Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ белок-белковых взаимодействий в живой клетке методом флюоресцентного резонансного переноса энергии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Мажуль, Ирина Вячеславовна, Пущино

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат физ.-мат. наук

Н.Ф. Ланина

Общая характеристика и актуальность работы

Сложившееся в процессе эволюции в клетках эукариот разделение процессов между специфическими внутриклеточными компартментами (такими как эндосомы, аппарат Гольджи, лизосомы, ядро и др.) привело к развитию между ними регулируемого транспорта веществ. Эксперименты последних лет показали, что внутриклеточный транспорт ке является хаотичным процессом, а осуществляется в ограниченных мембранами транспортных везикулах - Pelham, N.R.В. (1991); Orci L. and Rothman, J.E. (1993); Stamnes, M.A. and Rothman, J.E. (1994); Rothman, J.K. and Wieland, F.T. (1996),- Wieland, F.T. and Barter C. (1999).

Внутриклеточный везикулярный транспорт лежит в основе таких важных для живой клетки процессов, как эндо- и зкзоцитоз (Palage, G., 1975). Сохраняясь в процессе эволюции, везикулярный транспорт эффективно действует в каждой эукариотической клетке. Гомологичные молекулы, участвующие в образовании транспортной везикулы, идентифицированы в клетках дрожжей и в нейроне гиппокама (Maters, G и др., 1991, Sollner, Т и др. 1993). Везикулярным транспортом с поверхности цитоплазматической мембраны во внутриклеточные компартменты доставляются многочисленные белки (лиганды клеточных рецепторов, нейротрансмиттеры и другие секреторные молекулы), (Elasar. R. и др., 1994).

Механизмы регуляции в доставке специфических молекул к их чторным компартментам интенсивно исследуются на разных уровнях: з клетках дрожжей, так и в нейронах позвоночных (Cosson, Р. , • irner, F., 1994; Rothman, J.E., 1994).

Однако многие детали механизма транспорта остаются вмененными. Несмотря на то, что транспортные белки уже выделены ™""г.роклонированы (например, белки, участвующие в пресинаптической ■ эдаче!, исследование функций этих белков в живой клетке ш ххаточно сложно в исполнении и интерпретации.

В данной работе была впервые предпринята попытка исследовать белок-белковые взаимодействия в живой клетке. Для этого был применён метод ФРПЭ - Флюоресцентного Резонансного Переноса Энергии Сангл. FRET). ФРПЭ как метод регистрации основан на физическом явлении флюоресцентного резонансного переноса энергии между донором и акцептором при возбуждении донора. Состояние, при котором перенос энергии возможен (3-7 нм) , отражает состояние взаимодействия двух исследуемых белков, меченых соответственно двумя хромофорами: донором и акцептором. Мы применили этот метод в сочетании с высокоразрешающей Многофотонной Многофокальной Микроскопией - МММ, или FRET-МММ (сокращённый термин). Объединение

спектрофотометрических методов исследования клетки с биохимическими и молекулярно-биологическими подходами позволило получить данные, с помощью которых можно было создать теорию и обосновать механизмы осуществления ретроградного везикулярного транспорта белков в живой клетке.

В качестве модельной системы был использован разработанный нами ранее ретроградный транспорт субъединиц холерного токсина (XT), Majoul и др., 1996. Предложенные до этого системы внутриклеточного везикулярного транспорта были достаточно сложны, трудно воспроизводимы, вызывали побочные неконтролируемые эффекты (например, необходимость дополнительной обработки клеток ДТТ для внутриклеточного высвобождения связанного с носителем белка -(Miesenboeck. и др., 1995) и не позволяли эффективно исследовать механизмы регуляции ретроградного транспорта.

Вышеизложенная ситуация объясняет актуальность проблемы создания и разработки простой модели, позволяющей изучать механизмы клеточного транспорта а также системы регистрации (FRET-МММ), позволяющей изучать функции отдельных белков, участвующих в формировании, распознавании и слиянии донорных везикул с акцепторной мембраной в условиях живой клетки.

Трудность в исследовании везикулярного транспорта состояла также в необходимости разграничения разнонаправленных транспортных

потоков, функционирующих в клетке одновременно. С помощью предложенных ранее моделей можно было экспрессировать в клетке лишь один из транспортируемых белков (например, вирус везикулярного стоматита VSV-G (Balch, W. Е. и др., 1994), или действие сводилось к циркуляции эксг.рессироваккого белка между аппаратом Гольдаи и эндоплазматическим ретмкулумом (ЭР). В последнем случае разделение антероградных везикул, направленных от ЭР к аппарату Гольдам от ретроградных везикул, идущих в противоположном направлении, оказывалось технически невозможным.

Согласно современным представлениям формирование

транспортной везикулы на мембране донорного компартмента инициируется взаимодействием белков, переносимых этой везикулой с траксыембранным рецептором. При этом изменение структурного состояния связанного рецептора может распознаваться

цитоплазматическими белками, которые ассоциируются с мембраной и инициируют образование транспортной везикулы. Однако надёжного метода, позволяющего регистрировать формирование таких функционально-активных белковых комплексов в живой клетке разработано не было.

Таким отразом, предлагаемая работа описывает специально разработанную для мониторинга везикулярного транспорта модельную систему субъединиц холерного токсина и исследование этой системы с помощью разработанного автором и международно признанного метода Флюоресцентного Резонансного Переноса Энергии (ФРПЭ).

Для этого ряд белков, участвующих в ретроградном транспорте XT, зкспрессировали в живой клетке как донор-акцепторные пары с использованием живых хромофоров, синего и желтого (CFP и YFP) мутантов GFP {зелёного флюоресцирующего белка). Внутриклеточные функции этих белков были исследованы в живой клетке вышеуказанным методом ФРПЭ (FRET-МММ Majoul и др.1996, 1998, 2001, 2002) .

Разработка и успешное применение такого метода открыло принципиальные возможности для исследования и мониторинга многочисленных белковых комплексов (а также РНК, ДНК-белковых!,

которые формируются в живой клетке в ходе регуляции везикулярного транспорта, связанного с ним выброса нейромедиаторов, секреци, эндоцитоза,а также других белковых комплексов, участвугощих в транскрипции, трансляции и внутриклеточной передаче сигнала.

Таким образом становится понятным, что применение метода ФРЭТ-МММ в сочетании с другими развивающимися новыми методами (как напр. Флюоресцентная Корреляционная Спектроскопия и т.п.) для исследования живой функционально активной клетки является перспективным и расширит в будущем круг наших представлений о механизмах внутриклеточных процессов.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в разработке метода, основанного на резонансном переносе энергии, позволяющего изучать белок-белковые взаимодействия в живой клетке. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Разработать точный метод регистрации белок-белковых взаимодействий в живой клетке, основанный на физическом явлении флюоресцентного резонансного переноса энергии между донором и акцептором при возбуждении донора (ФРПЭЗ. Состяние при котором перенос энергии возможен (3-7нм) отражает взаимодействие двух исследуемых белков, меченых соответственно двумя хромофорами: донором и акцептором. Разработанная система внутриклеточного транспорта XT в сочетании с экспрессией в одной и той же клетке живых хромофоров (СРР и YFP) создала предпосылки для изучения взаимодействий белков, индуцированных транспортом XT.

2) Создать спектроскопически подходящие для ФРПЭ флкюресцентныехимерные пары химерных белков. В данной работе были использованы донор-акцепторные пары с интегральным перекрытием спектров: синий (CFP) и жёлтый (YFP) мутанты зелёного флюоресцирующего белка (GFP), образующие донор-акцепторную пару. На основе этой пары была создана галерея флюоресцирующих химерных белков, участвующих в ретроградном

транспорте: ARF1, ARF-GAP, белки C0P1-комплекса; ряд

трансмембранных белков: р23, р24, KDEL-рецептор и соответствующие им, находящиеся в состоянии ФРПЭ, «контрольные конструкты» (FCCI, PCCII, FCCIII)

3) Экспрессировать эти белки и исследовать поведение их в живых клетках методом ФРПЭ. Используя разработанную модельную систему внутриклеточного транспорта токсинов, выяснить, какие из этих белков участвуют в ретроградном везикулярном транспорте XT.

4) Проклонировать маркерные белки внутриклеточных компартментов. Экспрессировать маркерные белки внутриклеточных компартментов: аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума и др., позволяющие морфологически охарактеризовать эти внутриклеточные компартменты в живой клетке и идентифицировать присутствие в них субъединиц XT.

5} Получить холерный токсин, в котором субъединицы мечены флюорохромами с разной длиной возбуждения (Oregon Green или

Су2-Я. воэб - 488 км, СуЗ - X зоз0 530 км. Су5 - X ВОзб бЗЗнм) .

6) Показать транспортную и функциональную активности меченого XT в клетке, а также его мутанта СТХ-К63, неспособность вызывать возрастание уровня цАМФ.

7) На основании полученных результатов с помощью ФРПЭ изучить динамику образования функционально активных транспортных комплексов под нагрузкой токсина.

8) Разработать метод фотоинактивации акцептора в живой клетке (впоследствии устоявшегося под именем FRET-MMM-bleach) и подтвердить этим методом взаимодействие белков в живой клетке.

Научная новизна и практическое значение. Большинство научных результатов и методических разработок, представленных в работе, носит приоритетный характер. Впервые произведены измерения белок-белковых взаимодействий в живой клетке во времени методом FRET-МММ (Majoul и др.: Developmental Cell, Vol.1, p.139-153, 2001,- Revies

in Molecular Biotechnology, p.79-93, 2001). Установление механизмы ретроградного транспорта XT описаны в работах (Majoul и др.:1998, 1999, 2001, 2002). Показано, что А и В субъединицы XT разделяются в аппарате Гольджи; при этом А субъединица проникает в эндоплазматический ретикулуы клетки. (Majoul и др.1996, Bastiaens P.I.H., Majouln др., 1996). Таким образом XT представляет собой уникальный объект для фундаментальных исследований биологии клетки. Новая воспроизводимая во времени модель транспорта XT в живой клетке и впервые разработанный метод регистрации белок-белковых взаимодействий в живой клетке ФРЭТ-МММ могут быть использованы для более эффективного исследования внутриклеточных механизмов передачи сигнала, системы вторичных мессенджеров, рецептор-опосредованного эндоцит'оза, для изучения типов движения везикул по микротрубочкам, для исследования роли трёхмерных G-белков и малых ГТФ-связывающих белков в регуляции внутриклеточного транспорта. Предложенная автором модель везикулярного транспорта с использованием субъединиц XT успешно применяется на курсах ЕМВО (Гейдельберг), Зх-мерной Микроскопии, (Ванкувер, Канада), на курсах в институте Макса-Планка, (Геттинген) а для внутриклеточной регистрации белок-белковых взаимодействий используется метод FRET-MMM.

Разработанным нами ранее методом регистрации донор-акцепторных взаимодействий в фиксированных препаратах (Bastiaens P.I.H., Majoul I.V., 1996) было показано, что А субъединица XT транспортируется везикулярным транспортом в направлении, противоположном секреторному пути в эндоплазматический ретикулум клетки, где -S-S- связи между А1 и А2 KDEL субъединицами XT могут восстанавливаться (Majoul и др., 1997). Разработан точный ранее метод регистрации белок-белковых взаимодействий однако не позволял работать эффективно в живой клетке, поэтому мы перешли к использованию метода ФРЭТ-МММ. В настоящее время только два других метода позволяют с достаточной точностью исследовать взаимодействие белков - двухгибридная система и фаговый дисплей; однако ни

двухгибридкая система ни фаговый дисплей не позволяв® работать внутриклеточно.

Сочетание разработанной автором ранее системы внутриклеточного везикулярного транспорта XT с экспрессией живых хромофоров (CFP и YFP) а также изучение их поведения в живой клетке методом FRBT-MMM создали предпосылки для мониторинга формирования функционально активных белковых комплексов, участвующих в транспорте холерного токсина.

Результаты исследований, впервые полученные на живой клетке методом FRET-МММ, имеют принципиальное значение для понимания механизма регулируемого везикулярного транспорта белков в живой клетке. Метод FRET-МММ позволит и в будущем проверить многие построенные на основе in vitro экспериментов гипотезы.

Апробация работы.

Материалы работы докладывались на следующих международных конференциях и конгрессах: «Онкогены и контроль роста», (Германия, Гейдельберг,1992), на 2-й международной конференции «Биохимия клеточных мембран IUBMB», (Италия, Бари); на немецко-датском обществе по клеточной биологии, (Германия, Мюнстер,1993); на совместном англо-немецком обществе по клеточной биологии, ЕСВО, (Германия, Гейдельберг 1995); на ежегодном конгрессе немецкого общества клеточных биологов, (Германия, Гамбург,1996); на 3-й международной конференции ЕМВО «Сортинг и процессииг белков», (Австрия, Аннаберг, Сан-Мартин, 1996) ,- на 1-м Коллоквиуме немецкого научного общества «ГТФ-азы как центральные регуляторы внутриклеточных функций (Германия, Ульм, 1996),- на 2-м Международном конгрессе по флюоресценции Fluorescence Lifetime Imaging, (Нидерланды, Утрехт, 1996) ,- на 37-м конгрессе американского общества клеточных биологов (ASCB) и на 6-м Интернациональном Конгрессе по Клеточной Биологии, (США, Сан-Франциско, 1996), на докладе

«Молекулярные механизмы везикулярного транспорта токсинов» в Пущино, ИТЭБ РАН,1997; на коллоквиуме немецкого научного общества SFB (Sonderforschungsbereichs 236) 1997; в Институте Кюри, Париж 1998; на докладе «Внутриклеточная регуляция везикулярного транспорта». Кембриджский Университет, Англия,1998) ; на Втором Всесоюзном Съезде Биофизиков России, Москва, МГУ,1999; на 3 Международном Симпозиуме по Молекулярной и Клеточной биологии, Германия, С. Zeiss, Йена, 2000; на симпозиуме по транспорту токсинов, INSERM, Париж, Франция, 2000; на Гордоновской конференции (Proctor) и в Гарвардском Университете, Бостон, США, 2сю1; в Ммпериальном Колледже (ICRF) Англия 2001 и на др. митингах.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Впервые разработан и применен метод флюоресцентно резонансного переноса энергии (ФРПЭ) в сочетании с Многофокальной Многофотонной Микроскопией FRET-МММ для мониторинга белок-белковых взаимодействий в живой клетке.

2. С помощью этого уникального метода длительной регистрации белок-белковых взаимодействий в живой клетке (FRET-МММ) на ранее разработанной автором модельной системе внутриклеточного транспорта холерного токсина показана функция ряда белков, участвующих в ретроградном везикулярном транспорте.

3. Установлено, что в регуляции внутриклеточного везикулярного транспорта белков принимаеют участие специфические сигнальные последовательности аминокислот переносимого сарго, которые распознаются трансмембранными рецепторами, локализованными во внутриклеточных компартментах.

4. Выяснена роль группы цитоплазматических белков (arfi , arf-gap, copi) в формировании транспортных везикул а также последовательность стадий в регуляции ретроградного транспорта бактериальных токсинов (на примере XT).

5. На основании полученных данных автором предложена модель, объясняющая внутриклеточный механизм регуляции ретроградного транспорта белков в живой клетке.

Структура и объем работы. Диссертация в форме научного доклада состоит из введения, главы, описывающей объекты и методы исследования, глав с изложением полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 63 страницах и иллюстрирована заключительной схемой и 23-мя комплексными рисунками.

Методы исследования

1.1 Материалы. Холерный токсин (СТХ или XT! и его отдельные субъединицы А и В получали от фирм: Calbiochem Co., La Jolla, CA, USA,- Sigma, St. Louis, MO, USA, LIST, Biological laboratories, Campbell CA, USA. Моногакгшзоид Э4-1 был произведен на Фирме RBI, Natick, MA, USA. NHS-LC-биотин предоставлен Piers Chemical Co., Rockford, IL.USA. Сульфоиндоцианиновые красители СуЗ и Су 5 были производства Biological Detection Sysems, Pittsburg, PA, USA. Протеин-А сефароза и папаин-арагоза были получены от фирмы Pharmacia, Uppsala, Швеция. Для концентрирования очищенных белков использовали малые амикон- центриконовые концентраторы (до SOOOg av) фирмы Amicon-Centricon, Beverly, USA. Нокодазол, таксол, цитохалазин Б и брефельдии А были производства фирмы Sigma, St.Louis, МО, USA. Реагенты для клеточных культур получали от GibcoBRL, Life Technologies, FRG.Векторы GFP, CFP, YFP, Clontech, M13 mpl9 получен от Stratagen, USA. Плазмида pJS 752-3 (производная от pKK223-3) , содержащая ген В-субъединмцы XT, была любезно предоставлена Dr. J. Sanchez.

1.2. Клеточные линии и экспрессируемые химерные белки.

В большинстве экспериментов с ФРПЭ использовали Vero (фиброшгастоподобные клетки почки зелёной африканской мартышки). Для некоторых антител использовали гиппокампиальные нейроны в культуре, NIN-373 (мышиные фибропласты), HELA, НЕК293, и перыве 6 пассажей фибропластов кожи человека. Плазмида ую ДНК амщхифицировали в E.Coli, штамм-ОН5а_ Для трансфек�