Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фармакологическая модуляция кардиоваскулярных эффектов аденозина

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Фармакологическая модуляция кардиоваскулярных эффектов аденозина"

Г Б ОД } 4 ДЬК 1998

На правах рукописи

КРЫЛОВА Ирина Борисовна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ КАРДИОВАСКУЛЯРНЫХ ЭФФЕКТОВ АДЕНОЗИНА

03.00.13 - физиология человека и животных 14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в отделе нейрофармакологии (руководитель -заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Н.С.Сапронов) Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор -академик РАМН, профессор Б.И.Ткаченко)

Научные руководители:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Н.С.Сапронов

доктор медицинских наук, профессор В.И.Овсянников

Официальные оппоненты:

Лауреат Государственной премии СССР, доктор медицинских наук А.В.Самойленко

заслуженный деятель науки,

доктор медицинских наук, профессор ВАЦырлин

Ведущая организация - Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П.Павлова, Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится " " 1998 г.

в -/3 час, на заседании Диссертационого совета (К 001.23.01) в НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова д. 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН по адресу: Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова д. 12.

Автореферат разослан " ^ " А'О&ё'/ЬЯ 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

О.Г.Куликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Аденозин играет важную роль в регуляции деятельности сердечно-сосудистой системы, особенно в условиях кардиопатологии. Высвобождаясь из кардиомиоцитов, эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов при гипоксии или ишемии сердца, это соединение оказывает влияние на гемодинамику, функции возбудимости, проводимости и сократимости миокардиальной ткани (Sattin A., Rail T.W., 1970; Belardinelli L., et al., 1983). Наблюдение аналогичных эффектов при введении экспериментальным животным и человеку экзогенного аденозина позволило обосновать возможность его использования в качестве лекарственного средства с антиаритмическим и гипотензивным действием (Daly J.W., 1982; Belardinelli L„ et al., 1989; Collis M.G., 1989; Елисеев B.B., 1991; Селизарова И.О., 1992). В настоящее время нашел широкое применение препарат Adenocard® (аденозин для инъекций), рекомендованный Американской кардиологической ассоциацией в качестве средства выбора для лечения пароксизмальных наджелудочковых тахикардий (Гроер К., Кавалларо Д, 1997). Разрешены к клиническому применению периферические вазодилататоры на основе аденозина Adenoscan® и отечественный препарат рибаден (патент Российской Федерации RU 2063227 С1).

Кардиоваскулярные эффекты аденозина реализуются через систему пуриновых (аденозиновых) рецепторов, открытых в 70-х годах нашего столетия (Burnstock G., 1978). Возбуждение Агрецепторов на наружной поверхности сарколеммы кардиомиоцитов приводит, с одной стороны, к ингибированию аденилатцикпазы, связанной с другими рецепторными комплексами, например, ß-адренорецепторами (непрямой цАМФ-зависимый антиадренергический эффект), с другой стороны, к усилению выходящего тока ионов калия вследствие активации ацетилхолинзависимых калиевых каналов (прямой цАМФ-независимый эффект). Возбуждение А2-рецепторов на поверхности клеток сосудистой стенки сопровождается активацией аденилатцикпазы и последующей релаксацией гладкомышечных клеток кровеносных сосудов (Belardinelli L. et al., 1989).

Молекулярные механизмы аденозиновой рецепции предполагают взаимодействие на эффекторном уровне пуринергической системы и нейрогуморальной системы, играющей ведущую роль в экстракардиальной регуляции работы сердца и сосудов (Pelleg А., et al., 1997). Роль такого взаимодействия особенно возрастает в условиях кардиопатологии, в частности, при стрессорном и постишемическом реперфузионном поражениях миокарда.

1

Большинство аспектов, относящихся к взаимному влиянию симпатической, парасимпатической нервной системы, гормонов надпочечников и щитовидной железы и системы аденозиновых рецепторов практически не освещаются в современной литературе. Изучение подобных взаимодействий позволило бы не только расширить теоретические представления о механизмах физиологической и фармакологической регуляции функций сердечнососудистой системы, но и более четко определило бы круг показаний и противопоказаний для клинического применения лекарственных средств, воздействующих на аденозиновые рецепторы.

Цель исследования заключалась в экспериментальной оценке модулирующего влияния симпатической, парасимпатической нервной системы, а также адрено-, холинотропных препаратов и некоторых гормонов на кардиоваскулярные эффекты аденозина в физиологических условиях, при стрессорном и постишемическом реперфузионном повреждении сердца.

Задачи исследования.

1. Изучить зависимость влияния аденозина на сердечнососудистую систему животных от соотношения адренергического и холинергического компонентов нейрогуморальной регуляции.

2. Исследовать действие аденозина на сердце при стрессорном повреждении миокарда и уточнить характер его эффекторного взаимодействия с глюкокортикоидными гормонами и катехоламинами, которые являются важнейшим компонентом стресс-реакции.

3. Исследовать влияние аденозина на постишемическую дисфункцию миокарда и оценить при этом модулирующий эффект адрено- и холинотропных препаратов.

Научная новизна. Проведенное исследование позволило получить ряд новых приоритетных научных результатов. Обнаружено взаимодействие аденозина и адренергических медиаторов в их влиянии на хроно-, дромотропную функцию сердца по типу акцентированного антагонизма. Выявлено кардиопротекторное действие аденозина при стрессорном повреждении миокарда, связанное не только с антиадренергической, но и с антиглюкокортикоидной и антихолинергической активностью препарата. Обнаружено, что при стрессе повышается чувствительность миокарда к аденозину и снижается - к ацетилхолину. Установлено, что улучшение инотропных свойств миокарда под действием аденозина при постишемической дисфункции обусловлено ре-сенситизирующим воздействием аденозина на адренорецепторы сердца.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Аденозин является соединением с ультракоротким фармакологическим эффектом, отрицательное хроно- и дромотропное действие которого на сердце зависит от преобладания симпатического или парасимпатического компонентов нейрогуморальной регуляции.

2. Аденозин оказывает кардиопротекторное действие при стрессорном и постишемическом реперфузионном повреждении миокарда.

3. Позитивные фармакотерапевтические эффекты аденозина на миокард модулируются адрено- и холинотропными препаратами.

Практическая значимость работы.

1. Полученные данные позволяют рекомендовать применение препаратов аденозина в клинике с учетом обязательной оценки типа кровообращения у пациентов. Это позволит, с одной стороны, оптимизировать дозы препаратов при осуществлении лечебных и диагностических мероприятий, а с другой - избежать осложнений, связанных с возможным проаритмогенным действием аденозина.

2. Результаты работы позволяют рассматривать аденозин как кардиопротекторное средство для профилактики стрессорного повреждения сердца и как возможное средство для лечения и профилактики постишемической дисфункции миокарда.

Внедрение результатов исследования. Полученные данные были использованы в процессе разработки и внедрения препарата рибаден на основе аденозина, разрешенного для клинического применения и промышленного выпуска в качестве антигипертензивного средства (протокол №4 Фармакологического государственного комитета РФ от 23 февраля 1995 года).

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на IV и V Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 1997, 1998 гг.), научных конференциях "Использование моделей патологических состояний при поиске биологически активных препаратов" (Москва, 1983 г.), ' Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий" (Санкт-Петербург, 1992 г.), "От materia medica к современным медицинским технологиям" (Санкт-Петербург, 1998 г.) и на научном заседании отдела нейрофармакологии НИИ экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, 1998 г.).

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 6 - в периодической печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора

3

литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав с результатами собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 25 рисунками. Список использованной литературы содержит 2.&Z литературных источников ( 33 отечественных и 223 иностранных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 514 нелинейных белых крысах-самцах массой 250-300 г. Все исследования с применением оперативных вмешательств, включая катетеризацию сосудов, осуществляли при общей анестезии, в случае необходимости - при искусственной вентиляции легких.

Для наркоза использовали этаминал натрия (50 мг/кг, внутрибрюшинно) или пары эфира, подаваемые в контур дыхательного аппарата.

Опыты in vivo. Испытуемые соединения и лекарственные препараты вводили в бедренную или правую яремную вену с помощью полиэтиленового катетера или внутрибрюшинно. Навески субстанций растворяли в 0,9%-ном физиологическом растворе или смешивали с 20 мкл Tween-80 с последующим добавлением физиологического раствора до нужного объема (при болюсном введении - 0,2 мл на животное). В случае необходимости, осуществляли внутривенную инфузию препаратов с помощью шприцевого дозатора.

Фармакокинетику и метаболизм аденозина изучали у крыс при внутривенном одномоментном введении им [8- Н]-аденозина с удельной активностью 2,09 ТБк/г в дозе 12,2 МБк/кг. Через 15 секунд, 1, 15, 30 и 180 минут животных, наркотизированных парами эфира, декапитировали. Пробы крови, миокарда желудочков сердца, печени и почек после специальной обработки разделяли с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле (пластины "Силуфол") в системе диоксан-изопропанол-вода-аммиак (4:2:4:1). Радиоактивность пятен, соответствующих нуклеозидам и нуклеотидам, определяли на сцинтилляционном спектрометре SL-400 фирмы "Интертекник" (Франция) в импульсах в минуту и выражали в процентах по отношению к суммарной радиоактивности хроматографически выделенных фракций. Константы фармакокинетики рассчитывали по уравнениям для двухкамерной математической модели (Соловьев В.Н. и соавт., 1980).

Хроно- и дромотропный эффекты аденозина оценивали по ЭКГ во II стандартном отведении с помощью электрокардиографа ЭК-2Т-02

(ПО "Красногвардеец", Россия). Для оценки изменений длительности сердечного цикла определяли среднюю величину интервала RR за 10 секунд после введения препаратов или максимальную величину интервала RR (обычно - на 4-й - 5-й секунде после внутривенного введения). Среднее артериальное давление (АДср) измеряли в бедренной артерии с помощью катетера, соединенного с датчиком давления ЕМТ-746 ("Сименс-Элема", Швеция) и полиграфом П-4Ч-02 (Россия).

Влияние аденозина на микроциркуляцию оценивали по изменению диаметра артериол и венул брыжейки у крыс при инфузии раствора аденозина в бедренную вену с использованием телевизионного микроскопа ТМ-1, снабженного анализатором телевизионного изображения ("Ленинградское оптико-механическое объединение", Россия).

Эффекты аденозина при стрессорном повреждении сердца изучали на модели водноиммерсионного иммобилизационного стресса (Kanazawa Н., et at., 1980). В миокарде животных определяли активность тирозинаминотрансферазы (ТАТФ) по способности фермента превращать р-гидроксифенилпируват в р-гидроксибензаль-дегид (метод Diamondstone Т., 1966), интенсивность свободнорадикальных процессов и антиоксидантную активность -методом хемилюминесценции (Strechler B.L., Soup S.C., 1953; Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989). Объем повреждения миокарда оценивали с помощью планиметрии серийных срезов желудочков сердца после гистохимического определения в них фермента гликогенфосфорилазы по методу Лойда 3. и соавт. ( Lojda Z., et а!., 1982). Изменение длительности интервалов RR, Р, P(Q), (Q)RS и (Q)T при стрессе определяли по ЭКГ во II стандартном отведении (Driscoll Р., 1980).

Опыты на изолированных перфузируемых сердцах. Изолированные по Лангендорфу сердца (Dorling H.J., Dehnert Н., 1988) перфузировали оксигенированным раствором Кребса-Хенселейта. После 30-минутного периода стабилизации осуществляли 30-минутную тотальную ишемию путем прекращения подачи перфузата. Затем возобновляли перфузию в течение 30 минут. Испытуемые препараты и соединения в необходимых концентрациях вводили в перфузат на протяжении всего периода реперфузии. Оценивали их влияние на хронотропную (по частоте сердечных сокращений) и инотропную (по величине систолического и развиваемого давления в левом желудочке, максимальной скорости сокращения и расслабления желудочков сердца) функции миокарда.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исходя из анализа динамики уровня [8-3Н]-аденозина в сыворотке крови крыс, были рассчитаны фармакокинетические параметры меченого аденозина при его внутривенном введении (Табл.1). Меченый аденозин быстро выводится из организма, период полувыведения составляет 0,17 мин. При определении содержания пуриновых продуктов в тканях сердца, печени и почек, радиоактивный материал в виде аденозина не обнаружен. Через 0,25 мин. после введения наибольшая радиоактивность выявлена во фракции, соответствующей инозину (сердце - 75,0±7,4%; печень - 35,8±1,2%; почки - 73,7±3,7%). Уровни меток в адениновых нуклеотидах были ниже (в сердце: АМФ - 14,8±4,5%, АДФ - 7,2±2,1, АТФ - 3,0±0,9%; в печени: АМФ - 36,9+6,1%, АДФ - 21,7+4,3, АТФ - 5,4±1,5%; в почках: АМФ -15,3±3,1, АДФ - 9,2±1,1, АТФ -1,9±0,3%). Через одну минуту высокий уровень метки в инозине сохранялся, радиоактивность фракций адениновых соединений также существенно не изменялась. На 15-й

Таблица 1. Фармакокинетические параметры меченого аденозина у крыс после внутривенного введения препарата

Параметры Размерность Величина

Константа элиминации, kei -1 мин 6,0

Кажущийся объем распределения, V мл 3,8

Клиренс общий , CI мл/мин 23,1

Период полувыведения, t1/2 мин 0,17

Площадь под кривой концентрация-время, AUC (имп/мин)мин/мл 86,6-103

минуте радиоактивность фракции инозина резко уменьшалась (до 16,2±3,0% в сердце, 28,1±3,8% в печени и 42,1±6,0% в почках), а уровни меток в АМФ, АДФ, АТФ возрастали. Наибольшую радиоактивность имела фракция АМФ. В последующем характер распределения метки сохранялся. Иная картина распределения метки аденозина наблюдалась в цельной крови. Через 0,25 мин. после введения препарата в крови обнаружены следующие уровни радиоактивности: аденозин - 81,2±2,2%, инозин - 1,1±0,1%, АМФ -0,7±0,1%, АДФ - 3,9+0,3% и АТФ -13,0±1,7%. К концу 1-й минуты имело место резкое уменьшение уровня метки во фракции аденозина (до 8,0±3,2%), увеличение радиоактивности фракций инозина (5,7±1,6%), АМФ (4,8±2,2%), АДФ (12,1±1,4%) и, особенно, АТФ (69,4±5,8%).

Спустя 15 мин. уровень метки в аденозине и инозине достигал фона, радиоактивность фракции АМФ уменьшалась до 2,0±.0,4%, а уровни меток в АДФ и АТФ увеличивались до 14,2±1,2% и 84,0+1,5%, соответственно. В последующем радиоактивность отдельных фракций достоверно не изменялась. Полученные данные указывают на то, что в паренхиматозных органах крыс при внутривенном введении аденозина происходит его преимущественное дезаминирование, в то время как в крови - фосфорилирование с образованием АТФ.

При совместном введении аденозина с ингибиторами транспорта нуклеозидов дипиридамолом, 6(Ы-нитробензилмеркапто-пурин)-рибозидом и инозином, ограничивающим мембранный транспорт внеклеточного аденозина, конкурируя с последним за сайты связывания с белком-переносчиком, наблюдалось усиление кардиоваскулярных эффектов аденозина (Рис.1).

90

82

■V 4 64

-34 -38

-45 >

-66

о 2

2

и- 1 ^ га ю сч ш о" + I 1 СП + 10 = 2 + х т о"

5 5 о" I ЬЙ г X О о с! а. С О 1 о о зГ 1- <п о х~

1 п 5 п о 2 I ф х с 5 11 5 X (1) ГО О г

2 о X X £ се £ X 5

Рис.1. Потенцирование кардиоваскулярных эффектов аденозина под действием блокаторов транспорта нуклеозида - дипиридамопа и инозина; * - достоверные отличия по сравнению с аденозином (р<0,05)

Для исследования зависимости хроно- и дромотропного эффектов аденозина, а также его гипотензивного действия от исходного статуса нейрогуморальной регуляции функций сердечно-сосудистой системы экспериментальные животные были разделены на три группы: крысы с гипердинамическим типом кровообращения (длительность интервала ИЯ 140±4 мс, артериальное давление в бедренной артерии АДср

7

130±5 мм рт.ст.); с нормодинамическим типом кровообращения (длительность интервала ЯЯ 170±7 мс, АДср 115+3 мм рт.ст.) и с гиподинамическим типом кровообращения (длительность интервала Р^ 230±11 мс, АДср 90±2 мм рт.ст.). Наблюдалась четкая зависимость между выраженностью отрицательного хроно-, дромотропного действия аденозина и исходной продолжительностью сердечного цикла, в то время как корреляция между исходными величинами АДср и гипотензивным эффектом аденозина отсутствовала (Рис.2). Атриовентрикулярные блокады (АВ-блокады) различной степени выраженности отмечены у 80% крыс с гипердинамическим типом кровообращения, у 60% - с нормодинамическим. В остальных случаях возникала синусовая брадикардия.

£Д К

а. 5

ш х

Ё 9

з го

= £

Ь 2

О £

х -О

А X

С Ч

<ц о

' 8 2

О .

* 3

ф <

8.|

° §

а> с

5 а)

х ш

<" «г

х 5

% К

5 (X

2:

70 60 50 40 30 20 10 О -10 -20 -30 -40

Гипер-

64*

Нормо-

Гипо-

ш

V \>

49

□ АДср

32«

_

■32

-31

-29

Рис.2. Кардиоваскулярные эффекты аденозина у крыс с гипер-, нормо- и гиподинамическим типом кровообращения. * - достоверные отличия по сравнению с группой животных с нормодинамическим типом кровообращения (р<0,05).

Зависимость отрицательного хроно- и дромотропного эффектов аденозина от характера нейрогуморальной регуляции деятельности сердца подтвердилась в ходе экспериментов с использованием р-адреноблокатора пропранолола и М-холинолитика метацина.

Предварительное (за 10 минут до аденозина) внутривенное введение крысам с гипердинамическим типом кровообращения пропрано-

8

лола в дозе 3 мг/кг увеличивало продолжительность интервала ВР* на 24±5%. На этом фоне наблюдалось ослабление хроно- и дромо-тропной реакции на аденозин (Рис.3).

100

9 s X

0 ■у

ГС

1 о >. S о

X g

X

о s

80

60

40

20

-20

-40 L

Изменение RR

61

Изменение АДср

Частота АВ-блокад

24

□ Пропранолол □Аденозин

□ Аденозин + пропранолол

90

31'

-5

-33

50*

Рис.3. Влияние предварительного введения пропранолола крысам с гипердинамическим типом кровообращения на кардиоваскулярные эффекты аденозина.

* - достоверные отличия по сравнению с исходной реакцией на аденозин (р<0,05).

Предварительное внутривенное введение животным с гиподинамическим типом кровообращения метацина в дозе 5 мг/кг приводило к укорочению интервала RR на 16±2% и вызывало усиление хроно-, дромотропной реакции на аденозин (Рис.4.). Не наблюдалось корреляции между изменением АДср после инъекции метацина или пропранолола к моменту введения аденозина и его гипотензивным действием.

Известно, что дисбаланс гормонов щитовидной железы приводит к нарушению процессов возбудимости и проводимости миокардиальной ткани, что связано с изменением плотности р-адренорецепторов и М-холинорецепторов в сердце (Williams L.T., et al., 1977; McConnaughhey M.M., et al., 1979). Было проведено исследование хроно- и дромотропных эффектов аденозина у крыс с исходным нормодинамическим типом кровообращения после тиреоидэкгомии и

9

при гипертиреозе, вызванным ежедневным (в течение 5 дней) внутрибрюшинным введением трийодтиронина в дозе 40 мг/кг. Через 7 дней после двусторонней тиреоидэктомии у животных развивалась брадикардия (длительность сердечного цикла увеличивалась на 26%, с 175±8 мс до 220+8 мс).

100

80

X ф

У

га х

со >«

О х <=С О X о

60

40

20

-20

-40 I-

Изменение

59*

Изменение АДср

Частота АВ-блокад

28

■ Метацин

□ Аденозин

□ Метацин + аденозин

18 20

50*

-16

-35 .37

Рис.4. Влияние предварительного введения метацина крысам с гиподинамическим типом кровообращения на кардиоваскулярные эффекты аденозина.

* - достоверные отличия по сравнению исходной реакцией на аденозин (р<0,05).

Введение аденозина таким крысам увеличивало среднюю продолжительность интервала ЯИ в первые 10 с на 18±1% по сравнению с исходным значением, в то время как у крыс контрольной (ложнооперированной) группы изменение интервала ИИ под действием препарата составило +33±2% (р<0,05). Через 7 дней у животных, получавших трийодтиронин, отмечена тахикардия (укорочение интервала ЯР до 131 ±5 мс), на фоне которой наблюдалось усиление хроно- и дромотропной реакции на аденозин (интервал ИР? увеличивался на 53±6% по сравнению с 29+4% в контроле, р<0,05). В обоих случаях не было отмечено достоверных изменений гипотензивного эффекта препарата.

10

0

Одновременное введение аденозина и изопротеренола (5 мкг/кг) не только нивелировало положительный хронотропный эффект р-адреномиметика, но и потенцировало отрицательное хроно-дромотропное действие аденозина (Рис.5).

Таким образом, спонтанное (гипердинамический тип кровообращения) или индуцированное (гипертиреоз, введение р-адреномиметика и М-холинолитика) преобладание симпатической регуляции деятельности сердца, приводит к усилению хроно- и дромотропной реакции на введение аденозина. Причина этого может заключаться в существовании акцентированного антагонизма между аденозином и адренергическими медиаторами.

125 г-

2 100

50

-Дценозин (1)

- Изопрстеренол (2)

-Дценозин + изопрстеренол (3) •

25

-25

1 • -Г)- -О-

-

с 5с- 15 с 20 с ТТРГГГГ^гО^г 25 с 30 с

Рис.5. Влияние аденозина и изопротеренола на длительность сердечного цикла у крыс; приведены средние величины за каждый временной интервал.

*-pi-3<0,05.

Изучение изменения диаметра сосудов брыжейки крыс под действием аденозина показало, что его вазодилататорная активность максимальна в отношении артериол и венул диаметром 20-30 мкм. Эти сосуды характеризуются слабо выраженной моторной иннервацией (Чернух A.M. и соавт; 1984), с чем, видимо, связано отсутствие зависимости гипотензивного действия нуклеозида от особенностей нейрогуморальной регуляции.

При внутривенном введении крысам болюсов аденозина (0,125 мг/кг) и ацетилхолина (2,5 мкг/кг) максимальное удлинение

11

интервала составило 130±9 и 124±12% соответственно. При совместном одновременном введении этих соединений интервал увеличивался на 396+14%, то есть обнаруживалось потенцирование хроно- и дромотропного эффектов (супрааддитивный эффект). При увеличении дозы аденозина и ацетилхолина в 2 раза получено примерно двукратное увеличение длительности сердечного цикла под действием каждого соединения. Вместе с тем, совместное введение препаратов в этих дозах уже не вызвало потенцирования, отмечалась лишь суммация эффектов (аддитивный эффект). При увеличении дозы ацетилхолина до 10 мкг/кг и аденозина до 0,25 мг/кг суммарный эффект был даже несколько меньшим, чем в предыдущей группе. Введение болюса аденозина (0,25 мг/кг) до начала, на 10, 20 и 30 мин. внутривенной инфузии крысам ацетилхолина в дозе, не вызывающей изменения длительности сердечного цикла (10 мкг/кг-мин"1), сопровождалось увеличением интервала РК на 200±12%, 255±13%, 332±16% и 314±14%, соответственно. Таким образом, усиление хроно-и дромотропной реакции под действием аденозина наблюдалось только на 10-й и 20-й минуте инфузии ацетилхолина. Результаты этих экспериментов свидетельствуют об ослаблении эффектов аденозина при избыточном холинергическом воздействии на сердце (аналогично с действием адреноблокатора и тиреоидэктомии), что может быть связано с уменьшением активности ацетилхолинзависимых калиевых каналов, связанных с М-холино- и Агаденозиновыми рецепторами.

Для изучения эффектов аденозина и их фармакологической модуляции при стрессорнрм повреждении миокарда была использована модель 5-часового водноиммерсионного иммобилизационного стресса. Внутрибрюшинное введение аденозина в дозе 50 мг/кг до и через 2,5 часа после начала стрессорного воздействия привело к ограничению кардиотоксического действия катехоламинов и глюкокортикоидов (Табл.2).

Под действием аденозина объем дистрофических изменений в желудочках сердца уменьшался до 10,9±2,6% по сравнению с 57,2±7,4% в контроле. Сходные результаты были получены при введении животным прогестерона, являющегося аллостерическим ускорителем диссоциации комплексов глюкокортикоидов с глюкокортикоидными рецепторами. При совместном применении аденозина и прогестерона происходила суммация их фармакологического действия на интенсивность свободнорадикальных процессов и активность ТАТФ.

При стрессе изменялись электрофизиологические свойства миокарда. Анализ динамики изменения длительности сердечного цикла

12

Таблица 2. Интенсивность свободнорадикальных процессов, уровень антиоксидантной активности и активность тирозинаминотрансферазы в миокарде крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу (М±т)

Группа Интенсивность свободно-радикальных процессов, усл.ед./мл Общая антиокси-дантная активность, % Активность ТАТФ, мкмоль/мгмин"1

Интакгные 514±71 71 ±2 7,6±0,3

Стресс (контроль) 1309+103* 62+1* 9,0±0,4*

Стресс +аденозин 793±92 */ 77±1 / 5,3±1,2*/

Стресс +прогестерон 915+85 */ 64+1* 7,0±0,3 /

Стресс +прогестерон +аденозин 481±85 / 77±2 / 3,8±0,4*/

Примечания: * - отличие от группы интактных животных статистически

достоверно (р<0,05); / - отличие от контрольной группы статистически достоверно (р<0,05).

через 1, 2, 3, 4 и 5 часов после начала стрессорного воздействия показал, что первоначальная гиперкинетическая кардиальная реакция через 1 час после иммобилизации сменялась гипокинетической, нарастающей к концу эксперимента, когда длительность интервалов Р(О), (О)ЯЭ и (О)Т в 1,5-2 раза превышала исходные значения (Табл.3). После применения аденозина у крыс не возникали нарушения внутрипредсердной проводимости, не про исходила активизация латентных источников ритма и только в 50% случаев изменялась продолжительность интервала (О)Т. Такой эффект аденозина на электрофизиологические свойства миокарда может быть результатом его антихолинергического действия. Высказанное предположение подтвердилось при введении животным М-холинолитика метацина (внутрибрюшинно в дозе 2,5 мг/кг перед началом стресса и через 2,5 часа после иммобилизации), который вызывал эффект, сравнимый с эффектом аденозина вследствие ослабления избыточного холинергического воздействия на миокард. При совместном введении животным аденозина и метацина эффекты обоих препаратов суммировались.

Таблица 3. Изменение параметров ЭКГ у крыс при стрессе (М±т)

Группа мс Р, МС Р(О), мс мс (О)Т, мс

Контроль до стресса после стресса 170110 317+17* 18,510,5 32,512,9* 53,011,0 98,012,0* 15,510,8 22,012,4* 65,012,9 90,013,8*

Аденозин до стресса после стресса 16412 258+11* 17,010,5 18,010,5 53,012,4 81,014,3* 16,511,4 20,511,4* 61,011,9 65,013,3

Метацин до стресса после стресса 16918 25613* 13,511,0 16,510,5 49,012,9 73,014,8* 14,510,5 16,510,5 58,512,4 75,012,9*

Метацин +аденозин до стресса после стресса 16915 189110 14,511,4 14,511,4 48,0+1,0 61,011,9* 14,510,5 15,011,0 59,012,9 59,510,5

Примечание: * - отличия от исходных значений статистически достоверны (р<0,05).

При стрессе менялась чувствительность миокарда к аденозину, что выявилось при внутривенном введении болюса аденозина 0,25 мг/кг до и во время стрессорного воздействия. В начальной (компенсаторной) фазе стресса, когда адренергическое воздействие на миокард возрастает (1 час иммобилизации), хроно-, дромотропный эффекты аденозина усиливались. В последующем, по мере ослабления симпатического влияния, реакция проводящей системы на аденозин ослабевала (2 часа иммобилизации), а затем постепенно усиливалась (3-5 часов). Таким образом, в первые 2 часа после начала стрессорного воздействия реакция миокарда соответствует той, что наблюдалась у интактных животных с гипер- и гиподинамическим типом кровообращения. В дальнейшем, в условиях нарастания холинергического воздействия, которое сопровождается биохимическими, морфологическими и функциональными нарушениями, аденозин вызывает реакцию, не характерную для интакгного миокарда. Это может быть обусловлено увеличением плотности А1(А3)-аденози новых рецепторов или изменением их сродства к агонисту, распадом АТФ до аденозина и инозина, высвобождающихся во внеклеточное пространство и потенцирующих действие экзогенного аденозина, активацией КАтр-каналов, увеличивающих выходящий К^-ток в условиях дефицита АТФ. Нельзя

также исключить пермиссивное действие глюкокортикоидов на эффекты аденозина. Последнее положение косвенно подтверждается тем, что введение интактным крысам глюкокортикоидного гормона дексаметазона (200 мг/кг, внутрибрюшинно 1 раз в день на протяжении 5 дней) вызывало увеличение длительности сердечного цикла под действием внутривенного болюса аденозина (0,25 мг/кг) на 19+3% (р<0,05) по сравнению с хроно-, дромотропным действием нуклеозида до введения гормонального препарата. При этом дексаметазон не влиял на величину интервала RR.

При стрессорном воздействии ослабевали хроно- и дромотропная реакция миокарда на введение болюса ацетилхолина. Максимальное изменение длительности сердечного цикла при внутривенной инъекции ацетилхолина (5 мкг/кг) составляло +284+16% до и +149+8% после 5-часовой иммобилизации (р<0,05).

Представленные результаты свидетельствуют о кардиопротекторном действии аденозина при стрессорном повреждении сердца, механизм которого связан с регуляцией нейрогуморального воздействия на миокард. При совместном применении аденозина с М-холинолитиком метацином и антиглюкокортикоидным препаратом прогестероном их эффекты суммировались.

С целью изучения влияния аденозина на хроно- и инотропную функции сердца, а также возможностей его модуляции в условиях миокардиального станнинга ("оглушения", постишемической дисфункции миокарда) были проведены эксперименты с постишемической реперфузией изолированных сердец крыс.

Введение в перфузат аденозина (50 мкмоль/л) во время реперфузии сопровождалось отрицательным хронотропным действием, частота сердечных сокращений (ЧСС) к 30-й минуте реперфузии была на 37±9% меньше, чем в контрольной группе. При перфузии интактных сердец раствором аденозина при той же концентрации хронотропный эффект нуклеозида был менее выражен -к концу 30-й минуты перфузии ЧСС уменьшалась на 20±8%. Такая же закономерность прослеживалась и в опытах in vivo при инфузии препарата интактным животным и во время постишемической реперфузии.

При добавлении в перфузат М-холиномиметика пилокарпина (50 мкмоль/л) на протяжении постишемической реперфузии ЧСС к 30-й минуте составляла 16±7% от исходной величины, а при совместном применении эквимолярных концентраций пилокарпина и аденозина была еще ниже - 3+1%. При перфузии интактных сердец пилокарпин (50 мкмоль/л) уменьшал ЧСС на 23%. Блокатор М-холинорецепторов

15

атропин (50 мкмоль/л) вызывал небольшой положительный хронотропный эффект при реперфузии изолированных сердец, а при совместном применении с аденозином, взятым в той же концентрации, наблюдалось ослабление отрицательного хронотропного эффекта нуклеозида. При действии на интакгные сердца атропин вызывал положительный хронотропный эффект.

Использование р-адреноблокатора пропранолола (10 мкмоль/л), который не оказывал хронотропного действия на интактный и "оглушенный" миокард, усиливало отрицательный хронотропный эффект аденозина при совместном с ним применении. При постишемической реперфузии изолированных сердец крыс раствором, содержащим норадреналин (1 мкмоль/л), который при той же концентрации вызывал увеличение ЧСС изолированных интактных сердец, не было выявлено достоверного усиления положительного хронотропного влияния по сравнению с контрольной группой. При совместном применении норадреналина (1 мкмоль/л) и аденозина (50 мкмоль/л) обнаружено ослабление отрицательного хронотропного эффекта нуклеозида. Изопротеренол (1 мкмоль/л), оказывал положительное хронотропное действие на интактный миокард, превосходящее эффект норадреналина. При постишемической реперфузии этот эффект изопротеренола ослабевал, а при совместном введении с аденозином, также как и в случае с норадреналином, выявлено ослабление отрицательного хронотропного действия нуклеозида.

Таким образом, при перфузии интактных и реперфузии ишемизированных сердец растворами, содержащими аденозин, отмечено отрицательное хронотропное действие нуклеозида, которое усиливалось при возбуждении М-холинорецепторов и блокаде адренорецепторов сердца и ослаблялось при сочетанном применении с адреномиметиками или М-холинолитиком атропином. Хронотропный эффект аденозина был более выражен при постишемической реперфузии, чем при перфузии интактных сердец.

При постишемической реперфузии изолированных сердец крыс наблюдались характерные признаки реперфузионного синдрома в виде миокардиального станнинга (Табл.4). Основные показатели инотропной функции сердца - систолическое и развиваемое давление в левом желудочке (Рсист и РДлж), а также максимальная скорость сокращения и расслабления миокарда (+с!Р/с11ГПаХ и -(^Р/сИпих). к 30-й минуте реперфузии составляли, соответственно, 65, 27, 40 и 64% от исходных значений. При добавлении в перфузат аденозина (50 мкмоль/л) на протяжении периода реперфузии указанные параметры возвращались к исходным значениям. Эффект аденозина

16

Таблица 4. Инотропный эффект аденозина и некоторых фармакологических модуляторов на изолированные сердца крыс к 30-й минуте постишемической реперфузии в процентах к исходным значениям (М±т)

Группа Рсист РДлж +с!Р/с11тах -с1Р/с11тах

Контроль (реперфузия -РП) 65±3 27±2 40+7 64±2

РП + аденозин 107±8* 92±12*/ 99±8 * 105±9 *

РП + ДПФК + аденозин 19+27 23±3 / 10±5 */ 76±18 /

РП + фенилэфрин 40±57 20+1 */ 28±2 */ 40+4 */

РП + норадреналин 38±87 13+1 7 15+1 */ 41±1 */

РП + изопротеренол 42+17 31 ±4 29+3 * 48+6 */

РП + фенилэфрин + аденозин 92+9* 86+13* 93±15* 88+12*

РП + норадреналин + аденозин 115+2* 84+7 * 138+16*/ 185+13*/

РП + изопротеренол + аденозин 59+7 / 46+19*/ 47±15 / 72±15*

РП + пропранолол 52+8 36±6 35±3 75±6

РП + хлороквин 43±9*/ 20+4 25±4 * 25±4 *

РП + пропранолол + аденозин 57±6 / 51±9 */ 58±6 */ 72±13 /

РП + хлороквин + аденозин 29±7*/ 23±7 / 20±10*/ 12+3 */

РП + пилокарпин 118±4* 113+12* 184±18*/ 108±12*

РП + пилокарпин+ аденозин 97±9* 90+29* 91±4 * 106+15*

Примечания: * - достоверные отличия от величин в группе контроля (р<0,05); / -достоверные отличия от группы с реперфузией раствором, содержащим только аденозин (р<0,05).

блокировался антагонистом аденозиновых рецепторов 1,3-дипропил-8-фенилксантином (ДПФК, 50 мкмоль/л). 30-минутная перфузия интактных сердец крыс раствором, содержащим с^-адреномиметик фенилэфрин, р-адреномиметик изопротеренол или а-, р-адреномиме-тик норадреналин (все в концентрации 1 мкмоль/л) сопровождалась

17

положительным инотропным действием препаратов. Противоположный эффект наблюдался при добавлении этих веществ в перфузат во время постишемической реперфузии. При совместном введении фенилэфрина и норадреналина с аденозином происходило восстановление сократительной способности левого желудочка. Использование р-адреномиметика изопротеренола с аденозином сопровождалось менее выраженным эффектом. Антагонист р-адренорецепторов пропранолол (1 мкмоль/л), вводимый совместно с аденозином, уменьшал положительный инотропный эффект нуклеозида. Еще более выраженное действие оказал хлороквин (50 мкмоль/л) - ингибитор фосфолипазы С, которая является регуляторной единицей си-рецепторного комплекса.

Агонист М-холинорецепторов пилокарпин (10 мкмоль/л) оказывал положительное инотропное действие на миокард, превышающее эффект аденозина хотя при перфузии интакгных сердец выявлено его слабое отрицательное инотропное действие. При совместном воздействии пилокарпина и аденозина на миокард во время постишемической реперфузии не наблюдалось суммации или взаимного потенцирования их положительного инотропного действия, возможно, вследствие достижения максимально возможного эффекта при действии каждого препарата.

Представленные результаты свидетельствуют о положительном влиянии аденозина на инотропную функцию "оглушенного" миокарда и о возможности его модуляции адренотропными препаратами. Эффекты сочетанного применения аденозина с а-адреномиметиками фенилэфрином и норадреналином, а также с блокатором агадренорецепторов хлороквином дают основание полагать, что положительное инотропное действие аденозина связано с ресенситизацией адренорецепторов и восстановлением адренергической регуляции сократительной функции миокарда.

ВЫВОДЫ

1. Аденозин является препаратом с ультракоротким фармакологическим действием (период полувыведения у крыс ^2=1 Ос), при внутривенном введении оказывает гипотензивное, отрицательное хроно- и дромотропное действие, которое потенцируется блокаторами его мембранного транспорта - инозином, дипиридамолом, 6(М-нитробензилмеркаптопурин)-рибозидом (ЫВМРК).

2. Хроно- и дромотропный эффекты аденозина более выражены у крыс с высокой адренергической активностью (при гипердинамическом типе кровообращения, блокаде М-холинорецепто-

18

ров, активации Р-адренорецепторов или введении трийодтиронина), что можно расценить как проявление акцентированного антагонизма на уровне Агаденозиновых и р1-(р2)-адренорецепторов сердца.

3. У животных с преобладанием холинергической активности (гиподинамический тип кровообращения, активация М-холинорецепторов, блокада Р-адренорецепторов или тиреоидэктомия) хроно- и дромотропный эффекты аденозина ослабевают, что может быть связано с десенситизацией ацетилхолинзависимых калиевых каналов мембран кардиомиоцитов. Преобладание адренергической или холинергической регуляции сердечно-сосудистой системы не влияет на гипотензивный эффект аденозина.

4. Аденозин оказывает кардиопротекторное действие при стрессорном повреждении сердца крыс, которое можно объяснить антиадренергической и антиглюкокортикоидной активностью препарата в компенсаторной фазе стресса и антихолинергическим эффектом - на стадии декомпенсации.

5. Стрессорному повреждению сердца сопутствует увеличение чувствительности проводящей системы сердца к аденозину и уменьшение - к ацетилхолину, что может свидетельствовать об увеличении роли аденозиновых рецепторов в регуляции функций сердца при патологии.

6. Аденозин усиливает инотропную функцию левого желудочка сердца при постишемической реперфузионной дисфункции миокарда за счет ресенситизации адренорецепторов (преимущественно а,-, в меньшей степени - рг или р2-).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Использование препаратов аденозина в клинике для диагностических и лечебных целей следует осуществлять с учетом уровня адренергической и холинергической регуляции сердечнососудистой системы, обращая внимание на тип кровообращения (гипер-, нормо-, гипокинетический), назначение препаратов, влияющих на нейрогуморальную регуляцию сердца, эндокринологический статус. Это поможет оптимизировать дозы препаратов и избежать осложнений, связанных с возможным проаритмогенным действием аденозина.

2. Учитывая выраженный кардиопротекторный эффект аденозина при стрессе, целесообразно рассмотреть возможность создания оптимальной лекарственной формы для профилактики стрессорного повреждения сердца, провести ее доклиническое и клиническое изучение.

3. Целесообразно дополнительное клиническое изучение препаратов на основе аденозина в качестве профилактических и лечебных средств при постишемической дисфункции миокарда в кардиохирургии и тромболитической терапии инфаркта миокарда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морфофункциональный анализ лечебного эффекта некоторых нуклеозидов и нуклеотидов при нейродистрофическом поражении миокарда // Использование моделей патологических состояний при поиске биологически активных препаратов: Матер.конф., ч.1. М., 1983. С.57-58 (соавторы Елисеев В.В., Новиков В.П., Заводская И.С., Ильин Г. И., Ковалева В.А.).

2. Изменения микроциркуляции в брыжейке крысы при гипотонии, вызванной аденозином //Физиол.журнал СССР. - 1987. -№8. -С.1133-1135 (соавтор Елисеев В. В.).

3. Влияние аденозина на системную гемодинамику при острой артериальной гипертензии // Патолог.физиол.эксперим.терапия. -1987. - №5. - С.26-28 (соавторы Елисеев В.В., Овчинникова А.Г.).

4. Влияние аденозина на изменения гемодинамики при развитии нейрогенных поражений миокарда // Бюлл.эксперим.биол. -1989. - № 4. - С.409-411 (соавторы Заводская И.С., Елисеев В.В., Новиков В.П., Овчинникова А.Г.).

5. The effect of adenosine on the development mechanism of neurogeneous myocardial damage // Biogenic amines. - 1990. - Vol.7. -P.409-415 (соавторы Zavodskaya I.S., Eliseev V.V., Novikov V.P., Astakhova L.A., Nilova T.N., Poltavchenko G.M., Slobodskaya V.V.).

6. Влияние аденозина на гемодинамические показатели при нейрогенном повреждении миокарда // Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий: Матер.конф. С.-Пб., 1992. С.73 (соавторы Елисеев В.В„ Заводская И.С., Новиков В.П., Овчинникова А.Г., Астахова Л.А.).

7. Нейроэффекторная регуляция миокарда при реперфузии после ишемии // Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий: Матер.конф, С.-Пб., 1992. С.197 (соавт. Елисеев В.В., Селизарова Н.О.).

8. Влияние длительности сердечного цикла на хроно-, дромотропный эффекты аденозина и на его проаритмогенное действие II IV Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тез.докл. М., 1997. С.269 (соавторы Елисеев В.В., Евдокимова Н.Р., Сапронов Н.С.).

9. Фармакокинетика аденозина у крыс // Эксперим.клин.фармакол. -1997. - №2. - С.56-57 (соавторы Прокопенко В. М„ Елисеев В.В.).

10. Зависимость кардиоваскулярных эффектов аденозина от типа кровообращения у крыс // Росс.физиол.журнал. - 1998. - №5-6. -С.507-512 (соавторы Елисеев В.В., Сапронов Н.С., Евдокимова Н.Р., Овсянников В.И.).

11. Влияние аденозина и прогестерона на повреждение миокарда при стрессе // От materia medica к современным медицинским технологиям: Матер.конф. С.-Пб., 1998. С.85 (соавторы Елисеев В.В., Прокопенко В.М.).

12 Влияние аденозина на развитие дистрофических процессов в миокарде и слизистой оболочке желудка крыс при стрессорном воздействии // V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тез.докл. М., 1998. С.615. (соавторы Сапронов И.С., Елисеев В.В., Евдокимова Н.Р., Торкунов П.А.).