Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы внутриклеточного транспорта белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы внутриклеточного транспорта белков"

Геттипгенский университет имени Георга Августа

* е«» *. с-

На пранах рукописи УДК 577:519

Мажуль Ирина Вячеславовна

Молекулярные механизмы внутриклеточного транспорта белков (на примере субъединнц холерного токсина)

03.00.02 - Биофизика

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Гстгингсн - 1997 г.

Официальные оппоненты:

1. Академик, доктор биологических наук, профессор Н.Н.Никольский.

2. Доктор биологических наук, профессор Ю.В.Козлов.

3. Доктор биологических наук, профессор С.Э.Шноль.

Ведущая организация:

Кафедра молекулярной биологии биологического факулм Московского государственного университета имени М.В.Ломоносс

Защита состоится^"" 1997 г. в & ч. ^мин.

на заседании диссертационного совета Д - 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики Р (Московская область г. Пущино).

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомить библиотеке ИТЭБ РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана ЛаЛ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

П.А.Нслип(

Введение

Сложная организация эукариотических клеток требует налаженных механизмов внутриклеточного транспорта белков. Новейшие исследования показали, что механизмы, лежащие в основе таких функционально важных процессов как зндо - и экзоцитоз уникальны и, сохранившись в процессе эволюции, эффективно действуют как в клетке дрожжей, так и в нейроне гиппокампа (Rothman, J.E., Wieland, F.T., 1996. Science 272, 227-234).

Как зндоцитоз лиганд-рецепторного комплекса с поверхности плазматической мембраны, так и транспорт вновь синтезируемых секреторных белков из эндоплазматического аетикулума (ЭР) через цис-, медиал-, транс- Гольджи к поверхности плазматической мембраны осуществляются в везикулах. Транспортные везикулы формируются и отпочковываются от донорной мембраны и после осуществления внутриклеточного транспорта сливаются с акцепторной мембраной. (Palade, G., 1975. Science, v-189, p. 347-358). Предполагается, что слияние двух мембран осуществляется при взаимном распознавании рецептора транспортной везикулы (v-SNARE) рецептором акцепторной мембраны (t-SNARE), (Rothman, G.E., 1994. Nature, 372, p. 55-63). Специализированные белки цитоплазмы покрывают вновь образуемые везикулы. К настоящему времени в зависимости от вида покрывающих белков охарактеризовано четыре типа транспортных везикул:

1) клатрин содержащий комплекс АР-1 (от адаптор протеин) образуется на поверхности транспортных везикул, циркулирующих между аппаратом Гольджи и эндосомами.

2) клатрин - содержащий комплекс АР-2 покрывает транспортные везикулы, циркулирующие между плазматической мембраной и эндосомами;

3) клатрин - несодержащий С0Р1 комплекс (COated Protein - покрывающий везикулу белковый комплекс). СОР осуществляет транспорт между аппаратом Гольджи и эндоплазматическим ретикупумом и состоит из семи цитоплазматических белков («, р, р, у, 6, с, £ ), с молекулярной массой от 110 до 24 кД (Malhotra, V., et al. 1989. Cell, 58, 392-336);

4) СОРИ комплекс осуществляет транспорт от эндогшазматического ретикулума до аппарата Гольджи.

Сигналы, регулирующие ассоциацию в норме цитоплазматических СОР белков на поверхности донорной мембраны, до настоящего момента остаются неизвестны. Было показано, однако, что образование везикулы на донорной мембране инициируется связыванием с ней АРФ -аденозин рибозилирующего фактора, относящегося к семейству малых ГТФ-связывающих белков. АРФ впервые был обнаружен как кофактор, необходимый для АДФ-рибозилирования А-субъединицы холерного токсина, (Капп, R.A., and Gilman, A.G., 1984. J. Biol. Chem. 259, 6228-6234).

Предполагается, что источником энергии для везикулярного транспорта служат АТФ и ГТФ, которые могут расщепляться соответствующими АТФазами и ГТФазами. Гидролиз ГТФ могут осуществлять малые ГТФ связывающие белки. Известно, что ГДФ связанная форма этих белков неактивна и находится в цитоплазме, а активная ГТФ форма на везикулярной мембране. (Zerial, М., Stenmark, Н. 1993. Curr. Opin. Cell Biol. 5, p. 613-620). Было показано также, что в бесклеточной системе ГТФ-v-S препятствует слиянию изолированных мембран аппарата Гольджи (Melancon, P., et al.1987. Cell, V-51, р.1053-1062).

Остаются нерешёнными такие вопросы как регуляция доставки специфических молекул к их акцепторным компартментам; механизм разделения разнонаправленных транспортных потоков в клетке (секреция и эндоцитоз): механизм распознавания транспортными везикулами соответствующей акцепторной мембраны и механизм слияния с ней. Неясно, какие механизмы позволяют

поддерживать точный и эффективный перенос веществ внутри клетки и какова природа сигналов, поступающих со стороны карго для регуляции транспорта. Вопрос о том, участвуют ли моторные системы клетки в везикулярном транспорте, также остаётся открытым.

В 1990 было предложено использовать вирус везикулярного стоматита (VSV-G) для исследования транспорта вновь синтезированных вирусных белков из эндоплазматического ретикулума к плазматической мембране (Balch, W.E., 1990. Curr. Opin. Cell Biol. 2, 634664).

Для исследования везикулярного транспорта от плазматической мембраны до эндоплазматического ретикулума была предложена другая модель (Miesenböck, G. and Rothman, J. E.,1995. J.Cell. Biol. V. 129, p. 309-319), в которой использовались антитела связываемые на поверхности мембраны с антигеном и транспортируемые в аппарат Гольджи. Когда комплекс достигал аппарата Гольджи, дисульфидная связь между антителом и KDEL-пептидом расщеплялась с помощью DTT. После обработки клеток редуцирующим агентом, свободная KDEL последовательность должна была связываться с KDEL-рецептором, локализованным в аппарате Гольджи. Везикулярный транспорт от аппарата Гольджи до эндоплазматического ретикулума контролировался по N-гликозилированию KDEL-пептида в N-X-T положении ( N-гликозилирование в клетке может осуществляется только в эндоплазматическом ретикулуме). Одним из существенных недостатков такой сложной модельной системы была необходимость обработки клеток редуцирующим агентом (ДТТ), побочный эффект которого трудно контролировать.

Была также предпринята попытка использования Shiga-токсина для исследования везикулярного транспорта с применением метода электронной микроскопии, (Sandvig, К., et.al. 1994. J.Cell.Biol. 126, p. 53-64 ). Однако главные недостатки этой системы состояли в том, что во-первых, количество экзогенного токсина в клетке было незначительно по сравнению с эндогенными белками; во-вторых, фиксация обработанных токсином клеток сильно блокировала экспонирование антигенных участков для

распознавания антителами. Эти объективные трудности в исследовании не позволяли устанавливать точную внутриклеточную локализацию токсина во время транспорта и исследовать факторы, регулирующие транспорт.

К моменту начала наших исследований с использованием холерного токсина (XT') считалось, что после интернализации с плазматической мембраны (ПМ) токсин попадает в эндосомы, где "генерируется" свободная AI субьединица, которая транслоцируется через эндосомальную мембрану и проникает в цитоплазму (Janicot, M., Desbuquois, В. 1987. Eur. J. Biochem. V.163, p. 433-442). Однако, было непонятно, каким образом дисульфидная связь между AI и А2 субьединицами может расщепляться в эндосомах в отсутствие редуцирующих агентов.

После получения нами высокоспецифических антител к субьединицам XT (А1, А2, В) и использования антител к маркерным белкам внутриклеточных компартментов мы показали, что все три субьединицы транспортируются через эндосомы в аппарат Гольджи, и оттуда А субьединица продолжает транспорт а направлении эндоплазматического ретикупума (ЭР). (MajouU. et al. 1995. Eur.J.Cell.Biol., EC80 Supplement, p.56).

Интерес к XT вызывала и существующая гипотеза о том, что один из трансмембранных белков аппарата Гольджи служит рецептором для резидентных KDEL-белков ЭР и может "по ошибке" транспортировать в ЭР также содержащую KDEL-сигнал А субьединицу XT. В норме часть белков ЭР попадает в поток секретируемых белков. Для того, чтобы предотвратить секрецию функционально значимых резидентных белков ЭР, трансмембранный рецептор, находящийся в аппарате Гольджи, связывает их через С-концевую сигнальную последовательность KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) и возвращает везикулярным транспортом в ЭР, (Pelham H.R.B., 1989. Annu. Rev. Cell Bioi. 5, 1-23).

Сравнение KDEL, С-концевой аминокислотной последовательности резидентных белков ЭР с недавно опубликованной аминокислотной последовательностью XT ( Dames и др. 1991, Таблица. 1 ) показало, что

А субьединица ХТ действительно обладает природной С-концевой последовательностью - К0Е1_. На основании этого возникло предположение о возможном распознавании А субьединицы ХТ трансмембранным КОЕЬ-рецептором и транспорте связанного токсином рецептора из аппарата Гольджи в ЭР.

Выбор ХТ для изучения внутриклеточных механизмов везикулярного транспорта был обусловлен следующими факторами:

1 - сходством КОЕЦ С - концевой сигнальной последовательности ХТ с С-концевой сигнальной последовательностью резидентных белков ЭР;

2 - наличием трансмембранного КОЕЬрецептора в аппарате Гольджи;

3 - данными о транспорте ХТ с поверхности цитоплазматической мембраны в аппарат Гольджи, полученными в эксперименте;

4 - предположением о возможном взаимодействии КОЕЬрецептора с ХТ;

5 - возможностью транспорта связанного ХТ рецептора из аппарата Гольджи в ЭР.

Таким образом, детальное исследование механизмов везикулярного транспорта ХТ открыло бы возможности его внутриклеточной регуляции.

В результате проделанной нами работы было показано, что, по крайней мере, три фактора могут предотвратить везикулярный транспорт ХТ в клетке. Разрушение системы микротрубочек нарушало везикулярный транспорт ХТ и препятствовало возрастанию уровня цАМФ в клетках, обработанных и нокодазолом и ХТ. Микроиньекция СТР-у-Б и функционально активных антител к р-СОР белку, участвующему в образовании транспортных везикул, останавливали трансторт ХТ.

Актуальность проблемы

Компартментализация внутриклеточных процессов в клетках эукариот привела к развитию регулируемого транспорта веществ. Эксперименты последних лет показали, что внутриклеточный транспорт не является хаотичным

процессом, а осуществляется в ограниченных мембранами трэкспортных везикулах.

Внутриклеточный везикулярный транспорт лежит в основе таких функционально важных для живой клетки процессов как эндо - и зкзоцитоз. Сохраняясь в процессе эволюции, везикулярный транспорт эффективно действует в каждой эукариотической клетке. Гомологичные молекулы, участвующие в образовании транспортной везикулы, идентифицированы в клетке дрожжей и в нейроне гиппокампа. Везикулярным транспортом доставляются многочисленные белки (например, лиганды клеточных рецепторов) с поверхности цитоплазматической мембраны во внутриклеточные компартменты, а также осуществляется транспорт вновь синтезированых белков (клеточных, секреторных, нейротрансмиттеров).

Однако молекулярные механизмы, осуществляющие регуляцию в доставке специфических молекул к их акцепторным компартментам, остаются невыясненными. Несмотря на то, что многие транспортные белки уже выделены и проклонированы, (например группа СОР белков), исследование функций этих белков в живой клетке достаточно сложно в исполнении и интерпретации.

В разное время предпринимались попытки создания моделей везикулярного транспорта с целью исследования факторов, регулирующих этот внутриклеточный процесс. Предложенные системы были достаточно сложны, трудно воспроизводимы, вызывали неконтролируемые побочные эффекты (например, необходимость дополнительной обработки клеток ДТТ для внутриклеточного высвобождения связанного с носителем белка, Miesenböck и др.1995) и не позволяли эффективно исследовать механизмы, участвующие в регуляции транспорта.

Поэтому остаётся актуальной проблемой создание и разработка простой модели, позволяющей изучать механизмы везикулярного транспорта и функции отдельных белков, регулирующих формирование, распознавание и слияние везикул с акцепторной мембраной.

Трудность в исследовании везикулярного транспорта состоит также в необходимости разграничить

разнонаправленные транспортные потоки, функционирующие в живой клетке одновременно. Поэтому предложенные модели с экспрессией в клетке одного из транспортируемых белков сводились к циркуляции этого белка, например, между аппаратом Гольджи и эндоплазматическим ретикулумом. В этом случае отделение антероградных везикул, направленных от ЭР к аппарату Гольджи от ретроградных, идущих в противоположном направлении, оказывалось невыполнимым.

Согласно современным представлениям, формирование транспортной везикулы на мембране внутриклеточного компартмента начинается после взаимодействия белков, переносимых везикулой, с трансмембранным рецептором. Изменение структурного состояния связанного рецептора может распознаваться цитоплазматическими белками, которые ассоциируются с мембраной и инициируют образование транспортной везикулы. Однако в настоящее время нет надёжного метода, позволяющего регистрировать формирование таких функционирующих белковых комплексов в живой клетке.

Успешное применение такого метода открыло бы возможности для исследования и мониторинга многочисленных белковых комплексов (а также РНК, ДНК-белковых), которые формируются в клетке для регуляции везикулярного транспорта, связанного с ним выброса нейромедиаторов, секреции, эндоцитоза а также комплексов, участвующих в транскрипции, трансляции и внутриклеточной передаче сигнала.

Таким образом, исследование механизмов внутриклеточного везикулярного транспорта на предлагаемой модельной системе субьединиц холерного токсина с применением метода флюоресцентного резонансного переноса энергии (ФРПЭ) при мониторинге происходящих внутриклеточных процессов, представлялось актуальным, современным, и перспективным.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы - исследование механизмов, лежащих в основе везикулярного транспорта белков. Предполагалось, что нехоторые сигнальные последовательности переносимых везикулами молекул распознаются трансмембранными рецепторами и определяют сортировку и путь конечнго наначения этих белков. Объектом исследования транспорта был выбран холерный токсин. Все три субъединицы холерного токсина, ответственные за различные участки внутриклеточного везикулярного транспорта, были использованы как модельные системы.

Экспериментальные задачи исследования состояли в следующем:

1). Получить высокоспецифичные антитела к субъединицам холерного токсина( XT).

2). Используя полученные антитела разработать воспроизводимую во временной зависимости модель транспорта субъединиц холерного токсина в клетке.

3). Выделить маркерные белки внутриклеточных компартментов (Гольджи, эндоплазматического ретикулума и др.) и получить к ним антитела, позволяющие морфологически охарактеризовать эти внутриклеточные компартменты и идентифицировать присутствие в них холерного токсина.

4). Получить холерный токсин, меченый флюорохромами с различной длиной волны возбуждения (Oregon Green, ФИТЦ -488 нм, СуЗ - 546 нм, Су5 - 633 нм).

5). Показать транспортную и функциональную (способность вызывать возрастание уровня цАМФ) активности меченого холерного токсина в клетке.

6). Оценить структурное состояние А и В субьединиц в составе нативного XT и проследить изменения структурного состояния в процессе внутриклеточного везикулярного транспорта методом ФРПЭ.

7). По измерению эффективности переноса энергии зарегистрировать расхождение субьединиц XT и выяснить, в каких внутриклеточных компартментах это происходит.

8). Используя разработанную модельную систему выяснить, какие факторы (белки цитоплазмы, моторные системы клетки, трансмембранные рецепторы внутриклеточных компартментов) участвуют в везикулярном транспорте .

9). На основании полученных результатов изучить возможность регуляции внутриклеточного везикулярного транспорта XT.

Научная новизна работы

В результате проделанной работы впервые показано, что энзиматически активная А субъединица холерного токсина после интернализации с поверхности цитоплазматической мембраны транспортируется в аппарат Гольджи и, связываясь там через KDEL - сигнальную последовательность аминокислот с трансмембранным рецептором, продолжает обратный транспорт в ЭР, (Majoul, I.V., et. al. J.Ceil Biol. 1996, 133-4, 777-789).

Это открытие меняет изложенное во многих учебниках представление о том, что транслокация холерного токсина в цитоплазму осуществляется прямо после эндоцитоза через эндосомальную мембрану.

В данной работе впервые применена новая модификация спектроскопического метода - ФРПЭ, позволившая провести мониторинг изменения структурного состояния субьединиц холерного токсина в процессе везикулярного транспорта в живой клетке. В основе использованного метода флюоресцентного дзонансного переноса энергии (ФРПЭ-метод), лежит физический процесс образования донор-акцепторной пары при возбуждении донора, находящегося

на расстоянии 3 -7 hv er акцептора (Cagg, Я.'995). При расхождении меченых флюорехромами субьединиц холерного токсина во время транспорта донор - акцепторное расстояние увеличивалось и резонансный перенос энергии прекращался. Обычное разрешение српюсресцентнсго микроскопа составляет 200 -300 нм; таким образом новый метод - ФРПЭ открывает возможность исследования белок - белковых взаимодействий на расстоянии 3 -7 нм.

С помощью метода ФРПЭ было показано изменение расстояния между субьединицами холерного текемна so время транспорта, а также возникающие взаимодействия субъединиц холерного токсина с внутриклеточными рецепторами и другими белками, участвующими в транспорте. Было установлено, что флюоресцентно меченые А и 3 цепи, ассоциированные в составе холерного токсина, после перемещения с плазматической мембраны в аппарат Гольджи распадаются на А и В субъединицы, что обусловливает исчезновение резонансной передачи энергии между флюорохромами при расхождении А и В субъединиц на расстояние более 7 нм (Bastiaens,P.I.H., Majoul,!.V., EMBO J.,199b, V-l 5, Nr.! 6, p. 4246-4254).

Впервые показано, что в эндоплэзматическом ретикулуме А субъединица холерного токсина образует комплексы с PDI (протеин дисульфид изомеразой), которая способствует восстановлению -S-S- связи между Al и А2 цепями. Показано также, что восстановление дисульфидкой связи А субъединицы холерного токсина может осуществляться в эндоплазматическом ретикулуме, в условиях, где вновь синтезируемые белки в норме окисляются в момент формирования третичной структуры.

В бесклеточной системе воспроизведены окислительно-восстановительные условия эндоплазматического ретикулума. Реконструировано восстановление А субъединицы холерного токсина в присутствии очищенного белка - протеин дисульфид изомеразы (PDI) и подтверждена возможность образования комплексов между А субъединицей XT и PDI. (Majoul, I.V., и др. FEBS letters, 1 997. В печати).

Используя экспрессию флюоресцирующего в живой клетке GFP - (зеленого флюоресцентного белка), связанного

с трансмембранным KDEL - рецептором, мы впервые показли, что связанный А субъединицей KDEL-рецептор перемещается из аппарата Гольджи в эндоплазматический ретикулум (Majoul, I.V.,et al. 1996, 2nd. Int. FLIM Simposium, p.12, Abstr. book. )

Показано, что моторные системы клетки регулируют везикулярный транспорт. Разрушение системы микротрубочек нокодазолом подавляло возрастание уровня циклического АМФ в обработанных токсином клетках, и свидетельствовало о необходимости существования интактного везикулярного транспорта для реализации токсического действия, (Majoul, I.V., et al. J.Cell Biol. 1996, V.133, N. 4, p.777-789).

Впервые также показано, что везикулярный транспорт между аппаратом Гольджи и эндоплазматическим ретикулумом осуществляется при участии цитоплазматического белка ß-COP (110 кД), который ассоциируется с мембраной аппарата Гольджи, очевидно, уже после связывания освободившейся от В А субьединицы с трансмембранным рецептором. Микроиньекция функционально активных антител к СОР белку предотвращала транспорт А субьединицы холерного токсина в эндоплазматический ретикулум (Majoul,I.V., et al., Oncogens and Growth control, Heidelberg, p. 138, 1996).

Научно - практическая ценность работы

Обобщение результатов полученных нами данных показало, что холерный токсин представляет собой уникальный обьект для фундаментальных исследований биологии клетки. Изменение уровня циклического АМФ представляет собой независимый параметр действия холерного токсина, отражающий эффективность внутриклеточного транспорта XT. Новая воспроизводимая во времени модель транспорта холерного токсина в живой клетке может быть использована для более эффективного исследования внутриклеточных механизмов передачи сигнала, системы вторичных мессенджеров, рецептор-опосредованного эндоцитоза; для изучения нового типа движения везикул по микротрубочкам, для исследования

роли трёхмерных G-белков и малых GTP-связывающих белков в регуляции внутриклеточного транспорта.

Впервые показано, что А субьединмца холерного токсина транспортируется зезикулярным транспортом в направлении противоположном секреторному пути з эндоплазматический оетикулум клетки, где - S-S- сзязи между А1 и A2-KDEL субьединицами могут восстанавливаться. Свободная энзиматически активная А1 субьединица проникает в цитоплазму, где вызывает возрастание уровня цАМФ через активацию аденилатциклазы. В дальнейшем знание того, что А субьединица холерного токсина должна пройти весь путь до эндоплазматического ретикулума а не закончить его в эндосомах, как считали ранее, имеет фундаментальное значение для токсикологии и может использоваться з медицине для разработки новых препаратов и более успешного лечения заболевания.

Установлено, что В субьединица холерного токсина, обладающая липофильными гидрофобными свойствами, после отделения от А субьединицы удерживается в мембране аппарата Гольджи и транспортируется в лизосомы, где подвергается деградации. Это свойство В субъединицы холерного токсина может быть использовано з будущем для создания иммунотоксинов с цепью направленной доставки лекарственных веществ в определённые внутриклеточные компартменты.

Разработан новый современный метоп изучения белок-белковых взаимодействий внутри клетки, основанный на флюоресцентном резонансном переносе энергии - ФРПЕ. В настоящее время только два метода позволяют достаточно точно исследовать взаимодействие белков, однако ни двух гибридная система (two hybrid system), ни фаговый дисплей (phage display) не позволяют работать внутриклеточно. Применение предложенного нами уникального метода определения белок - белковых взаимодействий (Bastiaens,P.l.H., Majoui,I.V.,EMBO J., V-15 N-16, p. 42464253, 1996) позволите будущем воссоздать во времени трёхмерную картину белок-белковых а также ДНК-бепковых и РНК- белковых взаимодействий внутри живой клетки.

Предложенная автором модель везикулярного транспорта с использованием холерного токсина

применяется на курсах ЕМВО (Европейская молекулярно-биологическая организация), как пример внутриклеточной регистрации белок-белковых взаимодействий.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Использование ХТ как модельной системы позволило установить неизвестные ранее механизмы внутриклеточного везикулярного транспорта.

2. Впервые был применён метод флюоресцентного резонансного переноса энергии (ФРПЭ-метод), который позволил показать, что разделение А и В субьединиц ХТ происходит в аппарате Гольджи. Разрешение метода ФРПЭ (3-7 нм) на два порядка превосходит разрешение лазерного сканирующего микроскопа (200 нм) и открывает возможность исследования белок-белковых взаимодействий в живой клетке.

3.. Впервые показано, что транспорт и транслокация А-ХТ в цитоплазму осуществляется не в эндосомах, как считали ранее, а в ЭР. Таким образом А-ХТ проходит весь ретроградный путь от ПМ через аппарат Гольджи в ЭР.

4. Внутриклеточный везикулярный транспорт А-ХТ в ЭР регулируется специфической сигнальной последовательностью аминокислот - KDEL, которые распознаются трансмембранным рецептором, локализованным в аппарате Гольджи.

В комплексе с трансмембранным KDEL-рецептором группа цитоплазматических СОР белков участвует в образовании транспортных (Гольджи-ЭР) везикул.

В бесклеточной системе реконструирован обнаруженный ¡n vivo процесс образования дисульфидных связей между А субьединицей ХТ и протеин дисульфидизомеразой (PDI).

Апробация работы Материалы работы докладывались на следующих международных конференциях и конгрессах:

1992 - международной конференции "Онкогены и

контроль роста", (Гайдельберг, Германия);

1993 - 2й международной конференции Биохимия

клеточных мембран IU8M3 (Бари, Италия, 1993);

1993 - немецко-датском обществе по клеточной биологии,

(Мюнстер, Германия);

1994 - Мосбах коллоквиум по гликозилированию белков,

(Мосбах, Германия)

1995 - совместном англо-немецком обществе по клеточной

биологии, ЕСВО, (Гайдельберг, Германия, 1995);

1996 - на ежегодном конгрессе немецкого общества

клеточных биологов (Гамбург,1996); 1996 - на 3-й международной конференции ЕМВО "Сортинг и процессинг белков" (Аннаберг, Сант-Мартин, Австрия,! 996); 1996 - на 1 Коллоквиуме немецкого научного общества "GTP-азы как центральные регуляторы внутриклеточных функций", (Ульм, Германия); 1996 - на II Международном конгрессе по флюоресценции (Fluorescence Lifetime Imaging), (Утрехт, Нидерланды);

1996 - на 37-м конгрессе американского

общества клеточных биологов;

на 6-м Интернациональном Конгрессе по Клеточной

Биологии (Сан-Франциско, США, 7 -12. 12. 1996).

1997 - на коллоквиуме немецкого научного общества SFB

(Sonderforschungsbereichs 236) "Внутриклеточный обмен веществ и передача сигнала". (Гёттинген, Макс-Планк-Институт Экспериментальной медицины, Германия)

Лекции, прочитанные по теме диссертации:

1996 - Применение метода флюоресцентного резонансного переноса энергии в биологии. (Гёттинген, Университет, Германия).

1996 - Функциональное рассечение аппарата Гольджи -

исследования с использованием холерного токсина. (Мюнстер, Университет, Германия);

1997 - Регуляция обратного транспорта между аппаратом

Гольджи и эндоплазматическим ретикулумом. (Париж, Институт Кюри, Франция).

II Экспериментальная часть

1. Материалы и методы

1. Материалы.

Холерный токсин (XT) и его отдельные субьединицы А и В получали от фирм: Calbiochem, Co. La Jolla, CA, USA; Sigma, St. Louis, MO, USA; LIST, Biological laboratories, Campbell, CA, USA.

Использованный в работе моноганглиозид GM-1 был произведён на фирме RBI, Natick, MA, USA.

NHS-LC- биотин предоставлен Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA.

[3H] - уридиндифосфатгалактоза получена от фирмы Amersham-Duchler, Braunschweig, Германия.

Сульфоиндоцианиновые красители СуЗ и Су5 были производства Biological detection Systems, Pittsburg, PA, USA.

Протеин-A сефароза и папаин-агароза были получены от фирмы Pharmacia, Uppsala, Sweedn.

Для концентрирования очищенных белков использовали малые амикон-центриконовые концентраторы (до 5000g av.) фирмы Amicon-Centricon, Beverly, USA.

Нокодазол, таксол, цитохалазин Б и брефелдин А были фирмы Sig га, St. Louis, МО, USA.

Реагенты для клеточных культур получали от GibcoBRL, Life Technologies, Германия.

ДЕАЕ-целлюлоза, сефадекс и др. материалы для разделения белков были фирмы Whatman, UK.

Нитроцеллюлозные мембраны (Schleicher&Schull, Dassel), PVDF-мембраны (Roth, Karlsruhe) и ретнгенфильм (Cronex MRF 31, Du Pont, Bad Homburg) Германия.

Вектор M13 mp19 получен от Stratageri, USA. Плазмида pJS 752-3 (производная от pKK223-3), содержщая ген В-субьединицы холерного токсина, была любезно предоставлена Dr. J. Sanchez, Mexico.

Рестрикционные эндонуклеазы были фирмы GibcoSRL. Life Technologies, FRG. T4 пслинукпеотидхиназа и ДНК-лигаза были от Amersham-Duchler, Braunschweig, FRG. ДНказа 1, РНказа А и щелочная фосфатаза были производства Boehringer, Mannheim. FRG; Taq-лолимераза от фирмы Perkin Emier Cetus.

Клеточные линии: S большинстве экспериментов использовали Vero (фибробпастоподобные клетки почки зелёной африканской мартышки). Для некоторых антител использовали NIH-3T3 (мышиные фибробласты) и фибробласты кожи человека.

Антитела :

Все поликлональные и эпитоп-специфичесхие антитела против А, В, Al и А2 субьединиц холерного токсина (XT) были получены автором. Субьединицы холерного токсина разделяли при помощи препаративного электрофореза с последующей диализацией из геля. В случае эпитоп специфических антител пептид сшивали с гемоцианином. А2 пептид представлял собой NH2- KRQIFSGYQSDIDTHNRI-COOH. Поликлональные пептидные антитела к цитоплазматическому С-концевому участку расположенного в Гольджи трансмембранного рецептора к А субьединице холерного токсина (aHTM-ERD2) были получены автором после иммобилизации на гемоцианине пептида CLYITKVLKGKKLSLPA. Маркерные антитела к белкам эндоппазматического ретикулума (CaBPl, СаВР2, кальретикулину, протеиндисульфидизомеразе (PD1) и др. белкам были получены в сотрудничестве с работниками лаборатории ( P. Nguen Van, J. Fullekrug). Антитела к лизосомальному ферменту катепсину Д были от Dr. A. Hille, университет Гёттинген. Антитела к интермедиат-компартменту, расположенному между аппаратом Гольджи и эндоплазматическим ретикулумом (р53 ERGiC), Dr. Н.Р. Hauri, Базель, Швейцария.

Функционально активные антитела к белку ß-COP, впервые описанному в работе (Реррегкок, R., Kreis, Т. et.al. ß-COP is essential for biosynthetic membrane transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi complex in vivo. Cell,

1993, V. 74, p. 71-82), были получены диссертантом после иммобилизации EAGE-пептида на гемоцианине. Вторичные флюоресцентно меченые FITC-, TRITS- и СуЗ-антитела против F с фрагментов были получены от фирмы Dianova, Jackson Immunoresearch Lab., Hamburg, Германия.

2. Методы:

Биохимические:

2.1-Радиоактивное мечение XT. ХТ-А. KDEL - пептидов. Для иодинирования XT использовали [125 )]> специфическая активность которого была 850 Кюри/мМ. Мечение осуществляли по хлорамин - Т методу. Меченый XT токсин, А и В субъединицы и KDEL-пептиды отделяли от несвязавшейся метки гельфильтрацией на Сефадексе G-75. Фракции с максимальной активностью, тестированные после гельфильтрации на у-счётчике (Backman) использовали в эксперименте.

2.2. Электрофорез.

Одномерный электрофорез проводили в 5-20% полиакриламидном геле (в присутствии или отсутствии SDS и p-меркаптоэтанола) по методу Лаеммли (Laemmli, U., К. 1970. Nature, 227, р. 462 -464) или в оригинальной модификации используя непрерывную трис-бициновую буферную систему (Majoul, I.V. et al. 1997. Analytical Biochemistry, (в печати)).

Двухмерный электрофорез (изоэлектрофокусирование) субъединиц XT представлен на (Рис.1). Субъединицы XT разделяли в первом направлении в 5% растворе акриламида и 5% растворе амфолинов ( Sigma), pH 3 -10; 0,2% Nonidet Р-40; в присутствии 6М мочевины. Разделение во втором направлении производили в градиенте 5-20% полиакриламидного геля в присутствии SDS и редуцирующих агентов; ß-меркаптоэтанопа или DTT.

Радиоактивно меченые белки после электрофоретического разделения подвергались авторадиографии и экспонировались на плёнку Кодак.

2.3. Иммунобпоттинг.

Белки, разделённые в полиакрилзмиднсм гепе, переносили из 5 - 20% геля на мембрану (нитроцеллюлозную или PVDF) в полусухой камере в течение 1 часа (ток 100 тА. 6 mV на 5 см2 мембраны). После переноса белков мембрану блокировали в 0,05% Tween, 50 мМ Тоис-НС1, рН 7,4 1 50 мМ NaC! и инкубировали с антителами (в различном разведени 1:200/1:1000) против субьединиц XT или маркерных белков внутриклеточных компартментов. После окончания инкубации и удаления первых антител мембраны отмывали, блокировали и инкубировали со специфичными к первым вторыми антителами, связанными с пероксидазой. Присутствие связанной пероксидазы выявляли методом хемилюминесценции с использованием ECL-кита, (Eoehringer, Mannhein).

2.4. Иммунопреципитация.

Клеточный монослой инкубировали в среде без метионина с добавлением радиоактивно меченого (5 микроКюри/мл) [35S]- метионина (1000 C'i/mM, Amersham) и 10% сыворотки. После различных временных интервалов инкубации клетки отмызали и ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCI, рН 7.5, 140 мМ NaC!, в концентрации 107 клеток и лизировали дигитонином (10 мг/мл, 1 ч. 4° С). 10,000д супернатант лизата инкубировали с антителами, иммобилизованными на протеин А сефарозе (Pharmacia). Связанный в процессе инкубации белок осаждался вместе с протеин А сефарозой, промывался буфером и злюировался в Лаеммпи буфер для разделения электрофорезом.

2.5. Выделение и очистка маркерных белков.

Для получения белков ЭР гомогенат клеток печени быка после предварительного центрифугирования 1000 g (SI) подвергался повторному центрифугированию 10 000 g для получения (S2) супернатанта. Далее S2 центрифугировали 100 000 g для осаждения микросомальной фракции (М1), содержащей белки эндоплазматического ретикулума. Мембраны микросом разрушали на холоду (4°С) в течение 30 мин с помощью 0,1 М Na3C03,(pH 11,^. После

восстановления рН 7,3 остатки микросомальных мембран удаляли центрифугированием 100 ООО д. Белки эндоплазматического ретикулума, содержащиеся в последнем супернатанте наносили на ионообменник ДЕАЕ -целлюлозу. После удаления несвязавшейся фракции белки эпюировали градиентом соли в 20 мМ Трис-HCI буфере, ( рН

7.3), содержащем 1мМ EGTA и 0,1% р-меркаптоэтанола. Фракции ДЕАЕ целлюлозы, обладающие проводимостью 7-1 5 mS подвергались фи льтрированию, диализу и использовались для жидкостной хроматографии (FPLC). Хроматографию проводили на колонке Mono Q HR S/5 (до 20 мг), или HR 10/10 (более 20 мг) в зависимости от количества исходного материала. Материал эпюировали градиентом соли 0-1 M NaCI, приготовленном на буфере Трис-НCl, (рН 7,2) со скоростью120 мл/час для HR 5/5 колонки и 240 мл /час для HR 10/10 колонки. Смеси белков растворяли в разделяющем буфере 200 гпМ Трис-HCI; (рН

7.4); 150 mM NaCI; 0,1 тМ EGTA; 0,1%(v/v) меркаптоэтанола и разделяли жидкостной хроматографией.

2.6. Получение антител к белкам эндоплазматического ретикулума.

Поликлональные антитела против белков ЭР и получали по стандартной схеме путём подкожной иммунизации кроликов и морских свинок.

Полученные после повторной иммунизации антитела к антигену тестировали иммунобпотингом. Для детекции применяли высоко чувствительную систему, осонованную на хемилюминесценции пероксидазного субстрата.

2.7. Выделение иммунолобулиновой и аффинной фракции антител.

Для получения фракции иммуноглобулинов использовали Протеин-A сефарозу. Связанные антитепа эпюировали ацетатным или цитратным буфером (рН 3,5) с последующим диализом против фосфатного буффера (рН 7,2). Аффинную фракцию иммуноглобулинов получали на колонке с иммобилизованным антигеном с последующей элюцией и диализом.

2.8. Выделение Fab фрагмента с помощью папаин-згзрозы Для получения Fab фрагмента соответствующих антител использовали расщепление специфической -S-S- связи папаином, иммобилизованным на агарозе. Расщепление папаином контролировалось гель электрофорезом по появлению 25 кД фрагмента Fab в отсутствии редицирующих агентов. Контаминирующий Fe фрагмент удаляли с помощью протеин-A сефарозы.

2.9. Субклеточное фракционирование обработанных токсином клеток проводили в градиентах сахарозы или йодиксанола (1-25%), (Nycomed, Oslo, Норвегия). После инкубации с токсином клетки отмывали и удаляли клеточные мембраны путём продавпивания клеток через специальные фильеры с размером пор, меньшим диаметра клеток (20-50 микрон). После удаления ядер и остатков плазматической мембраны супернатант наносили на поверхность созданного градиента в К-глютаматном буфере.

2.10. Ферментный анализ субклеточных фракций: Определение галактозил-трансферазной активности во фракциях обогащенных аппаратом Гольджи проводили по методу (Verdón, В., Berger, E.G., 1983,Meth. Enzym. Anal., Galactosyltransferase. v 3, p.374-381).

В качестве маркерного фермента для ЭР использовали определение активности ротенон-нечувствительной цитохром С редуктазы в выделенных субклеточных фракциях, ( Sottocasa, G.L., et а!., 1967, J.Cell.Biol. v.32, p. 415-438).

2.11. Биотинилиоование клеточной поверхности.

Для эффективного отделения цитоплазматической мембраны от внутриклеточных компартментов в контрольных экспериментах проводили биотинилирсвание клеточной поверхности. Чашки Петри с клеточным монослоем переносили на лед. После охлаждения и промывания в фосфатном буфере клеточные мембраны обрабатывали в течение 10 мин раствором NHS-LC-биотина (Pierce Chemical Co.,Rockford, IL, USA) в конечной

концентрации 0,1 mg/mi. После удаления несвязанного биотина клеточную поверхность блокировали сменой трис-глициновых буферов для предотвращеня возможного биотинилирования внутриклеточных структур во время гомогенизации и субклеточного фракционирования дисульфид изомеразой

2.1 2. АДСР - рибозилирование мембранных белков. Клеточный монослой инкубировали в присутствии 0,5 мкг/мл холерного токсина с разными временными интервалами. Клетки ресуспендировали и гомогенизировали в среде, содержащей 20 mM HEPES (рН 7.о] 140 тМ КС!, 0,25 тМ MgCIZ- После осаждения клеточных ядер супернатант центрифугировали 30 мин. 100,000д. Осаждённые мембраны ресуспендировали в 10 мМ HEPES (рН 7.0) 1 мМ ЕДТА. Среда для определения АДФ-рибозилирования содержала 10 мкг мембранных белков в 25 мМ Трис-HCI /рН 7.^ 10 мМ ЕДТА, 10 мМ тимидмна, 1мМ АТФ, 100 мкМ ГТФ, 20 мкМ НАД+, 1 микроКюри [32ф] НАД+ на 10 мкг мембранного белка, (800 Кюри/мМ). Фракции инкубировали 30 мин при температуре 30°С. АДФ - рибозилирование останавливали добавлением 50 мкл буфера Лаеммли. Пробы выдерживали 5 мин при 95 °С и подвергали элетрофорезу в полиакриламидном геле. Для авторадиографии использовали рентген-фильм Кодак.

2.13. Обрзботка микросом трипсином как тест на интра- или экстра-везикулярную локализацию холерного токсина. После обработки клеток холерным токсином выделяли микросомную фракцию, содержащую белки эндоплазматического ретикулума и А субьединицу холерного токсина. Микросомы осаждали центрифугированием ЮО.ОООд в течение 1- 2 часов, промывали от цитоплазматических белков и снова осаждали. Обработку трипсином (30 мкг/мл, 10 мин) производили в присутствии или отсутствии 1 % (v/v) Triton Х-100. Образцы анализировали гель-электрофорезом в отсутствие редуцирующих агентов. В иммуноблотинге использовались знтител^против белков эндоплазматического ретикулума и против А субьединицы холерного токсина.

2Л4. Определение уровня циклического АМФ з обработанных токсином клетках

После обработки клеток холерным токсином уровень сАМФ определяли иммуноферментным анализом - ELISA, (Amersham-Buchler Co. RRPN 225) в соответствии с указаниями фирмы производителя.

Молекулярно-биологические методы:

2.15. Мечение субьединиц холерного токсина Фпюорохромами Cv-3 и Cv-5.

Для флюоресцентного мечения субьединиц холерного токсина использовали сукцинимидные эфиры индоцианиновых красителей Су2, СуЗ и Су5 (Biological Detection Systems, Pittsburg, PA, USA). Мечение белков осуществляется по остаткам лизина, поэтому буфферная система не должна была содержать аминогрупп. Использовали 20 мМ бициновый буфер. СуЗ-0-Su и Cy5-0-Su растворяли до конечной концентрации 20 мМ в диметилформамиде (DMF). Изменение концентрации pH от 8 до 9 увеличивало эффективность мечения. Ковалентное присоединение метки к субъединицам холерного токсина тестировали элетрофорезом в полиакриламидном гепе. Прокрашенный серебром гель наблюдался в ультрафиолетовом свете через LP550 (СуЗ) или LP650 (Су5) фильтры для идентификации метки, присоединившейся к белку. Характеристика меченого белка осуществлялась по отношению абсорбции (А) (метка/белок) 554 нМ/280 нМ для (СуЗ), вычисленной по формуле: А 554 М/[(А280-0.05 А554)*150] или 650 нМ/280 нМ для (Су5) соответственно: А 650М/[(А280-0.05 А650)*250], где М = молекулярной массе белка в кД; 1 50 и 250 мМ -1 см -1 коэффициенты экстинкции для СуЗ и Су5. Все меченые субъединицы холерного токсина тестировались на биологическую и транспортную активность. Меченые антитела к субъединицам холерного токсина тестировались на специфичность распознавания антигена.

2.1 8- Реконструирование меченых суоьединиц холерного токсина. Для рекоструирования холерного токсина из А и 8 субъединиц, меченых различными фпюсрохромами (А-СуЗ и В-Су5) использовали метод разспада белковых субьединиц под давлением (2000 бар) и воссоединение их после снятия давления. АВ5-СуЗ меченый токсин подвергали распаду на А-СуЗ и 5В-СуЗ субьединицы. А-СуЗ меченая субъединица после реконструкции с 5В-Су5 мечеными субъединицами образовывали пару флюорохромов для флюоресцентного резонансного переноса энергии ФРПЕ. Реконструированный токсин подвергался тесту на функциональную активность.

2.17. Получение антител методом фагового дисплея (phage display).

Метод фагового дисплея нами использовался для получения эпитоп специфических антител з соответствии с указаниями производителя (Mo Bi Tec, The pSKAN Phagemid Display System; Goettingen, FRG). Несколько раундов селекции филаментных фагов было произведено относительно синтетических пептидов представляющих собой аминокислотные последовательности А-субъединицы холерного токсина. Эти последовательности были выделены на основе кристаллографических данных о структуре. А-субьеднницы холерного токсина. Экспрессия Fab фрагмента фагами индуцировалась IPTG. Специфичность экспрессированных Fab фрагментов тестировалась по предотзращению связывания флюоресцентно меченых специфических антител.

Клеточная биология:

2.18. ИммуноФлюоресценция обработанных XT клеток. Мембраны клеток Vero перед началом эксперимента обрабатывали ганглиозидом GM1 - рецептором, специфически связывающим В субъединицу холерного токсина. Обработка клеточных мембран производилась на холоду (4°С) в среде не содержащей сыворотки. После насыщения плазматической мембраны клеток рецептором

клетки инкубировали (тоже на холоду) с холерным токсином в конечной концентрации 0,1 мкг/мп в течение 10-15 мин. После окончания инкубации и удаления несвязанного токсина клетки перемещали в термостат для последующей инкубации при 37°С, и 5% С02 для инициирования внутриклеточного везикулярного транспорта. Фиксацию клеток осуществляли в 3%-ном растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере. После фиксирования (20 мин) остатки альдегидных групп блокировали 50 мМ раствором NH4CL с последующей пермеабилизацией клеточной мембраны 0,2%-ным раствором сапонина. Неспецифические антигенные участки блокировали желатином перед аппликацией антител к субъединицам холерного токсина или антител к маркерным белкам субклеточных компартментов для колокализации с субъединицами холерного токсина. Используемые вторичные атитела были маркированы флюорохромами с неперекрывающимися спектрами. После удаления несвязанных антител клеточный монослой заключали в 0,1 М Tris-HCL, 25% w/v глицерол,Ю% w/v мовиол 4-88 (Hoechst), просушивали и исследовали под микроскопом.

2.19. Разработка теста на везикулярный транспорт токсина: от поверхности ПМ - через аппарат Гольджи - в ЭР.

Для проведения этого эксперимента клеточный монослой переносили в бессывороточную среду и инкубировали с различными концентрациями холерного токсина (0,1 - 1 мкг/мл) в течение 10 мин на льду. После связывания токсина с рецептором на поверхности плазматической мембраны несвязавшийся токсин отмывали и перемещали монослой в термостат (37°С). Для контроля этапов внутриклеточного везикулярного транспорта икубирование в термостате осуществляли в течение 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, и 120 мин. После окончания инкубации клетки фиксировали в 3%-ном растворе параформальдегида на фосфатном буфере. Двойная иммунофлюоресценция с эпитоп-специфическими антителами против субьединиц холерного токсина позволяла определить локализацию антигена в данный момент времени.

2.20. Микроиньекция антител к белкам, регулирующим везикулярный транспорт ХТ.

Очищенная иммуноглобулиновая или аффинная фракция антител к СОР белкам (участвующим в везикулярном транспорте) в концентрации 3 мг/мл подвергалась диализу против раствора глютамата калия (130 мМ), центрифугировалась 1 00 ООО д и микроиньецировалась в обработанные токсином и контрольные клетки.

2.21. Разрушение системы микротрубочек нокодазопом Участие системы микротрубочек в везикулярном транспорте холерного токсина оценивалось по функциональному параметру - возрастанию уровня циклического АМФ до и после разрушения микротрубочек.

Действующая (конечная концентрация в среде) нокодазола для клеток Vero составляла 10 мкг/мл. Аппликацию нокодазопа проводили после интернапизации и накопления холерного токсина в аппарате Гольджи.

Генная инженерия:

2.22. Создание кДНК гибридных белков.

Гибридный белок ERD2-GFP был получен посредством экспрессии кДНК ERD2-GFP, содержащейся в плазмиде pCMV5. Экспрессирующий вектор pCMV5-ERD2-GFP был получен в несколько этапов (Гл. Ш-2.2 и Рис. 3). Для этого Eco RI - Eco RI рестрикционный сайт KDEL-рецептора к А-субьединице холерного токсина (ERD-2) был вставлен перед N концевой последовательностью кДНК зелёного флюоресцирующего белка (GFP-Green Fluorescent protein). Плазмида pGEM, содержащая кДНК зелёного флюоресцирующего белка была любезно предоставлена Др. Ханс-Германом Гердесом (Институт нейрофизиологии, Гайдельберг, Германия).

Гибридный белок B-KDEL конструировали на основе кДНК В субьединицы холерного токсина с добавлением С-концевой последовательности SAGP-NST-ASE-KDEL. В качестве 5'-3' антикодона использовали следующий праймер: GAC GAA СТС AAG СТТ ТТА TAG СТС GTC СТТ СТС CGA GGC GGT CGA

GTT AGG ACC GGC CGC CGA ATT TGC CAT ACT, где TAG CTC GTC С TT кодирует KDEL-сигнал. Экспрессия кДНК B-KDEL осуществлялась в трансформированных pJS752-3-B-KDEL клетках E.coli. Выделение и очистка рекомбинантного белка B-KDEL осуществлялась с помощью гпутатион-сефарозы по указаниям фирмы-производителя.

2.23. Трансфекция клеток метопом электропорации и экспрессия гибридного белка в клетке. Электропорация и метод кальциевого преципитата испольцовался для внесения чужеродной ДНК в клетку. Электропорацию производили в специализированных кюветах на приборе Gene Pulser and Puls Controller, (BioRad). Экспериментально подобранная эффективная схема для электропорации представляла собой:! 00 мкл 10*7 Vero клеток, 10-20 мкг плазмидной ДНК (очищенной в градиенте CzCL), 200 mV, 175 микроФарад/на кювету. После электропорации клетки выдерживали на льду в течение 101 5 минут и рассеивали в культуральную посуду. Экспресси гибридного белка начинала наблюдаться через 12-18 часов после трансфекции.

Спектроскопические методы:

2.24. Конфокальная лазернея сканирующая микроскопия. Для наблюдения обработанных холерным токсином клеток использовался конфокальный лазерный сканирующий микроскоп системы Zeiss LSM-410. Иммерсионные объективы были: 40х, с апертурой 1,3 NA; 63x/NA=1,2 и 100x/NA=0,8. Для аргон-криптонового лазера с возбуждающей длиной волны 514 нМ использовали эммиссионные фильтры Omega 590ВР35, для длины волны возбуждения 663 фильтр был LP665.

2.25. Акцепторная Фотодеструкция.

Фотодеструкция акцептора - флюорохрома Су5, использованного для флюоресцентного мечения белка, осуществлялась длиной волны возбуждения 663 нМ в заданной области (нмер. внутриклеточный компартмент с находящимся в нём холерным токсином). Акустико-

оптический модулятор (АОМ) осуществлял контроль полноты фотодеструкции флюорохромз в заданной области.

2. 26. Донорная Фотодеструкция

Иррадиация донора (в данном случае флюорохромз СуЗ, иммобилизованного на В субьединице XT) осуществлялась длиной волны 546 нм с помощью Hg-лампы Osram HBO 100VV на микроскопе (Zeiss Axioplan Microskop), объектив 40x; 1,3 NA, в иммерсии. Использовали следующие фильтры: 546 ВР1 2 и дихроический фильтр FT580. СуЗ флюоресцентный сигнал регистристрировали с помощью CCD-камеры (Photometries Series 200 CCD camera [ Kodak, KAF 1400, 12-bit ADC]). Сигнал обрабатывали с помощью компьютера Макинтош квадра 800. Временные константы до норной фотодеструкции (г bl.Ö регистрировались для каждого пикселя - i и обрабатывались в программе NIH-lmage (National Institute of Health, Bethesda, MA). Различные no интенсивности флюоресценции имиджи клеток представляли в виде псевдо-цветовой шкалы.

Компьютерное программирование и обработка данных.

2.27. Для вычитания клеточных имиджей до и после фотодеструкции флюорохрома (в случае применения ФРПЕ метода) нами была разработана рабочая программа. Перед вычитанием имиджей призводился расчёт и коррекция сдвига имиджа. Такой сдвиг может возникать в момент регистрации или при изменении длины волны регистрации, например, от 546 к 633 в результате механического действия. Коррекция производилась по кросс-коррелляции максимумов или минимумов вычитаемых имиджей. Реконструкция полученных конфокальных имиджей обработанных холерным токсином клеток в случае регистрации ФРПЕ проводилась в программах SCIL-image (версия 1.3), Selima, Imaris.

В случае простой иммунофлюоресценции данные обрабатывались в программе Adobe Photoshop-3.0, NIH, Transform для Макинтоша Перформа 5200.

III Результаты и обсуждение

III-1.1. Молекулярно-биологическая характеристика субьединиц холерного токсина.

Использование холерного токсина (ХТ) в качестве модели для внутриклеточного везикулярного транспорта стало возможным после успешно проделанной предварительной работы по биохимической характеристике субьединиц (ХТ-А1, ХТ-А2, ХТ-В) и идентификации внутриклеточных компартментов, участвующих в их транспорте. Мы смогли разделить в геле все три субьединицы ХТ, получить эпитоп-специфические антитела ко всем трём субьединицам и'реконструировать меченый флюорохромами функционально и транспортно активный токсин.

В природе ХТ синтезируется бактерией Vibrio cholerae и секреткруется в форме холотоксина (84 кД), состоящего из пентамерной В субьединицы ХТ-В (55 кД) и ассоциированной с ней А субьединицы ХТ-А (28,5 кД). ХТ-В представляет собой пять нековалентно ассоциированных полипептидов, 11 кД каждый. ХТ-А состоит из двух полипептидов ХТ-А1 (23 кД) и ХТ-А2 (5,5 кД), связанных между собой дисульфидной связью. Холерный токсин способен связываться с рецептором (ганглиозидом 6М1) на поверхности плазматической мембраны эукариотических клеток и быть доставленным во внутриклеточные компартменты везикулярным транспортом. К моменту начала наших исследований было известно, что ХТ-В обуславливает интернализацию с поверхности мембраны. В результате внутриклеточного транспорта и процессинга происходит редукция дисульфидной связи ХТ-А и образование функционально активной ХТ-А1 субьединицы. ХТ-А1 катализирует НАД-зависимое АДФ-рибозилирование

а-субьединицы трёхмерных G-белков. В ГТФ-связанная форма Ga-субьединицы является необратимым активатором аденилатцикпазы. Таким образом, в результате внутриклеточного транспорта XT AI-субьединица должна доставляться в цитоплазму и вызывать возрастание уровня цАМФ в клетке. Однако внутриклеточные компартменты, через которые может проходить транспорт XT нам предстояло идентифицировать.

Аминокислотная последовательность А и В субьединиц холерного токсина по (Dams, Е., 1991) представлена о Таблице 1.

Таблица 1:

А субьединица:

1 MVKIIFVFFI FLSSFSYAND DKLYRADSRP PDEIKQSGGL 41 MPRGQSEYFD RGTQMNINLY DHARGTQTGF VRHDDGYVST

81 SISLSRAHLV GQTILSGHST YYIYVIATAP NMFNVNDVLG *

121 AYSPHPDEQE VSALGGIPYS QIYGWYRVHP GVLDEQLHRN

161 RGYRDRYYSN LDIAPAADGY GLAGFPPEHR AWREEPWIHH * *

201 APPGCGNAPR<-»SSMSNTCDEK TQSLGVKFLD EYQSKVKRQI 241 FSGYQSDIDT HHRIKDEL

В субьединица:

1 MIKLKFGVFF TVLLSSAYAH GTPQNITDLC AEYHNTQIHT 41 LNDKIFSYTE SLAGKREMAI ITFKNGATFQ VEVPGSQHID 81 SQKKAIERMK DTLRIAYLTE AKVEKLCVWN NKTPHAIAAI 121 SMAN

Функционально важными аминокислотами А субьединицы считаются: Arg (R - 25), ответственная за распознавание

участка связывания с Ga-субьединицей и Glu (Е-130), которая необходима для распознавания участка НАД, являющегося донором АДР-рибозы для рибозилирования стимуляторной субьединицы G-белков. А-субьединица синтезируется как одиночный полипептид и расщепляется специфической лротеазой V. cholerae во время секреции. Расщепление полипептидной цепи между Arg-210 и Ser-211 приводит к образованию AI и А2 субьединиц, которые остаются ковалентно связанными дисульфидным мостиком между Cys-205 и Cys-217. (Hirst, T.R., и др. 1984. Ргос. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 7725-7756). Предполагается, что ковалентно связанная А2 субьединица препятствует проявлению функциональной активности AI. Однако для нас особый интерес представляла С-концевая аминокислотная последовательность KDEL принадлежащая А2 субьединице. В составе В субьединиц интересен триптофан W-109, который необходим для связывания с GM1 - рецептором и последующей интернализации лиганд-рецепторного комплекса. Разделённые А1, А2, В и В5 субьединицы XT представлены на рис.1.

Рис. 1. Двухмерный электрофорез субьединиц XT

Mr,

67 43

30

20 14 6 2,5

Антитела, распознающие субьединицы ХТ получены как описано в гп. Методы (2.1.) и представлены на Рис. 2.

А1

3» А

А2

Рис.2. 1- А1 субьединица; 2. - А и А1 субьединицы;

3. - холотоксин (ХТ), А и А2 субьединицы;

4. - В субьединица.

Таким образом полученная у разных видов животных (кролики, морские свинки, овцы) гамма антител к субьединицам ХТ позволяла начать работу по одновременной идентификации всех трёх субьединиц во время везикулярного транспорта в субклеточных фракциях или в отдельных клетках. Для иммунофпюоресцентных исследований использовали высоко специфичные вторые антитела, у которых отсутствовала реактивность к антителам, произведённым у других видов животных. В случае проведения экспериментов с использованием флюоресцентного резонансного переноса энергии антитела тщательно очищали на протеин А сефарозе (иммуногпобупиновая фракция) или на колонке с иммобилизованным пептидом (для получения аффинной

фракции). Очищенные фракции антител тестировали на узнавание антигена и использовали для получения F ab фрагмента или метили соответствующим флюорохромом.

111-1.2. Получение белкоз ЭР и морфологическая

характеристика внутриклеточных компартментов

Для того, чтобы проследить путь субьединиц XT от клеточной поверхности до цитоплазмы были получены высокоспецифичные антитела, позволяющие идентифицировать внутриклеточные компартменты. Выделение и очистка белков эндоплазматическсго ретикулума производилась, как описано в гл. Методы (2. ) Исходным материалом служил гомогенат печени

быка. Микросомы, содержащие белки ЭР выделяли по следующей схеме: супернатант клеток после предварительного центрифугирования 1000 g (SI) подвергался центрифугированию 10 ООО g для получения (S2) супернатанта, который повторно центрифугировали 100 ООО g для осаждения микросомапьной фракции (Ml), и выделения белков ЭР. Мембраны микросом разрушали на холоду (4 С) в течение 30 мин. с помощью 0,1 M Na2C03, рН 11,3. После восстановления рН 7,3 остатки микросомальных мембран удаляли центрифугированием 100 ООО д. Белки эндоллазматического ретикулума, содержащиеся в последнем супернатанте (S5) наносили на ионообменник ДЕАЕ-целлюлозу. После удаления несвязавшейся фракции белки злюировали градиентом соли в 20 мМ Трис-НС! буфере, рН 7,3 , содержащем 1мМ EGTA и 0,1% b меркаптозтанола. Фракции ДЕАЕ целлюлозы, обладающие проводимостью 7-15 mS подвергались фильтрированию, диализу и использовались для жидкостной хроматографии (FPLC). Хроматографию проводили на колонке Mono Q HR 5/5 (до 20 мг), или HR 10/10 (более 20 мг) в зависимости от количества исходного материала. Материал злюировали градиентом соли 0-1 M NaCI, (приготовленным на буфере Трис-HCI, рН 7,2) со скоростью! 20 мл в час для HR 5/5 колонки и 240 мп в час для HR 10/10 колонки. Полученные фракции объёмом 1 мл или 2 мл тестировали на присутствие Са-связывающих белков ЭР по электрофорезу в

Выделенные фракции тестировали на присутствие Са-связывающих белков ЭР по электрофорезу в полиакриламидном геле и взаимодействию с радиоактивным Са45. Большинство разделённых по молекулярной массе на колонке сефакрил S-200 Са-связывающих белков ЭР (30 -90 кД), содержащих кальретикулин (СаВРЗ, Са-связывающий белок ЭР, N=3), CaBPl, СаВР4, (PDI) -протеиндисульфид изомеразу, BIP (белок, связывающий тяжёлые цепи иммуноглобулинов ), (см. Рис. 20-А), реагировали с пептидными антителами к KDEL последовательности. Полученные в результате элюции фракции одиночных белков подвергали окончательной очистке методом HPLC. Выделенная и очищенная фракция кальретикулина использовалась для подкожной иммунизации кроликов. Иммуиоглобулиновзя фракция полученных антител применялась для иммунофлюоресценции и выявляла ЭР в контрольных (Рис. За) и обработанных ХТ (Рис. 22е) клетках.

Рис. 3 : Морфологическая характеристика внутриклеточных компаргментов, участвующих в транспорте ХТ

3 Эндоплазматический ретикулум: маркёр - кальретикулин

(са!геГ1сиИп), резидентный белок ЭР; б Аппарат Гольджи: маркёр - трансмембранный белок аппарата Гольджи, Е1Ю2 (рецептор к КОЕ1_- содержащим белкам).

Таким образом выделение маркерных белков и получение к ним антител позволило нам охарактеризовать два внутриклеточных компартмента, необходимых для изучения транспорта ХТ: ЭР (Рис. За) и аппарат Гольджи (Рис. 36). Предполагалось, что а эти компартменты субьединицы ХТ доставляются с поверхности ПМ везикулярным транспортом.

III-1. 3. Связывание и интернализация холерного токсина с поверхности цитоллазматической мембраны

Для мониторинга внутриклеточного везикулярного транспорта мы получили эпитоп-специфические антитела к A, Al, А2 и В субьединицам холерного токсина. После положительного теста в иммуноблоте эти антитела подвергались контролю на специфичность распознавания интернализованного меченого токсина методом двойной иммунофлюоресценции. Этот дополнительный контроль был обусловлен тремя факторами: 1) - пептидные антитела легко распознают денатурированный белок (в иммуноблоте), но могут оказаться неспособными распознать нативный белок в клетке; 2) - пептидные антитела могут распознавать другой неспецифичный антиген в обработанных холерным токсином клетках; 3) - работающие антитела служат надёжным контролем при сравнении меченого и интактного токсинов, так как химическая модификация токсина может повлиять на транспорт. Эксперименты проводили следующим образом: плазматическую мембрану клеточного мокослоя инкубировали в бессывороточной среде с рецептором GM1, который необходим для связывания с В пентамером холерного токсина. После удаления несвязанного рецептора клетки инкубировали с холерным токсином как описано в гл. Методы. Несвязанный токсин удаляли и помещали монослой в культурапьную среду с сывороткой для инициации транспорта (37 С, 5% С02). В различные интервалы времени транспорта холерного токсина клеточный монослой фиксировали и подвергали иммунофлюоресцентному анализу.

Результаты эксперимента представлены на Рис. 4:

Холерный токсин связывается через пентамерную В субьединицу с ганглиозидом 6М1на поверхности

Рис. 4. Временная зависимость внутриклеточного транспорта холерного токсина, (описание в тексте)

цитоплэзматической мембраны: 1 и 2 - представляют соответственно А и В субьединицы XT в момент интернализации с поверхности цитоплазматической мембраны; 3 и 4 - колокализация ХТ-А с трансмембранным KDEL-рецептором в аппарате Гольджи (ERD2); 5 и 6 - А субъединица после 30 мин интернализации, которая ещё не («локализуется с маркёром к ЗР - кальретикулину (6). 7 - А субъединица через 45 мин после начала интернализации, частично колокализующаяся с белком р53-(8), маркёром для цис-Гольджи и мнтермедиат-компартменту, которые предшествуют входу в ЭР.

Таким образом, в результате наших экспериментов стало очевидным, что А и В субъединицы XT транспортируются вместе до аппарата Гольджи. А субьединица после прохождения Гольджи компартмента направляется в интермедиат компартмент. В отношении В субьединицы (King, С.А., и van Heyningen 1973. J. Infect. Dis. 127: 639-647) показали, что ганглиозид GM1, представляющий собой Galß-Я GalNAc ßl (NeuAca2-»3)-> глюкозил-церэмид, ( где GalNAc - N ацетилгалакозамин, а NeuAc - сиаловая кислота) добавленный экзогенно, способен предотвратить адсорбцию XT в малом кишечнике морских свинок. Никакие другие ганглиозиды не вызывали этого эффекта. Так был обнаружен рецептор ПМ, связывающий XT. Некоторые клеточные линии (в том числе и использованные нами в эксперименте клетки почки зелёной мартышки -Vero) зкспрессируют значительное количество эндогенного GM1 на клеточной поверхности. Было показано также, что XT как и пентамерная В субьединица после связывания с GM1 интернализуются через кавеолы (непокрытые клатрином везикулы) и транспортируются в эндосомы и транс-Гольджи компартмент (Parton, R.G., и др. 1994. J. Histochem. Cytochem. 42: 155-166). Поскольку данные электронной микроскопии свидетельствуют, что GM1 концентрируется в кавеолах, можно было предположить, что связывание рецептора холерным токсином будет инициировать внутриклеточный транспорт XT через эти структуры. Оставалось невыясненным происходит ли отделение ХТ-В от GM1 после интернализации и разделяются ли ХТ-А и ХТ-В в процессе транспорта через внутриклеточные компартменты.

В отдельной серии экспериментов мы проследили судьбу В субьединицы холерного токсина и показали (Рис. 5), что в отличие от ХТ-А (а), ХТ-В (Ь) остается в аппарате Гольджи значительно дольше, чем ХТ-А. После 90 - 120 мин от начала интернализации холерного токсина с поверхности плазматической мембраны ХТ-В (с) может быть частично колокализовзн с маркером лизосомального компартмента катепсином Д (Ь), [показано стрелками].

Рис. 5.

111-1. 4, Биохимическая и спектроскопическая характеристика меченого флюорохромом СуЗ холерного токсина.

После проведения экспериментов по интернализации и внутриклеточному транспорту ХТ возник вопросо том, каким образом и в каком компартменте происходит отделение ХТ-А от ХТ-В и какие молекулярные сигналы этих субьединиц обуславливают разделение их транспортных путей.

Для того, чтобы ответить на вопрос, происходит ли разделение А и В субьединиц холерного токсина во время везикулярного транспорта через внутриклеточные компартменты, был подготовлен эксперимент с использованием флюоресцентного резонансного переноса энергии (ФРПЕ). Флюоресцентное мечение ХТ осуществляли сульфоиндоцианиновым красителем (СуЗ), который ковалентно модифицирует остатки лизина. Результаты этого эксперимента представлены на Рис. 6:

а

(•от

В

Рис. 6. Биохимическая и спектроскопическая

характеристика СуЗ меченого холерного токсина

В экспериментально подобранных нами условиях (0,1 М бициновый буфер, рН 8,8) ковалентно модифицируется только В субьединица холерного токсина. Сравнение гелей меченого ХТ после электрофореза в отсутствии и в присутствии редуцирующих агентов действительно показало, что СуЗ модифицирует ХТ-В а не к ХТ-А/Рис. 6а.)

Флюоресценцию геля регистрировали при возбуждающей длине волны 514 нм. Для регистрации флюоресценции использовали фильтр LP590 нм (Schott). В отсутствие редуцирующих агентов наблюдали флюоресценцию холотоксина (84 кД), которая была обусловлена присутствием СуЗ меченой В субьединицы в составе холотоксина. Спектральная характеристика меченого токсина показала, что в среднем один флюорохром присоединён к одной пентамерной В субьединице (Рис. 6в). Молярное отношение токсин/фпюорохром составляло приблизительно 1:1. Расчёт производился следующим образом. В эксперименте концентрация меченого ХТ после гель фильтрации на колонке P10DG (Biorad) составляла1 54 мкг/мл, что при молекулярной массе в 84 кД соответствует 1,81 микромоля. Если считать коэффициент экстинкции СуЗ равным 150 мМ то отношение метки к бепку

можно рассчитать по формуле:

А 575 • M / [(А280 - 0-05. А575) • 150], где

А 575 ' абсорбция связанного с белком фпюорохрома СуЗ при его длине волны поглощения - 575 нм; А 575/! 50 - соответствует концентрации связанного СуЗ; M - молекулярная масса белка (в данном случае ХТ= 84 кД); А575 - абсобция белка с коррекцией на вклад фпюорохрома. Выражение А280 - (0.05. А575) может быть также заменено концентрацией меченого белка (ХТ), измеренной любым другим способом, например, по Брэдфорду. Вычесленная таким образом эффективность мечения ХТ составляла: 1,64 мкМ (СуЗ)/1,84 мкМ (ХТ)=0,89 по есть 90% молекул ХТ ковалентно присоединили по одному флюорохрому СуЗ.

Меченый при этих условиях ХТ сохранял немодифицированную по остатку лизина А субьединицу. После теста на функциональную и транспортную активность меченый ХТ использовался в экспериментах с флюоресцентным резонансным переносом энергии - (ФРПЕ). В состве ХТ меченая СуЗ - В субъединица представляла

ссбсй донор (Д). Меченье другим српюсрсхромсм (Су5, длина волны возбуждения 633 нм) ?зЬ фрагменты антител к А субьединице XI были использованы з качестве акцептора (А) для создания резонйнсной парь/ переноса энергии при взаимодействии субьединиц ХТ.

U1-1. 5. Обоснование использования метода ФРПЭ для изучения взаимодействия субьединиц холерного токсина в клетке

В предлагаемой работа впервые применен метод Флюоресцентного Резонансного Переноса Энергии (ФРПЕ) для исследования структурного состояния субъединиц холерного токсина. Принцип метода состоит з увеличении квантового выхода донора после фотохимичесхой деструкции акцептора. Для этого квантовый выход измеряется как интенсивность испускания (эмиссия) донора при соответствующей длине волны возбуждения. Сравнение интенсивности испускания Д до и после фотодеструкции А в референтной области клетки (на мембране, з эндосомах, в аппарате Гольджи) позволяет оценить структурное состояние субьединиц ХТ.

Эксперименты с применением меченого флюорохромом СуЗ (донор) ХТ и меченых флюорохромом Су5 (акцептор) антител показали, что зо время везикулярного транспорта с поверхности плазматической мембраны а аппарат Гсльджи происходит изменение состояния субъединиц XI'. Мы не случайно выбрали комбинацию, где донор (ХТ-В-СуЗ) относительно неподвижен и находится в окружении большего числа окружающих его акцепторов (Су5-меченые антитела против А субъединицы). Такая комбинация-избыток акцептора над донором - позволила нам зарегистрировать возрастание флюоресценции донора после разрушения акцептора. Регистрация ФРПЭ стала возможной не только в кювете, но и внутриклеточно.

Флюоресцентный резонансный переход энергии был впервые описан, как явление, Фёрстером (Forster 1949). Однако конкретное применение в биологии в то время было невозможно. С появлением нового поколения флюоресцентных красителей (Су2, СуЗ, Су5, Су7 -

с/пьфоиндоциацианиноаых красителей) впервые стало возможным эффективное использование метода ФРПЭ а биологии. Флюорохром, козапентна присоединённый .< молекуле обладает следующей информацией:

1). спектром поглащенмя и испускания:

2). временем жизни;

3). квантовым выходом;

4). поляризацией.

Под воздействием кванта света флюорохром переходит в возбуждённое состояние. Высзечивание кванта сопровождается флюоресценцией и характеризуется спектром испускания (эмиссия).

Ь

р-------- р*------эмиссия

При перекрывании спектра испускания одного флюорохрома - донора (Д) со спектром поглощения другого флюорохрома - акцептора (А) возможен флюоресцентный резонансный переход энергии (ФРПЕ) между Д и А и образование донор-акцепторного комплекса. Интенсивность свечения и время жизни такого комплекса отличаются от интенсивности и времени жизни одиночного Д или А. Перенос энергии от Д к А через квант света изменяет интенсивность регистрируемой флюоресценции. (При условии, что взаимодействующие субьединицы холерного токсина связаны с соответствующими флюорохромами - Д и А). Перенос энергии между донором и акцептором можно представить, как переход частицы с невозбуждённого энергетического уровня (п) на возбуждённый (э). Состояние частицы в пространстве и времени описывается уравнением Шредингера:

у (г,О = а е-' Е(г)т/Ь где состояние частицы в возбуждённом состоянии (э) опишется формулой:

------------5 \(/5 = аэе-' Е5(ГИ/Ь,

п или Ч»п = апе-'

в невозбуждённом состоянии (п). Переход п-> з

можно представить как действие оператора Гамильтона на функцию

Н(*п) = ¡И ( ^п/дг ) =Епап ехР ("'

При этом --> ^ э

После передачи части энергии от Д к А амплитуда функции (Ч'п) уменьшится на 5ап и станет равной ап- 5ап

Новое состояние Д (донора) будет описываться функцией

(ап_ 2ап) ехР Еп(гМ/ь-Эффективность переноса энергии будет зависеть от отношения

ап- 5ап/Епап = кл;

тогда, 1 - 5ап/зп= кп . Еп = кЕ (1)

- где к£, коэффициент переноса энергии от донора к акцептору;

Введём понятие эффективности переноса энергии: к = 1 - кр

тогда

1 - 5ап/ап= 1 - к, то есть к = £ап/ап

Эффективности переноса энергии пропорциональна квантовому выходу донора. При 5ап = ап к = 1. Однако в эксперименте к никогда не достигает единицы. Даже при идеально подобраной паре флюорохромов (СуЗ - Су5) и идеальном для переноса энергии расстоянии (3-7 нм) все полученные донором кванты не могут перейти к акцептору. Коэффициент переноса энергии связан с интенсивностью

флюоресценции донора и акцептора и пропорционален квадрату амплитуды а2

Поэтому коэффициент переноса энергии можно представить:

2

к, = (1 - 5ап/ап ) « 1 - 25ап/аЛ1

Максимум квантового выхода (при ^1 = 0) будет 5ап = 1/2 ап, тогда

к или (Е) = 5ап/ап <0,5.

Нами также получено экспериментальное подтверждение того что эффективность флюоресцентного резонансного переноса энергии (к=Е, Рис. 9 й) не превышает значения 0,5.

При расхождении субьединиц ХТ в результате везикулярного транспорта расстояние между флюорохромами будет увеличиваться, и эффективность переноса энергии будет уменьшаться пропорционально величине (Ко/г)®, где

Яо - донор-акцепторное расстояние Фёрстера, при котором возможен эффективный перенос энергии, Ко зависит от природы и пространственной ориентации взаимодействующих флюорохромов; г - определяет реальное расстояние взаимодействующих флюорохромов. В соответствии с уравнением Фёрстера коэффициент эффективности переноса энергии может быть вычислен по формуле:

1

Е = 1 - РОА/РО = _

1 + ( г/Ио)6

Из уравнения видно, что эффективность переноса энергии уменьшается с увеличением расстояния между Д и А. В эксперименте г колеблется в пределах

Ro < г < 1,5 Ro

В предельном случае (г = Ro), и Е принимает максимальное значение 0,5. Но так как г никогда не презышает Ro, то Е не может превысить 0,5 ( по классической теории), хотя в эксперименте могут наблюдаться значительные отклонения.

Ro-отражает расстояние между донором и акцептором в нм. Ro было экспериментально измерено (Bastiaens, P.I.H., Jovin,T., 1996) для следующих пар флюорохромов и составило:

СуЗ

СуЗ 4.4

Су5 5.3

Су5.5 5.1

СуЗ Су3.5 Су5

6.4

6.2 7.0, (нм).

Соотношение между расстоянием Ко в нанометрах и эффективностью переноса энергии между донором и акцептором зависит от пространственного положения флюорохромов. При некоторых теоретически предсказанных взаимных положениях флюорохромов флюоресцентнтный резонансный перенос энергии может не наблюдальться, хотя взаимодействующие молекулы находятся в пределах 1,5 Ио. Однако эксперименты показали, что количестно одновременно наблюдаемых в клетке флюоресцентных молекул настолько велико, что вклад отдельных пространственно "неверно" ориентированных молекул флюорохромов незначителен. Таким образом коэффициент

эффективности переноса энергии ( ^Е) действительно отражает структурное состояние взаимодействующих молекул. Зависимость кЕ от Яо представлена на рис. 7.

Рис.7.

Зависимость коэффициетта эффективности

пт, И0

Другим параметром, использованным нами в эксперименте и отражающим эффективность переноса энергии было _т -время жизни (или флюоресценция) донора. Естественно, что в присутствии акцептора при условии переноса энергии время жизни донора будет уменьшаться и величина г ;

г О будет меньше 1. При расчёте эффективности переноса энергии по времени жизни донора в присутствии и отсутствии акцептора мы использовали формулу:

Е = 1 - г О+А /г О,

(Clegg, R.M. 1 995. Fluorescence resonance energy transfer. Curr. Opin. Biotechnol., 6: 103 -11 0).

НИ. 6. Спектроскопический анализ структурного состояния субьединиц XT в клетке

Тестированный на транспортную и функциональную активность и меченый по В субьединице ХТ-СуЗ использовался в эксперименте. В разные интервалы времени после начала интернапизации XT с поверхности ПМ внутриклеточные флюоресцентные сигналы от ХТ-В-СуЗ и анти-ХТ-А-Су5 регистрировались с помощью конфокального флюоресцентного микроскопа при возбуждении 514/546 нм и 633 нм соответственно, как описано ранее (Методы, 2.24 - 2.27). Структурное состояние А и В субьединиц в составе XT (ассоциированное или диссоциированное) оценивалось по измерению ФРПЭ между ХТ-В-СуЗ и анти-ХТ-А-Су5. В предварительно выбранной (с помощью шторок встроенных в LSM) области клетки производили полное фотохимическое разрушение акцептора (Су5) иррадиацией длиной волны 633 нм.

Временная зависимость внутриклеточной локализации субьединиц холерного токсина и изменение молекулярного расстояния между А и В субьединицами представлены на Рис. 8. На этом рисунке по горизонтали расположены процессы, происходящие в один и тот же временной интервал: 0-5 мин, 5-10 мин, 20 мин и 30 мин после инициации внутриклеточного везикулярного транспорта XT с поверхности клеточной мембраны. В вертикальных колонках последовательно представлены: 1- флюоресценция донора ХТ-В-СуЗ во времени; 2- флюоресценция акцептора анти-ХТ-А-Су5 во времени; 3- области клетки, в которых производилась фотодеструкция акцептора Су5;

Рис. 8.

Спектроскопический анализ изменения состояния субъединиц холерного токсина в клетке, (описание в тексте)

4 - нормализованное отношение Су5/СуЗ или отношение интенсивности свечения ХТ-А к ХТ-8: 5 - Е, эффективность переноса энергии между Д и А, рассчитанная по формуле: Е = 1 - т 0+А/: О,

как указано на стр. 45. Сравнение колонок 1 и 2 показывает, что в начальный момент времени А и В субьединицы в равной степени декорируют поверхность клеточной мембраны ( все имиджи данного рисунка представляют собой продольный скан клетки толщиной не более 1 микрона, поэтому видны только контуры мембран). Различия во внутриклеточном распределении субъединиц ХТ начинают проявлятся уже после 20 мин. Данные ФРПЭ з колонке 5 обнаруживают, что после 20 минут эффективность переноса энергии (которая является функцией расстояния между субъединицами ХТ) падает в области аппарата Гольджи, хотя сохраняется на поверхности плазматической мембраны. Для объяснения этих результатов логично предположить, что неинтернапизованный с поверхности клетки ХТ сохраняет нативную структуру. При этом состоянии расположенные в пределах 1,5 Яо, то есть до 10 нм, А-Су5 и В-СуЗ субъединицы сохраняют возможность ФРПЭ. Логично предположить также, что в процессе везикулярного транспорта в аппарат Гопьджи происходит расхождение мономерной А и пентамерной В субъединиц ХТ на расстояние, больше 10 нм и ФРПЭ исчезает. Мы предполагаем, что происходит полное отделение А от В субъединицы, так как в противоположном случае, при сохранении одного из комплексов типа АВ£, АВд или АВ4, ФРПЭ продолжал бы наблюдаться в аппарате Гольджи значительно дольше 20 мин.

Эксперименты с ФРПЭ, в которых мы производили расчёт отношения А-Су5 к В-СуЗ (Рис. 8, колонка 4), а также данные иммунофлюоресценции с применением

Полученные с помощью метода ФРПЭ данные о судьбе субьединиц холерного токсина суммированы на Рис. 10.

Рис. 10. Расхождение субъединиц холерного токсина происходит в аппарате Гольджи.

а - флюоресценция донора В-СуЗ;

Ь - флюоресценция акцептора А-Су5;

с - область клетки, в которой производилась полная

фотохимическая деструкция акцептора Су5 иррадиацией лазера с длиной волны 633 нм; с) - возрастание флюоресценции донора В-СуЗ после

фотодеструкции акцептора А-Су5 (для сравн. см. 10.а); е - карта распределения эффективности ФРПЭ и

соответствующее структурное состояние субьединиц ХТ на поверхности мембраны клетки и в аппарате Гольджи.

Проведение нами иммунофлюоресцентные исследования показали, что ХТ-А и ХТ-В транспортируются вместе с поверхности плазматической мембраны до аппарата Гольджи, где их пути расходятся. Однако внутримолекулярное расхождение субьединиц ХТ невозможно измерить этим методом. Получение такой уникальной информации о структуре ХТ во время внутриклеточного везикулярного транспорта в аппарат Гольджи стало возможным с применением метода ФРПЭ. В эксперименте были использованы две независимые модификации метода ФРПЭ : 1 - измерение времени жизни донора (кинетика фотодеструкции) в присутствии и отсутствии акцептора (Рис. 9 с, б); и 2 - возрастание флюоресценции донора после иррадиации акцептора (Рис. 10 а, б). Обе применённые методики показали, что в используемой комбинации флюорохромов (В-СуЗ-донор и анти-А-Су5-акцептор) молекулярные расстояния между А и В субьединицами менее 7 нм и ФРПЭ может быть измерен для холотоксина. Такое сотояние ХТ наблюдается на поверхности цитоплазматической мембраны; при этом эффективность ФРПЭ составляла 0,4 - 0,3 (Рис. 9.6). Внутриклеточный везикулярный транспорт доставляет ХТ через эндосомы в аппарат Гольджи, где зарегистрировано исчезновение ФРПЭ (Рис. 9. с,с1). Это состояние становится возможным, когда молекулярное расстояние между А и В субьединицами возрастает. Следовательно, расхождение субьединиц ХТ происходит не в эндосомах, как считали ранее, а в аппарате Гольджи.

Ряд факторов может способствовать разделению А и В субьединиц ХТ в аппарате Гольджи: изменение рН, концентрации ионов, микроокружения. Однако, несмотря на то, что в эндосомах (рН=5) микроокружение более кислое, чем в аппарате Гольджи (рН = 6,3-6,5) разделение субьединиц ХТ там не происходит. Следовательно, в аппарате Гольджи есть фактор, необходимый для разьединения субьединиц ХТ, и отсутствующий в других компартментах (например в эндосомах). Действительно, в аппарате Гольджи локализован трансмембранный рецептор, функция которого - связывание С-концевой К0Е1_ последовательности резидентных белков ЭР.

II! - 2.1. Локализация и функции трансмембоаннсгс KDEL-рецептора в аппарате Гольджи.

В большинстве эукариотических клеток аппарат Гольджи представляет собой систему организованных уплощенных цистерн, окруженных мембранами, которые называются стеками и в фиксированных клетках расположены по одну сторону от ядра (Рис. 3-2). Гольджи компартмент лежит ча пересечении эндоцитозного и секреторного путей и зыполняет главную роль в перераспределении и соотисовке эндогенных клеточных и экзогенных импортированных белков. Когда белок достигает аппарата Гольджи. его сигнальная аминокислотная последовательность расшифровывается многочисленными трансмембсанньми рецепторами этого компартмента. которые сортируют белковые молекулы s соответствующие транслостнье зезикулы, направляющиеся к плазматической мембране, лизосомам, а специализированные секреторные гранулы, з зндоплазматический ретикулум и другие ксмпартменты клетки. Для сохранения уникальной структуры аппарата трансмембранные рецепторы, освободившиеся от доставленных к месту назначения белков, должны зозаращаться обратно в аппарат Гольджи.

Недавно было показано, что один из таких трансмембранных Гольджи рецепторов связывает С-концезую KDEL-последовательность белков (Lewis.M., Sweet, D.J., Pelham, H. 1990. Nature 348, 162-1 S3). Связанные KDEL-рецептором белки доставляются з зндоплазматический ретикулум.

После того, как в нашей лаборатории, а также в других лабораториях мира были выделены и секвенировань резидентные белки эндоплазматического ретикулумз оказалось, что они обладают С-концевой последовательностью KDEL. Эта последовательность найдена у белка, связывающего тяжёлые цепи иммуноглобулина - (BIP), у протеиндисульфид изомеразы-(PDI) и других Са-связывающих белков ЭР. В ЭР идёт постоянный синтез белков. Синтезируемые для секреции белки упаковываются в транспортные везикулы. Во время формирования транспортных везикул некоторые из

резидентных белков ЭР могут быть захвачены форимрующимися везикулами и контаминировать секреторные белки. Очевидно, в процессе эволюции выработался механизм для возврата резидентных белков, покинувших ЭР в потоке секретируемых белков.

Такой контроль осуществляет KDEL-рецептор, который находится в несвязанном состоянии в аппарате Гольджи. После связывания рецептора KDEL-белком, попавшим в аппарат Гольджи, связанный рецептор перераспределяется в ЭР, высвобождает там KDEL-белок и транспортируется обратно в аппарат Гольджи.

Проведённые нами эксперименты показали, что транспорт и разделение А и В субьединиц ХТ происходит в аппарате Гольджи, (Bastiaens, P.I.H., Majoul, I.V., и др. 1996. EMBO J., V.1 5, N16, р.4246-4253). На основании этих данных естественно было предположить, что KDEL-последовательность освободившейся А субьединицы ХТ также может связываться присутствующим в аппарате Гольджи KDEL-рецептором и транспортироваться вместе с рецептором в ЭР. Было бы интересно также установить, не является ли разделение нековалентно связанных А и В субьединиц в аппарате Гольджи следствием вновь возникшего и более прочного взаимодействия А субьединицы с KDEL-рецептором, чем связь в составе холотоксина.

III - 2. 2. Экспрессия и транспорт KDEL-рецептора в живой клетке. Исследование с использованием GFP - Зелёного Флюоресцирующего Белка (ЗФБ).

Чтобы установить, вызывает ли холерный токсин транспорт связанного KDEL-рецептора из аппарата Гольджи в ЭР, мы решили экспрессировать в клетке KDEL-рецептор. Для визуализации рецептора в живой клетке был использован ЗФБ, присоединённый к цитоплазматическому С - концу. Такая конструкция была выбрана в связи с тем, что N - конец рецептора обращён в люмен аппарата Гольджи и расположен близко к участку связывания KDEL-белка. Впервые связывание рецептором KDEL-белков было показано в работе (Wilson, D.W., et al. 1993. J.Biol. Chem.

263. Т^бЗ-'^бЗ). KDEL-рецелтор являющийся продуктом ERD2 гена, был открыт ( Lewis, M.J., и др.1990. Nature, 348, 162-163).

Полученный з чашей лаборатории сиквенс кДНК ERD2 был на 95% гомологичен h£RD2.2 из банка EMBL (кодовый номер Х- 63745'.. При этом аминокислотная последовательность K.DEL-peu.eri'1'opa, представленная на таблице 3, была исследсаана на гидрофобные участки. Результаты проведённого исследования показали, что семь гидрофобных аминокислотных последовательностей а молекуле белка (подчёркнуто линией) соответствуют трансмембранным доменам. Эти знания были использованы впоследствии при создании пептидных антител к KDEL-рецелтору (гл. Методы: Антитела'). Выявленный с помощью пептидных антител :< аминокислотной последовательности 201 - 212 аппарат Гольджи был представлен на Рис. 3-2.

Таблица 2.

Аминокислотная последовательность KDEL-рецепторз (подчёркнуты семь трансмембранных участков)

х. MNLFRFLGDL SHLLAIILLL T.XIWXSE3CA GISGKSOVLF

41. AWFTARYL3 LFTirciSV/N TCMKWYIAC SFTTVWLIYS

81. KFKATYDGNH DTFRVEFLW PTAILAFLVN HDFTPL5 XLW

121. TFSIYLESVA ILPOLFMVSK TGEAETIT5H YLFALGVYRT

1й: . LYLFNWIWRY HFEGFFDLIA IVAGLVCTVL YCDFFYLYIT

201. XVLXGXKLSL PA

Мутационный анализ KDEL-рецептсра, проведённый и показанный в работе (Townslay, F.M., и др. 1993. EMBO J. 12: 2821-2829) обнаружил участки связывания лиганда (KDEL-белка), и аминокислоты, необходимые для поддержания транспорта рецептора между аппаратом Гольджи и эндоплазматическим ретикулумом. Мы использовали эти знания при создании химерного флюоресцирующего в живой

клетке KDEL-рецептора. Экспрессия KDEL-peuenTop-GFP белка в живой клетке позволила бы визуализировать KDEL-рецептор и исследовать процессы везикулярного транспорта холерного токсина в живой клетке.

Зелёный Флюоресцирующий Белок (GFP или ЗФП), найденный в Aequorea victoria, впервые был использован как маркёр для экспрессии генов в живой клетке и описан в работе ( Chalfie, М., и др. 1994. Science, 263, 802-805).

Для получения кДНК KDEL-рецелтора выделенная и очищенная клеточная РНК была использована в качестве матрицы для обратной транскрипции ПЦР с лраймерами, соответствующими С и N концевым последовательностям KDEL рецептора hERD2. После клонирования соответственно в ТА векторе, pGEM и последующего клонирования в М13 mpl 8 проводили секвенирование одиночной цепи ДНК. После сиквенса вставка была переклонирована в вектор pCMV5 и опробована на экспрессию KDEL - рецептора в животных клетках.

Для конструирования гена гибридного белка (ERD2-GFP) была использована мутантная форма GFP(S65T), в которой Ser 65 замещён на Thr 65. GFP(S65T) был получен и предоставлен доктором Х.Г. Гердесом (Гейдельберг). Мутант GFP(S65T) имел следующие преимущества для исследований: в отличие от wt ЗФБ, мутантная форма не подвергалась димеризации и инактивации при возбуждении и обладала только одним максимумом возбуждения (488 нм). При возбуждении GFP(S65T) квантовый выход составлял 0,85, что приближаетсяся к кватовому выходу флюоресцеина -0,91. Такая флюоресцентная молекула в живой клетке представляет собой уникальный объект для спектроскопической регистрации. GFP(S65T). Полученная в плазмиде Bluescript II KS (Stratagen), была расщеплена через Kpnl и Xbal рестрикционные сайты и клонировалась на С-конце кДНК гена hERD2 в плазмиде pGEM. Далее для образования на стыке ERD2-GFP последовательности SLPASKGEE и удаления дополнительного EcoRl сайта Nael -Styl фрагмент в составе двойной вставки был замещён на последовательность, генерированную с помощью ПЦР, upstream праймер которой был представлен: AGO TGA GCC GGC AGT AAA GGA GAA GAA С, a downstream праймер имел

последовательность: AGT GTT GGC CAT GGA ACA GGT. После лигирования вставки в ERD2-GFP сайт слияния содержал аминокислотную последовательнось SLPASKGEE. Гибридная конструкция в составе EcoRI - EcoRI фрагмента была переклонирована в экспрессирующий вектор pCMV5. Ориентацию вставки EcoRI-ERD2-GFP-EcoRI в плазмиду pCMV5 проверяли по миграции в агарозном геле после рестрикционного анализа по сайтам Nae I и Sty I. Схема клонирования ERD2-GFP представлена на Рис. 11. Полученный вектор использовали для экспрессии в клетках млекопитающих (COS или Vero) .

Перед электропорацией в клетки млекопитающих плазмидную ДНК (pCMV5-ERD2-GFP) очищали в градиенте хлористого цезия. Результаты экспериментов по экспрессии KDEL-рецептора представлены на Рис.12. Рис.12 (А) -клетка в культуре через 36 часов после трансфекции pCMV5-ERD2-GFP. Трансфекцию проводили методом электропорации как описано в гл. Методы. В живой клетке видно распределение трансмембранного KDEL-рецептора, несущего на цитоплазматическом С-конце зелёный флюоресцирующий белок. Для сравнения на Рис.12 (В) представлены нетрансфицированные клетки, в которых КДЕЛ- рецептор выявлен методом иммунофлюоресценции с помощью пептидных антител к С-концевой аминокислотной последовательности. На вставке Рис. 1 2-А (а) представлен участок трансфицированной клетки (сигнал ЗФБ усилен через компьютер), в которой видна частичная локализация KDEL-рецептора в ЭР. В этом случае клетку обрабатывали циклогексимидом в течении 20 мин, поэтому флюоресцентный сигнал ЭР обусловлен не вновь синтезирующимися молекулами ЗФБ в ЭР, а циркулирующим между аппаратом Гопьджи и ЭР KDEL-рецептором. В нетрансфицированных клетках такое же усиление иммунофлюоресцентного сигнала не выявляло присутствие KDEL-рецептора в ЭР. Однако после трансфекции общее количество рецептора в клетке может возрастать более чем в 100 раз и это позволяет обнаружить KDEL-рецептор в области ЭР. Проведенная экспрессия ERD2-GFP позволила проводить эксперименты по интернализации и везикулярному транспорту XT в живой клетке.

Рис. 11 Схема клонирования ЗФб - К0Е1_ рецептора (ЕНОг-СРР).

ЕРЮ2 йЯР

бсо Я1

{

N361

Рис. 13.

Спектральная характеристика Зелёного Флюоресцирующего Белка (СРР-565Т) в живой клетке после экспрессии а составе КДЕЛ-рецептора.

a) - фазовый контраст группы живых клеток;

b) - флюоресценция живых клеток, соответствующих клеткам в фазовом контрасте;

c) - - регистрация спектра флюоресценции ЗФБ в клетке;

е) - сравнительные спектры флюоресценции ЗФБ в живой и в фиксированных клетках в различном микроокружении (подробное описание в тексте).

Эксперименты по интернапизации и внутриклеточному транспорту меченого ХТ проводили на живой клетке в культуре. Регистрация транспорта ХТ, производившаяся на одной клетке, представлена на Рис. 14. ХТ был мечен флюорохромом СуЗ по В субьединице,как описано в гл. Методы (2.15). Биологическая активность меченого токсина тестировалась, как описано в главе Результаты и обсуждение ( Ш-1.4). Подготовленные для эксперимента клетки подвергались электропорации для введения в клетку плазмидной ДНК (рСМУ5-ЕЯ02-6ГР). Начало экспрессии К0Е1_-рецептора (25-36 часов после трансфекции) оценивали по свечению ЗФБ при возбуждении длиной волны 488 нм. Для эксперимента отбирали светящиеся клетки с нормальной морфологией (в фазовом контрасте) и характерным расположением К0Е1_-рецептора в аппарате Гольджи. Клетки отмывали от культуральной среды и переносили на холод 4°С для инкубации с меченым ХТ. После окончания инкубации (10 мин) несвязавшийся токсин удаляли промыванием средой и переносили клетки на стекле в специально сконструированную камеру с проточной средой (ДМЕМ без фенолового красного, 10 % СЭК). Температура среды поддерживалась около 37°С в течение эксперимента. Камера помещалась под обьектив флюоресцентного микроскопа. В эксперименте использовались длины волн возбуждения 488 нм для ЗФБ и 546 нм для СуЗ-В-ХТ. Таким образом при флюоресценции 488 нм велось наблюдение за К0Е1_-рецептором по референтному свечению ЗФБ, который находился на цитоплазматическом С конце трансмембранного рецептора. При возбуждении 546 нм можно было наблюдать поведение В субьединицы ХТ. В этой серии экспериментов А субьединица оставалась химически немодифицированной, так как наличие флюорохрома могло повлиять на сигналы регулирующие транспорт или взаимодействие с рецептором. Результаты экспериментов показали, что при интернализации и транспорте токсина в аппарат Гольджи (О до 30 мин) свечение ЗФБ, а следовательно и состояние КОЕ1_-рецептора, не изменяется (Рис 14-1). После 30 мин начинает наблюдаться перераспределение свечения ЗФБ из аппарата Гольджи в направлении интермедиат

Рис. 1 4.

Внутриклеточный транспорт холерного токсина в живой клетке, экспрессирующей КОЕ!_-рецептор и Зелёный Флюоресцирующий Белок (ЗФБ).

Двойная эпифлюоресценция: ЗФБ/КОЕЬрецептор 488 нм, ХТ-В-СуЗ 546 нм; (подробное описание в тексте).

компартмента и ЭР. К 60 мин наблюдается максимальное рассредоточение сигнала ЗФБ в направлении ЭР(14-4). При этом свечение В-СуЗ (546 нм) остаётся локализованным в аппарате Гольджи, (14-2,5). Это объясняется тем, что после разделение А и В субъединиц XT А субъединица взаимодействует с KDEL-рецептором и вызывает перераспределение связанного рецептора из аппарата Гольджи в ЭР и соответственно дисперсию свечения ЗФБ.

На (14-3) показано перекрывание сигналов ЗФБ и В-СуЗ: через 30 мин после начала инкубации в аппарате Гольджи преобладает свечение ЗФБ и локализован KDEL-рецептор, при этом В-СуЗ субъединица ещё не полностью транспортирована в аппарат Гольджи, и частично локализуется в эндосомальных структурах. После 60 мин инкубации (14-6) В субъединица остаётся в аппарате Гольджи, при этом наблюдается максимальное перераспределение связанного немеченой А субъединицей KDEL-рецептора в направлении ЭР. Таким образом впервые в живой клетке зарегистрирован транспорт KDEL-рецептора из аппарата Гольджи в ЭР в результате связывания лиганда - KDEL содержащей А субъединицы XT.

Ill - 2. 3. Конструирование, экспрессия и транспорт рекомбинантного белка B-KDEL в клетке.

В результате везикулярного транспорта XT (А-субъединицы) в живой клетке наблюдалось перераспределение связанного KDEL-рецептора из аппарата Гольджи в направлении ЭР. Однако А-субъединица не может достигнуть аппарата Гольджи и транспортируется только вместе с В субьединицей. При проведении этих экспериментов возникла идея создать химерный белок В-KDEL на основе В субьединицы XT и исследовать транспотрные характеристики этого нового белка.

Плазмида pJS752-3 содержащая хромосомную ДНК В субьединицы V.cholerae была получена от Dr. Sanchez (Мексика). Фрагмент В субъединицы был вырезан из плазмиды с помощью эндонуклеаз EcoRI и Hindlll. Полученный фрагмент был разделён в агарозном геле и элюирован. Готовый для субклонирования фрагмент

N-terminal primer (CTBK.-N): 5' - 3'

CA GGA AGT GAA TTC CGG ATG ATT TAT GAA TAA ACT AAA AT Eco RI Stan leader CT.X sequence

C-terminal primer(CTBK-N): 5'-3' (anticodon) GAG G.AA CTC AAG CTT TTA TAG CTC GIT ГТТ CTC CGA GGC Hind III STOP KDEL-sequence

GGT CGA GTT AGG ACC GGC CGA ATT TGC CAT ACT N - S - T

M В B-KDEL

В B-KDEL

101 . * % 'у

83

50,6

~ ч, .<• , , > „ у. } Ч,

35,5 29,1 ? ^ ~ -» ^ $ S 3 * » < % ^^¿Wjb t * v Vw 1

20,9 ■ а * у* ■» * > » * < < Л» -у " . . „ _ ^ у. «У , И- > - * < * < 2

Рис. 15. Конструирование, выделение и тестирование рекомбинантного белка B-KDEL.

использовался как тэмппет. Синтезированные праймеры приведены на рис.1 5 в. После проведения ПЦР продукт лигироаали обратно в вектор и использовали для трансформации бактериальных клеток E.coli. ¡Слетки растили в культуре в присутствии ампициллина с добавлением IPTG (изопропил-р-О-тиогалактопиранозид) для экспрессии рекомбинантного белка B-KDEL. Белок выделяли из периплазмы бактериальных клеток после разрушения клеточной стенки в присутствии SDS. Рекомбинантный белок B-KDEL очищали до гомогенности аффинной хроматографией на колонке CBS-4C с иммобилизованными антителами к В субьединице ХТ. Элюированный с колонки белок разделяли гель-электрофорезом и тестировали в иммуноблоттинге антителами к KDEL-аминокислотной последовательности. Результаты эксперимента приведены на рис. 1 Sa.

Полученный белок B-KDEL использовали для исследования внутриклеточного везикулярного транспорта. Кинетика интернализации рекомбинантного B-KDEL белка с поверхности цитоплазматической мембраны и транспорт до аппарата Гольджи совпадал с кинетикой транспорта В субъединицы (B-wt). Однако B-KDEL оказался неспособным транспортироваться из аппарата Гольджи в отличие от А -KDEL субъединицы, которая за то же время (90 мин) перераспределялась в ЭР. B-KDEL также оказался неспособным вызвать дисперсию KDEL-рецептора-ЗФБ из аппарата Гольджи, несмотря на колокализацию B-KDEL с KDEL-рецептором после 30 мин. Таким образом мы выяснили, что аминокислотный код (KDEL) может быть реализован только в определённом микроокружении. При наличие других сигнальных аминокислот ( которые присутствуют в B-wt субьединице) перераспределение, а следовательно и транспорт в субклеточный компартмент ( в данном случае в лизосомы) будет регулироваться тем сигналом, который имеет предпочтение при связывании с соотетствующим трансмембранным рецептором.

Ill - 2.5. Субклеточное фракционирование обработанных XT клеток.

Субклеточное фракционирование в градиенте плотности йодиксанола (Pharmacia, Nicomed, Oslo) даёт возможность разделить внутриклеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, эндосомы, лизосомы, аппарат Гольджи, ЭР. Так как основной задачей было исследование состояния А субьединицы XT при везикулярном транспорте в ЭР, фракционирование осуществлялось таким образом, чтобы эффективно разделить стэки аппарата Гольджи от микросом ЭР. Обработанные XT клетки помещали в термостат 37°С. После 90 мин инкубации (в это время наблюдалась максимальная колокапизация А-ХТ с маркером к ЭР, рис.16 e-d) клетки ресуспендировали на холоду в бескальциевом растворе и разрушали при прокачивании через специально сделанные фильеры с уменьшающимся диаметром. Такая процедура способствовала сохранению интактности внутриклеточных структур. Клеточные мембраны и ядра удаляли предварительным центрифугированием. Отсутствие контаминации клеточными мембранами проверяли в экспериментах с биотинилированием клеточной поверхности. После предварительного центрифугирования 3000 rpm полученный супернатант наносили на предварительно созданный ступенчатый градиент йодиксанола: 25%, 20%, 17%, 1 5%, 12%, 10%, 7,5% и 2,5% в К-глютаматном буфере. Центрифугирование осуществлялось в горизонтальном ротере SW-40, (Backman) при 28000 rpm (1 26000 g.av) в течение 30 мин. Распределение маркерных ферментов для данного типа градиента приведено на Рис. 17. В качестве маркерного фермента аппарата Гольджи была выбрана УДФ-галактозилтрансферазэ. Маркерным ферментом ЭР служила ротенон-нечувствительная НАДФ-цитохром С редуктаза. Определение ферментативной активности маркерных ферментов в выделенных после центрифугирования фракциях производили как описано, (Sottocasa, G.L., 1967, J.Cell Biol., 32, стр. 415-438). Активность ферментов представлена как процент от максимальной активности наиболее насыщенной фракции.

1 23456789 10

fraction number

Рис. 17. Распределение маркерных ферментов а субклеточных фракциях обработанных холерным токсином клеток.

2 - активность УДФ-галактозилтрансферазы

(Гопьджи маркер) О - активность ротенон-нечувствительной НАДФ-цитохром С редуктазы (маркер для ЭР) Д.- значение концентраций белка во фракциях

111-2.6. Биохимический анализ состояния А субьединицы ХТ в субклеточных компартментах.

А субьединица ХТ синтезируется в \ЛсЬо1егае как белковая молекула 28,5 кД с одной дисульфидной связью между Суэ 205 и Суэ 217, (Таблица 1, стр. 29). Между двумя цистеинами А субьединицы находится последовательность ... Рго-Агд-Бег ..., которая расщепляется по аргинину бактериальными протеазами \Z.cholerae с образованием двух цепей А1 (23,5 кД) и А2 (5,5 кД), соединённых в составе ХТ дисульфидной связью. В результате транспорта ХТ через внутриклеточные компартменты происходит разделение А и В субьединиц и редукция дисульфидной связи между А1 и А2 субьединицами. Разделение внутриклеточных компартментов обработанных ХТ клеток и мониторинг состояния А-ХТ в них позволили оценить кинетику везикулярного транспорта (в данном случае от аппарата Гольджи до ЭР) и процессинга А субьединицы и выявить место образования физиологически активной А1 цепи. Эксперименты проводили по следующей схеме:

1 - обработка клеточного монослоя ХТ, (10 мин, 4°С);

2 - итернализация и транспорт ХТ до ЭР, (45-90 мин, 37°С); 3-остановка транспорта и разрушение клеточного монослоя;

4 - подготовка градиента йодиксанола и клеточного гомогената ( как описано в гл. Методы);

5 - разделение субклеточных фракций в градиенте;

6 - определение концентрации белка и ферментативной активности в полученных клеточных субфракциях;

7 - ПАА-гель электрофорез фракционированного материала в отсутствии и в присутствии редуцирующих агентов;

8. иммуноблоттинг разделённых во фракциях белков с антителами к А субьединице ХТ.

Результаты эксперимента приведены на Рис. 18. Субклеточное фракционирование обработанных ХТ клеток показало, что уже через 45 мин инкубации в результате везикулярного транспорта и процессинга во внутриклеточных компартментах наблюдается частичная редукция А1-5-5-А2 (28,5 кД) субьединицы с появлением восстановленной

Рис. 18.

Субклеточное фракционирование обработанного холерным токсином монослоя:

а - разделение элетрофорезом (в отсутствие редуцирующих агентов) и иммунобпоггинг с антитепами к А субъединице ХТ в - разделение элетрофорезом (в присутствии р-меркаптоэтанола) и иммуноблоттинг с антителами к А субьединице ХТ.

Стрелкой (Рис. 16-а) указано формирование А1-5-5-А1 комплекса, который образутся в отсутствие редуцирующих агентов или Р01. Фракции 1 (а и Ь) содержат неинтернализованный с поверхности ПМ ХТ (84 кД).

A1-SH (23 кД) субьединицы (Рис. 18а). Кроме того было обнаружено образование комплекса около 46 кД, (Рис. 18а, указано стрелкой), который реагирует с антитепами к А субьединице XT и может соответствовать A1-S-S-A1 структуре. Добавление редуцирующего агента р-меркаптоэтанопа в образцы перед началом электрофореза приводило к редукции дисульфидной связи A1-S-S-A2 и A1-S-S-A1 молекул и появлению на иммуноблоте одной полоски, соответствующей А1 (23 кД) положению, Рис. 18в. Очевидно в момент восстановления дисульфидной связи между А1 и А2 субьединицами в определённом микроокружении возможно одновременное окисление при котором образуются преимущественно A1-S-S-A1 комплекс.

Для более глубокого исследования состояния А субьединицы XT в момент везикулярного транспорта из аппарата Гольджи в ЭР была проведена следующая серия экспериментов, в которой мы попытались выделить только неразрушенные везикулы из фракций градиента. Перед началом выделения субклеточные мембраны стабилизировали тетракаином (1-5 мМ). Буферный раствор содержал также N-этилмалеимид (NEM), алкилирующий агент, препятствующий образованию дисульфидных связей de novo. Материал из фракций переносили в специальные устойчивые к центрифугированию пробирки и осаждали 1 час при 100 OOOg (TLS Backman centrifuge). Осаждённые везикулы промывали буферным раствором глютзмата калия (130 мМ), содержащим N-этилмалеимид и тетракаин и повторно осаждали. Таким образом, в гель-электрофорезе разделялась только находящаяся в зезикулах А субьединица XT. Результаты электрофореза и последующего иммуноблоттинга представлены на Рис. 1 9.

Анализ данных эксперимента (Рис. 19) обнаруживает, что редукция дисульфидных связей и появление восстановленных A1-SH и A2-SH субъединиц XT наиболее выражено во фракциях 8 и 9. В соответствии с результатами ферментативного анализа субклеточных фракций градиента (Рис. 17), фракциям W 8 и 9 соответствует максимальная активность ротенон-нечувствительной НАДФ цитохром С редуктазы, которая является

маркёром ЭР. Таким образом биохимический анализ подтвердил, что восстановление А субьединицы ХТ и образование физиологически активной АДФ-рибозилтрансферазы (АЬБН) проиходит в ЭР. Присутствие А1 субьединицы наблюдается также во фракциях М 2, 3, 4. Этим фракциям соответствует максимальная ферментативная активность УДФ-галактозилтрансферазы -маркёра аппарата Гольджи. Однако отсутствие в них А2 субьединицы свидетельствует о контаминации фракций 2-4 сходной по плотности субпопуляцией фракций ЭР, содержащей А1 субьединицу.

1 2 3456789 10

Мг,

кД

_ _„ в» О Р01

, 4 «ийЭзза5> Д2

Рис. 19. Разделение А субьединицы ХТ в выделенных после субклеточного фракционирования микросомах из обработанных ХТ клеток. Фракционирование осуществлялось в присутствии 1^-этилмалеимида. Иммуноблоттинг проводили с антителами к А -ХТ и К0Е1_-содержащим белкам ЭР: Р01, СаВР2 и СаВРЗ. Показано, что восстановление дисульфидной связи между А1 и А2 субьединицами холерного токсина происходит в ЭР (фракции 8,9).

Был проведён также иммунобпоттинг с антитепами к другим резидентным маркёрам ЭР: к Са-связывающим белкам СаВР2 и СаВРЗ (кальретикупин), а также к PDI (протеин-дисупьфидизомераза - ПДИ). Как видно из Рис. 19, все перечисленные белки ЭР ярко выражены во фракциях 8 и 9, и только незначительно контаминируют фракции 1 - 4, подтверждая идею о том, что восстановление дисульфидной -S-S- связи между А1 и А2 субъединицами XT осуществляется в ЭР. Это утверждение было сделано вопреки общепринятому мнению о том, что ЭР служит местом окисления - SH групп в момент формирования третичной структуры вновь синтезирующихся белков.

После подтверждения факта образования А1 субъединицы в ЭР возник вопрос о том, каков механизм восстановления дисульфидной связи в таком "окислительном" компартменте как ЭР.

Ill - 2.7. Выделение и очистка функционально активной PDI (протеиндисульфидизомеразы) из ЭР. In vitro реконструкция образования комплексов между А субьединицей XT и PDI.

Среди молекул ЭР, участвующих в формировании дисульфидных связей вновь синтезированных белков наиболее распространённой является PDI (ЕС 5.3.1.4). PDI (57 кД) содержит две копии тиоредоксиновой последовательности Cys-Gly-His-Cys (CGHC), которые необходимы для взаимодействия с цистеинами белков, подвергающихся окислению. Для того, чтобы установить участвует ли PDI в образовании A1-SH субьединицы XT мы решили выделить функционально активную PDI из ЭР и реконструировать in vitro окислительно-восстановительные условия ЭР в присутствии интактной A1-S-S-A2 субъединицы. Выделение PDI проводили как описано в гл. Методы 2.5. для белков ЭР. После получения микросомальной фракции из гомогената печени быка мембраны микросом разрушали карбонатом натрия, рН 11 при 4°С. После нормализации рН до 7,2 и удаления обломков мембран ЭР смесь белков ЭР разделяли на колонках MonoQ и MonoS как

описано в гл. Методы. Промежуточный этап разделения белков ЭР представлен на Рис. 20-а. PDI как большинство резидентных белков ЭР содержит С терминальную последовательность KDEL, которая регулирует удержание белка в ЭР. Наибольшая трудность в выделении RDI состояла в том, что другой белок ЭР, участвующий в связывании тяжёлых цепей иммуноглобулинов (BIP) имеет то же значение pi = 4,9 что и PDI. Однако в отличие от PDI, BIP связывает АТФ. Используя это свойство белка, BIP был выделен из фракции PDI с помощью аффинной хроматографии на АТФ-агарозе. Разделённые фракции PDI и BIP приведены на Рис. 20-Ь.

Ферментативная активность выделенной PDI проверялась по способности редуцировать дисульфидную связь в молекуле инсулина (Holmgren, А. 1979. J.Biol. Chem., 254, 9627-9632). Освободившаяся В цепь инсулина образует преципитат. Скорость формирования преципитата измерялась по возрастанию коэффициента экстинкции при 576 нм. Результаты оценки редуктазной активности PDI по инсулину приведены на Рис. 20с. Редуктазная активность PDI зависела от окислительно-восстановительного потенциала микроокружения. Как было показано в работе (Hwang, С., и др. 1993. Science 257, 1496 -1502) окислительно-восстановительные условия ЭР определяются соотношеним окисленного и восстановленного глутатиона, и находятся в пределах GSH/GSSG = 2, тогда как в цитоплазме отношение GSH/GSSG = 60. Соответственно, активность PDI измерялась при разных значениях окисленного и восстановленного гпутатиона. Отношение GSH/GSSG использованное в эксперименте было 1/1, 2/1, 3/1, 60/1. Было отмечено также, что условия для максимальной восстановительной активности PDI могут отличаться от условий необходимых для максимального проявления изомеразной активности PDI. При выделении PDI быстро инактивировалась при длительном экспонировании щелочному раствору (рН 11) в момент удаления микросомальных мембран, поэтому топько тестированная и функционально активная PDI использовалась для экспериментов по in vitro реконструкции процессинга А субьединицы XT в ЭР.

ЕЯ: КОЕЬ-ргсЯетэ

В1Р

Р01

СКР94

СаВР1

СаВРЗ

НЭРЭО

А

МП 30- В|р

4932-

РОI

В

Определение активности Р01 по восстановлению инсулина

а ,575 пш

Рис. 20. Выделение Рй1 из группы К0Е!_ содержащих белков ЭР и тестирование ферментативной активности.

А 576 - коэффициент экстинкции; г - время восстановления инсулина в присутствии РЭ1 при разных отношениях окисленного и восстановленного глутатиона.

Необходимость проведения экспериментов по реконструкции микроокружения ЭР in vitro объяснялась тем, что в растворе восстановленная форма А1 субьединицы XT плохо растворима и образует преципитат. Однако в живой клетке этого не происходит. Поэтому была предпринята попытка выяснить, какие факторы ЭР способствуют растворимости и поддержанию активности Al субьединицы XT после транспорта и процессинга в ЭР.

Результаты проведённых in vitro экспериметов по реконструкции процессинга А субьединицы XT в ЭР в присутствии PDI и GSH/GSSG = 2 приведены на Рис. 21-Ь. Разрешение образовавшихся комплексов между А1 и А2 субьединицами XT и PDI осуществлялось в полиакриламидном геле с 5% бисакриламида в отсутствии редуцирующих агентов. Молярное отношение PD1/A-XT в эксперименте составляло 10. На Рис. 21-2Ь показан окрашенный серебром после иммуноблоттинга гель, который выявляет положение избыточной PDI, не задействованной в образовании комплексов. В колонке 1 (Рис. 21-2 а, Ь) иммуноблота и геля показано состояние А субьединицы в отсутствии PDI, в колонках 2-5 в присутствии PDI.

На основании проведённой in vitro серии экспериментов по реконструкции восстановления А-ХТ в ЭР была предложена модель формирования физиологически активной Al субьединицы в ЭР (Majoul, I., и др. FEBS Letters., 1997. 401, р. 104 -108). Схематическое изображение происходящих процессов при восстановлении А субъединицы XT в ЭР представлено на Рис. 21-1.

В результате везикулярого транспорта с поверхности плазматической мембраны XT переносится в аппарат Гольджи, где происходит разделение А и В субьединиц. Окислительно-восстановительный потенциал цитоплазмы (GSH/GSSG=60) способен вызвать восстановление А субъединицы XT до A1-SH. Однако в момент транспорта через цитоплазму А субьединица окружена везикулярной мембраной и не может быть экспонирована восстановительному потенциалу цитоплазмы, GSH=60. После того, как А-ХТ доставляется везикулярным транспортом в ЭР, PDI через тиоредоксиновые мотивы -CGSC-

находящиеся в молекуле PDI взаимодействуют с дисульфидной связью A1-S-S-A2 с образованием комплексов A1-S-S-PDI и A2-S-S-PDI (Рис. 21-а). При распадании комплексов наблюдается формирование A1-SH и A2-SH субъединиц. При восстановительных значениях GSH/GSSG=60, которые существуют в цитоплазме, также может осуществляться восстановление А-ХТ до A1-SH. Однако в in vitro экспериментах такое восстановление приводит к формированию A1-S-S-A1 комплексов, которые организуются в преципитат и не являются физиологически активными АДФ-рибозилтрансферазами. Известно, что только после попадания в цитоплазму восстановленная А1 субъединица XT способна АДФ-рибозилировать стимуляторную субъединицу трёхмерных G-бепков (Gilman, A., G. 1987. Annu. Rev. Biochem., 56, стр. 615 - 649). На основании полученных данных мы предположили, что в отношении А-ХТ PDI обладает не только окислительно-восстановительной, но в большей степени изомеразной активностью, которая необходима для поддержания физиологически активной конформации А1 субьединицы.

Хотя остаётся неизвестным, каким образом осуществляется перенос А1 субьединицы через мембрану ЭР в цитоплазму, можно предположить, что для этого процесса необходимо отсутствие преципитатов и наличие правильной конфигурации А1. Возможно для этого необходимо присутствие активной изомеразы - PDI, которая является необходимым условием успешной транспокации А1 через мембрану ЭР.

пм

ЦИТОПЛ. I ЭНДОПЛ.РЕТИКУЛУМ

GSH/GSSG=60i

GSH/GSSG=2

АВ5

A1-S-S-A2 4- PDI =

1. А1 -S-S-PDI

2. A2-S-S-PDI

3. A1-S-S-A1

4. A1-SH + A2-SH

Рис. 21

Схематическое представление формирования комплексов A-XT-PDI в

а).

Ь).

1 2 3 4 5

POI+A1 (23 кО)

-p0i + a-2 (5.5ко) -PDI

A1-S-S-A1

А А1

1 2 3 4 5

-PDI

siver stained gel

anti-A + anti PDI

111-3 - Исследование механизмов регуляции

внутриклеточного везикулярного транспорта холерного токсина.

После того как были изучены основные этапы транспорта XT, мы попытались использовать эти знания для выявления отдельных белков и клеточных систем, способных регулировать везикулярный транспорт.

Одним из наиболее удобных для измерения физиологических параметров при исследовании везикулярного транспорта XT явилось возрастание уровня цАМФ в результате прохождения А субьединицей ретроградного пути с поверхности ПМ до ЭР с последующей транслокацией в цитоплазму. В наших экспериментах уровень цАМФ начинал возрастать через 30 мин после начала интернализации XT с поверхности ПМ и достигал максимума к 90 мин, (в том случае если новая порция токсина не поступала внутрь клетки с поверхности ПМ).

II 1-3.1 Участие системы микротрубочек в везикулярном транспорте холерного токсина.

Считалось, что система микротрубочек выполняет не только структурную функцию, но может принимать участие в транспорте органелл, (Vale, Ann. Rev. Cell Biol., 1987, 3: 374-378). Было решено проверить, осуществляется пи везикулярный транспорт от аппарата Гольджи до ЭР по системе микротрубочек. Чтобы проверить эту идею мы обработали клетки XT и после достижения XT аппарата Гопьджи внесли в среду нокодазол, агент разрушающий микротрубочки. Конечная концентрация нокодазола в среде составляпаЮ мкг/мл. Через различные промежутки времени после добавления нокодазола проводили определение уровня цАМФ (гл Методы). Параллельно контрольные и обработанные нокодазолом клетки фиксировали для иммунофлюоресценции Результаты иммунофлюоресцентного анализа представлены на Рис.22: а) - интактные микротрубочки окрашены антителами к тубулину ; Ь) - расположение KDEL-рецептора в этой же клетке; с) - разрушенные нокодазолом

Рис. 22, Эффект нокодазола на везикулярный транспорт ХТ.

микротрубочки; с! - вызванное нарушением микротрубочек перераспределение КОЕЬрецептора; е - ЭР (кальретикулин) в обработанных ХТ и нокодазолом клетках, и ^ -соответствующее расположение А субьединицы в этой клетке ; д, I - распределение КОЕЬ - рецептора; И, ) -соответствующее д, 1 - распределение А субьединицы ХТ через 20 и 50 мин после аппликации нокодазола.

111-3.2. Изменение уровня цАМФ при нарушении везикулярного транспорта ХТ по микротрубочкам.

Определение уровня циклического АМФ в контрольных клетках представлено на Рис. 23-А (0 мин). Уровень цАМФ в обработанных ХТ клетках начинает возрастать после 30 мин и достигает максимума через 90 мин после начала интернализации ХТ. Разрушение системы микротрубочек нокодазолом (обозначено N на Рис. 23-В) показывает задержку возрастания уровня цАМФ. Так, через 40 мин уровень цАМФ в обработанных ХТ и нокодазолом клетках значительно не отличается от уровня фона (0 мин); полное разрушение микротрубочек в эксперименте подтверждено данными иммунофпюоресенции (сравн. Рис.22 а и с). Таким образом, везикулярный транспорт ХТ из аппарата Гояьджи в ЭР может быть остановлен при разрушении системы микротрубочек. Через 90 мин уровень цАМФ при разрушенных микротрубочках всё же возрастает. Можно предположить, что дезорганизованное в отсутствие микротрубочек движение везикул всё же приводит к слиянию части их с мембраной ЭР и способствует процессингу А-ХТ в ЭР. Можно предположить также, что количество функционально активных А1 субьединиц ХТ, необходимых для активации аденилатциклазы в цитоплазме, незначительно и что отсутствие новой порции А1-ХТ будет препятствовать скорой инактивации существующего уже пула А1 субъединиц в цитоплазме. Полученные нами данные свидетельствовали об участии системы микротрубочек в везикулярном транспорте ХТ. Нарушение интактной структуры микротрубочек вызывало задержку транспорта и возрастания уровня цАМФ, тестируемого физиологического эффекта А1 субьединицы.

о Е

а

г <

о га за 4а бо за

Итв (т1п)

01 и

X

о Е

О

100"

0 20 40 40 90 90 Нте(тт)

В

Рис. 23.

А - возрастание уровны цАМФ в клетках в результате везикулярного транспорта и процессинга А субьединицы холерного токсина;

В - Задержка возрастания уровня цАМФ в клетках после разрушения нокодазолом системы микротрубочек.

111-3.3. Транспорт А-субьединицы холерного токсина из апарата Гольджи в ЭР может быть остановлен при микроиньекции антител к р-СОР - белку, ответственному за образование транспортных везикул между аппаратом Гольджи и эндоплазматическим ретикупумом.

Среди белков, которые могут участвовать в образовании транспортных везикул на мембране аппарата Гольджи наиболее интересной в настоящее время является группа СОР белков, (Schekmann, R., Orci, L. 1 996. Science, 271, 1S26 - 1532). Полученные нами функционально активные антитела к р-СОР белку (гл. Методы, разд. Антитела) позволили проведение экспериментов с микроинъекцией этих антител в обработанные XT клетки.

Согласно существующим представлениям СОР белки находятся в цитоплазме клетки в свободном состоянии и ассоциируются с мембранами внутриклеточных компартментов (Гольджи, интермедиата и ЭР) в момент образования транспортной везикулы (Bednarek, S.Y., и др., 1996. Trends in Cell Biol. V-6, p.468-472). Ассоциация COP белков на внутриклеточной поверхности аппарата Гольджи, по-видимому, вызывается сигналом, поступающим из аппарата Гольджи. Возможно, что этот сигнал реализуется через изменение конформационного состояния трансмембранных Гольджи рецепторов после связывания лиганда. Если эта идея верна, то насыщение аппарата Гольджи XT и связывание А субъединицы с KDEL-рецептором будет инициировать перераспределение СОР белков из цитоплазмы к мембране аппарата Гольджи. В этом случае микроиньекция функционально активных антител и связывание р-СОР белка предотвратила бы формирование СОР-комплекса на мембране аппарата Гольджи и возникновение новых транспортных везикул. При этом А субьединица XT должна оставаться в аппарате Гольджи в микроиньецированных клетках и перераспределяться в ЭР в контрольных клетках обработанного XT клеточного монослоя.

Результаты этого уникального эксперимента приведены на Рис. 24. Очищенная и сконцентрированная аффиная фракция функцонально активных антител к р-СОР белку

была микроиньецирована через 15 мин после начала интернализации ХТ. Монослой микроиньецированных и контрольных клеток возвращался в термостат (37°С) для продолжения везикулярного транспорта ХТ до ЭР. Клетки фиксировали через 90 мин после начала интернализации ХТ и проводили иммунофлюоресцентный анализ.

Рис. 24. Микроиньекция антител к ß-COP белку ингибирует транспорт А субьединицы ХТ из аппарата Гольджи в ЭР.

Результаты иммунофлюоресцентного анализа показали, что в отличие от контрольной фракции иммуноглобулинов микроиньекция функционально активных антител к ß-COP белку (Рис.24-1) вызывала остановку перераспределения А субьединицы ХТ из аппарата Гольджи в ЭР (Рис.24-2).

Нам удалось показать также, что только правильно подобранная концентрация микроинъцированных в клетку антител к ß-COP белку (в отношении к концентрации ß-COP белка в цитоплазме) может остановить выход А судьединицы ХТ из аппарата Гольджи. Если микроиньекцию проводили после выхода А субьединицы из аппарата Гольджи (после 30 - 35 мин), задержки трансторта в ЭР не наблюдалось. Таким образом мы показали участие СОР белков в ретроградном транспорте ХТ. (Majoul, I.V., Soling H.D.I996. Mol. Biol, of the Cell, Vol. 7, p. 617).

Ill - 3.4. Участие ГТФаз в регуляции внутриклеточного везикулярного транспорта XT.

Ряд компонентов цитоплазмы необходим для движения органелл и осуществления внутриклеточного везикулярного транспорта. Энергия для большинства транспортных процессов получается при гидролизе АТФ и ГТФ. Гидролиз ГТФ в клетке осуществляют две больших группы белков: трёхмерные G-белки и малые ГТФазы. Представители этих двух групп белков АЯГ(малая ГТФаза) и Gs« (трёхмерный G белок) взаимодействуют между собой в обработанных XT клетках. ARF был впервые обнаружен как кофактор, необходимый для эффективного АДФ-рибозилирования Gsa (Kahn, R., Gilman, A.G., 1984. J.Biol: Chem. 259, 6228-6234). Эксперименты на дрожжах показали, что отдельная группа малых ГТФаз (Rab - белки) необходимы для внутриклеточного везикулярного транспорта (Novic, Р., Brennwald Р 1993. Cell. V-75, р. 597-601). Недавно было показано, что для реинтернализации синаптических везикул после экзоцитоза необходимо присутствие моторной ГТФазы - динамина (Takei, К., и др. 1995. Nature, V 374, р. 186-189). Однако в работе других авторов утверждается, что в клетках животных ГТФазы участвуют только при транспорте с поверхности ПМ, а формирование транспортных везикул на мембране аппарата Гольджи может происходить даже в присутствии GTPyS ( Schnitzer, J., и др. 1996. Science. V.274, p. 239-242).

Для того чтобы выяснить на каком этапе осуществляется участие ГТФаз в везикулярном транспорте, мы использовали микроиньекцию негидролизуемого аналога ГТФ (GTPyS) и исследовали на модельной системе XT транспорт А субьединицы в микроиньецированных и контрольных клетках.

В результате проведёных экспериментов оказалось, что микроиньекция GTP-yS (0,5 - 5 мМ в пипетке) до аппликации XT способна предотвратить транспорт XT с поверхности ПМ и даже через 45 - 90 мин инкубации только небольшая часть XT перемещается с поверхности в эндосомы. Микроиньекция GTPyS в клетку, после того как XT достигал аппарата Гольджи, останавливала транспорт А субьединицы,

Рис. 25. Временная зависимость распределения А субъединицы ХТ в контрольных и микроиньецированных клетках

контроль микроинъекция внутриклеточный

компартмент

и перераспределение А-ХТ в ЭР в 80% клеток не происходило.

Обобщённые результаты экспериментов по регуляции внутриклеточного везикулярного транспорта СОР белками и ГТФазами приведены на Рис.25.

На основании этих и описанных ранее результатов выстраивается следующая картина процессов внутриклеточного везикулярного транспорта ХТ:

I. Связывание ХТ на поверхности клетки осуществляется после взаимодействия В субьединицы с рецептором (СМ1).

II. Концентрация связанного ХТ рецептора в области кавеол вызывает их интернализацию.

Регуляция: На этой стадии транспорт ХТ может быть остановлен микроинъекцией негидролизуемого аналога ГГФ.

III. Через 10 мин после начала интернализации ХТ обнаруживается в эндосомах, отличных от эндосом, транспортирующих трансферрин.

IV. Через 20 - 30 мин после начала интернализации с поверхности клеточной мембраны ХТ доставляется везикулярным транспортом в аппарат Гольджи.

V. Разделение А и В субъединиц ХТ осуществляется в аппарате Гольджи, предположительно после связывания А-ХТ через К0Е1_-последовательность с расположенным в аппарате Гольджи трансмембранным КОЕЬ-рецептором.

VI. Связывание К0Е1-рецептора лигандом распознаётся группой цитоппазматических СОР белков, которые участвуют в образовании транспортной везикулы на мембране аппарата Гольджи.

Регуляция: - в момент образования везикулы на мембране аппарата Гольджи транспорт А-ХТ может быть остановлен микроиньекцией функционально активных антител к р-СОР белку;

- разрушение системы микротрубочек на этой стадии приводит к задежке в образовании цАМФ;

- микроиньекция негидролизуемого аналога ГТФ блокирует транспорт А-ХТ в ЭР.

УШ. После завершения транспорта А-ХТ в ЭР происходит восстановление дисульфидной связи и образование активной А1 субьединицы.

IX. А1 субъединица пересекает мембрану ЭР и попадает в цитоплазму, где реализуется биологическое действие ХТ.

Обобщённая схема внутриклеточных процессов везикулярного транспорта ХТ представлена на Рис. 26.

III. 4. Холерный токсин как модель для исследования внутриклеточного везикулярного транспорта.

Холерный токсин представляет собой уникальную модельную систему для исследования внутриклеточного везикулярного транспорта. Уникальность его в отличие от других молекул, интернализующихся с поверхности плазматической мембраны, состоит в способности с помощью везикулярного транспорта пройти весь путь от клеточной поверхности через эндосомы и аппарат Гольджи в ЭР и оттуда транслоцироваться в цитоплазму. В составе холерного токсина В субьединица ответственна за рецептор-опосредованный эндоцитоз с поверхности цитоплазматической мембраны и доставку А субьединицы в аппарат Гольджи. Трансмембранный рецептор для KDEL сигнала, находящийся в аппарате Гольджи, связывает освободившуюся А субьединицу и транспортирует её посредством везикулярного транспорта с участием комплекса СОР белков из аппарата Гольджи в ЭР.

' < -Л '

О, А Г")

дио. гес*г<гг

А1 * А2 С^ШКСО. Су1с>о1!с ГвсЮг» У^-'У

£ я

Рис. 26. Схема внутриклеточного везикулярного транспорта холерного токсина

Создание моделей является необходимым на стадии исследования механизмов внутриклеточного везикулярного транспорта и позволяет составить общую картину регуляции этого уникального процесса на основании тех данных, которые были получены в этой области клеточной биологии за последние годы. Так, результаты исследований указывают на то, что эндоцитоз с поверхности плазматической мембраны осуществляется по крайней мере двумя независимыми путями: через клатрин-покрытые или непокрытые (кавеолы) везикулы. Считается, что холерный токсин интернализуется в основном через кавеолы, тогда как трансферрин интернализуется через клатрин (непокрытые везикулы). Ретроградный транспорт от аппарата Гольджи до ЭР осуществляется в везикулах, покрытых СОР белками (к. р, р',^, 8, еД ) и, как показали наши исследования, транспорт А-субьединицы холерного токсина может быть остановлен микроиньекцией функционально активных антител к р-СОР белку. Транспорт вновь синтезированных белков из ЭР в аппарат Гольджи осуществляется с помощью набора цитоплазматических белков, сходных с СОР1 комплексом. Известно также, что слияние мембран энергетически зависимо и происходит при гидролизе АТФ ^Р-белком. Однако ещё предстоит выяснить, например, какие конкретные рецепторы акцепторных мембран распознают информацию на поверхности различных транспортных везикул и обуславливают слияние этих везикул с мембранами акцепторных компартментов и какие новые белки АТФазы, ГТФазы, моторные актиновые, миозиновые или совсем ещё неизученные белки участвуют в этом процессе .

Выводы.

1. Установлено, что ХТ, связанный рецептором на поверхности клетки, доставляется внутриклеточным везикулярным транспортом через эндосомы в аппарат Гопьджи.

2. Транспорт ХТ с поверхности клетки осуществляется в везикулах (кавеолах), отличных от везикул, транспортирующих трансферрин.

3. Показано, что во время интернализации и транспорта в аппарат Гольджи ХТ сохраняет нативную структуру (АВ5).

4. Впервые в живой клетке проведена регистрация белок-белковых взаимодействий методом флюоресцентного резонансного переноса энергии (ФРПЕ). Этим методом было установлено, что разделение А и В субъединиц ХТ происходит в аппарате Гольджи.

5. Впервые показано, что А субьединица ХТ доставляется везикулярным транспортом в ЭР клетки, а не подвергается редукции в эндосомах, как считали ранее.

6. Впервые обнаружен в ЭР и реконструирован в бесклеточной системе процесс формирования дисульфидных комплексов между Al, А2 субьединицами ХТ и протеин дисульфидизомеразой (PDI).

7. Показано, что протеин дисульфидизомераза (PDI), находящаяся в ЭР, способствует редукции дисульфидной связи и облегчает транслокацию в цитоплазму функционально активной AI субьединицы ХТ.

8. Установлено, что В субьединица ХТ, обладающая пипофипьными гидрофобными свойствами, после отделения от А субьединицы удерживается в мембране аппарата Гольджи, транспортируется в лизосомы, и подвергается там деградации.

9. Показано, что связывание А субьединицы ХТ с К0Е1_-рецептором вызывает иммобилизацию цитоплазматических СОР белков на поверхности аппарата Гольджи и участие их в формировании транспортной везикулы.

10. Впервые установлено, что микроиньекция функционально активных антител против белка везикул р-СОР предотвращает транспорт А субьединицы ХТ из аппарата Гольджи в ЭР. Эти даные подтверждают существовавшее ранее предположение о внутриклеточной роли СОР-белков в регуляции везикулярного транспорта.

11. Показано, что везикулярный транспорт ХТ можно регулировать состоянием моторных систем клетки (микротрубочек) и ингибированием ГГФазной активности.

12. Разработана новая модельная система внутриклеточного везикулярного транспорта субьединиц ХТ. Воспроизводимая во времени модель позволяет анализировать факторы, участвующие в регуляции везикулярного транспорта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мажуль, В. М. Конев, C.B., Янчевская Т.Н., Мажуль И.В. Роль микрофиламентов в регуляции высокопроницаемой контактной мембранной активности. 1985. Биофизика. XXX, N-2, Р. 273-277.

2. Majoul, I.V., Bastiaens, P.I.H., Soling Н.-О. Use of cholera toxin and ist subunits to study KDEL-mediated Golgi-ER back transport. 1995. EurJ.Cell. Biol. ECBO meeting. Abstr. vol., p. 56.

3. Majoul, I.V., Schaefer, U., Basiaens; P.I.H., Soling H.D., Back transport of KDEL-receptor from the Golgi to the ER in Vero cells as studied with cholera toxin. 1996. Protein Sorting in the Secretory Pathway. EMBO - Workshop. Abstr. p. 12.

4. Sôling, H.-D., Hilleman, J., Топко, С., Bartel, A., and Majoul, I.V. Trimeric GTP-binding proteins and intracellular vesicuiar transport. 1996. I DFG colloquium GTPases as central regulator of cellular function. Abstr. book, p. 29.

5. Majoul, I.V., Bastiaens, P.I.H., Soling, H.D. Back transport of KDEL- proteins from the Golgi to the ER as studied with cjlera toxin. 1996. Eur. J. Cell Biol. S.42, (Vol.69), P. 123.

6. Majoul, I.V., Bastiaens, P.I. 11, Soling, H.D. Cholera toxin as a tool to study the regulation vesicular transport in the cell. 1996. Oncogenes and Growth Control, Heidelberg. Abstract of EMBL conference. P.I 39.

7. Majoul I.V., Bastiaens, P.I.H., Mieskes, G., Jovin T.M., Soling, H.D. Monitoring of cholera toxin transport and processing in the cell: Application of the energy transfer and GFP fusion protein. 1996. 2nd International Fluorescence Lifetime Imaging Meeting. Abstr. P.68.

8. Plattner, H., Habermann, A., Kissmehl, R., Klauke, N., Majoul, I.V., Soling, H.D. Differential distribution of calcium-stores in Paramecium cells. Occurence of a subplasmalemmal store with a caisequestrin-like protein. Eur. J. Cell Biol. 1997, (в печати).

9. Majoul, I.V., Soling H.D. Intracellular transport and processing of cholera toxin subunits: role of KDEL signal ana reduction of A-subunit in the ER. 1996. Mo). Biol, of the Cell. Vol. 7. P. 617.

10. Bastiaens P.I.H., Majoul, I.V., Jovin T.M. Mtcrospectroscopic imaging of intracellular protein processing in signal transduction and bacterial toxin trafficking. 1996. 2nd International Fluorescence Lifetime Imaging Meeting. Abstr. P. 1 2

11. Majoul, I.V., Smirnov, A., Wiltfang, J., Soling, H.D.

New method of detection and separation of cholera toxin subunits in the gel. 1997. Analytical Biochemistry, (в печати).

12. Majoul, I.V., P.I.H. Bastiaens, H.-D. Soling. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL)-Protein from Plasma Membrane to the Endoplasmic Reticulum: Studies with Cholera toxin in Vero Cells. 1996, J.Cell Biol. 133, N4, p. 777-789.

1 3. Bastiaens, P.I.H., Majoul, I.V., P.V. Verveer, H.-D. Soling, T.MJovin. Imaging the intracellular trafficking and state of the AB5 quaternary structure of cholera toxin. 1 996. The EMBO J., V.I 5, N16, p.4246-4253.

14. Majoul, I.V., Soling H.-D. Monitoring the cholera toxin transport and processing in the cell

Trends in cell Biol., submitted. 1997.

15. Majoul, I.V., Soling H.-D. Reduction of disulfide bonds in an oxidising environment. The disulfide bridge of cholera toxin A-subunit is reduced in the endoplasmic reticilum. FEBS Letters. 1997. 401, стр. 104 -108.

16. Majoul, I.V., Veereb, J. Mieskes, G., Soling H.D. Dynamic translocation of enzymatically active cholera toxin subunit monitored with ERD2-GFP on a live cell.

J.Cell Science, in prep. 1997

СОДЕРЖАНИЕ

Введение...................................................................................................1

Актуальность проблемы...................................................................5

Цель и задачи исследования.............................................................8

Научная новизна работы..................................................................9

Научно - практическая ценность работы.................................11

Основные положения диссертации, выносимые на

защиту.......................................................................................................13

Апробация работы.............................................................................13

Лекции, прочитанные по теме диссертации..............................14

II Экспериментальная часть.........................................................15

11.1. Материалы и методы.................................................................15

III Результаты и обсуждение:........................................................28

111-1.1. Молекулярно-биопогическая характеристика

субьединиц холерного токсина..................................................28

111-1.2. Получение белков ЭР и морфологическая

характеристика внутриклеточных компартментов..............32

ИМ. 3. Связывание и интернализация холерного токсина с поверхности цитоплазматической

мембраны...............................................................................................34

Ш-1. 4. Биохимическая и спектроскопическая характеристика меченого флюорохромом СуЗ

холерного токсина............................................................................37

Ш-1. 5. Обоснование использования метода ФРПЭ для изучения взаимодействия субьединиц XT

вклетке...................................................................................................40

ИМ. 6. Спектроскопический анализ структурного

состояния субьединиц XT в клетке..........................................46

III - 2.1. Локализация и функции трансмембранного

KDEL- рецептора в аппарате Гольджи......................................53

III - 2. 2. Экспрессия и транспорт KDEL-рецептора в живой клетке. Исследоваия с использованием

GFP-ЗелёногоФлюоресцирующего Белка (ЗФБ)......................54

III - 2. 3. Конструирование, экспрессия и

транспорт рекомбинантного белка B-KDEL в клетке............64

Ill - 2.4. Транспорт А субьединицы холерного токсина из аппарата Гольджи в эндоплазматический ретикупум....67 III - 2.5. Субклеточное фракционирование

обработанных XT клеток..................................................................69

111-2.6. Биохимический анализ состояния А

субьединицы XT в субклеточных компартментах................71

III - 2.7. Выделение и очистка функционально активной PDI (протеиндисульфиднзомеразы) из ЭР. In vitro реконструкция образования комплексов

меж ду А субье диницей ХТ и Р01...................................................75

111-3. Исследование механизмов регуляции внутриклеточного везикулярного транспорта

холерноготоксина................................................................................81

111-3.1 Участие системы микротрубочек в

везикулярном транспорте холерного токсина........................81

111-3.2. Изменение уровня цАМФ при нарушении везикулярного транспорта ХТ по микротрубочкам...................................................................................83

111-3.3. Транспорт А-субъединицы холерного токсина из апарата Гольджи в ЗР может быть остановлен при микроиньекции антител к р-СОР - белку, ответственному за образование транспортных везикул

между аппаратом Гольджи и ЭР...................................................85

III - 3.4. Участие ГТФаз в регуляции

внутриклеточного везикулярного транспорта ХТ.................87

III. 4. Холерный токсин как модель для исследования

внутриклеточного везикулярного транспорта..........................90

Выводы.....................................................................................................93

Список работ, опубликованных по теме

диссертации...........................................................................................94