Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм защитного действия ганглиозидов на клетки РС12 при окислительном стрессе

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм защитного действия ганглиозидов на клетки РС12 при окислительном стрессе"

005538735

МЕХАНИЗМ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ ГАНГЛИОЗИДОВ НА КЛЕТКИ РС12 ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

Санкт-Петербург 2013

На правах рукописи

ВЛАСОВА

Юлия Александровна

005538735

Работа выполнена в лаборатории сравнительной нейрохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Научный руководитель: Аврова Наталия Федоровна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Ещенко Наталья Дмитриевна

доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии биолого-почвенного факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Плеснёва Светлана Александровна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эндокринологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Ведущее научное учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится « 10 » декабря 2013 года в ' ^ часов на заседании Диссертационного совета Д 002.127.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М.Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук (194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44)

п/г

автореферат разослан « _ » ноября 2013 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Важность изучения механизма действия нейропротекторов, обладающих антиоксидантными свойствами, определяется тем, что окислительный стресс является одной из основных причин повреждения и гибели нервных клеток мозга при болезнях, связанных с нейродегенеративными и ишемическими поражениями мозга. Эти болезни являются одной из основных причин старческого слабоумия и смерти людей в пожилом возрасте, они широко распространены и являются очень затратными для общества (Leicht et al., 2011; Naylor et al., 2012). Долгое время большие надежды при лечении таких болезней, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, инсульт и травмы мозга связывали с применением высоких доз классических антиоксидантов (прежде всего витамина Е), обладающих способностью прерывать свободно-радикальные цепи, непосредственно реагируя со свободными радикалами. Но анализ результатов клинических испытаний витамина Е показал, что у пациентов с различными болезнями и людей в группах риска, получавших витамин Е в высоких дозах, смертность от разных причин была достоверно выше, чем у людей, получавших плацебо (Muller et al., 2005; Bjelakovic et al., 2007).

По современным представлениям важную роль в защитном эффекте соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, таких, как флавоноиды, Ы-ацетил-Ь-карнозин, карнитин и другие, играет модуляция ими сигнальных систем, которая в большой мере определяет их способность снижать интенсивность окислительного стресса в клетках (Zingg et al., 2007; Kulebyakin et al., 2012). К таким соединениям относятся и ганглиозиды мозга.

Ганглиозиды представляют собой гликосфинголипиды, содержащие сиаловые кислоты. Ганглиозиды являются характерными компонентами мембран нервных клеток. Основные ганглиозиды мозга (GM1, GDI a, GDlb и GTlb) оказывают защитный эффект и предохраняют от гибели нервные клетки мозга при их введении животным, подвергнутым действию ишемии или токсинов (Hadjiconstantinou, Ne ff, 1998; Saito et al., 2007). В опытах in vivo и in vitro чаще всего используется наиболее стабильный ганглиозид GM1. При широкомасштабных клинических испытаниях ганглиозида GM1 (препарата Sygen), как лекарства при инсультах мозга и повреждении спинного мозга, не удалось выявить достоверного долгосрочного улучшения состояния больных (Geisler et al., 2001; Candelise, Ciccone, 2002; Becker et al., 2003; Wahlgren, Ahmed, 2004). По-видимому, для успешных клинических испытаний ганглиозида GM1, необходимо расшифровать механизм его защитного действия на нервные клетки, который пока далек от понимания.

Основные ганглиозиды мозга обладают способностью снижать интенсивность окислительного стресса в клетках, что было впервые показано в работах нашей лаборатории (Avrova et al., 1998, 2002). Затем антиоксидантный эффект ганглиозида GM1 был подтвержден в работах зарубежных исследователей (Fighera et al., 2003, 2006; Sergent et al., 2005; Gorria et al., 2006; Tanaka et al., 2010). Под антиоксидантной активностью нейропротекторов мы

з

о

понимаем их способность снижать аккумуляцию активных форм кислорода (АФК) в нервных клетках и клетках нейрональных линий, предотвращая тем самым развитие в них окислительного стресса. В литературе нам не встретилось исследований зависимости антиоксидантного эффекта GM1 или других основных ганглиозидов мозга от модуляции ими сигнальных путей.

Выяснение механизма действия ганглиозидов может способствовать успешному проведению клинических испытаний этих соединений как лекарств при болезнях, связанных с поражением мозга.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение механизмов защитного и антиоксидантного действия ганглиозидов GM1 и GDla в микро- и наномолярных концентрациях на клетки нейрональной линии PC 12, подвергнутые действию перекиси водорода и бактериального липополисахарида (ЛПС), выявление той роли, которую играет модуляция ганглиозидом GM1 различных протеинкиназ в повышении им жизнеспособности клеток PC 12 и снижении накопления в них АФК в условиях окислительного стресса.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние ганглиозида GM1 и других основных ганглиозидов мозга (GDla, GTla и GTlb) в микро- и наномолярных концентрациях на жизнеспособность клеток PC 12 при действии на них токсических концентраций перекиси водорода.

2. Изучить влияние ингибиторов тирозинкиназы Trk-рецепторов, киназы киназы, регулируемой внеклеточными сигналами 1/2 (киназы ERK1/2 -МЕК1/2), фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), протеинкиназы С (РКС) и протеинкиназы А на защитный и антиоксидантный эффекты ганглиозида GM1 в клетках PC 12, подвергнутых действию перекиси водорода. Методом иммуноблоттинга изучить влияние ганглиозида GM1 на активность тирозинкиназы Trk-рецепторов, ERK1/2 и протеинкиназы В (Akt), которая активируется PI3K, изучить влияние перекиси водорода и преинкубации с ганглиозидом GM1 на активность этих протеинкиназ.

3. Изучить влияние ганглиозида GM1 и ингибитора тирозинкиназы Trk-рецепторов на окислительную инактивацию Na+, К+- АТФазы в клетках PC 12, индуцированную перекисью водорода.

4. Изучить способность ганглиозидов GM1 и GDla повышать жизнеспособность клеток PC 12 и снижать в них накопление АФК при действии на клетки токсических концентраций бактериального ЛПС.

Научная новизна. Впервые изучена роль модуляции активности сигнальных путей ганглиозидом GM1 в реализации его антиоксидантного эффекта. Найдено, что способность GM1 снижать аккумуляцию АФК в клетках нейрональной линии PC 12 в условиях окислительного стресса зависит от активации им тирозинкиназы Trk-рецепторов, активации ERK1/2 и Akt и от модуляции активности РКС.

Впервые найдено, что ганглиозид GM1 в наномолярных концентрациях, повышает жизнеспособность клеток PC 12 и уменьшает в них аккумуляцию

4

АФК в условиях окислительного стресса, причем эти эффекты GM1 зависят от активации им тирозинкиназы Trk-рецепторов. Эти данные представляют интерес в связи с тем, что наномолярные концентрации ганглиозида GM1 и других основных ганглиозидов мозга являются их физиологическими концентрациями в межклеточном пространстве мозга.

Впервые найдено, что способность ганглиозида GM1 в микро- и наномолярных концентрациях уменьшать окислительную инактивацию Na+,K+-АТФазы, индуцированную перекисью водорода в клетках нейрональной линии, не выражена в присутствии ингибитора тирозинкиназы Trk-рецепторов.

Впервые показано, что ганглиозид GM1 повышает жизнеспособность клеток нейрональной линии при действии на них токсических концентраций бактериального ЛПС и снижает в них аккумуляцию АФК.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модуляция ганглиозид ом GM1 активности одних и тех же протеинкиназ определяет как его защитный, так и антиоксидантный эффекты на клетки нейрональной линии PC 12 в условиях окислительного стресса. Эти эффекты опосредуются тирозинкиназой Trk-рецепторов и протеинкиназами, которые активируются после этого фермента - ERK1/2, Akt и РКС.

2. Ганглиозиды GM1 и GDla в наномолярных концентрациях, повышают жизнеспособность клеток нейрональной линии PC 12, подвергнутых действию перекиси водорода, причем этот эффект, как и их эффект в более высоких концентрациях, связан с активацией тирозинкиназы Trk-рецепторов.

3. Ганглиозиды GM1 и GDla повышают жизнеспособность клеток нейрональной линии РС12 при токсическом действии на них бактериального ЛПС и снижают образование АФК в этих клетках. Выявлены различия в механизмах защитного действия ганглиозидов против токсического воздействия перекиси водорода и бактериального ЛПС.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют представления о биологических эффектах основных ганглиозидов мозга. Найдено, что ганглиозиды GM1 и GDla повышают жизнеспособность клеток нейронального происхождения при действии на них природного прооксиданта - перекиси водорода или бактериального ЛПС, а не только возбуждающих аминокислот (Scaper et al., 1991; Avrova et al., 1998; Bachis et al., 2003) или амилоидного бета-пептида (Sokolova et al., 2007; Kreutz et al., 2011).

В настоящей работе показано, что защитный и антиоксидантный эффект на клетки PC 12, подвергнутые действию перекиси водорода, характерен для ганглиозида GM1 и других ганглиозидов в различных концентрациях, вплоть до наномолярных, являющихся физиологическими концентрациями ганглиозидов мозга во внеклеточном пространстве этого органа. Эти данные помогают понять, в каких концентрациях в условиях окислительного стресса эндогенные ганглиозиды, высвобождающиеся в межклеточное пространство мозга при разрушении нервных клеток, вызванном токсическими

воздействиями на мозг, могут оказывать защитный эффект на оставшиеся неповрежденными нейроны.

Проведенное исследование уточняет представления о том, какой вклад вносят протеинкиназы, активирующиеся после активации тирозинкиназы Trk-рецепторов, в защитный эффект ганглиозидов на клетки, имеющие нейрональное происхождение. Такого рода исследования были единичными и фрагментарными (Ruy et al., 1999; Choi et al., 2003). Нами найдено, что активация ганглиозидом GM1 ERK1/2 и Akt, а также модуляция активности РКС вносят свой вклад в повышение им жизнеспособности клеток PC 12 в условиях окислительного стресса.

Выяснение механизма действия на клетки, имеющие нейрональное происхождение, антиоксидантов, таких как флавоноиды, Ы-ацетил-Ь-карнозин, карнитин и другие, эффект которых основан на модуляции сигнальных систем, призвано способствовать более успешному проведению клинических испытаний этих соединений как лекарств при болезнях, связанных с поражением мозга. По-видимому, наиболее эффективным является применение в клинике комплекса природных протекторов, обладающих антиоксидантным действием и взаимодополняющих эффекты друг друга (Prasad et al., 2000; Kedar, 2003; Mancuso et al., 2007). Ганглиозиды, повышающие жизнеспособность клеток и снижающие интенсивность окислительного стресса в них благодаря модуляции активности сигнальных систем, могут стать одним из компонентов такого комплекса.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на конференции с международным участием "Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга" (Санкт-Петербург, 2008), на VIII Международной научно-практической конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010), на научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (Ростов-на-Дону, 2011), на XTV Международном совещание и VII школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), на XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, 5 из которых статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций (в том числе 1 статья в международном журнале), 6 - тезисы докладов.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского министерства образования и науки (грант 14.740.11.0918), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты -06-04-48603,10-04-00315,12-04-31158).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: общей характеристики работы, обзора литературы, глав с изложением материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы,

б

включающего 316 источников, из них 13 отечественных и 303 иностранных. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков и 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили на культуре нейрональной клеточной линии РС12 (АТСС). Клетки выращивали в инкубаторе при 5 % СОг и температуре 37°С в питательной среде DMEM с L-глутамином, содержащей 10 % сыворотки крови плодов коровы и 5 % сыворотки крови лошади, 25 мкг/мл пенициллина и 25 ед/мл стрептомицина.

Жизнеспособность клеток оценивали по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), вышедшей из разрушенных клеток PC 12 в среду инкубации (ЛДГ-метод). Активность ЛДГ в пробах определяли по изменению уровня НАДН, который измеряли по уменьшению оптической плотности при 340 нм на спектрофотометре Specord М40 (Karl Zeisse, Германия) в течение 5-6 минут, как это описано в работе (Vassault, 1983). Процент активности ЛДГ, вышедшей из клеток в результате того или иного воздействия, определяли как процент активности фермента в культуральной среде к суммарной активности ЛДГ в пробах (в клетках и в среде). Ноль процентов жизнеспособности клеток соответствует 100 % активности ЛДГ в среде.

Определение жизнеспособности клеток проводили также МТТ методом, основанным на превращении МТТ (бромида 3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2Н-тетразолия) в окрашенный МТТ-формазан митохондриями живых клеток, как это описано нами ранее (Avrova et al., 2010). Содержание МТТ-формазана в контрольных пробах и жизнеспособность клеток принимали за 100%. Жизнеспособность клеток в пробах выражали в процентах от контроля.

Клетки преинкубировали с ингибиторами К252а, SL327, GF109203X и LY294002 (или без них) в течение 0.5 часа, затем с ганглиозидами GM1, GDla, GDlb и GTlb (или без них) в течение 1 часа. После этого добавляли Н2О2 в конечной концентрации 1.0 мМ и инкубировали в течение 2 часов. При действии на клетки бактериального ЛПС (0.125, 0.25 или 0.5 мг/мл среды) клетки инкубировали с ним в течение 24 часов.

Определение активности протеинкиназы, регулируемой внеклеточными сигналами 1/2 (ERK1/2), протеинкиназы В (Akt) и тирозинкиназы Trk-рецепторов в контрольных клетках PC 12 и в клетках, подвергнутых действию ганглиозида GM1 и перекиси водорода проводили методами иммуноблоттинга и иммунопреципитации. Опыты проводили в бессывороточной среде. Клетки инкубировали со 100 нМ, 1 мкМ или 10 мкМ ганглиозида GM1 в течение 1 часа, затем воздействовали 1.0 мМ Н2О2 в течение 10, 20, 30, 45, 60, 80, 100 и 120 мин. Клетки лизировали в буфере, содержащем фосфатазные и протеазные ингибиторы: 50 мМ Трис (pH 8.0), 150 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ ß-глицерофосфата натрия, 10 мМ NaF, 1 мМ №зУ04, 1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид) и протеазный ингибиторный коктейль (Roche). Концентрацию белка в пробах

7

определяли по методу Лоури (Markwell et al., 1978). Пробы, содержащие 35-40 мкг белка, разделяли в 10% полиакриламидном геле и переносили на PVDF мембрану. Неспецифическое связывание на мембране блокировали фосфатным буфером, содержащим 5% обезжиренного молока (Nestle) и 0,1% Tween 20. Об активности ERK1/2 судили по количеству фосфо-ЕЮСШ (pERKl/2), выявляемому с помощью моноклонального антитела специфического к pERKl (pThr202/pTyr204) и pERK2 (pThr,85/pTyr187) (1:2000, Sigma), об активности Akt судили по количеству фосфо-Akt (pAkt), выявляемому с помощью моноклонального антитела, специфического к pAkt (Ser473) (1:1000, Cell Signaling). Детектирование белков осуществлялось с помощью вторичных антител HRP-IgG (Amersham, GE Healthcare), связанных с пероксидазой хрена. Для нормализации данных мембраны после стриппинга окрашивали на бета-тубулин (1:2000, Sigma), ERK1/2 (1:1000, Cell Signaling) или Akt (1:1000, Cell Signaling). Фотопленки сканировались на сканере Canon (CanoScan 8800F). Денситометрическая обработка данных проводилась с помощью программы NIH Image версия 1.43. Уровень pERKl/2 или pAkt выражали в условных единицах, базальный уровень pERK 1/2 или рAkt в клетках PC 12 принимали за 1.0. Для определения активности тирозинкиназы TrkA-рецепторов применяли метод иммунопреципитации. Изучали воздействие на активность фермента перекиси водорода, 50 нг фактора роста нервов (NGF), 100 нМ, 10 и 50 мкМ GM1. Об активности рецепторной тирозинкиназы судили по уровням pTyr TrkA (140 кДа) и pTyr TrkA (110 кДа).

Определение аккумуляции активных форм кислорода в клетках PC 12 проводили в 6-луночных планшетах (Orange Scientifis, Бельгия). Преинкубацию клеток PC 12 с ингибиторами и ганглиозидами GM1 и GDI а проводили, как это было описано ранее. После этого добавляли 0.5 мМ Н2О2 и клетки инкубировали с ней в течение 0.5, 1 или 2 часов. Флуоресцентный краситель 2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин-диацетат вносили в среду за 20 минут до окончания инкубации с Н2О2 в конечной концентрации 10 мкМ. Для отмывки от избытка красителя клетки осаждали центрифугированием, затем промывали раствором Хэнкса. Флуоресценция продукта реакции АФК с дихлородигидрофлуоресцеином измерялась на спектрофлуориметре Schimadzu 1501 (Япония). Прописывали спектр эмиссии в диапазоне 500-560 нМ при длине волны возбуждения Хех=457 нМ, пик эмиссии наблюдался при длине волны Act,=522 нМ. Содержание АФК выражали в условных единицах, отражающих интенсивность флуоресценции (Cafe, 1995).

Активность Na+,K+-ATOa3bi в клетках РС12 при действии ганглиозида GM1 и перекиси водорода оценивали по сопряженной реакции в присутствии избытка пируваткиназы, лактатдегидрогеназы и фосфоенолпирувата (Leon at al., 1981). Белок определяли модифицированным методом Лоури (Markwell et al., 1978).

Анализ и статистическая обработка данных. Данные, представлены в работе как среднее ± S.E.M. Статистическую достоверность различий между тремя и более группами данных определяли на основании однофакторного

8

дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием Tukey's post hoc теста для множественных сравнений. При сравнении двух групп данных применяли t-критерий Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Влияние ганглиозидов GM1, GDla, GDlb и GTlb на жизнеспособность клеток РС12 в условиях окислительного стресса.

Ганглиозиды GM1, GDla, GDlb и GTlb являются основными ганглиозидами мозга млекопитающих. Показано, что каждый из них достоверно снижает выделение ЛДГ из разрушенных клеток нейрональной линии PC 12, индуцированное Н2О2, т.е. повышает жизнеспособность клеток (рис. 1) Эффект GM1 и GDla наиболее выражен, различия в защитном эффекте 10 мкМ GDla и 10 мкМ GM1 недостоверны (рис. 1А). Ингибирование цитотоксического действия Н2О2 ганглиозидами GDlb и GTlb также является существенным, но оно достоверно ниже, чем у GM1 (рис. 1Б, В).

Рис. 1. Влияние перекиси водорода и ганглиозидов GM1, GDla, GDlb и GTlb на выход ЛДГ из клеток PC 12.

Примечание. Данные на каждом из рисунков (А, Б, В) представляют собой средние ± S.E.M. из трех-четырех параллельных определений в одном типичном опыте из четырех поставленных. На рисунке Н2О2 обозначена как ПВ. Преинкубация проводилась с 10 мкМ каждого из ганглиозидов. Различия достоверны: *- по сравнению с контролем, р<0.01; и -по сравнению с эффектом Н202, -р<0.01, - р<0.05, - различия достоверны по сравнению с эффектом Н202 и GM1, р<0.01.

С увеличением времени инкубации клеток PC 12 с Н202 увеличивается выход ЛДГ из разрушенных клеток в среду инкубации. Достоверное снижение ганглиозидом GM1 выхода ЛДГ из клеток наблюдалось при инкубации клеток с 1 мМ Н2О2В течение 1.5, 2 и 3 часов, но не 0.5 часа (рис. 2).

Найдено, что защитный эффект GM1 тем выше, чем выше его концентрация. Выявлена следующая зависимость защитного эффекта GM1 от его концентрации: 1 нМ < 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ < 10 мкМ < 50 мкМ (Табл. 1).

Для вычисления процента клеток, защищенных от гибели ганглиозидом СМ 1 (табл. 1) вычисляли увеличение высвобождения ЛДГ в среду инкубации в присутствии одной Н202, в присутствии Н2О2 и СМ1, а также разницу между этими величинами. Отношение этой разницы к увеличению высвобождения ЛДГ в присутствии одной Н2О2, которое принимали за 100 %, составляло процент клеток, гибель которых была предотвращена ганглиозидом СМ1 при действии на них Н2О2 (или процент ингибирования СМ1 токсического действия

н2о2).

Рис. 2. Зависимость защитного эффекта ганглиозида СМ1 от времени инкубации клеток РС12 с перекисью водорода.

Примечание. Данные

представляют собой средние ± Л'. Е. М из 3-4 параллельных определений в типичном опыте из 3 поставленных.

На рисунке Н2О2 обозначена как ПВ.

*

Различия достоверны: - по сравнению с контролем, р<0,01, х -по сравнению с эффектом Н2О2, р<0,01.

Таблица 1. Влияние разных концентраций ганглиозида СМ1 на жизнеспособность клеток РС12 при действии на них токсических концентраций перекиси водорода (% клеток, защищенных от гибели ганглиозидом СМ1).

Примечание. Данные

представлены как среднее ± Б.Е.М. по результатам 5 и более опытов (34 параллельных определения в каждом опыте). Различия достоверны *, ** — по сравнению с эффектом одной перекиси, * - р< 0.05, ** - р< 0.02, " - по сравнению с эффектом 1 нМСМ1, р < 0.05, **- по сравнению с эффектом всех более низких концентраций йМ1, р< 0.02.

Проба % клеток PC 12, защищенных от гибели GM1

1 нМ GM1 3.2 ± 1.7

10 нМ GM1 **№ 22.8 ± 2.7

100 нМ GM1 21.5± 4.4

1 мкМ GM1 *# 31.1 ±9.1

10 мкМ GM1 бз.о ± з.з"##

100 мкМ GM1 76.0 ± 3.3**##

Нами показано, что СМ 1 уменьшает выход ЛДГ из клеток РС12, индуцированный Н2Ог (т.е. повышает жизнеспособность клеток). Но в присутствии 1 мкМ ингибитора тирозинкиназы Тгк-рецепторов К252а

защитный эффект СМ 1 не выражен, нет достоверной разницы в выходе ЛДГ из клеток РС12, подвергнутых действию Н2О2 и К252а с одной стороны, и Н202 , СМ] и К252а, с другой стороны (рис. 3). При этом сам ингибитор существенно увеличивает гибель клеток в условиях окислительного стресса.

Рис. 3. Влияние ганглиозида СМ1 и ингибитора тирозинкиназы Тгк-рецепторов К252а на цитотоксический эффект перекиси водорода.

Примечание. Данные представлены как среднее ± Б.Е.М. из 3-5 определений в одном типичном опыте из 3 поставленных. На рисунке Н2О2 обозначена как ПВ. Различия достоверны: * - по сравнению с контролем, р<0,01, по сравнению с эффектом Н2О2, р<0,01, * - по сравнению с эффектом Н202 и СМ1, р<0,01.

Сходные результаты были получены и при использовании МТТ метода. Было показано, что ганглиозид GM1 повышает жизнеспособность клеток, подвергнутых действию перекиси водорода. Но в присутствии К252а защитный эффект ганглиозида GM 1 не выражен.

В присутствии 1 мкМ ингибитора РКС GF109203X, 10 мкМ ингибитора PI3K (LY294002), который предотвращает фосфорилирование и активацию Akt (или протеинкиназы В), а также 10 мкМ ингибитора МЕК 1/2 (SL327), который предотвращает фосфорилирование и активацию ERK1/2, защитный эффект GM1 достоверно уменьшался, но не исчезал (табл. 2). Процент клеток, гибель которых была предотвращена ганглиозидом GM1 в отсутствие ингибитора вычисляли как это было описано ранее, аналогичным образом вычисляли процент клеток, гибель которых была предотвращена GM1 в присутствии ингибитора или смеси ингибиторов (табл. 2), в этом случае ингибитор (или ингибиторы) присутствовали во всех пробах. Значительно большее снижение защитного эффекта GM1 на клетки PC 12 имело место в присутствии в среде не одного из этих ингибиторов, а всех трех ингибиторов. Так, процент клеток, гибель которых была предотвращена ганглиозидом GM1 в присутствии 1 мкМ GF109203X, 10 мкМ SL327 и 100 мкМ LY294002, составляет 20.8±7.4%, в то время как в отсутствие ингибиторов процент «защищенных» клеток составлял в этой серии опытов 57.5±5.0% (различия достоверны, р<0.01). Эти данные показывают, что при одновременном добавлении ингибиторов всех трех протеинкиназ защитный эффект GM1 снижался в 2-3 раза и становился слабо выраженным. Они свидетельствуют, по-видимому, о том, что все три протеинкиназы, активирующиеся после тирозинкиназы Trk-рецепторов (РКС, ERK1/2 и Akt), участвуют в реализации защитного эффекта ганглиозида GM1

на клетки нейрональной линии РС12, причем их эффект, очевидно, является аддитивным.

Наряду с изучением влияния ингибиторов на эффекты СМ1, перед нами стояла задача показать, как ганглиозид ОМ 1 модулирует активность протеинкиназ, участвующих в реализации его защитного эффекта.

Таблица 2. Ингибиторы Р13К, МЕК1/2 и РКС снижают защитный эффект ганглиозида ОМ1 против цитотоксического действия перекиси водорода._____

Проба % клеток, гибель которых предотвращена GM1 Проба % клеток, гибель которых предотвращена GM1

GM1 63.1 ±4.1 GM1 74.9 ±3.7

GM1+1 мкМ GF 48.2 ±3.4* GM1+10 мкМ SL+ 10 мкМ LY 50.9 ±6.2**

GM1 76.2 ±3.2 GM1 57.5±5.0

GM1+ 10 мкМ SL 65.7 ±2.8* GM1±10 мкМ SL+ 100 мкМ LY+1 цМ GF 20.8±7.4**

GM1 70.5±3.8 GM1 + 10 мкМ SL+ 10 mkMLY+1 mkMGF 36.0±6.1 *

GM1+10 мкМ LY 56.7±4.5*

Примечание. Данные представлены как среднее ± S.E.M из 6-7 поставленных опытов. Ингибитор LY294002 обозначен как LY, ингибитор SL327 - как SL, ингибитор GF108293X - как GF. Концентрация GM1 составляла 10 мкМ. Различия достоверны: * и ** — по сравнению с защитным эффектом GM1 на токсическое действие Н202 в отсутствии ингибиторов, * -р< 0.05, ** - р<0.01.

2. Влияние GM1 и перекиси водорода на активность тирозинкиназы Trk-рецепторов (уровень pTyr TrkA), Akt (уровень pAkt) и ERK1/2 (уровень pERKl/2) и на экспрессию этих протеинкиназ в клетках РС12.

Ганглиозид GM1 не влиял на экспрессию тирозинкиназы Trk-рецепторов - на уровень TrkA (рис. 4), но увеличивал уровень её фосфорилированной формы (pTyr TrkA). Как видно из представленных на рисунке 4 данных, в контроле pTyr TrkA не была выявлена. Уровень экспрессии pTyr TrkA при действии одного NGF в относительно небольших концентрациях в условиях наших опытов был низким. Но при действии ганглиозида 100 нМ, 10 и 50 мкМ GM1 на фоне той же концентрации NGF уровни pTyr TrkA (140 кДа) и pTyr TrkA (110 кДа) были хорошо выражены, что говорит об активации TrkA под влиянием различных концентраций ганглиозида GM1.

Ганглиозид GM, мкМ

pTyrTrkA (140 кДа) рТуг TrkA (110 кДа)

TrkA (140 кДа) TrkA (110 к Да)

0.1

ии» тт

ШШ

Рис. 4. Влияние различных концентраций ОМ1 на активность тирозинкиназы Тгк-рецепторов (уровень рТуг ТгкА).

Примечание. На рисунке представлены данные о том, как изменяется уровень рТуг ТгкА и общий уровень ТгкА в клетках РС12 после инкубации с различными концентрациями ганглиозида СМ1 и с ЫСЬ\

Изучение влияния ганглиозида GM1 на базальную активность Akt (уровень pAkt) в клетках РС12 показало, что 100 нМ и 10 мкМ GM1 достоверно увеличивает уровень pAkt через 30 и 45 минут после добавления к клеткам, при этом суммарная экспрессия Akt не изменяется (рис. 5 А и Б).

А. Инкубация со 100 пМ GM1

Время

(минуты) 0 1 5 10 15 20 30 45 60

>Akt

Ser473)

уммарное kt

Инкубация с 10 мкМ GM1

0 1 5 10 15 20 30 45 60

О 1 5 10 15 20 30 45 60 Время инкубации с ганглиовидом GM1, мин

Рис. 5. Влияние ганглиозида GM1 на базальный уровень pAkt и экспрессию Akt в клетках PC 12

Примечание. А. Результаты одного типичного опыта из 4 опытов (иммуноблотт). Б. Данные представляют собой средние ± S.E.M. из 4 поставленных опытов. Квадратами обозначен эффект 100 нМ GM1, ромбами — эффект 10 мкМ GMI. Различия достоверны по сравнению с уровнем pAkt в контроле (принятым за 1.0) согласно t-критерию Стьюдента (метод попарных сравнений): *р<0.05, **р<0.02

При действии Н2О2 уровень рАк! возрастает, что говорит об активации этого фермента, ганглиозид ОМ1 в концентрациях 100 нМ и 10 мкМ не меняет

степень активации этого фермента при действии Н2О2. Перекись водорода, как

и ОМ1 не изменяет экспрессию Ак1 клетками РС12.

Влияние ганглиозида СМ1 на активность ЕЫК1/2 (уровень рЕЫК1/2)

и ее экспрессию в клетках РС12 было также изучено. Показано, что 10 мкМ

СМ1 активирует эту протеинкиназу в клетках РС12, тогда как более низкие

концентрации ганглиозида (10 и 100 нМ) достоверно не изменяют базальную

активность фермента (рис. 6). „

Рис. 6. Влияние различных

концентраций ганглиозида вМ1

на базальный уровень рЕЯК1/2)

в клетках РС12.

Примечание. Данные

представляют собой средние ±

Б.Е.М. из 4 поставленных опытов.

Клетки инкубировали с разными

концентрациями ОМ1 (100 нМ, 1

мкМ, 10 мкМ). Различия между

уровнем рЕЯК в контроле и при

действии 10 мкМ СМ!

достоверны: **р<0.01.

.........................................................................................................** I

—

О 0,1 1 10

КОНЦЕНТРАЦИЯ ОУИ, мкМ

Рис. 7. Влияние перекиси водорода и ганглиозида ОМ I на уровень рЕЮС1/2 в клетках РС12.

Примечание. Данные представляют собой средние ± Б.Е.М. из 5 поставленных опытов. Клетки инкубировали с СМ1 в течение 1 часа, затем с 1.0 мМ Н2О2 в течение 2 часов. А. 100 нМ ОМ1. Б. 10 мкМ ОМ1. Линией с квадратами обозначен эффект Н2О2, а линией с ромбами - эффект Н2О2 после инкубации с ОМ1. Различия между эффектом одной Н2О2 и Н2О2 после инкубации с ОМ1 достоверны согласно г критерию Стьюдента (метод попарных сравнений): *р<0.05.

Перекись водорода вызывает ярко выраженную активацию Е11К1/2, а преинкубация с ганглиозидом СМ1 еще больше увеличивает активацию этой

протеинкиназы (рис. 7). Увеличение уровня рЕШСШ под влиянием 100 нМ и 10 мкМ ОМ1 было достоверным через 20 минут после воздействия перекиси водорода. Кроме того, преинкубация с 10 мкМ СМ1 достоверно увеличивала активность ЕКК1/2 еще и через 30 и 45 минут после начала воздействия перекиси водорода (рис. 7).

3. Метаболические эффекты гаиглиозида вМ1 на клетки РС12, подвергнутые действию токсических концентраций перекиси водорода. Ганглиозид вМ1 обладает способностью снижать образование активных форм кислорода (АФК), индуцированное Н202 в клетках РС12. При действии на клетки Н202 в них происходит увеличение образования АФК (рис. 8). Преинкубация клеток с 10 мкМ ОМ1 достоверно снижает образование АФК, индуцированное 0.5 мМ перекисью водорода, при ее действии в течение одного или двух часов (рис. 8). Но при воздействии Н202 в течение 0.5 часа эффект ОМ1 на образование АФК еще не проявляется.

Способность ганглиозида вМ1 снижать образование АФК не проявляется в присутствии 1.0 мкМ К252а (ингибитора тирозинкиназы Тгк-рецепторов) ни через 1 час, ни через 2 часа после воздействия Н202. Образование АФК в клетках РС12 под действием Н202, К252а и ОМ1 не отличалось от образования АФК в клетках под действием одной Н202 (или под действием Н202 в присутствии К252а), но было выше, чем при действии на клетки Н202 и ОМ1 (рис. 8). Это позволяет полагать, что способность ОМ1 снижать индуцированное Н202 накопление АФК в клетках РС12 опосредуется активацией тирозинкиназы Тгк-рецепторов.

0,5 ЧАСА

400 350 300 250 200 150 100 50 0

1 ЧАС 2 ЧАСА

*

I

*хх

......Г*1

с? оГ

у

о* &

„^

У

Рис. 8. Влияние ганглиозида вМ1 и ингибитора тирозинкиназы Тгк- рецепторов на образование АФК в клетках РС12 при разном времени их

инкубации с перекисью водорода.

Примечание. Данные представляют собой средние ± Е. М. из трех параллельных определений в одном типичном опыте из 4 поставленных. На рисунке Н202 обозначена как ПВ. Данные по накоплению А ФК выражены в условных единицах измерения. Различия достоверны: * - по сравнению с контролем, р <0.01, х и хх - по сравнению с эффектом одной Н202 ,хх-р <0.05, х-р <0.01.

Нами также исследовалось влияние ингибиторов протеинкиназ, активирующихся после тирозинкиназы Trk-рецепторов (Akt, ERK1/2 и РКС) на способность GM1 уменьшать или практически предотвращать накопление АФК в клетках PC 12, индуцированное Н202 (рис. 9). Показано, что этот эффект ганглиозида практически не проявляется в присутствии ингибитора МЕК 1/2 SL327 (рис. 9 А), предотвращающего фосфорилирование и активацию ERK1/2, и в присутствии ингибитора PI3K LY294002 (рис. 9 Б), предотвращающего фосфорилирование и активацию Akt. Достоверно уменьшалась способность GM1 снижать индуцированное Н202 накопление АФК в клетках PC 12 и под воздействием ингибитора РКС GF108293X (рис. 9 В), но его воздействие было менее выраженным, чем эффект SL327 и LY294002.

250 ^ 200 I 150 $ 100 В 50 а * я в *

1*1 хх ... 1 Sa : 1!

у «< <- &

Рис. 9 . Влияние ингибиторов МЕК 1/2, РОК и РКС на способность ганглиозида ОМ1 снижать накопление АФК в клетках РС12, вызванное Н202.

Примечание. Данные представляют собой средние ± Б. Е. М. из трех параллельных определений в одном типичном опыте из четырех-шести опытов. На рисунке Н202 обозначена как ПВ, Ы294002 как Ы, 31327 как БЬ, ОРШ293Х как СЖ Данные по накоплению АФК выражены в условных единицах измерения. А. Эффект 10 мкМ £У294002. Б. Эффект 10 мкМ $Ъ327 В. Эффект 1 мкМ СЕ!0829ЗХ. Различия достоверны: * — по сравнению с контролем, * р <0.01, х и хх - по сравнению с эффектом одной Н2О2 , Х -р <0.05, х -р <0.01, * - по сравнению с эффектом Н202 и СМ1,"-р<0.01.

Нами было показано также, что ганглиозид ОМ1 способен уменьшать накопление АФК, вызванное Н202 в клетках РС12, не только в микромолярных, но и в наномолярных концентрациях, причем эффект ОМ 1 в наномолярных концентрациях также не проявляется в присутствии ингибитора К252а.

Перекись водорода вызывает окислительную инактивацию Ыа+,К+-АТФазы в клетках РС12, достоверно снижая ее активность. Преинкубация с СМ1 в микро- и наномолярных концентрациях повышает активность фермента, в значительной мере предотвращая эффект Н202. Но в присутствии ингибитора тирозинкиназы Тгк-рецепторов К252а (1 мкМ) этот эффект 10 нМ и 10 мкМ СМ1 практически не выражен (табл. 3).

Таблица 3. Эффект перекиси водорода, ганглиозида вМ1 и ингабитора К252а на активность Ыа ,К -АТФазы в клетках РС12 (мкмоль Р,/мг белка/час)

Проба Активность Na+,K+- АТФазы Проба Активность Na+,K+- АТФазы

Контроль 57.4±0.9 Контроль 62.6±4.1

Контр.+ЮмкМ GM1 60.4±1.25 Контр.+Ю нМ GM1 58.0±2.4

Коптроль+К252а 58.2±1.15 Контроль + К252а 57.8±2.8

н2о2 36.9±2.7* Н202 33.2±2.8*

H202+10 мкМ GM1 45.9±1.3»х Н202+10нМ GM1 49.2±2.2Х

Н202+ 10 мкМ GM1 +К252а 36.1±2.0*" Н202+10нМ GM1 + К252а 40.2±3.2*

Н202 + К252а 33.2±1.8» Н202 + К252а 39.1±4.1*

описано в разделе «Материалы и методы исследования. В опытах использовали ингибитор К252а в концентрации 1 мкМ. Данные представляют собой среднее ± S.E.M. из четырех поставленных опытов. Различия достоверны: *— по сравнению с

контролем, р<0.01, Х - по сравнению с эффектом одной Н2О2, р<0.02, - по сравнению с эффектом Н202 и GM1, р<0.05.

4. Защитное действие ганглиозидов против токсического эффекта на клетки РС12 бактериального липополисахарида (ЛПС). Защитный эффект ганглиозидов на нервные клетки и клетки нейрональных линий наблюдается против действия тех токсинов, которые увеличивают интенсивность окислительного стресса в клетках - глутамата (Scaper et al., 1991; Avrova et al., 1998; Bachis et al., 2003), амилоидного бета-пептида (Avrova et al., 2010, Kreutz et al., 2011), перекиси водорода (настоящая работа). Представляло интерес выяснить, способны ли ганглиозиды мозга уменьшать гибель клеток нейрональной линии при действии бактериального ЛПС, который также активирует свободнорадикальные реакции в клетках. Найдено, что ЛПС из Escherichia coli серотипов 0111:В4 и 055:В5 оказывает токсический эффект на клетки нейрональной линии PC 12, что согласуется с данными, полученными при изучении эффектов ЛПС на нервные клетки и клетки нейрональных линий (Sharifi et al., 2010, Ansari et al., 2010, 2011, Dodd, Filipov, 2011). Но данных о защитном эффекте ганглиозидов на клетки РС12 нам не встретилось.

Нами показано, что ганглиозиды GM1 и GDI а в микромолярных концентрациях повышают жизнеспособность клеток PC 12 (табл. 4), а также снижают накопление АФК в клетках, индуцированное ЛПС. Ранее защитный эффект ганглиозидов против токсического действия ЛПС был показан только на клетках кишечника (Park et al., 2010, 2011). Впервые показано, что защитный эффект GM1 и GDI а против действия ЛПС не зависит от активации тирозинкиназы Trk-рецепторов в отличие от защитного эффекта GM1 против

17

действия глутамата (ВасЫв е1 а1., 2002) и перекиси водорода (настоящая работа). Так, нами показано, что защитный эффект ганглиозидов ОМ1 и СО 1а против токсического действия ЛПС сохраняется и в присутствии ингибитора тирозинкиназы Тгк-рецепторов К252а, причем не наблюдалось даже уменьшения их защитного действия в его присутствии. Так, ЛПС серотипа 0111 :В4 снижал количество жизнеспособных клеток РС12 практически до нуля, в то время, как преинкубация клеток с вМ1 в отсутствие и в присутствии К252а увеличивала количество жизнеспособных клеток до 65.4±12.9 и 73.7±9.5, соответственно, эффект ингибитора не достоверен (р>0.05).

Таблица 4. Влияние липополисахарида, ганглиозидов GM1 и GDla на жизнеспособность клеток PC 12 (МТТ-метод)__

Контроль 100 % Контроль 100 %

Контроль + 50 мкМ GM1 93.3±3.2 Контроль + 50 мкМ GDla 99.4+1.1

Контроль +100 мкМ GM1 95.2±6.3 Контроль +100 мкМ GDla 101.6+1.1

0,125 мг/мл ЛПС 37.8+5.5* 0,25 мг/мл ЛПС 3.2+1.7*

ЛПС (0,125)+50мкМ GM1 72.6±6.0*Х ЛПС (0,25)+50 мкМ GM1 34.6+14.1 *х#

ЛПС (0,125)+100 мкМ GM1 73.5+10.3 *Х ЛПС (0,25)+100 мкМ GM1 65.4+12.9*Х

ЛПС (0,125)+50 мкМ GDla 69.4±3.7*Х ЛПС (0,25)+50 мкМ GDla 55.0+10.6*Х

ЛПС (0,125)+100мкМ GDla Не опред. ЛПС (0,25)+100мкМ GDla 64.5+3.7 *Х

Примечание. Данные представлены как среднее ± S.E.M из 4-5 поставленных опытов. В опытах использовали ЛПС серотипа 0111:В4. Жизнеспособность клеток определяли МГТметодом и принимали за 100 % в контроле. Различия достоверны: * -

по сравнению с контролем, р<0.01, - по сравнению с эффектом одного ЛПС, р<0.01, *-по сравнению с эффектом 100мкМGDla, *-р<0.05

Нами не выявлено достоверного увеличения жизнеспособности клеток PC 12, подвергнутых действию ЛПС, под влиянием ганглиозидов в наномолярных концентрациях, хотя такие концентрации оказывают защитный эффект против действия перекиси водорода на клетки. Выявлено сходство защитных эффектов на клетки PC 12 ганглиозида GDla, с одной стороны, и метил-бета-циклодекстрина, разрушающего структуру липидных рафтов, с другой стороны. Эти и другие полученные данные позволяют предполагать, что способность экзогенных ганглиозидов GM1 и GDla снижать, а в некоторых случаях практически предотвращать токсический и метаболические эффекты

is

ЛПС на клетки PC 12, связана с изменением структурной и функциональной организации липидных рафтов в клеточных мембранах.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Повышение под влиянием GM1 и других основных ганглиозидов мозга жизнеспособности нервных клеток и клеток нейрональных линий в культуре, подвергнутых действию возбуждающих аминокислот, показано во многих работах (Skaper et al., 1990; Mahadik et al., 1992; Avrova et al.,1998; Matsuoka et al., 2003). Защитный эффект ганглиозида GM1 выявлен и против длительной инкубации клеток в бессывороточной среде (Ferrari et al., 1995, 1995) или действия амилоидного бета-пептида (Sokolova et al., 2007; Kreutz et al., 2011). Нами показано, что ганглиозиды GM1, GDla, (а также GDlb и GTlb) повышают жизнеспособность клеток нейрональной линии PC 12 при действии на них перекиси водорода или бактериального ЛПС. Полученные данные расширяют представления о нейропротекторном эффекте ганглиозидов.

Установлено, что защитным эффектом против действия на клетки PC 12 перекиси водорода ганглиозиды GM1 и GDla обладают не только в микро-, но и в наномолярных концентрациях. Эти результаты согласуются с данными, об увеличении под влиянием 10 нМ GM1 и GDla жизнеспособности первичных культур нейронов мозжечка, подвергнутых действию глутамата (Avrova et al., 1998). Но в наших опытах эффект ганглиозидов GM1 и GDla был достоверно ниже в нано-, чем в микромолярных концентрациях, а защитные эффекты 10 нМ и 10 мкМ GM1 (как и 10 нМ и 10 мкМ GDla) на первичные культуры нейронов мозжечка при действии глутамата на эти клетки достоверно не отличались между собой (Avrova et al., 1998). Нам не встретилось других свидетельств защитного эффекта ганглиозидов мозга в наномолярных концентрациях на нервные клетки или клетки нейрональных линий, кроме данных, полученных в нашей лаборатории. Между тем именно наномолярные концентрации являются физиологическими концентрациями ганглиозидов в межклеточном пространстве мозга, в таких концентрациях они осуществляют воздействие на нервные клетки мозга in vivo.

Наши результаты о зависимости защитного эффекта ганглиозида GM1 против действия на клетки Н2О2 от активации тирозинкиназы Trk-рецепторов в клетках PC 12, согласуются с данными других работ (Ferrari et al., 1995; 1996, Bachis et al., 2002). В этих работах изучали механизм защитного эффекта GM1 при токсическом действии на клетки бессывороточной среды или возбуждающих аминокислот. Было показано, что ганглиозид GM1 (как и NGF) значительно уменьшает гибель этих клеток благодаря активации тирозинкиназы Trk-рецепторов и повышению её аутофосфорилирования. В присутствии ингибитора фермента К252а защитный эффект ганглиозида GM1 резко снижается или практически отменяется (Ferrari et al., 1995, 1996; Bachis et al., 2002; Duchemin et al., 2002, 2008)

В отличие от хорошо изученной роли тирозинкиназы Trk-рецепторов в реализации защитного эффекта GM1, исследования того, модуляция каких протеинкиназ, активирующихся после этого фермента, определяет повышение

19

жизнеспособности клеток при воздействии ганглиозида GM1, являются единичными и неполными (Ryu et al., 1999; Choi et al., 2003). Наши результаты о зависимости защитного эффекта ганглиозида GM1 от активации ERK1/2 согласуются с данными, полученными при изучении защитного эффекта GM1 на нейроны сетчатки глаза при перерезке зрительного нерва (Choi et al., 2003). Этими авторами найдено, что введение GM1 предохраняет нейроны сетчатки от гибели и приводит к увеличению уровня pERKl/2 и pCREB (фактора транскрипции). Добавление ингибитора МЕК 1/2, предотвращающего фосфорилирование и активацию ERK1/2, приводило к снижению защитного действия ганглиозида GM1 на нейроны сетчатки (Choi et al., 2003). Наши данные о том, что ингибитор PI3K, предотвращающий фосфорилирование и активацию Akt, снижает протекторный эффект ганглиозида GM1, согласуются с результатами, полученными на первичных культурах нейронов коры мозга, подвергнутые действию глутамата (Ryu et al., 1999). Данные, полученные нами с использованием ингибиторов протеинкиназ, активирующихся после тирозинкиназы Trk-рецепторов, а также с помощью метода иммуноблоттинга показывают, что активация ганглиозидом GM1 Akt и ERK1/2 и модуляция активности РКС в клетках PC 12 вносят заметный вклад в реализацию его защитного эффекта. При этом влияние модуляции активности этих протеинкиназ ганглиозидом GM1 на его защитный эффект является, очевидно, аддитивным.

Способность ганглиозидов достоверно снижать индуцированное токсинами накопление АФК или продуктов перекисного окисления липидов (Avrova et al., 1998, 2002), была впервые показана в работах нашей лаборатории, а затем подтверждена в работах зарубежных исследователей (Yamomoto, Mohanan, 2003; Fighera 2003, 2006; Sergent et al., 2005; Gorria et al., 2006). В настоящей работе впервые найдено, что способность GM1 снижать интенсивность окислительного стресса в клетках, индуцированного действием на них токсинов, зависит от модуляции этим ганглиозидом сигнальных путей. Так, в присутствии ингибитора тирозинкиназы Trk-рецепторов К252а способность ганглиозида GM1 снижать накопление АФК и окислительную инактивацию Ыа+,К+-АТФазы в клетках PC 12, индуцированные Н2О2, не проявляется. Ингибиторы протеинкиназ, активирующихся после тирозинкиназы Trk-рецепторов, достоверно снижают способность GM1 уменьшать интенсивность окислительного стресса в клетках PC 12, индуцированное Н2О2. Впервые показано, что повышение жизнеспособности клеток и снижение в них аккумуляции АФК ганглиозидом GM1 при действии перекиси водорода на клетки РС12 зависят от активации одних и тех же сигнальных путей. Это позволяет полагать, что способность ганглиозидов уменьшать интенсивность окислительного стресса в клетках играет важную роль в механизме их защитного эффекта.

При изучении механизма защитного эффекта ганглиозидов GDla и GM1 против токсического действия ЛПС на клетки РС12 было показано, что их эффект не зависит от модуляции активности тирозинкиназы Trk-рецепторов и

20

сходен с эффектом метил-бета-циклодекстрина, нарушающего структуру рафтов. Не выявлен защитный эффект GDI а и GM1 в наномолярных концентрациях против действия ЛПС. Ганглиозиды, как и холестерин, являются основными компонентами липидных рафтов, изменяя состав рафтов, они могут изменять активность рецепторов и других компонентов сигнальных систем клетки (Prinetti et al., 2001; Sonnino, Prinneti, 2010). Имеются данные о том, что встраивание основных ганглиозидов мозга GM1, GDla и GDlb в наружную мембрану моноцитов ингибирует вызванную ЛПС активацию рецепторов TLR4 и TLR5 (Shen et al., 2008). Результаты исследования позволяют предполагать, что снижение или практическое предотвращение экзогенными ганглиозидами GDla и GM1 эффектов ЛПС на клетки РС12 связаны с изменением структурной и функциональной организации липидных рафтов в мембранах клеток под влиянием вошедших в их состав ганглиозидов. Это может в значительной мере предотвращать передислокацию рецептора TLR4 в рафты в мембранах клеток PC 12 под влиянием ЛПС и его активацию, приводя к значительному уменьшению токсического и метаболических эффектов ЛПС на клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе найдено, что ганглиозиды GM1, GDla (а также GDlb и GTlb) повышают жизнеспособность клеток нейрональной линии PC 12 при воздействии на них такого природного прооксиданта как перекись водорода или бактериального ЛПС. Эти данные расширяют представления о нейропротекторном эффекте ганглиозидов. Установлено, что защитным эффектом против действия перекиси водорода на клетки PC 12 ганглиозиды GM1 и GDla обладают не только в микро -, но и в наномолярных концентрациях. Получены свидетельства зависимости защитного эффекта GM1 на клетки PC 12, подвергнутые действию Н2О2, от активации тирозинкиназы Trk-рецепторов. В защитный эффект GM1 существенный вклад вносит активация Akt и ERK1/2, а также модуляция активности РКС. Впервые показано, что повышение жизнеспособности клеток и снижение в них аккумуляции АФК ганглиозидом GM1 при действии Н202 на клетки PC 12 зависят от активации одних и тех же сигнальных путей. Способность ганглиозидов уменьшать интенсивность окислительного стресса в клетках играет, по-видимому, важную роль в механизме их защитного эффекта.

Полученные данные позволяют предполагать, что способность экзогенных ганглиозидов GDla и GM1 снижать, а в некоторых случаях практически предотвращать токсические и метаболические эффекты ЛПС на клетки PC 12, связана с изменением структурной и функциональной организации липидных рафтов в клеточных мембранах.

В дальнейшем предстоит выяснить, каким образом модуляция ганглиозидами активности сигнальных путей в условиях окислительного стресса приводит к повышению жизнеспособности нервных клеток. Активация ганглиозидами протеинкиназ, а затем факторов транскрипции может усиливать экспрессию и активность белков антиоксидантной защиты или ферментов

21

синтеза глутатиона. Вероятным является также увеличение экспрессии антиапоптотических белков (Вс1-2 и других) и уменьшение экспрессии или изменение степени фосфорилирования и инактивации проапоптотических белков (Вах, Bäk и других). Это может приводить к снижению накопления АФК в клетках, к уменьшению нарушений проницаемости и функций митохондрий и, как следствие, к повышению жизнеспособности клеток. Выяснение механизма действия природных соединений, эффект которых основан на модуляции сигнальных путей и приводит к снижению интенсивности окислительного стресса в нервных клетках, важно для успешного проведения их клинических испытаний как лекарств при болезнях, связанных с поражением мозга. Возможно создание комплекса таких соединений, взаимодополняющих эффекты друг друга, в состав которого войдут ганглиозиды.

ВЫВОДЫ

1) Найдено, что основные ганглиозиды мозга (GM1, GDla, GDlb и GTlb) повышают жизнеспособность клеток нейрональной линии РС12 в условиях окислительного стресса, вызванного перекисью водорода, причем эффект ганглиозидов GM1 и GDla более выражен, чем эффект GDlb и GTlb.

2) Методом иммуноблоттинга и иммунопреципитации показано, что ганглиозид GM1 активирует в клетках РС12 тирозинкиназу Trk-рецепторов, увеличивает базальную активность протеинкиназы В (Akt) и киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK1/2). Активация этих протеинкиназ происходит в клетках PC 12 и при индукции в них окислительного стресса, причем ганглиозид GM1 достоверно увеличивает активацию ERK1/2, вызванную действием на клетки перекиси водорода.

3) Впервые показано, что повышение жизнеспособности клеток PC 12 и снижение в них аккумуляции активных форм кислорода ганглиозидом GM1 при действии на клетки Н2О2 зависят от активации одних и тех же сигнальных путей. Эти эффекты GM1 не выражены в присутствии ингибитора тирозинкиназы Trk-рецепторов и достоверно снижены в присутствии ингибиторов Akt, ERK1/2 и протеинкиназы С.

4) Впервые показано, что ганглиозид GM1 не только в микро-, но и в наномолярных концентрациях, являющихся его физиологическими концентрациями во внеклеточном пространстве мозга, повышает жизнеспособность клеток PC 12, снижает накопление активных форм кислорода и окислительную инактивацию Na+, К+-АТФазы в этих клетках, индуцированные перекисью водорода, причем все эти эффекты не выражены в присутствии ингибитора тирозинкиназы Trk-рецепторов.

5) Показано, что ганглиозиды GDla и GM1 в микромолярных концентрациях повышают жизнеспособность клеток PC 12 и снижают накопление активных форм кислорода в этих клетках, подвергнутых действию бактериального липополисахарида (ЛПС), причем защитный эффект ганглиозидов, по-видимому, связан с изменением состава рафтов в наружной мембране клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в рецензируемых научных изданиях (в соответствии с перечнем ВАК):

1. Соколова, Т.В. Снижение нейропротекторного эффекта ганглиозида GM1 на клетки PC 12 в условиях окислительного стресса в присутствии ингибитора тирозинкиназы Trk-рецепторов / Т.В. Соколова, И.О. Захарова, В.В. Фураев, М.П. Рычкова, Ю.А. Власова. Н.Ф. Аврова // Ж. эвол. биохим. и физиол. - 2008,- Т. 44. - № 4. - С. 373-379.

2. Власова. Ю.А. Роль тирозинкиназы Trk-рецепторов в реализации антиоксидантного эффекта ганглиозида GM1 в клетках РС12 / Ю.А. Власова, И.О. Захарова, Т.В. Соколова, В.В. Фураев, М.П. Рычкова, Н.Ф. Аврова // Ж. эвол. биохим. и физиол. - 2009. - Т. 45. - № 5. - С. 465-471.

3. Avrova, N.F. Protective and antioxidative effects of GM1 ganglioside in PC12 cells exposed to hydrogen peroxide are mediated by Trk tyrosine kinase / N.F. Avrova, T.V. Sokolova, Y.A. Vlasova. I.O. Zakharova, V.V. Furaev, M.P. Rychkova // Neurochem. Res. - 2010. - V. 35. - No.l. - P. 85-98.

4. Баюнова, Л.В. Защитный эффект ганглиозида GDla и ингибиторов синтазы оксида азота при действии на клетки PC 12 бактериального липополисахарида // Л.В. Баюнова, Ю.А. Власова. Т.В. Соколова, И.О. Захарова, Р.Г. Парнова, Н.Ф. Аврова // Нейрохимия. - 2012. - Т. 29. - № 4. - С. 305-311.

5. Власова. Ю.А. Метаболические эффекты ганглиозида GM1 на клетки PC 12 при окислительном стрессе зависят от модуляции активности тирозинкиназы Trk-рецепторов / Ю.А. Власова, И.О. Захарова, Т.В. Соколова, Н.Ф. Аврова//Ж. эвол. биохим. и физиол. - 2013. - Т.49. - № 1. - С. 15-23.

Публикации в материалах и тезисах конференций:

1. Власова. Ю. А. Снижение образования активных форм кислорода в клетках РС12 и повышение их жизнеспособности ганглиозидом GM1 в условиях окислительного стресса, влияние ингибиторов протеинкиназ / Ю.А. Власова, Т.В. Соколова, И.О. Захарова, Н.Ф. Аврова // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008): сборник тезисов. - Новосибирск. - 2008. - С. 142.

2. Аврова, Н.Ф. Роль систем трансдукции сигнала в нейропротекторном и метаболических эффектах ганглиозидов на клетки PC 12 в условиях окислительного стресса / Н.Ф. Аврова, Т.В. Соколова, Ю.А. Власова. И.О. Захарова, М.П. Рычкова, В.В. Фураев // Конференция с международным участием "Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга" (10-12 сентября 2008): сборник тезисов. -Санкт-Петербург. - 2008. - С. 6-7.

3. Власова. Ю.А. Антиоксидантный эффект ганглиозида GM1 при действии на клетки PC 12, роль модуляции систем трансдукции сигнала / Ю.А.

Власова // VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» (2-6 октября 2010): сборник тезисов. - Москва. - 2010. - С. 84-85.

4. Аврова, Н.Ф. Защитный эффект и механизмы действия антиоксидантов в микро- и наномолярных концентрациях на нервные клетки, роль модуляции активности сигнальных систем / Н.Ф. Аврова, Ю.А. Власова. Т.В. Соколова, И.О. Захарова, В.В. Фураев, М.П. Рычкова // Научно-практическая конференция с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (28-30 сентября 2011): сборник тезисов. - Ростов-на-Дону. - 2011. - С. 53.

5. Власова. Ю.А. Роль модуляции активности протеинкиназ в реализации антиоксидантного действия ганглиозида GM1 на клетки РС12 / Ю.А. Власова // XIV Международное совещание и VII школа по эволюционной физиологии (2429 октября 2011): сборник тезисов. - Санкт-Петербург. - 2011. - С. 48.

6. Аврова, Н.Ф. Различия в механизме защитного эффекта ганглиозидов против токсического действия прооксидантов и бактериального липополисахарида на клетки РС12 / Н.Ф. Аврова, И.О. Захарова, Т.В. Соколова, JI.B. Баюнова, Ю.А. Власова. С.Д. Николаева // XXII Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова (16-20 сентября 2013): сборник тезисов. -Волгоград. - 2013. - С. 11-12.

Подписано в печать 30.10.2013 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 535

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Власова, Юлия Александровна, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова

На правах рукописи

04201450888

ВЛАСОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

МЕХАНИЗМ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ ГАНГЛИОЗИДОВ НА КЛЕТКИ PC 12 ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

Специальность 03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Аврова Н.Ф.

Санкт-Петербург 2013

СОДЕРЖАНИЕ

2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................. 6

РАЗДЕЛ 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.............................. 8

РАЗДЕЛ 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие представления о строении, составе и локализации ганглиозидов

в организме животных и человека......................................................... 13

2.1.1. Классификация ганглиозидов. Структура ганглиозидов, характерных для нервной ткани.................................................................................... 13

2.1.2. Содержание ганглиозидов в ткани мозга и некоторых других органов млекопитающих ........................................................................... 17

2.1.3. Роль ганглиозидов в организации клеточной мембраны...........................17

2.1.4. Изменение ганглиозидов мозга позвоночных в процессе эволюции......... 20

2.2. Обмен ганглиозидов........................................................................21

2.2.1. Анаболизм ганглиозидов............................................................... 22

2.2.2. Нарушения синтеза ганглиозидов...................................................... 24

2.2.3. Катаболизм ганглиозидов.................................................................24

2.2.4. Нарушения катаболизма ганглиозидов.................................................25

2.3. Нейропротекторная активность ганглиозидов.............................. 27

2.3.1. Защитный эффект введения ганглиозидов животным in vivo.................. 27

2.3.2. Повышение жизнеспособности нервных клеток под влиянием ганглиозидов в опытах in vitro..................................................................................... 30

2.4. Клинические испытания ганглиозидов........................................ 31

2.5. Влияние ганглиозидов на обучение, формирование памяти, процессы межклеточного взаимодействия. Рецепторная роль ганглиозидов............... 33

2.5.1. Влияние ганглиозидов на обучение, формирование памяти...................... 33

2.5.2. Участие ганглиозидов в нейритогенезе.............................................. 35

2.5.3. Ганглиозиды в процессах межклеточного взаимодействия, рецепторная роль ганглиозидов....................................................................................... 36

2.6. Роль модуляции сигнальных систем в механизме защитного действия ганглиозидов.......................................................................................38

2.7. Антиоксидантные эффекты ганглиозидов.............................................43

2.7.1. Окислительный стресс и его роль в поражении нервных клеток...................43

2.7.2. Антиоксидантные функции ганглиозидов.............................................48

2.8. Регуляция апоптоза и некроза сигнальными системами......................51

РАЗДЕЛ 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Условия культивирования клеточной линии РС12................................57

3.2. Методы определения жизнеспособности клеток РС12.............................57

3.2.1. Определение жизнеспособности клеток PC 12 по выходу лактатдегидрогеназы из разрушенных клеток............................................................................57

3.2.2. Определение жизнеспособности клеток по превращению МТТ в окрашенный МТТ-формазан.......................................................................................58

3.3. Определение активности регулируемой внеклеточными сигналами киназы 1/2 (ERK1/2) и протенкиназы В (Akt) в клетках РС12 в контрольных клетках, при действии перекиси водорода и ганглиозида методом иммуноблоттинга..................................................................................59

3.4. Иммунопреципитация TrkA-рецепторов............................................60

3.5. Определение аккумуляции активных форм кислорода в клетках РС12. 61

3.5.1. Определение аккумуляции активных форм кислорода в клетках PC 12 при действии перекиси водорода и ганглиозида GM1...........................................62

3.5.2. Определение аккумуляции активных форм кислорода в клетках PC 12 при действии бактериального ß-липополисахарида и ганглиозидов GDI а и GM1.....................................................................................................62

3.6. Метод определение активности Ка^К^-АТФазы в клетках РС12 при действии перекиси водорода и ганглиозида GM1.......................................64

3.7. Выделение индивидуальных ганглиозидов из мозга млекопитающих.......65

3.8. Анализ и статистическая обработка данных.........................................67

РАЗДЕЛ 4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Влияние ганглиозида GM1 и других основных ганглиозидов мозга на жизнеспособность клеток РС12 в условиях окислительного стресса.................68

4.1.1. Основные ганглиозиды мозга (GM1, GDI a, GDlb и GTlb) увеличивают жизнеспособность клеток РС12, подвергнутых действию перекиси водорода..........68

4.1.2. Влияние разных способов снятия клеток PC 12 с поверхности фласков и времени инкубации клеток с ганглиозидом GM1 на его защитный эффект

ганглиозида GM1 в условиях окислительного стресса.....................................69

4.1.3. Защитный эффект ганглиозида GM1 на клетки PC 12 в условиях окислительного стресса зависит от его концентрации.......................................71

4.1.4. Ингибитор тирозинкиназы Trk-рецепторов блокирует защитное действие ганглиозида GM1 на клетки РС12, подвергнутые действию перекиси водорода......73

4.1.5. Ингибиторы РКС, PI3K, МЕК 1/2 снижают защитное действие ганглиозида GM1 на клетки PC 12, подвергнутые действию перекиси водорода..............................................................................................75

4.2. Влияние ганглиозида GM1 на экспрессию и активность тирозинкиназы Trk-рецепторов, ERK1/2 и Akt в клетках РС12 в контроле и в условиях окислительного стресса...................................................................... 81

4.2.1. Влияние GM1 и перекиси водорода на экспрессию и активность TrkA (уровень pTyr TrkA) в клетках РС12..................................................................... 81

4.2.2. Влияние GM1 и перекиси водорода на экспрессию и активность Akt (уровень pAkt) в клетках PC 12............................................................................. 82

4.2.3. Влияние GM1 и перекиси водорода на экспрессию и активность ERK1/2 (уровень pERKl/2) в клетках РС12.......................................................... 84

4.3. Метаболические эффекты ганглиозида GM1 на клетки РС12, подвергнутые действию токсических концентраций перекиси водорода...... 86

4.3.1. Ганглиозид GM1 снижает накопление активных форм кислорода в клетках PC 12, индуцированное перекисью водорода................................................. 86

4.3.1.1. Ингибитор тирозинкиназы Trk-рецепторов блокирует антиоксидантное действие ганглиозида GM1...................................................................... 86

4.3.1.2. Влияние ингибиторов PI3K, МЕК1/2 и РКС на способность ганглиозида GM1 снижать аккумуляцию активных форм кислорода в клетках PC 12, индуцированную перекисью водорода.................................................................................88

4.3.1.3. Ганглиозид GM1 в наномолярных концентрациях снижает накопление активных форм кислорода в клетках PC 12 в условиях окислительного стресса .... 93

4.3.2. Ганглиозид GM1 снижает окислительную инактивацию Иа+,К+-АТФазы в клетках PC 12, индуцированную перекисью водорода, ингибитор тирозинкиназы Trk-рецепторов блокирует этот эффект ганглиозида GM1..........................................................94

4.4. Защитный и антиоксидантный эффект ганглиозидов при действии на клетки РС12 бактериального липополисахарида.........................................95

4.4.1. Ганглиозиды GDla и GM1 повышают жизнеспособность клеток РС12, подвергнутых действию токсических концентраций липополисахарида...............95

4.4.2. Ганглиозид GDla уменьшает накопление активных форм кислорода в клетках

PC 12, вызванное действием липополисахарида.............................................101

РАЗДЕЛ 5. ОБСУЖДЕНИЕ

5.1. Защитный и антиоксидантный эффекты основных ганглиозидов мозга (GM1, GDla, GDlb и GTlb)..............................................................................102

5.2. Защитный эффект ганглиозида GM1 при действии на клетки PC 12 в условиях окислительного стресса, роль сигнальных систем в его реализации...................104

5.3. Антиоксидантный эффект ганглиозида GM1 при действии на клетки PC 12 в условиях окислительного стресса, роль сигнальных систем в его реализации.......109

5.4. Защитный и антиоксидантный эффект ганглиозида GM1 в наномолярных концентрациях......................................................................................114

5.5. Защитный эффект ганглиозидов GM1 и GDla при действии на нервные клетки и

клетки нейрональной линии бактериального липополисахарида........................118

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................122

ВЫВОДЫ...........................................................................................125

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................126

N

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозин-5'-дифосфат АТФ - аденозин-5'-трифосфат АФК - активные формы кислорода

ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография

ЛДГ - лакгатдегидрогеназа

ЛПС - бактериальный липополисахарид

МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы

МДА - малоновый диальдегид

МТТ - бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия

НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный

НАДНг - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

НейАц - N-ацетилнейраминовая кислота

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксидцисмутаза

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФЛА2 - фосфолипаза А2

Фн - фосфор неорганический

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

BDNF (brain derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор мозга СОХ 1/2 - циклоксигеназа 1/2 DAG - диацилглицерин

EGFR (epidermal growth factor receptor) - рецептор эпидермального фактора роста

ERK1/2 - киназа, регулируемая внеклеточными сигналами

GDlb - дисиалоганглиозид (Ь-серии)

GDI а - дисиалоганглиозид (а-серии)

GM1 - моносиалоганглиозид

GQlb - тетрасиалоганглиозид

GTlb - трисиалоганглиозид

IL-10 - интерлейкин IL-10

LTB4 - лейкотриен В4

MAG - миелин-ассоциированный гликопротеин

mHtt - мутантный белок хантингтин

МРТР - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

NGF - фактор роста нервов

NMDA - N-метил-О-аспартат

N-NeuAc - N-ацетилнейраминовая кислота

N-NeuGl - N-гликолилнейраминовая кислота

PGE2 - простагландин Е2

PI3K - фосфоинозитид 3-киназа

РКА - протеинкиназа А

РКС - протеинкиназа С

TNF - фактор некроза опухолей

РАЗДЕЛ 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важность изучения механизма действия нейропротекторов, обладающих антиоксидантными свойствами, определяется тем, что окислительный стресс является одной из основных причин повреждения и гибели нервных клеток мозга при болезнях, связанных с нейродегенеративными и ишемическими поражениями мозга. Эти болезни являются одной из основных причин старческого слабоумия и смерти людей в пожилом возрасте, они широко распространены и являются очень затратными для общества [Leicht et al., 2011; Naylor et al., 2012]. Долгое время большие надежды при лечении таких болезней, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, инсульт и травмы мозга связывали с применением высоких доз классических антиоксидантов (прежде всего витамина Е), обладающих способностью прерывать свободно-радикальные цепи, непосредственно реагируя со свободными радикалами. Но анализ результатов клинических испытаний витамина Е показал, что у пациентов с различными болезнями и людей в группах риска, получавших витамин Е в высоких дозах, смертность от разных причин была достоверно выше, чем у людей, получавших плацебо [Muller et al., 2005; Bjelakovic et al., 2007].

По современным представлениям важную роль в защитном эффекте соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, таких, как флавоноиды, М-ацетил-Ь-карнозин, карнитин и другие, играет модуляция ими сигнальных систем, которая в большой мере определяет их способность снижать интенсивность окислительного стресса в клетках [Zingg et al., 2007; Kulebyakin et al., 2012]. К таким соединениям относятся и ганглиозиды мозга.

Ганглиозиды представляют собой гликосфинголипиды, содержащие сиаловые кислоты. Ганглиозиды являются характерными компонентами мембран нервных клеток. Основные ганглиозиды мозга (GM1, GDI a, GDlb и GTlb) оказывают защитный эффект и предохраняют от гибели нервные клетки мозга при их введении животным, подвергнутым действию ишемии или токсинов [Hadjiconstantinou, Neff, 1998; Saito et al., 2007]. В опытах in vivo и in vitro чаще всего используется наиболее стабильный ганглиозид GM1. При широкомасштабных клинических испытаниях ганглиозида GM1 (препарата Sygen), как лекарства при инсультах мозга и повреждении спинного мозга, не удалось выявить достоверного долгосрочного улучшения состояния больных [Geisler et al.,

2001; Candelise, Cjccone, 2002; Becker et al., 2003; Wahlgren, Ahmed, 2004]. По-видимому, для успешных клинических испытаний ганглиозида GM1, необходимо расшифровать механизм его защитного действия на нервные клетки, который пока далек от понимания.

Основные ганглиозиды мозга обладают способностью снижать интенсивность окислительного стресса в клетках, что было впервые показано в работах нашей лаборатории [Avrova et al., 1998, 2002]. Затем антиоксидантный эффект ганглиозида GM1 был подтвержден в работах зарубежных исследователей [Fighera et al., 2003, 2006; Sergent et al., 2005; Gorria et al., 2006; Tanaka et al., 2010]. Под антиоксидантной активностью нейропротекторов мы понимаем их способность снижать аккумуляцию активных форм кислорода (АФК) в нервных клетках и клетках нейрональных линий, предотвращая тем самым развитие в них окислительного стресса. В литературе нам не встретилось исследований зависимости антиоксидантного эффекта GM1 или других основных ганглиозидов мозга от модуляции ими сигнальных путей.

Выяснение механизма действия ганглиозидов может способствовать успешному проведению клинических испытаний этих соединений как лекарств при болезнях, связанных с поражением мозга.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение механизмов защитного и антиоксидантного действия ганглиозидов GM1 и GDI а в микро- и наномолярных концентрациях на клетки нейрональной линии PC 12, подвергнутые действию перекиси водорода и бактериального липополисахарида (ЛПС), выявление той роли, которую играет модуляции ганглиозидом GM1 различных протеилкиназ в повышении им жизнеспособности клеток PC 12 и снижении накопления в них АФК в условиях окислительного стресса.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние ганглиозида GM1 и других основных ганглиозидов мозга (GDI a, GTla и GTlb) в микро - и наномолярных концентрациях на жизнеспособность клеток PC 12 при действии на них токсических концентраций перекиси водорода.

2. Изучить влияние ингибиторов тирозинкиназы Trk-рецепторов, киназы киназы, регулируемой внеклеточными сигналами 1/2 (киназы ERK1/2 - МЕК1/2), фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), протеинкиназы С (РКС) и протеинкиназы А на

защитный и антиоксидантный эффекты ганглиозида GM1 в клетках PC 12, подвергнутых действию перекиси водорода. Методом иммуноблоттинга изучить влияние ганглиозида GM1 на активность тирозинкиназы Trk-рецепторов, ERK1/2 и протеинкиназы В (Akt), которая активируется PI3K, изучить влияние перекиси водорода и преинкубации с ганглиозидом GM1 на активность этих протеинкиназ.

3. Изучить влияние ганглиозида GM1 и ингибитора тирозинкиназы Trk-рецепторов на окислительную инактивацию Na+, К+- АТФазы в клетках PC 12, индуцированную перекисью водорода.

4. Изучить способность ганглиозидов GM1 и GDI а повышать жизнеспособность клеток PC 12 и снижать в них накопление АФК при действии на клетки токсических концентраций бактериального ЛПС.

Научная новизна. Впервые изучена роль модуляции активности сигнальных путей ганглиозидом GM1 в реализации его антиоксидантного эффекта. Найдено, что способность GM1 снижать аккумуляцию АФК в клетках нейрональной линии PC 12 в условиях окислительного стресса зависит от активации им тирозинкиназы Trk-рецепторов, активации ERK1/2 и Akt и от модуляции активности РКС.

Впервые найдено, что ганглиозид GM1 в наномолярных концентрациях, повышает жизнеспособность клеток PC 12 и уменьшает в них аккумуляцию АФК в условиях окислительного стресса, причем эти эффекты GM1 зависят от активации им тирозинкиназы Trk-рецепторов. Эти данные представляют интерес в связи с тем, что наномолярные концентрации ганглиозида GM1 и других основных ганглиозидов мозга являются их физиологическими концентрациями в межклеточном пространстве мозга.

Впервые найдено, что способность ганглиозида GM1 в микро- и наномолярных концентрациях уменьшать окислительную инактивацию Na+,K+-АТФазы, индуцированную перекисью водорода в клетках нейрональной линии, не выражена в присутствии ингибитора тирозинкиназы Trk-рецепторов.

Впервые показано, что ганглиозид GM1 повышает жизнеспособность клеток нейрональной линии при действии на них токсических концентраций бактериального ЛПС и снижает в них аккумуляцию АФК.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модуляция ганглиозидом GM1 активности одних и тех же протеинкиназ определяет, как его защитный, так и антиоксидантный эффекты на клетки нейрональной линии PC 12 в условиях окислительного стресса. Эти эффекты опосредуются тирозинкиназой Trk-рецепторов и протеинкиназами, которые активируются после этого фермента - ERK1/2, Akt и РКС.

2. Ганглиозиды GM1 и GDI а в наномолярных концентрациях, повышают жизнеспособность клеток нейрональной линии PC 12, подвергнутых действию перекиси водорода, причем этот эффект, как и их эффект в более высоких концентрациях, связан с активацией тирозинкиназы Trk-рецепторо