Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Флуоресцентные исследования взаимодействия холерного токсина и его В-субъединицы с липосомами, содержащими флуоресцентно-меченные липиды

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Флуоресцентные исследования взаимодействия холерного токсина и его В-субъединицы с липосомами, содержащими флуоресцентно-меченные липиды"

$ и«А «»

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ' ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

Нэ правах рукописи

СМИРНОВ Олег Николаевич

ФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И ЕГО В-СУБЪЕДИНЩЫ С ЛИПОСОИАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЕ ЛИВДЫ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации нэ соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-1995 г.

Работа выполнена в Институте биотехнологии

Научные руководители:

доктор биологических наук Е.И.Асташкин

кандидат химических наук А.Ц.Сурин .

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических ньук А.С.Заседателев доктор химических наук А.И.Кокорин

Ведущая организация: Институт оиоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова РАН

Защита состоится 1935 года в часов

на заседании Специализированного ученого совета К.сбЗ.91.10. при Московском ОСизико-техническом институте ю адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский пер., э, МФТИ, аудитория

С диссертацией »южно ознакомиться в библиотеке МФТИ

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Специализированного ученого совета кандидат фазико-математических наук

В.Б.Киреев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Изучение механизмов проникновения бактериальных токсинов через плазматическую мембрану клеток имеет большое значение, так как это позволяет объяснить пути проникновения в клетки высокомолекулярных гидрофильных белков. Проникая внутрь клеток, токсины влияют на различные белки-мишени, расположенные в цитоплазме или примыкавшие к внутренней поверхности плазматической мембраны. Для холерного токсина такой мишень» является gj-белок, расположенный на внутренней поверхности плазматической мембраны. Установлено, что с момента добавления токсина к клеткам до начала увеличения ферментативной активности каталитического компонента аденилатциклазн проходит характерный латентный период. Полагают, что это время необходимо для прохождения токсина или его активного компонента через плазматическую мембрану. До настоящего времени механизм проникновения каталитического компонента холерного токсина - Ai-пептида через плазматическую мембрану клетки остается неизвестным. Существует несколько гипотез, объясняющих прохождение Ai-пептида через мембрану. Эти гипотезы часто противоречат друг другу и на объясняют экспериментальные данные, полученные в последнее время.

Ориентация молекулы холерного токсина по отношению к мембране клетки-мишени имеет важное эначене для механизма его проникновения через плазматическую мембрану. Рентгеноструктур-ный анализ термолабильного токсина я. coli, аминокислотная последовательность которого на во % совпадает с CT, показал, что AI-пептид этого токсина может располагаться как над ВСТ, так и под ВСТ (sixma et ai., 1991). Если Ai-пептид направлен к мембране, то он способен непосредственно проникать внутрь клетки-мишени (Wisniesky & Bramhall, 1981). ЕСЛИ А1-П6ПТИД направлен от мембраны, то в этом случае существует несколько путей про никновения Ai-пептвда: 1) ВСТ образует трансмембранный канал, по которому Ai-пептид проникает внутрь клетки-мишени (gin, 1976), 2) ВСТ в результате связывания с gmi "раскрывается" по-

'Сокрагцёнйя:"CT"-"холерный"токсин; "ВСТ"-""В-субъёдйнйц§ холерного токсина; ACT - А-субъединица холерного токсина; РОРС -пальмитоилолеоилфосфатидилхолин; agmi, pgmi - аналоги ганглио-зида gmi, несущие остаток соответственно транс-12-(9-антрил)-и-додеценовой или 9-(з-периленоил)нонановой кислоты в церамид-ной части; АРС - 1-ацил-2-[транс-12-(9-антрил)-и-додеценоил)-sn-глицеро-з-фосфохолин; ррс - 1-ацил-2-[9-(з-периленоил)нона-ноил]-sn-глицеро-З-фосфохолин.

добно цветку ириса; в образовавшуюся пору входит ai пептид и

ПрОШСКйеТ ВНУТРЬ КЛеТКИ-иИШеНИ (London, 199?.i, з; Al-ПвПТИД

попадает внутрь клетки-мишени в результате эндоцитоза комплекса холерного токсина с gmi.

Цель работы. Настоящая работа посвящена исследований взаимодействия холерного токсина и его В-субъединицы с модельной мембранной системой. Мы ставили своей задачей определение стехиометрии связывания и константы диссоциации комплексов СТ (ВСТ) - (асм1,рсм1| на поверхности мембраны липосомы. а также изучение проникновения Ai-пептида холерного токсина внутрь липосомальной мембраны в месте связывания с ней холерного токсина. Необходимо было также ответить на вопрос о взаимном расположении Ai-пептида и В-суоъединицы относительно мембраны лшосом в момент связывания токсина. В качестве модельной системы мы применили моноламелярные липосомы. содержание ганглиозид gmi и (или) его флуоресцентно-меченые аналоги: антрилвинил-меченый ганглиозид (agmi) или периленоил-меченый ганглиозид (pgmi), а также аналогично меченые фосфатидилхолшш (арс, ррс). Основным методическим подходом были измерения флуоресцентных параметров изучаемой системы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Методами флуоресцентной спектроскопии были определены константа диссоциации и стехиометрия связывания холерного токсина и его В-субъедшшцы с липосомами, содержащими ганглиозид gmi. Установлено, что Ai-пептид холерного токсина не изменяет флуоресцентных параметров (характер спектра и анизотропия флуоресценции) флуорофоров, локализованных в центральной гидрофобной области мембраны. В связи с этим непосредственное проникновение Ai-пептида внутрь гидрофобной области мембраны липосомы маловероятно. Анализ данных по переносу энергии с гриптофилов СТ и ВСТ на ганглиозидные фдуорофоры позволил сделать вывод о том, что Ai-пептид в момент взаимодействия холерного токсина с мембраной располагается над ВСТ и посла связывания токсина практически не меняет своего положения относительно ВСТ и поверхности мембраны липосомы. Сравнение результатов переноса энергии с триптофилов ВСТ на периленоилы pgmi и ррс позволили предположить, что после взаимодействия с гангли-оэвдом gmi, ВСТ погружается на 6-7 Л в лшшдаый вислой липо-сом.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано з статьи Объем работы. Диссертация изложена на хзо страницах машинописного текста. Она состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуадения, заключения и выводов. Список использованной литературы включает юз работы.

I.i. Спектры флуоресценции холерного токсина и

В-субъединицы в суспензии лютоеоы, содержащих ганглиозиды сих, achí, pcmi.

Шли сняты спектры (флуоресценции триптофилов В-субъединицы холерного токсина и холерного токсина в буферном растворе в суспензиях литосом,.не содержащих гвнглиозид gmi и содержащих ганглиозид gmi или его флуоресцентно-меченые производные, agmi или pgmi с целью определения локализации триптофилов ВСТ, а также для выяснения, каким образом связывание ВСТ или СТ с углеводным фрагментом ганглиозида gmi будет влиять на спектр флуоресценции триптофилов ВСТ. Для этого селективно возбуждали флуоресценцию только триптофилов ВСТ или СТ (х« = 292 нм). Известно, что ВСТ состоит из пяти е-пептидов, каждый из которых содержит единственный остаток триптофана. А-субъедишща, состоящая из Ai- и А2-пептидов, содержит три триптофановых остатка в Ai-пептиде.

Спектры флуоресценции ренатурированной В-субъединицы холерного токсина в буферном растворе и в суспензии липосом из рорс имели положение максимума и полуширину (табл. i: рис. i), которые характерны для остатков триптофана, полностью доступных воде и однородных по окружению (Бурштейн, 1976, 1977). спектры флуоресценции холерного токсина практически не отличались от спектров ренатурированной ВСТ (табл. 2; рис. 2), так как вклад триптофилов Ai-пептида в флуоресценцию целого токсина примерно в 2 раза меньше, чем триптофилов ВСТ. Поэтому максимум флуоресценции триптофилов холерного токсина будет определяться максимумом флуоресценции триптофилов ВСТ. Таким образом, по спектральным данным СТ нельзя ничего определенного сказать о локализации триптофилов Ai-пептида в составе СТ, кроме того каждый из них, в отличие от триптофилов ВСТ, имеет различное окружение.

Эмиссионные спектры СТ и ВСТ, связанных с ганглиозидом gmi или его флуоресцентно-мечеными аналогами, встроенными в липосомальную мембрану, были сдвинуты в коротковолновую область (табл. i, 2; рис. i, 2). Мы наблюдали увеличение квантовых выходов флуоресценция ВСТ и СТ при связывании этих Оежов с липосомами, содержащими ганглиозид gmi (табл. i, 2; рис. i, 2>,

Рис.1. Спектры флуоресценции ренатурированной ВСТ в буфере

0.05 мМ Трис-нс1 рН « 7.4, в суспензиях липосом из РОРС (i), б липосомах из РОРС, содержащих ганглиоэид gmi см GM1 И AGM1 (3), AGM1 (4) И АРС (5) . РЗЗНОСТШЙ СПвКТр

(2) - (i) - (6). Концентрация белка - о.з ккм, РОРС -

200 мкг/МЛ, GM1 - 20 МКГ/МЛ, AGM1 - 4 мкг/МЛ, АРС - 2

1,(кг/мл; возбуждение при 292 нм, полосы пропускания моно-хроматоров возбуждения и эмиссии з и s m» соответственно.

Рис.2. Спектры флуоресценции СТ в том еэ буфере (i), в суспензии липосом щ РОРС в том m буфере (2), в липосомах из РОРС, содержащих ганглиоэид cm (з), ганглиоэид agmi (4), ганглиоэид pgmi (5); разностный спектр (6) = (2) - (3), коэффициент усиления 2. Концентрация белка - о.28 мкМ, роке и ганглиозидов - 200 и 5 мкг/мл соответственно; условия регистрация спектров - в подписи к рис.1.

в .

Таблица 1

Флуоресценция остатков триптофана В-субъедишпш холерного токсина в буферном растворе и в присутствии липосом различного состава.

"c¿ci¡¡......

липосом максийум'вннс-*" полуширина по- квантовый ____________„сии^.Ю-б^вм_______________

ТрИС-НС1 343 60 (59) 0.121*

(контроль)

РОРС 347 60 0.10-Ó.01

POPC+GM1 337 51 0.18*0.01

POPC+GM1 «-AGM1 337 52 0.16;0.'Э1

POPC+AGM1 337 50 0.14-0.01

POPC+APC 345 60 0.09-0.01,

Прилечанш. Звездочкой отпечена величина, взятая из работы De wolf et. ai, i98s; остальные квантовые выходы рассчитавд. по соотношению площадей спектров а миссии растворов вст одинаковой концентрации, светорассеяние липосом не учитывалось: ь скобках указаны значения, соответствующие триптофилам в однородном окружении. Концентрация ВСТ - 0.3 мкМ, концентрация

■ШИЛОВ (MKT/мл) POPC - 200, ОМ1 - 20, AGM1 - 4, АРС - 2.

Таблица 2

Флуоресценция остатков триптофана холерного токсина в буферном растворе н в присутствии липосом различного состава.

Состав ........"...i??!"!!^................

ЛИПОСОМ максимум"амйс-"* полуширина ño- ** квантовый _____________ _ _сииt._;0,_5_ нм.___др_с_ы_._ _ _-_0,5.5ÍJ______выход___

ТРИС-НС1 346 61 0.076

(контроль)

РОРС 346 60 0.065-0.005

РОРС + GM1 339 53 0.075-0.005

РОРС AGM1 . 333.5 52 0.064^0.00S

POPC + PGM1 338.5 52 0.063-0.005

Примечание. Звездочкой отмечена величина, взятая из работы De wolf et. al, 1985¡ остальные квантовые выходы рассчитаны по соотношению площадей спектров эмиссии растворов холерного токсина одинаковой концентрации, светорассеяние липосом не учитывалось. Концентрация Ст - 0.28 мкМ, концентрация липидов

(МКГ/МЛ) РОРС - 200, GM1 - 5, AGM1 - 5, PGM1 - 5.

в отличие от результатов, описанных в работе De wolf ее.al, 19в5. Известно, что флуоресценция триптофнлов в пептидах и белках может тушиться молекулами воды, амидными группами полипептидного остова и боковами цепями соседних аминокислотных остатков (особенно заряженных) (Еурштейн, 1976,1977). В частности, при изучении рН-зависимости флуоресценции В-субъединицы холерного токсина было установлено, что интенсивность Флуоресценции триптофилов зависит от степени протонирования карбоксильных

груш боковых цепей остатков гистидина, лизина и/или тирозина (De Wolf ее al, 1985). ТЭКИМ ОбрЭЗОМ, уВвЛИЧвНИв КВЭНТОВОГО выхода флуоресценции СГ и ВСТ, наблюдаемое в наших опытах на липосомах, содержащих gmi, свидетельствует о том, что в этом случае связывание приводит к изменению взаимного расположения индольных колец остатков триптофана и, по крайней мере, одной из перечисленных выше тушащих групп.

Квантовый выход флуоресценции триптофилов холерного токсина увеличивался не так сильно, как квантовый выход ВСТ после связывания белков с ганглиозидом gmi (рис.1, 2, табл.1, 2). Это говорит о том, что при связывании белков с ганглиозидом, по-видимому, изменяется квантовый выход только триптофилов ВСТ. Меньшие значения квантовых выходов триптофилов ВСТ и СТ в случаях с agmi и pgmi по сравнению с gmi свидетельствует о переносе энергии с триптофановых остатков ВСТ и СТ на флуоресцентные метки ганглиозида gmi. О переносе энергии с триптофилов ВСТ и СТ на флуоресцентные метки свидетельствует также сенсибилизация флуоресценции знтрилвинила (рис.1, спектр 4, и рис. 2, спектр 4, область 400-450 нм) и периленоила (рис. 2, спектр 5, область > 470 нм).

1.2. Титрование gmi-содерхащих лштосом холерным токсином и его В-субъединицей. Определение равновесных параметров связывания СТ (ВСТ) с ганглиозидом gmi и его флуоресцентно-мечеными аналогами.

Изменения в спектрах флуоресценции ВСТ и СТ (коротковолновое смещение максимума полосы испускания и увеличение квантового выхода) после связывания белков с ганглиозидом gmi или его флуоресцентно-мечеными аналогами были использованы для .определения равновесных параметров связывания (стехиометрии связывания, константы диссоциации) комплекса ВСТ (СТ) - ган-

ГЛИОЗИД GMI (AGMl, PGM1).

Максимальные и минимальные различия в интенсивностях флуоресценции триптофилов свободного холерного токсина (ВСТ) и его комплекса с ганглиозидом, независимо от наличия флуоресцентной метки, наблюдались при 330 и 369 нм соответственно (рис. 1, спектр 6; рис. 2, спектр 6). Эти данные были использованы для построения кривых титрования липосом холерным токсином (ВСТ) и расчета на основе изменений в спектрах фдуорес-

цевдий СТ (ВСТ) стехиометрии связывания и константы диссоциации комплексов СТ (ВСТ) с липосомами, содержащими ганглиозид вмг или флуоресцентно-меченый ганглиозид асм1 (рзм1).

Кривые титрования ганглиозид-содержащих липосом В-субъединицей холерного токсина представлены на рис. з. За процессом связывания белка с ганглиозидом следили по изменению флуоресценции на длине волны ззо нм. соответствующей максимуму разностного спектра связанной и свободной форм ВСТ (рис. 1, спектр 6), а также по изменению отношения интенсивностей флуоресценции на длинах волн ззо и 369 нм, соответствующих максимальному и минимальному значениям разностного спектра (иг -гзбэ/гззо) (рис. 2, спектр б). На кривых 1 и г (рис. з. 8) видны точки, соответствующие достиже шло стехиометрического соотношения ганглиозид вм1 - ает.

Как видно на рис. з, а, кривые титрования в координатах гззо - (вст), а также Лт - (вел позволяют надежно следить за процессом связывания. Однако они не дают представления о том, остаются ли все центры связывания ганглиозида по мере их заполнения ВСТ индентичными или существует кооперативное взаимодействие между э-пептидами, приводящее к тому, что связывание молекулы ганглиозида с одним из р-пептидов изменяет параметры связывания (константу диссоциации комплекса) соседних Э-пептидов. Если подобное взаимодействие существует и влияет на микроокружение остатков триптофана, то достаточно наглядно этот вопрос решается, когда полученные данные представлены в координатах Скэтчарда.

На рисунке з, б показана одна из типичных кривых, представленная в виде ленгмюровской изотермы связывания, а на вставке - те же данные в координатах Скэтчарда. Определение [всть) проводили согласно формуле:

н - я . ,

[всть] - [вст] . (1 ♦ _)-'

т/ т т XI

Величину я^ определяли из кривой титрования липосом, не содержащих ганглиозида см1, в.тЬ вычисляли как среднее значение для точек, составляющих начальный (горизонтальный) участок кривой титрования, когда вась белок находится в связанной форме, определяли как отношение наклонов конечного и

начального участков кривой титрования, построенного в координа-

[ВСЦиМ

Рис. 3. Кривив титрования лотосом, содержащих ганглиозид сит.,

В-суОъедашицей холерного токсина, а: г - зависимость интенсивности флуоресценции при -330 нм (гэзо) и 2 - зависимость отношения интенсивностей флуоресценция при 369 и 330 нм (яг) от концентрации ВСТ: о - зависимость концентрации связанного холерогеноида ((всты) от общего содержания белка, ца вставке - кривая титрования в координатах Скэтчардэ, {встс] - концентрация свободной ВСТ. Концентрации РОРС - 200. ганглиозида СМ1 - 0.5 мкг/мл! возбуждение при 292 ем,-полосы пропускания монохрома-торов возбуждения и эмиссии соответственно 3 и 5 нм. Температура 20 С.

тах гззо - (вст], либо как отношение наклона кривой титрования липосом без ганглиозида к начальному наклону кривой титрования липосом с а-и. построенного в тех же координатах.

Стехиометрию связывания и константу диссоциации комплекса ВСТ-ганглиоЗид вт определяли по графику Скэтчарда (рис. з, б). Стехиометрия связывания есть величина, обратная значению, отсекаемому графиком Скэтчарда на оси абсцисс, а константа диссоциации данного комплекса равна отношению величины, обратной стехиометрии связывания к значению, отсекаемому графиком Скэтчарда на оси ординат. кй и стехиометрия связывания комплекса ЕСТ - ганглиозид смх , полученные из кривых Скэтчарда для липосом различного состава, продставлзны в табл. з.

Аналогичные кривые зависимостей рззо, ит (збэ/ззо) и [стъ] от концентрации белка были построены при титровании липосом различного состава холерным токсином (данные не приведены). На основании этих кривых были получены равновесные параметры связывания холерного токсина с липосомами, содержащими ганглиозид 6М1 или его флуоресцентно-меченые аналоги (табл. 3).

Таблица з

Равновесные параметры связывания СТ и ВСТ с липосомами, содержащими ганглиозид <зм1 или флуоресцентные ганглиозиды АвМ1 и

Белок Состав липосом ка, нМ (Ганглиозид)/(белок)

Р0РС-вМ1 О.46-0.1 4.9-0.3

СТ РОРС-АвМ! 0.39-0.1 4.9-0.2

..........РОРС:Р<ЗМ1.......................1 .......

„„ РОРС-ЙН! 0.1-0.1 4.7;0.5

РОРС-АвМ1 0.25-0.1 5.3-0.6

Число мест связывания ганглиозидов gmi или его флуоресцентно-меченых аналогов, включенных в липосомы, с холерным токсином или его В-субъединицей, определенное по изменению спектра испускания флуоресценции триптофилов СТ или ВСТ равно примерно 5 (табл.з), что практически совпадает со значениями, установленными ранее (Fishraan, 1978; Song и Rintoul, 1969). Полученные значения icd 0.2-0.5 нМ (табл.з) близки к найденным в работах (Cuatrecaaas, 1973; Janlcot et.al., 1991).

Данные работ (De wolf et.al., 1985,1987) позволили авторам предположить, что единственный остаток тгр-88 #-пептида нахо-

дится в том участке пептида, который при связывании непосредственно взаимодействует с полярной головкой ганглиозида. Если это так, то полученные в настоящей работе низкие значения ка объясняются, возможно, тем, что регистрировались изменения физико-химических параметров непосредственно участка связывания gmi. Таким образом, с помощью метода флуоресцентной спектроскопии можно получить величинны ка с большей точностью. Следует отметить, что значения кd (табл. з) близки значениям этого параметра, найденным с применением радиоактивно-меченого СТ. • Ограниченность числа точек, которые могли бы быть использованы для представления полученных в данной работе изотерм связывания в линейных координатах, не позволяет надежно ответить на вопрос о кооперативности взаимодействия СТ или ВСТ с ганглиозид-содержащими липосомами.

Спектры излучения остатков триптофана и поглощения антрил-винильных и периленоильных хромофоров эффективно перекрываются, благодаря чему возможен безызлучательный перенос энергии с возбужденных издольных флуорофоров на антрилвшгильные или пе-риленоильные группы липидов. Эти особенности могут быть использованы для регистрации связывания ВСТ Или СТ с липосомами, содержащими флуоресцентно-мечеше ганглиозиды, и определения стехиометрии связывания белок-ганглиозид. Ферстеровские радиусы для пар тгр_7СТ- Ant, тгрв„- Per примерно одинаковы и равны соответственно 24.3 24.9 л.

Перенос энергии может, как известно, проявляться в тушении флуоресценции доноров энергии, а в том случае, когда акцепторами энергии служат флуоресцирующие хромофоры, то и в сенсибилизации флуоресценции акцепторов (Лакович, 1985).

Если ВСТ или СТ добавляли к липосомам, включавшим помимо нативного ганглиозида его антрилвинил-меченое или периленоил-меченое производное или аналогично модифицированный фосфатидилхолин, то возрастание интенсивности флуоресценции белка было заметно меньшим по сравнению с наблюдаемым при введении ВСТ или СТ в суспензию липосом, не содержащих флуоресцентных лшгидных зондов (рис.1, 2 и табл. 1, 2). Причиной снижения квантового выхода является перенос энергии что подтверждается сенсибилизацией флуоресценции антрилвинильного или периленоильного флуорофора. О сенсибилизации флуоресценции антрилвинильного флуорофора свидетельствует наличие дополнительной полосы с характерной для этого хромофора колебательной

структурой на длинноволновом склоне полосы белковой флуоресценции в диапазоне длин волн выше 400 ны (рис. 1, спектр 4< рис. .2, спектр 4), а о сенсибилизации флуоресценции периле-ноильного флуорофора свидетельствует наличие дополнилальцоф полосы в диапазона длйн волн вше 470 нм (рис. 2, спектр 5).

Более наглядно сенсибилизация флуоресценции проявляеся в спектрах возбуждения антрилвинильной или периленоильной метки-. Спектры возбуждения комплексов ВСТ с липосомами, содержащими флуоресцентно-меченые лшшды, имели дополнительную полосу в интервале 270-320 нм (рис.-4, спектр 2), где поглощают остатки триптофана и тирозина. Амплитуда спетра возбуждения в этом диапазоне длин волн пропорциональна эффективности переноса энергии. Максимальная сенсибилизация флуоресценции антрилвинильной или периленоильной группы наблюдалась при добавлении ВСТ к липосомам, в которых ганглиозид был представлен только ~ флуоресцентно-меченым аналогом. -

Сенсибилизация флуоресценции была использ'ована для построения изотермы связывания ВСТ с липосомами, состоящими из РОРС и флуоресцентно-меченого вм1. На рис. 5 (кривая 2) эта кривая представлена в виде зависимости от концентрации ВСТ прироста интенсивности флуоресценции антрилвинильной метки, возбуждаемой при 285 нм (максимум возбувдения ароматических остатков ВСТ). Для снижения влияния нестабильности работы прибора, ; разбавления раствора и других побочных эффектов этот прирост нормировали по интенсивности излучения асзм1, наблюдаемой при возбуждении при 369 нм, т. е. в максимуме поглощения антрилви-нильного флуорофора. Для сравнения на рис. 5 приведена кривая 1 связывания ВСТ с теми же липосомами в координатах лт(369/330) - 1вст). Точки, соответствующие достижению стехио-метрического соотношения вст-асм1, на обеих кривых совпадают. Таким образом, по переносу энергии с триптофилов ВСТ (СТ) на антрилвинильные или периленоильные фдуорофоры ганглиозидов асм1 и изм1 можно следить за процессом связывания белков с ганглиозидом, а также определить отношение концентраций бежа к айм1 или гон, при котором все ганглиозиды на поверхности мембран липосом находятся в связанном состоянии.

Рис. 4. Спектры возбувдения флуоресценции антрилвюшльной

метки в суспензиях липосом из рорс, содержала ганглиозид agmi до (1), и после (2) добавления ВСТ и спектр возбуждения вст в суспензии липосом из рорс <з>. Концентрации белка - о.з ыкМ. РОРС - 200, agmi - 4 мкг/мл; испускэние при 4 35 нм, полосы пропускания монохроматоро^ возбуждения и эмиссии соответственно з и ю нм. Т-ра 20 С.• Рис. 5. Кривые титрования липосом, состоящих из РОРС и agmi. В-субъединкцей холерного текста, зависимости: i -отношения интенсивностей при 369 и 330 им (Ri), 2 -отношения прироста интенсивности при 285 нм к величине интенсивности при 369 ни сВ(235/36э>). Концентрация рорс - 200 и agmi - o.s мкг/мл; возбувдение при 292 нм, полосы пропускания монохроматоров возбуждения и эмиссии соответственно з и 5 нм и>; испускание при 435 км, щели монохроматоров з и ю нм <2>. Т-ра 20 С.

Г.з. Изучение влияния холерного токсина и его В-субьединкца на пертурбацию мембран липосом, содержащих ганглиозид рвт

Известно, что спектры флуоресценции першшноильных ганглио-зидов зависят от полярности микроокружения флуорофора (мо1оскоувку ее а1., 1992). Этот факт был использован для вы-яенвшя возможного влияния СТ и ВСТ на пертурбацию липидного Оислоя липосом, содержащих ганглиозид рвт. Изучали изменение спектра флуоресценции периленоила, прикрепленного к ацильной цепи ганглиозида от по положению С9. Эта метка позволяет изучать изменение полярности липидного компонента мембран липосом ' на той глубине, где она располагается.

При связывании пе риле нойл-меченого ганглиозида с СТ или ВСТ наблюдается длинноволновое смещение спектра испускания периленоила и незначительное уменьшение максимума одной (более коротковолновой) полосы (рис.6. А; спектр 2). Изменения в спектре флуоресценции периленоила являются следствием изменения полярности окружения флуорофора, которое в свою очередь происходит в результате разрыхления липидного бислоя либо иэ--за связывания молекулы ВСТ или СТ с пятью молекулами ганглио-зкдов Рйм1 (известно, что молекула ВСТ занимает большую площадь, чем пять углеводных фрагментов ганглиозидов а-и), либо в результате взаимодействия периленовых колец мевду собой (при связывании ВСТ (СТ) с ром1 происходит увеличение локальной концентрации периленоила). Для проверки этих предположений мы разбавили меченый ганглиозид немеченым и исследовали связывание СТ (ВСТ) с лишеомами, содержащими смесь ганглиозидов <5М1 и рсм1 в соотношениях 4:1 и 9:1. Это позволяет, на наш взгляд, исключить взаимодействие флуорофэров между собой после связывания СГ (ВСТ) с ганглиозидом. В система с отношением ганглиозидов см1-рсм1 - 4:1 изменения в спектре испускания периленоила незначительны (рис. 6. Б), а в системе с отношением см1-рсм1 - 9:1 практически отсутствуют (рис. 6. В) после добавления СТ. Эти измерения были проведены при 20°С; такие же результаты были получены при 36°С, и при исследовании связывания В-субъедшпщы холерного токсина с липосомалышм ганглиозидом (данные не приводятся).

Можно заключить, что изменения в спектре флуоресценции пе-риленоил-меченого ганглиозида при добавлении холерного токсина

Рис.6. спектры флуоресценции в состава липосом: из одного рорс (А), из смесей РОРС и смх <Б> и (В), снятые без добавок (1). после добавления избытка холерного токсина <2 и приведены также разностные спектры а>-<2) - <з>, коэфЕи-циент усиления Ю: пунктирной линией показана ось абсцисс для разностных спектров. Концентрация рорс - 200, рсмх - о.1, СА-В), СМ1 - 0.4 (Б) И О.Э МКГ/МЛ 1В); возбуждение при 450 нм, полосы попу екания монохроматоров возбундеиия и эмиссии 5 да.

в липосомальных системах не являются следствие!.; присоединения СТ (рис. 6, В; спектры 1 и 2); а обусловлены взаимодействием периленоилов ганглиозидов рйм1 меаду собой, что, возможно, является причиной разрыхления фосфолипидного бислоя и изменения полярности окружения фдуорофора, которое приводит к красному смещению спектра (рис.6, л, спектр 2). Таким образом, в результате взаимодействия холерного токсина (ВСТ) с ганглиозидом рвт не происходит разрыхления фосфолипидного бислоя, по крайней мере, на уровне, близком С9 кирнокислотной цепи и ниже.

1.4. Изменение анизотропии антрилвинильного флуорофора при связывании ВСТ и СТ с липосомаыи, содержащими гонглиозид лет.

В настоящем разделе представлены данные исследования изменения анизотропии антрилвинильного зонда, прикрепленного к ¡кирнокислотной цепи ганглиозида емг, входящего в состав мембран липосом, при титровании их холерным токсином или В-субъединицей холерного токсина. Целью этой части работы было выявить разницу меаду изменениями анизотропии флуоресценции антрилвинила при титровании лет-содержащих липосом ВСТ и СТ.

При добавлении СТ или В-СТ к липосомам, содержащим ганглиозид АвМ1, отмечалось увеличение анизотропии антрилвинильного флуорофора (г). В случае, когда в липосомах присутствовал только антрилвинил-мёченый ганглиозид, наблюдали достоверное возрастание анизотропии на 5-6 X при 20°С и на 9-10 % при 36°С, если жа лшосош содержали смесь ганглиозидов Авт-от, 1:ю, наблюдали возрастание величины г на 8-9 % при температуре 20° С и на 20-25 % при температуре З^С (рис.7, графики 1 и 2) Данные нашей работы показывают одинаковое увеличение анизотропии флуоресценции антрилвинила в лот-содержащих лилосомах при титровании их холерным токсином и его В-субъединицей. Напомним, что холерный-токсин содержит две субъединицы А и В. Поэтому л-субъедишща не вносит изменений в г антрилвинильного зонда, что может говорить о том, что А-субъединица холерного токсина после связывания болка, по всей видимости, спонтанно не проникает в мембрану липосом в месте связывания СТ.

При титровании холерным токсином или ВСТ менятся светорассеяние липосом, содержащих, ганглиозид Авм1, что монет являться причиной изменения величины г антрилвинильного флуорофора (рис. 7, графики 1,2) или внести некую ошибку в значения г. Это

• г*Ю' "

0.6 г

я В

4°

X а* 0 1

. до * г

Q-4Ê- * 4

+ + + + 0.3^-'--1---L_

® О.Г 1.Ц 2.1 2.8

[CT];[BCT],jhM

Рис. 7. Зависимость аниэотрршш флуоресценции зондов agmi (i,2) и АРС (3,4) в составе липосом из смеси popc-gmi от концентрации БСТ (1,3) и СТ (2,4). концентрации!

рорс - 200, gm1 - 20, agm1 и арс - 2 мкг/мл. длины

волн испускания и возбуждения 369 и 435 нм соответственно, полосы пропускания монохроматоров. возбуждения и эмиссии 3 и 20 нм соответственно. Т-ра 36 С,

предположение обусловлено следующими рассуждениями. Титрование липосом холерным токсином приводит к увеличению светорассеяния системы и изменению .величины i„, входящей в выражение, определяющее анизотропию флуоресценции, так как рассеянный свет при использовании вертикального поляризатора сильно поляризован в вертикальном направлении. При этом не происходит искажения значения величины по той причине, что рассеянный свет, поляризованный в вертикальном направлении, почти полностью блокируется горизонтальном анализатором. Поэтому было необходимо провести дополнительный эксперимент для того, чтобы оценить количественный вклад изменения светорассеяния в величину относительного увеличения анизотропии антрилвинильного флуоро-фора при титровании холерным токсином или ВСТ липосом, содержащих ганглиозид gmi и внтрилвшшл-меченый фосфэтидилхолин. На рис. 7 (графики з и 4) представлены данные изменения анизотропии флуоресценции антрилвинила в составе липосом popc-gmi-apc при титровании их холерным токсином и ВСТ. Относительные изменения анизотропии при добавлении избытка СТ или ВСТ составили 20-25 % в системе popc-gmi-agmi при 36°С, в то время как в системе popc-gm1—арс - 7-8 %. Значительно большие относительные изменения анизотропии флуоресценции антрилвинильного флуорофо-ра в липосомах, содержащих ганглиозиды agmi и gmi по сравнению с относительными изменениями величины г антрилвинила в составе липосом, содержащих арс и gmi, свидетельствуют о том, что изменения г agmi обусловлены главным образом изменением подвижности антрилвинильного фдуорофора после связывания СТ или ВСТ с ганглиозидом agmi и не являются следствием изменения светорассеяния липосом в процессе их титрования СТ или ВСТ.

Таким образом, связывание СТ и ВСТ с углеводным фрагментом ганглиозида gmi изменяет подвижность ацильного остатка гангли-озида agmi. А-субъединица холерного токсина не влияет на изменение подвижности антрилвинильного зонда при связывании целого токсина с agmi-содержащиш липоссмами, так как, по-видимому, не происходит проникновение ACT в мембрану липосомы, по крайней мере, в месте связывания СТ с мембраной.

ё •

1.5. Определение расположения субъединиц холерного

токсина относительно поверхности мембраны липосоми по переносу энергии с остатков триптофана ВСТ и СТ на флуоресцентные цетки рсш и ррс.

Решение вопроса о взаимном расположении Аппептида и В-субъединицы холерного токсина относительно мембраны липосомы позволит более конкретно судить о путях проникновения холерного токсина через плазматическую мембрану клетки-мишени. Результаты рабОТ (Шап1ев)с1 & ВгастЬаИ, 1981; ШЫ еЬ а1., 1968; 81хта ее а1., 1991) показывают, что А1-пептид после связывания СТ направлен к мембране, тоесть находится ближе к мембране, чем ВСТ. Другие работы (Тотав! & Мопсесиссо, 1982; 81хта еь

а1., 1992; ОПапсИ & Р1вИтап, 1993) уТВврЖДЗЮТ ГфОТИВОПОЛОЖ-

ное. Поэтому целью этой части работы было определить расположения В-субъединицы и А1-пептида холерного токсина относительно мембраны липосомы, а также выяснить проникает ли А1-пептид в мембрану липосомы после связывания с ней СТ.

Как известно, В-субъединица холерного токсина состоит из пяти з-пептидов. КаадыЛ р-пептид содержит единственный остаток триптофана. По данным тхта а1., 1992) эти остатки расположены симметрично относительно оси симметрии ВСТ и на различных расстояниях от оснований "цилиндра" ВСТ: 15 й и 25 Также известно, что А1-пепгид локализован у одного из оснований, от которого триптофилы ВСТ удалены на расстояние 25 X. Решение вопроса, которым из оснований ВСТ взаимодействует с мембраной липосомы после связывания с ганглиозидом ом1, позволяет выяснить расположение субъединиц относительно мембраны липосомы в момент связывания СТ с мембраной.

В липосомах, содержащих ганглиозид гст и связанную с ним ВСТ, исследовали перенос энергии с триптофилов ВСТ на периленоилы изм1. В рассматриваемой системе доноры и акцепторы локализованы по поверхностям трех концентрических сфер с радиусами гф (триптофилы). па) (периленоилы внешнего монослоя). 1ъе (периленоилы внутреннего монослоя). Эффективность переноса энергии зависит от разностей ш> - м/ и ко - М2, то есть минимальных расстояний между донором и акцепторами соответственно внешнего и внутреннего монослоев, а также поверхностной плотности акцептора ([РСми/[РОРС]) и ферстеровского радиуса для пары пе-риленоил - триптофил. Были рассмотрены возможные виды переноса энергии с триптофилов ВСТ на периленоилы рот. в данной сис-

теме имеют место три вида переноса энергии с триптофилов ВСТ: i) на периленоилы ганглиозидов pgmi, с которыми связался этот ее белок, 2) на переленоилы ганглиозидов pgmi, локализованных во внешнем монослое, з) на pgmi, локализованные во внутреннем монослое. Теоретическую зависимость эффективности переноса энергии с триптофилов ВСТ на периленоилы pgmi рассчитывали используя теорию Ферстера для двухмерного случая, детально представленную В работе (Fung U Stryer, 1978) .

Расстояние от центра периленоильного флуорофора ганглиозида pgmi до поверхности мембраны, учитывая положение, по которому этот флуорофор прикреплен к ацильной цепи ганглиозида gmi и размер флуорофора, составляет 15-17 ft. Если предполагать, что ВСТ вплотную примыкает к мембране липосомы, то минимальное расстояние между триптофилами ВСТ и периленоилами ганглиозидов pgmi, с которыми связался этот же белок должно быть либо Kmlnl - 30-32 8 (15-17 + 15), либо Rmin2 = 40-42 ft (15-17 + 25) . Если 328 ВСТ примыкает к мембране липосом не вплотную, тогда значения Rmlnl и Kmlnl должны быть несколько большими.

На рис. в (з) (табл. 4) звездочками отмечены экспериментальные значения эффективности переноса энергии в системе триптофил ВСТ - периленоил pgmi, а также представлены теоретические зависимости Е( [pgmi) /ipopc) ; при ¡ым = 31.5 Я (кривая i) и ¡ым - 41.5 Я (кривая 2). Из этих данных следует вывод, что, вероятнее всего, ВСТ связывается с ганглиозидом gmi таким образом, что Ai-пептид в составе СТ располагается над ВСТ, так как экспериментальные значения е соответствуют кривой i, а не кривой 2 (рис. 8). Здесь следует сказать, что такое расположение субъединиц имеет место в момент взаимодействия СТ с поверхностью мембраны. Однако неясно, изменяет ли Ai-пептид свое положение по отношению.к поверхности мембраны после того, как холерный токсин связался с мембраной. Поэтому мы провели исследования переноса энергии с триптофилов СТ на периленоилы ганглиозида pgmi, аналогичные этим же исследованиям для ВСТ.

При расчете теоретической зависимости эффективности переноса энергии от поверхностной плотности акцептора (pgmi) в системе СТ - pgmi считали, что каждый остаток триптофана Ai- пептида равноудален от периленоилов ганглиозидов, с которыми связался СТ; расстояния от триптофилов Ai-пептида до плоскости локализации периленоилов ганглиозидов pgmi, с которыми связался СТ, обозначим м, м и ы. Неизвестной величиной считаем м, a м

[РОМИ/ихЭРО]

Рис. 8 . Теоретические (1, 2> и экспериментальная (3) зависимости эффективностей переноса энергии с триптофшэв ВСТ на периленоилы кзм1 ог поверхностной плотности периле-ноила в липосомах, содержащих рсми, при различных минимальных расстояниях между донором и акцептором яты . 31.5 д (1) и ВтШ2 - 41.5 А (2). Т-ра 36 (г.

Рис. э. Теоретическая а> и экспериментальная <2> зависимости эффективностей переноса энергии с триптофилов СГ на периленоилы гст от поверхностной плотности периле-ноила в липосомах, содержащих рои, при минимальном расстоянии между триптофилами А1-пептида и периленои-лами рвт м • 55 а (квантовые выходы триптофилов А1-пептида принимали одинаковыми, минимальное расстояние от триптофштов ВСТ до периленоилов и;м1 Кты = 31.5 а). Т-ра 36 о.

■ м - ю Л I м > ы » ю 1?; квантовые выходы триптофилов А1-пептида принимали одинаковыми. На рис. 9 звездочками отмечены экспериментальные значения эффективностей переноса энергии с триптофилов холерного токсина на периленоилы ганглиозидов Рвт (табл. 4). Сплошной линией показана

Таблица 4.

Экспериментальные значения эффективностей переноса зйергии <Е1 с триптофилов ВСТ (СТ) на периленоилы рвт или ррс в липосомах.

Донор

Акцептор

[Акцептор)/IPOPC)

Триптофилы ВСТ

Периленоилы

PGM1

Периленоилы РРС

0.0023 0.0069 0.0115 О. -164

0.0134 0.0252 0.0385 0.0536

0.242+0.015 О.264+0.015 0.295+0.017 0.320+0.01

0.166+0.016 0.250+0.004 0.332+0.01 О.399+0.004

Триптофилы СТ

Периленоилы

pgm1

0.0023 0.0069 0.0115 0.0164

0.183+0.015 0.196+0.012 О.220+0.015 0.224+0.02

теоретическая зависимость £прсм1)/(рорс] ) для этого же белка при ы = 31.5 И, м = 45 И, м г-. Ц, ьз = 65 Расчет теоретической зависимости (РбтлРок:]) проводили так же, как для ВСТ. БЫли рассмотрены различные вариации значений ы и м, и квантовых выходов триптофилои А1-пептида. Существенных изменений в величину м эти вариации не внесли (данные не приводятся).

Принимая в расчет полученное значение м, можно прийти к выводу, что центральный триптофил А1-пептида удален от плоскости локализации фдуорофоров ра-п, с которыми связан СТ, на расстояние 55 8. Вычитая из этой величины значение глубины залегания периленоилов внешнего монослоя (15-17 X), получаем значение расстояния от центрального триптофила А1-пептида до поверхности мембраны липосомы: 40 1. Это расстояние соответствует высоте В-субъединицы. На основании этих данных можно сказать, что какая-то часть А1-пептида будет располагаться над ВСТ, а какая-то "внутри" ВСТ, но в целом, можно говорить, что А1-пептид после связывания СТ с ганглиозидом етп располагается над ВСТ. Эти данные дополняют результаты, полученные при исследовании переноса энергии с ВСТ ка рсм1, тюскольку позволяют

говорить о той, что Ai-пептид располагается над ВСТ не только в момент связывания СТ с мембраной липосома, но и после связывания .

Кинетика связывания СТ и ВСТ с липосоыальной мембраной (рис.ю), содержащей периленоил-меченый ганглиоэид pgmi, показывает небольшое уменьшение квантового выхода флуоресценции триптофилов холерного токсина в отличие от триптофилов В-субъединицы. Эти изменения могут говорить лишь о незначительном смещении Ai-пептида относительно ВСТ (возможно он несколько погружается внутрь кольца В-пентамера).

Представляет определенный интерес вопрос о том, насколько эффективно взаимодействует ВСТ с фосфолипидным бислоем посла связывания с gmi на поверхности липосомальной мембраны. По данным (Tomasi & Hontecucco, 1S82) известно, что после связывания с мембранами липосом, содержащих ганглиозид gmi, ВСТ металась фотоактивной радиоактивной меткой, прикрепленной к жирно-кислотной цепи фосфатидилхолкна по положении сг и не метилась такой же меткой, прикрепленной по положению ci2. Поскольку эти данные не дают точных значений расстояний, насколько глубоко ВСТ проникает в мембрану, мы исследовали перенос энергии с триптофилов ВСТ на периленоилы периленоил-меченого фосфатидил-холина (ррс) с целью определения минимального расстояния между триптофилами ВСТ и периленоилами РРС внешнего монослоя, с последующим сравнением этого расстояния с минимальным расстоянием между донором и акцептором в липосомах, содержащих ганглиозид pgmi и ВСТ. Периленоильный флуорофор присоединен к жирно-кислотной цепи фосфатидилхолина также как и ганглиозида gmi по положении С9. Различие между этими системами состоит в том, что после связывания ВСТ с pomi расстояние триптофил - перила-^ ноил остается постоянным, так как флуорофоры как бы связаны между собой через углеводный фрагмент и жирнокислотную цепь ганглиозида pgmi; а это же расстояние в системе BCT-POPC-PPC-gmi может меняться. Например, при погружении ВСТ внутрь мембраны расстояние триптофил ВСТ - периленоил ррс внешнего монослоя будет меньше, чем расстояние триптофил ВСТ ~ периленоил pgmi внешнего монсслоя. Даже при незначительном погружении В-субъединицы в лигшдный бислой ляпосомы могло зарегистрировать разницу в зависимостях рф$ективностей переноса энергии от поверхностной плотности акцептора в этих системах, так как значение расстояния между тршггофилаии ВСТ и першюно-

IPPCÎ/IPOPC]

Рис. ю. Изменение триптофановой флуоресценции ВСТ <i,2> и СТ (3,4) после связывания с липосоыами, содержащими ганглиозид gmi (х.з> и pgmi <2,4>. Концентрация добавленного белка o.i мкМ, РОРС - 200, gmi - з, pgmi - з мкг/мл; возбуждение и испускание при 292 и 339 ны соответственно, полосы пропускания монохроматоров воз буждений и эмиссии соответственно 3 и 5 нм. Т-ра 36 ъ.

Рис. il. Теоретическая и> и экспериментальная <2> зависимости эф$ективностей переноса энергии с трипто$шюв ВСТ на периленоилы РРС от поверхностной плотности РРС в липосомах, содержащих ганглиозид gmi и периленоил-ме-ченый фосфатидилхолин.п Теоретическая зависимость расчитана для us - 24.7 к. Т-ра 36 С.

«

Рис. 12. Схематическое изображение холерного токсина, связанного с ганглиозидом гем1. ее - триптофмьный остаток ВСТ, р - периленоильный флуорофор, е - углеводный фрагмент ганглиозида рсм1. схема составлена по данным <з1хша et а!., 1991) и настоящей работы.

илами рсм1 (31.5 Я) сравнимо со значением ферстеровского радиуса для пары триптофил (ВСТ) - пераленоил (24.9 Я).

На рис. и звездочками показаны экспериментальные данные зависимости Е ((ррс/рорс)) для системы вст-сш-ррс (табл.4), которые хорошо согласуются с теоретической зависимостью в от поверхностной плотности акцептора при минимальном расстоянии между триптофышми ВСТ и периленоилами ррс м « 24.7 Это расстояние несколько ниже значения расстояния от триптофилов ВСТ до периленоилов ганглиозида Рвт (31.5 Я), что может свидетельствовать о той, что после связывания с липосомальным ганглиозидом ВСТ на 6-7 Я погружается в мембрану липосомы.

На рис. 12 представлена модель холерного токсина, связанного с липосомальной мембраной, содержащей ганглиозид рат.

ВЫВОДЫ

1) Установлено, что ВСТ в процессе взаимодействия с мембраной липосомы, содержащей ганглиозид вм1, погружается в мембрану на 6-7 X.

2) ВСТ не образует трансмембранного канала, по которому А-субъединица холерного токсина могла бы проникать внутрь клетки-мишени.

3) Установлено, что в момент связывания СТ с мембраной липосомы Ашептид располагается над ВСТ и после связывания, токсина с липосомой, содержащей ганглиозид сзм1, существенно не изменяет своего положения по отношению к ВСТ и поверхности ли-посоыальной мембраны.

4) Показано, что в процессе взаимодействия СТ и ВСТ с липо-сомами не происходит разрыхления гидрофобной области мембраны липосомы, по крайней мере, в месте связывания белков.

5) Установлено, что А-субъединица холерного токсина не изменяет анизотропию флуоресценции антрилвинила ганглиозида асм1, что свидетельствует об отсутствии ее взаимодействия с фпуорофором и о малой вероятности ее проникновения в гидрофобную область мембраны липосомы, по крайней мере, в месте связывания токсина с мембраной.

б / Определены стехиометрия комплекса холерина токсин (ВСТ)-ганглиоаид йт (аои , рамп - 115 и константа диссоциации /ка> комплексов: холерный токсин-гаяглиоэвд см1 (лот, рсмп -о.з - о.5 им,- В-субьединицв холерного токсина-гвнглиозид омг

(аом1) - 0.2 - 0.1 им.

Основное содераание диссертации опубликовано в статьях:

1. Сурин А. и., Асташющ Е. И., Смирноа О. Н., Михалев И. И., Молотковский Пл. Г., Бергельсон Л. Д. Исследование взаимодействия В-субгедшшцы холерного токсина с лило сомами. Тезисы докладов: "Современные направления развития биотехнологии"

МОСКВа. 1991. С. 70.

2. Сурин А. 19.. Асташкив В. И., Смирнов 0. Н., Михалев И. И., йолотковский Пл.- Г,, Бергельсон Л. Д. Исследование взаимодействия В-субъедишцн холерного токсина с липосомами, содержащими ганглигоэвд ©и и флуоресцентно-меченые липиды. Биол. МвМбраНЫ, 1992. Т. 9. К 5. С. 495-508.

3. Смирнов 0. Н., Сурин А. Ы., Асташкин Е. И.. Михалев И. И., Молотковский Пл. Г. Исследование взаимодействия холерного токсина и его В-субъедииицы с липосомами, содержащими ганглиозид от, и флуоресцентно-меченые ганглиозида. Биол. иембраны. 1995, Т. 12. И г. С. 174-18«.

НСрТИ тиГ /00 2+.ОУ.