Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Защитное действие карнозина на нейроны, эритроциты и кардиомиоциты в условиях окислительного стресса

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Защитное действие карнозина на нейроны, эритроциты и кардиомиоциты в условиях окислительного стресса"

На правах рукописи

Арзуманян Елена Сергеевна

ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ КАРНОЗИНА НА НЕЙРОНЫ, ЭРИТРОЦИТЫ И КАРДИОМИОЦИТЫ В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

Специальность - биохимия 03.01.04

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН ?п?о

Москва, 2010

004609084

Работа выполнена в лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии Научного Центра неврологии РАМН

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, Профессор

Болдырев Александр Александрович

Доктор медицинских наук

Мовсесян Рубен Рудольфович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук

Сазонтова Татьяна Геннадьевна

Кандидат биологических наук

Казей Василий Игоревич

Ведущая организация:

НИИ фармакологии имени

В.В. Закусова РАМН

Защита диссертации состоится 10 г. в 14-00 часов на заседай

диссертационного совета Д 212. 203. 13 при Российском университете друж! народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российско университета дружбы по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6

Автореферат диссертации разослан ?2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.203.13 доктор биологических наук,

профессор Лукашева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Окислительный стресс в клетках, может вызывать развитие многих патологических процессов, таких как ишемическое и реперфузионное повреждение тканей, воспалительные процессы, сосудистые нарушения, атеросклероз, нейродегенеративные заболевания (Halliwell, 1999). В последние годы возрастает внимание к гомоцистеину (ГЦ) и продуктам его аутоокисления (главным образом, к гомоцистеиновой кислоте, ГЦК), как факторам индукции окислительного стресса при различных заболеваниях человека. Концентрация гомоцистеина и его метаболитов в крови существенно возрастает при нарушениях мозгового кровообращения (Зорилова, 2006), а также при развитии нейродегенеративных процессов (Boldyrev and Johnson, 2007).

Для подавления окислительного стресса все чаще используются синтетические антиоксиданты, применение которых нарушает естественный метаболизм клеток. В связи с этим исследование природных соединений, способных оказывать протекторное действие на различные типы клеток в условиях окислительного стресса, является актуальной задачей. Природные антиоксиданты могут играть существенную роль в предотвращении заболеваний, связанных с окислительным повреждением, а также служить эффективным средством в профилактике конкретных патологических процессов.

В настоящей работе проведено исследование защитного действия природного гистидинсодержащего дипептида карнозина на нейроны, эритроциты и кардиомиоциты в условиях окислительного стресса. В рамках исследования противоишемического действия карнозина была предложена новая формула кардиоплегического раствора на основе карнозина и его производного N-ацетилкарнозина. Использование природных антиоксидантов, обладающих высокой буферной емкостью в пределах физиологических значений pH, является перспективным направлением для разработки новых подходов в защите тканей от окислительного стресса. Цели и задачи работы:

Целью работы было изучение защитного действия карнозина и его природного ацетилированного производного N-ацетилкарнозина на нейроны, эритроциты и изолированное сердце в условиях окислительного стресса. Для осуществления этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить протекторное действие карнозина и Т^-ацетилкарнозина на нейроны интактных крыс под действием гомоцистеиновой кислоты и перекиси водорода.

2. Исследовать влияние гомоцистеиновой кислоты на осмотический и кислотный гемолиз эритроцитов и возможность защиты карнозином эритроцитов от окислительного стресса.

3. Проанализировать защитное действие карнозина и Ы-ацетилкарнозина на сердце крысы в условиях фармакохолодовой кардиоплегии; создать новую композицию кардиоплегического раствора на основе карнозина и родственных ему соединений.

Научная новизна и практическая значимость работы

Показано, что окислительный стресс, вызываемый в нейронах кратковременной активацией ММОА-рецепторов гомоцистеиновой кислотой, приводит к фосфорилированию МАР-киназы (МАРК) и к индукции апоптоза, а длительное возбуждение НМОА-рецепторов вызывает некротическую гибель нейрональных клеток. Перекись водорода также приводит к активации МАР-киназы и вызывает смерть клеток по пути как апоптоза, так и некроза. Карнозин защищает нейроны от развития окислительного стресса и активации МАР-киназы и предотвращает гибель клеток при действии каждого из используемых повреждающих факторов. И-ацетилкарнозин не обладает протекторным действием в этих условиях.

Продемонстрировано, что инкубация эритроцитов с ГЦК вызывает накопление в них свободных радикалов и ускоряет как кислотный, так и осмотический гемолиз клеток. Карнозин защищает эритроциты от действия ГЦК, замедляя кислотный и осмотический гемолиз, а также предотвращает спонтанный гемолиз эритроцитов.

На основании анализа эффектов карнозина и М-ацетилкарнозипа на сердце в условиях ишемического повреждения предложен кардиоплегический раствор нового состава, содержащий карнозин и М-ацетилкарнозин. Положения, выносимые на защиту

В диссертации представлены доказательства эффективности карнозина как протектора нейронов в условиях окислительного стресса, а также показано защитное действие карнозина на форменные элементы крови. На основании данных, полученных на ишемизированном сердце крысы в процессе кардиоплегии и в период реперфузии, предложен новый кардиоплегический раствор для применения в операциях на открытом сердце.

Впервые определена эффективность совместного действия карнозина и М-ацетилкарнозина в составе кардиоплегического раствора. Добавление этих

соединений в кардиоплегический раствор при длительной ишемии в условиях фармакохолодовой кардиоплегии приводит к улучшению электрофизиологических и биохимических показателей состояния миокарда в период реперфузии. Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (биологический факультет МГУ, 2007 г) и на заседании Ученого Совета Научного Центра неврологии РАМН (2010 г).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 6 в журналах, входящих в список ВАК.

Структура диссертации: диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, включающей описание используемых методов и полученных результатов, а также их обсуждения, Заключения, Выводов и Списка цитируемой литературы (149 ссылок). Работа изложена на 125 страницах машинописного текста и включает 5 таблиц и 30 рисунков.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении сформулированы цели и задачи работы, ее научная новизна и практическая значимость. Обзор литературы посвящен характеристике окислительного стресса в тканях мозга и сердца и способам защиты клеток от окислительного повреждения. Экспериментальная часть содержит два раздела. В первом разделе описаны материалы и методы исследования, второй раздел содержит описание полученных результатов и их обсуждение. Второй раздел содержит три главы:

1) Оценка протекторного действия карнозина и Ы-ацетилкарнозина на нейроны головного мозга крыс в условиях окислительного стресса.

2) Защита карнозином эритроцитов от окислительного стресса, вызываемого гомоцистеиновой кислотой.

3) Защитное действие карнозина и Ы-ацетилкарнозина в условиях ишемии и реперфузии изолированного сердца.

Завершают работу разделы «Заключение» и «Выводы».

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы

Моделирование окислительного повреждения нейронов in vitro.

Исследование окислительного стресса на суспензии нейронов мозжечка 8-12-дневных крыс проводили на проточном цитометре EPICS XL фирмы Beckman Coulter (США). Для регистрации уровня активных форм кислорода (АФК) в клетках использовали дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCF-DA, 100 мкмоль/л) (Болдырев, 2000). Количество мертвых клеток в нейрональной суспензии измеряли в присутствии йодида пропидия (PI). В каждой пробе подвергали анализу 10000 клеток, повторяя измерения в 3-4 параллельных пробах.

Измерение общей и фосфорилированной р42/44-МАРК проводили методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител к общей р42/44-МАРК (Thr202/Tyr204) и ее фосфорилированной (активированной) форме р42/44-МАРК (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology, США). Активацию МАРК оценивали по увеличению доли фосфорилированной фракции фермента. Клетки подвергали пермеабилизации метиловым спиртом и далее обрабатывали антителами на р42/44 МАРК (Thr202/Tyr204) или на фосфо-р44/42 МАРК (ТЬг202Яуг204). После отмывания клеток проводили окрашивание связавшихся моноклональных антител с ФИТЦ коньюгатом к суммарным иммуноглобулинам кролика в соответствии с протоколом производителя (Cell Signaling Tecnology, США). Антитела использовали в разведении 1:1000. В данной методике была применена фиксация поверхностных клеточных антигенных рецепторов, пермеабилизация клеток и последующее внутриклеточное окрашивание связавшихся с моноклональными антителами антигенов методом непрямой реакции иммунофлуоресценции. Флуоресценцию связавшихся с внутриклеточными антигенами ФИТЦ-меченых вторичных антител оценивали методом проточной цитометрии.

Для определения доли клеток, в которых инициировано развитие апоптоза, клетки инкубировали с ФИТЦ меченым аннексином V в соответствии с протоколом, рекомендуемым производителем («BioVision», США). Полученные значения средней флуоресценции выражали в процентах к контрольным значениям. Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы «Биостатистика». Достоверность различий оценивалась по стандартной ошибке среднего.

Гемолиз эритроцитов. Осмотический гемолиз вызывали разбавлением

клеточной суспензии дистиллированной водой в 2,2 раза. При этом происходило набухание клеток с последующим разрывом клеточной мембраны.

Кислотный гемолиз индуцировали добавлением к суспензии клеток соляной кислоты (до конечной концентрации 2,2 ммоль/л), что вызывало нарушение структуры цитоскелета, набухание и разрушение клеток (Prokopieva et al, 2002).

Просветление проб отражало процесс гемолиза эритроцитов. Регистрацию гемолиза осуществляли на фотоколориметре «Photometer 1101М» (Германия), соединенном с компьютером через аналогово-цифровой преобразователь. Полученные данные анализировали с помощью компьютерной программы VI Logger 2.0.1 («National Instruments», США) и программы MS Excel.

В качестве источника эритроцитов была использована кровь лабораторных крыс или здоровых доноров, стабилизированная гепарином (20 ед/мл). Для обоих источников крови были получены аналогичные результаты. Кровь разводили в 10 раз физиологическим раствором (145 ммоль/л NaCl) и хранили при 37°С не более 4 ч. Для измерения гемолиза в кювету с физиологическим раствором вносили суспензию эритроцитов до концентрации (5,0±0,3)-106 клеток/мл. Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева.

Гемолиз измеряли по изменению оптической плотности среды при 630 нм. Полученные результаты представляли в виде интегральных кривых, из которых рассчитывали скорость гемолитического процесса и количество гемолизованных клеток к моменту завершения измерений (Тюлина и соавт., 2002). В конце эксперимента в пробу добавляли соляную кислоту до конечной концентрации 1 М, вызывая полный гемолиз всех эритроцитов и рассчитывая процент гемолизированных клеток в каждом случае.

Спонтанный гемолиз эритроцитов оценивали по выходу оксигемоглобина, который измеряли при 576 нм в супернатанте после осаждения клеток.

Измерение уровня свободных радикалов в эритроцитах проводили аналогично методике измерения свободных радикалов в гранулярных клетках мозжечка. Фракцию эритроцитов для анализа выделяли путем центрифугирования в течение 5 мин. при 1000 g (4°С). Плазму и белые клетки крови удаляли с поверхности осажденных эритроцитов, после чего ресуспендировали клетки в инкубационной среде следующего состава (моль/л): 145 NaCl, 5 КС1, 1 СаСЦ, 0,15 MgCU, 15 глюкозы, 1% БСА, 10 Трис-HCl (рН 7,4). После ресуспендирования эритроциты отмывали 3 раза при помощи центрифугирования в аналогичных условиях. В конце процедуры упакованные эритроциты разводили до концентрации 40%. Инкубацию с

исследуемыми веществами проводили в течение 90 мин.

Модель ишемии и реперфузии изолированного сердца в условиях фармакохолодовой кардиоплегии. В экспериментах были воспроизведены условия фармакохолодовой кардиоплегии, применяемой при операциях на открытом сердце. Фармакохолодовая кардиоплегия — это быстрая полная электромеханическая остановка сердца в условиях глубокой гипотермии (4 - 7°С). В работе использовали самцов белых крыс линии массой 280-350 г. Крыс декапитировали, вскрывали

грудную клетку, изолировали сердце и помещали в ванночку с раствором Кребса-Хензеляйта (4°С). Затем аорту надевали на канюлю, прикрепленную к перфузионнной системе. После 20 мин. адаптации сердца к условиям ретроградной перфузии проводили запись исходных параметров сокращения (Таблица 1).

Таблица 1. Средние значения параметров сокращения интактного

изолированного сердца

Параметры Амплитуда, мм рт. ст. ЧСС, уд/мин Сократимость

Среднее значение(п=60) 72± 6 252± 23 18162± 138

После этого отсоединяли сердце вместе с канюлей от установки, промывали кардиоплегическим раствором (контрольным или экспериментальным). Состав используемых кардиоплегических растворов приведен в Таблице 2.

На следующем этапе эксперимента сердце помещали в ванночку с кардиоплегическим раствором (100 мл) на 30-480 мин. (в зависимости от длительности кардиоплегии), при температуре 4°С, а затем возобновляли перфузию сердца при 37 - 38°С. Запись сокращений производили в течение 45 мин. после начала реперфузии.

В работе проводили сравнение трех растворов: раствор Г.И. Цукермана -внеклеточный раствор, сделанный на основе раствора госпиталя святого Томаса, используемого большинством клиник (рН 7,8; осмолярность 345 мосм/л), раствор «Кустодиол» — кардиоплегический раствор внутриклеточного типа, в состав которого входит Ь-гистидин (рН 7,2; осмолярность 310 мосм/л), и предложенный нами и экспериментально охарактеризованный раствор «АСН» (рН 7,4; осмолярность 340 мосм/л), основанный на комбинации карнозина, Ы- ацетилкарнозина и Ь-гистидина.

Для определения сократительной функции левого желудочка до и после кардиоплегии регистрировали максимальное давление в левом желудочке -систолическое давление (СД, мм рт ст), минимальное давление в левом желудочке -

конечное днастолнческое давление (КДД, мм рт ст), развиваемое давление (его амплитуда вычислялась как разница между СД и КДД и выражалась в мм рт ст), частоту сокращений препарата изолированного сердца (ЧСС, уд/мин), +dp/dt шах -максимальную скорость фронта пульсовой волны в левом желудочке, -dp/dt шах -максимальную скорость спада пульсовой волны в левом желудочке, а также сократимость миокарда.

Из всех перечисленных параметров сократимость миокарда (произведение амплитуды сокращений на ЧСС, то есть работа, которую сердце совершает за 1 мин.) является наиболее четким индикатором функционального состояния миокарда. Регистрация сигнала с датчика давления и подача его на аналого-цифровой преобразователь происходила каждые 5 мс (в среднем 100 точек на сердечный цикл), что позволяло достаточно точно регистрировать кривую давления в левом желудочке. Так как параметры сокращения препарата варьировали внутри экспериментальных групп, величину изменения параметров после кардиоплегии для каждого препарата выражали в % от величины соответствующего параметра до кардиоплегии:

%=(A2/Ai)*100%,

где А[ - исходное значение параметра до реперфузии (таблица. 1), А2 - значение параметра в после кардиоплегии (при реперфузии) в соответствующий момент времени.

Таблица 2. Состав используемых кардиоплегических растворов

Компоненты (ммоль/л) Р-р Г.И. Цукермана «Кустодиол» «ACH»

NaCl 110 15 80

KCL 15 10 15

MgCl2 16 4 16

NaHC03 24

CaC12 8 0.015 0.03

L-гистидин 180 5

Триптофан 2

Маннитол 30 25

Карнозин 100

N-ацетилкарнозин 40

В растворе измеряли pH, р02 и уровень лактата, определяя эти величины на газовом анализаторе ABL 800 FLEX (Radiometer Medical ApS, Дания). Потребление кислорода миокардом вычисляли по разнице р02 в притекающем к сердцу и оттекающем от сердца растворах. Забор проб проводили до введения раствора в

аорту (проба 1), и после проведения кардиоплегии во время реперфузии в динамике: на 15 мин. реперфузии (проба 2), на 30 мин. (проба 3) и на 45 мин. (проба 4).

Достоверность различий оценивали с помощью критерия Манна Уитни в программе Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Оценка протекторного действия карнозииа и N-ацетилкарнозина на нейроны

головного мозга крыс в условиях окислительного стресса

Мы провели анализ действия карнозина и N-ацетилкарнозина на популяцию нервных клеток в условиях окислительного стресса, вызываемого действием разных агентов. В качестве индукторов окислительного стресса были выбраны ГЦК, NMDA и перекись водорода. Эти факторы являются известными маркерами окислительного стресса (Dumaswala et al, 1999; Болдырев, 2000). Известно, что перекись водорода вызывает повреждения клеток двумя независимыми способами: через активацию МАР-киназы и индукцию программируемой гибели клетки при кратковременном воздействии (Chen et al, 2009), а также через массированное окислительное нарушение мембранных компонентов клетки, вызывающее некротическую гибель клеток при длительном воздействии (или при действии высоких концентраций). В обоих случаях эффект ЩЬ осуществляется вследствие ее проникновения в клетку. Действие как NMDA, так и ГЦК опосредованно взаимодействием этих лигандов с глутаматными рецепторами преимущественно NMDA-класса (Shi et al., 2003; Bulygina et al, 2006).

Нами было показано, что после инкубации с ГЦК или NMDA в нейронах наблюдается повышение уровня свободнорадикальных соединений. ГЦК увеличивает продукцию активных форм кислорода (АФК) - средняя величина флуоресценции DCF возрастает с 50±5 отн. ед в контроле до 82±7 отн. ед после инкубации с ГЦК (Рис. 1А). При инкубации клеток с NMDA (2 ммоль/л; 60 мин.) уровень флуоресценции также увеличивается (до 68±5 отн. ед). Для предотвращения роста свободных радикалов под действием исследуемых индукторов окислительного стресса мы инкубировали пробы с известным антиоксидантом карнозином и его ацетилированным производным N-ацетилкарнозином. Характерно, что при инкубации нейронов с карнозином уровень свободных радикалов оставался в пределах контрольных значений (50±5 отн. Ед) во всех исследуемых образцах, невзирая на присутствие факторов окислительного стресса, в то время как N-ацетилкарнозин росту свободных радикалов не препятствовал.

Продукция свободнорадикальных соединений в нейронах может быть опосредована глутаматными рецепторами различных классов, но ведущая роль, судя по данным литературы (Болдырев, 2005), принадлежит NMDA-рецепторам. Для оценки участия этих рецепторов в реализации эффекта ГКЦ мы использовали специфический антагонист NMDA-рецепторов МК-801.

Из рис. 1 видно, что МК-801 препятствует росту свободных радикалов в нейронах, инкубированных с ГЦК, средняя величина флуоресценции, как и в контроле, составляет в этом случае 55±5 отн. ед.

Количество клеток Количество клеток

Рис. 1. Влияние ГЦК (1 ммоль/л, 60 мин., А) и Н2О2 (20 ммоль/л, 20 мин., Б) на флуоресценцию нейронов, преинкубированных и не преинкубированных с МК-801 (10 мкмоль/л)

При инкубации клеток с перекисью водорода также наблюдается рост уровня свободных радикалов - с 50±5 до 118±11 единиц флуоресценции, однако внесение в среду МК-801 не препятствует этому процессу - средняя величина флуоресценции в пробах с перекисью водорода и МК 801 составлет 117±9 отн. ед (Рис. 1Б). Эти данные соответствуют представлениям о том, что рост свободных радикалов при инкубации нейронов с перекисью водорода осуществляется за счет ее проникновения в клетки, а действие ГЦК, как и действие NMDA, опосредовано в наших опытах NMDA-рецепторами. Гомоцистеиновая кислота в отличие от NMDA присутствует в низких концентрациях в крови человека в норме. Повышение концентрации ГЦК может являться как непосредственной причиной, так и фактором, усугубляющим развитие патологических процессов (Болдырев, 2009). Поэтому в дальнейших экспериментах мы использовали ГЦК.

Для оценки последствий окислительного стресса под действием ГЦК и

перекиси водорода мы измеряли смертность нейронов по пути некроза. Мы показали, что инкубация клеток в присутствии ГЦК (180 мин.) или перекиси водорода (20 мин.) индуцирует некроз части клеточной популяции (рис. 2).

Рис. 2. Влияние индукторов окислительного стресса ГЦК (1 ммоль/л) и Н202 (20 ммоль/л) на гибель клеток по пути некроза в условиях предварительной инкубации клеток с МК-801 (10 мкмоль; 10 мин.) или карнозином (5 ммоль/л, 30 мин.). Количество мертвых клеток в контроле принято за 100%. Знак «*» -соответствует достоверному отличию от контроля, «$» - соответствует достоверному отличию от группы (ГЦК + Кари.) и группы (ГЦК + МК-801) от группы (ГЦК). «#» - соответствует достоверному отличию группы (Н202 + Карн.) от группы (Н202)

В стандартных условиях в суспензии выделенных нейронов присутствуют от 10 до 15% мертвых клеток, что является следствием манипуляций на разных стадиях выделения. Для удобства сравнения мы принимали этот уровень мертвых клеток за 100%. Из рис. 2 видно, что 180 мин. инкубация клеток с ЩК или с перекисью водорода приводит к росту популяции мертвых клеток по сравнению с контролем. Максимальным эффектом обладает перекись водорода, при этом наблюдается увеличение смертности клеток более чем в два раза. При коротких временах инкубации с исследуемыми индукторами окислительного стресса количество мертвых клеток не увеличивалось.

Из литературы известно, что в результате повышения стационарного уровня свободных радикалов (Grewal et al, 1999) в клетках может происходить активация МАР-киназы (МАРК). Для понимания процессов, происходящих в популяции живых клеток под воздействием ГЦК и перекиси водорода, мы исследовали активацию этого фермента (Рис. 3).

¡v.>K;tv;i?. K:ip:i,<inn 1I2(V Ш02

ГЦК ГЦК ГЦК

•К^.рп < МкмЦ

ЯО-J

ймгршн, Кяршнм ГЦК ПДС Ю02 1ШЙ

^Sapti. тКарн.

Рис. 3. Уровень фосфо-р42/44 МАРК в нейронах при инкубации в разных условиях: ГЦК (500 мкмоль, 120 мин.), Н202 (10 ммоль/л, 20 мин.), преинкубированные и не преинкубированные с 10 ммоль/л карнозина). Уровень фосфо-р42/44 МАРК в контроле принят за 100%. Знак «*» соответствует достоверному отличию от контроля, «$» - достоверному отличию группы (ГЦК + Кари) от группы (ГЦК). «#» соответствует достоверному отличию группы | (Н202 + Карн) от группы «Н202»

Из рис. 3 видно, что уровень фосфорилированной формы МАРК увеличивается в два раза при инкубации клеток с перекисью водорода. Инкубация с ГЦК также приводит к активации МАРК - наблюдается полутарократный рост уровня J фосфорилированной формы по сравнению с контрольным (см. рис. 3). Предварительная инкубация клеток с карнозином снижает активацию МАРК до значений ниже контрольных вне зависимости от присутствия индукторов окислительного стресса.

Известно, что активация МАРК перекисью водорода индуцирует программируемую гибель клеток (Chen et al, 2009). Мы предположили, что ' инкубация клеток с ГЦК также может приводить к апоптозу клеточной популяции. Для проверки этого предположения мы измеряли количество экстернализованного фосфатидилсерина в нейрональных мембранах. Оказалось, что через 120 мин. инкубации интактных клеток с ГЦК в популяции выявляется 44% клеток, в которых произошла инициация апоптоза (рис. 4). В то же время, в суспензии клеток, преинкубированных с 5 ммоль/л карнозина, вообще не выявляются Аннексии V положительные клетки.

Из полученных нами данных можно заключить, что длительная инкубация (180 мин.) клеток с высокими концентрациями ГЦК ("1 ммоль/л), приводит к росту

свободных радикалов, разрушению клеточных мембран и смерти клеток по пути некроза. При инкубации клеток с пониженной концентрацией ГЦК (0,5 ммоль/л) происходит активация МАРК и индукции другого типа клеточной гибели - апоптоза.

«8

Рис. 4. Влияние ГЦК (500 мкмоль, 120 мин.) на смертность нейронов по пути апоптоза. Знак «*» соответствует достоверному отличию от контроля

Контроль ГЦК Карнозм ГЦК

+Карн.

Таким образом, внесение в среду к суспензии переживающих нейронов природного антиоксиданта карнозина препятствует росту свободных радикалов под действием ГЦК и перекиси водорода. Предварительная инкубация с карнозином предотвращает активацию МАР-киназы, а также защищает клетки от гибели по пути как апоптоза, так и некроза . В отличие от карнозина его производное М-ацетилкарнозин не обладает защитным действием, не оказывая влияния ни на уровень свободных радикалов ни на смертность клеток.

II. Защита карнозином эритроцитов от окислительного стресса, вызываемого

Окислительный стресс, вызываемый в клетках гомоцистеиновой кислотой, мы проанализировали на моделях гемолиза эритроцитов крысы и человека. В этой работе мы использовали три разных способа гемолиза: спонтанный гемолиз, гемолиз, вызываемый закислением среды (кислотный гемолиз), и осмотический гемолиз. В случае кислотного гемолиза повреждение эритроцитов происходит вследствие проникновения избыточного количества протонов в клетку и нарушения структуры клеточных мембран. Осмотический гемолиз эритроцитов происходит в результате уменьшения изотоничности внешней среды и активного проникновения воды в клетку. Для контроля участия свободнорадикальных соединений в этих процессах мы измеряли флуоресценцию эритроцитов, нагруженных маркером свободных радикалов, БСР-ОА.

гомоцистеиновой кислотой

ILL Влияние ГЦК и карнозина на спонтанный выход гемоглобина из эритроцитов. При длительной инкубации эритроцитов в условиях in vitro происходит постепенное накопление дефектов клеточной мембраны, нарушение ее целостности и спонтанное разрушение клеток. Инкубация эритроцитов в присутствии ГЦК (1 ммоль/л) усиливает этот процесс, и просветление проб в присутствии ГЦК происходит значительно быстрее, что указывает на ускорение процесса гемолиза. Измерение выхода оксигемоглобина из эритроцитов в этих условиях показало, что ГЦК увеличивает спонтанный гемолиз на 15±2%, а в присутствии карнозина (5 моль/л) этот процесс осуществляется даже на 19±3%

Рис. 5. Спонтанный выход оксигемоглобина под действием ГЦК (1 ммоль/л) в отсутствие и в присутствии 5 ммоль/л карнозина (Х=575 нм, инкубация эритроцитов крысы в течение 90 мин.). Знак «*» соответствует достоверному

отличию от контроля

В условиях предварительной инкубации эритроцитов крысы с карнозином ГЦК вообще не влияла на спонтанный гемолиз, и величина спонтанного выхода оксигемоглобина в этих условиях составляла 86±4% от контроля.

II.2. Влияние гомоцистеиновой кислоты и карнозина на кислотный гемолиз эритроцитов. Следующим этапом наших исследований было исследование действия ГЦК на эритроциты в условиях кислотного гемолиза. Кислотный гемолиз в используемых условиях имел выраженный латентный период, а общее количество клеток, подвергающихся гемолизу, составляло 60-75%. При измерении начальной скорости этого процесса мы показали, что, ГЦК (1 ммоль/л) увеличивает скорость, кислотного гемолиза на 22±3%, а карнозин снижает скорость гемолиза до 80±5% от контрольной величины вне зависимости от присутствия ГЦК.

Ускорение гемолиза гомоцистеиновой кислотой в условиях кислотного гемолиза происходит более выраженным образом по сравнению со спонтанным гемолизом.

медленнее, чем в контроле (р<0,05) (рис. 5).

Контроль ГЦК Карншин Каришин

+ ГЦК*

11.3. Влияние гомоцистеиновой кислоты и карнозина на осмотический гемолиз эритроцитов. На рис. 6 представлены кривые осмотического гемолиза эритроцитов, осуществляемого в разных условиях.

Рис. 6. Осмотический гемолиз эритроцитов в разных условиях. 1 -контроль, 2 - ГЦК (1 ммоль/л), 3 -ГЦК (1 ммоль/л) + карнозин (5 ммоль/л)

Время (млн.)

В условиях осмотического гемолиза общее количество гемолизированных клеток к концу опыта составляет около 30%. Из рис. 6 видно, что ГЦК значительно увеличивает скорость гемолитического процесса, а карнозин предотвращает ее действие. При этом максимальное количество клеток, подвергаемых осмотическому гемолизу к моменту его окончания, во всех экспериментах остается на уровне 30%.

П.4. Измерение уровня свободных радикалов в эритроцитах в различных условиях. Известно, что распространенной причиной гибели эритроцитов является продукция свободных радикалов, которая вызывает окислительную модификацию мембранных липидов и белков цитоскелета (Арзуманян и соавт., 2008). Ранее было показано, что скорость гемолиза эритроцитов может быть понижена при добавлении во внеклеточную среду антиоксидантных ферментов (1уапоу, 1999). Мы предположили, что ускорение гемолиза эритроцитов под действием ГЦК происходит в результате ускорения свободнорадикальных процессов в эритроцитах. Для проверки этого предположения мы проанализировали влияние гомоцистеиновой кислоты и карнозина на продукцию свободных радикалов в используемых условиях. Мы показали, что при инкубации эритроцитов с ГЦК продукция свободных радикалов увеличивается на 50% по сравнению с контрольным уровнем (рис. 7).

Присутствие карнозина препятствует росту свободных радикалов, снижая их уровень до контрольного, невзирая на присутствие перекиси водорода или ГЦК.

Рис. 7. Уровень свободных радикалов в эритроцитах, измеренный в условиях спонтанного гемолиза в разных условиях. 1 - контроль, 2 - ГЦК (1 ммоль/л), 3 - Н202 (1 ммоль/л), д^ г 4 - карнозин (1 ммоль/л), 51 [. ГТ1 карнозин (1 ммоль/л) + ГЦК (1

I i ммоль/л), карнозин (1 ммоль/л) +

* ф л * H202 (1 ммоль/л). Знак «*»

/ 4 * € / /

■г ^ соответствует достоверному

^ отличию от контроля

Таким образом, мы показали, что ГЦК индуцирует окислительный стресс в эритроцитах, увеличивая продукцию свободных радикалов, чем провоцирует повреждения эритроцитарных мембран. Этот фактор необходимо учитывать при оценке состояния пациентов с хронической гипергомоцистеинемией.

То обстоятельство, что карнозин нивелирует повреждающее действие ГЦК и увеличивает стабильность эритроцитов в условиях кислотного и осмотического гемолиза, является существенным для стабилизации и сохранения функции эритроцитов в неблагоприятных условиях. Результаты, полученные нами в этих исследованиях, позволяют рекомендовать карнозин в качестве компонента для сред, используемых в сердечно-сосудистой хирургии.

III. Защитное действие карнозина и N-ацетилкарнозина в условиях ишемии н реперфузии изолированного сердца

Ишемия выступает в качестве неспецифического компонента многих заболеваний и возрастных изменений в тканях человека и животных, а также является одним из главных факторов ухудшения состояния сердца после искусственной остановки сердца - в период реперфузии (Jynge, 1981). Ранее было показано, что карнозин, как и его производное N-ацетилкарнозин, эффективно препятствует развитию ишемической реперфузионной контрактуры сердца, а также способствуют восстановлению силы сокращений на стадии реперфузии (Алабовский и соавт., 1997). Данное исследование послужило для нас предпосылкой в изучении кардиопротекторного действия этих соединений в условиях фармакохолодовой кардиоплегии, а также для создания на их основе принципиально нового

кардиоплегического раствора. Такое исследование проведено нами совместно с сотрудниками Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева.

Для оценки влияния карнозина и N-ацетилкарнозина на ишемию и переживание тканей сердца при проведении фармакохолодовой кардиоплегии были проведены предварительные эксперименты, в результате которых была предложена новая формула кардиоплегического раствора, основанного на комбинации дипептидов. Для оценки защитных свойств нового кардиоплегического раствора мы провели сравнение эффективности восстановления миокарда после кардиоплегии с предложенным нами экспериментальным раствором «ACH», а также с существующими кардиоплегическими растворами «Кустодиол» и раствор Цукермана. Состав растворов представлен в таблице 2 в разделе «Материалы и методы».

Раствор Цукермана используется при операциях на открытом сердце в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева. Максимальное время кардиоплегии с раствором Цукермана составляет 40 мин. Раствор «Кустодиол» признан в медицинской практике одним из лучших кардиоплегических растворов, он обеспечивает максимально эффективное восстановление сократимости миокарда после длительной кардиоплегии при операциях на сердце по сравнению с другими используемыми растворами. Максимальное время кардиоплегии при операциях на сердце с использованием раствора «Кустодиол» составляет 120 мин. В состав раствора «Кустодиол» входит L-гистидин, который, как было показано ранее в условиях ишемии и реперфузии, не проявляет защитных свойств (Алабовский и соавт., 1997).

Сердце крысы использовалось нами как объект с высоким миокардиальным резервом. Принимая во внимание, что увеличение времени энергетического дефицита способствует выявлению протекторных свойств исследуемых соединений, для получения достоверных различий мы проводили кардиоплегию длительностью 480 мин.

В данном исследовании для оценки состояния миокарда в режиме реального времени использовали несколько показателей (см. «Материалы и методы»), прежде всего - показатель сократимости.

В начале реперфузии во всех экспериментальных группах отмечается тенденция к увеличению сократительной способности миокарда. Сократимость миокарда после кардиоплегии с раствором «ACH» была достоверно выше, чем после кардиоплегии с раствором Цукермана или раствором «Кустодиол». Показатели

восстановления активности сердца с экспериментальным раствором «ACH» на 45 мин. реперфузии приближаются к значениям, полученным для интактного сердца, и составляют 98% (рис. 8). Для раствора «Кустодиол» максимальные значения сократимости миокарда на последнем этапе реперфузии достигают только 80%. После кардиоплегии с раствором Цукермана восстановление сократимости миокарда не превышает 50%.

Рис. 8. Восстановление сократимости изолированного сердца крысы после кардиоплегии (480 мин.) в разных условиях

Время (midi)

Величина амплитуды (рис. 9), отражающая давление в левом желудочке, достоверно растет с момента начала реперфузии с раствором «ACH» и приближается к контрольным показателям уже на 40 мин. реперфузии.

Рис. 9. Восстановление амплитуды изолированного сердца крысы после кардиоплегии (480 мин.) в разных условиях

После кардиоплегии с раствором Цукермана значения амплитуды к 45 мин. реперфузии достигают несколько более 60% от исходного уровня. В экспериментах с кардиоплегическим раствором «Кустодиол» параметры амплитуды были выше, чем при кардиоплегии с раствором Цукермана, однако ниже, чем при кардиоплегии с раствором «ACH», и составляли около 80% от начального уровня.

Не менее значимым показателем восстановления сердечных сокращений является максимальная скорость спада пульсовой волны. В наших экспериментах было показано, что скорость спада пульсовой волны с раствором «ACH» увеличивается до 80% от показателей интактного сердца и достигает значений 90% к 45 мин. реперфузии (рис. 10).

Показатели скорости спада пульсовой волны после кардиоплегии с раствором «Кустодиол» были достоверно ниже значений полученных для экспериментального раствора «ACH».

Рис. 10. Восстановление скорости спада изолированного сердца крысы после кардиоплегии (480 мин.) в разных условиях

Вр<мч (мин)

Для оценки метаболизма миокарда в экспериментах с использованием нового кардиоплегического раствора помимо электрофизиологических показателей мы оценивали рН раствора после проведения кардиоплегии, потребление кислорода (разница р02 в притекающем и оттекающем растворе), и содержание лактата в оттекающем растворе. Данные по содержанию лактата и потреблению кислорода (р02) приведены в таблице 3.

Таблица 3. Содержание лактата и потребление кислорода (р02)

Кардиоплегические растворы

Время Р-р Г.И.

реперфузии Параметры Цукермана «Кустодиол» «ACH»

р02 (мм Hg) 2,00 ±1 9.0 ±1 26 ± 1

15 мин. лактат (ммоль/л) 0,37 ±0,02 0,3 ± 0,04 0,15 ±0,02

р02 (мм Hg) 6± 1 9± 1 14 ± 2

30 мин. лактат (ммоль/л) 0,32 ±0,03 0,19 ±0,04 0,07 ±0,02

р02 (мм Hg) 7± 2 11 ±2 3 ± 2

45 мин. лактат (ммоль/л) 0,25 ± 0,03 0,15 ±0,03 0,05 ± 0,02

100

Из таблицы 3 видно, что динамика показателей кислотно-щелочного равновесия обратима. На последних этапах реперузии показатели приходят в норму. Содержание лактата в оттекающем растворе в первые минуты после реперфузии достоверно ниже после кардиоплегии с раствором «АСН», чем после кардиоплегии с раствором Цукермана или «Кустодиолом».

Анализ изменений рН приведен в таблице 4, из которой видно, что критического снижения значений рН (ниже рН 7,0) не наблюдалось ни с одним из растворов. Однако при кардиоплегии с раствором Цукермана показатели рН в течение всего реперфузионного периода оставались низкими. Значения рН после кардиоплегии с раствором «Кустодиол» на начальном этапе реперфузии были снижены, однако на последнем этапе наблюдалось восстановление значений рН. По-видимому, снижение рН на начальных этапах реперфузии связано с вымыванием продуктов метаболизма, накопленных за время кардиоплегической ишемии.

Таблица 4. Изменения рН растворов при применении разных кардиоплегических растворов

Время реперфузии Р-р Г.И. Цукермана «Кустодиол» «АСН»

15 мин. 7,22±0,02 7,25±0,03 7,34±0,06

30 мин. 7,24±0,02 7,29±0,02 7,38±0,04

45 мин. 7,28±0,04 7,34±0,04 7,38±0,05

В результате проведенных экспериментов мы можем заключить, что ни с одним раствором не происходило полного восстановление исследуемых параметров в условиях гипотермии и длительной ишемии, однако при сравнении их между собой оказалось, что раствор «АСН», составленный на основе комбинации гистидина, карнозина и N-ацетилкарнозина, обеспечивает наиболее полное восстановление параметров сократимости миокарда.

Заключение

В настоящей работе нами показано, что окислительный стресс, вызываемый in vitro ГЦК или перекисью водорода, индуцирует смерть нейрональных клеток. Интенсивность и длительность воздействия исследуемых индукторов окислительного стресса существенна для типа выявляемой гибели нейронов. Кратковременная инкубация клеток с ГЦК или перекисью водорода приводит к активации МАР-киназы и гибели клеток по пути апоптоза, в то время как высокие концентрации и/или длительная инкубация с этими веществами приводит к массовому некрозу. Карнозин эффективно препятствует накоплению АФК в нейронах в условиях окислительного стресса, одновременно препятствуя активации

МАРК и гибели клеток при действии каждого из используемых повреждающих факторов. Аналог карнозина, Ы-ацетилкарнозин не оказывает влияния ни на рост свободных радикалов, ни на смертность клеточной популяции.

Инкубация эритроцитов с ГЦК приводит к ускорению кислотного и осмотического гемолиза путем накопления в них свободных радикалов. Карнозин защищает эритроциты от действия ГЦК, предотвращая накопление в них свободных радикалов, останавливая спонтанный, а также замедляя кислотный или осмотический гемолиз.

Нами продемонстрировано защитное действие карнозина и 1^-ацетшгкарнозина в условиях ишемии и реперфузии изолированного сердца и обоснована эффективность использования природных дипептидов в составе кардиоплегического раствора. На основании проделанных экспериментов мы предложили новую формулу кардиоплегического раствора на основе карнозина и И-ацетилкарнозина для использования при операциях на открытом сердце.

Выводы

1. Карнозин является эффективным протектором нейронов в условиях окислительного стресса, вызываемого двумя видами индукторов - перекисью водорода и гомоцистеиновой кислотой. В этих условиях карнозин предотвращает накопление свободных радикалов в нейронах, препятствует активации МАРК и подавляет процессы, ведущие к смерти клеток по пути как апоптоза, так и некроза. Ы-ацетилкарнозин не оказывает защитного эффекта на нейрональные клетки.

2. Гомоцистеиновая кислота вызывает увеличение продукции свободных радикалов в эритроцитах, индуцирует спонтанный гемолиз эритроцитов, а также ускоряет осмотический и кислотный гемолиз. Карнозин защищает эритроциты от действия гомоцистеиновой кислоты и повышает устойчивость эритроцитов к гемолитическому воздействию.

3. Карнозин препятствует накоплению мабранных дефектов, замедляя как спонтанный, так и осмотический или кислотный типы гемолиза эритроцитов.

4. Использование карнозина и Ы-ацетилкарнозина в кардиоплегическом растворе повышает эффективность восстановления сердечных сокращений после длительной ишемии и улучшает биохимические показатели метаболизма миокарда, что позволяет увеличить длительность кардиоплегии в период операции на открытом сердце.

5. Создан новый кардиоплегический раствор на основе карнозина и И-ацетилкарнозина, который апробирован в практике сердечно-сосудистой хирургии.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Арзуманян Е.С. Защитное действие карнозина на гемолиз эритроцитов, ускоренный гомоцистеиновой кислотой. Новые лекарственные препараты. 2007, №9, С. 12-15.

2. Козина Л.С., Стволинский С.Л., Федорова Т.Н., Булыгина Е.Р., Арзуманян Е.С., Арутюнян A.B., Хавинсон В.Х. Изучение антиоксидантных и мембранопротекторных свойств коротких пептидов в модельных экспериментах. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии 2008. № 6, С. 31-36.

3. Арзуманян Е.С. Исследование влияния гомоцистеиновой кислоты на осмотический гемолиз эритроцитов. Бюллетень московского общества испытателей природы. 2007. 112 ( 1), С. 15-17.

4. Арзуманян Е.С., Махро A.B., Тюлина О.В., Болдырев A.A. Карнозин защищает эритроциты от окислительного стресса, вызываемого гомоцистеиновой кислотой. Доклады Российской Академии Наук. 2008.418, № 6, С. 834-836.

5. Бокерия Л.А., Болдырев A.A., Мовсесян P.P., Алиханов С.А., Арзуманян Е.С., Нисневич Э.Д., Артюхина Т.В., Серов P.A. Кардиопротекторный эффект гистидинсодержащих дипептидов при фармакохолодовой кардиоплегии. Бюлл. эксп. биол. мед. 2008.145 (3), С. 291-295.

6. Мовсесян Р.Р., Алиханов С.А., Нисневич Э.Д., Арзуманян Е.С., Артюхина Т.В., Серов P.A., Муратов P.M., Болдырев A.A., Бокерия Л.А. Дополнительный противоишемический эффект карнозина и его производных в кардиоплегическом растворе. Бюллетень научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН Сердечно-сосудистые заболевания. 2008. 9 (1), С. 98-105.

7. Арзуманян Е. С., Степанова М.С., Механизмы токсического действия гомоцистеиновой кислоты на нейрональные клетки. Нейрохимия. 2010.27 (3), С. 251256

Краткая аннотация диссертационной работы Б.С. Лрзуманян «Защитное действие карнозина на нейроны, эритроциты и кардиомноцнты в условиях окислительного стресса»

Работа посвящена изучению защитного действия карнозина и его природного ацетилированного производного N-ацетилкарнозина на нейроны, эритроциты и изолированное сердце в условиях окислительного стресса. Показано, что карнозин защищает нейроны от развития окислительного стресса и предотвращает активацию МАР-киназы и гибель клеток при действии каждого из используемых повреждающих факторов. N-ацетилкарнозин не обладает протекторным действием в этих условиях.

Продемонстрировано, что инкубация эритроцитов с ГЦК вызывает накопление в них свободных радикалов и ускоряет как кислотный, так и осмотический гемолиз клеток. Карнозин защищает эритроциты от действия ГЦК, замедляя кислотный и осмотический гемолиз, а также предотвращает спонтанный гемолиз эритроцитов.

На основании анализа эффектов карнозина и N-ацетилкарнозина на сердце в условиях ишемического повреждения предложен кардиоплегический раствор нового состава, содержащий карнозин и N-ацетилкарнозин.

Summary of PhD. Thesis by Arzumanyan E. entitled «The protective effect of carnosine on neurons, red blood cells and cardiomyocytes from oxidative damages»

The study is devoted to protective effect of carnosine and its natural acetylated derivative N-acetylcarnosine on neurons, red blood cells and isolated rat heart under oxidative damage. In this work, it has been shown that carnosine protects neurons from oxidative stress and prevents activation of MAP-kinase and cell death by both apoptosis and necrosis.

Incubation of red blood cells with HCA caused intracellular accumulation of free radicals and accelerated both acidic and osmotic hemolysis, preincubation with carnosine prevented spontaneous hemolysis and slowing down hemolysis induced by both HC1 and decrease in osmotic pressure.

Based on the effects of carnosine and N-acetylcarnosine on isolated rat heart under ischemic injury the new composition of cardioplegic solution containing carnosine and N-acetylcarnosine has been constructed.

Подписано в печать:

05.08.2010

Заказ № 3999 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Арзуманян, Елена Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Свободные радикалы

1.2. Окислительный стресс в нейронах

1.3. Роль NMDA-рецепторов в окислительном стрессе нейронов

1.4. Окислительный стресс в эритроцитах

1.5. Антиоксидантная система 30 1.5.1. Природный антиоксидант карнозин

1.6. Кардиоплегия

1.7. Влияние интенсивности ишемического повреждения на реперфузию

1.8. Методы защиты миокарда при кардиоплегии

1.9. Роль буферной емкости, рН и гипотермии при фармакохолодовой кардиоплегии

1.10. Применение природных антиоксидантов в условиях фармакохолодовой кардиоплегии

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Выделение переживающей культуры нейронов мозжечка

2.2. Проточная цитометрия

2.3. Определение уровня АФК в клетках

2.4. Определение количества мертвых (некротических) клеток

2.5. Анализ клеточной гибели по пути апоптоза

2.6. Моделирование окислительного стресса в суспензии нейронов in vitro

2.7. Измерение общей и фосфорилированной р42/44 МАР-киназы

2.8. Гемолиз эритроцитов

2.9. Выделение эритроцитов

2.10. Осмотический гемолиз

2.11. Кислотный гемолиз

2.12. Спонтанный гемолиз

2.13. Анализ роста свободных радикалов в эритроцитах

2.14. Модель ишемии и реперфузии изолированного сердца в условиях фармакохолодовой кардиоплегии

2.15. Схема установки для перфузии препарата изолированного сердца крысы по методу Лангендорфа

2.16. Препарат изолированного сердца

2.17. Регистрируемые параметры при перфузии изолированного сердца крысы

2.18. Эксперименты с перфузией изолированного сердца крысы

2.19. Особенности перфузии изолированного сердца крысы

2.20. Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Оценка протекторного действия карнозина и Ы-ацетилкарнозина на нейроны головного мозга крыс в условиях окислительного стресса

3.1.1. Действие карнозина на уровень свободных радикалов

3.1.2. Влияние карнозина на активацию МАР-киназы и апоптоз в суспензии изолированных нейронов

3.2. Защита карнозином эритроцитов от окислительного стресса, вызываемого гомоцистеиновой кислотой

3.2.1. Влияние ГЦК и карнозина на спонтанный выход гемоглобина из эритроцитов

3.2.2. Влияние гомоцистеиновой кислоты и карнозина на кислотный гемолиз эритроцитов

3.2.3. Влияние гомоцистеиновой кислоты и карнозина на осмотический гемолиз эритроцитов

3.2.4. Измерение уровня свободных радикалов в эритроцитах в различных условиях

3.3. Защитное действие карнозина и Ы-ацетилкарнозина на изолированное сердце в условиях ишемии и реперфузии

3.3.1. Предпосылки использования карнозина и родственных ему соединений в качестве компонентов кар диоплегического раствора

3.3.2. Защитное действие карнозина и Ы-ацетилкарнозина в условиях фармакохолодовой кардиоплегии

3.3.3 Анализ восстановления сердечных сокращений после кардиоплегии с экспериментальным раствором «АСН»

Введение Диссертация по биологии, на тему "Защитное действие карнозина на нейроны, эритроциты и кардиомиоциты в условиях окислительного стресса"

Окислительный стресс в тканях может вызывать развитие многих патологических процессов, таких как ишемическое и реперфузионное повреждение тканей, воспалительные процессы, нейродегенеративные заболевания [НаШ\уе11, 1999]. Неконтролируемое накопление свободных радикалов приводит к развитию окислительного стресса, разрушению макромолекул и в результате к дисрегуляции клеточного метаболизма. Свободные радикалы выполняют в организме двойственную роль, в низких концентрациях они вызывают активацию МАР-киназы и экспрессию генов раннего ответа, что приводит к увеличению выживаемости клетки, ее адаптации, однако при длительном воздействии свободные радикалы вызывают развитие программируемой клеточной смерти.

В связи с этим систематическое исследование природных соединений, способных оказывать протекторное действие на различные типы клеток в условиях окислительного стресса, является актуальной задачей.

В настоящей работе мы провели исследование защитного действия природного гистидинсодержащего дипептида карнозина, который, как было показано ранее, обладает выраженными буферными и антиоксидантными свойствами. Направлением нашего исследования было оценить возможность использования карнозина в качестве модулятора клеточного метаболизма. Для этого мы проанализировали действие карнозина и некоторых его производных на клетки возбудимых тканей мозга и сердца. Для оценки действия карнозина мы выбрали две структурно-функциональные системы: для оценки действия карнозина на головной мозг мы использовали гранулярные клетки мозжечка, для оценки действия карнозина на сердечнососудистую систему - кровь и изолированное сердце крысы.

В рамках исследования противоишемического действия карнозина нами совместно с НЦССХ имени А.Н. Бакулева РАМН была предложена новая формула кардиоплегического раствора на основе карнозина и его производного N-ацетилкарнозина. Использование природных антиоксидантов, обладающих высокой буферной емкостью в пределах физиологических значений pH, является перспективным направлением для разработки новых подходов для защиты тканей от окислительного стресса.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Окислительный стресс и способы защиты от окислительного стресса с помощью природного антиоксиданта карнозина

Окисление и продукция свободных радикалов является неотъемлемой частью метаболизма живых организмов [Papas, 1996]. По оценке Гельмута Эстербауэра, человек за 70 лет жизни вырабатывает от 800 до 1700 кг свободных радикалов [Esterbauer, 1990]. При нормальном функционировании клетки свободные радикалы действуют как сигнальные соединения, обеспечивающие метаболический ответ клетки на внешние факторы, а также выполняют защитную роль — разрушают чужеродные вещества.

В процессе жизнедеятельности свободные радикалы индуцируют около 10000 повреждений ДНК за сутки, что может являться механизмом регуляции транскрипции генов или приводить к разрывам* двойной* спирали ДНК, реорганизации генома и трансформации здорой клетки в раковую [Tsai, Lieber, 2010].

Многие события в регуляции клеточных процессов, такие как фосфорилирование белков, в том числе регуляторных, активация факторов транскрипции и их связывание с регуляторными участками ДНК, контролируются, физиологическим редокс гомеостазом, в особенности тиол-дисульфидным балансом. Универсальными, индукторами изменений редокс-баланса в ответ на стрессовые воздействия выступают активные формы кислорода (АФК), а также продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ). В клетках млекопитающих наг сегодняшний' день идентифицировано огромное количество так называемых «редокс-чувствительных» транскрипционных факторов, отвечающ их на изменение окислительно восстановительного баланса или изменения соотношения прооксидантови антиоксидантов. Активация таких редокс-чувствительных элементов, как факторы транскрипции Nuclear factor-kappa (NF-kB), activator protein-1 (AP-1), p53', NF-E2-related factor-2 (Nrf2), early growth response protein-1 (EGR-1) в клетках приводит к изменению-экспрессии нескольких сотен генов» и; соответственно, активности* многих ферментативных процессов; что делает эти- регуляторные молекулы ключевыми элементами1 клеточной пролиферации и дифференцировки, индукции апоптоза и развития множественной лекарственной устойчивости [Acker, Acker, 2004].

Факторы транскрипции NF-kB и АР-1 являются, ключевыми в экспрессии генов, отвечающих за развитие патологических процессов воспалительной природы, включая бронхиальную астму, атеросклероз, ревматоидный артрит.

Участие АФК в регуляции активности ферментов и факторов транскрипции-[Болдырев, 2003; Marshal et al., 2004; Den Hertog et al., 2005] может осуществляться по трем редокс-чувствительным механизмам: через каскады, митогенактивируемых протеинкиназ (mitogen-activated1 protein kinases, МАРК), фосфорилирование белков и АР-1 подобные транскрипционные факторы [Ikner, Shiozaki, 2005; Toone, 2001], Показано, что в ответ на окислительный стресс модулируется экспрессия-около 24% всего генома [Fernandes et al., 1997]. Главным регуляторным элементом изменения экспрессии генов в ответ на окислительный стресс является фактор транскрипции Yap 1, который относится к ZIPзапирающим белкам семейства АР-1. Гены, контролируемые Yapl, включают антиоксидантные ферменты, ферменты регулирующие тиолдисульфидный баланс: супероксид дисмутазы СОД1 и СОД2, глутатион пероксидазу 2, тиол-зависимые пероксидазы TS AI и АНР1, тиоредоксин 2 и глутаредоксин 1 [Paget, Buttner, 2003].

В число стрессорных белков, синтез которых регулируется свободнорадикальными продуктами, входят антиоксидантные ферменты Мп-СОД и глутатионпероксидаза, белки теплового шока, ферменты- репарации ДНК, факторы, стимулирующие ангиогенез и дифференциацию стволовых клеток, факторы роста, дифференцировки и старения фибробластов. Эти белки не только, предохраняют клетки, но и способствуют репарации уже возникших клеточных повреждений [Коркина, Деева, 2006]. Однако при длительном воздействии CP пролонгированная активация этих факторов приводит к включению генов, контролирующих апоптоз [Acker, Acker, 2004].

Основными механизмами, которые запускаются АФК, являются воздействие на Са2+-метаболизм клетки, взаимодействие с металлсодержащими белками и окисление SH-групп в белках влияния.

•Атомы металлов переменной валентности имеют на внутренних атомных орбиталях непрочносвязанные электроны и являются мишенями АФК, которые в большинстве своем имеют незаполненные внешние орбитали и стремяться. либо захватить, либо отдать электрон. Молекулы Ог", ОН*, NO*, и СО эффективно взаимодействуют с атомами металлов переменной валентности в составе белков, в том числе и с гемовыми группами. Активация гуанилатциклазы, ингибирование компонентов электронтранспортной цепи митохондрий, нитрозилирование гемоглобина, являются классическими примерами такого взаимодействия [КогЬопеп е1 а1., 2005]

Так, перекись водорода, регулируя метаболизм арахидоновой кислоты, влияет на процессы агрегации тромбоцитов через образование тромбоксанов, стимулирует секрецию окиси азота и простагландинов, расслабляет гладкую мускулатуру, регулирует секрецию гистамина. Известно, что фосфорилирование различных белков (включая ферменты, рецепторы, факторы транскрипции, сократительные белки) может приводить к их активации или ингибированию за счет специфического изменения конформации. Действие СР может быть также направлено на ингибирование протеинфосфатаз или активацию протеинкиназ [Дубинина, 2006]: При этом-СР являются реакционноспособными и, следовательно, токсичными для клетки молекулами. Активные формы кислорода (такие как супероксид анион радикал, гидроксид-радикал, перекись водорода), а также липидные гидроперекиси могут реагировать с различными клеточными компонентами. АФК генерируются в различных биологических системах в ходе нормального метаболизма. Генерация свободных радикалов связана с такими процессами, как аэробное дыхание митохондрий [ВоуепБ, 1977], дыхательный взрыв фагоцитирующих клеток, перекисное окисление липидов, метаболизм арахидоновой кислоты и- многие другие реакции [НаШшеН еЬа!., 1995].

Для предотвращения повреждений под действием длительного воздействия свободных радикалов в организме существует многоступенчатая система антиоксидантной защиты, включающая как специальные ферменты, так и неферментативные антиоксиданты. В нормальных условиях антиоксидантная система способна контролировать уровень СР и предотвращать негативные последствия действия кислородных радикалов.

Однако при избыточном образовании радикалов или нарушении работы, антиоксидантной системы возникает дисбаланс между продукцией и нейтрализацией клеточных оксидантов. Такое состояние дисбаланса в системе генерации и нейтрализации СР, приводящее к усилению деструктивных процессов, называют окислительным стрессом.

В последнее время появляется все больше данных об участии окислительного стресса во'многих процессах, протекающих в организме как в норме, так и при разнообразных патологиях. В частности, указывается на вовлеченность окислительного стресса в процессы адаптации, старения, а также протекание многих заболеваний и таких патологических процессов (более 100), как воспаление, атеросклероз, канцерогенез, ишемическое и реперфузионное повреждение тканей, нейродегенеративные патологии [НаШ\ге11, 1999].

Таким образом складывается новое представление о двойственной роли 1 свободных радикалов" в живых клетках. С одной стороны, свободные' радикалы принимают участие в> метаболизме аэробных организмов^ с другой стороны могут обладать высокой окислительной способностью, вызывать состояние окислительного стресса и< инициировать патологические процессы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Арзуманян, Елена Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

1. Карнозин является эффективным протектором нейронов в условиях окислительного стресса, вызываемого двумя видами индукторов -перекисью водорода и гомоцистеиновой кислотой. В этих условиях карнозин предотвращает активацию процессов, ведущих к смерти клеток по пути как апоптоза, так и некроза. ]\Г-ацетилкарнозин не оказывает защитного эффекта и не снижает уровня свободных радикалов в нейронах.

2. Гомоцистеиновая кислота вызывает увеличение продукции свободных радикалов в эритроцитах, индуцирует спонтанный гемолиз эритроцитов, а также ускоряет осмотический и кислотный гемолиз. Карнозин защищает эритроциты от действия гомоцистеиновой кислоты и повышает устойчивость эритроцитов к гемолитическому воздействию.

3. Карнозин препятствует кислотному и осмотическому гемолизу эритроцитов.

4. Использование карнозина и ]\Г-ацетилкарнозина в кардиоплегическом растворе повышает эффективность восстановления сердечных сокращений после длительной ишемии и улучшает биохимические показатели метаболизма миокарда, что позволяет увеличить длительность кардиоплегии в период операции на открытом сердце.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю искреннюю благодарность моим научным руководителям профессору Александру Александровичу Болдыреву за постоянное чуткое руководство, критические замечания и искреннее дружеское отношение, и Мовсесяну Рубену Рудольфовичу за неоценимую научную помощь, поддержку и теплое отношение.

Работа под руководством A.A. Болдырева и Мовсесяна Рубена Рудольфовича значительно способствовала моему личному и профессиональному развитию, формированию стиля и подхода к работе. Я выражаю искреннюю благодарность всем коллегам, которые помогали мне в работе над кандидатской диссертацией. Я очень признательна сотрудникам кафедры биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и лаборатории нейрохимии НЦН РАМН Степановой Марии Сергеевне, Стволинскому Сергею Львовичу, Федоровой Татьяне Николаевне, Булыгиной Елене Романовне, Тюлиной Ольге Владимировне, Маклецовой Марине Геннадьевне, Владыченской Елизавете Александровне за дружеские советы и помощь в освоении методик.

Благодарю сотрудников НЦССХ имени А.Н. Бакулева, в сотрудничестве с которым была выполнена значительная часть работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе показано; что карнозин и его ацетилированное производное обладают набором различных свойств, которые не ограничиваются только антиоксидантной активностью, но направлены на нормализацию клеточного метаболизма, что увеличивает адаптационные возможности клетки. В наших экспериментах мы показали, что карнозин увеличивает устойчивость клеток при различных видах повреждений. На основании этого мы предположили, что карнозин помимо антиоксидантных свойств обладает свойствами модулятора метаболизма.

В работе продемонстрировано, что окислительный стресс, вызываемый ГЦК или перекисью водорода, индуцирует смерть нейрональной популяции. Интенсивность и длительность воздействия исследуемых индукторов окислительного стресса оказывает влияние на тип гибели клеток. Кратковременная инкубация клеток с ГЦК или перекисью водорода приводит к активации МАР-киназы и гибели клеток по пути апоптоза, в то время как высокие концентрации и/или длительная инкубация с этими веществами приводит к некрозу клеточной популяции.

Карнозин-является эффективным протектором нейронов в условиях окислительного стресса и предотвращает гибель клеток при действии каждого из используемых повреждающих факторов. Аналог карнозина, И-ацетилкарнозин не оказывает влияния на рост свободных радикалов.

В наших опытах мы показали, что карнозин приводит к ограничению клеточной смерти по пути как апоптоза, так и некроза. Возможно, что антиоксидантное действие карнозина является основным в реализации защитных эффектов, однако на данный момент существуют данные о целом ряде особенностей в его действии. Ацетилированный аналог карнозина >1-ацетилкарнозин, не обладает такими свойствами, несмотря на повышенную вероятность проникновения его в клетки. Ранее было показано, что карнозин может образовывать «вторичные» циклические структуры с участием (3-аминогруппы, что может объяснять отличие свойств карнозина от Ы-ацетилкарнозина.

Таким образом, мы обнаружили, что карнозин, в отличие от № ацетилкарнозина является эффективным средством для защиты нейронов в условиях, окислительного стресса. Известный факт периодического повышения содержание в крови карнозина позволяет предполагать возможность проявления защитных свойств* карнозина в условиях целого организма.

Целью нашего исследования было исследовать протекторное действие карнозина на различных типах клеток, поэтому далее мы решили сконцентрировать свое внимание на карнозине в качестве возможного протектора от окислительного стресса эритроцитов, создавая его при введении ГЦК.

Инкубация эритроцитов с ГЦК приводит к ускорению кислотного и осмотического гемолиза путем накопления в них свободных радикалов. Карнозин защищает эритроциты от действия ГЦК, предотвращая накопление в них свободных радикалов, останавливая спонтанный, а также замедляя кислотный и осмотический гемолиз.

Мы проанализировали разные модели окислительного стресса на различных типах клеток и показали, что в случае с нейронами карнозин защищает клетки, предотвращая смертность по пути как некроза, так и апоптоза, а также защищает эритроциты от действия ГЦК. Нами было показано, что при инкубации эритроцитов с ГЦК наблюдается рост свободнорадикальных соединений, предотвращаемый карнозином. В данных условиях эффект карнозина может объясняться его антиоксидантным действием.

Однако в экспериментах с кислотным или спонтанным гемолизом, причиной которого являются дефекты клеточной мембраны, возникающие вследствие механических повреждений эритроцитов, объяснить действие карнозина антиоксидантными свойствами не представляется возможным. Таким образом, мы еще раз подтвердили мембранопротекторные свойства карнозина, не связанные с его антиоксидантной активностью.

То обстоятельство, что карнозин нивелирует повреждающее действие ГЦК и увеличивает стабильность эритроцитов- в условиях кислотного и осмотического гемолиза, является существенным для стабилизации и сохранения» функции эритроцитов в неблагоприятных условиях. Результаты, полученные нами в этих исследованиях, позволяют предположить, что карнозин может эффективно защищать кардиомиоциты в условиях длительной ишемии и может быть использован в качестве компонента для сред, используемых в сердечнососудистой хирургии. Для проверки данного предположения, мы исследовали действие карнозина в условиях длительной ишемии миокарда.

В этих опытах мы продемонстрировали защитное действие карнозина и N-ацетилкарнозина на изолированном сердце в условиях ишемии и реперфузии. Нами была обоснована эффективность использования природных дипептидов в составе кардиоплегического раствора и предложена новая формула кардиоплегического раствора на основе карнозина и N-ацетилкарнозина для использования при операциях на открытом сердце.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Арзуманян, Елена Сергеевна, Москва

1. Алабовский В.В., Болдырев A.A., Винокуров A.A., Галлант С., Чесноков Д.Н. Сравнение защитного действия карнозина и N -ацетилкарнозина в процессе кардиоплегии. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. - 3. - С. 290-294.

2. Алабовский В.В., Болдырев A.A., Винокуров A.A., Шаврацкий В.Х. Действие гистидинсодержащих дипептидов в условиях ишемии и • реперфузии изолированного сердца. //Биохимия. 1997. - 62(1). - С. 91-102.

3. Арзуманян Е. С., Степанова М.С., Механизмы токсического действия гомоцистеиновой кислоты на нейрональные клетки. Нейрохимия. -2010.-27 (З).-С. 251-256.

4. Арзуманян Е.С. Защитное действие карнозина на гемолиз эритроцитов, ускоренный гомоцистеиновой кислотой. // Новые лекарственные препараты. -2007.-9.-С. 12-15.

5. Арзуманян Е.С., Махро A.B., Тюлина О.В., Болдырев A.A. Карнозин защищает эритроциты от окислительного стресса, вызываемого гомоцистеиновой кислотой. Доклады Академии наук. 2008. - 418 (6). - С. 834-836.

6. Баканов А. Ю. Интраоперационная оценка адекватности температурных режимов искуственного кровообращения при операциях на клапанах сердца. // Дисс. Канд. Мед. Наук. М., 2004.

7. Батрукова М.А., Рубцов A.M., Болдырев A.A. Эффект карнозина на Са-каналы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц. // Биохимия -1992.-57.-С. 904-910.

8. Бокерия Л.А., Мовсесян P.P., Мусина P.A. Актуальные вопросы интраоперацонной защиты миокарда (кардиоплегия). // Грудная и серд. -сосуд, хир. 1998. - 5. - С. 63-70.

9. Болдырев A.A. Дискриминация между апопозом и некрозом нейронов под влиянием окислительного стресса. // Биохимия. 2000. — 65. - С. 981-990.

10. Болдырев A.A. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса. -М., "Диалог-МГУ" 1999. - 364 с.

11. Болдырев A.A. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. М. 1998. -320 с.

12. Болдырев A.A. Молекулярные механизмы токсичности гомоцистеина. // Биохимия 2009. - 74. - С. 725- 736.

13. Болдырев A.A. Нейрональные рецепторы в клетках иммунной системы // Природа 2005. - 7. - С. 3-8.

14. Болдырев A.A. Окислительный стресс и мозг. // Соросовский образовательный ж-л. 2001а. - 7(4). - С. 21-28.

15. Болдырев A.A. Парадоксы окислительного метаболизма мозга // Биохимия. 1995. - 60. - С. 1173-1177.

16. Болдырев A.A. Роль активных форм кислорода в жизнедеятельности нейрона.// Усп. физиол. наук. 2003. - 34(3). - С. 21-34.

17. Брагин Е.О., Дергунов А. Д. и др. Роль фосфолипазы А2 в аноксическом повреждении энергозависимых функций митохондрий. // Вопросы медицинской химии. 1977. - 23(5). - С.673-677.

18. Гордеева A.B., Звягильская P.A., Лабас Ю.А. Взаимосвязь между активными формами кислорода и кальцием в живых клетках. // Биохимия -2003.-68 (10).-С. 1318-1322.

19. Дубинина Е. Окислительный стресс в экстремальных условиях и при патологических состояниях. Сб. под ред. А. Петрухиной. Окислительный стресс и антиоксиданты: организм, кожа, косметика. М. - 2006. — 288 с.

20. Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А., Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга. — М: «Знание-М». 2000. -344 с.

21. Керцман В.П. Острая сердечная недостаточность после операции в условиях искусственного кровообращения. // Дисс. Д-ра мед. наук. — М., 1989.

22. Коркина Л., Деева И. Двуликий Янус свободных радикалов. Сб. под ред. А. Петрухиной. Окислительный стресс и антиоксиданты: организм, кожа, косметика. М. - 2006. - 288 с.

23. Лилли Л. Патофизиология заболеваний сердечно-сосудистой системы. // под ред. Д.М. Аронова (пер. с англ.). М. : Бином. — 2007. С. 164-183.

24. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. // Под ред. В.В. Португалова. М.: Мир. 1969. - С. 421-456.

25. Лопина О.Д., Болдырев A.A. Влияние дипептидов карнозина и анзерина на аккумуляцию Са2+ фрагментами саркоплазматического ретикулума. // Доклады АН СССР. 1975. - 220. - С. 1218 - 1221.

26. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы корекции. //Бюлл. эксп. биол. мед. 1997. - 124 (9). - С. 244-253.

27. Мазур Н.А. Патологическая физиология кровообращения. // В кн. • Патологическая физиология. Под ред. А.Д. Адо. М, «Триада - X». - 2000. -С. 398-407.

28. Малашенков А.И. Кардиоплегия (история, теория, разновидности). // В кн. «Лекции по сердечно-сосудистой хирургии». Под ред. Л.А. Бокерия в 2 т. T.l. -М., Издательство НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2001. - С. 185202.

29. Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфанкин В.А.Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М. - "Слово". - 2006. - С. 556.

30. Мовсесян P.P. Защита миокарда при операциях на открытом сердце (кардиоплегия). // В кн. Лекции по сердечно-сосудистой хирургии. Под ред. Л.А. Бокерия. В 2-х т. Т. 1. М., Издательство НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, - 2001. - С. 203 - 17.

31. Прокопьева В.Д. Лаптев Б.И., Афанасьев С.А. Защитное действие карнозина при гипоксии и реоксигенации изолированного сердца крысы. // Биохимия 1992. - 57 (9). - С.1389-1392.

32. Северин С.Е. Открытие карнозина и анзерина. Некоторые их свойства //Биохимия 1992.- 57.-С. 1285-1295.

33. Суслина З.А., Зорилова И.В., Иллариошкин С.Н., Кистенев Б.А. Наследственно обусловленная гипергомоцистеинемия в патогенезе ишемического инсульта у лиц молодого возраста. // Международный неврологический журнал 2006. - 6.

34. Федорова Т.Н., Стволинский С.Л., Доброта Д., Болдырев A.A. Терапевтическое действие карнозина при экспериментальной ишемии мозга. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 2002. -1. - С. 41-44.

35. Abe Н. Role of histidine-related compounds as intracellular proton buffering constituents in vertebrate muscle. // Biochemistry (Mose). 2000. - 65. - P. 75765.

36. Acker Т., Acker H. Cellular oxygen sensing need in CNS function: physiological and pathological implications. // J. Exp. Biol. 2004. - 207. - P. 3171-3188.

37. Anwyl R., The effect of foreign cations, pH and pharmacological agents on the ionic permeability of an excitatory glutamate synapse // J. Physiol. 1977. -273.-P. 389-404.

38. Aruoma O.I., Laughton M.J., Halliwell B. Carnosine, homocarnosine and> anserine: could they act as antioxidants in vivo? // Biochem. J. 1989. - 264. - P. 863-9.

39. Aruoma, O., and Haliwell B. (Eds.) Molecular Biology of Free Radicals in Human Diseases. OICA Int., St. Lucia-London. - 1999.

40. Bleich S., Degner D., Sperling W., Bönsch D., Thürauf N., Kornhuber J. Homocysteine as a neurotoxin in chronic alcoholism. // Prog. Neuropsychopharmacol Biol. Psychiatry. 2004. 3. - 453-64.

41. Boldyrev A., Abe H., Stvolinsky S., Tyulina O. Effects of carnosine and related compounds on generation of free oxygen species: a comparative study. // Comp. Biochem. Physiol. В Biochem. Mol. Biol. 1995. - 112. - P. 481-485.

42. Boldyrev A.A. Retrospectives and perspectives on the biological activity of histidine containing dipeptides // Int. J. Biochem. 1990. - 22. - P. 129 - 132

43. Boldyrev A.A., Carpenter D.O, Johnson P. Emerging evidence for a similar role of glutamate receptors in the nervous and immune systems. // J. Neurochem. — 2005.-4.-P. 913-918.

44. Boldyrev A., Koldobsky A., Kurella E., Maltseva V., Stvolinsky S. Natural histidine-containing dipeptide carnosine as a potent hydrophilic antioxidant with membrane stabilizing function. // Molec. Chem. Neuropathol. 1993, 19, 185-192.

45. Boldyrev A.A., Johnson P. Homocysteine and its derivatives as possible* modulators of neuronal'and non-neuronal cell glutamate receptors in Alzheimer's disease. // J. Alzheimer's Dis. 2007. - 11(2). - P. 219-228.

46. Boldyrev A.A., Petukhov V.B. Localization of camosine effect on the fatigued muscle preparation. // Gen. Pharmacol. 1978. - 9. - P. 17r20.

47. Boveris A., Oshino N., Chance B., The cellular production of hydrogen peroxide//Biochem. J. 1972. - 128. - P. 617-30.

48. Boveris A., Mitochondrial production of superoxide radical and hydrogen peroxide. // Adv. Exp. Med. Biol. 1977. - 78. - P. 67-82.

49. Bretschneider H. J: Myocardial protection. // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. -1980.-28.-P. 295-302.

50. Briehl M.M., Cotgreave I.A., Powis G. Downregulation of the antioxidant defence during glucocorticoid-mediated apoptosis. // Cell Death Differ. 1995. -2.-41-6.

51. Bruce-Keller A.J., Umberger G., McFall R., Mattson M.P. Food restriction reduces brain damage and improves behavioral outcome following exitotoxic and metabolic insults. // Ann. Neurol. 1999. - 45(1). - P. 8-15.

52. Careaga G., Salsazar D., Tellez S. et al. Clinical impact of histidine -ketoglutarat tryptophan (HTK) cardioplegic solution on the perioperative period in open heart surgery patients. // Arch. Med. Res. - 2001. - 32. - P. 296-299.

53. ChanP.H., ChuL., Chen S.F., CarlsonE.J., and EpsteinG.J.,Reduced: neurotoxicity intransgenic mice overexpressing human copper-zinc-superoxide dismutase. // Stroke. 1990: - 21(11). - P: 80-82.

54. Chance B., Sies H., Boveris A., Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. // Physiol. Rev. 1979. - 59. - P. 527-605.

55. Coyle J:T., Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate, andv neurodegenerative disorders. // Science. 1993. 262. - P; 689-95.

56. Cussocrea S., Riley D. P:, Caputy A. P., Salvemini D. Antioxidant Therapy: A new pharmacological approach in shock, inflammation, and . ischemia/reperfusion injury. // Pharmacol; Rev. 2001. - 53. - P: 135-159.

57. CzapskiG. Reaction of OH; // Methods Enzymol. 1984. - 105.-P. 20915. "•' ' • •• ^

58. Darley-UsmarV., Wiseman H., Halliwell B. Nitric oxide and oxygen radicals: a question of balance. // FEBS Lett. ™ 1995; 369. - P.131-5.

59. Debono M., Turner W.W., LaGrandeur L., Burkhardt F.J., Nissen J.S.,

60. Do K.Q., Benz B, Binns K.E., Eaton S.A., Salt T.E. Release of homocysteic acid-from rat thalamus following stimulation of somatosensory afferents in vivo: feasibility of glial participation in synaptic transmission. // Neuroscience. 2004. -124.-387-93.

61. Dobrota D., Fedorova T., Stvolinsky S., Babusikova E., Likavcanova K., Drgova A., Strapkova A., Boldyrev A. Carnosine protects the brain of rats and Mongolian gerbils against ischemic injury: after-stroke-effect. // Neurochem Res. -2005. 10. —P.1283-8.

62. Dumaswala U.J., Zhuo L., Jacobsen D.W., Jain S.K., Sukalski K.A. Protein and lipid oxidation of banked human erythrocytes: role of glutathione. // Free Radic Biol. Med. 1999. - P. 1041-1049.

63. Dyavanapalli J., Rimmer K., Harper A.A. Reactive Oxygen Species alters the electrophysiological properties and raises Ca2+. in intracardiac ganglion neurons. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2010. - [Epub ahead of print]

64. Esterbauer H., Cytotoxicity and genotoxicity of lipid oxidation products. // Am. J. Clin. Nutr. - 1993. - 57. - P. 779-786.

65. Femandes L., Rodrigues-Pousada C., Struhl K., Yap, a novel family of eight bZIP proteins in Saccharomyces cerevisiae with distinct biological functions. // Mol. Cell Biol. 1997. - 17. -P. 6982-93.

66. Fleury C., Mignotte B., Vayssiere J.L. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling. // Biochimie. 2002. - 84. - P. 131-41.

67. Forman H.J., Fukuto J.M., Miller T., Zhang H., Rinna A., Levy S., The chemistry of cell signaling by reactive oxygen and nitrogen species and 4-hydroxynonenal // Arch. Biochem. Biophys. 2008. - 477(2). - P. 183-95.

68. Fridovich, I. Fundamental aspects of reactive oxygen species, or what's the matter with oxygen? // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1999. - 893. - P. 13-18.

69. Fryer M.J, Oxborough K., Martin B., Ort D.R, Baker N.R., Factors Associated with depression of Photosynthetic Quantum Efficiency in Maize at Low Growth Temperature. // Plant Physiol. 1995. - 108. - P. 761-767.

70. Gallant S., Kukley M., Stvolinsky S.L. Bulygina E. R., Boldyrev A. A. Effect of carnosine on rats under experimental brain ischemia. // Tohoku J. Exp. Med.-2000.-191.-P. 85-99.

71. Gharib A., Chabannes B., Sarda N., Pacheco H. In vivo elevation of mouse brain S-adenosyl-L-homocysteine after treatment with L-homocysteine. // J. Neurochem. 1983. -40.-P.l 110-2.

72. Gorman A., McGowan A., Cotter T.G. Role of peroxide and superoxide anion during tumour cell apoptosis. // FEBS Lett. 1997. - 404. - P. 27-33.

73. Gortz P., Hoinkes A., Fleischer W., Otto F„ Schwahn B., Wendel U., ' Siebler M. Implications for hyperhomocysteinemia: not homocysteine but its oxidized forms strongly inhibit neuronal network activity. // J. Neurol. Sci. 2004. -218. - P.109-14.

74. Grewal S.S., York R.D., Stork P.J. Extracellular-signal-regulated kinase signalling in neurons. // Curr. Opin. Neurobiol. 1999. - 5. - P. 544-53.

75. Halliwell B. Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the end (of the beginning). // Free Radic. Res. 1999. - 31. - P.261-72,

76. Halliwell B., Oxidation of low-density lipoproteins: questions of initiation, propagation, and the effect of antioxidants. // Am. J. Clin. Nutr. 1995. - 61. - P. 670-677.

77. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C. Free radicals in biology and medicine. // 3rd ed., UK: Oxford University Press 1999. -10.-1306-1314.

78. Harreveld A., Compounds in brain extracts causing spreading depression of cerebral cortical activity and contraction of crustacean muscle. // J. Neurochem. -1959.-3.-300-15.

79. Ho P.I., Collins S.C., Dhitavat S., Ortiz D., Ashline D, Rogers E., Shea T.B. Homocysteine potentiates beta-amyloid neurotoxicity: role of oxidative stress. // J. Neurochem. 2001. - 78. - P. 249-53.

80. Ikeda M., Ikeda-Sagara M., Okada T., Clement P., Urade Y., Nagai T., Sugiyama T., Yoshioka T., Honda K., Inoue S., Brain oxidation is an initialprocess in sleep induction, Neuroscience // 2005. 130. - P. 1029 - 1040.

81. Ikner A, Shiozaki K.,Yeast signaling pathways in the oxidative stress response. //Mutat. Res. -2005. 6(569). - P.13-27.

82. Ivanov I.T. Low pH-induced hemolysis of erythrocytes is related to the entry of the acid into cytosole and oxidative stress on cellular membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - 2. - P. 349-360.

83. Jynge P., Hearse D.J., Feuvray D., Mahalu W., Cankovic-Darracott S., O'Brien K, Braimbridge M.V. The St. Thomas' hospital cardioplegic solution: a characterization in two-species. // Scand. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. Suppl. -1981.-30.-P.1-28.

84. Jynge P, Hearse D.J., Feuvray D, Mahalu W, Cankovic-Darracott S, O'Brien K, Braimbridge M.V. Scand. J. Thorac. The St. Thomas' hospital cardioplegic solution: a characterization in two species. // Cardiovasc. Surg. Suppl. — 1981. — 30.-P. 1-28.

85. Kim W.K., Pae Y.S. Involvement of N-methyl-d-aspartate receptor and free radical in homocysteine-mediated toxicity on rat cerebellar granule cells in culture. //Neurosci. Lett. 1996.-216. - PI 17-20.

86. Kohen R, Yamamoto Y, Cundy K.C., Ames B.N. Antioxidant activity of carnosine, homocarnosine, and anserine present in muscle and brain. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1988. - 85. - P. 3175-9.

87. Korhonen R, Lahti A, Kankaanranta H, Moilanen E. Nitric oxide production and signaling in inflammation. // Curr. Drug. Targets Inflamm. Allergy. 2005. -4.-P. 471-9.

88. Kruman I.I., Culmsee C., Chan S.L., Kruman Y., Guo Z., Penix L., Mattson M.P. Homocysteine elicits a DNA damage response in neurons that promotes apoptosis and hypersensitivity to excitotoxicity. // J. Neurosci. 2000. - 20. - P. 6920-6926.

89. Kruman II, Mattson MP. Pivotal role of mitochondrial calcium uptake in neural cell apoptosis and necrosis. // J. Neurochem. 1999 — 72. - P. 529-540.

90. Kulikov A.V., Boldyrev A.A. Glutamate receptors regulate the level of reactive oxygen species in neurons of senescence accelerated mice (SAM) strain. // Dokl. Biochem. Biophys. 2006. - 407. - P. 106-108.

91. Langendorff O. Geschichtliche Betrachtungen zur Methode des überlebenden Warmblüterherzens. // Münchener medizinische Wochenschrif., -1903. 50.-P. 508-509.

92. Maas K, Chan S, Parker J, Slater A, Moore J; Olsen N, Aune T.M. Cutting edge: molecular portrait of human autoimmune disease. // J Immunol. 2002. -169.-P. 5-9.

93. Michaelis E.'K., Molecular biology of glutamate receptors in the central nervous system and their role in excitotoxicity, oxidative stress and aging. // Progr. Neurobiol. 1998. - 54. - 369-415. '

94. Morris L.G., Veeriah S, Chan T.A. Genetic determinants at the interface of cancer and neurodegenerative disease. // Oncogene. 2010 - Apr 26. Epub ahead of print.

95. Nohl H, Jordan W. The mitochondrial site of superoxide formation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. - 138. - P. 533-9.

96. Obeid R., Herrmann W., Mechanisms of homocysteine neurotoxicity in neurodegenerative diseases with special reference to dementia. // FEBS Lett. -2006.-580.-P. 2994-3005.

97. O'Dowd A., O'Dowd J.J., Miller D.J.The dipeptide carnosine constricts rabbit saphenous vein as a zinc complex apparently via a serotonergic receptor. // J. Physiol. 1996. - 495. - P. 535-43.

98. Olanow C.W. A radical hypothesis of neurodegeneration. // Trends Neurosci. 1993. - 16. - P. 439-444.

99. Overbeeke R, Steffens-Nakken H, Vermes I, Reutelingsperger C, Haanen C.Early features of apoptosis detected by four different flow cytometry assays. // Apoptosis. 1998.-2.- 115-21.

100. Oyama Y., Carpenter D.O., Chikahisa L., Okazaki E. Flow-cytometric estimation on glutamate- and kainate-induced increases in intracellular Ca2+ of brain neurons: a technical aspect.//Brain Res. 1996. - l.-P. 121-124.

101. Paget M.S., Buttner M.J. Thiol-based regulatory switches. // Annu. Rev. Genet.-2003. -37. P. 91-121.

102. Papas A.M., Determinants of antioxidant status in humans. // Lipids. 1996. -31.-P. 77-82.

103. Pavlov A.R., Revina A.A., Dupin A.M., et al. The mechanism of interaction of carnosine with superoxide radicals in water solutions // Biochem. Biophys. Acta. 1993.- 1157.-P. 304-312.

104. Pryor W.A. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes, and reactions. // Annu. Rev. Physiol. 1986. - 48. - P. 657-667.

105. Reis E.A., Zugno A.I., Franzon R, Tagliari B, Matte C, Lammers M.L., Netto C.A., Wyse A.T. Pretreatment with vitamins E and C prevent the impairment of memory caused by homocysteine administration in rats. // Metab. Brain Dis. -2002.-172.-P. 11-17.

106. Renner C, Zemitzsch N, Fuchs B, Geiger K.D, Hermes M, Hengstler J, Gebhardt R, Meixensberger J, Gaunitz F. Carnosine retards tumor growth in vivo in an NIH3T3-HER2/neu mouse model. // Mol. Cancer. 2010. - 6. - P. 9-12.

107. Ruigrok T. J., D de Moes, Borst C. Bretschneider's histidine-buffered cardioplegic solution and the calcium paradox. // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. -1983.- 86.-P. 412-417.

108. Ryan T.J., Ernes R.D., Grant S.G., Komiyama N.H., Evolution of NMD A receptor cytoplasmic interaction domains: implications for organisation of synaptic signalling complexes // BMC Neurosci. 2008. - 9; 6.

109. Sandstrom P.A., Pardi D, Tebbey P.W., Dudek R.W., Terrian D.M., Folks T.M., Buttke T.M. Lipid hydroperoxide-induced apoptosis: lack of inhibition by Bcl-2 over-expression // FEBS Lett. 1995. - 365. - P. 66-70.

110. Shea T.B., Rogers E., Folate quenches oxidative damage in brains of apolipoprotein E-deficient mice: augmentation by vitamin E. // Brain Res Mol Brain Res.-2002.-108. P. 1 -6.

111. Stefanelli C, Stanic I, Bonavita F, Muscari C, Pignatti C, Rossoni C, Caldarera CM. Oxygen tension influences DNA fragmentation and cell death in glucocorticoid-treated thymocytes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. -212.-P. 300- 6.

112. Sureda F.X., Viu E., Zapata A., Capdevila J.L., Camins A., Escubedo E., Camarasa J., Trullas R. Modulation of NMDA-induced cytosolic calcium levels by ACPC in cultured cerebellar granule cells. // Neuroreport 1996. - 7. - P. 1824 - 8.

113. Tan S, Sagara Y, Liu Y, Maher P, Schubert D. The regulation of reactive oxygen species production during programmed cell death. // J. Cell Biol. 1998. -141. -P. 1423-32.

114. Toone W.M., Morgan B.A., Jones N. Redox control of AP-l-like factors in yeast and beyond. // Oncogene. 2001. - 20. - P.* 2336-46.

115. Tsai A.G, Lieber M.R., Mechanisms of chromosomal rearrangement in the human genome. //BMC Genomics. -2010. Feb 10 - 11 Suppl 1:S1.

116. Vitvitsky V, Dayal S, Stabler S, Zhou Y, Wang H, Lentz SR, Banerjee R. Perturbations in homocysteine-linked redox homeostasis in a murine model for hyperhomocysteinemia. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2004. -287.-P. 39-46.

117. Vladimirov Y.A. Studies of antioxidant acivity by measureing chemiluminescence kinetcs, In Natural Antioxidants: Molecular Mechanisms and Health Effects (L.Packer, M.G. Traber and W. Xin, Eds.) // AOSC Press, Champaign, II. 1996. - P. 124-144.

118. Wee K.S., Zhang Y., Khanna S., Low C.M., Immunolocalization of NMD A receptor subunit NR3B in selected structures in the rat forebrain, cerebellum, and lumbar spinal cord//J. Comp. Neurol. -2008. 509. - P. 118-135.

119. Wei X, Guo W, Wu S, Wang L, Huang P, Liu J, Fang B. Oxidative stress in NSC-741909-induced apoptosis of cancer cells. // J. Transl. Med. 2010. - 16. - P. 37-45

120. Whyte K.A., Hogg R.C., Dyavanapalli J, Harper A.A., Adams D.J. Reactive oxygen species modulate neuronal excitability in rat intrinsic cardiac ganglia. // Auton. Neurosci. 2009. - 150. - P 45-52.

121. Zaloga G., Roberts P., Black K. et al. Carnosine is novel peptide modulator of intracellular calcium and contractility in cardiac cells. // Am. J. Physiol. 1997. -272.-P. 462-468.

122. Zou C.G., Banerjee R. Homocysteine and redox signaling. // Antioxid. Redox Signal. 2005. - 7. - P. 547-59