Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние производных аденозина на нейрональную дифференцировку клеток феохромоцитомы РС12

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние производных аденозина на нейрональную дифференцировку клеток феохромоцитомы РС12"



^ всероссийский научный центр

МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

На правах рукописи УДК 576.536:577.17.02

ЮСУПОВА Раиса Анваровна

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ АДЕНОЗИНА НА НЕЙРОНАЛЬНУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ КЛЕТОК ФЕОХРОМОЦИТОМЫ РС12.

03.00.04 — Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения, Москва.

Научный руководитель: доктор химических наук Н. В. Породенко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Н. А. Федоров

кандидат биологических наук В. К. Сологуб

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН, г. Черноголовка.

Защита состоится 22 июня 1993 г. в час. Мин.

на заседании Специализированного совета К 074.51.01 при Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения по адресу: 113149, Москва, Симферопольский б-р, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦМДЛ.

Автореферат разослан « Я/ » ¿-¿-&Л- 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук В. В. Отраднова

л 0Б1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕНЫ. Фактор роста нервов - белок, мишенью действия которого являются симпатические, сенсорные и центральные холинергические нейроны. Действие ФРН определяет нормальное развитие и Функционирование нервной системы в эмбриогенезе, поскольку он регулирует рост и ориентацию нервных волокон, пролиферацию и дифференцировку нейробластов. Способность к восстановлению нарушенной иннервации у зрелого организма также связана с ФРН. Нарушения в механизме действия ФРН приводят к тяжелым поражениям нервной системы-

Неханизи его биологического действия изучается в основном на 2-х модельных системах: клетках культур первичных нейронов и клетках клона Феохомошггомы крысы РС12, полученной Грином и Тишлером в 1вте г. Неханизи действия ФРН на клетки -мишени в настоящее время не ясен, несмотя на то, что в последнее время в этой области достигнуты большие успехи. Так, показано, что ФРН взаимодействует со специфическими рецепторами на поверхности, активируя при этой целый ряд систем вторичных посредников. На определенном этапе изучения механизма действия ФРН, было выдвинуто предположение о возможности опосредования действия ФРН через систему циклического лю. Предположение основывалось на результатах ряда авторов, показавших, что через несколько минут после связывания ФРН . с рецептором уровень camp в клетке повышается, а также на том. что аналог camp, дибутирил camp <вг2сАМР) аналогично ФРН вызывает появление отростков на клетках р<н2, а также модулирует синтез практически тех же белков, что и ФРН.

Однако другими авторами эти результаты не были воспроизведены» и в совокупности данные о роли camp как вторичного посредника фрн являются потиворечивыми. в частности замечено, что нейриты, обазуемые клетками РС12 в присутствии Bt2cAMP сушественно отличаются как по морфологии, так и по кинетике появления и стабильности к ингибиторам транскрипции и трансляции от нейритов, появляющихся в результате воздействия ФРН-:

В последнее время появились данные, позволяющие , по-иному.> взглянуть на механизм действия Bt2camp. изначально это соединение использовалось как гидроФобизованное производное camp, более устойчивое к действию Фосфодиэстераз циклических нукле- : отидов и предполагалось^ что при длительной инкубации происходит его накопление в клетке, что позволяет изучать, клетку, находящуюся в состоянии с повышенным.уровнем camp, однако было показано, что в ходе таких экспериментов значительная часть Bt2cAMP разрушается, появляются нетаболиты, действие которых, возможно, и приводит к появлению отростков на -клетках рс»г. При изучении других систем также неоднократно высказывалось предположение относительно действия camp и его производных, . отмечалось, что сходство эффектов, вызываемых этими разными в химическом плане соединениями. . . может; быть обусловлено существованием .единого продукта, появлявшегося в процессе деградации этих соединений. Что касается клеток PCta, то рядом авторов было показано существование рецепторов к аденозину на мембране этих клеток. Установлена, их принадлежность к подтипу А-2. ■ ' ■ '. "' ' \ /

ЦЕЛЬ РАБОТЫ- Целью настоящей работы явилось-изучение влия-.-ния аденозина и ряда его производных. - atp, adp, amp. с amp BticAMP. на морфологию клеток PC12. Поскольку клетки rci2

- Э - '•*

служат моделью для изучения механизма действия ФРН, задачей данной работы явилось также изучение взаимного влияния адено-зина и ФРН на, эффекта, вызываемые этими агентами и установление связи между эффектами, вызываемыми аденозинои и известными эффектами BtjcAMP,' одного из наиболее часто используемык гидрофобизованяых производных camp,

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ- ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

В настоящей работе впервые показано, что аденозин в низких концентрациях (мкН) индуцирует рост нейритов у клеток Фе-охромоцитомы PCií практически ^ерез зо иин инкубации. Аналогичным нейритстимулирущин эффектом обладали производные аденозина ' атр, adp, amp, camp, bt2camp, а также агонисты аденозиновых рецепторов сна и ñeca. Обнаружено, что нейрит-стимулируюший эффект атр, camp проявляется только в присутствии сыворотки, а эффект, вызываемый Bt2cAMP, значительно усиливается в среде с сывороткой. Нейритстимулируший эффект атр зависит, кроне того, от концентрации ионов мд2+. сна и ñeca вызывают образование отростков, имеющих норфологию, характерную для аденозииа. причем сна вызывает равный с ñeca морфологический ответ клеток pci2 в концентрации на г порядка превышающей концентрацию ñeca, что указывает на то. что эффект аденозина опосредуется рецептором, относящимся к А-2 подтипу. Показано, что дипириданол. ингибитор транспорта аденозина в клетку, увеличивает время действия как аденозича, так и атр и BtjcAMP. ТеоФиллин. добавляемый к иктактнык клет-кан PCJ2, не изменял уровня camp в клетке, но выступал в качестве антагониста аденоЗина. снимая стимулирующее влияние . дипиридамола на рост нейритов, вызываемый атр. Эти результаты

* -

указывают на то, что для индукции роста нейритов под воздействием Btjeamp и других производных аденозина важна концентрация этих соединений имменно с внешней стороны плазматической мембраны, что, в свою очередь, свидетельствует в пользу ре-пептор-опосредуемого механизма их действия- Это обстоятельство исключает возможность дальнейшего использования Bt2e*MP в качестве проникающего в клетку гидроФобизованного производного сАмр, по крайней мере, в клетках, имеющих на мембране рецепторы к аденозину и в средах с высоким содержанием сыворотки. Впервые показано, что ФРН стимулирует ранюю индукцию роста нейритов, вызывайую адеНозином. Аденозин вызывал появление отвосткоа характерной морфологии не только у недифференцированных клеток rea, но и у дифференцированных.под воздействием ФРН клеток, что очевидно указывает на важность функционирования аденозиноых рецепторов как для делящихся, так и для диФФеренпированных клеток pcia.

Показано, " что поздний нейритстимулируюший эффект аденозина. проявляющийся через .ч инкубапии клеток в среде.: содержащей аденозин и ФРН (или в*2самр и ФРН». сохраняется и в том случае, если ФРН добавлять к клеткам. ; предобработакным аденозином за i сутки и более до момента добавления ФРН. г ' "

ПУБЛИКАЦИИ. .По материалам диссертации опубликовано i печатных работ. _

' СТРУКТУРА И ОБЬЕН РАБОТЫ. Работа состоит, из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описания результатов. проведенных автором исследования и их обсуждения, а также выводов и списка литературы, включающего l&e наименова--ний- Диссертация изложена .на 95 страницах машинописного текста.

включая »в рисунков и i таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ-

РАЗДЕЛ. 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ-

В эток разделе детально рассмотрены данные о пуринэрги-ческих рецепторах, их классификация, эффекты, вызываемые при активации рецепторов каждого типа- Показано, что адениновые • нуклеоткяы и аяенозин активируют различные типы рецепторов-Детально рассмотрена роль .атр, способного благодаря своим свойствам макроэргического соединения участвовать как в реак-. циях эктоФос Формирования. , так и в активации соответствующих рецепторов. Также описаны культивируемые линиии клеток, осу' шествляшие секрецию атр во внеклеточное простроанство. Это хромаФФинные клетки паренхимы надпочечников, нейроны и тромбоциты. Перечислены источники образования аденозина, среди которых секретируемый во внеклеточное пространство атр, а в экспериментальных системах - BtjcAMP, и пути его инактивации. Уделено значительное место рассмотрению механизма диФФеренци-ровки нервных клеток, а также описанию свойств клеток Феохро-мопитомы крысы РС12, используемых в качестве модели нейрона. Описаны ранние-и поздние эффекты Фактора роста нервов .

. ■ РАЗДЕЛ. 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. .

В этом разделе описаны условия культивирования клеток клона Феохромопитомы крысы PCi 2, методы подсчета клеток с нейритами и оценки интенсивности морфологического ответа клеток. Приведен .метод Флуоресцентного окрашивания актинового питоскелета TRITC-Фаллоидином и нетодика определения уровня внутриклеточного сакр.

- б -

РАЗДЕЛ. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ-ГЛАВА 3.1. Норфологическая яифферендировка клеток pciг в присутствии аденозина и его производных (ATP, ADP, AMP, BtjcAMP) Нногини исследователями давно было отмечешь что отростки. образуемые клетками РС12 в присутствиям bt2cAMP несколько отличаются как по морфологии, так и по кинетике появления и стабильности к ингибиторам транскрипции и трансляции от нейритов, появляющихся в результате воздействия ФРН. .

Так, инициация роста нейритов происходит довольно быстро в отличие от ФРН и не требует, синтеза РНК . (Gunning р, w. et al. , (981 ) отростки. появлятиеся в присутствии Bt2CAMP, не имеют конусов роста и не проявляют тенденции к формированию сети нейритов и синапсов (Green S. Н. et a»., 19861

Нами показано, что клетки образуют отростки с аналогичной морфологией при добавлении в культуральную среду аденозина. и ряда его производных: атр, adp, amp . а не только вг2слмр (рис. t)■ Установлена зависимость интенсивности морфологического ответа клеток ( ее амплитуда, длительность)! от концентрации аденозина в среде. Показано, что клетки способны образовывать отростки при концентрации аденозина i мкМ. Отростки v появлялись через короткий промежуток времени- Инкубация кле- ; ток с otp или btjcdmp не вызывала роста нейритов-

Было замечено, что эффект/, вызваемый атр, в отличие от авр и амр, сильно зависит от концентрации ионов мд2< (РИс. 2аь Для появления отростков в присутствии adp, амр, а также аденозина (рис. 2, б, в) присутствие ионов Mg2* не являлось обязательным и практически .' никак не влияло на индекс клеток с

Рис. «. Зависимость индекса клеток РС12 с нейритами (см. •Экспериментальную часть"» от времени их культивирования в среде, содержашей в км мдс12, а также 1 ин атр (и, а»р (21, амр (3), $»гсАир <*» или аденозина <»)-

: Рис. 2. Влияние различных концентраций мдС1г на индекс клеток с нейритами (м( в присутствии » мН атр (а!. 1 мн апр (Б) и i мн амр' (В) в среде, содержащей йох сыворотки. Концентрация мэс»2 о.а мН «и, г,в мн и», мн «з» и «о.в мн

- в -

нейритами, лтр в среде с низкой концентрацией мд2* j в среде, dmem конпетрапия Щг* равна о, в mhj в (большинстве случев не вызывал образования отростков'или же образовывал в гораздо меньшей степени, чем в присутствии заметных количеств Mg2f. Вероятно это связано с тем. что для проявления Ферментативной активности систем, вовлеченных в деградацию атр, требуются ионы Mg2t в качестве кофактора реакции, поскольку хорошо известно, что для реакций, протекающих с использованием атр, ионы Мд2* являются необходимыми косубстратами. Понимо этого известно, что активность 5. - эктонуклеотидазы самих клеток зависит от концентрации ионов ид2+.

ГЛАВА з. 2. Влияние сыворотки, присутствующей в среде куль- .

тивирования, на, образование нейритов у клеток рс12 под действием различных нуклеотидов.

В работе Браумаяна и соавт. Н9вв> была исследована стабильность циклических нуклеотидоа в условиях, наиболее часто используемых при работе с клетками; длительная инкубация при зт° с, высокое содержание сыворотки в культурадьной среде.

•у, » • ••

Было показано, что в этих условиях значительное количество camp и Bt2cAMP деградирует (например, BtjcAMP при начальной концентрации « мН через 72 часа разрушается примерно на son», образующиеся при этом продукты распада обладали аналогичной с Bt2cAMP стинулируюшей активностью на индукцию роста нейритов, вызываемую ФРН.

Мы также предположили, что поскольку влияние веек исполь-зуемых-здесь производных аденозина на морфологию клеток РС12

- было аналогично, действуюяим началом для всех нуклеотидов в этих условиях является, по-видимому, аденозин. который ножет появляться в среде под действием Ферментов сыворотки.

Было проверено влияние сыворотки на рост нейритов у клеток Petz под действием различных нуклеотидов.. Из рис. з видно, что наличие сыворотки в среде необходимо для появления отростков в присутствии атр и camp, а также в значительной степени влияет на эффект, вызываемый Bt2camp по крайней мере в первые сутки инкубации. Присутствие, сыворотки не Играло стояь значительной роли в случае adp, amp или аденоэина. Весьма вероятно! что для превращения adp или amp в аденозин более существенную роль играет эктонуклеотидаза плазматической мембраны клеток, а не ферменты сыворотки. Кроме того, известно, что amp также является хорошим лигандом для активации аденозинового рецептора наряду с аденозином (Burnstock g, et al. , 1985).

Результаты этих экспериментов позволяют полагать. ' что сыворотка, добавляемая в среду для культивирования клеток, может существенно влиять на. результаты эксперимента, посколь-' ку, как это уже отмечалось выше, вещества, добавляемые в среду, могут кетаболизироваться с появлением множества продуктов распада, обладающих иной биологической активностью.

ГЛАВА 3. 3. Дипирицамол, ингибитор транспорта аденозина , в клетку, повышает интенсивность морфологического ответа клеток РС12 в присутствии как аденоэина, так и его производных.

¿4

.-'.'• ВРЕМЯ ' ,1

Рис. 3. Влияние сыворотки на индекс клеток с нейритами в , Присутствии О, i MM ATP <A>, о, t МИ ADP <Б1, 0,1 KM AMP {Bh о, i мН аденозина <гь о, t мн camp <д>, о, t ни bt2camp je». »-среда, содержащая юк сыворотки и s, » мн Идс12, 2-среда без сыворотки, содержащая s. в мН Mgci2. ' , .

4k z

время. ч

Рис. 4. Зависимость индекса клеток рс«2 с нейритами от времени инкубации в присутствии аденозина вереде с сывороткой, содержашей Ю мкМ дипиридамол и аденозин (1 ( или только аленознн (2) при различных концентрациях аденозина: 50 (А). 5 IГ». » ккМ <В1. -

- U -

Известно, что клетки РС12 имеют на своей поверхности аде-нозиновые рецепторы А-2 подтипа (Noronha-Btob L. , et at. , 1986i.■ При связывании с ними аденозина происходит активация аденилатииклазц. По-пидимому, эФФекти. вызываем!,ie аденозинои . и его производными, в том числе и BtjcAMP,. опосредуются именно этими рецепторами .

Для проверки этого предположения в культуральную среду наряду с аденозином, атр или bt2camp добавляли дипиридамол, который является ингибитором транспорта аденозина в клетку (ваег н. p., et ai., 1984.). из данных, приведенных на рис. видно, что добавление дипиридамола в концентрации to мкМ значительно влияет на длительность сохранения нейритов на клетках РС12, появляющихся под действием аденозина. Это особенно заметно при небольших концентрациях аденозина 1\< ю мкН). Здесь видно, что в присутствии дипиридамола существенно продлевается время, в течение которого клетка сохраняет свои отростки. При малых концентрациях аденозина ( t-5 мкН, рис- 4-, Б, В) эффект дипиридамола ошутим при малых временах инкубации-При более высоких концентрациях аденозина --эффект проявляется позднее, т. е. всегда приурочен ко времени исчезновеня отростков.

По-видимому основной причиной исчезновения отростков при воздействии небольшими концентрациями аденозина является захват его клетками . На это указывают и другие авторы, определявшие уроваень, camp в клетках, обработанных аденозином.

При определении степени морфологического ответа клеток РС12 мы проверяли среду с аденозином , инкубированную с клетками вплоть до исчезновения у них отростков . на способность

Ni

40

ю

•1 д2 O3 O4

Рис. 5. Морфологический ответ клеток РС12 в присутстбии ю мкН апенозина при инкубации их в свежеприготовленной среде, содержащей Iох сыворотки И)! со средой, перенесенной от обработанных аденозинои клеток после исчезновения у них отросткоз (момент добавления среды обозначен стрелкой) к свежим клеткам (2>; со; средой, содержащей сыворотку. инкубированной такое же время (3.5 ч) при это с в пробирке (зи со средой'без сыворотки. содержащей аденозив. инкубированной при это с в течение

} з, 5 ч <+).

вызывать образование отростков у "свежих" клеток. При аобав-

ние среды'по аденозину.

Помимо самих клеток существенный вклад в убыль аденозина вносит сыворотка, присутствующая в среде (ср. кривые з и рис. 51, Возможная деградация аденозина в условиях культивирования клеток (37® с ) не вносит существенного вклада в убыль аденозина.

Влияние дипириданола на индукцию роста нейритов у PC»2. вызываемую BtjcAMP, было . аналогично случаю с аденозинои. В присутствии дипириданола ответ клеток pci2 значительно усиливался. Разница между пробами, содержащими и не содержащими дипиридамол. (¡охранялась в течение длительного времени

для атр. помимо воздействия дипиридамолон (который как и в случае btjcamp и аденозина. усиливает эФФект атр), исследовали влияние ю мкН теоФиллина при различных концентрациях ; атр. Если в присутствии дипиридамола степень морфологического ответа клеток заметно усиливалась, то при одновременном

лении такой среды к свежим клеткам образования отростков не наблюдалось (рис- 5. кривые 1 и 21. Это указывает на истоше-

. . ■-- - ~ «э -

действии лтр, дипиридамола и теоФиллина амплитуда ответа сила существенно ниже. Ныло проверено, что при добавлении к интактнчм - , клеткам : теоФйллин не повишает уровня внутриклеточного слмр в отличие от адеиозина и neca. В яанноь случае, теоФиллин выступает, именно я' качеств« антагониста ■ аденозиносого , реиептера, а не активатора зденилатциклазы

'. (Sutherland Е. W, , et at., 135в).

, . . ГЛАВА з. 5. Взаимное влияние аденозкяа и его произвойкнх и / ФРН на инДукшэл роста нейритов, вызываемую-эти-

. \ •■".''-• " ; ми агентани.' ' •":. .,-'■••.'■.'

■> - 'Стимулирующее влияние агентов (таких как Форсколик. гшено-зин. Bt2cAMP), повышаших уровень внутрикле1очного camp , на образование отростков, вызываемых Фактором роста нервов, детально описано во многих работах для больших времен инкубации ( 1 сут и более). Нам было интересно посмотреть влияние ФРН на раннюю индукцию роста нейритов.

При одновременном добавлении ФРН и аденозина < или атр) к Г клеткам ( рис. 'в )• г 'и'фрн'усиливал быстрое образование отростков,. вызываемое либо аденоз'ином,- либо, атр ( кривые t и 3, а также г и * I; "2Г аденозйн (или атр> в свою очеред£ усиливал эффект, вызываемый Фактором роста нервов через +в ч. В - первые " сутки интенсивность морфологического ответа клеток, . для пробы "ФРН" 6wja ненаичого меньше, чем для пробы "ФРН * - _ дденозин". Если аг.'ноэин добавляли к клеткам . культивировавшимся с ФРН в течение 1-х суток, наблюдалось кратковре- . .. менное усиление; ответа клеток . ' ухе имеющих отростки ( рис-

£

время, ч

Рис. 6. Зависимость 2-> от времени инкубации клеток рс« в среде, содержащей «ох сыворотки, 5, в мМ МдС1г и следующие компоненты: (И 25 мкИ атр, (2) 25 нкН аденозин, (3) 25 мкМ атр, фрн, (4) 25 нкН аденозин,- ФРН, (5) ФРН, о - клетки инкубировали в,течение 2 сут с ФРН и 25 мкМ аденозином, а затем через +в ч после начала инкубации среда была заменена на свежую с теми же компонентами (обозначено стрелкой).

15-

15

а

Рис- т. Влияние аденозина и В12сЛМР на, морфологию клеток р<п 2, культивируемых в присутствии ФРН--' а - ФРН (50 ч). клетки Фиксированы з, г/, параформальдегидом с последующей окраской актинового цитоскелета коныогатом родамин-Фаллоидин (тштс-Фаллоидин) , б - ФРН (4» ч), затем в среду добавлен 25 мкМ аденозин и через 2 ч клетки зафиксированы и окрашены тштс-Фаллоидином, в - ФРН (48 ч), затем в среду добавлен 25 мкМ вг2сАМР и через 2 ч клетки зафиксированы и окрашены тштс-Фаллоидином.

6 , кривая 6). это выражалось в дальнейшем ветвлении имеющихся отростков и появлению новых на соме клетки (рис. т, б).

Интересно, что в присутствии вг2самр также происходит " 1 усиление ветвления отростков, аналогичное для пробы с адено-зином, что также говорит в пользу рецепторо-посредованного механизма воздействия его на клетку (рис. т, в1-

ГЛАВА 3. 6. Ингибиторы транскрипции и трансляции не вли

яют на раннюю индукцию роста нейритов, вызн

ваемую аденозиком.

- Ранняя индукция роста нейритов в присутствии аденозина является процессом, ' не зависпшим ни от трансляции РНК, ни от

транскрипции ДНК. На йис. 8, <»-з) показано, что при тех кон-

N1

50

10

I

- 46 -

¿2

ГР

l

1

a '

Рис. »■ а» Влияние юо ни актидиона <заштрихованные столбики) на индекс клеток с нейритами, инкубированных в присутствии 25 мкн аденозина (1), 25 икИ аденозина и ФРН (2) в течение 2-х часов и ФРН 2* ч инкубации;

б) Влияние актиноиишша о в концентрации «о нг/нл ( заштрихованные столбики) на индекс клеток с нейритами в присутствии 25 мкМ аденозина (4) и 25 нкН аденозина и ФРН (Б) через з, в ч п^сле начала инкубации.

центрациях актидиона. ингибитора синтеза бедка, (too пм», при которых индукция роста нейритов, вызываеная ФРН . блокируется полностью (t».ранняя индукция роста нейритов практически не претерпевает изменений 4 2). Кроме того, в присутствии актиди-, она сохраняется с тин у лир ушее влияние ФРН на рашою индукцию роста нейритов. 13). .

\ В присутствии актиномицйна д ( ингибитора транскрипций днк), клетки также неизменно образовывали отростки (рис. в, +).

Изменение морфологии клеток происходит.в течение коротко-, го промежутка времени. Однако нельзя исключить, что активация рецептора аденозина не имеет долговременных последствий, "запоминаемых" клеткой на длительный промежуток времени. На это указывает повышение уровня орнитиндекарбоксилазы в клет- '

- IT -

kax Pci2 (Guroff G., et. ai., 1981), ключевого Фермента синтеза полиаминов. Как известно, индукция этого Формента считается хорошим индикатором предстоящих изменений в транскрипции. Каким же образом проявляются поздние эффекта аденозина? Известно, что инкубация меток рс12 при совместном присутствии в среде ФРН и реагентов, повышающих уровень camp ( в том числе и аденозина», приводит к белее сильному морфологическому ответу, чем при инкубации их только с ФРН. Данное стимулирующее влияние всегда наблюдалось на 2-е сутки инкубации. При некоторой модификации этого эксперимента получены следующие . результаты.

Если клетки PC12 прединкубировали с аденозином в течение 1 суток, а затем подвергали воздействию ФРН уже в отсутствии аденозина, стимулирующее влияние аденозина на образование отростков клетками сохранялось (рис- 9). Кривая зависимости nt от времени лежит левее по сравнению с кривой, соответствуюшей инкубапии в присутствии только с ФРН ( ср. кривые з и 5). Характер кривой отличался от случая, когда аденозин и ФРН добавляли к клеткам одновременно «рис. 9, 4). .Отсутствует пик, возникающий непосредственно после добавления ФРН и аденозина. Таким - образон. стимулирпзщее влияние ФРН на раннюю индукцию роста нейритов наблюдалось лишь в том случае, когда добавление ФРН во времени совпадало с начальным моментом воздействия аденозина, когда на клетках присутствовали "аденозиновые " отростки. По прошествии определенного времени | в данном случае 1 сут, концентрация аденозина 25 мкМ) , мы не наблюдали всплеска образования отростков непосредственно после побавле-ния ФРН. Очевидно это связано.с тем, что активация адекозино-

Рис. 9. Влияние прединкубашга клеток рс»2 с адевозинои (25 нкН) на вреия появления отростков ори последующей добавлении ФРН. ' ■

1 - прединкубаиия в течение з-х сут; Г- 2 - прединкубаоия в течение 2-х сут*.

» т предиикубапия в течение 1-х-суток с адевозинои; ; л ^ - одновременное добавление аденозина и ФРН; . - .; 5 - ФРН (мши). 50 нг/мд. ,

вого рецептора ведет к запуску каскада реакций, строго лимитированных во времени, и начальна этап, возможно связанный с повышением уровня с amp и приводящий к быстрой индукции рост£ нейритов, заканчивается к конау первых.суток. Стимулирующее влияние аденозина на "позднюю" индукцию роста нейритов, характерную для ФРН сохранялось , причем сохранялось и в том случае, если момент начала инкубации клеток с аденозином был отдален во времени от момента добавления ФРН на 2 или з суток (рис.1 9. I, 2). в этих случаях клетки инкубировали в среде с аденозином только в течение » суток. Последующие сутки или

двое клетки находились в обычной среде • Если аденозин добавляли к клеткам одновременно с ФРН, то через 24 ч индекс клеток с нейритами всегда был ниже, чем для пробы "ФРН". стимулирующее влияние аденозина проявлялось лишь на вторые сутки. Это временное подавление образования отростков вероятно связано с истощением ресурсов клетки, израсходованных на раннюю индукцию роста нейритов и необходимостью времени на их восполнение.

Следует отметить, что стимулирующее влияние аденозина на образование отростков, появляющихся под действием ФРН, проявляется раньше в том случае, если имеет место прединкубация с аденозином, а ФРН добавляется в среду спустя некоторое время. Причем при прединкубапии клеток за 2-е сут отростки появлялись раньше, чем если клетки инкубировали с аденозином за 1 сутки до добавления ФРН (прединкубация за з сут дает тот же эФФект, что и прединкубация за 2 сут до момента добавления ФРН). Возможно это связано с тем, что под действием аденозина в клетке накапливаются продукты. 'используемые ею, впоследствии для Формирования нейритов в присутствии ФРН. Клетка не тратит времени на их синтез, а использует'уже имеющиеся резервы. ...... .....

Таким образом, - стимулируюшее влияние: .аденозина сохраняется долго С По крайней мере в течение :3-х суток), несомненно должно затрагивать процессы транскрипции и трансляции, и не связано непосредственно с- повышенном уровня camp - быстрого эффекта аденозина, проявляичвогс.гя р ккрмл} часы, после его добавления к клеткам- ■"'*■•- .

ГЛАВА з. т. Морфологическая дифференпировка клеток РС12 в присутствии агонистов аденозиновых рецепторов.

Совокупность данных, представленных выше, позволили нам предположить, .что эффекты аденозина,. а также его производных, изученные нани.^на клетках Феохромопитомы РС12, опосредуются рецепторами. А поскольку установлено, что аденозиновые рецепторы клеток PCi 2 относятся к А-2 подтипу, была определена эффективность различных агонистов при индукции роста нейритов у клеток PCi2. основного изучаемого в данной работе эффекта аденозина. K¿k уже отмечалось в разделе * Обзор литературы", аналоги аденозина. имеющие заместитель.в положении W® . например. и6-циклогексиладенозин (снаь являются агонистаии рецепторов подкласса А-1. Аналоги аденозина, инегаие заместитель в положении в> (нами использован s,, n - этилкарбоксами-доаденозин - леса), являются агонистами преимущественно рецепторов подкласса А-2 (Stone т. W.1955). Однако абсолютной специфичности рецепторов к тем или иным агонистам не существует. Оба подкласса рецепторов активируются ñeca или, напри* мер. сна, но в разной степени- Здесь и было показано, что нейриты характерной морфологии появляются у клеток PCi 2 как в присутств1ш neca. так и в присутствии сна. (Рис. ю, 2, 3, 4), Как и следовало ожидать, концентрация Ñeca и сна, при которой они вызывают одинаковый эффект, различаются.на 2 порядка: ñeca является более эффективным индуктором, чем сна.

Т.о. мо*но с определенностью сказать, что описанный в данной работе эффект ранней индукции роста нейритов, вызываемый аденозинон и рядом его производных, а также хорошо извес-

времени инкубации клеток в среде, содержащей 5 мкМ аденоэина

«П. 5 ИКН СНА (2), 100 нкн СНА (3), 5 МКН NECA <*).

тное стимулирующее влияние bi2camp на рост нейритов в присутствии ФРН, опосредуются адекозиновыми рецепторами-..,, .

функционирование аденоэимовых рецепторов не может не ока:-."'..' зывать залетного влияния на диФФеренпировку и функционирование нейрона, поскольку рецепторы существуют как на. делящихся, так. и : на; дифференцированных клетках. Неснотя на то, что действие ФРН не опосредуется системой camp, рецепторы аденозина, изменяющие" его уровень, играют существенную роль в функционировании как нейробластов, . так и зрелых нейронов- Определяющее значение в процессе диФФеренциовки нервных клеток принадлежит, нег сомнекко, ..ФРН- Однако очевидно, что этот процесс подвержен .влиянйю множества других 'факторов, зависящих от состояния, ор-: ганизма., условий Внешней'среды", возраста. И среди этих Факторов аденозин, видимо .играет не последнюю роль. '

выводы.. . .'■;''•..-..

1. Аденозйн в "концентрациях от 1 мкН до 1 нН индуцирует образование нейритов у клеток Раг через зо мин после добавления в культуральну» среду. Длительность нейритстимулируюего действия аденозйна зависит от его концентрации-: Чем больше концентрация аденозйна. тек длительнее нейритстдмулируюее

действие И наоборот. '

i . • ■

2. Аналогичным нейритстимулирушим действием обладают производные аденозйна act, adp. amp, camp, Bt2rcAMP, а также aró-яисты аденозиновых рецепторов сна и ñeca. Эффект, вызываемый атр, camp, Bt2cAMP усиливается в присутствии сыворотки, а эффект, вызываемый атр - и в присутствии ионов мз2+.

3. индукция роста нейритов, вызываемая адензинои, поисхо-дит в присутствии ингибиторов трансляции и транскрипции.

4-. Показано, что дипиридамол, ингибитор транспорта аденозйна в клетку, в концентрации to Midi.увеличивает время действия как аденозйна, так и атр и Bt2cA№. 4

5. ТеоФиллин.- добавляемый к клеткам PCt2 , не изменяет уровня сайр, а выступает в качестве антагониста аденозйна^ снимая стикулирушее влияние дипиридамола на рост нейритов, вызываемый атр в концентрации от i до ю «кН-

6. Агонист аденозинового рецептора а-2 типа ñeca обладает более сильным нейритстимулиругявин действием, чем агонист • аденозинового рецептора а-1 типа сна, что указывает на то, что нейритстгачулирутзий эффект аденозйна опосредуется рецептором, принадлежащим к А-г типу.

т. ФРн оказывает стимулирушее влияние на раннюю индукцию

роста нейритов, вызываемую аденозином (или его производными!, аденозин, в свою очередь, усиливает эффект, вызываемый ФРН, через 49 ч. Стимулирующее влияние адентина сохраняется' и в том.случае, если его добавлять к клеткам до инкубации с ФРН.

е. Аденозин и его. производные оказывают ней'ритстимуяирую-шее действие при инкубации как с недиФФеренциропанными, так и с дифференцированными под действием фрн клетками pcí2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Юсупова Р. А. . Кондратьев А. Д. Быстрая индукция роста нейритов у клеток PCÍ2 под действием аденозина и его производных. Влияние сыворотки- Биологические мембраны. '991, т-ft, N 12, с- i 275-i 260.

2. Юсупова Р. А- , Кондратьев А- Д. Механизм диФФерении-ровки клеток РС12 под действием производных аденозина- Влияние аденозина на нейрональну» диФФерениировку под действием

' фактора PocTá нервов. Биологические мембраны- »992. т- 9, N », С. 52-59. -••■'■-•-•-..•.:■..• ,.;:.. . ' .. ■ - -

* - ■ . . з. Кондратьев А. Д., Северин С. Е-■ Косквитина Е• Л-, По-у сыпйа'оза:Х"А- ,10сУпова/Р.А'^' 7УСУПов О-: К.. Вмдоев И- й-, Зотова. Е. Е. Системы вторичных'мессенджеров в регуляции не при чальной диФФеренцнровки е нейросекрепии- Нейрохимия- »992.

- ' 4; A, D, Kondratyev, 0. A. Posypauova, R A Yusupova, I. Shinyrev. The role of protein Kinase in.the mecliaiiisro of the. action of net ve., growth {actor. Symposium nn> MolucuUr : Neurobioloyy, (USA-USSA) KUv;, 1991, iv 80-BÍ.

, S. R. A,. Yifcupova, A. D. Ko/idratycv. Stimulation oí

adenosine receptor potentiates differentiation of JPC12 rat pheochromocytoma cell» caused by nerve growth . factor. 4 Soviet-FRG symposium Receptor and i'oh channels. Moscow. 1991. p. 9. ■ ■ , ' ^ -, '

6. посыпаиова Г- A-. Юсупова P. . A. * Юмырев И. И- Влияние Фактора роста ^ервов на протеинкиназную активность в клетках Феохронопитоиы Pci2. Тезисы докладов 9 Всесоюзной конференции но нейронаукам. Киев. 1990, с. «2.

т. Юсупова Р. А-, Шиырев И- И-, Кондратьев А. Д. Неха- . низм морфологической диФФеренцировки клеток крысиной Феохро-моцитомы рс 12*. вызываемой производными аденозина- Взаимное влияние ФРН и аденозина на индукцию роста нейритов- Тезисы докладов Второго Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии". Самарканд, 1991,

с. 21т.

Подписано в печать QjT. 159,3г.__Зак. J&J Тир. /60

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕТИТ»