность гладкой мышцы при воздействии 0,1-10 мкг гистамина при стимуляции постганглионарных нервов. Применялась блокада гистаминовых рецепторов (в тех же концентрациях) и блокада нервно-мышечной передачи (1 мкг/мл атропина). Третий этап исследования был посвящен рассмотрению ответов гладкой мышцы на 0,1-10 мкг гистамина при стимуляции преганглионарных нервов. Определялось участие быстро и медленно адаптирующихся стреч-рецепторов и С-волокон в

реакциях гладкой мышцы, для чего применялись анестетик новокаин 1 мкг/мл и капсаицин 1 мкг/мл, и антагонисты гистаминовых рецепторов в указанных выше концентрациях. Также рассматривались ответы гладкой мышцы на фоне блокады межнейронной передачи 10 мкг гексаметония. На четвертом этапе исследования выяснялась роль тормозной НАНХ-системы в реакциях гладкой мышцы трахеи и бронхов на действие 0,1-10 мкг гистамина, для чего применялись ингибитор синтеза оксила азота L-NAME 10 мкг и ингибитор циклической гуанилат циклазы метиленовый синий 20 мкг.

Результаты исследования и их обсуждение

Эффект гистамина на гладкую мышцу органов дыхания зависит от результата тонкого баланса процессов сокращения и расслабления (Jolly, Desmecht, 2003). Благодаря наличию разных подтипов рецепторов в дыхательных путях гистамин вызывает большое разнообразие ответов в бронхах (Müller et al., 2006). В наших экспериментах экзогенный гистамин в низких дозах (0,01 -10 мкг) вносился в экспериментальную камеру (V=2 мл) методом аппликации; в зависимости от вида применяемой электростимуляции препаратов он оказывал разные, часто противоположные эффекты на гладкую мышцу дыхательных путей крысы (рис.1). При стимуляции мышцы он снижал сокращения, при стимуляции постганглионарных холинергических нервов -повышал, а при стимуляции преганглионарных нервов наблюдалась двухфазность реакции - низкие дозы (0,01-0,1 мкг) снижали, а более высокие (1-10 мкг) повышали ответы гладкой мышцы.

*

—А— мышца

—■— пост

пре

85 -

80

0 | 0,01 | 0,1

10 100

О | 0,01 | 0,1

100

трахея

бронхи

Рис. 1. Ответы трахеи и бронхов при стимуляции пре- и постганглионарных нервов и мышцы.

По оси абсцисс доза гистамина в мкг, по оси ординат изменение ответов в %, за 100 % приняты ответы препаратов трахеи и бронхов в физиологическом растворе. Условные обозначения: «пре», «пост» и «мышца» - стимуляция пре- и постганглионарных нервов и мышечных клеток, соответственно.

* - достоверные (Р<0,05) отличия эффекта гистамина.

Влияние Ш-рецепторов, расположенных на разных структурах трахеи и бронхов на активность гладкой мышцы

Мы проанализировали ответы гладкой мышцы, вызванные разными видами электрической стимуляции, на блокаду Н1-рецепторов супрастином. Чтобы исключить влияние Н2-рецепторов, их предварительно заблокировали циметидином. В опытах со стимуляцией гладкомышечных клеток блокада Н1-рецепторов снижала ответы до 92,4 % на препаратах трахеи и до 83% - на бронхах (рис. 2). При блокаде обоих рецепторов реакция на гистамин отсутствовала. Однако без блокады Н1-рецепторов гистамин на фоне блокады Н2-рецепторов вызывал усиление сокращения гладкой мышцы до 109,9 % на препаратах трахеи и до 115,3 % на бронхах, а у интактных препаратов трахеи и бронхов гистамин снижал сокращения одинаково до 85 %.

Рис. 2. Ответы гладкой мышцы трахеи и бронхов на гистамин при блокаде HI-рецепторов.

По оси абсцисс - вид стимуляции, по оси ординат изменение ответов в %, за 100 % приняты ответы препаратов трахеи и бронхов в физиологическом растворе. Условные обозначения: «пре», «пост» и «мышца» - стимуляция пре- и постганглионарных нервов и мышечных клеток, соответственно; «пост+атр» - ответы трахеи и бронхов на гистамин на фоне атропина при постганглионарной стимуляции.

* - достоверные (Р<0,05) отличия эффекта гистамина.

л - достоверные (Р<0,05) отличия между ответами при разных видах стимуляции.

Таким образом, у интактных препаратов трахеи и бронхов действие Н1-рецепторов, активация которых вызывает увеличение сокращения, подавлялась влиянием низкочувствительных Н2-рецепторов, связанных с торможением сокращения. Снятие этого влияния приводило к увеличению сократительных реакций, при этом на бронхах этот эффект проявляется сильнее, очевидно, на бронхах крысы находится больше Н1-рецепторов. (Matsumoto, 1992, Costello et. al., 1999, Федин и др., 1997, Федин, Крюкова, 2001). Однако у крупного рогатого скота реакция бронхов на гистамин была более слабой, чем трахеи, возможно из-за относительного дефицита HI-рецепторов на гладких мышцах бронхов (Jolly, Desmecht, 2003).

При стимуляции постганглионарных нервов эффект блокады Н1-рецепторов приводил к одинаковому (до 84 - 87 %) снижению сокращения на трахее и бронхах, 10 мкг гистамина уменьшали ответы трахеи до 74 %, а бронхов до 92 %. Блокада нервно-мышечной передачи атропином не изменяла разницы в эффекте гистамина на трахею и бронхи (Рис. 2). Можно предположить, что различия в действии гистамина на трахею и бронхи связаны с разницей реакции самих гладкомышечных клеток на гистамин. Учитывая, что блокада Н1-рецепторов при стимуляции мышцы вызывала на бронхах более сильное снижение ответов, чем на трахее (практически на ту же величину), можно предположить, что на бронхах располагается большее количество Н1-рецепторов, чем на трахее. 10 мкг гистамина вызывали усиление ответов трахеи и бронхов,

вызванных преганглионарной стимуляцией. Блокада Н1-рецепторов или блокада стретч-рецепторов новокаином снимала этот эффект гистамина (Рис. 3).

115 -110 -105 -

100 -95 "

90 -85 -80 -75 -70 -

0 0,1 10

Рис. 3. Действие гистамина на фоне новокаина на сокращения трахеи и бронхов.

По оси абсцисс - доза гистамина в мкг, по оси ординат - изменения ответов в %. За 100 % принимается величина сокращений препаратов трахеи и бронхов на фоне новокаина. Условные сокращения: «тр пре», «тр пост», «бр пре», «бр пост» - трахея и бронхи, преганглионарная и постганглионарная стимуляция, соответственно. * - достоверные (Р<0,05) отличия эффекта гистамина.

.Л

--♦--тр пост —▲— бр пре

--А - ~ бр ПОСТ

По-видимому, гистамин оказывал влияние на Н1-рецепторы, расположенные на афферентных окончаниях. При регистрации импульсной активности от волокон блуждающего нерва, связанных со стретч-рецепторами, было отмечено усиление импульсации в ответ на ингаляцию гистамина кроликам (Matsumoto et al., 1993). Активация этих рецепторов гистамином рефлекторно изменяет активность гладкой мышцы морской свинки (Canning et al., 2001). Можно заключить, что в функционировании интактных препаратов трахеи и бронхов главную роль играют HI-рецепторы, локализованные на постганглионарных холинергических нервах и регулирующие выделение ацетилхолина из нервных окончаний. При патологических состояниях главенство может переходить к Н1-рецепторам, расположенным непосредственно на гладкомышечных клетках, вызывая развитие бронхоспазма, тем более, что на бронхах количество их больше. HI-рецепторы, находящиеся на стретч - рецепторах, также играют значительную роль в патологии, их активация может вызвать кашлевый рефлекс (Canning et al., 2006).

Сравнение функции гистаминовых мышечных Н2-рецепторов и нейрональных НЗ-рецепторов

Н2-рецепторы локализованы на гладкомышечной ткани, а локализацию НЗ-рецепторов связывают с тормозной НАНХ-системой (Burgaud et al., 1992). При стимуляции мышцы блокада Н2-рецепторов приводила к усилению ответов трахеи и бронхов на гистамин, эффект на бронхах проявлялся сильнее, при блокаде НЗ-рецепторов гистамин не изменял величины сокращения мышцы. Аналогичный результат был получен при изучении влияния блокаторов Н2- и НЗ-рецепторов на тонические сокращения на препараты трахеи и бронхов быка (Jolly, Desmecht, 2003). Можно заключить, что при воздействии на мышцу электрическим полем, что в некоторой степени можно рассматривать как влияние на тонус, НЗ-рецепторы не принимают участия.

При стимуляции постганглионарных нервов блокада Н2-рецепторов не изменяла ответов мышцы на стимуляцию нервов, но вызывала усиление ответов на гистамин, причем на трахее сильнее, чем на бронхах. Блокада НЗ-рецепторов приводила к одинаковому снижению ответов трахеи и бронхов до 90 %. После блокады НЗ-рецепторов гистамин незначительно (на 5 %) уменьшал ответы на препаратах трахеи, а на препаратах бронхов - до 15 % (рис. 4). Таким образом, при стимуляции постганглионарных нервов, то есть

Т

в тех условиях, когда выделяется ацетилхолин из нервных окончаний, блокада Н2-рецепторов приводит к усилению сокращений гладкой мышцы трахеи и бронхов, а блокада НЗ-рецепторов - к их снижению.

130

120

110

100

90 ■

80 -

70

60

50

мыш пост

пре

цим

□ трахея И бронхи

мыш пост

бета

пре

Рис. 4. Влияние гистамина на сокращения трахеи и бронхов при блокаде Н2- и НЗ- рецепторов.

По оси абсцисс - вид стимуляции, по оси ординат изменение ответов в %, за 100 % приняты ответы препаратов трахеи и бронхов в физиологическом растворе. Условные обозначения: «пре», «пост» и «мыш» - стимуляция пре- и постганглионарных нервов и мышечных клеток, соответственно, «цим» - блокатор Н2-рецепторов циметидин, «бета» - блокатор НЗ-рецепторов бетагистин.

При стимуляции преганглионарных нервов блокада Н2- и НЗ-рецепторов не изменяла величины сокращений, но усиливала ответы на гистамин, эффект проявляется сильнее на бронхах при блокаде НЗ-рецепторов. Учитывая, что при стимуляции постганглионарных нервов регистрируется снижение ответов, можно предположить, что тормозные НЗ-рецепторы расположены на постганглионарных структурах. Усиление ответов при блокаде НЗ-рецепторов и стимуляции преганглионарных нервов предполагает, что рецепторы локализованы на преганглионарных структурах, возможно на чувствительных нервных окончаниях С-

волокон, так как блокада этих окончаний капсаицином также приводит к усилению ответов (Рис. 5).

\р

125 1 120 115 Н 110 105 -100 -95 -90 -85 80

0

тр

0,1

10

0 бр

0,1 10

Рис. 5. Влияние гистамина на сокращение гладкой мышцы трахеи и бронхов на фоне блокады С-волокон.

По оси абсцисс - доза гистамина в мкг, по оси ординат - изменения ответов в %. За 100 % принимается величина сокращений препаратов трахеи и бронхов на фоне капсаицина. Условные обозначения: тр, бр — трахея и бронхи, пре, пост - преганглионарная и постганглионарная стимуляция, соответственно.

* - достоверные (Р<0,05) отличия эффекта гистамина.

л - достоверные (Р<0,05) отличия между ответами при разных видах стимуляции.

На трахее морской свинки показано, что эффекты НЗ-рецепторов связаны с холинергическими ганглиями, а именно с постганглионарными нервными окончаниями, через их активацию происходит торможение выхода медиатора из НАНХ нервов (1сЫпо5е е1 а1., 1989; Еа-Клт е1 а1., 1996). Кроме того, имеются данные, показывающие, что НЗ-рецепторы могут действовать, как нейронные ингибирующие авторецепторы (Яерка-Иагшгег, 2003). Можно предположить, что НЗ-рецепторы располагаются на разных структурах дыхательных путей: на постганглионарных тормозных нервах и на чувствительных окончаниях С-волокон. При

стимуляции пост- или преганглионарных нервов в большей степени проявляется действие тех или иных рецепторов.

На основании полученных результатов можно заключить, что гистаминовые HI-рецепторы расположены на разных структурах трахеи и бронхов и их активация или блокирование приводит к различным влияниям на сокращения гладкой мышцы. Наибольший эффект при раздражении нервов (что происходит во время каждого дыхательного цикла) проявляют HI-рецепторы, расположенные на постганглионарных холинергических волокнах и регулирующие выход ацетилхолина из нервных окончаний. Н1-рецепторы, локализованные на гладкой мышце в естественных условиях мало активны. Их активность возрастает при нарушении функции тормозных Н2-рецепторов, что приводит к увеличению мышечного тонуса и развитию бронхоспазма. HI-рецепторы, расположенные на стретч рецепторах, оказывая влияние на афферентные структуры дыхательных путей, участвуют в кашлевом рефлексе и модулируют длительность дыхательного цикла. Н2-рецепторы располагаются только на гладкомышечных клетках. Их активация, особенно низкими концентрациями гистамина, вызывает расслабление мышцы трахеи и бронхов, и снижает активность HI-рецепторов, предотвращая развитие бронхоспазма. НЗ-рецепторы связаны с тормозной НАНХ системой и находятся на тормозных постганглионарных нервах и на чувствительных нервных окончаниях С-волокон. Их активация приводит к снижению сокращений гладкой мышцы, вызываемых стимуляцией нервов. Кроме того, НЗ-рецепторы С-волокон могут снижать чувствительность этих окончаний к различным активирующим, в том числе и патогенным агентам, действующим на С-волокна (Canning et al., 2006; De Swert et al., 2007).

Влияние нейронов интрамуральных ганглиев на действие гистамина в трахее и бронхах

Динамика двухфазного ответа, наблюдаемого нами при действии гистамина при стимуляции преганглионарных нервов, подтверждала, что оно может быть опосредовано афферентными нервными структурами и нейронами интрамуральных ганглиев. На препаратах дыхательных путей сенсибилизированных морских свинок показано, что гистамин, высвобождаемый во время реакции гиперчувствительности немедленного типа, имеет прямое

воздействие через активацию HI-рецепторов на нейроны перасимпатических ганглиев бронхов (Myers, Undem, 1995). Ранее была показана роль нейронов интрамуральных ганглиев в реакциях гладкой мышцы крысы на гистамин (Федин, 2001, Fedin et al, 2003).

В наших опытах применение ганглиоблокатора гексаметония снижало сокращения гладкой мышцы сегментов дыхательных путей, вызванные стимуляцией преганглионарных нервов (рис. 6).

105 ■

100

95

90

85 ■

75

□ К В пре 0 пост

тр

Рис. 6. Влияние гексаметония на фоне циметидина на ответы трахеи и бронхов.

По оси ординат - изменения ответов в %. Условные обозначения: «тр» —

трахея, «бр» - бронхи, «К» - контроль, «пре», «пост» - преганглионарная и

постганглионарная стимуляция, соответственно.

* - достоверные (Р<0,05) отличия эффекта гексаметония.

А - достоверные (Р<0,05) отличия между ответами препаратов трахеи и

бронхов.

Ганглиоблокатор потенцировал действие гистамина на гладкую мышцу - ответы трахеи и бронхов повышались до 121 % на трахее и до 111 % на бронхах, величина сокращений трахеи была достоверно выше сокращений бронхов. В то же время при постганглионарной стимуляции ответы и трахеи, и бронхов на

гистамин на фоне гексаметония уменьшались до 84 % (рис. 7). Данные факты свидетельствуют, что нейроны интрамуральных ганглиев модулируют влияние гистамина на гладкую мышцу дыхательных путей. Вероятнее всего, что нейроны ганглия могут оказывать модулирующее воздействие при низких концентрациях гистамина в среде, так снижение ответов при эксперименте наблюдалось только при аппликации низкой дозы; повышение концентрации апплицируемого гистамина уже усиливало сокращения гладкой мышцы. Это может быть связано с присутствием в ганглиях гистаминовых рецепторов разной чувствительности. Повышение сократительной активности гладкомышечных клеток происходит при участии возбуждающих низкочувствительных HI-рецепторов, в процессах расслабления могут быть задействованы нейрональные ингибирующие НЗ-рецепторы, выступающие как авторецепторы (Repka-Ramirez, 2003). В литературе ранее отмечалось, что в модуляцию холинергической нейротрансмиссии в дыхательных путях морской свинки могут быть вовлечены тормозные НЗ-рецепторы (Ichinose et al., 1989). Также указывалась роль оксида азота, синтезируемого нейронами ганглиев. Это было показано на нервных волокнах и вагальных сенсорных ганглиях верхних дыхательных путей человека (Fischer, Hoffmann, 1996). Холинергические азотсодержащие волокна были выделены при изучении парасимпатических нейронов ганглиев в дыхательных путях морской свинки (Calupca et al., 2000).

130 -, 120 -110 -100 -90 -80 -

0 0,1 10 0 0,1 10

трахея бронхи

Рис. 7. Действие гистамииа на фоне гексаметония на сокращения гладкой мышцы трахеи и бронхов.

По оси абсцисс - доза гистамина в мкг, по оси ординат - изменения ответов в %. За 100 % принимается величина сокращений препаратов трахеи и бронхов на фоне гексаметония.

Условные обозначения: пре, пост - преганглионарная и постганглионарная стимуляция.

* - достоверные (Р<0,05) отличия эффекта гистамина.

л - достоверные (Р<0,05) отличия между ответами при разных видах стимуляции.

Роль тормозной НАНХ-системы нейронов интрамуральных ганглиев в действии гистамина

Оксид азота N0 является одним из главных тормозных медиаторов ингибирующей НАНХ-системы, вызывающих дилатацию гладкомышечных клеток. Была рассмотрена роль оксида азота в регуляции активности гладкой мышцы трахеи морской свинки (КШвитоК) & а1., 1997), кролика (Оош^оиНашв е1 а!., 1998), быка (8р1сигга й а1., 2002), собаки (УапЬоиКе, 2013). Его синтез в НАНХ-системе дыхательных путей осуществляется специфическими нейронами интамуральных ганглиев. Торможение НАНХ-индуцированной генерации оксида азота приводило к

уменьшению расслабления гладкой мышцы трахеи морской свинки (МаагБ^Ь ег а!., 2005). Ингибирование синтеза N0 вызывает изменения механики легких в ответ на гистамин и повышает реактивность дыхательных путей у сенсибилизированных морских свинок (РпЬещ е! а!., 2006, ЯЦаркоуа й а1., 2008, ЗЦаркоуа, АЩовоуа, 2011).

Мы рассмотрели эффекты гистамина на гладкую мышцу, применив ингибитор ЫО-синтазы Ь-ИАМЕ (Рис. 8).

Рис. 8. Действие гистамина на фоне Ь-ИАМЕ на сокращения трахеи и бронхов.

По оси абсцисс - концентрация гистамина в мкг, по оси ординат -изменения ответов в %. За 100 % принималась величина сокращений препаратов на фоне Ь-ЫАМЕ. Условные обозначения: «пре», «пост», «мышца» - стимуляция преганглионарных, постганглионарных нервов и мышцы, соответственно. * - достоверные (Р<0,05) отличия от контроля.

На фоне действия Ь-ЫАМЕ гистамин дозо-зависимо усиливал сокращения препаратов дыхательных путей при обоих видах нервной стимуляции. Ответы трахеи и бронхов, вызванные стимуляцией преганглионарных нервов, повышались до 124 - 125 %. При постганглионарной стимуляции показатели сокращения

составляли 113 и 118% на трахее и бронхах, соответственно. В то же время, при стимуляции мышцы на препаратах наблюдалось дозо-зависимое снижение сокращений гладкой мышцы - до 83,0 % на трахее и до 88,0 % на бронхах. Различий в ответах между трахеей и бронхами при всех видах стимуляции не наблюдалось. Амплитуды сокращения, полученные при стимуляции мышцы, не отличались от контрольных величин сокращения препаратов без обработки L-NAME. Это подтверждает сделанный нами ранее вывод о том, что основная дилатация гладкомышечных клеток при стимуляции непосредственно мышцы происходит при включении гистаминовых высокочувствительных Н2-рецепторов,

реагирующих на предъявление низких доз экзогенного гистамина. Результаты, полученные при стимуляции пре- и постганглионарных нервов свидетельствовали об уменьшении дилатирующего влияния NO на гладкую мышцу. При ингибировании NO-синтазы выработка оксида азота в ганглиях снижалась, и мы наблюдали значительное увеличение амплитуды сокращений препаратов при воздействии гистамина. Максимальные значения сокращений препаратов отмечались при стимуляции преганглионарных нервов, что свидетельствует о значительной роли NO-синтезирующих нейронов интрамуральных ганглиев в опосредовании дилатирующего действия гистамина на гладкую мышцу. При стимуляции постганглионарных нервов увеличение сократительных ответов препаратов наблюдалось в меньшей степени. По-видимому, здесь могут быть задействованы какие-то другие механизмы, вызывающие расслабление гладкой мышцы при воздействии низких концентраций гистамина. Возможно, это тормозные НЗ-рецепторы, связанные с нервными путями ингибирующей НАНХ-системы, о чем уже упоминалось выше.

Влияние оксида азота (NO) на гладкую мышцу в значительной мере связано с внутриклеточными механизмами синтеза растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) и с последующим увеличением производства циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). В литературе неоднократно отмечалась важная роль этого пути воздействия N0 в процессах дилатации гладкой мышцы дыхательных путей. цГМФ-зависимые эффекты оксида азота изучались на препаратах трахеи морской свинки (Hwang et al., 1998, Antosova et al., 2008). Однако взаимосвязь между колебаниями

уровня внутриклеточной цГМФ и экзогенным гиетамином низкой концентрации остается малоизученной.

Мы рассмотрели действие 0,1-10 мкг гистамина на гладкую мышцу при инактивации циклической гуанилатциклазы. Сократительные ответы трахеи и бронхов на гистамин на фоне действия метиленового синего возрастали до 110 - 114 % при стимуляции преганглионарных нервов. Во время постганглионарной стимуляции сокращения препаратов увеличивались на 8 - 10 %. В то же время, при стимуляции мышцы ответы трахеи на гистамин снижались до 88 %, тогда как сокращения бронхов практически не менялись (Рис. 9). При всех видах стимуляций гистамин на фоне действия метиленового синего не оказывал влияния на расслабление трахеи и бронхов.

125 120 115 110 105 100 95 90 85

- пре

- пост

- мыща

0 | 0,1 | 10 бр

Рис. 9. Действие гистамина и метиленового синего на сокращения трахеи и бронхов.

По оси абсцисс - концентрация гистамина в мкг, по оси ординат -изменения ответов в %. За 100 % принимается величина сокращений препаратов на фоне метиленового синего. Условные сокращения: «тр», «бр» - трахея и бронхи, «пре», «пост», «мыш» - стимуляция преганглионарных, постганглионарных нервов и мышцы, соответственно. * - достоверные (Р<0,05) отличия эффекта гистамина. л - достоверные (Р<0,05) отличия между ответами трахеи и бронхов.

Применение метиленового синего во время стимуляции нервов увеличивало сокращения препаратов примерно с тем же эффектом, что и действие Ь-ЫАМЕ. Эти эффекты сильнее проявлялись на бронхах, так как величина их сокращений при совместном действии метилинового синего и гистамина во время стимуляции мышцы была примерно на 10 % выше относительно исходного уровня. Ответы трахеи в тех же условиях оставались в пределах амплитуды сокращений без применения ингибитора циклической гуанилат циклазы. Эти результаты согласуются с данными других авторов На трахее и тканях легких морской свинки было показано, что предварительное введение ингибитора растворимой гуанилатциклазы метиленового синего уменьшало амплитуду сокращения гладких мышц в толуол-индуцированной гиперреактивности (А^ОБОУа е! а1., 2008). В наших условиях наибольший эффект ингибитора был выражен при стимуляции гладкомышечных клеток, то есть снижение сокращений было связано с уменьшением потенцирующего действия гистамина при снижении активации Н1-рецепторов. Возможно, разница в ответах трахеи и бронхов на фоне влияния метиленового синего объясняются несколько иным представительством Н-рецепторов на гладкомышечных клетках трахеи и бронхов на разных уровнях генерации бронхо-легочного дерева и, соответственно, различающимся внутриклеточными механизмами опосредования процессов расслабления гладкой мышцы.

Заключение

Результаты проведенных исследований показывают, что характер воздействия гистамина на гладкую мышцу трахеи и бронхов определяется его концентрацией и видом стимуляции препаратов. В зависимости от указанных факторов гистамин может оказывать различные и часто противоположные эффекты на гладкую мышцу дыхательных путей крысы. Самые низкие концентрации не изменяют тонических сокращений гладкой мышцы и вызывают выраженные дилатационные эффекты при электростимуляции гладкомышечных клеток. Прямые механизмы действия низких доз гистамина на гладкую мышцу связаны с активацией высокочувствительных тормозных Н2-рецепторов и менее чувствительных возбуждающих Н1-рецепторов, расположенных на мембране гладкомышечной клетки. Самые

низкие дозы непосредственно воздействуют на гладкую мышцу через трансмембранные Н2-рецепторы и вызывают ее естественное расслабление. При повышении концентрации гистамина до критических значений функции Н2-рецепторов нарушаются и активируются возбуждающие Н1-рецепторы, которые усиливают сокращения гладкомышечной клетки и повышают тонус гладкой мышцы. Стимуляция эфферентных нервных структур потенцирует сократительное действие гистамина на гладкую мышцу. Этот эффект объясняется локализацией на постганглионарных холинергических нервных окончаниях возбуждающих гистаминовых Н1-рецепторов. При воздействии гистамина их активация деполяризирует пресинаптическую мембрану нервных окончаний, что стимулирует выход ацетилхолина, усиливающего сокращения гладкомышечных клеток. В тоже время тормозные НЗ-рецепторы, располагающиеся на постганглионарных тормозных нервах ингибирующей НАНХ-системы, могут снижать высвобождение медиаторов и уменьшать сократительные ответы клеток. Эти влияния на гладкую мышцу определяются локальной и/или центральной активацией возбуждающих эфферентных нейронов функционального модуля дыхательных путей. На фоне афферентных нейрональных влияний действие гистамина носит сложных двухфазный характер, это связано с активацией различных нервных структур, определяющих характер ответа. Трахеобронхиальные быстро адаптирующиеся стреч-рецепторы, вызывающие сократительную активность гладкой мышцы, связаны с возбуждающими гистаминовыми Н1-рецепторами; взаимодействие этих структур потенцирует сократительное действие гистамина. Чувствительные окончания С-волокон взаимодействуют с тормозными гистаминовыми НЗ-рецепторами, что уменьшает сократительный эффект гистамина на гладкомышечные клетки. Непосредственно на нейронах ганглия присутствуют ингибирующие НЗ-авторецепторы.

Таким образом, нейроны интрамуральных ганглиев определяют действие физиологически низких концентраций гистамина на гладкую мышцу, характер этого влияния зависит от взаимодействия различных нервных и рецепторных структур.

Выводы

1. Проведенное исследование показало сложный характер действия гистамина на гладкую мышцу трахеи и бронхов. Это определяется наличием разных типов гистаминовых рецепторов и их локализацией на различных структурах дыхательных путей. Взаимодействие активности этих рецепторов определяет характер ответа респираторного тракта на стимуляцию на фоне действия гистамина.

2. Непосредственно на гладкой мышце Н1-рецепторы активируются только при повышении дозы гистамина. Высокочувствительные Н2-рецепторы тормозят активность HI-рецепторов.

3. На эфферентных нервных структурах (постганглионарных холинергических нервах) локализованы гистаминовые Н1-рецепторы, регулирующие выход медиатора ацетилхолина из постганглионарных окончаний. На трахее HI-рецепторы экспрессированы в большей степени, чем на бронхах. Присутствие ганглиев снижает эффект гистамина, то есть оказывает тормозное влияние.

4. На афферентных нервных структурах дыхательных путей локализуются разные подтипы гистаминовых рецепторов: на стретч-рецепторах присутствуют Н1- рецепторы, активация которых вызывает усиление ответов трахеи и бронхов на гистамин, а на чувствительных нервных окончаниях - тормозные НЗ-рецепторы, снижающие сократительную активность.

5. На постганглионарных тормозных нервах НАНХ-системы присутствуют тормозные НЗ-рецепторы, влияющие на расслабление и сокращение гладкомышечных клеток, на бронхах они экспрессированы в большей степени.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Федин А.Н, Кивер E.H., Смирнова JI.E., Кирилина В.М., Кривченко А.И. Роль интрамуральных ганглиев дыхательных путей в действии гистамина, // Российский физиологический журнал имени И. М. Сеченова, 2014. - т.ЮО, №9. - с. 1059 -1067.

2. Федин А.Н., Постникова Т.Ю., Кивер E.H., Кирилина В.М., Смирнова JI.E. Дилатирующее действие гистамина и серотонина на дыхательные пути крысы // Сб. материалов 11-ой

Международной телеконференции «Актуальные проблемы современной науки». Томск, 2013. - Т. 2, № 2. - с. 74-75.

3. Кивер E.H., Смирнова Л.Е., Кирилина В.М., Федин А.Н. Влияние тормозных гистаминовых рецепторов на активность гладкой мышцы нижних дыхательных путей крысы // Сб. материалов IV Всероссийской научной интернет-конференции с международным участием «Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных»,. Казань, 2013. - с. 58 -62.

4. Кивер E.H., Смирнова Л.Е. , Кирилина В.М., Федин А.Н. Взаимодействие гистамина с НАНХ-системой дыхательных путей крысы // Сб. матер, конф. «Современные концепции научных исследований». М., 2014,- т. 3, № 4. - с. 72 - 77.

5. Смирнова Л.Е., Кивер E.H., Кирилина В.М. Влияние аденозина и гистамина на сократительную активность гладкой мускулатуры трахеи и бронхов крысы // Сб. матер, конф. «Современные концепции научных исследований». М., 2014. - т.2, № 4. - с. 6 - 8.

6. Кивер E.H., Смирнова Л.Е., Кирилина В.М., Федин А.Н. Действие низких доз гистамина в НАНХ-системе нижних дыхательных путей крысы // Сб. матер, конф. «Наука и образование в XXI веке». Тамбов, 2014. - т.16. - с. 59 - 62.

7. Кирилина В.М., Смирнова Л.Е., Кивер E.H., Федин А.Н. Взаимодействие тучных клеток и гладкой мускулатуры в нижних дыхательных путях // Материалы III Международной научно-практической конференции конференции «Science in the modern information society III», North Charleston, USA, 2014. - Vol, 2. - p. 6 -11.

Подписано в печать 30.03.15. Формат 60x84 Чк. Бумага офсетная. Печ. л. 1. Тираж 100 экз. Изд. № 85 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСТИТЕТ Отпечатано в типографии Издательства ПетрГУ Республика Карелия, 185910, г. Петрозаводск, пр. Ленина, 33.