Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Карнозин как фактор эндоэкологической защиты организма от повреждений, вызванных окислительным стрессом

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Карнозин как фактор эндоэкологической защиты организма от повреждений, вызванных окислительным стрессом"

На правах рукописи

^М0

Беляев Михаил Сергеевич

КАРНОЗИН КАК ФАКТОР ЭНДОЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА ОТ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ СТРЕССОМ

Специальности 03 00 16-экология 03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00344GG4G

Москва - 2008

003446846

Работа выполнена в Государственном учреждении «Научный Центр неврологии» Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель-

Доктор биологических наук Федорова Татьяна Николаевна

Научный консультант-

Доктор биологических наук, профессор Орлова Валентина Сергеевна

Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор

Муронец Владимир Израилевич

Доктор биологических наук, профессор Коденцова Вера Мптрофановна

Ведущая организация Научно-исследовательский институт

акушерства и гинекологии им Д О Отто

Защита диссертации состоится «25» сентября 200В г в 16 00 часов на заседании диссертационного совета Д 213 203 17 при Российском университете дружбы народов по адресу 113093, г Москва, Подольское шоссе, д 8/5, Экологический факультет РУДН, ауд 302

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117 ] 98, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6 Автореферат диссертации разослан «22» августа 2008 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета № Д 212 203 17 Доктор биологических наук, профессор

Чернышев В И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эндоэкология является одним из важных разделов современной системной экологии, исследующей взаимоотношения биологических структур, как между собой, так и с окружающей средой В свете научных интересов молекулярной и физиологической эндоэкологии изучение механизмов регуляции гомеостаза как многоклеточного организма в целом, так и клеток, входящих в его состав, является одной из важнейших задач этой науки (Реймерс, 1994)

Повреждающие факторы, как правило, являются индукторами окислительного стресса (ОС), который характеризуется повышением уровня высокотоксичных свободнорадикальных соединений и истощением эндогенной антиоксидантной системы организма ОС может быть вызван как эндогенными, так и экзогенными неблагоприятными факторами -загрязняющими веществами окружающей среды, ионизирующим излучением, действием чужеродных организмов, влиянием экстремальных температур, недостатком кислорода В соответствии с вышеизложенным, ОС можно рассматривать как неблагоприятный экологический фактор внутренней среды организма, называемый нами эндоэкологическим стрессом

Головной мозг отличается особой чувствительностью к ОС, что обусловлено максимально активным потреблением кислорода этой тканью, высокой окисляемостью мембранных липидов и относительно низкой активностью эндогенной антиоксидантной системы Поэтому многие заболевания ЦНС (сосудистые, нейродегенеративные и другие) протекают на фоне длительно существующего ОС, который в настоящее время рассматривается как одна из основных причин необратимой гибели мозга

К числу химических факторов, способствующих развитию системного окислительного стресса в тканях, относятся гомоцистеин и продукты его спонтанного окисления (главным образом, гомоцистеиновая кислота), уровень которых в кровяном русле резко возрастает при нарушениях мозгового кровообращения (Yap, 2003, Зори лова, 2006) Как правило, при хронических сосудистых заболеваниях головного мозга наблюдается гипергомоцистеинемия различной степени выраженности, вызванная нарушениями метаболизма, происходящими под влиянием разнообразных экзо- и эндогенных факторов Другой химический агент, 3-нитропропионовая кислота (3-НПК) является токсином, в мозге он необратимо ингибирует митохондриальную сукцинатдегидрогеназу и тем самым усугубляет функционально-метаболические нарушения мозга. В настоящее время действие этих соединений в условиях гилоксического и ишемического повреждения мозга и организма в целом исследовано недостаточно Актуальным вопросом является и f

природных нейропротекторов в условиях гипоксии/ишемии, отягощенной токсическим действием эндогенных и экзогенных химических агентов

Целесообразным подходом к регуляции окислительного стресса в условиях поврежденного организма является применение антиоксидантов природного происхождения (Федорова и соавт, 1999, Boldyrev, 2006) С этой точки зрения перспективным соединением может быть природный нейропептид карнозин ((З-аланил-Ь-гистидин) Являясь специфическим компонентом возбудимых тканей позвоночных животных, карнозин обнаруживает способность защищать мозг от окислительного стресса и его последствий в различных экспериментальных моделях (Boldyrev, Sevenn, 1990, Болдырев, 1992, Boldyrev, 2002) Он уменьшает эхзайтотоксичность NMDA-рецепторов, предотвращает индукцию нейрональной смерти при действии неблагоприятных факторов, смягчает неврологическую симптоматику и уменьшает смертность животных после экспериментальной ишемии головного мозга (Федорова и соавт, 2002)

В клинико-биохимических исследованиях показано участие окислительного стресса в патогенезе гипоксических и ишемических поражений головного мозга (Суслина, 2000). Оценка возможности применения карнозина в качестве дополнительного лечения больных с хронической дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ) является актуальной задачей

Целью настоящего исследования явилась характеристика окислительных повреяедений тканей в условиях эндоэкологического стресса и разработка подходов к нормализации метаболизма с помощью природного нейропептида карнозина. Задачи исследования включали:

1 характеристику защитного эффекта карнозина на структурные элементы крови человека на фоне действия гомоцистенновой кислоты (ГЦК) в опытах in vitro,

2 исследование терапевтического влияния карнозина на биохимические и физиологические проявления острой гипобарической гипоксии, отягощенной действием 3-НПК у крыс линии Вистар,

3 оценку протекторного эффекта карнозина на модели 3-сосудистой ишемии головного мозга на фоне введения ГЦК,

4 оценку терапевтического действия карнозина в комплексном лечении пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ)

Научная новизна. В работе описаны модели сочетанного действия различных эндоэкологических факторов, включающих гипоксию/ишемию, отягощенную воздействием 3-НПК или гомоцистенновой кислоты

Нейропептид природного происхождения карнозин был впервые применен нами в качестве дополнительного фактора лечения пациентов, страдающих ДЭ

В работе показано, что защитные эффекты карнозина как на структурные элементы крови, так и на организм в целом, не ограничиваются его антиоксидантными свойствами, а включают мембраностабилизирующее и иммуномодулирующее действие Выявлена способность карнозина улучшать когнитивные функции мозга у пациентов с ДЭ

Проведенное исследование выявило многофункциональность карнозина как модулятора биологических структур

Научно-практическая значимость. Обнаруженное нами положительное влияние карнозина при его введении животным в постгипоксический/постишемический период позволяют рекомендовать его для лечения больных с различными гипоксическими состояниями, а также для реабилитации лиц, подвергшихся воздействию гипоксии, и спортсменов в периоды интенсивных нагрузок

Результаты проведенного клинико-биохимического исследования позволяют считать целесообразным введение карнозина в схему лечения пациентов, страдающих ДЭ

Основные положения, выносимые на защиту Эффекты карнозина в условиях эндоэкологического повреждения не ограничивается его антиоксидантными свойствами, на моделях in vitro карнозин проявляет мембраностабилизирующее действие на структурные элементы крови человека

Карнозин оказывает защитное и регуляторное действие на биохимические и физиологические параметры, изменяющиеся в результате сочетанного действия эндоэкологических факторов - острой гипобарической гипоксии и 3-НПК - у крыс линии Вистар

3-НПК и ГЦК являются важными факторами, усугубляющими развитие ОС в условиях гипоксии/ишемии головного мозга крыс Вистар Карнозин проявляет свойства нейропротектора, предотвращая развитие неврологических и двигательных нарушений у животных, что коррелирует с нормализацией биохимических показателей

Введение карнозина в схему лечения пациентов с ДЭ дополнительно к базовой терапии повышает уровень эндогенной антиоксидантной защиты, эффективность иммунокомпетентной системы, а также проявляет мембранопротекторное действие Эти эффекты сопровождаются положительным действием карнозина на когнитивные функции мозга

Апробация работы Работа апробирована и рекомендована к защите 25 сентября 2008 г на заседании кафедры системной экологии экологического факультета РУДН Материалы диссертации были представлены на конференциях «Актуальные проблемы экологии и природопользования» (экологический факультет РУДН) в 2003 и 2005 гг, на XI Международном симпозиуме «New frontiers of neurochemistry and neurophysics on diagnosis

and treatment of neurological diseases» в 2003 г в г Мартине (Словакия), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (МГУ им MB Ломоносова, биологический факультет) в 2008 г , на I Национальном Конгрессе по болезни Паркинсона и расстройствам движений, 2008 г (Москва)

Публикации, по теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в список ВАК РФ

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и иллюстрирована 15 рисунками Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, раздела, отражающего результаты собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, состоящего из 104 отечественных и 78 зарубежных источников

Материалы и методы экспериментальных и клшшко-биохимических исследований Лабораторные животные Экспериментальные исследования были проведены на 160 крысах-самцах линии Вистар, содержавшихся в стандартных условиях вивария В работе были использованы две модели, сопровождающиеся развитием окислительного стресса

Острая гипобарическая гипоксия, отягощенная введением 3-НПК (Стволинский, Федорова, 2002), создавалась в барокамере при снижении давления до величины 140 мм рт ст Для дальнейших экспериментов отбирали животных, сохранявших дыхательную активность в условиях гипоксии Сразу после гипоксического эпизода крыс разделяли на 5 групп по 12 особей в каждой Животным первой группы вводили 3-НПК (30 мг/кг массы тела), второй - карнозин (100 мг/кг массы тела), третьей - 3-НПК в сочетании с карнозином, четвертой - физиологический раствор, контрольную группу составили интактные животные Все препараты вводили ежедневно в течение 6 дней Развитие неврологических нарушений оценивали с помощью специально разработанной шкалы (Федорова и соавт, 2002) Для оценки двигательной и мышечной активности животных (перед началом и в конце эксперимента) тестировали в тесте «открытое поле» В конце эксперимента регистрировали смертность, неврологическую симптоматику, двигательную активность, активность сукцинатдегидрогеназы (СОД), моноаминокисдазы типа В (МАО-В), Мп-супероксиддисмутазы (СОД)

Двухэтапную окклюзию 3 магистральных сосудов головы (пережатие средней мозговой артерии и билатеральной сонной артерии) крыс линии Вистар с последующей 5-суточной рециркуляцией (Pulsmelli, Brierly, 1994) осуществляли на фоне введения ГЦК Все вещества животным вводили интраперитонеально ГЦК в первый день операции и последующие 4 дня (180 мг/кг), карнозин за 1 час до ишемии (200 мг/кг) и в последующие 4

дня (100 мг/кг ежедневно) Животные контрольной группы получали физиологический раствор

Для оценки памяти и способности к обучению животных тестировали в водном лабиринте Морриса за 1 сутки до ишемии и на 3 сутки после ишемии, регистрируя поведение животных в бассейне с помощью специально разработанной программы (Махро и соавт 2008)

Применение карнозина в лечении больных с хронической дисииркуляторной энцефалопатией. В работе представлены биохимические результаты комплексного клинико-биохимического обследования пациентов с хронической ДЭ Диагностику и лечение осуществляли в отделении острых нарушений мозгового кровообращения Научного центра неврологии РАМН (НЦН РАМН) (Заведующий в н с,кмн, БА Кистенев) Исследование было выполнено двойным слепым плацебо контролируемым способом Под наблюдением находилось 42 пациента (мужчины и женщины) с хронической ДЭ в возрасте от 32 до 79 лет В группу, получавшую базовую терапию, вошло 20 пациентов, в группы, получавших дополнительно карнозин (в суточной дозе 0,75 г или 2,0 г), входило по 11 пациентов Длительность исследования составила 21 день Результаты были сопоставлены с данными, полученными при аналогичном исследовании крови здоровых доноров,

В качестве источника карнозина использовали биоактивную добавку «Севитин» (ОАО «Медтехника», Россия) - таблетки, покрытые кислотоустойчивой оболочкой, содержащие 0,25 г карнозина

Для оценки когнитивных функций головного мозга регистрировали вызванные потенциалы (ВП) Р300 на приборе «нейроМВП 4» («Нейрософт», Россия), анализируя параметры, используемые для оценки когнитивного ответа (Гнездицкий, 1997) сенсорный компонент и его амплитуду, а также латентность и амплитуду когнитивной составляющей пика РЗ Оценку когнитивных функций головного мозга пациентов поводили совместно с сотрудниками лаборатории нейрофизиологии НЦН РАМН Оценка когнитивных функций мозга была проведена сотрудниками лаборатории клинической нейрофизиологии, заведующий лабораторией - д б и, проф Гнездицкий В В

Биохимические методы.

Активность супероксиддисмутазы в митохондриальной фракции мозга крыс (Мп-СОД) и в эритроцитах человека (Cu/Zn-СОД) определяли по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия при генерации супероксидного анион-радикала в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой при 560 нм (Mishra and Fridovich, 1972)

Активность моноаминоксидазы В (МАО В) в митохондриальной фракции мозга крыс определяли, используя в качестве субстрата бензиламин (Степанова и соавт, 2005)

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в митохондриальной фракции мозга крыс определяли спектрофотометрически при длине волны 600 нм, измеряя кинетику восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола в присутствии феназинметасульфата при ферментативном окислении сукцината натрия (Кривченкова, 1977)

Хемилюминесценцию (XJI) липопротеинов сыворотки крови человека или гомогената мозга животных, индуцированную ионами двухвалентного железа (Vladimirov, 1996, Федорова и соавт, 1999) измеряли с помощью хемилюминометра 1251, LKB (Швеция) В работе анализировали быструю вспышку ХЛ (h, mV), интенсивность которой характеризует уровень липидных гидроперекисей, лаг-период возгорания XJI (т, с), длительность которого определяет соотношение про- и антиоксидантов в изучаемой пробе, максимальную величину XJI (Н, mV), характеризующую окисляемость образцов, скорость окисления (тангенс угла наклона кривой, V, отн ед )

Дыхательный взрыв лейкоцитов крови человека, выделенных по стандартному протоколу, характеризовали хемилюминесцентным методом (хемилюминометр 1251, LKB, Швеция) После добавления в пробу люминола и опсонизированного зимозана измеряли скорость нарастания ХЛ, время достижения максимума XJ1 и его величину, а также светосумму ХЛ за 10 мин период)

Кислотный гемолиз эритроцитов крови человека вызывали внесением в среду, содержащую цельную кровь, 0,1N соляной кислоты и регистрировали изменения оптической плотности на спектрофотометре Ultraspec 3300 фирмы «Amersham» (США) при 660 нм, рассчитывая латентный период и скорость гемолиза (Бохан, Прокопьева, 2004)

Исследование физико-химических характеристик мембран лейкоцитов человека с помощью флуоресцентного зонда пирепа. Для измерения флуоресценции суспензию лейкоцитов титровали спиртовым раствором пирена, используя для возбуждения свет с длиной волны 335 нм и регистрируя спектр флуоресценции в области от 360 до 500 нм Измерения проводили на термостатированном регистрирующем спектрофлуориметре «ФЛЮОРАТ-02-ПАНОРАМА», производства фирмы «Люмекс», Россия

Определение гомоцистеина в плазме крови крыс и человека проводили с применением иммунофлуоресцентного метода с помощью набора реактивов фирмы Axis™ (Axis-Shield, Великобритания) Принцип метода заключается в восстановлении всех форм ГЦ, содержащихся в плазме крови, до свободного ГЦ и затем в ферментативном переводе его в 8-аденозил-Ь-гомоциетеин (SAH) Твердофазная иммунологическая стадия реакции основана на конкуренции SAH из образца и неподвижного SAH на стенках плашки за места

связывания на моноклоналыюм анти-SAH антителе После удаления несвязанных анти-SAH антител добавляются вторичные кроличьи анти-мышиные антитела, помеченные перокисдазой хрена Пероксидазная активность измеряется спектрофотометрически после добавления субстрата, и поглощение имеет обратную зависимость от концентрации гомоцистеина в образце

Содержание белка определяли в пробах по методу Лоури (Lowry et al, 1951) Определение концентрации гемоглобина в крови человека проводили гемоглобин-цианидным методом

Математическая обработка данных проводилась с использованием программы «Statistica 6 0» Все данные представлены в виде M±SEM Для оценки достоверности обнаруженных изменений применяли тест Стьюдента (при соблюдении условий равенства дисперсий для сравнения средних значений непрерывных признаков в группах), критерий Манна-Уитни (сопоставление двух независимых групп данных по количественным признакам в случае распределений, отличных от нормальных), метод Уилкоксона (сравнение параметров, измеренных до и после лечения) Достоверным считалось такое различие средних показателей, при котором уровень значимости р удовлетворял условию p<O.OS

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. Влияние карнозина на устойчивость клеточных структур крови человека в

опытах in vitro

Способность карнозина стабилизировать структурные элементы крови (липопротеины, эритроциты и лимфоциты), подвергнутые воздействию различных химических агентов, мы оценили в опытах т vitro

11 Оценка действия карнозина в условиях Fe2* -индуцированной хемилюминесценции липопротеинов сыворотки крови человека Для оценки антиоксидантного действия карнозина измеряли устойчивость липопротеинов, выделенных из крови здоровых доноров, к Рег+-индуцированному окислению.

Таблица I Влияние карнозина на параметры Ре2*-инду дарованной хемилюминесценции липопротеинов, выделенных из крови здоровых доноров (результаты представлены в процентах по отношению к контролю)

Концентрация карнозина (мМ) Параметры Ре^-индуцированной хемилюминесценции (XJI)

h, % т,% Н,% Скорость окисления, %

0,1 84±4 116±5 99±2 97±2

0,5 53±6 133±8 94±7 81±2

1,0 40±5 189±9 88±8 58±1

2,5 32±3 202±12 85±6 43±1

5,0 25±6 320±10 72±2 38±2

Полученные результаты представлены в Таблице 1, из которой видно, что в присутствии карнозина наблюдается уменьшение уровня предобразованных гидроперекисей (Ь), удлинняется лаг-фаза индукции окисления (т) и снижается скорость окисления, причем эти эффекты имеют дозо-зависимый характер Таким образом, карнозин способен защищать липопротеины крови от окисления, что может явиться отражением его антиоксидантной активности

1 2 Влияние карнозина и гомоцистеина на «дыхательный взрыв» лейкоцитов человека, индуцированный опсонизированным зимозаном in vitro На рис 1 представлено развитие «дыхательного взрыва», индуцированного опсонизированным зимозаном в лейкоцитах, выделенных из крови здорового донора Видно, что спустя 30-60 с после начала реакции XJI сигнал начинает расти, что свидетельствует об образовании активных форм кислорода. Это является следсьтвием известного эффекта зимозана, направленного на активацию НАДФН-оксидазного комплекса, что ведет к образованию супероксид-аниона

S О 4.5 4.0 3 5 3.0 2.5 2.0 1 5 1.0 0.5 0.0

Рис 1 Развитие «дыхательного взрыва» в суспензии лейкоцитов здорового донора На 2 мин измерений в пробу был добавлен люминол (Л), на 4 мин - зимозан (3)

В этих условиях 15-мин преинкубация лейкоцитов с ГЦК приводит к уменьшению скорости нарастания хемилюминесценции (на 95-98%) и светосуммы сигнала (на 86-88%)

(Рис. 2А). Карнозин в тех же условиях оказывал аналогиченое действие (Рис. 2Б). Совместное действие этих агентов дает аналогичную картину (Рис. 2В).

Рис. 2, Влияние карнозина (А), ГЦК (Б) и ГЦК на фоне карнозина (В) на параметры дыхательного взрыва

Подавление дыхательнрого взрыва при внесении в пробу ГЦК может быть связано с описанным в литературе нарушением мембранного циттоскелетка, что, безуслвно, должно отразиться на эффективности сборки НАДФН-оксидазного комплекса. Внешне аналогичное действие карнозина, однако, может имиеть совершенно отличную природу, основанную на его хорошо известной способности тушить свободные радикалы (Курелла и соавт., 1992) и модулировать процесс дыхательного взрыва (Стволинский и соавт., 1993). Следовательно, обнаруженное нами дейстувие ГЦК, также может отражать ее иммуномодулирующую активность.

13 Кислотный гемолиз, отягощенный ГЦК Измерения процесса кислотного гемолиза проводили при постоянном значении рН в пробе В этих условиях скорость гемолиза, вызванного 0,1N НС1, составляла 0,2 уел ед /мин, а латентный период составлял величину порядка 150 с Преинкубация эритроцитов человека с 250 мкМ ГЦК в течение 30 мин вызывала укорочение латентного периода гемолиза на 6775% и увеличение его скорости на 145% В противоположность этому, совместная инкубация клеток с карнозином (250 мкМ) и ГЦК (250 мкМ) приводила к снижению скорости гемолиза (на 25-50%) без изменения латентного периода Полученные данные указывают, что карнозин способен защитить мембраны эритроцитов крови человека от повреждения, вызванного действием ГЦК Данные результаты позволяют предполагать, что ГЦК в используемой модели оказывает на мембраны дезинтегрирующее действие, а карнозин, напротив, проявляет мембраностабшшзирукяций эффект

Таким образом, помимо прямого антиоксидантного действия на липопротеины и иммуномодулирующего действия на лейкоциты, мы описали мембраностабилизирующее действие карнозина, направленное на защиту эритроцитов от кислотного гемолиза 1 4 Эксимеризация пирена в суспензии лейкоцитов донорской крови

Регистрация спектров флуоресценции в мембранах лейкоцитов показала, что присутствие ГЦК существенно увеличивает степень эксимеризации пирена, что свидетельствует о возрастании жидкостности мембранного бислоя (Boldyrev et al 1983) и соответствует известным данным о нарушении упаковки клеточных мембран гомоцистеином и его производными (Baydos et al, 2008) В данных условиях карнозин вновь демонстрирует защитное действие от дезинтегрирующего эффекта ГЦК, восстанавливая присущий интакгным мембранам низкий уровень эксимеризации пирена (Рис 3) Таким образом, карнозин выступает в качестве мембраностабилизирующего агента

Рис. 3. Влияние ГЦК и карнозина на соотношение величины пиков F,(474 hm)/Fu(393 нм) в суспензии лейкоцитов человека (* - достоверно по отношению к контролю, #- достоверное отличие по отношению к контроль+ГЦК 250 мкМ)

Демонстрация мембранопротекторных свойств карнозина на моделях in vitro поднимает вопрос о возможности аналогичных эффектов в условиях целого организма.

Глава 2. Действие карнозина на крыс Вистар в условиях гипобарической гипоксии, отягощенной 3-нитропропионатом

Исследование защитного действия карнозина на крыс в условиях острой гипобарической гипоксии проводили на модели, сочетающей воздействие двух патологических факторов - гипоксии и введение 3-НПК, вызывающей ингибирование митохондриальной сукцинатдегидрогеназы. Этот подход позволял выявлять неврологические нарушения у животных, характерные для нейродегенеративных заболеваний (Степанова и соавт., 2005). В этих условиях мы провели оценку защитного действия карнозина при его курсовом введении.

Введение 3-НПК начиная с 3 дня после гипоксического эпизода вызывает у животных отчетливое нарастание неврологической симптоматики (2,7 балла к 7 дню эксперимента), в то время как у гипоксических животных, не получавших 3-НПК, неврологическая симптоматика не выявлялась. В то же время, у крыс, получавших карнозин в постгипоксическом периоде, отягощенном введением 3-НПК, выявлялось достоверное снижение неврологической симптоматики - до 1,6 баллов (р<0,05) к б дню эксперимента (Рис. 4А). При этом обнаруживалось и достоверное снижение смертности - 8% против 33% в группе, которая карнозина не получала (см. Рис. 4Б).

Дни после перенесенной гипоксии

I 2 3 4 5 6 7 Дни после перенесенной гипоксии

Рис. 4. Влияние карнозина на развитие неврологической симптоматики у крыс, получавших 3-НПК (4А) Смертность животных на фоне введения 3-НПК в постгипоксический период (4В). I - крысы, получавшие 3-НПК в постгипоксическом периоде (п=12); II - крысы, получавшие карнозин в постгипоксическом периоде на фоне введения 3-НПК (п=12).

В тесте «открытое поле» было отмечено снижение двигательной активности крыс под воздействием гипоксии (на 48%, р<0,05). Еще большее снижение наблюдалось при сочетанном действии гипоксии и 3-НПК (на 78%, р<0,05) (Таблица 2). Подавление двигательной активности предотвращалось в случае введения карнозина «гипоксическим» животным, но такого эффекта мы не смогли наблюдать в условиях сочетанного действия гипоксии и 3-НПК. По-видимому, необратимый характер ингибирования СДГ 3-НПК не позволял карнозину оказывать защитное действие. Действительно, снижение активности фермента как в отсутствие, так и в присутствии карнозина составляло одну и ту же величину

- 72-75% (см. Таблицу 2). Сочетанное действие гипоксии и 3-НПК приводило также к снижению активности МАО В (на 18%) без изменения активности СОД. В то же время, под влиянием карнозина в этих условиях происходило повышение активности СОД (на 24%) и МАО В (на 57%) (р<0,05).

Таким образом, комбинация действия гипоксии и фактора эндоэкологического стресса

- 3-НПК - приводит к появлению неврологической симптоматики и более выраженным нарушениям двигательной активности. Применение карнозина в этих условиях способствует сохранению активности МАО В и повышает Си/гп-СОД, что может иметь адаптационный характер. Фактически, действие карнозина приводило к снижению смертности, ослаблению неврологической симптоматики и частичному восстановлению двигательной активности животных.

Таблица 2 Влияние карнозина на изменения физиологических и биохимических параметров у животных, подвергшихся сочетанному действию гипоксии и 3-НПК (данные представлены в % по отношению к интактным животным)

Измеряемый параметр Группы животных

КОНТРОЛЬ гипоксия ГИПОКСИЯ+ КАРНОЗИН ГИПОКСИЯ+ 3-НПК ГИГОКСИЯ+З -НПК + КАРНОЗИН

Двигательная активность, % 100 52* 79*# 23* 28*

Активность СДГ 100 107 114» 25* 22*

Активность МАО В 100 96 157* 82* 124*

Активность СОД 100 98 109 96 132*

* - статистически достоверное отличие от контроля, # - статистически достоверное отличие от группы, подвергнутой воздействию гипоксии

В этих условиях карнозин проявил себя не только как антиоксидант прямого действия, но и обнаружил более широкий спектр действия, выступая как регулятор активности ферментов, играющих важную роль для адаптационной функции мозга

Глава 3. Оценка протекторного эффекта карнозина на модели 3-сосудистой ишемии головного мозга на фоне введения гомоцистеиновой кислоты

Аналогичное многокомпонентное защитное действие карнозина обнаружено нами и на модели ишемии головного мозга, отягощенного введением ГЦК В этих экспериментах мы оценивали эффект карнозина на поведенческие реакции, определяемые в водном тесте Мориса, и сопоставляли их с уровнем митохондриальной СОД в гомогенате мозга.

На рис 5 видно, что как ишемия, так и введение ГЦК значительно увеличивают время поиска платформы животными в водном тесте Морриса Сочетанное действие этих факторов приводит к еще более выраженному увеличению времени поиска Следовательно, можно видеть, что оба эти фактора ухудшают способность к обучению и запоминанию у животных В то же время, животные, перенесшие ишемию, отягощенную ГЦК, и получавшие карнозин, быстрее находили платформу, чем животные, перенесшие ишемию (с ГЦК или без нее), хотя это время оставалось более длительным, чем в контроле (33 с против 22 с - Рис 5)

Рис. 5. Время поиска платформы животными, подвергнутыми тесту Мориса. Л -ложнооперированные животные, ГЦК получавшие ГЦК в постишемический период, И -подвергшиеся воздействию ишемии, И+ГЦК -получавшие ГЦК в постишемический период, И+ГЦК+К - получавшие ГЦК и карнозин в постишемический период. (Статистически достоверное отличие от группы Л: # - р<0,01, * -р<0,05).

Рис. 6. Активность Мп-СОД в митохондриальной фракции мозга исследуемых животных (обозначения - как на Рис. 5).(Статистически достоверное отличие от группы Л: * - р<0,05)

На Рис. 6. показано изменение активности Мп-СОД в этих экспериментах. Видно, что для мозга всех исследованных животных характерно повышение уровня Мп-СОД, что, по-видимому, иллюстрирует адаптационные процессы, протекающие в неблагоприятных условиях. Как видно на Рис. 5, этих адаптационных ресурсов оказывается недостаточно для сохранения способности мозга к запоминанию. И только в одном случае, когда уровень СОД повышается наибольшим образом (при введении карнозина ишемизированньм животным, получавшим ГЦК), этого оказывается достаточным для хотя бы частичного восстановления процессов запоминания.

В этих же условиях мы анализировали данные, полученные при определении уровня общего ГЦ в крови исследованных животных (см. Таблицу 3). Из таблицы видно, что 4-кратное введение ГЦК (80 мг/кг массы тела) интактным животным увеличивает уровень общего ГЦ в крови до 7,4 мкМ, что достоверно выше известного значения для интактных животных - 5,8 мкМ (Махро и соавт., 2008). У животных, подвергнутых ишемии, также наблюдался повышенный уровень ГЦ. Наибольшим значением ГЦ отличались животные, получавшие ГЦК на фоне ишемии (Таблица 3), Важным является то обстоятельство, что ведение карнозина не снижает уровня гипергомоцистеинемии. Другими словами, его нейропротекторный эффект реализуется независимо от метаболизма ГЦК в организме. Таким образом, в данной модели карнозин обнаруживает нейропротекторные свойства,

направленные не на устранение пшергомоцистеинемии, а на защиту от его токсического действия

Таблица 3 Содержание общего гомоцистеина в плазме крови исследуемых животных (каждая группа содержала 8 животных)

Животные, группы Общий ГЦ, мкМ

Интактные + ГЦК 7,4 ±0,5

Ишемия 8,1±0,6

Ишемия + ГЦК 8,9±0,6

Ишемия + ГЦК+ Карнозин 8,7±1

Подводя итог исследованиям на клеточных моделях и на животных т т'о, можно заключить, что карнозин обладает широким спектром защитных возможностей организма в условиях эндоэкологического стресса, и может рассматриваться как перспективный агент для применения при лечении нейродегенеративных заболеваний

Глава 4. Карнозин увеличивает устойчивость к эидоэкологнческому стрессу у пациентов с хронической дисциркуляторпой энцефалопатией

Выявленные ранее эффекты карнозина явились основанием для его применения в лечении больных с хронической ДЭ Для оценки устойчивости структурных элементов крови исследуемых пациентов мы измеряли резистентность липопротеинов плазмы крови к Ре2+-индуцированному окислению и скорость кислотного гемолиза эритроцитов, а также способность лейкоцитов к реализации дыхательного взрыва, вызванного опсонизированньш зимозаном Эти параметры отражают как состояние антиоксидантной защиты организма и устойчивость мембранных структур и состояние иммунной системы, ее готовность противодействовать неблагоприятным эндоэкологическим факторам.

4 1 Влияние карнозина на окислительную устойчивость липопротеинов и эритроцитов крови и эффективность иммунокомпетентной системы у пациентов с хронической дисциркуляторпой энцефалопатией Характеристика окисляемости липопротеинов плазмы крови приведена на Рис 7 Видно, что уровень липидных гидроперекисей в исследуемых образцах пациентов с ДЭ не отличается достоверно от здоровых доноров и не изменяется при различных способах лечения (Рис 7А) Остается неизменным и параметр, характеризующий окисляемость исследуемых образцов (Рис 7Б) В то же время, латентный период развития Ре2+-индуцированного роста ХЛ для липопротеинов, выделенных из крови пациентов с ДЭ, меньше почти на 50% и не изменяется при базовом лечении Введение в схему лекарственной терапии карнозина увеличивает длительность латентного периода, причем этот эффект демонстрирует отчетливую дозовую зависимость (Рис 7В) Параметр скорости

Ре2+-индуцированного окисления изменяется противоположным образом - она имеет большую величину у пациентов до лечения, не изменяется при базовой терапии и значительно снижается в результате введения карнозина в схему лекарственной терапии (Рис. 7Г). При этом большие дозы карнозина обеспечивают более выраженный эффект.

Рис. 7. (А, Б, В, Г) Устойчивость липопротеинов плазмы крови пациентов с дисциркуляторной энцефалопатией при разных способах лечения (в % к данным, полученным для здоровых доноров). А -гидроперекиси липидов, Б - окисляемость биологического материала, В - латентный период окисления, I" -скорость окисления, * - достоверность различий до и после лечения (тест Уилкоксона), & - достоверность различий в зависимости от дозы карнозина (тест Манна-Уитни)

Активность Си/Хп-супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах больных с ДЭ, измеренная до начала лечения, не отличалась значительно относительно величин, характерных для здоровых доноров. При этом обнаружилось, что как базовая терапия, так и ее сочетание с карнозином, повышали активность этого фермента в одинаковой степени, причем величина этого повышения была весьма незначительной.

Известно, что выбранная категория пациентов характеризуется относительно стабильным уровнем окислительного стресса (Суслина, 2006, Кадыков, 2006) Это подтверждается и нашими данными об отсутствии существенного накопления липидных гидроперекисей (Ь на Рис 7А) В этих условиях, по-видимому, СОД не вовлекается в адаптационные процессы в мозге (Таблица 4) Более того, и эффект карнозина на состояние этих пациентов, если имеет место, должен рассматриваться не с точки зрения влияния на антиоксидантный статус, а с учетом других сторон его влияния

Таблица 4 Влияние карнозина на активность Си/гп - супероксиддисмутазы (СОД) эритроцитов у больных ДЭ (доза карнозина - 2г/сут)

Обследованные Сроки Число наблюдений Активность Сч/гп-СОД (ед /мг белка)

Все больные до лечения 21 4,06±0,21

Базовая терапия после лечения после лечения 10 4,25±0,34

Базовая терапия + карнозин после лечения после лечения 11 4,23±0,28

Исследование «дыхательного взрыва» лейкоцитов, индуцированного зимозаном, обнаружило, что ни скорость возгорания ХЛ, ни другие параметры дыхательного взрыва не претерпевали достоверных изменений в результате базовой терапии, только время достижения максимума дыхательного взрыва удлинялось на 11% (р<0,05). Не оказывало влияния на исследуемые параметры и введение в протокол лечения карнозина в дозе 0,75 г в сутки

Увеличение суточной дозы карнозина до 2 г приводило к существенной модификации дыхательного взрыва скорость развития ХЛ возрастала на 46% (р<0,05), максимальная величина ХЛ увеличивалась на 68% (р<0,05), а светосумма увеличивалась на 49% (р<0,05) (Таблица 5) Время достижения максимума ХЛ увеличивалось на 12% Таким образом, можно заключить, что карнозин модулирует ответ иммунокомпетентаых клеток, причем этот эффект не основан на его антиоксидантном действии

Таблица 5 Влияние карнозина (2 г/сут), на параметры дыхательного взрыва «*» -соответствует достоверности различий в показателях до и после лечения с р<0,05

Группы Кол-во пациентов в группе Скорость ХЛ, мкВ/с Макс ХЛ, мВ Время достижения максимума ХЛ, с Светосумма ХЛ, мВ/с2

Пациенты до лечения 21 14,8±3,0 4,1±0,7 760±30 1880±310

Базовая терапия после лечения 10 14,4±3,0 4,4±1,2 845±30* 1820±430

Базовая терапия + карнозин после лечения 11 22,0±4,0* 6,9±1,8* 855±30* 2800±590*

НС1-индуцированный гемолиз эритроцитов у больных с ДЭ показал, что ни латентный период, ни скорость кислотного гемолиза эритроцитов, выделенных из крови пациентов, получавших базовую терапию, не изменялись в процессе лечения (Таблица 6) Карнозин в суточной дозе 0,75 г также не влиял на эти параметры Однако применение карнозина в большей суточной дозе (2 г) достоверно увеличивало длительность латентного периода (со 134±4 до 151±б, р<0,05)

Таблица 6. Влияние карнозина на параметры НС1-индуцнрованного гемолиза эритроцитов у больных ДЭ (доза карнозина 2 г/сут) «*» - соответствует достоверности различий показателя до и после лечения с р<0,05

Обследованные пациенты Количество пациентов в группе Скорость гемолиза, опт ед/мин Латентный период, с

Все пациенты до лечения 21 0,26±0,01 134±4

Базовая терапия после лечения 10 0,25±0,02 138±6

Базовая терапия +карнозин после лечения 11 0,24±0,01 151±6*

Содержание общего гомоцистеина в плазме крови пациентов с ДЭ, измеренное до начала проведения лечения в обеих группах было повышено относительно здоровых доноров (Таблица 7) Из литературных данных известно, что верхний предел нормы концентрации общего гомоцистеина колеблется в пределах от 12 до 15 мкМ (Жлоба и др, 2004) Полученные нами данные свидетельствуют о наличии выраженной гипергомоцистеинемии у обследованных больных,

В обеих группах пациентов после проведенного курса лечения не наблюдалось изменения общего уровня гомоцистеина в плазме крови Следовательно, защитный эффект карнозина, подтверждаемый положительными изменениями биохимических показателей у пациентов, также не связан с метаболизмом ГЦ и продуктов его окисления, как это было нами обнаружено в экспериментальных моделях на животных (Глава 3)

Таблица 7. Содержание общего гомоцистеина в плазме крови пациентов с ДЭ при двух вариантах лечения * - достоверное (р<0,05) отличие от нормы

Сроки лечения Число наблюдений Концентрация гомоцистеина, мкмоль/л

Здоровые доноры - (Жлоба и соавт, 2004) 12,5±2,5

Все больные до лечения 21 20,2±1,7*

Базовая терапия после лечения 10 18,2±1,4*

Базовая терапия + карнозин после лечения 11 22,4±4,5*

4 2 Оценка неврологического состояния и когнитивных функций мозга пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией

При оценке неврологического статуса пациентов не было отмечено выраженного действия базовой терапии на неврологическую симптоматику, что может быть связано с характером заболевания Соответственно и введение карнозина в дополнение к базовой терапии не выявляло явного улучшения состояния пациентов Только исследование вызванных потенциалов Р300 (ВП Р300), отводимых от лобных и теменных областей мозга (отвечающих за когнитивные функции), продемонстрировало положительное действие карнозина

У пациентов, получавших базовую терапию, существенной динамики параметров Р300 не выявлялось Не меняло ситуации и дополнительное включение в схему лечения карнозина в суточной дозе 0,75 г В то же время, в картине ВП Р300 у пациентов, получавших карнозин в суточной дозе 2,0 г, отчетливо уменьшалась латентность пиков когнитивного комплекса до лечения она составляла 378±21 мс, а после лечения - 345±12 мс (р<0,05) В то же время, амплитуда пиков РЗОО у пациентов обеих групп до и после лечения существенно не изменялась, но число ответов с низкой амплитудой в группе пациентов, не получавших карнозина, составляло 60%, а в группе пациентов, получавших карнозин, - 27% (р<0,05)

Таким образом, при использовании карнозина в суточной дозе 2 г в качестве дополнительного компонента лечения пациентов с ДЭ мы наблюдали усиление устойчивости липопротеинов плазмы крови к Ре2+-индуцированному окислению, стабилизацию эритроцитов по отношению к кислотному гемолизу и интенсификацию дыхательного взрыва лейкоцитов В наших исследованиях была также установлена пороговая доза эффективности карнозина - использование суточной дозы в 0,75 г было практически неэффективным, а использование 2 г в сутки оказывало статистически достоверный эффект Поскольку эта доза

была сравнима с количеством карнозина, появляющимся в крови при использовании диеты с высоким содержанием белка, и при этом не наблюдалось побочных эффектов или отказа пациентов от приема препарата, можно считать, что указанная доза соответствует начальному уровню эффективности карнозина

Одновременно наблюдается снижение латентного периода вызванных потенциалов Р300 Положительная динамика параметров этих потенциалов дает объективное указание на улучшение когнитивных функций мозга Полученные данные свидетельствуют о возрастании эффективности базовой терапии пациентов с ДЭ при использовании карнозина Таким образом, впервые в клинико-биохимическом исследовании нами был выявлен дозозависимый эффект карнозина при лечении пациентов с хроническими сосудистыми заболеваниями головного мозга

ВЫВОДЫ

1 Обнаружено защитное действие карнозина на биологические структуры при воздействии факторов эндоэкологического повреждения в условиях т vitro и т vivo

2 Отягощение окислительного повреждения мозга крыс линии Вистар 3-нитропропионовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой усугубляет патофизиологические и биохимические нарушения Введение карнозина предотвращает развитие неврологической симптоматики, снижает смертность и способствует восстановлению двигательной активности, что коррелирует с нормализацией активности Mn-супероксиддисмутазы и моноаминоксидазы В

3 Включение карнозина в схему лечения пациентов с ДЭ оказывает стабилизирующее действие на форменные элементы крови и усиливает эндогенную антиоксидантную систему организма

4 При использовании карнозина в качестве дополнительного компонента лечения пациентов с дисциркулягорной энцефалопатией наблюдается повышение устойчивости липопротеинов плазмы крови к Ре2+-индуцированному окислению, а также стабилизация эритроцитов по отношению к кислотному гемолизу и интенсификация дыхательного взрыва лейкоцитов

5 Выраженная гипергомоцистеинемия, наблюдаемая у пациентов с ДЭ, не устраняется после проведения курса лечения независимо от использования карнозина в схеме лечения Следовательно, положительное действие карнозина направлено не на нормализацию уровня гомоцистеина в крови, а на защиту от его токсического действия

6 При введении карнозина в схему лечения обнаруживается улучшение когнитивных функций мозга у пациентов с ДЭ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Стволинский С Л , Беляев М С , Болдырев А А Карнозин поддерживает реабилитационные возможности организма в постгипоксическом периоде, отягощенном введением 3-нитропропионовой кислоты // Научные труды МБЦ МГУ, М Макс-Пресс, - 2003 - с 55-59

2 Stvolinsky S , Belyaev М, Boldyrev A Protective effect of carnosine on rats under hypoxia aggravated by 3-nitropropionate // Proceedings of the 11th International Symposium, «New Frontiers of Neurochemistry and Neurophysics on Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases» J Alzheimer's Disease - 2004 - Vol 6 - p 547-568

3 Беляев M С , Топунова H В , Стволинский С Л Антиоксидантная защита мозга от окислительного стресса как фактор повышения адаптивных возможностей организма в условиях гипоксического воздействия // Актуальные проблемы экологии и природопользования Выпуск 5-6 Системная экология М Изд-во РУДН - 2004 - с 35-37

4 Куликов А В , Беляев М С Возможности терапевтического применения карнозина и мексидола в условиях 3-НПК-индуцированной хореи Гентингтона на быстростареющих мышах линии SAMP-1 // Актуальные проблемы экологии и природопользования Сборник научных трудов, Выпуск 6 М Изд-во РУДН - 2004 - с 22-25

5 Степанова М С , Беляев М С Защитное действие карнозина в условиях гипоксической и химической гипоксии // Актуальные проблемы экологии и природопользования Сборник научных трудов, Выпуск 6 М Изд-во РУДН - 2004 - с 18-21

6 Степанова М С , Беляев М С , Стволинский С Л Действие карнозина на крыс при гипоксии, отягощенной 3-нитропропионатом // Нейрохимия - 2005 - т22, №2 - с 128-132

7 Беляев М С , Стволинский С Л , Орлова В С Сравнительная характеристика карнозина и ацетилкарнозина как антигипоксантов в модели гипобарической гипоксии, отягощенной воздействием ингибитора сукцинатдегидрогеназы - 3-нитропропионовой кислоты // Актуальные проблемы экологии и природопользования Геоэкология, системная экология, экология человека Сборник научных трудов, Выпуск 7 М Изд-во РУДН - 2005 - с 47-50

8 Беляев М С Состояние мембран эритроцитов человека в зависимости от воздействия различных эндоэкологических факторов //Актуальные проблемы экологии и природопользования Системная экология Сборник научных трудов, Выпуск 8 М Изд-во РУДН-2006 -с 50-53

9 Стволинский С Л , Федорова Т Н , Беляев М С , Степанова М С , Булыгина Е Р , Тюлина О В , Болдырев А А Карнозин новейшая история давно известного вещества //Бюллетень Московского общества испытателей природы Отдел биологический Т 112, вып 1 , 2007 г Приложение №1 Биотехнология Экология Охрана окружающей среды С 107-123

10 Беляев М С , Трунова О А Карнозин замедляет скорость кислотного гемолиза эритроцитов, отягощенного воздействием гомоцистеиновой кислоты // Ломоносов - 2008 (тезисы докладов) Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых, секция «Биология», 8-11 апреля 2008 г, Москва М МАКС Пресс - 2008 - с 31

11 Болдырев А А, Беляев М С, Трунова О А, Гнездицкий В В , Максимова М Ю , Федорова Т Н Нейропептид карнозин увеличивает устойчивость липопротеинов и эритроцитов крови и эффективность иммунокомпетентной системы у пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией // Биологические мембраны - 2008 - Т 25,№8 (в печати)

Беляев Михаил Сергеевич (Россия) «Карнозин как фактор эндоэкологическоП защиты организма от повреждений, вызванных окислительным стрессом»

В диссертационной работе показано защитное действие карнозина на биологические структуры при воздействии факторов эндоэкологического повреждения в условиях т vitro и in vivo Введение карнозина животным с гипоксией/ишемией головного мозга, отягощенное введением эндотоксинов, предотвращает развитие неврологической симптоматики, снижает смертность и способствует восстановлению двигательной активности, что коррелирует с нормализацией биохимических параметров

Введение карнозина в схему лечения пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией предотвращает развитие окислительного стресса и способствует улучшению когнитивных функций мозга В этих условиях карнозин оказывает антиоксидантное, мембраностабилизирующее и иммуномодулирующее действие, что указывает на многофункциональность карнозина как модулятора биологических структур

Отсутствие побочных эффектов карнозина позволяет рекомендовать его в качестве дополнительной терапии пациентов с хроническими сосудистыми заболеваниями головного мозга

Belyaev Mikhail Sergeevich (Russian Federation) "Carnosine as a factor of endoecological protection of organism from damage caused by

oxidative stress"

The protective effect of carnosine on biological structures under conditions of endoecological damage in both in vitro and m vivo models has been shown in the work The carnosine therapy of the animals exposed to the action of hypoxia/ischemia aggravated by the endotoxins prevents the development of neurological symptoms, decreases mortality and contributes to the recovering of motor activity, that correlates with normalization of biochemical parameters

The introduction of carnosine into the scheme of treatment of patients with chronic dyscirculatory encephalopathy prevents the development of oxidative stress and improves brain cognitive function Under these conditions carnosine acts both as an antioxidant and membrane-stabilizing agent and immunomodulator, and that points to the multi-functional activities of carnosine, as modulator of biological structures

The absence of side effects of carnosine allows recommending this substance for additional therapy of patients suffering from chronic vascular brain diseases

Отпечатано в ООО «Компания Спутники-» ПД № 1-00007 от 25.09 2000 г. Подписано в печать 18 08.08. Тираж 100 экз. Усл. п.л 1,5 Печать авторефератов (495) 730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Беляев, Михаил Сергеевич

Введение.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

Обзор литературы.

Развитие окислительного стресса, индуцированного экологическими факторами.

Свободные радикалы. Активные формы кислорода.

Гипоксия — экологический фактор окружающей природной и техногенной среды.

Повреждения, возникающие в митохондриях при окислительном стрессе.

Перекисное окисление липидов (ПОЛ).

Кислородный (дыхательный) взрыв.

Состояние мембран эритроцитов при окислительном стрессе.

Система антиоксидантной защиты. Утилизация свободных радикалов в клетке.

Пути обеспечения энергетического обмена при окислительном стрессе. Роль сукцинатдегидрогеназы

Роль моноаминоксидазы.

Роль супероксиддисмутазы как основного фермента антиоксидантной защиты в обеспечении устойчивости организма к воздействию окислительного стресса.

Эндоэкологические факторы, индуцирующие развитие окислительного стресса.

3-нитропропионовая кислота, ее воздействие на головной мозг.

Гомоцистеин и его метаболизм.

Сосудистые патологии головного мозга. Хроническая дисциркуляторная энцефалопатия.

Оценка когнитивных функций пациентов, страдающих ДЭ. Метод вызванных потенциалов Р300.

Обоснование целесообразности использования природных и синтетических антиоксидантов в качестве лекарственных средств.

Карнозин - природный нейропротектор.

Материалы и методы экспериментальных и клинико-биохимических исследований.

Острая гипобарическая гипоксия, отягощенная введением 3-нитропропионовой кислоты.

Лабораторные животные.

Экспериментальная модель острой гипоксической гипоксии.

Тестирование физиологической активности крыс.

Эксперименты по введению 3-НПК.

Модель ишемии, отягощенной введением гомоцистеиновой кислоты (ГЦК).

Двухэтапная окклюзия 3 магистральных сосудов головы крыс.

Эксперименты по введению ГЦК и карнозина.

Эксперименты по оценке памяти и способности к обучению у животных в водном лабиринте Морриса

Проведение биохимических исследований (эксперименты in vivo).

Приготовление гомогенатов головного мозга.

Получение митохондриальной фракции из ткани мозга крысы.

Определение содержания белка в пробах по методу Лоури.

Определение активности сукцинатдегидрогеназы в митохондриальной фракции головного мозга животных.

Определение активности моноаминоксидазы в гомогенатах головного мозга животных.

Определение активности супероксиддисмутазы в гомогенатах головного мозга животных.

Проведение биохимических измерений в рамках клинико-биохимического исследования.

Определение активности Cu/Zn-супероксиддисмутазы в эритроцитах человека.

Определение концентрации гемоглобина.

Кислотный гемолиз.

Хемилюминесценцш липопротеинов сыворотки крови, индуцированная ионами двухвалентного железа

Исследование физико-химических характеристик мембран лейкоцитов человека с помощью флуоресцентного зонда пирена.

Опсонизация згшозана.

Кислородный (дыхательный) взрыв.

Определение гомоцистеина в плазме крови методом ВЭЖХ.

Определение гомоцистеина в плазме крови иммунологическим методом (Axis1,Ki).

Оценка когнитивных функций мозга пациентов методом вызванных потенциалов Р300.

Математическая обработка данных.

Результаты исследования.

Глава 1. Влияние карнозина на устойчивость клеточных структур крови человека в опытах in vitro.

Оценка действия карнозина в условиях Fe2+-индуцированной хемипюминесценции липопротеинов сыворотки крови человека.

Влияние карнозина и гомоцистеина на «дыхательный взрыв» лейкоцитов человека, индуцированный опсонизированным зимозаном in vitro.

Кислотный гемолиз, отягощенный ГЦК.

Эксимеризация пирена в суспензии лейкоцитов донорской крови.

Глава 2. Действие карнозина на крыс Вистар в условиях гипобарической гипоксии, отягощенной 3нитропропионатом.

Глава 3. Оценка протекторного эффекта карнозина на модели 3-сосудистой ишемии головного мозга на фоне введения гомоцистеиновой кислоты.

Глава 4. Карнозин увеличивает устойчивость к эндоэкологическому стрессу у пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией.

Влияние карнозина на окислительную устойчивость липопротеинов и эритроцитов крови и эффективность иммунокомпетентной системы у пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией.

Активность Cu/Zn — супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах крови у больных сДЭ.

Дыхательный взрыв в суспензии лейкоцитов, индуцированный опсонизированным зимозаном.

HCl-индуцированный гемолиз эритроцитов.

Концентрация общего гомоцистеина в плазме крови пациентов сДЭ.

Оценка неврологического состояния и когнитивных функций мозга пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Список публикаций по теме диссертации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Карнозин как фактор эндоэкологической защиты организма от повреждений, вызванных окислительным стрессом"

Актуальность проблемы

В процессе жизнедеятельности организма клеточный гомеостаз подвергается воздействию различных повреждающих факторов как экзогенного, так и эндогенного происхождения. В клетке существуют механизмы, обеспечивающие стабильность внутренней среды организма, которые могут рассматриваться как эндоэкологические. Подавляющее большинство всех живых организмов, принадлежащих к сложным экологическим системам, являются кислород-потребляющими. Многие метаболиты способны вызывать нарушения, лежащие в основе необратимых изменений обмена веществ. Такие соединения, являющиеся факторами риска, в частности, нейродегенеративных процессов, могут служить показателями как нарушений обмена веществ, так и его нормализации в процессе лечения. Такого рода факторы являются сенсорами эндоэкологического состояния гомеостаза.

К числу факторов, индуцирующих развитие системного окислительного стресса в тканях, относятся гомоцистеин и продукты его спонтанного окисления (главным образом, гомоцистеиновая кислота), уровень которых в кровяном русле резко возрастает при острых нарушениях мозгового кровообращения. Эти же соединения являются известными факторами риска, осложняющими течение хронических сосудистых заболеваний головного мозга.

Особая чувствительность к окислительному стрессу головного мозга, ткань которого наиболее активно потребляет кислород, вызвана повышенной окисляемостью мембранных липидов нейрональной ткани и относительно низкой активностью эндогенной антиоксидантной системы. Таким образом, эндоэкологическое факторы баланса между образованием и нейтрализацией активных форм кислорода (АФК) являются показателем устойчивости мозга к неблагоприятным факторам.

Окислительный стресс и истощение эндогенной антиоксидантной системы могут рассматриваться в качестве факторов эндоэкологического стресса.

Эндоэкология — раздел биоэкологи, то есть экологии в первоначальном понимании термина, то есть часть биологии, изучающая отношения организмов (особей, популяций, биоценозов) между собой и окружающей средой. Вместе с тем - это биологическая основа (базис) современной экологии. В структуре современной экологии, предложенной Н.Ф. Реймерсом (Реймерс, 1994), биоэкология выглядит следующим образом: она включает в себя системную экологию, экологию систематических групп, эволюционную экологию и палеоэкологию. Системная экология, в свою очередь, представляет собой совокупность научных дисциплин, исследующих взаимоотношения системных биологических структур (биотических систем) между собой и с окружающей их средой. В зависимости от иерархического уровня организации биологических структур (биотических систем) биоэкологию подразделяют на эндоэкологию и экзоэкологию. Эндоэкология, в свою очередь, подразделяется на молекулярную экологию (в том числе экологическую генетику) и физиологическую экологию (экология индивида).

В свете научных интересов молекулярной и физиологической эндоэкологии изучение механизмов регуляции гомеостаза как многоклеточного организма в целом, так и клеточных структур, входящих в его состав, является одной из важнейших задач этой науки.

Как ни странно, в научном мире понятия «экология» и «окислительный стресс» имеют больше точек соприкосновения, чем может показаться с первого взгляда. Так, именно одна из основных экологических проблем человечества — ядерное оружие и атомная энергетика — послужила поводом к активному изучению свободнорадикальных процессов. Взрыв первой атомной бомбы в США в 1945 г. породил много новых вопросов, в том числе и о влиянии радиации на биологические системы. Исследования 50-60-х годов прошлого столетия показали, что действие ионизирующего излучения реализуется посредством образования чрезвычайно реакционноспособных свободных радикалов, возникающих при расщеплении молекул воды (Н20 -> радиация -> нГ + ОН* + е). Теория цепного радикального окисления органических молекул, разработанная группой ученых во главе с H.H. Семеновым, оказалась применимой и в случая окисления липидов, входящих в состав клеточных мембран. В дальнейшем Б.Н. Тарусов разработал концепцию о свободнорадикальной патологии, а академик Н.М. Эммануэль впервые высказал предположение, что повреждения, вызываемые свободными радикалами, могут играть важную роль в процессе канцерогенеза. Здесь необходимо отметить, что раковые заболевания являются одной из основных причин смертности. Показано, что именно свободным радикалам отводится важная роль в развитии процесса старения (Меньщикова и соавт., 2006).

Некоторые исследователи даже склонны выделять роль свободнорадикальных процессов в биологических системах, которые неразрывно связаны с понятием «окислительный стресс», в отдельную научную дисциплину - свободнорадикальную биологию (Меньщикова и соавт., 2006).

В живых организмах имеется многокомпонентная антиоксидантная система (АО), необходимая для контроля продукции активных форм кислорода (АФК) и предотвращения развития свободнорадикальных реакций. Она представлена ферментами антирадикальной защиты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза), а также многочисленными низкомолекулярными антиоксид антами.

Согласованная работа всех компонентов АО системы держит под постоянным контролем как образование, так и превращение АФК в клетках. Для мозга характерно низкое содержание основных компонентов АО защиты с одной стороны, и высокое содержание субстратов (полиненасыщенных жирных кислот) и катализаторов (в основном ионов металлов с переменной валентностью - меди и железа) свободнорадикальных реакций. Кроме того, мозг является органом, наиболее активно потребляющим кислород, что в целом и обусловливает его высокую избирательную чувствительность к свободнорадикальным процессам. Многие заболевания центральной нервной системы (ЦНС) (сосудистые, нейродегенеративные и другие) протекают на фоне длительно существующего ОС, который в настоящее время рассматривается как одна из основных причин необратимой гибели мозга.

В норме свободные радикалы участвуют в выполнении важнейших физиологических процессов в организме. Супероксид-анион, гидроксид-радикал и перекись водорода могут участвовать в поддержании вазоконстрикторного-вазодилятаторного (сужение-расширение кровеносных сосудов) баланса, обусловливающего гетерогенность и изменяемость органного кровотока. При этом супероксид-анион не оказывает прямого действия на гладкомышечные клетки сосудов, но способен инактивировать МО-радикал, являющийся эндотелий-зависимым релаксирующим фактором. Н2О2 и ОН", напротив, индуцируют вазодилатацию. Чрезвычайно велика роль активных форм кислорода в воспалительных реакциях, которые имеют место практически при всех типах повреждений тканей, в том числе и при ишемии.

Свободнорадикальное окисление является одним из естественных механизмов модификации липидного состава клеточных мембран, обусловливающим изменения их функциональных характеристик (Кругл и ков и соавт. 1995). Образование N0 из аргинина происходит с участием молекулярного кислорода и НАДФН2. N0 выполняет чрезвычайно разнообразные физиологические функции, принимая участие в модуляции сосудистого тонуса, в механизмах памяти и в реакциях воспаления. N0 в норме является антиоксидантом, поскольку он реагирует с липофильными пероксильными радикалами, важнейшими и широко распространенными соединениями в биологической цепи реакций пероксидации липидов, приводя к генерации значительно более стабильных алкил-пероксинитратов (ЬООЫО), что позволяет N0 остановить пероксидацию липидов.

Особую роль АФК играют в поддержании жизнедеятельности организма в неблагоприятной окружающей среде, в адаптивных реакциях, в обеспечении работы протекторных систем организма — в процессах, обеспечивающих поддержание гомеостаза, физиологический статус. При этом показано, что избыточная генерация активных форм кислорода (АФК) приводит нарушению клеточного гомеостаза и развитию патологических процессов в организме (Владимиров, 1972; Козлов, 1973; Болдырев, 1996).

Одними из наиболее агрессивных химических структур являются гидроксид-радикалы, которые реагируют с большой скоростью почти со всеми молекулами, находящимися в живой клетке, в частности, вызывая химическое повреждение дезоксирибозы, пуриновых и пиримидиновых оснований, мембранных липидов и углеводов, что приводит к каскаду реакций, вызывающих повреждение митохондриальной элетронтранспортной системы, нарушению внутриклеточного гомеостаза Са2+, индукции протеаз, увеличению пероксидации липидов в мембране и в финале — смерть клетки (УоисИт е! а1, 1993).

Нарушение баланса между образованием АФК и их нейтрализацией компонентами АО системы приводит к увеличению уровня радикальных соединений и истощению эндогенной АО системы. Такое состояние называется окислительным стрессом (ОС).

Окислительный стресс - явление, наблюдаемое при таком широко распространенном заболевании, как ишемический инсульт (инфаркт мозга). Это - локальная ишемия головного мозга, сопровождающаяся проявлением очаговых неврологических нарушений. Ишемия мозга может быть вызвана тромбозом или эмболией вне- либо внутричерепных артерий, в редких случаях — гипоперфузией мозга вследствие системных гемодинамических нарушений. По данным Всемирной федерации неврологических обществ, ежегодно в мире регистрируется до 15 млн. случаев инсультов. В РФ заболеваемость инсультом составляет 3,4 на 1000 человек в год, то есть около 450000 случаев в год. (Яхно, 2005).

В 20—30% случаев инсульту предшествуют транзиторные ишемические атаки (преходящие нарушения мозгового кровообращения), характеризующиеся острым развитием неврологических нарушений и их регрессом в течение суток. Другие основные факторы риска ишемического инсульта включают увеличение возраста, артериальную гипертензию, сахарный диабет, гиперхолестеринемию, атеросклеротический стеноз сонных артерий, курение, сердечнососудистые заболевания.

Состояние окислительного стресса возникает тогда, когда возобновляется ранее нарушенное кровоснабжение того или иного участка головного мозга.' При реперфузии наблюдается реоксигенация тканей, и, как следствие, образование большого количества АФК, оказывающих свое разрушающее действие на клетки головного мозга, находящиеся в так называемой зоне «ишемической полутени». К этой зоне относится большинство клеток, гибель которых наступает в течение 6-12 часов после перенесенного ишемического эпизода в результате сложного каскада биохимических реакций. Пути предотвращения гибели этих клеток — с одной стороны, возобновление поступления кислорода в эту зону, а с другой стороны - защита нейронов от окислительного повреждения, возникающего как раз из-за образования АФК. Для осуществления нейропротекции теоретически нужно применение препаратов с антиоксидантной активностью, химических соединений, уменьшающих активность возбуждающих медиаторов, блокаторов кальциевых каналов. Однако известно, что применение нейропротекторов имеет свои ограничения, и они могут быть эффективны лишь в течение первых нескольких часов после возникновения неврологических симптомов (Гусев, Скворцова, 2001). В связи с этим поиск новых препаратов, способных воспрепятствовать процессам, вызывающим нейрональную гибель, и обеспечить восстановление функции мозга, является актуальной задачей.

Окислительный стресс (ОС) может быть вызван как эндогенными, так и экзогенными неблагоприятными факторами — загрязняющими веществами окружающей среды, ионизирующим излучением, действием чужеродных организмов, влиянием экстремальных температур, недостатком кислорода. В соответствии с вышеизложенным, ОС можно рассматривать как неблагоприятный экологический фактор внутренней среды организма, называемый нами эндоэкологическим стрессом.

К числу химических факторов, способствующих развитию системного окислительного стресса в тканях, относятся гомоцистеин и продукты его спонтанного окисления (главным образом, гомоцистеиновая кислота), уровень которых в кровяном русле резко возрастает при нарушениях мозгового кровообращения (Yap, 2003; Зорилова, 2006). Как правило, при хронических сосудистых заболеваниях головного мозга наблюдается гипергомоцистеинемия различной степени выраженности, вызванная нарушениями метаболизма, происходящими под влиянием разнообразных экзо- и эндогенных факторов. Другой химический агент, 3-нитропропионовая кислота (3-НПК) является токсином; в мозге он необратимо ингибирует митохондриальную сукцинатдегидрогеназу и тем самым усугубляет функционально-метаболические нарушения мозга. В настоящее время действие этих соединений в условиях гипоксического и ишемического повреждения как мозга, так и организма в целом исследовано недостаточно. Актуальным вопросом является и поиск природных нейропротекторов в условиях гипоксии/ишемии, отягощенной токсическим действием эндогенных и экзогенных химических агентов.

Целесообразным подходом к регуляции окислительного стресса в условиях гипоксии/ишемии головного мозга является применение антиоксидантов природного происхождения (Федорова и соавт., 2001; Boldyrev, 2006). С этой точки зрения перспективным соединением может быть природный нейропептид карнозин ф-аланил-Ь-гистидин). Являясь специфическим компонентом возбудимых тканей позвоночных животных, карнозин обнаруживает способность защищать мозг от окислительного стресса и его последствий в различных экспериментальных моделях fBoldyrev, Severin, 1990; Болдырев, 1992; Boldyrev. 2001). Он уменьшает экзайтотоксичность NMDA-рецепторов, предотвращает индукцию нейрональной смерти при действии неблагоприятных факторов, смягчает неврологическую симптоматику и уменьшает смертность животных после экспериментальной ишемии головного мозга (Федорова и соавт., 2002).

В клинико-биохимических исследованиях показано участие окислительного стресса в патогенезе гипоксических и ишемических поражений головного мозга (Суслина, 2000). Оценка возможности применения карнозина в качестве дополнительного лечения больных с хронической дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ) является актуальной задачей.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилась характеристика окислительных повреждений тканей в условиях эндоэкологического стресса и разработка подходов к нормализации метаболизма с помощью природного нейропептида карнозина.

Задачи исследования включали: 1. характеристику защитного эффекта карнозина на структурные элементы крови человека на фоне действия гомоцистеиновой кислоты (ГЦК) в опытах in vitro;

2. исследование терапевтического влияния карнозина на биохимические и физиологические проявления острой гипобарической гипоксии, отягощенной действием 3-НПК у крыс линии Вистар;

3. оценку протекторного эффекта карнозина на модели 3-сосудистой ишемии головного мозга на фоне введения ГЦК;

4. оценку терапевтического действия карнозина в комплексном лечении пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ).

Научная новизна. В работе описаны модели сочетанного действия различных эндоэкологических факторов, включающих гипоксию/ишемию, отягощенную воздействием 3-НПК или гомоцистеиновой кислоты.

Нейропептид природного происхождения карнозин был впервые применен нами в качестве дополнительного фактора лечения пациентов, страдающих ДЭ.

В работе показано, что защитные эффекты карнозина как на структурные элементы крови, так и на организм в целом, не ограничиваются его антиоксидантными свойствами, а включают мембраностабилизирующее и иммуномодулирующее действие. Выявлена способность карнозина улучшать когнитивные функции мозга у пациентов с ДЭ.

Проведенное исследование выявило многофункциональность карнозина как модулятора биологических структур.

Научно-практическая значимость. Обнаруженное нами положительное влияние карнозина при его введении животным в постгипоксический/постишемический период позволяют рекомендовать его для лечения больных с различными гипоксическими состояниями, а также для реабилитации лиц, подвергшихся воздействию гипоксии, и спортсменов в периоды интенсивных нагрузок.

Результаты проведенного клинико-биохимического исследования позволяют считать целесообразным введение карнозина в схему лечения пациентов, страдающих ДЭ.

Это исследование является фрагментом плановой научно-исследовательской темы клинического отделения и лаборатории биохимии.

Работа одобрена этическим комитетом, этическим комитетом был разработан и утвержден протокол, пациенты давали письменное информированное согласие на включение карнозина в виде БАД в их схему лечения. Состояние пациентов оценивались неврологами, группы однородны, все пациенты получали терапевтическое лечение. Для доказательства эффективности препарата (с точки зрения показательной медицины) был использован двойной слепой плацебо-контролируемый метод.

Основные положения, выносимые на защиту. Эффекты карнозина в условиях эндоэкологического повреждения не ограничиваются его антиоксидантными свойствами; на моделях in vitro карнозин проявляет мембраностабилизирующее действие на структурные элементы крови человека.

Карнозин оказывает защитное и регуляторное действие на биохимические и физиологические параметры, изменяющиеся в результате сочетанного действия эндоэкологических факторов - острой гипобарической гипоксии и 3-НПК - у крыс линии Вистар.

З-НПК и ГЦК являются значимыми факторами, усугубляющими развитие ОС в условиях гипоксии/ишемии головного мозга крыс Вистар. Карнозин проявляет свойства нейропротектора, предотвращая развитие неврологических и двигательных нарушений у животных, что коррелирует с нормализацией биохимических показателей.

Введение карнозина в схему лечения пациентов с ДЭ (дополнительно к базовой терапии) повышает уровень эндогенной антиоксидантной защиты, эффективность иммунокомпетентной системы, а также проявляет мембранопротекторное действие. Эти эффекты сопровождаются положительным действием карнозина на когнитивные функции мозга.

Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите 25 сентября 2008 г. на заседании кафедры системной экологии экологического факультета РУДН. Материалы диссертации были представлены на конференциях «Актуальные проблемы экологии и природопользования» (экологический факультет РУДН) в 2003 и 2005 гг., на XI Международном симпозиуме «New frontiers of neurochemistry and neurophysics on diagnosis and treatment of neurological diseases» в 2003 г. в г. Мартине (Словакия), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет) в 2008 г., на I Национальном Конгрессе по болезни Паркинсона и расстройствам движений, 2008 г. (Москва).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и иллюстрирована 15 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, раздела, отражающего результаты собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, состоящего из 104 отечественных и 78 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Беляев, Михаил Сергеевич

Выводы

1. Обнаружено защитное действие карнозина на биологические структуры при воздействии факторов эндоэкологического повреждения в условиях in vitro и in vivo.

2. Отягощение окислительного повреждения мозга крыс линии Вистар 3-нитропропионовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой усугубляет патофизиологические и биохимические нарушения. Введение карнозина предотвращает развитие неврологической симптоматики, снижает смертность и способствует восстановлению двигательной активности, что коррелирует с нормализацией активности Mn-супероксиддисмутазы и моноаминоксидазы В.

3. Включение карнозина в схему лечения пациентов с ДЭ оказывает i стабилизирующее действие на форменные элементы крови и усиливает эндогенную антиоксидантную систему организма.

4. При использовании карнозина в качестве дополнительного компонента лечения пациентов с дисциркуляторной энцефалопатией наблюдается повышение устойчивости липопротеинов плазмы крови к Fe2+-индуцированному окислению, а также стабилизация эритроцитов по отношению к кислотному гемолизу и интенсификация дыхательного взрыва лейкоцитов.

5. Выраженная гипергомоцистеинемия, наблюдаемая у пациентов с ДЭ, не устраняется после проведения курса лечения независимо от использования карнозина в схеме лечения. Следовательно, положительное действие карнозина направлено не на нормализацию уровня гомоцистеина в крови, а на защиту от его токсического действия.

6. При введении карнозина в схему лечения обнаруживается улучшение когнитивных функций мозга у пациентов с ДЭ.

Список публикаций по теме диссертации

1. Стволинский С.Л., Беляев М.С., Болдырев A.A. Карнозин поддерживает реабилитационные возможности организма в постгипоксическом периоде, отягощенном введением 3-нитропропионовой кислоты. //Научные труды МБЦ МГУ, М.: Макс-Пресс

2003. - с.55-59.

2. S.Stvolinsky, M.Belyaev, A.Boldyrev. Protective effect of carnosine on rats under hypoxia aggravated by 3-nitropropionate // Proceedings of the 11th International Symposium, «New Frontiers of Neurochemistry and Neurophysics on Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases». J. Alzheimer's Dis. - 2004. - Vol. 6. - p. 547-568.

3. Беляев M.C., Топунова H.B., Стволинский С.JI. Антиоксидантная защита мозга от окислительного стресса как фактор повышения адаптивных возможностей организма в условиях гипоксического воздействия. // Актуальные проблемы экологии и природопользования. Выпуск 5-6. Системная экология. М.: Изд-во РУДН - 2004. - с.35-37.

4. Куликов A.B., Беляев М.С. Возможности терапевтического применения карнозина и мексидола в условиях 3-НПК-индуцированной хореи Гентипгтона на быстростареющих мышах линии SAMP-1.// Актуальные проблемы экологии и природопользования. Выпуск 6 (часть 1). Сборник научных трудов. М.: Изд-во РУДН - 2004. - с.22-25.

5. Степанова М.С., Беляев М.С. Защитное действие карнозина в условиях гипоксической и химической гипоксии. // Актуальные проблемы экологии и природопользования. Выпуск 6 (часть 1). Сборник научных трудов. М.: Изд-во РУДН

2004.-С.18-21.

6. Степанова М.С., Беляев М.С., Стволинский С.Л. Действие карнозина на крыс при гипоксии, отягощенной 3-нитропропионатом. // Нейрохимия — 2005. - т.22, №2 - с.128-132.

7. Беляев М.С., Стволинский С.Л., Орлова B.C. Сравнительная характеристика карнозина и ацетилкарнозина как антигипоксантов в модели гипобарической гипоксии, отягощенной воздействием ингибитора сукцинатдегидрогеназы - 3-нитропропионовой кислоты. // Актуальные проблемы экологии и природопользования. Выпуск 7 (часть 1). Геоэкология, системная экология, экология человека. Сборник научных трудов. М.: Изд-во РУДН - 2005. - с.47-50.

8. Беляев М.С. Состояние мембран эритроцитов человека в зависимости от воздействия различных эндоэкологических факторов. //Актуальные проблемы экологии и природопользования. Выпуск 8 (часть 1). Системная экология. Сборник научных трудов. М.: Изд-во РУДН - 2006. - с.50-53.

9. Стволинский С.Л., Федорова Т.Н., Беляев М.С., Степанова М.С., Булыгина Е.Р., Тюлина О.В., Болдырев A.A. Карнозин: новейшая история давно известного вещества. //Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отдел биологический. Т.112, вып.1., 2007 г. Приложение №1. Биотехнология. Экология. Охрана окружающей среды, с. 107-123.

10. Беляев М.С., Трунова O.A. Карнозин замедляет скорость кислотного гемолиза эритроцитов, отягощенного воздействием гомоцистеиновой кислоты. // Ломоносов - 2008: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых; секция «Биология»; 8-11 апреля 2008 г., Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов/ Сост.: О.Ф. Женавчук, А.Н. Серков. — М.: МАКС Пресс -2008.-280 с. с.31.

11. Болдырев А.А, Беляев М.С., Трунова O.A., Гнездицкий В.В., Максимова М.Ю., Федорова Т.Н. Нейропептид карнозин увеличивает устойчивость липопротеинов и эритроцитов крови и эффективность иммунокомпетентной системы у пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией // Биологические мембраны. — 2008. -Т.25,№8. (в печати).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Беляев, Михаил Сергеевич, Москва

1. Арзуманян Е.С. Защитное действие карнозина на гемолиз эритроцитов, ускоренный гомоцистеиновой кислотой. //Новые лекарственные препараты. М.: 2007. Вып. 9. с. 12-15.

2. Башкиров A.A. Динамика нейрофизиологических и вегетативных процессов адаптации организма к гипоксии в различных экологических условиях. Автореферат на соискание ученой степени доктора медицинских наук. М., РУДН, 1997. — 32 с. с. 2-3.

3. Башкиров А. А. Мультивариантный принцип адаптации организма к экстремальным воздействиям, (с. 106-114) //Актуальные проблемы экологии и природопользования: сб. научн. трудов/ Отв. ред. Ю. П. Козлов, М. Д. Хуторской. М., Изд-во РУДН, 2000. 378 с.

4. Березовский В.А. Реактивность и резистентность организма при гипоксии, (с. 16-17) // Адаптация и резистентость организма в условиях гор. Киев, Изд-во «Наукова думка», 1986.-204 с.

5. Биленко М.В., Вахрушева Т.В., Федосова C.B. Способность эндотелиальных клеток вызывать окисление липопротеинов низкой плотности // Бюл. эксперим. биол.мед. 1998. -126, № 9. - с.314 - 317.

6. Болдырев A.A. О биологическом значении гистидинсодержащих препаратов. // Биохимия. 1986.-т. 51. с. 1930-1943.

7. Болдырев A.A., Курелла Е.Г., Павлова Т.Н., Стволинский C.JL, Федосова Н.У. Биологические мембраны. Практическое руководство для студентов университетов пи высших учебных заведений по специальности «Физиология человека и животных». М., МГУ, 1992.-140 с.

8. Болдырев A.A. Карнозин — Биологическая роль и клиническое применение // Биохимия. 1992. -Т.57. - с.1302-1310.

9. Болдырев A.A. Парадоксы окислительного стресса //Биохимия. 1995. —'Т.60. -с.1536-1542.

10. Болдырев A.A., Куклей M.JI. Свободные радикалы в нормальном и ишемическом мозге. Нейрохимия, Т.13, вып.4, с .271 -278, 1996

11. Болдырев A.A. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. М., МГУ. - 1998. - с.6, 266-269.

12. Болдырев A.A. Карнозин и защита мозга от окислительного стресса. М.: МГУ-Диалог. 1999. - 362 с.

13. Болдырев A.A. Роль активных форм кислорода в жизнедеятельности нейрона.// Усп. Физиол. Наук. 2003 - Т.34, №3 - с. 21-34.

14. Болдырев A.A. Гомоцистеиновая кислота вызывает окислительный стресс лимфоцитов, усиливая токсический эффект NMDA Бюл. Эксперим. И клин. Медицины, 2005, т. 140, №7, С. 39 -41.

15. Болдырев A.A. Почему гомоцистеин является фактором риска нейродегенеративных заболеваний. Нейрохимия, 2006, Т.23, № 3, С. 165-172.

16. Бохан H.A., Прокопьева В.Д. Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на эритроциты in vivo и in vitro. — Томск: Изд-во Том. Ун-та, 2004. — 166 с. с. 62.

17. Братин Е.О., Дергунов А. Д. и др. Роль фосфолипазы А2 в аноксическом повреждении энергозависимых функций митохондрий. // Вопросы медицинской химии. — 1977. Т.23. - №5. - с.673-677.

18. Варакин Ю.Я. Артериальная гипертония и профилактика острых нарушений мозгового кровообращения // Неврологический журнал. 1996. -№3.с. 11-15.

19. Вартанян J1.C., SOD, СОД (Супероксидцисмутаза). Электрон, ресурс. Режим доступа -http://medbiol.ru/medbiol/antioks/00003a03.htm

20. Васькина Г.В., Федорова Т.Н., Стволинский C.JI. Защитное действие карнозина на мозг в постгипоксическом периоде. // В кн.: Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. Материалы Третьей Российской конференции 7-9 октября 2002 г. М. - 2002. — с. 24-25.

21. Верещагин Н.В. Болезни сердца и сосудов. Под ред. Е.И.Чазова М.: - 1992. - Т. 3, с. 226-229.

22. Верещагин Н.В., Моргунов В.А., Гулевская Т.С. Патология головного мозга при атеросклерозе и артериальной гипертонии. М.: Медицина, 1997. - 283 с.

23. Векшин H.JI. Об использовании пирена в качестве люминесцентного индикатора вязкости модельных и биологических мембран. // Биологические науки, №11, 1987 г. с.60-66.

24. Верстенникова H.A., Буров Ю.В.Влияние мексидола на содержание медиаторных моноаминов и аминокислот в структурах головного мозга крыс//Бюл. эксп. биол., № 2, С.170- 173, 1996.

25. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах.- М., Наука, 1972.- 365с.

26. Владимиров Ю.А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции // Соросовский образовательный журнал. Биология. — 1999. №6. с. 25-32.

27. Виноградов А. Д., «Биохимия». М. 1986. - 51, в. 12, с. 1944-1973.

28. Волошина О.Н., Москвитина Т.А. Способ определения моноаминоксидазной активности тромбоцитов. // М.: Лабораторное дело. 1985 - №5. С.-289-291.

29. Воронина Т.А. Антиоксидант мексидол. Основные эффекты и механизм действия // Психофармакол. и биол. наркол. 2001. —№.1, с. 2-12.

30. Гнездицкий В.В. Вызванные потенциалы в клинической практике . М.: Медпресс-информ 1997. - 264с.

31. Горкин В. 3. Аминоксидазы и их значение в медицине. М.: «Медицина» — 1981. -с.270-323. -360 с.

32. Горкин В.З., Медведев А.Е. Режим доступа: http://medbiol.ru/medbiol/endocrinology/000b8ea8.htm (Электрон, ресурс).

33. Гукасян Т.Г., Петросян A.A., Ширинян М. Э., Ширинян Э.А. Катехоламинэргическая система мозга при ишемии //Нейрохимия- 2000. т. 17,№ 1-е. 13-22.

34. Гулевская Т.С. Патология белого вещества головного мозга при артериальной гипертонии с нарушениями мозгового кровообращения. Автореф. дисс. д.м.н., М.: 1993. — 44 с.

35. Гуляева Н.В., Обидин А.Б., Левшина И.П. Карнозин предотвращает активацию свободнорадикального окисления липидов при стрессе. // Бюл. эксп. биол. мед. 1989. Т. 107. №2. С. 144-147

36. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М., Медицина -2001. — 328 с.

37. Дупин A.M., Болдырев A.A., Архипенко Ю.В., Каган В.Е. Защита карнозином транспорта Са2+ от повреждений, вызываемых перекисным окислением липидов // Бюл. эксперим. биол. мед. 1984. - 98,№ 8 - с. 186 - 188.

38. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., Мир, 1991. (с.26.) 544 с.

39. Дьячкова Н. Г., Савина Н. П. Лекарственные препараты медицинского научно-производственного комплекса «Биотики». М., Компьютерный центр НИИ цитохимии и молекулярной фармакологии. 2003. — 32 с. — с. 14-15.

40. Дюмаев K.M., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. М.: 1995.

41. Егоров С. Ю., Курелла Е. Г., Болдырев А. А., Красновский А. А. Тушение синглетного молекулярного кислорода карнозином и анзерином в водных растворах // Биоорг. химия -1992. -Т.18(1). с. 142-144.

42. Зенков Н.К., Кандалинцева П.В., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б., Просенко А.Е. Фенольные биоантиоксиданты. — 2003. Новосибирск: СО РАМН — 328

43. Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга. М., Знание-М, 2000. - 344 стр.

44. Жлоба A.A., Никитина В.В. Выявление и лечение гипергомоцистеинемий. Пособие для врачей. М., Дружба народов, 2004. — 40 с.

45. Зорилова И.В. Молекулярно-генетические факторы риска громбофилических состояний при ишемическом инсульте у пациентов молодого возраста. М.: НИИ неврол. РАМН. Автореферат дисс. на соиск. . канд. мед. наук. 2006.

46. Кадыков A.C., Манвелов Л.С., Шахпаронова Н.В. Хронические сосудистые заболевания головного мозга (Дисциркуляторная энцефалопатия). — ГЭОТАР-Медиа, 2006. -224 с.

47. Калашникова Л. А. Лакунарные инфаркты мозга. Обзор. // Жури, невропатол. и психиатр. 1988. -№1. - с. 134-140.

48. Козлов Ю.П., Данилов B.C., Каган В.Е., Ситковский М.В. Свободнорадикальное окисление липидов в биологических мембранах. — М., МГУ, 1972.

49. Коваленко Е.А., Катков А. Ю., Панков В. Л., Маилян В. С. Новое в проблеме адаптации организма к гипоксии. // Кислородный режим организма и механизм его обеспечения. Барнаул. — 1976. — т.З. — с. 29-30.

50. Коваленко Е. А., Катков А. Ю., Давыдов Г. А., Чабдарова Р. Н. Антигипоксическая эффективность «импульсного» режима барокамерной тренировки человека. // Космическая биология и авиакосмическая медицина. 1981. - №5. — с.56-58.

51. Коваленко Е. А. Проблема гипоксии и адаптационный потенциал. Фармакологическая коррекция гипоксических состояний. — Гродно. 1991. - Т.З. - с.360-370.

52. Кольман Я., Рём К.-Г. Наглядная биохимия: Пер. с нем. М., Мир, 2000. - 469 с.

53. Кондрашова М.Н. Гормоноподобное действие янтарной кислоты.// Вопросы биологической, фармацевтической и медицинской химии. М., №1, 2002. с.7-12.

54. Кривченкова P.C. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в суспензии митохондрий. // Современные методы в биохимии (под ред. В.Н. Ореховича). М., Медицина. 1977. - с.44-46.

55. Кругликов Р.И., Гецова В.М., Орлова Н.В и др. Изменение содержания моноаминов в мозге влияет на реакцию эмоционального резонанса //Журн. высш. нерв. деят. — 1995. -Т.45,№3.-С. 551,

56. Кубатиев A.A., Рудено Т.С., Черниховская Т.И., Сушкевич Г.И., Жданов Р.И. Бюл. экспер. Биол. 1993. - CXV (1), с. 15 - 17.

57. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Белепков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях. (НИИ Кардиологии им. Л. А. Мясникова, пособие для врачей). М., РКНПК МЗ РФ. 2001. - 78 с. - с. 14-39.

58. Ленинджер А. Биохимия. Пер. с англ. М., Мир. - 1974.

59. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. №9, т. 124.-—1997. с.244-253.

60. Маевский Е.И., Розенфельд A.C., Гришина Е.В., Кондрашова М.Н. Коррекция метаболического ацидоза путем поддержания функций митохондрий. Пущино, 2001. 155 с. (с. 100-115).

61. Малкин В.Б., Гиппенрейтер Е.Б. Острая и хроническая гипоксия. // Проблемы космической биологии. М. - 1977. - т. 35. - с.320-331.

62. Максудов Г.А. Дисциркуляторная энцефалопатия. Сосудистые заболевания нервной системы / Под ред. Е.В. Шмидта. М., Медицина, 1975. - с. 501-512.

63. Манвелов Л.С., Кадыков A.C. Дисциркуляторная энцефалопатия. Часть I. // Клин, геронтология. — 2000. Т.6, №9-10. - с.21.-27.

64. Махро A.B., Машкина А.П., Соленая O.A., Трунова О.В., Тюлина О.В., Булыгина Е.Р., Болдырев A.A. Карнозин защищает от окислительного стресса, вызванного гипергомоцистеинемией.// М., Нейрохимия. — 2008. т.25,№3. — с. 1-8.

65. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Слово. 2006. ' - 553 с. с. 3-20.

66. Миррахимов М. М., Калько Т. Ф. Реактивность системы дыхания и резистентность организма в условиях высокогорья. // Адаптация и резистентость организма в условиях гор. Киев, Изд-во «Наукова думка», 1986.-204 с. с. 172-175

67. Практикум по биохимии под ред. С. Е. Севериной и Г. А. Соловьевой. М., МГУ. -1989.-е. 81-82.

68. Панков Д.Д. Синдромология и возможности дифференцированной терапии при ранних клинических формах недостаточности кровообращения мозга // Журн. невропатол. и психиатр. 1982. -Т. 87,№9. с. 1301-1306.

69. Ревенок Е.В, Гнездицкий В.В., Корепина О.С. Вызванные потенциалы в оценке старения и деменции. В кн. «Опыт применения вызванных потенциалов в клинической практике». Под ред. Гнездицкого В.В., Шамшинова A.M. М.: МБН 2001. - с. 160-183.

70. Реймерс Н.Ф. Экология (теории, законы, правила, принципы и гипотезы). М.: Россия Молодая. - 1994.-367 с.

71. Румянцева С.А. Комплексная антиоксидантная терапия реамберином у больных с критическими состояниями неврологического генеза. Электрон, ресурс. 2002. Режим доступа: http://ww\v.polysan.spb.ru/rni2002/rrrixcsng/rrrixcsng.htmn.

72. Смирнова И.Н. Хронические цереброваскулярные заболевания: нарушения перекисного окисления липидов и возможности их фармакологической коррекции. Автореферат . к.м.н. М.: 2003.

73. Стволинский С.Л., Соуза Понтеш Э., Сергиенко В.И., Болдырев A.A. Иммуномодулирующие эффекты карнозина в экспериментах in vitro и in ум).//Биологические мембраны, том 13, №3, 1996. с. 300-306.

74. Стволинский C.J1., Федорова Т.Н., Юнева М.О., Болдырев A.A. Защита Си,гп-СОД карнозином при нарушениях окислительного метаболизма в мозге in vivo // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2003. т. 135, №2.-с. 151-154.

75. Стволинский С.Л., Беляев М.С., Болдырев A.A. Карнозин поддерживает реабилитационные возможности организма в постгипоксическом периоде, отягощенном введением 3-нитропропионовой кислоты. // Науч. Труды МБЦ МГУ под ред. Шестакова и др.-М.-20036.-с. 55-59.

76. Стволинский С.Л., Федорова Т.Н., Болдырев A.A. Карнозин: новые предпосылки для применения в фармакологии // «Новые лекарственные препараты» 2007. - №9.

77. Степанова М.С., Беляев М.С., Стволинский С.Л. Действие карнозина на крыс при гипоксии, отягощенной 3-нитропропионатом. // Нейрохимия, Т. 22, №2. 2005. - с. 128132.

78. Суслина З.А. Лечение ишемического инсульта // Лечение ишемического инсульта // Лечение нервных болезней. 2000. - №1. -с.3-7.

79. Суслина З.А., Федорова Т.Н., Максимова М.Ю., Рясина Т.В.,. Стволинский С.Л, Храпова Е.В., Болдырев A.A. Антиоксидантная терапия при ишемическом инсульте // Журн. неврол. психиатр.-2000.-N10. с.34-38

80. Суслина З.А., Федорова Т.Н., Максимова М.Ю., Ким Е.К. Антиоксидантное действие милдроната и L-кариитина при лечении больных с сосудистыми заболеваниями головного мозга // Ж-л эксп. кл. фарм. — 2003. -Т.66,№3. с.32-35.

81. Суслина 3., Максимова М., Федорова Т. Хронические цсреброваскулярные заболевания: клиническая и антиоксидантная эффективность милдроната // Врач. — 2007. -№4.-с. 1-5.

82. Терсков И.А., Гительзон И.И. Метод химических (кислотных) эритрограмм // Биофизика 1957. -Т. 11, с. 259 - 266.

83. Тюлина О.В., Стволинский С.Л., Каган В.Е., Болдырев A.A. Влияние карнозина и его природных производных на хемилгоминесценцию лейкоцитов, активированных BaS04. //Нейрохимия, том 12, вып. 1, 1995. с. 46-51.

84. Тюлина О.В., Хантельман М.Дж., Прокопьева В.Д., Джоносн П., Болдырев A.A. Влияние этанола на гемолитическую устойчивость эритроцитов. //Биохимия, 2000, т. 65, вып. 2., с. 218-224.

85. Федорова Т.Н., Болдырев A.A., Ганнушкина И.В. Перекисное окисление липидов при экспериментальной ишемии мозга // Биохимия. 1999. - № 1. - с. 94-98.

86. Федорова Т.Н., Стволинский С.Л., Доброта Д., Болдырев A.A. Терапевтическое действие карнозина при экспериментальной ишемии мозга //Вопр. биол. мед. фарм. химии. -2002.-№1.-с. 41-44.

87. Федорова Т.Н. Применение хемилюминесцентного анализа для сравнительной оценки антиоксидантной активности некоторых фармакологических препаратов // Ж-л эксп. кл. фарм. — 2003. т.66, №5 - с.56-58.

88. Федорова Т.Н. Механизмы окислительного стресса и способы защиты головного мозга от ишемического повреждения. Дисс. . д.б.н. НИИ неврологии РАМН. 2003.

89. Фисенко В.П. (председатель), Арзамасцев Е.В., Бабаян Э.А., Булаев В.М. (ответственный секретарь) и др. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., «Ремедиум». 2000. — 398 с. - с. 7-21.

90. Фролов П.Ф., Гитик A.C., Нормак П. Р. и др. Лечение язв желудка и кишечника с помощью Са-ионофореза и диаметрии в чистой форме и в сочетании с карнозином. // Эксп. мед. 1936. - №2. - с.67-68.

91. Чизмаджев Ю.А. Биоэлектрохимия: из прошлого в будущее. // Соросовский Образовательный журнал. — 2000. Т.6. №3. - с.23-27.

92. Шалабодов А.Д., Гусева Н.В. Основы мембранного транспорта. Под ред. Болдырева A.A. Изд-во Тюменского государственного университета, 2001. 162 с.

93. Шаронов Б.П., Чурилова И.В. К механизму инактивации супероксидцисмутазы стимулированными нейтрофилами. //Доклады Академии наук СССР. 1992. Том 322, №1. -с. 185-188.

94. Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Червякова Н.В. Гомоцистеин. М.: Реафарм, 2002. 48 с.

95. Шмидт Е.В. Классификация сосудистых поражений головного и спинного мозга. // Журн. Невропатол. и психиатр. 1985. -№9.-с. 1281-1288.

96. Шпрах В.В., Черняк Б.А., Гецкович Д.А. Прогнозирование развития дисциркуляторной энцефалопатии у больных с гипертонической болезнью с начальными проявлениями недостаточности кровоснабжения мозга // Журн. неврол. и псих. — 1994. -№4. -с.51-55.

97. Якобсон Л.И., Семенова Т.С., Рубанова H.A. Влияние кратковременной гипоксии на каталитические и кинетические свойства митохондриальных ферментов. В кн.: Гипоксия и окислительные процессы. Сб. науч. трудов. -Нижний Новгород. -1992. -С.131-136.

98. Яхно H.H., Виленский Б.С. Инсульт как медико-социальная проблема. //Русский медицинский журнал. -2005. -Т.13. -№ 12. -С.807-815.

99. Abell С. W., Kwan S. W. Molecular characterization of monoamine oxidases A and B. Prog. Nucleic. Acid Res. Mol. Biol., Vol. 65. -2001. p. 129-156.

100. Aketa S., Nakase H., Kamada Y., Hiramatsu K., Sakaki T. Chemical preconditioning with 3-nitropropionic acid in gerbil hippocampal slices: therapeutic window and the participation of adenosine receptor. // Exp Neurol. 2000. - Vol. 166(2), p. 385-391.

101. Albin R.L., Greenamyre J.T. Alternative cxcitotoxic hypothesis. // Neurology. -1992. -Vol.42, p. 733-738

102. Alexi T., Hughes P. E., Faull R. L., Williams C.E., 3-nitropropionc acid's lethal triplet: cooperative pathways of neurodegeneration. // Neuroreport. 1998. - 9(11). - p.54 -57. Abstract.,

103. Andreassen, O. A., Ferrante R. J. et al. Mice with a partial deficiency of manganese superoxide dismutase show increased vulnerability to the mitochondrial toxins malonate, 3-nitropropionic acid, and MPTP. Exp. Neurol., Vol. 167, №1. 2001. p. 189-195.

104. Arshad M., Rajanikant K. Carnosine-related compounds for preventing and treating impaired neurovascular blood flow // United States Patent 20080171095. Kind Code:Al. Publication date 07/17/2008.

105. Baydas G., Koz S.T., Tuzcu M., Nedzvetsky S. Melatonin prevents gestational hyperhomocysteinemia-associated alterations in neurobehavioral developments in rats. //J.Pineal Res. 2008 - Vol. 44, p.181-188.

106. Beal M. F. Neurochemistry and toxin models in Huntington's disease. // Current Opinion Neurology. 1994. - Vol.7. - p.542 - 547.

107. Boers G.H.J., // Mediator 8(2), March 1997, p. 9-11

108. Boldyrev A.A., Severin S.E. The histidine-containing dipeptides, carnosine and anserine: distribution, properties and biological significance // Adv. Enzyme Regul. 1990. - Vol. 30. — p.175-194.

109. Boldyrev A., Abe H., Stvolinsky S., Tyulina O. Comp. biochem. Physiol., 1995, Vol.112b, p. 481-485.

110. Boldyrev A.A., Song R., Lawrence D., Carpenter D.O. Carnosine protects against excitotoxic cell death independently of effects on reactive oxygen species // Neuroscience. — 1999.-Vol.94.- p.571-577.

111. Boldyrev A. A. Carnosine as a modulator of endogenous Zn2+ effects // TRENDS in pharmacological Sciences. 2001. - Vol.22,№3. - p. 112-113.

112. Boldyrev A.A. Carnosine is a natural antioxidant and neuroprotector: biological functions and possible clinical use.//Free radicals, NO, and inflammation: molecular, biochem. Clinical aspects, 2003, pp. 203-217.

113. Boldyrev A.A. Carnosine and Oxidative Stress in Cells and Tissues. NY.: 2006. Nova Publishers. - 297 p.

114. Borlongan C., Koutouzis T., Freeman T., Hauser R., Cahill D., and Sanberg P. Hyperactivity and hypoactivity in a rat model of Huntington's disease: the systemic 3-nitropropionic acid model.// Brain Res. Protection, Vol.1, 1997, p. 253-257.

115. Brouillet E., Jenkins B.G., Hyman B.T., et al. Age dependent vulnerability of the striatum to the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid. // J. Neurochem. 1993. - Vol.60. - P.356-359.

116. Buresh J., Bureshiva O., Huston J. Techniques and Basic Experiments for the study of Brain and Behavior. Amsterdam; N.Y.: Elsevier. — 1983. p. 326.

117. Campbell A.K.//Trends Biochem. Sci. 1986. V.ll. P.104-108

118. Chuanyu Li., Jackson R. M. Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenation injury. // Am. J. Cell. Physiol. 2002. -282: p. 227-241.

119. Clapp-Lilly K.L., Smith M.A., Perry G., Harris P.L., Zhu X., Drew K.L., Duffy L.K. Melatonine exhibits antioxidant properties in a mouse brain slice model of excitotoxity.// International Journal of Circumpolar Health. 2002, vol. 61, p. 32-40.

120. Coyle J.T., Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorder.// Science 1993. - 262, p. 689-695.

121. Determination of homocysteine, Standard operating procedure A.29 HCYS1, Bethesda Hospital, Hoogeveen, The Netherlands

122. Durand P., Prost M., Loreau, N., Lussier-Cacan S., Blache D. Impaired Homocysteine Metabolism and Atherothrombotic Disease// Laboratory Investigation, Vol. 81, No. 5, p. 645, 2001.

123. Droge W. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function. // Physiol. Rev. -2002.-82.-p. 47-95.

124. Eisner J., Kapp A. Reactive Oxygen Release // Methods in Molecular Biology 2000. -Vol.138.-p.153-156.

125. Fedorova T.N., Stvolinsky S.L., Dobrota D., Boldyrev A.A. Carnosine protects brain of rats and Mongolian gerbils against ischemic injury after stroke effect. // J. Alzheimer disease, 2004, 5, p.591.

126. Gallant S., Kukley M., Stvolinsky S.L. Bulygina E. R., Boldyrev A. A. Effect of carnosine on rats under experimental brain ischemia. // Tohoku J. Exp. Med. 2000. - 191. - p. 85-99.

127. Goodin D.S., Aminoff M.J. Electrophysiological differences between subtypes of dementia//Brain- 1986.-v. 109, p. 1103-1113.

128. Gulevitshch W.S., Amiradgibi S. Uber das Carnosin, eine neue organische Base des Flieischextractes // Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1900. B.33. S. 1902 1903

129. Guyot M. C., Hantaraye P., Dolan R. et al. Quantifiable bradykinesia, gait abnormalities and Huntington's disease-like striatum lesions in rats chronically treated with 3-nitropropionic acid. // Neuroscience. 1997. - Vol. 79. - p.45-56.

130. Halliwell B. & Gutterige J.M.C. //in Free Radicals in Biology and Medicine Clarendon Press, Oxford, ed.2, 1989. -p. 1-81.

131. Hamilton, B.F., and Gould, D.H. Correlation of morphologic brain lesions with physiologic alterations and blood-brain impairment in 3-nitropropionic acid toxicity in rats. // Acta Neuropatol. (Berl.), Vol. 74. 1987. - p. 67-74.

132. Hassan H.M. Biosynthesis and regulation of superoxide dismutases. // Free radical Biology '& Medicine, 1988, Vol.5, pp. 377-385.

133. Kang J.H., Kim K.S., Choi S.Y., Kwon H.Y., Won MH, Kang T.C. Protection by carnosine-related dipeptides against hydrogen peroxide-mediated ceruloplasmin modification // Mol. Cells. 2002, Vol.13, p.107-112.

134. Kochanek Patrick M., Hallenbeck John M. Polymorphonuclear Leukocites and Monocytes/Macrophages in the Pathogenesis of Cerebral Ischemia and Stroke. // Stroke, Vol. 23, #9, September 1992. p. 1367-1379.

135. Maragos W. F., Tillman P. A., Jakel R. J. Clorgyline and deprenyl attenuate striatal malonate and 3-nitropropionic acid. // Brain Research, Vol. 834. 1999. - p. 168-172.

136. Mark W. Uhl., Patrick M. Kochanek, Joanne K. Schiding, Edwin M. Nemoto. Effect of Phorbol Myristate Acetate on Cerebral Blood Flow in Normal and Neutrophil-Depleted Rats // Stroke, Vol. 24, #12, December 1993. p.1977-1982.

137. McLaughlin B.A., Nelson D., Erecinska M., Chesselet M.F. Toxicity of dopamine to striatal neurons in vitro and potentiation of cell death by a mitochondrial inhibitor. // J. Neurochem. 1998. - 70. - p. 2406-2415 Abstract.

138. McCord J.M., Fridovich I. Superoxide dismutase: an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein).//J. Biol. Chem. Vol. 244, p.6049-55, 1969.

139. Misra H.P., Fridovich J. // Biochemistry, 1972, Vol. 247. p.3170-3175.

140. Nagai K. Realization of life-sustaining stabilizing-barrier// Intern. Congr.Physiol. Sci., 31st. Helsinki, Finland, 9-14 July. 1989. - p. 3308.

141. Nagai K., Suda T. Realization of spontaneous healing function by carnosine.// Methods and Findings in Exp. Clin. Pharmacol. 1988. - Vol. 10. - p. 497-507.

142. Olanow C.W.A radical hypothesis of neurodegeneration // Trends in neuroscience 1993 -Vol.16, p.439-444.

143. Olinescu R., Kummerow F.A., Handler B., Fleischer L. The Hemolytic Activity of Homocysteine Is Increased by the Activated Polymorphonuclear Leukocytes // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1996. - Vol. 226 (3) p. 912-916.

144. Patel A.K., Hallett M.B., and Campbell A.K. Threshold responses in production of reactive oxygen metabolites in individual neutrophils detected by flow cytometry and microfluorimetry //Biochem J. -1987,- Vol. 248(1). p. 173-180.

145. Pavlov A.R., Revina A.A., Dupin A.M., et al. The mechanism of interaction of carnosine with superoxide radicals in water solutions // Biochem. Biophys. Acta. 1993. Vol. 1157. p. 304312.

146. Patrick M. Kochanek, John M. Hallenbeck. Polymorphonuclear Leukocites and Monocytes/Macrophages in the Pathogenesis of Cerebral Ischemia and Stroke. // Stroke, Vol. 23, #9, September 1992. p. 1367-1379.

147. Popov I. The antioxidant homeostasis in human organism and its characterization by means of chemiluminescent methods.//Abstracts of 2nd International Conference on Clinical Chemiluminescence. Berlin, April 27-30, 1996. D4.

148. Prokop'eva V.D., Lopina O.D., Boldyrcv A. A. Effect of temperature on fluorescence of labels and probes of various localizations incorporated into sarcoplasmic reticulum samples // Biofizika 1983. -Vol.28(l). - p. 40-41.

149. Pulsinelli W.A., Brierley J.B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.//Stroke. 1979. - May-Jun;10 (3) - p. 267-272.

150. Reynolds I.J., Hastings T.G. Glutamate induces the production of reactive oxygen species in cultured forebrain neurons following NMDA receptor activation //J. Neurosci.-1995.-Vol. 15.-p.3318-3327.

151. Sanberg Paul R., Nishino Hitoo, Borlongan Cesario V. Mitochondrial Inhibitors and Neurodegenerative Disorders. Humana Press,, 1999, 313 p. p. 57-59

152. Singer T. P., Gutman M., Kearney, E. B. Multiple control mechanisms for succinate dehydrogenase in mitochondria.// Biochem. Biophys. Res. Commun. -1971. 44: p. 526-532.

153. Singer T. P., Kearney E. B., Kenney W. C. Succinate dehydrogenase // Advances in Enzymology and related subjects to Biochemistry. 1973. - Vol. 37. - p. 417-463. >

154. Smith Nicola C., Dunnet Mark, Mills Paul C., Journal of Chrom. 673 (1995), p. 35-41.

155. Tabrizi S.J., Cleeter M.W., Xuereb J., Taanman J.W., Cooper J.M., and Schapira A.H. Biochemical abnormalities and excitotoxicity in Huntington's disease. // brain. Ann. Neurol.-1999.-45(1).-p. 25-32.

156. Takagi T., Mitsuno Y., Masumura M. Determination of peroxide value by the colorimetric iodine method with protection of iodine as a cadmium complex.// Lipids. 1978. - V. 13, N.2. - p. 147-151.

157. Uhl Mark W., Kochanek Patrick M., Schiding Joanne K., Nemoto Edwin M. Effect of Phorbol Myristate Acetate on Cerebral Blood Flow in Normal and Neutrophil-Depleted Rats. // Stroke, Vol. 24, #12, December 1993. p.1977-1982.

158. Vladimirov Y. A. Studies of antioxidant activity by measuring chemiluminescence kinetics, In Natural Antioxidants: Molecular Mechanisms and Health Effects (L. Packer, M.G. Traber and W. Xin, Eds.) AOSC Press, Champaign, II. - 1996.- p. 124-144.

159. Watanabe E., Schramm J., Strauss C. and Fahlbusch R. Neurophysiology monitoring in posterior fossa surgery //Acta Neurochirurgica. Springer Wien 1989. - Vol.98,(3-4). p. 118-128.

160. Weller M., Paul S.M. 3-Nitropropionic acid is indirect excitotoxin to cultured cerebellar granule neurons. // Eur. J. Pharmacol. 1993. - Vol.248. - P.223-228.

161. Wei G., Hough C J., Sarvey J.M. The mitochondrial toxin, 3-nitropropionic acid, induces extracellular Zn2+ accumulation in rat hippo-campus slices. // Neurosci Lett., 2004. 370(2-3), p. 118-122.

162. Weiss S.J.//Handbook of Inflammation/Ed. Glinn L.E., Houck J.C. Wcissman G.V. 4. Amsterdam-N.Y.-Oxford: Elsevier, 1983. P.37-87.

163. Yap S. Classical homocystinuria: Vascular risk and its prevention // Journal of Inherited Metabolic Disease. -2003,- Vol. 26, № 2-3. p. 259-265.

164. Youdim M.B., Ben-Shachar D., Eshel G., Finberg J.P., Riederer P. The neurotoxicity of iron and nitric oxide. Relevance to the etiology of Parkinson's disease.// Adv Neurol. 1993; vol. 60, p. 259-266.

165. Yuksel M., Haklar G, Yalsin A. S. Chemiluminescence detection of reactive oxygen and nitrogen species in 3-NPA-induced Huntington disease model in rats. // p. 167-171.

166. Zatta P., Zambenedetti P., Milanese M. Activation of monoamine oxidase type-B by aluminum in rat brain homogenate. Neuroreport., Vol. 17., №10. 1999. - p.3645-3648.1. Благодарности