Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ганглиозидов в регуляции процессов перекисного окисления липидов в синаптосомах мозга и эритроцитах крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль ганглиозидов в регуляции процессов перекисного окисления липидов в синаптосомах мозга и эритроцитах крысы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ

им.И.М.СЕЧЕНОВА

на правах рукописи УДК: 612.8.015.541.51

ТЮРИНА Юлия Юрьевна

РОЛЬ ГАНГЛИОЗИДОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В СИНАПТОСОМАХ МОЗГА И ЭРИТРОЦИТАХ КРЫСЫ.

Специальность: 03.00.04 - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

РГб ОД

л о м » ~ •^ »Г

У / ' ' г ^

Работа выполнена в лаборатории сравнительной биохимии нервной системы Института эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН.

Научный руководитель - доктор биологических наук

зав.лаб. Н.Ф.Аврова

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

ст.н.сотр., С.Ю.Туманова

доктор биологических наук ст.н.сотр., А.М.Казеннов

Ведущая организация - Институт физиологии

им.И.П.Павлова, РАН

Защита состоится " ¿3 11МОНА* 1995 г. в часов на заседании Диссертационного совета К002.89.01 в Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН 194223, Санкт-Петербург, пр. М.Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ им.И.М.Сеченова РАН.

Автореферат разослан 1Ч0 " М&Ру 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.В.Зуева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) - один из важнейших метаболических процессов протекающих в биологических мембранах. Низкие концентрации продуктов ПОЛ характерны для нормального функционирования клетки (Kagan, 1988). Строгая регламентация ПОЛ в мембранных структурах достигается за счет функционирования согласованной системы ферментных и неферментных механизмов контроля за содержанием активных форм кислорода. свободными радикалами и молекулярными продуктами ПОЛ. Нарушение в системе регуляции ПОЛ может явиться причиной несбалансированного развития реакций свободнорадикального окисления липидов. Увеличение концентрации продуктов ПОЛ над стационарным уровнем рассматривается как механизм повреждения мембранного аппарата нервных клеток при целом ряде патологий и нарушений ЦНС (ишемии и отеке мозга, эпилепсии, болезни Альцгей-мера и болезни Паркинсона, шизофрении, сенильной деменции, синдроме Дауна, осложнениях, вызванных действием нейролептиков и антидепресантов и т.д.), при острых нарушениях кровообращения, включая гемолитические анемии и др. В основе этих представлений лежат экспериментальные данные о мощном повреждающем действии свободнораДикальных реакций на такие важные функции нейронов как рецепция и трансмембранная передача сигнала, захват и выброс нейромедиаторов и др. (Halliwell, 1992). Очевидно, что строгая регуляция процессов ПОЛ исключительно важна для поддержания нормальной функциональной активности клетки. Сравнительно недавно было установлено, что в регуляции ПОЛ, наряду с антиоксидантными системами могут принимать участие системы трансдукции сигнала, реализующие свойэффектна уровне протеинкиназ (Kagan et al., 1992; Пальмина и др., 1994).

Ганглиозиды являются природными компонентами мембран клеток различных органов человека и животных (Крепе, 1981), во многом определяют структурно-функциональную организацию плазматических мембран и играют существенную роль в процессах межклеточного взаимодействия (Hakomori, 1990), рецепции (Fishman, 1988; Agnati, Fuxe, 1990), пролиферации, дифференциации клеток (Hakomori, 1990), пластичности и регенерации нервных клеток (Shengrund, 1990; Langone, da-Silva, 1990; Cuello, 1990) и являются модуляторами активности протеинкиназ (Faroqul et al., 1988; Fukunaga et al., 1990).

Снижение содержания ганглиозидов в ткани мозга при старении и при различных болезнях человека, связанных с нарушением функций ЦНС (Svennerholm, 1991) является биохимическим критерием, позволяющим судить о степени деградации нервных клеток (Karpova et al., 1992). В настоящее время ганглиозиды нашли применение в ряде западных стран в качестве лекарственных веществ при лечении заболеваний, связанных с поражениями ЦНС (Massarotti, 1986). Однако, остается не ясным вопрос о механизме нормализующего действия ганглиозидов, их использования в качестве регуляторов ПОЛ и мембранопротекторов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение мем-бранопротекторной роли ганглиозидов при индукции ПОЛ in Vitro в мембранных структурах мозга и изучение действия ганглиозидов in vivo на структурно-функциональную организацию мембран мозга и эритроцитов при экспериментальной ишемии миокарда. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику интенсивности ПОЛ (накопление продуктов ПОЛ, образование липидных радикалов, изменение жирнокислотного состава липидов) в мембранных структурах мозга в присутствии ганглиозидов.

2. Оценить действие ганглиозида GM1 на ПОЛ в синаптосомах мозга в присутствии ионов Са^ +, дибутирил-цАМФ, активатора (форбол-12-миристат, 13-аце-

тата (ФМА) и ингибитора (полимиксина В) протеинкиназы С.

3. Исследовать действие ганглиозида GM1 при индукции ПОЛ на /3-адреноре-цепторы и активность 3',5': фосфодиэстеразы цАМФ (ФДЭ) в синаптосомах мозга.

4. Исследовать in vivo действие суммарных ганглиозидов на накопление продуктов ПОЛ, фосфолипидный состав и активность Na +, К + ,-АТФазы в мембранных структурах^мозга и эритроцитов при экспериментальной ишемии миокарда.

Научная новизна. Впервые показано ингибирующее действие ганглиозидов на ПОЛ в мембранных структурах мозга. Эффект ингибирования ПОЛ (снижение накопления продуктов ПОЛ, ограничение образования липидных радикалов, защита полиеновых жирных кислот от окислительной деструкции) ганглиозидами проявляется только после их прединкубации с мембранами. Установлено, что ин-шбирующий эффект на ПОЛ зависит от концентрации ганглиозидов, носит би-фазный характер, усиливается в присутствии ионов Са^ + или ФМА. Существенно снижается при добавлении дибутирил-цАМФ и ингибитора липид-зависимых протеинкиназ - полимиксина В, полностью отсутствует после термоинактивации синаптосом и слабо выражен в липосомах. Установлено, что инактивация ФДЭ и снижение специфического уровня связывания рН] -дигидроалыгренолола ([^Н]-ДГА) с /З-адренорецепторами синаптосом мозга, вызванные индукцией ПОЛ могут быть в значительной степени предотвращены в присутствии ганглиозида GM1. Защитный эффект ганглиозида GM1 на активность ФДЭ при индукции ПОЛ в синаптосомах обусловлен, с одной стороны, за счет ингибирования ПОЛ, а с другой стороны, за счет активации самого фермента. Это свидетельствует в пользу участия ФДЭ в усилении уровня ингибирующего действия ганглиозида GM1 за счет уменьшения внутриклеточного цАМФ.

Впервые установлено, что внутривенное введение ганглиозидов перед инициацией экспериментальной ишемии миокарда в значительной степени предотвращает накопление продуктов ПОЛ, продуктов гидролиза фосфолипидов фосфоли-пазой А2 (ФЛА2) - лизофосфатидилхолина (лизоФХ) и предохраняет Na + ,К + -АТФазу от инактивации в мембранах мозга и эритроцитов. Полученные результаты позволяют рассматривать ганглиозиды в качестве полифункциональных эндогенных мембранопротекторов биологических мембран при нарушениях, связанных с активацией свободно-радикальных реакций и ФЛА2-

Практическое значение работы. Установленная в работе способность экзогенных ганглиозидов включаться в процессы регуляции ПОЛ и стабилизировать структурно-функциональную организацию плазматических мембран позволяет рассматривать эти природные соединения в качестве полифункциональных мембранопротекторов, осуществлять эффективную профилактику и устранение повреждений при окислительном стрессе в организме.

Апробация работы: Материалы и основные положения работы были доложены на Международной конференции "Регуляция свободно-радикальных реакций" (Болгария, Варна, 1989), на 8-ом съезде Европейского нейрохимического общества (ГДР, Лейпциг, 1990), на Учредительном конгрессе Международного общества патофизиологов (Москва, 1991), на Международной конференции "Ганглиозиды: Физиология нейрональной пластичности" (Италия, Рим, 1991), на конференции Академии наук США "Клеточные, биохимические и молекулярные аспекты повреждений, вызванных реперфузией (США, Нью-Йорк, 1993), на 10-ом съезде Европейского нейрохимического общества (Израиль, Иерусалим, 1994).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 158 страницах, содержит 17 рисунков, 12 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в себя 210 литературных источников. i 4

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали 2 месячных крыс линии Вистар. Объектом исследования служили синаптосомы мозга и эритроциты крысы. Часть работы была проведена на липосомах, приготовленных из липидов синаптосомальных мембран.

Выделение синаптосом из мозга крысы проводили по методу (Gurd et al., 1974). Чистоту получаемой фракции синаптосом и их целостность контролировали методом электронной микроскопии* и флуоресцентного зондирования**. Эритроциты крысы выделяли по методу (Arduini et al., 1992). Экспериментальную ишемию миокарда вызывали высокой перевязкой левой коронарной артерии (Clark et al., 1980). Ганглиозиды выделяли из мозга свиньи по методу Фолча (Folch et al., 1957) с дополнительной экстракцией по Сузуки (Suzuki, 1965). Разделение суммарных ганглиозидов проводили методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле. Содержание ганглиозидов определяли по методу (Svennerholm, 1957).

Липиды из синаптосомальных мембран экстрагировали по методу Фолча (Folch et al., 1957), а из эритроцитов по методу (Arduini eta]., 1992). Липидный фосфор определяли методом (Böttcher et al., 1961). Определение фосфолипидных классов проводили в микроварианте, используя системы растворителей как в работе (Rouser et al., 1966). Активность фосфолипазы А2 (ФЛА2) определяли по накоплению лизофосфолипидов. Трансбислойное распределение аминофосфоли-пидов в мембране изучали при помощи непроникающего гидрофильного модификатора 2,4,6-тринитробензосульфокислоты (ТНБС). Изучение жирнокислотно-го состава липидов синаптосом проводили методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе PYE-104 (Англия) с пламенноионизационным детектором. Перекисное окисление липидов в синаптосомах и липосомах индуцировали системой: Fe^ + (10 и 40 мкМ, соответственно) + аскорбат (500 мкМ). Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по методу (Buege and Aust,

1978). Содержание шиффовых оснований проводили флуоресцентным методом (Malshet et al., 1974). Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуо-риметре MPF-2A "Hitachi" (Япония). Активные формы кислорода в синаптосомах мозга генерировали системой: Fe^ + (20 мкМ) + Н2О2 (400 мкМ) в присутствии люминола (50 мкМ) и регистрировали по хемилюминесценции люминола на хе-милюминометре LKB-1251 (Швеция). Белок определяли модифицированным методом Лоури (Marklwell et al., 1978). Возможные перестройки в липиднойфазе синаптосомальных мембран регистрировали методом ЭПР-спин-зондовой спектроскопии, используя в качестве зонда 5-доксилстеариновую кислоту (Берлинер,

1979). ЭПР-спектры регистрировали на малогабаритном ЭПР-спектрометре (ЛПО "Светлана").

Активность 3'5': фосфодиэсгеразы цАМФ (ФДЭ) определяли по методу (Cheung, 1969). Определение активности уабаин-чувствительной Na + ,К + -АТФазы проводили по методу (Казеннов и др., 1984)***. Для определения уровня фосфорили-рования эндогенных белков синаптосом использовали [у^-]-АТФ (69 ПБк/ моль). Связывание [3Н]-дигидроальпренолола ([3Н]-ДГА (55-58 Кю/моль) с мембранами синаптосом определяли по методу (Lewkowitz et al., 1974)****. При анализе полученных данных вычислялась ошибка среднего арифметического, для нахождения достоверности результатов использовали t-тест Стьюдента.

* Работа по электронномикроскопическому контролю фракции синаптосом, полученной из мозга крысы выполнена совместно с к.б.н. Н.В.Горбуновым (Институт эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова. РАН)

** Оценка поверхностного и траснмембранного потенциала синаптосом, отра-

жающая их целостность, проведена совместно с д.б.н. А.Н.Ериным (Институт

Психиатрии РАМ, Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Действие ганглиозида СМ1 на ПОЛ, индуцированное в синаптосомах мозга системой Бе^ + + аскорбат. В первой серии экспериментов изучали действие ганглиозидов на ПОЛ, индуцированное в синаптосомах мозга системой Бе^ + + аскорбат. В этой серии экспериментов и других последующих действие ганглиозидов сравнивали с действием основного природного антиоксиданта а-токофе-рола (а-ТФ). Как видно из данных, представленных на рис.1, инкубация синап-тосом в системе

ре2 +

+ аскорбат в течение 30 мин сопровождалась накоплением продуктов ПОЛ (ТБК-реагирующие соединения) в контроле достигающее 23 нмоль/мг белка. При добавлении СМ1 наблюдалось ингибирование ПОЛ, степень которого зависила как от времени прединкубации СМ1 с мембранами си-наптосом, так и от концентрации экзогенного СМ1. Добавление СМ1 к мембранам синаптосом непосредствешю перед, индукцией ПОЛ не сопровождалось ин-гибированием ПОЛ. Напротив, ингибирующее действие а-ТФ проявлялось практически без прединкубации. Незначительный ингибирующий эффект СМ1 на ПОЛ наблюдался после 30 мин прединкубации (5,0 ±2,6), который увеличивался после 60 мин и достигал максимума после 120 мин и составлял, соответственно, 83,5 ±3,7 и 100,0 ± 4,2 % от максимального эффекта ганглиозида, что говорит об опосредованном действии ганглиозида. В этой связи, существенно, что ган-глиозиды стабильно связываются с плазматическими мембранами различных типов клеток при их концентрации в среде 10-Ю . 10-8м

и обладают метаболической активностью после 1,5-2 час инкубации (Бадг е1 а1., 1993). При более высоких концентрациях ганглиозиды образуют мицеллы, связь которых с мембранами не достаточно прочна (СогИ е1 а1., 1988, Saqг е1 а1., 1993).

Ингибирующее действие СМ1 на ПОЛ не сопровождалось лаг-периодом, характерным для действия антиоксидантов (рис.1). Ингибирующий эффект СМ1 проявлялся при концентрации 10"'1 - КГ'^М, достигал насыщения в области 10~9 - 10"'М и уменьшался при более высоких концентрациях ганглиозида (рис.2). Увеличение количества сиаловых кислот в молекуле ганглиозида приводило к снижению способности ганглиозидов ингибировать ПОЛ и составляло при 5 мин индукции ПОЛ для ганглиозидов СЭ1а (10"®М) и СТ1Ь (10"®М) - в среднем 38,1 % и 29,8%, соответственно. Ингибирующий эффект не был связан с ограничением молекулярной подвижности липидов в мембранах синаптосом, так как значения параметра упорядоченности мембран Б после прединкубации синаптосом с СМ1 (10~1' - 10~"м) достоверно не отличались от контрольных величин (0,790±0,008 против 0,781 ¿0,007). Кроме того, хранение синаптосом в течение 60 часов при 4°С приводило к снижению ингибирующего действия СМ1 на 55 %. В синаптосомах подверженных температурной денатурации в течение 2 мин при 90°С ингибирующее действие ганглиозидов на индуцированное ПОЛ не проявлялось. Маловероятным была также возможность ингибирования ПОЛ за счет образования комплексов с ионами Ие^ +, поскольку ингибирующий эффект регистрировался при несопоставимо низких концентрациях СМ1.

Степень ингибирования ПОЛ ганглиозидом в липосомах, приготовленных из липидов синаптосомальных мембран была значительно ниже, чем в синаптосомах и зависела от способа встраивания ганглиозидов в липосомы. В результате

*** Работа по определению активности уабаин-чувствителыюй Ыа + ,К + -АТ-Фазы проведена совместно с к.б.н. О.В.Федоровой (Институт эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова, РАН).

""Работа по оценке лиганд-рецепторного связывания мембран синаптосом проведена совместно с к.б.н. Л.А.Кузнецовой (Институт эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова, РАН).

прединкубации липосом в течение 2 час при 37°С, ингибирующий эффект ган-глиозидов (10" Ч - 10"^М) на ПОЛ отсутствовал, а при более высоких концентрациях не превышал 5%. При озвучивании липосом в присутствии СМ1, ингибирующий эффект СМ1 (10~°М) на индуцированное ПОЛ достигал насыщения и составлял 25% (рис.2).

О 5 1015202530

ВРЕМЯ, МИНУТЫ

во в м К

и <

а о с. К tó

п s

-12 -10 -8 -6 -4 -lg[GMl]

Рис.1. Зависимость накопления МДА в синаптосомах мозга при индукции ПОЛ системой + асхорбат. Предин-

кубация синаптосом с СМ1 2 часа при 37°С.

1-синаптосомы;

2-синаптосомы + СМ1 (10"10М)

3-синаптосомы + СМ1 (10"9М)

4-синаптосомы + а-ТФ (10"6М)

5-синаптосомы + а-ТФ (10'^М)

Рис.2. Действие ганглиозида СМ1 на ПОЛ индуцированное системой Яе^ + + аскорбат, время индукции ПОЛ - 5 мин.

1 -синаптосомы (и = 11).

2-липосомы вМ1 встраивался путем УЗ обработки (п = 3).

3-липооомы прединкубированные с

2 часа при 37°С.(п = 4).

2. Защита полиеновых жирных кислот липидов синаптосом при индукции

ПОЛ. При изучении жирнокислотного состава липидов синаптосом обнаружено,

что индукция ПОЛ вызывала уменьшение доли полиеновых жирных кислот в основном, за счет арахидоновой - С20;4и6 и докозагексаеновой С22-бшЗ и увеличение уровня короткоцепочечных насыщенных жирных кислот, что проявлялось в

снижении индекса ненасыщенности жирных кислот. Прединкубация синаптосом

с GMI (10"®М) или а-ТФ (10"®М) 120 и 5 мин, соответственно, предохраняла по-лиеновые жирные кислоты от окислительной деструкции. Значения индекса ненасыщенности в присутствии GM1 или а-ТФ были близки к значению индекса в синаптосомах без индукции ПОЛ, которое составляло 164,3; 158,2 и 187,4, соответственно (табл.1). Получение результаты согласуются с данными других авторов, которые показали, что у животных обработаннных ганглиозидами in vivo наблюдалась защита жирных кислот липидов мембран от окислительной деструкции при шпемическом инсульте (Mahadik et al., 1993а).

Таблица I. Состав жирных кислот липидов миелина и синаптосом мозга крысы (% от суммы).

Жирная Миелин Контроль Синаптосомы Индукция ПОЛ

кислота + СМ1(Ю"8М) + огТФ(Ю"®М)

20:4о)6 22:б0)3 8.7 1.0 12.4 15.0 7.7 ' 4.8 10.9 10.0 9.5 10.1

16:0+18:0 20:4+22:6 2.28 1.52 3.87 1.99 2.13

моноеновые 41.2 22.6 26.5 26.8 27.0

полиеновые 21.2 34.0 19.4 29.6 28.1

насыщенные 37.6 43.4 54.1 43.6 44.9

индекс ненасыщенности 110.8 187.4 113.1 164.3 158.2

3. Действие ганглиозида (5М1 на образование радикальных липидных интер-медиатов при генерации активных форм кислорода в синаптосомах мозга крысы системой Ре^ + + НзОг* На рис.3 представлены кривые люминол-зависимой хемилюминесценции, индуцируемой системой Бе^ + + Н2О2 в трис-НС1 буфере (А) и в мембранах синаптосом и миелина (Б). Видно, что при генерации активных форм кислорода в используемой системе в буфере регистрировалась "быстрая" вспышка хемилюминесценции, которая обуславливала взаимодействие люминола с супероксид анионом О2 и гидроксильным радикалом ОН* (Владимиров, Шерстнев, 1989). В мембранах синаптосом и миелина также наблюдалось образование "быстрой" вспышки хемилюминесценции, но наряду с этим регистрировалась "медленная" компонента ответа, за счет взаимодействия люминола с липидными радикалами, отражающая реакцию диспропорционирования пере-кисных радикалов (Ю2-1Ю2) (Владимиров и др., 1990). При этом характер кинетики хемилюминесценции в мембранах миелина, а также синаптосом до и после их прединкубации с СМ1 и а-ТФ существенно не отличался (рис.3). Сопоставление уровня хемилюминесценции (медленной компоненты ответа) в изученных препаратах при одинаковых условиях генерации активных форм кислорода показало, что интенсивность хемилюминесценции в синаптосомах была существенно выше, чем в миелине, что, вероятно, обусловлено большим содержанием полиеновых жирных кислот - арахидоновой и докозагенсаеновой, являющихся основным источником липидных радикалов (табл.1). Прединкубация мембран синаптосом и миелина с СМ1 или ФМА приводила к снижению уровня хемилюминесценции (рис.3-5).

Изучение зависимости хемилюминесцентного ответа синаптосом от концентрации СМ1 показало, что кривая, характеризующая ингибирующий эффект носила бифазный характер и достигала максимальных значений при концентрации СМ1 10"8м (рис.5). Ингибирующий эффект а-ТФ проявлялся непосредственно после добавления его к мембранам, тогда как для СМ1 была необходима прединкубация с синаптосомами, по крайней мере в течение 60 мин.

Рисунок 3. Типичные кривые люминолзависимой хемилюминесценции, индуцируемой системой Ре^-Ь^С^- А - Трис НС1 буфере; В - синап-тосомы; I - синаптосомы; 2 - синаптосомы, преинкубированные с СМ1 (10*8М) 60 минут при 37°С; 3 - синаптосомы +а-ТФ (10"6М). Стрелки -50 мкМ люминол, 400 мкМ Н2О2. 20 мкМ Ре^ +, соответственно.

^-нчглин

Следует отметить, что ФМА также оказывал ингибирующий эффект на ПОЛ в мембранных структурах печени, скелетной и сердечных мышц (ВаИепкоу е( а1., 1988, Кадап е1 а1., 1988), и напротив, в фагоцитирующих клетках ФМА вызывал генерацию анион-радикалов суперокиси О2 (Владимиров, Шерстнев, 1989), которая многократно усиливалась в присутствии наномолярных концентраций ган-глиозида вМ1 (Авроваидр., 1994). Представленные результаты позволяют полагать, что ингибирующий эффект СМ1 в синаптосомах мозга реализуется не за счет прямого взаимодействия с липидными радикалами, а за счет взаимодействий опосредованных белковым фактором (необходимость преинкубации, слабый эффект в липосомах, отсутствие эффекта после термоинактивации синаптосом).

В специальной серии экспериментов было показано, что прединкубация мембран синаптосом с СМ! (10~°М) или ФМА (10"®М) приводила к увеличению включения [т33Р1-АТФ в мембранные белки на 24% и 61 %, соответственно. При

1 2 3 4 5 6

ВРЕМЯ, МИНУТЫ

-12 -10 -8 -6 -1д[вМ1]

Рис.4. Действие СМ1, а-ТФ и ФМА на светосумму люминол-зависимой хеми-люминесценции индуцированную системой Ие^ + + Н2О2 в синаптосомах мозга.

1-синаптосомы; 2-синаптосомы без прединкубации с СМ1; 3-синаптосомы без прединкубации с ФМА;

4-синаптосомы, прединкубированные с ФМА (10"6М) 60 мин при 37°С;

5-синаптосомы, прединкубированные ыс СМ1 (10"8М) 60 мин при 37°С; 6-си-наптосомы + а- ТФ (10"6М).

Рис.5. Концентрационная зависимость ингибирующего действия СМ1 на лю-минол-зависимую хемилюминесцен-щпо индуцированную системой Ре^ + + Н2О2 в мембранах синаптосом мозга.

совместной инкубации СМ1 и ФМА с мембранами синаптосом наблюдалось увеличение уровня фосфорилирования мембранных белков на 78 %, которое полностью устранялось в присутствии ингибитора липид-зависимых протеинкиназ по-лимиксина В.

4. Действие ФМА, ионов Са^ +, дибутирил-цАМФ и полимиксина В на ПОЛ, индуцированное в синаптосомах мозга крысы системой Бе^ + + аскорбат. Как

видно из данных представленных в табл.2, ФМА существенно ингибировал ПОЛ дозозависимым способом. Действие ФМА проявлялось при его концентрации 10~®М и возрастало с повышением концентрации. При концентрации 10"®М ФМА

вызывал 50% ингибирование ПОЛ, что согласуется с данными (Baldenkov et al., 1988). В липосомах, приготовленных из липидов синаптосом, ингибирование ПОЛ в присутствии ФМА (до 10"^М) не наблюдалось, что соответствует данным (Kagan et al., 1992).

Значительное ингибирование ПОЛ ганглиозиды вызывали при концентрации !0~9-10~'м, при которых они способны активировать протеинкиназу С, заменяя собой фосфатидилсерин (ФС) (Momoi, 1986). Ганглиозиды также приводят к модификации фосфатидилинозитадифосфата (ФИФ2). повышая долю полиеновых жирных кислот в составе его молекулы и увеличивают концентрацию диацил-глицерина (ДАГ), за счет гидролиза модифицированного ФИФ£ (Leray etal., 1988). Прединкубация ганглиозидов с синаптосомами в микромолярных концентрациях вызывала снижение ингибирующего эффекта на ПОЛ и ингибирование про-теинкиназы С (Kreutter et al., 1987; Kim et al., 1987).

Участие протеинкиназы С в реализации действия ФМА и GM1 подтверждалось экспериментами с полимиксином В, который значительно предотвращал их ингибирующее действие, а сам обладал лишь незначительным ингибирующим действием (табл.2).

Обращает на себя внимание также и усиление ингибирующего действия ганглиозидов в присутствии ионов Са2 + (табл.2), необходимых для активации протеинкиназы С (Nishizuka, 1984). Ионы Са2 + при их концентрации в среде инкубации 2Х10"3М оказывали Ингибирующее действие на ПОЛ в синаптосомах мозга крысы, которое составляло 61,5% за 5 мин индукции ПОЛ. Ингибирующее действие GM1 в этих экспериментах составляло в среднем 65,4%. Совместное использование Са2 + с GM1 (10~9М) вызывало 70,9% ингибирование ПОЛ.

Таблица 2. Действие СМ1, ФМА, Са^ + и полмиксина В (ПхВ) на индуцированное ПОЛ в синаптосомах мозга крысы.

Прединкубация синаптосом, с СМ1 (10"8М) и дибутирил-цАМФ при его кон-

Время индукции ПОЛ Добавки % ингибирования ПОЛ

5 мин CaCL2 (2Х10"3М) GM1 (10"9М) CaCL2{2xl0"3M)+GMl (10"9М) 61,5±2,7 65,4 ±2,9 70,9 ±3,2

15 мин ФМА (10"6М) GM1 (10'8М) ПхВ (10"4М) GM1 (10"8М)+ФМА (10"6М) GM1 (10"8М)+ПхВ (10_4М) GM1 (10'8М)+ФМА (10'6М) (10"6М)+ПхВ(10-4М) 52.6 ±2,3 48.7 ±2,0 9,1 ±0,4 58,3±2,6 13,3 ±0,5 13,0±0,6

центрации 4x10"® М достоверно снижало ингибирующее действие на ПОЛ СМ1, тогда как сам дибутирил-цАМФ не влиял на ПОЛ. Так после 5 мин индукции ПОЛ действие ганглиозида СМ! в присутствии дибутирил-цАМФ понижалось на 16%, а после 30 минут индукции снижалось в 3,8 раза. Аналогичное действие дибути-рил-цАМФ оказывал в синаптосах мозга и на действие ФМА (10"®М), которое после 15 мин индукции ПОЛ снижалось в 1,5 раза. Однако, эффект проникающего аналога цАМФ в наших опытах был менее выражен, чем эффект форскалина

на ФМА-зависимое ингибирование ПОЛ в микросомах печени и мозга крыс (Baldenkov et al., 1988, Kagan et al., 1988, 1992). Это, вероятно, может быть связано с органной специфичностью, либо отражать другие эффекты форскалина, действующего, как известно, не только на аденилатциклазу.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что цАМФ в синаптосо-мах может вызывать снижение протекторного действия ганглоизидов при активации ПОЛ. /З-Адренорецепторы являются входным звеном в цепи образования цАМФ в синаптосомах. При добавлении GM1 (10~®М) или а-ТФ (10"^М) к контрольным препаратам синаптосом (в отсутствии ПОЛ) не наблюдалось достоверных отличий в уровне специфического связывания [3Н]-ДГА с /З-адренорецепто-рами. В результате химической модификации липидов при индукции ПОЛ в мембранах синаптосом происходило существенное снижение уровня специфического связывания [3Н]-ДГА, при этом величина максимального связывания Вмакс уменьшалась с 1,28 до 0,51 пмоль/мг белка, а констатнта диссоциации Кд увеличивалась с 0,2 до 1,8 нМ, что соответствует данным других авторов (Кгешег et al., 1986, Haenen et al., 1990). В присутствии GM1 (10"8M) или -ТФ (10"6М) при индукции ПОЛ наблюдался защитный эффект этих соединений, при этом величина Вмакс составляла в среднем 1,00 и 1,19 пмоль/мг белка, соответственно, а значения Кд достоверно не отличались от контрольных величин и составляли 0,10 и 0,23 нМ, соответственно.

Можно полагать, что обнаруженное действие GM1 на ПОЛ в синаптосомах мозга крысы связано с активацией липидзависимой протеинкиназы, например, протеинкиназы С, участие которой в регуляции процессов ПОЛ описывается в литературе (Пальмина и др., 1994, Baldenkov et al., 1988, Kagan et al., 1988, 1992). Нельзя исключить также возможность активации Са^ + /кальмодулин-зависи-мых протеинкиназ, а также специфических эктопротеинкиназ и ганглиозид-за-висимых протеинкиназ (Chan, 1987 ab, Tsuji et al., 1988), расположенных на внешней поверхности нервных клеток (Ehlich et al., 1990, Volonte et al., 1994).

5. Участие ганглиозида GM1 в защите 3'5': фосфодиэстеразы цАМФ от повреждающего действия ПОЛ в синаптосомах мозга крысы. Как видно из данных пред-

ставленных на рис.6, Gfvfl стимулировал активность ФДЭ в синаптосомах мозга крысы дозозависимым способом. Действие GM1 проявлялось при концентрации

10"9М, достигало максимума при 10~'м и уменьшалось с повышением концентрации, что согласуется с данными (Yates et al., 1989). Изменение активности ФДЭ

контрольных препаратов синаптосом в присутствии а-ТФ обнаружено не было. Индукция ПОЛ системой Fe2+ + аскорбат в синаптосомах приводила к окислительной деструкции как Са2 + -зависимой, так и Са2 + -независимой ФДЭ и проявлялась в значительном снижении удельной активности фермента и зависила от времени индукции ПОЛ. Са2 + -зависимая ФДЭ была наиболее подвержена действию ПОЛ. За 30 мин индукции ПОЛ активность в среднем падала на 70%. При этом основное изменение активности происходило в первые 5 мин индукции. Снижение активности Са^ + -независимой ФДЭ за 30 мин индукции ПОЛ происходило на 22% и носило линейный характер. Прединкубация синаптосом с GM1 предохраняла фермент от окислительной инактивации (рис.7) и выражалась в том, что падение активности Са2 + -зависимой ФДЭ составляло 23 %, а изменений в активности Са2 -независимой ФДЭ обнаружено не было. Аналогичным действием в исследуемых препаратах синаптосом мозга обладал а- ТФ (10"6М).

Таким образом, можно полагать, что, с одной стороны, ганглиозиды опосредованно ингибируют ПОЛ через систему протеинкиназ, с другой активация ФДЭ, приводящая к гидролизу цАМФ вносит дополнительный вклад в реализацию ган-глиозидами их ингибирующего действия на ПОЛ.

СП

W «

Л

н о о я и К н

180

160

140

120

100

-10-9 -8 -7 -6 -5 -4 -lg[GMl]

S

л

d о а и

s

а <

100

80

60

40"

20"

--р<0.001--р<0.01

р<0.01

ь

1

4

/1

4 5

Рис.6. Действие GM1 на актив- Рис.7. Защитное действие GM1 и

ность ФДЭ синаптосом мозга. а-ТФ ФДЭ от инактивации вызван-

1 . Са2 + - зависимая ФДЭ ной ПОЛ в синаптосомах мозга. Кон-

2 - Са2+ - независимая ФДЭ троль принят за 100%.

Время индукции ПОЛ 30 мин.

Са2 + - зависимая ФДЭ:

1 - ПОЛ; 2 - ПОЛ + GM1 (10"8М);

3 - ПОЛ + а-ТФ (10"6М)

Ca2 + - независимая ФДЭ:

4 - ПОЛ; 5 - ПОЛ + GM1 (10 М"8).

б. Действие ганглиозидов ln vivo на накопление продуктов ПОЛ, активность Na + ,К + -АТФазы и фосфолипидный состав мембран мозга и эритроцитов крысы при экспериментальной ишемии миокарда. Из данных, представленных в табл.3, 4 видно, что в результате ишемии миокарда в мембранах мозга и эритро-

цитов происходило ингибирование активности Na + ,К + - АТФазы, существенное увеличение содержания конечных продуктов ПОЛ, накопление продуктов гидролиза фосфатидилхолина ФЛАг - лизоФХ и уменьшение содержания ФЭ А. Содержание остальных классов фоефолипидов достоверно не изменялось. Кроме того, в мембранах эритроцитов происходило нарушение трансбислойной организации аминофосфолипидов. Наблюдалось увеличение доступности молекул ФЭА, расположенных во внутреннем монослое, к непроникающему химическому гидрофильному модификатоу ТНБС (табл.3).

Предварительное введение внутривенно суммарных ганглиозидов (30 мг/кг веса) приводило к торможению развития ПОЛ. При этом содержание конечных продуктов ПОЛ в условиях ишемии было существенно ниже, чем в отсутствии ганглиозидов и лишь незначительно превышало уровень ПОЛ в мембранах мозга и эритроцитов ложнооперированных животных. Вместе с этим, наблюдалось частичное восстановление активности Na+, К +-АТФазы в мембранах мозга и эритроцитов и нормализация распределения аминофосфолипидов в мембранах эритроцитов (табл.3). Представленные данные могут отражать наличие "стресс-

синдрома" и, как следствие, возбуждение адренергическойи гипофизарно-адре-наловой системы (Меерсон, 1984). В результате стресса в крови резко повышается содержание катехоламинов, которые проникают в мозг через гематоэнцефа-лический барьер, что создает предпосылки для их окисления (адреналина в ад-ренохром) и приводит к генерации супероксидных радикалов (Меерсон и др., 1982). Взаимодействие избытка агонистрв /3-адренорецепторов усиливает цепь метаболических превращений липидов, включающих последовательное метилирование ФЭА, образование из него ФХ и его последующий гидролиз ФЛА2 (Hirata, Axelrod, 1980). Введение ганглиозидов приводило к уменьшению содержания продуктов гидролиза ФХ - лизо-ФХ и увеличению уровня ФХ в мембранах мозга и эритроцитов (табл.4). Это может быть следствием того фактора, что ганглиозиды, способы вызывать ингибирование ФЛА2 в модельных системах (липосомах) (Bianko et al., 1990) и усиливать процесс трансметилирования ФЭА (Anriamampandry et al., 1991). В специальной серии экспериментов было изучено действие GM1 на активность экзогенной ФЛА2 (Streptomyces vialoceorible) в эритроцитах in vitro. Прединкубация эритроцитов с GM1 (10"8М) в течение 2 час при 37°С приводила к существенному снижению (на 50%) активности ФЛА2-

Известно, что активность ФЛА2 существенно зависит о содержания в среде ионов Са2 + . Однако, наблюдаемый эффект ингибирования активности ФЛА2 GM1 был не связан с образованием комплексов ганглиозидов с ионами Са^ +, поскольку эффект GM1 проявлялся при значительно более низких концентрациях по сравнению с ионами (10"® и Ю'^М, соответственно). Таким образом,

представленные результаты свидетельствуют о том, что ганглиозиды можно рассматривать в качестве полифункциональных эндогенных мембранопротекторов при нарушениях, связанных с активацией свободнорадикальных реакций и фос-фолипазы А2-

Таблица 3. Действие ганглиозидов на накопление продуктов ПОЛ, активность Na + ,К + -АТФазы мембран мозга и эритроцитов и содержание модифицированного ФЭА в мембранах эритроцитов при ишемии миокарда.

мембраны мозга (фракция Р2) эритроциты

ложно оперированные ишемия миокарда ишемия Миокарда + ганглиозиды ложно оперированные ишемия миокарда ишемия миокарда + ганглиозиды

Продукты ПОЛ 1отн* 3,8 + 0,2 7,2i0,3 5,0±0,1 29,9 ±5,8 73,8 ±10,2 42,7 ±7,5

Na + ,K + -АТФаза" 16,1±0,9 11,8±1,2 14,8 i 1,2 11,2± 1,0 6,1 ±0,6 8,3±0,5

модифицированный ФЭА(%) не опред. не опред. не опред. 12,1 ±.1,2 23,8 ±2,3 10,2± 1,1

Примечание: п = 10, р«0.01;

*- I отн. (интенсивность флуоресценции при концентрации липидов 1 мг/мл). ** - активность Ыа +, К + - АТФазы в мембранах мозга мкмоль Р1/мг белка/час в эритроцитах мкмоль Р1/мл/час.

Таблица 4. Изменение фосфолипидного состава мембран мозга и эритроцитов при ишемий миокарда.

мембраны мозга (фракция Р2) эритроциты

ФЛ ложно ишемия ишемия ложно ишемия ишемия

опериро- миокарда миокарда опериро- миокарда миокарда

ванные + гангли- ванные + гангли-

озиды озиды

ФХ 41,2±1.2 43,3±Д,8 44,4-±Д8 49,г±1,2 48,9-i-l, 1 53,9-+1,1

ФЭА 38,7±0,8 36,&±Я,7 35,8±Л,7 24,8-+0,8 23,5±0,8 22,S±jO,7

ЛФХ 0,6±Х),2 1,3±0,2 о,а±о,з 3,3-±0,7 5,2±Д4 2,6±0,3

Примечание: п=10, р«0,01; ФЛ-фосфолипиды, ФХ-фосфатидилходин, ФЭА-фосфатидилэтаноламин, ЛФХ-лизофосфатидилхолин.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что в синаптосомах мозга крысы ганглиозиды ингибировали индуцированное перекисное окисление липидов. Ингибирующее действие ганглиозидов увеличивалось в ряду СМ1 »С01а»СТ!Ь, носило бифазный характер и являлось максимальным при концентрации ганглиозидов 10"®-10"®М.

2. Ингибирующее действие ганглиозида СМ1 на перекисное окисление липидов проявлялось в снижении уровня накопления продуктов перекисного окисления липидов, ограничении образования липидных радикалов, предохранении по-лиеновых жирных кислот липидов от окислительной деструкции. Эффект действия ганглиозидов имел место только после прединкубации (60-120 мин) синап-тосом мозга крысы с ганглиозидами, отсутствовал после термоинактивации си-наптосом мозга и был слабо выражен в липосомах, приготовленных из липидов синаптосомальных мембран.

3. Ингибирующее действие ганглиозида на перекисное окисление липидов в синаптосомах мозга крысы усиливалось в присутствии ионов Са2 +, фор-бол 12-миристат, 13-ацетата, существенно снижалось в присутствии дибутирил-цАФМ и практически не наблюдалось в присутствии ингибитора липид-зависи-мых протеинкиназ - полимиксина В.

4. Показано, что снижение уровня специфического связывания [3Н1-дигидро-альпренолола с /3-адренорецепторами при индукции перекисного окисления липидов в мембранах синаптосом мозга крысы в присутствии экзогенного ганглиозида СМ1 (10~®М) было незначительным и достоверно не отличалось от контроля.

5. Установлено, что ганглиозид вМ1 (10"10-10~7М) вызывал активацию 3'5':фос-фодиэстеразы цАМФ и уменьшал снижение активности 3'5':фосфодиэсте-разы цАМФ при индукции перекисного окисления липидов в синаптосомах мозга крысы. •

6. При ишемии миокарда у крыс внутривенное введение ганглиозидов (30 мг/ кг массы животного) уменьшало накопление продуктов перекисного окисления липидов и лизофосфатидилхолина в мембранах мозга и эритроцитах крысы. В значительное мере сохраняло активность Ыа +, К + -АТФазы мембран мозга и эритроцитов. Прединкубация цельных эритроцитов крысы с ганглиозидом СМ1 (10"°М) приводила к ингибированию активности экзогенной фосфолипазы А2 из вЬтеркшусев уЫасеопЫе.

СЛИСОК ПУБЛИКАЦИЙ, ОТРАЖАЮЩИЙ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. AvrovaN.F., Tyurina Y.Y., Tyurin V.A., Kagan V.E. Gangliosiddependentfactor-inhibiting lipid peroxidation in rat synaptosomal membranes. Abstract of Conference "Regulation of Free Radical Reactions (Biomtdical apects), Bulgaria, Varna, 1989, p.77

2. Тюрина Ю.Ю. Тюрин B.A., Аврова Н.Ф., Каган В.Е. Ганглиозидзависимый фактор, ингибирующий перекисное окисление липидов в мембранах синаптосом. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1990, т. 109, N 6, с.553-555.

3. Tyurina Y.Y., Tyurin V.A., Avrova N.F. Preincubation of rat brain synaptosomes with ganglioside GM1 protects cAMP phosphodiesterase against inactivation by induction of lipid peroxidation. Abstract of 8th General Meeting of European Society for Neurochemistry, Leipzig, 1990, P. 15.5, p. 122.

4. Tyurin V.A., Tyurina Y.Y., Avrova N.F. Ganglioside-dependent factor inhibiting lipid peroxidation in the nervous system. Abstract of 8th General Meeting of European Society for Neurochemistry, Leipzig, 1990, P. 15.6, p. 122.

5. Kuznetzova LA., Tyurin V.A., Tyurina Y.Y., Pertseva M.N., Avrova N.F. Ganglioside GM1 protects (j-adrenoieceptor from desensitzatiori caused by induction of lipid peroxidation in rat brain synaptosomes. Abstract of 8th general Meeting of European Socity for Neurochemistry, Leipzig, 1990, 0.6.3, p. 69.

6. Avrova N.F., Tyurin V.A., Tyurina Y.Y. Ganglioside-dependent factor, inhibiting lipid peroxidation, evidences possible protein kinase nature. Abstract of Satellite Symposium of the 8th general Meeting of European Society for neurochemistry "Clinical and behaviural aspects of ganglioside research", Magdeburg, 1990, p.5.

7. Тюрин B.A., Кузнецова Л.А., Тюрина Ю.Ю., Ерин А.Н., Аврора Н.Ф., Перце-ва М.Н., Каган В.Е. Участие ганглиозидов, в защите 0-адренореценторов от повреждающего воздействия, вызванного, перекисным окислением липидов в мембранах синаптосом. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1991, т.111, N 6, с.597-599.

8. Аврова Н.Ф., Тюрина Ю.Ю., Тюрин В.А., Денисова Н.Ф. Ганглиозиды предохраняют ферменты обмена вторичных мессендл^еров и полиеновые кислоты липидов от окислительной деструкции. Биол. мембраны, т.8, N И, с. 1144-1145.

9. Tyurin V.A., Tyurina Y.Y., Avrova N.F. Protection of cAMP phosphodiesterase of brain synaptosomes against lipid peroxidation damage by nanomolar concentration of ganglioside GM1. Abstract of Constituent Congress International Society for Patophysiology, Moscow, 1991, 9.3.65, p. 238.

10. Tyurin V.A., Tyurina Y.Y., Avrova N.F. Ganglioside-dependent factor, inhibiting lipid peroxidation in rat brain synaptosomes. Neurochem. Int., 1992, v. 20, No 3, p. 401-407.

11. Тюрин B.A., Багров А.Я., Федорова O.B., Жабко Е.П., Тюрина Ю.Ю., Аврора Н.Ф., Дас Д.К., Каган В.Е. Защита ганглиозидами мембран эритроцитов при ишемии миокарда, 1992, т. 114, N 10, с. 366-368.

12. Тюрин В.А., Ерин А.Н., Тюрина Ю.Ю., Аврова Н.Ф., Каган В.Е. Участие ган-глиозидов в регуляции свободнорадикальных реакций в мембранах мозга. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1992, т. 114, N 12, с. 592-594.

13. Tyurina Y.Y., Tyurin V.A., Avrova N.F. Ganglioside GM1 protects cAMP 3'5':phosphodiesterase from inactivation caused by lipid peroxidation in brain synaptosomes of rats. Mol. and Chem. Neuropath., 1993, v.19, No 3, p. 205-217.

14. Аврова Н.Ф., Наливаева H.H., Тюрин В.А., Ветош А.Н., Тюрина Ю.Ю., Баев В.А., Васильева И.В. О способности ганглиозидов улучшать функциональное состояние организма и нормализовать биохимическую организацию клеточных мембран при гипоксии. Физиология человека, 1993, т. 19, N 6, с. 109-120.

15. Avrova N.F., Tyurina Y.Y., Tyurin V.A., Kagan V.E. Ganglioside in postishemic cellular dysfunctions. Abstract of the Conference "Cellular, Biochemical and Molecular Aspects of Reperfusion Injury", New York, 1993, p.20.

16. Avrova N.F., Tyurin V.A., Tyurina Y.Y., Ivanova V.P., Denisova N.A. Gangli-osides and second messengers as the modulators of free radical reactions in brains. Abstract of 10th General Meeting of the European Society for Neurochemistry, Israel, Jerusalem, 1994, J.Neurochem., 1994, Suppl., 1, S23A.

17. Avrova N.F., Tyurin V.A., Tyurina Y.Y., Kagan V.E. Ganglioside in postis-chemic cellular dysfunctions. In: "Cellular, Biochemical and Molecular Aspects of Reperfusion Injury" (ed. by D.K.Das), Ann New York Acad Sei., 1994, v.723, Pt 7, p.353-355.

18. Аврова Н.Ф., Тюрин B.A., Тюрина Ю.Ю., Иванова В.П. Протекторный эффект ганглиозидов при окислительном стрессе в тканях мозга, сердца и других органов. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1994, т. 117, N 2, с. 198.

Усл. печ. л. 1. Компьютерный набор. Балтика. Тираж 100.

АОЗТ "Сильвинит"