Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo"

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный Центр Неврологии» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, '

Федорова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

Муронец Владимир Израилевич

доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биохимии животной клетки, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Орлова Елена Владимировна

доктор биологических наук, руководитель группы клеточных технологий и нанокомпозитных материалов, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук.

Защита состоится 23 декабря 2013 г. в 16 ч 00 мин. на заседании диссертационного совета Д. 001.002.01 при ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу: 109240, Москва, Устьинский проезд, д.2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ питания» РАМН.

Автореферат разослан 22 ноября 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

В.М.Коденцова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время развитие окислительных реакций в различных

биологических структурах рассматривается как один из основных повреждающих механизмов. Особенно значимыми эти процессы являются для нервной системы, что связано с избирательной чувствительностью клеток возбудимых тканей к окислительной деструкции (Halliwell and Gutteridge, 1999). Нерегулируемое образование активных форм кислорода (АФК) в условиях недостаточной эффективности эндогенной антиоксидантной системы приводит к индукции окислительного стресса (ОС), сопровождающего патологические процессы в ЦНС (Tsai, Lieber, 2010). Показано, что развитие ОС активирует каскадный механизм саморазрушения нейронов по пути апоптоза или некроза.

Для изучения механизмов развития ОС, индуцированного нейротоксинами в условиях in vitro, используется клеточная культура линии РС-12. Особенностью этих клеток является способность к образованию нейритов в ответ на действие фактора роста нервов NGF (Greene, Tischier, 1976). Дифференцировка клеток сопровождается такими характерными признаками как формирование нейронального фенотипа, определённая последовательность событий в клетке во время пролиферации, экспрессия нейрональных маркеров и секреция нейротрансмиттеров (Vandry et.al., 2002; Wesering, Ewing, 2008). В условиях in vivo для оценки нейропротекгорного действия изучаемых соединений разрабатываются различные экспериментальные модели заболеваний ЦНС на здоровых животных, что ограничивает объективность получаемых результатов. С этой точки зрения одним из наиболее подходящих объектов являются мыши линии SAM, характеризующиеся ускоренным темпом старения и сниженным уровнем антиоксидантной защиты (Болдырев A.A. 2004, Федорова Т.Н и соавт, 2005).

Природными протекторами клеток и тканей от окислительного стресса являются антиоксиданты, одним из которых является природный дипептид карнозин (р-аланин-L-гистидин) - антиоксидант прямого и непрямого действия, также проявляющий свойства протонного буфера, хелатора ионов металлов, модулятора супероксиддисмутазы и NMDA-рецепторов (Boldyrev, 2006; 2012; Bellia F., 2011). Однако, для достижения стабильного протекторного эффекта требуется введение избыточных доз карнозина, чтобы компенсировать его гидролиз под действием специфических дипептидаз - тканевой и сывороточной карнозиназ (Lenny, J. F., 1990). Повысить эффективность карнозина можно путем его модификации, о'беспечивающей устойчивость дипептида к действию карнозиназ, или связав его в структуру, недоступную для ферментов. Ранее были описаны производные карнозина, полученные путем его конденсации с Тролоксом®, обладающие основными биологическими свойствами карнозина, но при этом характеризующиеся высокой устойчивостью к карнозиназе (Stvolinsky

et al., 2010). Другим подходом к этой проблеме может бьпъ включение карнозина в наноструктурные конструкции, наиболее распространенными среди которых являются нанолипосомы. Нанолипосомы определяются как липосомы в пределах наномерных размеров, везикулы которых образованы одно- или мультибислойными оболочками из амфифильных липидных молекул и содержат одно или несколько водных отделений (2002 Guidance for industry: liposome drug products. Rockville, MD: U.S. Food and Drag Administration). В последние годы как в России, так и за рубежом проводятся исследования по возможности применения нанокомплексов на основе фуллеренов, ферригидрита, синтетических полимеров, липосом и других нанокострукций. Принципиально значимыми являются данные о способности наноструктур преодолевать гемагоэнцефапический барьер и проявлять заданные свойства при их адресной доставке в мозг. Физико-химические особенности наноразмерных структур делают эти конструкции перспективными для создания новых лекарственных препаратов. Уже утвержден ряд липосомальных препаратов для лечения онкологических заболеваний и различных инфекций (Zolnik B.S., Sadrieh N., 2009). Выявлена перспектива использования липосом в лечении заболеваний ЦНС, включая опухоль мозга, ишемию, инфекции и энцефалиты (Zhong Y., Bellamkonda R. V., 2008; Reddy M. К., Labhasetwar V., 2009). В то же время, оценка протекторного действия наноразмерных биологически активных композиций в условиях моделирования патологических процессов в мозге, развивающихся под действием многофакторного ОС, является актуальной задачей. С этой точки зрения создание наноструктурных комплексов на основе карнозина в составе фосфолипидных структур -липосом является актуальной задачей. В настоящей работе впервые предпринята попытка использовать карнозин, включенный в состав фосфолипидных наноструктур, на биологических моделях in vitro и in vivo в условиях окислительного стресса.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «НЦН» РАМН в рамках темы № 146 «Исследование в условиях in vitro и in vivo проблем эффективности безопасности наноструктурных комплексов, обладающих нейропротекгорным действием».

Цель работы: оценить защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в условиях индуцированного окислительного стресса in vitro (нейроны и клетки РС-12) и in vivo (мыши с ускоренным темпом старения).

Задачи работы:

1. Охарактеризовать морфологические и функциональные свойства клеток РС-12, полученных в результате дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF.

2. Выявить экспрессию мембранных белков: NMDA-рецепторов в клетках РС-12, дифференцированных под действием фактора роста нервов NGF.

3. Оценить действие индукторов окислительного стресса (пероксид водорода, гомоцистеиновая кислота, NMDA-специфический агонист NMDA-рецепторов, полиамины и продукт их распада акролеин) на продукцию АФК и гибель клеток РС-12.

4. Оценить протекторное действие карнозина в условиях токсического влияния индукторов окислительного стресса на рост АФК и гибель клеток РС-12.

5. Оценить протекторное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом на рост АФК и гибель клеток РС-12 (дифференцированных по нейрональному типу) в условиях токсического влияния полиаминов (спермина, спермидина и путресцина).

6. Оценить защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, на нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения, в условиях ОС, индуцированного пероксидом водорода.

7. На модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения выявить позитивные эффекты карнозина, включенного в состав нанолипосом на физиологические (время потери позы, время «жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции, способность к обучению) и нейрохимические (общая антиоксидантная активность) параметры.

Научная новизна:

Впервые на суспензии нейронов (в условиях ОС, индуцированного перекисью водорода), выделенных из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1) показано протекторное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом в сопоставлении с карнозином.

Впервые выявлено защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом в условиях токсического действия полиаминов (спермина, спермидина и путресцина), а также продукта их распада акролеина на рост АФК и гибель клеток РС-12 в сопоставлении с карнозином.

Впервые в условиях ОС in vivo на модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1/SAMR1) показано защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, проявляющееся в улучшении физиологических параметров и повышении антиоксидантной активности мозга животных.

Теоретическая и практическая значимость: полученные результаты послужат обоснованием для разработки и применения высокоэффективных и специфичных препаратов, обладающих способностью к контролируемому транспорту в зону повреждения мозга.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Полученные в результате дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF клетки РС-12 по морфологии имеют сходство с нейронами, по функциональным свойствам характеризуются наличием NMDA рецепторов и могут быть использованы в качестве модели дм изучения патологических процессов, происходящих в ЦНС.

2. Карнозин, включенный в состав нанолипосом, оказывает более выраженное протекторное действие на уровень АФК и гибель нейрон-подобных клеток РС-12 относительно карнозина в условиях токсического влияния полиаминов (спермина, спермидина и путресцина).

3. Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом на нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения, проявляется в условиях ОС, индуцированного перекисью водорода.

4. На модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1) показано защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом на физиологические (время потери позы, время «жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции, способность к обучению) и нейрохимические (общая антиоксидантная активность) параметры.

Протокол диссертационного исследования «Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo» был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НЦН» РАМН (протокол №12/12 от 10.10.2012 г).

Апробация работы: диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном собрании научных сотрудников неврологических отделений и лабораторий ФГБУ «НЦН» РАМН (протокол №10 от 18 октября 2013 года).

Материалы диссертации были представлены на 7 международных конференциях:

«Expression of Na/K-pump and N-methil-D-aspartat receptors in pheochromocytoma cells, activated

by dexamethasone and nerve growth factor» Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev А (Италия,

Флоренция, 2009); «Dexamethasone and rhu-NGF as differentiation factors of PC-12 cells»

Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev А (Словакия, Мартин, 2009); «Carnosine containing

nanoliposomes protect PC-12 cells and neurons from oxidative stress in vitro» Konovalova E.,

Karpova L., Stvolinsky S., Boldyrev А. (Бельгия, Гент, 2011). «Нейропротекторные эффекты

нанолипосом, содержащих карнозин» Е.В. Коновалова, О.А.Шадрина, О.А.Трунова,

С.Л.Стволинский (Украина, Судак, 2012), «Моделирование биохимических процессов

нейродегенерации и способы её коррекции» М.Г.Маклецова, Е.В. Коновалова, C.JI.

Стволинский, Т.Н.Федорова (Россия, Росгов-на-Дону, 2012), «New mechanisms of

6

neuroprotective carnosine action: role of polyamine system.» Konovalova E., Kulikova O., Stvolisky S., Makletsova M., Rikhereva G., Fedorova T. (Bath, UK. 2013), «Polyamines neurotoxicity at the brain and ways of its correction». Konovalova E., Kulikova O., Stvolisky S., Makletsova M., Rikhereva G., Fedorova T. (Saint Petersbourg, Russia, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 статьи в научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.

Конкретное личное участие автора в получении результатов: автору принадлежит определяющая роль в постановке задач диссертационной работы и их выполнении, а также в анализе и обосновании полученных результатов (эксперименты на клеточной культуре РС-12 и на нейронах мозжечка in vitro и на модели острой гипобарической гипоксии у быстро стареющих мышей in vivo).

Струкггура и объём диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 43 отечественных и 175 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 42 рисунками.

Материалы и методы исследования

В условиях in vitro экспериментальные исследования проведены на клетках линии РС-12 и суспензии нейронов, выделенных из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения.

Окислительный стресс in vitro в суспензии выделенных гранулярных клеток мозжечка создавали инкубацией в среде 3,5 мМ пероксида водорода в течение 30 мин при 37°С; в клетках линии РС-12 - инкубацией в среде 5 мМ пероксида водорода в течение 60 мин при 37°С, 1 мМ N-Memn-D-acnapTaTa (NMDA) в течение 30 мин при 37°С, 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты в течение 30 мин при 37°С, 10 мкМ и 100 мкМ акролеина в течение 1, 3 и 24 ч при 37 °С, а также с полиаминами (спермин, спермидин и путресцин - в дозе 500 мкМ, в течение 60 мин)

Уровень активных форм кислорода (ЛФК) и количество мертвых клеток определяли методом проточной цитометрии (Sureda F.X.et al., 1998; A.Boldyrev et al., 1999). Работа была проведена на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, USA). В каждом измерении регистрировали 10000 событий. Данные обрабатывали с помощью программы ModFit LT™(BD Biosciences, USA) и Cell Quest Pro (BD Biosciences, USA), средние значения интенсивности флуоресценции рассчитывали в Microsoft Exel (Microsoft, США).

Рис. 1. Нанолипосомы. Проба, полученная на трансмиссионном электронном микроскопе методом замораживания-скалывания. Размер каждой липосомы составляет около 150 нм.

Концентрацию карнозина в нанолипосомах измеряли методом определения карнозина в безбелковом экстракте по диазореакции (Практикум по биохимии изд. МГУ под ред. С.Е.Северина, Г.А. Соловьёвой).

Карнозин и карнозин в составе нанолипосом (в концентрации 1 мМ) добавляли за 1 ч до инкубации с индукторами ОС.

Выделение гранулярных клеток мозжечка проводили из 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения (¡Sureda F.X. et al., 1998).

Дифференцировка клеток PC-12 под действием фактора роста нервов NGF и дексаметазона. Клетки инкубировали в ССЬ инкубаторе в присутствии 5% СОг при 98% влажности и 37°С. Фактор роста нервов (NGFP) вносили в клетки в концентрации 0,1 нг/мл и оставляли на 48 ч. Для сравнения степени и качества дифференцировки часть клеток была продифференцирована по почечному типу с помощью дексаметазона. Сравнительный анализ проводили по морфологическим различиям, а также по количеству функциональных NMDA рецепторов.

Окислительный стресс in vivo индуцировали с помощью острой гипобарической гипоксии. Экспериментальные исследования выполнены на быстростареющих мышах линии SAM (Senescence Accelerated Mice, клоны SAMR1 - resistance и SAMP1 - Prone) SPF-категории, выращенных в Питомнике экспериментальных животных в Пущино-на-Оке.

Все эксперименты проводили с соблюдением регламента работы с экспериментальными животными, утвержденного Международным этическим комитетом (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals - Russian Version The National Academies, Washington, D.C. (1996).

Острую гипобарическую гипоксию (ОГГ) создавали в барокамере проточного типа для

предотвращения развития эффекта гиперкапнии (Агаджанян А.Н., 1986; Boldyrev А.А. et al.,

1997). Опыты выполнены на 8-месячных мышах линий SAMR1 (п=25) и SAMP1 (п=25),

9

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коновалова, Евгения Викторовна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУЧНЫЙ ЦЕНТР НЕВРОЛОГИИ РАМН

На правах рукописи

04201450241

Коновалова Евгения Викторовна

Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.01.04 - биохимия

Научный руководитель: доктор биологических наук, Федорова Татьяна Николаевна

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 7

ВВЕДЕНИЕ 8

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14

1.1. Окислительный стресс и антиоксиданты 14

1.1.1. Роль активных форм кислорода в нормальных и патологических условиях 14

1.1.1.1. Кислородные радикалы и их повреждающее действие на клетку 14

1.1.1.2. Окисление и продукция свободных радикалов 28

1.1.2. Антиоксидантная система клеток 19

1.1.3. Карнозин и родственные ему соединения 23

1.1.4. Нанопрепараты и их применение 26

1.1.5. Окислительный стресс и мозг 28

1.1.6. Апоптоз и некроз как возможные пути гибели нервных клеток 29

1.1.7. Свободнорадикальное окисление липидов и антиоксидантная терапия при заболеваниях ЦНС. 32

1.2. Возможности изучения механизмов развития окислительного стресса на разных биологических объектах, включая клеточные культуры. 35

1.2.1. Экспериментальные модели окислительного стресса. 35

1.2.2. Клеточные культуры для изучения ОС. 37

1.2.2.1. Гранулярные клетки мозжечка. 37

1.2.2.2. Клеточная культура РС-12 38

1.3.МУГОА рецепторы и клеточный сигналинг. 41

1.4.Индукторы окислительного стресса. 45

1.4.1. NMDA 45

1.4.2. Гомоцистеиновая кислота 46

1.4.3. Полиамины 47

1.4.4. Акролеин 48

1.4.5. Пероксид водорода 49 1.5.Проточная цитометрия 50

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54

2.1. Моделирование окислительного стресса на культуре клеток PC-12 in vitro. 54

2.1.1. Характеристика клеточной культуры. 54

2.1.1.1. Культивирование клеток. 54

2.1.1.2. Подготовка клеток для анализа. 56

2.1.1.3. Дифференцировка клеточной культуры с помощью дексаметазона и NGF-(3 56

2.1.2. Определение уровня активных форм кислорода и клеточной гибели методом проточной цитометрии 58

2.1.2.1. Проточная цитометрия. 5 8

2.1.2.2. Определение уровня активных форм кислорода (АФК). 60

2.1.2.3. Определение доли мертвых клеток 61

2.1.3. Определение экспрессии NMDA-рецепторов методом непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания антителами. 62

2.2.Способы индукции окислительного стресса 65 2.2.1. Пероксид водорода 65

2.2.2. N-метил-О-аспартат 66

2.2.3. Гомоцистеиновая кислота 67

2.2.4. Полиамины 67

2.2.5. Акролеин 68

2.3. Введение карнозина и нанолипосомальных конструкций на его основе в клеточную культуру PC-12 при моделировании ОС. 69

2.3.1. Схема экспериментов. 69

2.3.2. Приготовление нанолипосом, содержащих карнозин 70

2.3.2.1. Измерение размеров 71

2.3.2.2. Выбор оптимальной липидной композиции 72

2.3.3. Карнозинсодержащие нанолипосомы 74

2.3.4. Определение содержания карнозина в составе нанолипосом по диазореакции 74

2.4. Приготовление растворов. 75

2.5. Экспериментальные исследования in vitro и in vivo на быстро стареющих мышах линии SAM 76

2.5.1. Окислительный стресс in vitro 77

2.5.2. Выделение гранулярных клеток мозжечка. 77

2.5.3. Окислительный стресс in vivo 77

2.5.4. Устойчивость мышей к гипоксии 78

2.5.5. Определение общей антиоксидантной активности 78

2.6. Статистическая обработка результатов 79

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 80

Оценка защитного действия карнозина в составе нанолипосом в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo 80

3.1. Морфологическая характеристика клеточной культуры РС-12, дифференцированной дексаметазоном и фактором роста нервов rHuNGF(3. 80

3.2. Анализ экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры РС-12, активированных дексаметазоном или фактором роста нервов NGF. 83

3.3. Индукция окислительного стресса различными химическими агентами в недифференцированных и дифференцированных клетках РС-12. 86

3.3.1. Индукция окислительного стресса при действии NMDA и Н2О2 86

3.3.1.1. Интактные клетки РС-12. 87

3.3.1.2. Интактные клетки РС-12 в условиях окислительного стресса. 88

3.3.1.3. Влияние Н202 и NMDA на рост АФК в клетках РС-12, дифференцированных по нейроналыюму типу 90

3.3.2. Влияние гомоцистеиновой кислоты на клетки РС-12 95

3.3.2.1. Влияние гомоцистеиновой кислоты на развитие окислительного стресса в недифференцированных клетках РС-12 95

3.3.2.2. Влияние гомоцистеиновой кислоты на рост АФК в клетках РС-12, дифференцированных по нейрональному типу 97

3.3.3. Влияние полиаминов на клетки РС-12 100

3.3.3.1. Влияние спермина, спермидина и путресцина на недифференцированную клеточную культуру РС-12. 100

3.3.3.2. Влияние полиаминов на рост АФК и гибель клеток РС12, дифференцированных по нейрональному типу 103

З.ЗАТоксическое действие акролеина на клетки PC-12 в зависимости от его дозы и времени инкубации 108

3.3.4.1. Влияние акролеина на рост АФК. 108

3.3.4.2. Влияние акролеина на гибель клеток PC-12 109

3.3.4.3. Влияние акролеина на морфологические изменения клеток РС-12. 111

3.4. Защитное действие карнозина на клетки РС-12, в условиях окислительного стресса, индуцированного акролеином. 111

3.4.1. Защитное влияние карнозина на рост АФК. 112

3.4.2. Защитное влияние карнозина на гибель клеток. 114

3.5. Защитное действие карнозина на клетки РС-12, дифференцированные по нейрональному типу 114

3.5.1. Исследование влияния карнозина на клетки РС-12, инкубированные с перекисью водорода. 115

3.5.2. Влияние карнозина на дифференцированные клетки РС-12 в условиях окислительного стресса, индуцированного гомоцистеиновой кислотой. 116

3.5.3. Оценка антиоксидангной активности карнозина в составе нанолипосом. 117

3.6. Защитное действие карнозина в составе нанолипосом на дифференцированные клетки РС-12 в условиях ОС, индуцированного полиаминами. 118

3.6.1. Влияние карнозина и нанокарнозина, включенного в состав нанолипосом на уровень АФК клеток РС-12, при инкубации их с полиаминами. 118

3.6.2. Влияние карнозина и нанокарнозина, включенного в состав нанолипосом на гибель клеток РС-12, индуцированную полиаминами.

3.7. Защитное действие нанолипосомальных структур, содержащих карнозин на нейроны головного мозга мышей линии 8АМР1/8АМЯ1 в условиях

окислительного стресса 122

3.7.1. Окислительный стресс in vitro 122

3.7.2. Окислительный стресс in vivo 124

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 129

5. ВЫВОДЫ 142 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК- активные формы кислорода

ВЖ- время жизни

ВПП- время до потери позы

BP- время реституции

ГЦ- гомоцистеин

ГЦК-гомоцистеиновая кислота

ДФПГ- 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразил

KCJ1 - карнозинсодержащие липосомы

ОГГ-острая гипобарическая гипоксия

ОС- окислительный стресс

ЦНС - ценральная нервная система

DCF-dichlorfluoresceine

NGF -nerve growth factor

NMDA -N-methyl-D-aspartate

PC-12-клетки феохромоцитомы

PI- propidium iodide

SAMP- senescence accelerated mice (prone) SAMR- senescence accelerated mice (resistant)

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время развитие окислительных реакций в различных биологических структурах рассматривается как один из основных повреждающих механизмов. Особенно значимыми эти процессы являются для нервной системы, что связано с избирательной чувствительностью клеток возбудимых тканей к окислительной деструкции. (Karnaukhov V., et al., 2008). Показано, что развитие окислительного стресса (ОС) активирует каскадный механизм саморазрушения нейронов по пути апоптоза или некроза (Luk'ianova L., et al., 1989; Majno G., and Joris I., 1995; Nicotera P. and Lipton S., 1999) Окислительные повреждения мозга рассматриваются современной наукой как значимый фактор патогенеза заболеваний ЦНС. В связи с этим, разработка новых антиоксидантных препаратов сохраняет высокую актуальность и имеет хорошие фармакологические перспективы. В последние годы как в России, так и за рубежом проводятся исследования по возможности применения панокомплексов на основе фуллеренов, ферригидрита, синтетических полимеров и липосом и других нанокострукций. Принципиально значимыми являются данные о способности различных наноструктур преодолевать гематоэнцефалический барьер, проявлять антиоксидантные и пейропротекторные свойства, а также возможность их адресной доставки в мозг. Физико-химические особенности наноразмерньтх структур делают их перспективными для создания новых лекарственных препаратов (Сейфулла Р.Д., 2012; Amstad, Е. et al. 2011; Heng H.et al.2010)

Природным протектором клеток и тканей от окислительного стресса является дипептид карнозин - антиоксидант прямого и непрямого действия. Его существенной особенностью является легкое включение в метаболические процессы с образованием используемых в обмене веществ метаболитов, гистидина и ß-аланина. ( Болдырев A.A. и соавт. 2002; Boldyrev А., 2012; Boldyrev А et al. 2013).

Повысить эффективность действия карнозина можно путем его модификации, обеспечивающей устойчивость дипептида к действию карнозиназ, или связав его в структуру, недоступную для активного центра фермента. В данной работе на биологических моделях in vitro и in vivo впервые предпринята попытка использовать карнозип, включенный в состав фосфолипидных наноструктур, для защиты от окислительного повреждения.

В настоящее время для решения целого ряда научных задач в условиях in vitro используется клеточная культура линии PC-12. Опухолевая клеточная линия PC-12 была впервые получена в 1976 г. из хромаффшшых клеток мозгового вещества надпочечников (Greene L.,Tischier А., 1976). Особенностью этих клеток является их способность к образованию нейритов в ответ на действие фактора роста нервов NGF (Greene L., Tischier А., 1976). Дифференцировка клеток сопровождается такими характерными признаками, как формирование нейроналы-юго фенотипа, экспрессия нейрональных маркеров и секреция нейротрансмиттеров, а также определённая последовательность событий в клетке во время пролиферации, (Vandry et.al., 2002; Wesering, Ewing, 2008).

В условиях in vivo для оценки нейропротекторного действия изучаемых соединений разрабатываются различные экспериментальные модели заболеваний ЦНС на здоровых животных, что ограничивает обьективность получаемых результатов. С этой точки зрения одним из наиболее перспективных обьектов являются мыши линии SAMP1, характеризующиеся ускоренным темпом старения и сниженным уровнем антиоксидантной защиты (Stvolinskii S, et al., 2003; Федорова Т.Н. и соавт, 2005). Оценка протекторного действия наноразмерных биологически активных композиций в условиях моделирования патологических процессов в мозге, развивающихся под действием ОС, является актуальной задачей.

Цель работы: оценка защитного действия карнозина и его наноструктурного аналога в условиях индуцированного ОС in vitro (нейроны и клетки PC-12) и in vivo (мыши с ускоренным темпом старения)

Задачи работы:

1. Охарактеризовать морфологические и функциональные свойства клеток РС-12, полученных в результате дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF.

2. Выявить экспрессию мембранных белков: NMDA-рецепторов в клетках РС-12, дифференцированных под действием фактора роста нервов NGF.

3. Оценить действие индукторов окислительного стресса (Н2О2, гомоцистеиповая кислота, NMDA-специфический агонист NMDA-рецепторов, полиамины и акролеин) на продукцию активных форм кислорода и гибель клеток РС-12.

4. Оценить действие наностуктурного аналога карнозина на нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения в условиях ОС, индуцированного Н2О2

5. Оценить действие карнозина на рост АФК и гибель клеток РС-12 в условиях токсического влияния акролеина в зависимости от концентрации и времени инкубации.

6. Оценить действие карнозина, включённого в состав нанолипосом, на рост АФК и гибель клеток РС-12 (дифференцированных по нейрональному типу) в условиях токсического влияния полиаминов (спермина, спермидина и путресцина).

7. На модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1/SAMR1) выявить эффекты наностуктурного аналога карнозина на физиологические (время потери позы, время «жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции,

способность к обучению) и нейрохимические (общая антиоксидаптная активность) параметры.

Научная новизна:

Впервые на суспензии нейронов, выделенных из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1) в условиях ОС, индуцированного Н2О2, показано протекторное действие наностуктурного аналога карнозина в сопоставлении с карнозином.

Впервые выявлено защитное действие карнозина и его наностуктурного аналога в условиях токсического действия полиаминов (спермина, спермидина и путресцина), а также продукта их распада акролеина на рост АФК и гибель клеток РС-12.

Впервые в условиях in vivo на модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1/SAMR1) выявлены позитивные эффекты наностуктурного аналога карнозина in vivo, проявляющиеся в улучшении физиологических параметров и повышении антиоксидантного статуса животных.

Теоретическая и практическая значимость: полученные результаты послужат обоснованием для разработки и применения высокоэффективных и специфичных препаратов, обладающих способностью к контролируемому транспорту в зону повреждения мозга.

Положения выносимые на защиту:

1. Полученные в результате дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF клетки РС-12 по морфологии имеют сходство с нейронами, по функциональным свойствам характеризуются наличием NMDA рецепторов и могут быть использованы в качестве модели для изучения патологических процессов, происходящих в ЦНС.

2. Карнозин в составе нанолипосом оказывает более выраженное протекторное действие на уровень АФК и гибель нейрон-подобных клеток PC-12 относительно карнозина в условиях токсического влияния полиаминов (спермина, спермидина и путресцина).

3. Защитное действие карнозина в составе нанолипосом на нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения, проявляется в условиях ОС, индуцированного Н2О2.

4. Защитное действие карнозина в составе нанолипосом па модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1) характеризуется улучшением как физиологических (время потери позы, время «жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции, способность к обучению), так и нейрохимических (общая антиоксидантная активность) параметров.

Апробация работы:

Результаты исследований были доложены на 7 международных конференциях.

1. «Expression of Na/K-pump and N-methil-D-aspartat receptors in pheochromocytoma cells, activated by dexamethasone and nerve growth factor» Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev A. // Membrane Proteins: Abstracts.-Italy.-Florence.- 2009.- P.69.

2. «Dexamethasone and rhu-NGF as differentiation factors of PC-12 cells» Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev A. // Neurological congress: Abstracts.-Slovakia.- Martin.- 2009.- P.63.

3. «Carnosine containing nanoliposomes protect PC-12 cells and neurons from oxidative stress in vitro» Konovalova E., Karpova L., Stvolinsky S., Boldyrev A. // Carnosine in exercise and disease. Abstracts.- Belgium.- Ghent.- 2011. -P45.

4. «Нейропротекторные эффекты нанолипосом, содержащих карнозин» Е.В. Коновалова, О.А. Шадрина, О.А. Трунова, C.JT. Стволинский //

International Congress «neuroscience for Medicine and Psychology» Тезисы-Украина.- Крым.- Судак.- 2012.- С.210-211.

5. «Моделирование биохимических процессов нейродегенерации и способы её коррекции» М.Г. Маклецова, Е.В. Коновалова, C.JI. Стволинский, Т.Н. Федорова // Материлы XVI Международной конференции по нейрокибернетике - Россия.- Ростов-на Дону.- 2012. -С.28-31.

6. «New mechanisms of neuroprotective carnosine action: role of polyamine system». Konovalova E., Kulikova O., Stvolisky S., Makletsova M., Rikhereva G., Fedorova T. // 5th Conference on Advances in Molecular Mechanisms Underlying Neurological Disorders. Abstract book- Bath. - UK. - 2013. -P31.

7. «Polyamines neurotoxicity at the brain and ways of its correction». Konovalova E., Kulikova O., Stvolisky S., Makletsova M., Rikhereva G., Fedorova T. // The 38th FEBS Congress.FEBS Journal. Abstracts-Saint Petersbourg.- Russia.- 2013.-P576.

Публикации

Материалы диссертации изложены в 2 публикациях

1. Коновалова Е.В., Федорова Т.Н., Маклецова М.Г., Березов Т.Т. Влияние карнозина на гибель клеток PC-12, индуцированную токсическим действием акролеина. // Вопросы биологической, медицинской и фармакологической химии.- 2013.- №6.-С.43-48 .

2. Березов Т.Т., Маклецова М.Г., Сяткин С.П., Рихирева Г.Т., Куликова О.И., Коновалова Е.В., Федорова Т.Н. Роль обмена полиаминов в функциональной активности мозга в норме и при патологии. // Журнал неврология и психиатрия им. С.С.Корсакова.- 2013.-№7.-С. 65-70.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Окислительный стресс и антиоксиданты

1.1.1. Роль активных форм кислорода в нормальных и патологических условиях.

1.1.1.1 Кислородные радикалы и их повреждающее действие на клетку

Молекулярный кислород является широко распространенным окислителем в живых системах. Особенностью строения его молекулы является наличие двух неспаренных электронов с параллельным состоянием их спинов, в то время как электроны в молекулах стабильных органических соединений организованы в пары с антипараллельными спинами. По этой причине в ходе взаимодействия кислорода с окисляемыми им соединениями возможно образование короткоживущих комплексов.

Для полного исчерпания окислительной способности молекулярного кислорода и образования двух молекул воды необходимо присоединить к нему 4 электрона.

е е", 2Н+ е е\ 2 Н+

02 -> 0"2 -> Н202 ОН" + ОН" 2 Н20

При постадийном присоединении электронов к молекулярному кислороду образуются супероксид-анион радикал, гидропероксид и гидроксид-радикал. Изменение спинового состояния электронов в молекуле кислорода может прои