Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гомологическая рекомбинация у эукариот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гомологическая рекомбинация у эукариот"

На правах рукописи

ШАЛГУЕВ Валерий Иванович

ГОМОЛОГИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ У ЭУКАРИОТ: ОСОБЕННОСТИ ГОМОЛОГИЧЕСКИХ ДНК-ТРАНСФЕРАЗ 114051 ИЗ ДРОЖЖЕЙ Рккш angust* И ВОДОРОСЛЕЙ СМатуйотошк геткагйШ

03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Владислав Александрович Ланцов, Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Николай Викторович Томилин, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург,

доктор биологических наук, профессор Андрей Петрович Перевозчиков, ГУ НИИ Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный

Университет.

Защита состоится /¿Г декабря 2006 г. в '/^часов на заседании диссертационного совета Д. 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр.,-4. .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан ноября 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рекомбинация ДНК — один из фундаментальных процессов, происходящих в живой клетке. К настоящему времени наиболее детально исследована гомологическая рекомбинация (ГР) у прокариот. Основой процесса ГР у прокариот является способность белка RecA катализировать клеточную реакцию синапсиса и обмена нитей ДНК. Белок RecA играет центральную роль в гомологической рекомбинации и участвует в процессах: рекомбинационной репарации, репликации, мутагенеза, клеточного деления, регуляции экспрессии многих репарационных генов и индукции SOS-ответа клетки у бактерий [1-3].

Структурные и функциональные аналоги белка RecA обнаружены во всех организмах: от бактерий до эукариот, включая человека [4, 5]. Хотя многие принципиальные механизмы являются общими у прокариот и эукариот, ГР у высших организмов отличается наибольшей сложностью. Поэтому поиск аналогов белка RecA и исследование механизма ГР у эукариот является актуальной задачей молекулярной биологии. >

Дрожжи Pichia augusta — один из видов таксономического комплекса метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha — являются интересным объектом, привлекающим внимание в качестве продуцентов для получения рекомбинантных белков. Уникальность дрожжей Р. angusta состоит в их термотолерантности, т.е. в способности расти при высоких температурах вплоть до 50 °С. Сравнение генома Р. angusta с геномом Saccharomyces cerevisiae показало, что среди 2500 идентифицированных генов Р. angusta 94% обладают гомологией с S. cerevisiae, тогда как 6% не обладают гомологией. До настоящего времени в литературе не было сообщений об обнаружении в геноме Р. angusta генов, ответственных за гомологическую рекомбинацию и рекомбинационную репарацию.

В настоящей работе клонирован гена RAD51 из термотолерантного штамма Р. angusta, и приведены основные рекомбинационные характеристики белка Rad51Pa, кодируемого , этим геном. Белок Rad51pa является ДНК-зависимой АТФазой и проявляет типичные свойства семейства белков Rad51. В контексте белковой термостабильности биохимические и рекомбинационные свойства белка Rad51pa сравнивали с RadSlsc [6].

Вторым модельным объектом биохимических исследований была одноклеточная зеленая микроводоросль Chlamydomonas reinhardtii. К моменту начала наших исследований ее система гомологической рекомбинации (ГР), лежащая в основе рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК, была очень слабо изучена. В последние годы реализуется программа секвенирования ядерного генома С. reinhardtii. В

геноме были выявлены разнообразные нуклеотидные повторы. И было получено объяснение низкого уровня ядерной ГР относительно негомологичной рекомбинации. Анализ геномной и EST библиотек (EST - маркеры экспрессированных последовательностей) у микроводорослей С. reinhardtii позволил клонировать последовательность кДНК гена RAD51C. В настоящей работе ген RADS J С был экспрессирован, выделен и очищен его продукт. Были также изучены основные рекомбинационные и биохимические активности белка Rad51Ccr [7]. Цели и задачи исследования

Целями данной работы являлось демонстрация и анализ основ термотолерантности дрожжевого белка Rad51 из P. angusta и выявление рекомбинационных активностей белка Rad51C из микроводорослей С. reinhardtii. Для достижения этих целей были решены следующие задачи:

1. Клонирован ген RAD51 из термотолерантных дрожжей P. angusta.

2. Выделен белок Rad51 р».

3. Исследованы рекомбинационные и термодинамические характеристики белков Rad51 из дрожжей P. angusta Rad51 sc и S. cerevisiae.

4. Выделен белок Rad51C-His6 и Rad51C из С reinhardtii.

5. Исследованы рекомбинационные характеристики белка Rad51C-His6. Основные положения, выносимые на защиту

1. Белок Rad51pa обладает основными биохимическими активностями, необходимыми для образования рекомбинационного пресинаптического комплекса.

2. При температуре 40—42°С (оптимальной для роста клетки-хозяина) по сравнению контролем при 37°С изменяются три характеристики пресинаптического комплекса, образуемого белком Rad51 ра, АТФ и онДНК:

• уменьшается время образования комплекса [Rad51 р»: :онДНК:: АТФ];

• уменьшается энергия активации АТФазной активности комплекса

[Rad51 ра: гонДНК];

• появляется способность пресинаптического комплекса [Rad51 ра::онДНК:: АТФ]

катализировать реакцию обмена протяженных молекул ДНК.

3. Белок Rad51Ccr обладает следующими биохимическими активностями, необходимыми для образования рекомбинационного пресинаптического комплекса у водорослей С. reinhardtii:

• ДНК-зависимая АТФазная активность;

• способность к образованию нуклеопротеинового филамента на он- и днДНК;

• ДНК-трансферазная активность.

Научная новизна

Впервые клонирован ген RAD51 из метилотрофных термотолерантных дрожжей Pichia angusta, способных к выживанию при температуре 50°С.

Впервые показано, что белок Rad51 из Р. angusta обладает термозависимыми характеристиками. При температуре выше оптимальной для роста клетки-хозяина (-40°С) по сравнению с 37°С: (1) уменьшается время образования и энергия активации АТФазной активности комплекса белка Rad51 и онДНК; (2) появляется способность комплекса катализировать ключевую реакцию ГР -реакцию обмена протяженных молекул ДНК.

Впервые показано, что белок Rad51C из водорослей С. reinhardtii способен: (1) образовывать нуклеопротеиновый филамент на онДНК; (2) катализировать реакцию замещения и обмена нитей ДНК.

Впервые получены доказательства консервативности функций белков семейства RadSl из разных царств эукариот на примере термотолерантных дрожжей Р. angusta и водорослей С. reinhardtii.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты работы показывают сходство механизма ГР у низших и высших эукариот. Полученные данные могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов гомологической рекомбинации у различных эукариотических организмов. Теоретические результаты работы могут быть использованы в учебных спецкурсах по молекулярной биологии, читаемых на биолого-медицинских факультетах высших учебных заведений. Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых Петербургского института ядерной физики (Гатчина, 2000-2005); УШ, IX и X Международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004, 2005, 2006 г.); Международной конференции "Chlamy 2004" Abstracts of 1 Ith International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas (Kobe, Japan, 2004 г.), Политехническом Симпозиуме "Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона" (Санкт-Петербург, Россия, 2004 г.), Международной конференции "The N.W. Timofeeff-Ressovsky conference" (Ереван, Армения, 2005 г), Международной конференции "Chlamy 2006" Abstracts of 12th International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas (Portland, Oregon, USA, 2006).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 123 странице машинописного текста и состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", двух глав результатов исследования, главы "Обсуждение", выводов и списка цитируемой литературы. Иллюстрационный материал представлен 55 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные и дрожжевые штаммы. Термотолерантный дрожжевой штамм Р. angusta Y1397 получен из Российской коллекции микроорганизмов. Для исследования функциональной компенсации дефекта гена RAD51 использовали следующие дрожжевые штаммы. Дрожжевой диплоидный штамм D4004 S. cerevisiae (МАТа/МАТа adelA-248/ade2A-248 1еи2-3,112/ leu2-3,112 ura3-160,288/ura3-160,288 trpl/trpl RAD51/RAD51) и производный от него штамм rad51-l, D3164 {МАТа/МАТаade2A-248/ade2A-2481еи2-3,112/ Ieu2-3,112 ura3-160,288/ura3-160,288 trpl/trpl rad51-l/rad51-l). Бактериальный штамм DH5a использовали для выделения и трансформации плазмидной ДНК. Для производства рекомбинантных белков использовали бактериальный штамм BL21 (DE3): F ompT hsdSß (гв'пгв ) dem galArecÄ306-

Клонирование и секвенирование гена RAD51 из Р. angusta. Геномную ДНК выделяли

из термофильных дрожжей Р. angusta штамма ВКМ Y1397. Геномную библиотеку этих

дрожжей конструировали по рестршсгазам Xhol и BamHI на базе плазмиды pUC19. Для

клонирования полноразмерного гена RAD51 создали библиотеку кДНК этих дрожжей в

векторной системе Uni-ZAP XR. Путем скрининга выявили клон, содержащий открытую

рамку считывания длиной 1107 н, соответствующий гену RAD51 из P. angusta (код доступа

DDB J/EMB LVGenB ank-A Y307358). Нуклеотидную последовательность определяли с

помощью секвенирования дидезокситерминирующим методом с ДНК-полимеразой Т7.

Выделение белка Rad51 из P. angusta. Кодирующую последовательность гена RAD51 из

P. angusta клонировали в экспрессионный вектор рЕТ2lb: Белок Rad51p» выделяли из

экстракта клеток BL21(DE3), содержащих плазмиду pET-PaRad51 с геном RAD51,

осаждали полимином Р и последовательно очищали на колонках с фосфоцеллюлозой PI 1,

гидроксиапатитом, Cibacron Blue и Hi-Trap Q. -

Выделение белка Rad51Ccr и Rad51Ccr-His6 из С. reinhardtîi. Анализ баз данных EST-

последовательностей кДНК микроводоросли С. reinhardtîi выявил две последовательности

(AV629583 и BG848251), кодирующие белок сходный с белком Rad51C из Arabidopsis.

Используя праймеры специфичные к AV629583 и BG848251, с помощью полимеразной

цепной реакции (ПЦР) амплифицировали ген RAD51C из С. reinhardtîi. Была обнаружена

открытая рамка считывания, соответствующая белку RadSIC (код доступа

6

DDBJ/EMBL/GenBank-AY058913). Ген RAD5IC переклонировали в вектор рЕТ21Ь для экспрессии белка Rad51 Ссг и Rad51 Ccr-His6 (содержащий полигистидиновый (6 аа) тракт на С-конце белка) в клетках Е. coli BL21(DE3) АгесА. Белок Rad51Ccr выделяли из телец включения с использованием хроматографической очистки на колонке MonoQ. Белок Rad51 Ccr-Hisg выделяли с помощью ряда последовательных хроматографических стадий на колонках с Ni-NTA-агарозой, гидроксиапатитом, DEAE-сефарозой и Hi-Trap Q. Анализ кинетических параметров реакции гидролиза АТФ. Гидролиз АТФ, катализируемый белками Rad51 и RecA, измеряли с помощью спектрофотометрического теста, в котором уровень образования АДФ сопряжен с окислением NADH в NAD+. Таким образом, уменьшение в поглощении света с ^з4онм оказывается прямо пропорциональным гидролизу АТФ- Окисление NADH определяли с использованием коэффициента экстинции ез4о = 6.22x10"3 (М"1 хсм" ). Реакцию проводили при 37°С в стандартном буфере TMD (50 мМ Трис-HCl (pH 8.0), ЮмМ MgCl2, 1мМ дитиотрейтол, 1мМ АТР, ЮОмМ NaCl, 3 мМ Фосфоенолпируват, 30 U/мл Пируват киназа, 30 U/мл Лактат дегидрогеназа, 200 мкМ NADH) и указанные количества ДНК-субстратов и белка Rad51. Спонтанный и ДНК-независимый гидролиз АТФ учитывали как фоновый. Кинетические параметры реакции, катализируемой ферментом, константы Михаэлиса (Км) и каталитические константы скоростей ферментативного гидролиза каждого из субстратов (kcat). определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа уравнений Михаэлиса-Ментен. Для расчетов использовали компьютерную программу Origin 6.0.

Реакция переноса нити с ДНК-олигонуклеотидным субстратом. Реакционную смесь (40 мкл), содержащую буфер А (33 мМ Tris-acetate, 2 мМ Mg-acetate, 66 мМ K-acetate (pH 7.9), 1 мМ АТР), 18 мкм олигонуклеотида #1, меченного [32Р] (5' - gtt gca tga agt age tga aga ata att agt tet ttc ggg ttg aaa ata ata ata aat aaa gtc ttt ata tat gag tat gta tat cat ega tga att ega gc) и 1 мкМ белка RecAEc или 6 мкМ белка Rad51CcrHis6 инкубировали 10 мин при 37°С. Реакцию переноса нити ДНК инициировали добавлением 36 мкМ днДНК-субстрата. ДнДНК-субстрат приготовлен отжигом олигонуклеотидов #1 и #2 (5' - get cga att cat ega tga tat аса tac tea tat ata aag act tta ttt att att att ttc aac ccg aaa gaa cta att att ctt cag cta ctt cat gca ас). В качестве гетерологического контроля использовали олигонуклеотид #3 (5'- tgc age gta cga age ttc age acc taa ttg аса ccg tac tac ttt aat tag acc cag aga egg aga gag aga ggg aga ggg aga ggg aga ggg aga ggg ag). Реакцию останавливали добавлением 2 мкл буфера S (150 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 200 мМ ЭДТА, 5% SDS; 5% глицерина; 0.05% бромфенола синего; 0.05% ксиленцианола). Продукты реакции разделяли электрофорезом в ПААГ (12%) в буфере TBE. Гели высушивали и анализировали после экспозиции на рентгеновской пленке.

Реакция замещения нити с флуоресцентной ДНК. Реакцию замещения нити ДНК, катализируемую белком Rad51, проводили следующим образом. ДнДНК длиной 28 нп (флуорогенный зонд) была с двойной меткой. 5'-конец одной из ее нитей был помечен флуоресцеином #20 (5'-FAM - ааа cta ata aga ttt аса аса att tet с - 3'- PO4); а З'-конец комплементарной нити содержал дапсил #21 (З'-DABCYL - ttt gat tat tet ааа tgt tgt taa aga g - 5'). Гибридизационная проба днДНК была образована отжигом олигонуклеотидов #20 и #21. ОнДНК-мишень #22 содержала последовательность 5'- ааа cta ata aga ttt аса аса att tet caa act aat aag att tac aac aat ttc tea aac taa taa gat tta caa caa ttt ctc. В качестве гетерологичного контроля использовали негомологичный олигонуклеотид 84н. Перекрывание между спектром испускания флуоресцеина и спектром поглощения дапсила приводило к гашению флуоресценции. В стандартной реакции (125 мкл) белок RecAEc (3 мкМ) или Rad51pa (3 мкМ) и онДНК (10 мкМ) инкубировали в буфере Y (20 мМ Tris-HCl (рН 7.5); 2 мМ MgCl2; 20 мМ NaCl; 1 мМ АТР) и с АТФ-регенерирующей системой (3 мМ фосфоенолпируват и 30 U/мл пируват киназы) в течение 3 минут при 37°С. Затем добавляли MgCh (до конечной концентрации 12 мМ) и днДНК пробу (3 мкМ). Изменение флуоресценции реакционной смеси анализировали с помощью спектрофлюориметра Hitachi F-4000 (Hitachi, Япония) с длиной волны поглощения и испускания: 490 и 520 нм соответственно. Спектр испускания записывался автоматически в корректирующей моде с вычитанием спектра буфера. Спектр поглощения и испускания регистрировали при оптической ширине 10 и 5 нм соответственно.

Реакция переноса нити ДНК с субстратом на основе фага фХ174. В стандартной реакции, 20 мкМ белка Rad51pa и 60 мкМ (+)фХ174 онДНК инкубировали в буфере TMD (25 мМ Трис-HCl (рН 7.5); 10 мМ MgCl2; 1 мМ DTT; 2 мМ АТР; 4 мМ PEP; 30 U/мл РК) в течение 5 минут при указанной температуре. Добавляли 6 мкМ белка SSB или 3 мкМ RPA и после инкубации в течение 7 минут, добавляли 60 мкМ днДНК фХ174 (линеаризованную обработкой эндонуклеазой рестрикции Pstl). Финальный объем смеси составлял 40 мкл. По истечении 120 минут, реакцию останавливали добавлением 2 мкл буфера STOP (150 мМ Трис-HCl (7.5), 200 мМ EDTA, 5% SDS и 20 мг/мл протеиназы К) и инкубацией реакционной смеси при 37°С в течение 30 минут. Продукты реакции разделяли электрофорезом в агарозном геле (1%) в буфере ТАЕ в течение 12 часов при 1 В/см и анализировали после окрашивания бромистым этидием. Реакцию переноса нити ДНК с белком Rad51sc проводили следующим образом. 20 мкМ белка Rad51sc инкубировали с 60 мкМ онДНК (+)фХ174 в буфере MMD (40 мМ K-Mes (рН 6.5); 2.5 мМ MgCh; 1 мМ DTT; 2мМ АТР; 60 мМ КС1) в течение 5 минут при указанной температуре, добавляли 6 мкМ белка SSB и продолжали инкубацию 7 минут. Далее добавляли 5 мМ

-8-

спермидина (конечная концентрация) и 60 мкМ днДНК фХ174, линеаризованную рестриктазой Pstl и продолжали инкубацию в течение 120 минут. Анализировали реакцию переноса нити ДНК аналогично тому, как это было сделано для белка Rad51pa. Реакцию переноса нити с белком RecAgc проводили аналогичным образом.

Визуализация белка RadSlp, методом иммуиоблотинга. Иммунизацию курицы проводили препаратом белка Rad51p». Доза антигена составляла 550 мкг на курс иммунизации. Вторичное введение антигена проводили на 15-й день. Очистку и выделение поликлональных антител из куринных яиц проводили с помощью хроматографии на колонке DEAE. Элетрофорез белков проводили в 10% ПААГ. Электроперенос осуществляли на нитроцеллюлозные мембраны (Schleicher and Schulc) с помощью аппарата 2051 MIDGET MULTIBLOT (LKB). Первичные антитела визуализировали с помощью вторичных, сцепленных с пероксидазой хрена. Затем их окрашивали диаминобензидином и фотографировали. Негативы сканировали на лазерном денситометре, и определяли количество белков в пробе.

Функциональная компенсация дефекта гена RAD51 в S. cerevisiae. О способности компенсировать дефект гена RAD51 в дрожжах S. cerevisiae судили, сравнивая чувствительность клеток трансформантов, несущих ген RAD51, к действию у-облучения. Ген RAD51 субклонировали в дрожжевой вектор pYES2 под промотор GAL1. Плазмидами pYES2-PaRad51 и pYES2 (с геном RAD51 и без него) трансформировали диплоидный штамм S. cerevisiae, несущий мутацию в гене RAD51. Перед облучением клетки выращивали до стационарной фазы роста на селективной среде с неферментируемым источником углерода (2% рафиноза или 3% лактоза). После у-облучения разными дозами, клеточные суспензии высевали на среду YEP-лактат. В качестве индуктора промотора CAL1 использовали галактозу (0.2%). Клетки инкубировали при 30°С в течение 3-4 дней перед подсчетом числа колоний. Определение радиочувствительности культур клеток к у-облучению 60Со проводили на установке "Исследователь" с мощностью дозы 33.7 Грей/мин.

Статистическая обработка результатов. Анализ проводили методом наименьших квадратов с использованием коэффициента Стьюдента для заданной достоверности а=0.9.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование рекомбинационных и термодинамических характеристик белков Ка(151 из дрожжей Р. angusta и Ж, cerevisiae

1.1 Клонирование и первичная структура гена НА051 Р. апщш(а

Для клонирования гена были выбраны консервативные области, содержащие мотивы Волкера А и В. С помощью ПЦР с вырожденными праймерами, фрагмент гена ЯА051 был амплифицирован. В качестве матрицы ПЦР использовали геномную ДНК термотолерантных дрожжей Р. ап^Ш. Этот фрагмент клонировали в плазмиду р1)С19 по сайтам рестрикции ЕсоШ и секвенировали.

Для клонирования полноразмерного гена 11А051 была создана библиотека кДНК этих дрожжей. Скрининг библиотеки провели зондом, который получили из фрагмента гена ЯЛ051 (552 нп), кодирующего М-конец белка. В результате выявили клон, содержащий открытую рамку считывания длиной 1107 нп, что соответствовало белку в 369 аа. Аминокислотная последовательность белка 11а<151ра оказалась гомологичной белку ЯесА (26% идентичных аминокислот) и дрожжевому белку Иж^Ьс (71% идентичных аминокислот). Нуклеотидную последовательность гена ЯА051 термотолерантных дрожжей Р. депонировали в базу данных ООВ1/ЕМВ1УОепВапк с кодом доступа

АУ307358.

1.2 Гидролиз АТФ, катализируемый белком Кас151р,

Существует прямое соответствие между гидролизом АТФ и связыванием белка ЯесА с ДНК. Поэтому скорость гидролиза АТФ позволяет проводить прямой мониторинг образования нуклеопротеинового филамента ЯесА на ДНК. Ферментативные активности белков 11а(151 анализировали по способности катализировать ДНК-зависимый гидролиз АТФ.

В присутствии поли(с1Т) белки Ла<151ра и НасШвс проявляли линейную скорость гидролиза АТФ. Гидролиз АТФ абсолютно зависел от наличия в реакционной смеси ионов М£+2 и ДНК. При температуре 37°С белок 11ас151ра катализировал гидролиз АТФ с постоянной скоростью в течение 2 часов. При увеличении температуры до 47°С линейная скорость гидролиза АТФ сохранялась без изменений в течение 20 минут, после чего скорость гидролиза снижалась до нуля вследствие инактивации белка. В наших экспериментах был определен гидролиз АТФ при 37°С с ко, (число оборотов) -1.2 мин'1 для белка ЯасШра. Скорость гидролиза АТФ белком 11ас151ра оказалась сниженной в ~25 раз по сравнению с белком ЯесАвс. Подобная низкая АТФазная активность характерна для большинства эукариотических гомологов ЯесА (Таблица 1). Интересно, что при

использовании онДНК (<рХ174) в условиях избытка белка относительно онДНК (6 нуклеотидов на мономер белка) наблюдалось изменение в энергии активации при температуре выше или ниже 40°С (18 и 13 ккалхмоль"1 соответственно). Таблица 1. Кинетические параметры гидролиза АТФ

ДНК-субстрат Т(°С) поли(с1Т) онДНК фХ174 без ДНК

11ас151Ссг-№зб 37 0.16±0.05 0.10±0.03 0.04±0.02

Лас!51Ссг 34 0.10+0.03 0.10±0.02 0.03±0.02

Rad51Cнs [8] 37 0.02 0.019 0.006

Каё51Ра 37 1.2±0.5 1.0±0.1 0.08±0.03

ааа5Ьс [9] 37 0.5 0.4-0.44 0.044

Предполагается, что это связано с изменением константы Михаэлиса при росте температуры для этого ДНК-субстрата. Подобная бимодальность АТФазной активности была обнаружена у гомологичных белков Яас1А из РугоЬасиЫт 1$\апсИсит [10] и Яас1А из Оези1/игососси$ атуЫуИст [11,12].

13 Сравнение термостабильности белков На(151р| и 11а<151$с Термостабильность белков 11ас151 ра и Яас1518с сравнивали по их остаточной каталитической активности. Белки Яас151 ра и ЯаеШэс (1 мг/мл) прогревали в отсутствие кофакторов в течение 10 минут и измеряли остаточную скорость поли(с1Т)-зависимого гидролиза АТФ до и после прогрева. Добавление онДНК и АТФ увеличивало время полуинактивации белка 11ас151ра с 12 до 50 мин при температуре 47°С.

Можно предположить, что большая энергия инактивации Иас151ра является следствием большей термостабильности его активного центра по сравнению с белком 1Ш515с (Таблица 2).

Таблица 2. Сравнение термодинамических параметров инактивации ДНК-зависимой гидролитической активности белков И.ас151ра и 11ас1515с

Термодинамический параметр Яаа51ра ЯаабЬс

Е; (ккалхмоль"1) 71.0±2.0 62.0±1.0

АН (ккалхмоль"1) 70.4±2.0 61.0±2.0

ДБ (ккалхмоль'1 хК"1) ; 0.15±0.03 0.13±0.02

Дв (ккалхмоль*1) 25 0±2.0 21.012.0

Примечание: Ег энергия инактивации, ДН-изменение энтальпии, ДБ-изменение энтропии, ДО — изменение свободной энергии.

Если при образовании активированного комплекса число вращательных и колебательных степеней свободы увеличивается, то Д8>0. Известно, что, если в реакции происходит разрыв химических связей, то ДН>0. Так как продукты диссоциации обладают большей степенью неупорядоченности, чем исходные вещества, то АБ>0. Из (Таблица 2) видно, что изменение энтропии у белка Яаё51 эс несколько больше, чем у белка 11ас151 ра.

1.4 Термозависимость нуклеации

Связывание белка Яас151ра с ДНК в присутствии АТФ, регистрируемое по скорости его гидролиза, проходит две фазы: задержку нуклеации (лаг-период) и полную нуклеацию. Последняя выражается в постоянной скорости гидролиза АТФ. Протяженность лаг-фазы для онДНК была обратно пропорциональна температуре проведения реакции. Выше температуры 42°С происходил резкий переход от относительно замедленной лаг-фазы (6-8 мин) к быстрой нуклеации с лаг-фазой 1-2 мин, что означало более быстрое образование филамента при повышении температуры.

1.5 Рекомбинационный перенос онДНК, активируемый [Кас151р(::АТФ::онДНК]

Реакция переноса максимально эффективна при стехиометрии связывания белка

11ас151ра в соотношении 1 мономер на 2 нуклеотида. Эту реакцию анализировали электрофоретически путем выявления промежуточного и конечного продуктов реакции. Это позволяло прослеживать переход нити ДНК, катализируемый белком 11а<151ра, с двунитевой линеаризированной молекулы фага фХ174 на однонитевую замкнутую в кольцо молекулу ДНК того же фага. Реакция хорошо изучена и проходила в несколько этапов, важнейшими из которых являлось накопление промежуточного продукта -сцепленных молекул ДНК (1М) между ее кольцевой и линейной формой, и переход этого промежуточного продукта в конечный продукт (РР), каким является кольцевая днДНК фага с разрывом в переданной нити. Результаты рекомбинационной реакции обмена нити представлены в виде графика, показывающего соотношение промежуточных и конечных продуктов реакции. Как видно (Рис. 1), накопление промежуточных продуктов достаточно эффективно при 37°С и выше, тогда как завершение реакции (переход промежуточных продуктов в конечные), происходило эффективно лишь при температурах выше 40-42"С. Наблюдаемая рекомбинационная реакция была возможна вплоть до 53°С.

о

онДНК днДНК

конечный замещаемая продукт (FP) онДНК

Температура,°С 37 42 47 51 53 56 g PaRad51 - + - + - + - + - + - +

JM II

FP —

днДНК—

- ScRad51

+ ScRad51

32 37 42 47 53 32 37 42 47 51

FP. днДНК"

С »

H "8

30 35 40 45 50

Температура (°C)

30 35 40 45 50

TeMn«p«Typ»("C)

Рис. 1. Реакция переноса нити in vitro, катализируемая белками RadSlp, (PaRad51) или Rad51sc (ScRad51) зависит от температурных условий. (А) Схема реакции обмена нити ДНК между ФС174 онДНК (плюс нить) и репликативной формой линейной днДНК того же фага. (В) Тестирование реакции обмена нити ДНК в агарозном гель-электрофорезе. JM (joint molecules) - связанная молекула ДНК, промежуточный продукт реакции переноса нити; FP (final products) - финальные продукты переноса нити ДНК. (С) Графическое представление относительных количества JM и FP, определенных из теста (В) (см. Материалы и методы). Обозначения: белый треугольник, JM; черный треугольник, FP. Слева, Rad51 р.; справа, Rad51 sc- 13-

1.6 Функциональная компенсация дефекта гена КА051 дрожжей 5. сегеутае О способности гена компенсировать дефект гена 11А051 в 5. cerevisiae судили, сравнивая чувствительность клеток трансформантов, несущих ген к действию у-

облучения. Из дозовой зависимости выживаемости дрожжевых штаммов в нашем эксперименте (Рис. 2) было выявлено значение (Ь037=3 50 Грей) для диплоидного штамма & сегеушае (дикий тип).

Доза гамма - облучения, (Грей)

Рнс. 2. Чувствительность клеток дрожжей S. cerevisiae к действию у-излучения в жидкой среде. Обозначения: Диплоидный штамм (rad51/rad51), трансформированный плазмидой pYES2::RAD51Р„ несущей ген RAD51 из Р. angusta под контролем регулируемого промотора GAL1: на среде без индуктора (-*-); на среде с индуктором (-»-). Диплоидный штамм (rad51/rad51), трансформированный плазмидой pYES2:" на среде без индуктора (-о4); на среде с индуктором (—о—). Диплоидный штамм дикого типа (Wt 2n RAD+) (-*—).. Стандартное отклонение (±) определялось из трех экспериментов.

Штаммы с делецией гена RAD51 оказались более чувствительны к у-облучению, чем дикий тип дрожжей S. cerevisiae (ФИД=0.135), а штамм, в котором экспрессировали белок Rad51pa обладал повышенной выживаемостью (ФИД=0.176). Как видно, ген RAD51 дрожжей из Р. angusta функционировал в гетерологичных клетках S. cerevisiae, что проявлялось в частичной репарации у-повреждений клеток, дефектных по гену ScRAD51 и трансформированных плазмидой pYES2-PaRad51, продуцирующей синтез белка RadSlp». Эти данные показывают, что хотя белки Rad51sc и Rad51 ра гомологичны друг другу, in vivo белок RadSlp. способен частично компенсировать функцию дрожжевого RadSlsc-

-14.

Эффект частичной компенсации выявил сложность ДНК репарационного механизма в дрожжах, где существенную роль играют взаимодействия Иас151 с другими белками рекомбинационного комплекса.

2. Изучение рекомбинационных свойств и кинетических параметров белка Кас151С из микроводоросли СЫату(1отопа$ геткагйШ

2.1 Гидролиз АТФ, катализируемый белками Ка<151Ссг и 1*ас151Ссг-Н18б

Пресинаптический комплекс - это тройной комплекс [Иас151::АТФ::онДНК], который в присутствии ионов М§+2 обладает АТФазной и ДНК-трансферазной активностями. ОнДНК-зависимый гидролиз АТФ позволяет прослеживать условия образования, стабильность и распад комплекса. Нами исследован ряд биохимических характеристик пресинаптического комплекса, образованного белком Кас151 СсгШвв. Таблица 3. Термодинамические параметры гидролиза АТФ, катализируемого белками 11а<151Ссг и Яа<151Ссг-№86

Термодинамический параметр 1Ш51Ссг 11ас151Ссг-Ш5б

ЕА(ккалхмоль"') ДЩккалхмоль"1) ДБ (ккалхмол ь" 'хК"1) Др(ккалхмоль"1) 11.2±1.0 10.6±1.0 -0.020±0.007 17.2±0.9 10.5±1.0 9.9±0.9 -0.030±0.008 17.0±1.0

Примечание: ЕА — энергия активации, ДН — изменения энтальпии, ДБ — изменения энтропии, ДО -изменения свободной энергии.

Производили сравнение термодинамических параметров гидролиза АТФ этих белков. С такой целью сняли зависимость скорости гидролиза АТФ от температуры, варьируя последнюю от 25 до 50°С. В интервале температур от 25 до 37°С АТФаза обоих белков подчинялась уравнению Аррениуса, что позволило рассчитать искомые термодинамические параметры (Таблица 3).

Сравнение представленных параметров показало, что наличие полигистидинового тракта не только не ухудшило термодинамических характеристик природного белка, но и позволило выделить белок в более активном состоянии. Последнее, возможно, объяснялось более простой схемой его экспрессии и выделения, не предусматривающей процедуру денатурации/ренатурации белка. Дальнейшие исследования мы проводили с белком КасШСсгШэб.

2.2 Реакции замещения и переноса нитей ДНК in vitro

Для исследования Ree А- или Rad51 Ссг зависимого обмена нити ДНК между 24 нп дуплексной ДНК и гомологичной 50 н был использован метод флуоресцентного гашения. В нашем тесте 5'-конец днДНК был помечен флуоресцеином, а комплементарный 3*-конец -дапсилом. Перекрывание между флуоресцентным спектром испускания флуоресцеина со спектром поглощения дапсила приводило к гашению флуоресценции в дуплексе.

Обмен нити ДНК приводил к усилению флуоресцентного сигнала при отделении донора от акцептора (Рис. 3).

А) В)

- ^

+ t _•

It

Time (min)

Рис. 3. Кинетика реакции замещения нити ДНК с использованием флуоресцентномеченных субстратов (см. Материалы и методы). А) Реакция замещения нити ДНК для белков RecA и Rad5 lCcr-His6 в присутствии АТР; В) схема реакции замещения нити ДНК.

Расхождение в эффективности переноса нити, катализируемой белком RecA, связано с тем, что реакцию проводили при низкой концентрации белка RecA и в отсутствие АТФ-регенерирующей системы. Известно, что при эквимолярном соотношении нуклеопротеинового филамента RecA к дуплексу, образуется -50% конечного продукта реакции переноса нити ДНК. Однако эффективность реакции переноса нити увеличивается, если соотношение дуплекс/онДНК превысит 1. Скорость реакции переноса нити ДНК белком Rad51Ccr-His6 того же порядка, как в реакции с белком RecA^. Низкая эффективность реакции переноса нити ДНК с использованием флуоресцентномеченных субстратов связана с избытком субстрата онДНК относительно белка в нашей реакции (дуплекс/онДНК <1). Реакция переноса нити ДНК с радиоактивномеченным

олигонуклеотидом. Результаты переноса нити (Рис. 4) регистрировали с помощью меченного 32Р олигонуклеотида. Как видно, перенос онДНК белком ЯасШСсгНюб к 90 минуте по эффективности составлял лишь 30% от таковой у ЯесА, что было в согласии с результатами с флуоресцентной меткой. В последнем случае максимум переноса однонитевого олигомера длиной в 170 нуклеотидных остатков белком ЛесА достигал к 120 мин и составлял 75% от исходной днДНК, тогда как белок 11ас151 Со-Ивв переносил лишь 20% онДНК из флуоресцентномеченной днДНК.

А)

= + 4--> *=-+ -

в> ЯесА ЯасШС-Шз,

__6 время

О 90 0 90 0 20 40 90 0 90 (мян)

к 1 2 3456789 Ю

Рис. 4. Радиоавтограф электрофореграммы реакции переноса нитей ДНК. А) Схема тестирования ДНК-трансферазной активности с использованием радиоактивномеченного ДНК-субстрата. В) Кинетика реакции переноса нити ДНК с радиоактивномеченным субстратом. Дорожки 1, 2 -реакция с белком ЯесА втечение 0 и 90 минут, соответственно. Дорожки 3, 4 - контрольная реакция с белком ЯасШСа-Шзб, когда в реакции отсутствует гомологичная днДНК втечение 0, 90 минут, соответственно. Дорожки 5, 6, 7, 8 - реакция с белком Каё51СсгН1$б и гомологичными ДНК-субстратами втечение 0, 20, 40, и 90 минут, соответственно. Дорожки 9, 10 - контрольная реакция с белком Яас151Ссг-Н13б, когда в реакции присутствует гетерологичная, втечение 0, 90 минут, соответственно.

выводы

1. Белок Rad51 из P. angusta обладает термозависимыми характеристиками ДНК-зависимого гидролиза АТФ. При температуре, оптимальной для роста термофильных дрожжей P. angusta (~40°С), изменяются три рекомбинационные характеристики его пресинаптического комплекса [Rad51pa:: АТФ::онДНК]:

• уменьшается время образования комплекса;

• уменьшается энергия активации АТФазной активности комплекса;

• появляется способность комплекса катализировать обмен протяженных молекул

ДНК.

2. Ген RAD51 из дрожжей P. angusta способен частично компенсировать дефект гена ScRAD51 в клетках S. cerevisiae.

3. Белок RadSIC из водорослей С. reinhardtii является гомологической ДНК-трансферазой и обладает основными рекомбинационными характеристиками подсемейства Rad51С семейства белков Rad51, включая:

• ДНК-зависимую АТФазную активность;

• АТФ-зависимую ДНК-трансферазную активность пресинаптическего комплекса

[Rad51Ccr" АТФ::онДНК].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шалгуев В.И., Киль Ю.В., Юрченко Л. В. и Ланцов В. А. Термозависимость главного белка гомологической рекомбинации Rad51 у дрожжей Hansenula polymorpha. ДАН. 2002. Т.З 87. Стр. 328-330.

2. Shalguev V.I., Kil Y.V., Yurchenko L.V., Namsaraev E.A., Lanzov V.A. Rad51 Protein from , the Thermotolerant Yeast Pichia angusta as a Typical but Thermodependent Member of the Rad51 Family. Eukaryot Cell. 2004. V. 3(6). P. 1567-1573.

3. Шалгуев В.И., Кабоев O.K., Сизова И.А., Hegemann P., Ланцов B.A.. Идентификация белка Rad51C из Chlamydomonas reinhardtii: рекомбинационные характеристики. Молекулярная биология. 2005. Т.39. №1. Стр. 112-119.

4. Шалгуев В.И., Киль Ю.В., Ланцов В. А. Гомологическая трансфераза RAD51 из термотолерантных дрожжей Pichia angusta// Тезисы докладов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", -Пущино. - 2004. - Стр.72.

5. Irina Sizova, Valery Shalguev, Oleg Kaboev, Peter Hegemann, Vladislav Lanzov. Identification of Chlamydomonas reinhardtii homologous recombination system: biochemical activities of Rad51С protein // Abstracts of 11 th International Conference on the Cell and

Molecular Biology of Chlamydomonas "Chlamy2004" Kobe, Japan, May 11-15,2004.

6. В. И. Шалгуев, О. К. Кабоев, И. А. Сизова, В. А. Ланцов. Идентификация белка Rad51C из Chlamydomonas reinhardtiv. рекомбинационные характеристики // Тезисы докладов 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", - Пущино. - 2005. - Стр. 104.

7. В. И. Шалгуев, О. К. Кабоев, И. А. Сизова, П.Хегеманн, В. А. Ланцов. Идентификация белка Rad51C из Chlamydomonas reinhardtiv. рекомбинационные характеристики // Тезисы Материалов семинаров Политехнического Симпозиума "Молодые ученые — промышленности Северо-Западного региона", — Санкт-Петербург. - 2005. - Стр. 48-49.

8. V.I. Shalguev, О.К. Kaboev, I.A. Sizova, P. Hegemann and V.A. Lanzov. Paralogs of Rad51 protein family from Chlamydomonas reinhardtiv. recombinational characteristics. Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution. The Second International Conference dedicated to the 105th anniversary of the birth of N. W. Timofeeff-Ressovsky and the 70th anniversary of the paper "On the Nature of Gene Mutations and Gene Structure" by N.W.Timofeeff-Ressovsky, K.G.Zimmer and M.Delbruck. Yerevan, September 8-11,2005; p.90.

9. Шалгуев В.И., Кабоев O.K., Сизова И.А., Хегеманн П., Ланцов В.А. Три паралога семейства рекомбинационных белков Rad51 у микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii II Тезисы докладов 10-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", - Пущино. - 2005. - Стр. 100.

10. Irina Sizova, Valery Shalguev, Oleg Kaboev, Peter Hegemann and Vladislav Lanzov Identification and biochemical activities of Chlamydomonas homologous recombination proteins Rad51, Rad51B and Rad51C // Abstracts of 12th International Conference on the Cell and Molecular.Biology of Chlamydomonas. "Chlamy 2006". Portland, Oregon, USA. May 9-14, 2006. P.78.

11. Kaboev O, Luchkina L, Shalguev V, Andreichuk Y, Kulikov V, Kozarenko A, Lanzov V: Improved RecA-assisted fluorescence assay for DNA strand exchange reaction. Biotechniques 2006,40(6):736-738.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bianco PR, Tracy RB, Kowalczykowski SC: DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. Frontiers in Bioscience (online journal) 1998,3:560-603.

2. Roca AI, Cox MM: RecA protein: structure, function, and role in recombinational DNA repair. Progress in Nucleic Acid Research & Molecular Biology 1997, 56(129): 129-223.

3. Yoshioka K, Yumoto-Yoshioka Y, Fleury F, Takahashi M: pH- and salt-dependent self-assembly of human Rad51 protein analyzed as fluorescence resonance energy transfer between labeled proteins. J Riochem (Tokyo) 2003, 133(5):593-597.

4. Shinohara A, Ogawa H, Matsuda Y, Ushio N, Ikeo K, Ogawa T: Cloning of human, mouse and fission yeast recombination genes homologous to RAD51 and recA. Nat Genet 1993, 4(3):239-243.

5. Brendel V, Brocchieri L, Sandler SJ, Clark AJ, Karlin S: Evolutionary comparisons of RecA-like proteins across all major kingdoms of living organisms. Journal of Molecular Evolution 1997,44(5):528-541.

6. Shalguev VI, Kil YV, Yurchenko LV, Namsaraev EA, Lanzov VA: Rad51 protein from the thermotolerant yeast Pichia angusta as a typical but thermodependent member of the Rad51 family. Eukaryot Cell 2004,3(6): 1567-1573.

7. Shalguev VI, Kaboev OK, Sizova IA, Hagemann P, Lanzov VA: Identification of Chlamydomonas reinhardtii Rad51C: Recombinational Characteristics. Molecular Biology 2005, 39(1):98-104.

8. Lio YC, Mazin AV, Kowalczykowski SC, Chen DJ: Complex formation by the human Rad51B and Rad51C DNA repair proteins and their activities in vitro. J Biol Chem 2003, 278(4):2469-2478.

9. Sugiyama T, Zaitseva EM, Kowalczykowski SC: A single-stranded DNA-binding protein is needed for efficient presynaptic complex formation by the Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry 1997, 272(12):7940-7945.

10. Spies M, Kil Y, Masui R, Kato R, Kujo C, Ohshima T, Kuramitsu S, Lanzov V: The RadA protein from a hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum islandicum is a DNA-dependent ATPase that exhibits two disparate catalytic modes, with a transition temperature at 75 degrees C. Eur J Biochem 2000,267(4): 1125-1137.

11. Kil YV, Glazunov EA, Lanzov VA: Characteristic thermodependence of the RadA recombinase from the hyperthermophilic archaeon Desulfurococcus amylolyticus. J Bacteriol 2005, 187(7):2555-2557.

12. Glazunov EA, Kil Y, Lantsov VA: Two types of temperature dependence of homologous recombinases in archaea: the properties of the Desulfurococcus amylolyticus recombinase. Dokl Biol Sci 2001,379:389-392.

Автореферат отпечатан в авторской редакции

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 404, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 09.11.2006 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шалгуев, Валерий Иванович

Введение .- 5

Список сокращений.-11

Глава 1. Обзор литературы.-14

1.1. Введение.-141.2. Гомологическая рекомбинация у прокариот.-14

1.2.1. Схема гомологической рекомбинации.-15

1.2.2. Биохимические свойства белка RecA у бактерий.-171.2,3. Пространственная структура белка RecA.- 20

1.3. Гомологическая рекомбинация у эукариот.- 22

1.3.1. Схема гомологической рекомбинации у дрожжей S. cerevisiae.- 23

1.3.2. Три субсемейства белков ГР у дрожжей S. cerevisiae.- 23

1.3.3. Биохимические свойства белка Rad51 So.- 25

1.3.4. Схема гомологической рекомбинации у Н. sapiens.- 28

1.3.5. Консервативность нуклеопротеиновых филаментов RecAEc, Rad51Hs и Rad51Sc.- 32

1.4. Дрожжи P. angusta как объект исследований.- 33

1.5. Водоросли С. reinhardtii как объект исследований.- 34

1.6. Задачи данного исследования.- 34

Глава 2. Материалы и методы.- 36

2.1. Бактериальные и дрожжевые штаммы.- 36

2.2. Приборы и оборудование.-362.3. Ферменты и реактивы.- 36

2.3.1. Ферменты.-362.3.2. Среды.-372.4. Плазмиды.- 37

2.4.1. Выделение плазмидной ДНК.- 37

2.4.2. Клонирование и секвенирование генаRAD51 из P. angusta.- 38

2.4.3. Конструирование и секвенирование плазмид.- 38

2.5. Олигонуклеотиды.- 40

2.6. Выделение, визуализация и определение концентрации белков.- 42

2.6.1. Выделение белка Rad51Ра из P. angusta.- 42

2.6.2. Выделение белка Rad51ССг из С. reinhardtii.- 44

2.6.3. Выделение белка Rad5 lCCr-His6 из С. reinhardtii.- 46

2.6.4. Выделение белков RPA и Rad51Sc из S. cerevisiae.- 46

2.6.5. Выделение белка RecAEc из Е. coli.- 46

2.6.6. Визуализация белков методом иммуноблотинга.- 46

2.6.7. Определение концентрации белков.- 46

2.7. Тестирование нуклеазной активности в препаратах белков.

2.7.1. ОнДНК-экзонуклеазный тест.

2.7.2. ДнДНК-экзонукпеазный тест.

2.7.3. ДнДНК-эндонуклеазный тест.

2.7.4. Геликазный тест.

2.8. Анализ кинетических параметров реакции гидролиза АТФ, катализируемого белками Rad51 и RecA.

2.8.1. Гидролиз АТФ.

2.8.2. Кинетические параметры гидролиза АТФ.

2.8.3. Термодинамические параметры активации гидролиза АТФ.

2.8.4. Термодинамические параметры инактивации гидролиза АТФ.

2.9. Тестирование связывания белка Rad51 CCr-His6 с онДНК (молекулярным биконом).

2.10. Рекомбинационный перенос нитей ДНК in vitro.

2.10.1. Реакция переноса нитей с радиоактивномеченной ДНК.

2.10.2. Реакция переноса нитей с субстратом на основе фага фХ174.

2.10.3. Реакция замещения нити с флуоресцентномеченной ДНК.

2.10.4. Анализ кинетических параметров реакции замещения нити ДНК.

2.11. Тестирование функциональной компенсации дефекта гена RAD51 в S. cerevisiae.

2.12. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Исследование рекомбинационных и термодинамических характеристик белков Rad51 из дрожжей Р. augusta и S. cerevisiae.

3.1. Клонирование и первичная структура гена RAD51 из P. angusta.

3.2. Экспрессия и выделение белка Rad51ра из Р. angusta.

3.3. Гидролиз АТФ, катализируемый белком Rad51Ра.

3.3.1. ДНК-зависимая скорость гидролиза АТФ.

3.3.2. Влияние различных субстратов ДНК на АТФазную активность.

3.3.3. Стехиометрия связывания белка Rad51Pa с онДНК.

3.3.4. Стимуляция онДНК-зависимой АТФазной активности белка Rad51 Ра белками

SSB и RPA.

3.3.5. Сравнение термостабильности белков Rad51Pa и Rad51sc.

3.3.6. Термозависимость нуклеации.

3.3.7. Кинетические параметры гидролиза АТФ.

3.3.8. Кооперативность гидролиза АТФ.

3.3.9. Зависимость гидролиза АТФ от рН.

3.4. Рекомбинационный перенос онДНК, активируемый [Rad51Pa::ATP::oHflHK].

3.4.1. Реакция замещения нити ДНК.

3.4.2. Реакция переноса нитей ДНК.

3.5. Анализ функциональной компенсации дефекта гена RAD51 в дрожжах S. cerevisiae.

Глава 4. Изучение рекомбинационных свойств и кинетических параметров белка Rad51C из микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii.

4.1. Выделение белков Rad51CCr и Rad51Ccr-His6 из С. reinhardtii.

4.2. Гидролиз АТФ, катализируемый белками Rad51 ССг и Rad51 CCr-His6.

4.2.1. Температурная зависимость скорости гидролиза АТФ.

4.2.2. Влияние различных субстратов ДНК на АТФазную активность.

4.2.3. Зависимость скорости гидролиза АТФ от рН.

4.2.4. Стехиометрия взаимодействия белка Rad5 lCCr-His6 и поли^Т) в пресинаптическом комплексе.

4.2.5. Стабильность пресинаптического комплекса.

4.3. Анализ кинетики связывания белка Rad5 lCcr-His6 с онДНК (молекулярным биконом).

4.4. Рекомбинационный перенос онДНК in vitro, катализируемый [Rad51 Ccr

His6:: ATP: :онДНК].

4.4.1. Реакция замещения нити ДНК.

4.4.2. Реакция переноса нитей ДНК.

Глава 5. Обсуждение.

5.1. Термальная адаптационная гипотеза.

5.2. Анализ термостабильности белков.

5.3. Связь скорости гидролиза, катализируемого RecA-подобным белком, со сложностью генома и длиной клеточного цикла.

5.4. Биохимические и рекомбинационные характеристики белкаRad51Pa из P. angusta.

5.5. Биохимические и рекомбинационные характеристики белка Rad51С из С. reinhardtii-

Глава 6. Выводы.

Список публикаций по теме диссертации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гомологическая рекомбинация у эукариот"

Актуальность проблемы.

Рекомбинация ДНК - один из фундаментальных процессов, происходящих в живой клетке. К настоящему времени наиболее детально исследована гомологическая рекомбинация (ГР) у прокариот. Основой процесса ГР у прокариот является способность белка RecA катализировать клеточную реакцию синапсиса и обмена нитей ДНК. Белок RecA играет центральную роль в гомологической рекомбинации. Этот белок участвует в процессах: рекомбинационной репарации, репликации, мутагенеза, клеточного деления, регуляции экспрессии многих репарационных генов и индукции SOS-ответа клетки у бактерий [1-3].

Структурные и функциональные аналоги белка RecA обнаружены во всех организмах: от бактерий до эукариот, включая человека [4, 5]. Хотя многие принципиальные стадии ГР являются общими у прокариот и эукариот, механизм ГР у высших организмов отличается наибольшей сложностью. Поэтому поиск аналогов белка RecA и исследование механизма ГР у эукариот являются актуальными задачами современной молекулярной биологии.

Дрожжи Pichia augusta - один из видов таксономического комплекса метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha - интересный объект, привлекающий внимание в качестве продуцентов для получения рекомбинантных белков. Дрожжи Н. polymorpha способны расти до высокой плотности на доступных средах и субстратах. Эти одноклеточные микроорганизмы часто содержат в геноме мощные промоторные элементы, и имеют системы гомологической и негомологической рекомбинации, которые позволяют проводить множественную тандемную интеграцию (линейных) плазмид в дрожжевую хромосому. Уникальность дрожжей Р. angusta состоит в их термотолерантиости, то есть в способности расти при высоких температурах вплоть до 50°С. Сравнение генома Р. angusta с дрожжевым геномом Saccharomyces cerevisiae выявило, что среди 2500 идентифицированных генов Р. angusta 94 % обладают гомологией с S. cerevisiae, тогда как 6% не обладают такой гомологией. До настоящего времени в литературе не было сообщений об обнаружении в геноме Р. angusta генов, имеющих отношение к гомологической рекомбинации и рекомбинационной репарации. Не найдены также и гены, гомологичные гену RAD51 из S. cerevisiae, который является ключевым геном ГР необходимым для сохранения генома. Последний кодирует RecA/RadA/Rad51-подобный белок, найденный во всех трех доменах живого: Bacteria, Archaea и Eukarya. Белок Rad51 образует нуклеопротеиновые филаменты (НФ) на онДНК и днДНК в присутствии АТФ и ионов Mg2+. Этот белок катализирует реакции гомологического спаривания и обмена нитей ДНК - две основные стадии ГР и рекомбинационной репарации.

Семейство рекомбиназ RecA/RadA/Rad51 составляют белки, образующие нуклеопротеиновые филаменты со сходной структурой, стехиометрией и ДНК-специфичностью. Эти белки отличаются количественными характеристиками АТФ-зависимых и рекомбинационных функций. Что позволяет подразделить их на два субсемейства: RecA и Rad51/RadA. Белки субсемейства Rad51/RadA обладают низкой каталитической эффективностью в гидролизе АТФ и не имеют ярко выраженной АТФ-индуцируемой кооперативное™, показанной для RecA.

К настоящему времени наиболее подробно исследованы системы ГР у Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae и Homo sapiens. Эти системы ГР имеют в своем составе различные белковые комплексы, и различным образом модулируют каталитическую активность ДНК-трансферазы Rad51 в проведении рекомбинационной реакции.

В Е. coli два белковых комплекса RecFO и RecRO обладают способностью к связыванию с потенциально рекомбиногенными сайтами ДНК и модулируют рекомбинационную реакцию с участием филамента RecA. В этой же реакции участвует и белок SSB, который расплавляет вторичные структуры в ДНК, что способствует полному образованию нуклеопротеинового филамента RecA [6].

У дрожжей S. cerevisiae кроме белкового комплекса RPA, играющего ту же роль, что и бактериальный белок SSB, ещё четыре белка усиливают рекомбинационную реакцию, которая катализируется белком Rad51. Два из них (белки Rad52 и Rad54) образуют динамический комплекс с Rad51, а два других (белки Rad55 и Rad57) образуют гетеродимер, стимулирующий ДНК-трансферазную активность Rad51. Термином "трансферазная активность" в дальнейшем будем называть способность белка катализировать реакцию образования синапса или переноса нитей ДНК [7]. Особенность данной системы ГР заключается в том, что белок Rad51 имеет относительно слабую АТФазную и ДНК-трансферазную активность. Белки Rad55 и Rad57 являются паралогами Rad51, т.е. имеющими, хотя и ограниченную, но достаточно выраженную гомологию с последним. В целом же система ГР у дрожжей-сахаромицетов достаточно мощная.

В настоящей работе клонирован ген RAD51 из термотолерантного штамма P. angusta, и исследованы основные рекомбинационные характеристики белка Rad51Pa, кодируемого этим геном. Белок Rad51Pa является ДНК-зависимой АТФазой и проявляет типичные свойства семейства белков Rad51. В контексте белковой термостабильности биохимические и рекомбинационные свойства белка Rad51Pa сравнивали с Rad51Sc [8].

В результате реализации международной программы "Геном человека", начатой в 1988 году в настоящее время имеется обобщенный вариант генома Н. sapiens. У человека (как и у других высших эукариот, включая растения) уровень ГР на три порядка величины ниже негомологичной рекомбинации [9]. Это явление объясняется наличием разнообразных нуклеотидных повторов, занимающих большую часть генома. У Н. sapiens ГР регулируется сложными комплексами. Нуклеопротеиновый филамент, образованный белком Rad51 человека, подобно его эукариотическим ортологам, имеет слабые АТФазные и ДНК-трансферазные активности [10]. Эти активности стимулируются белковыми комплексами Rad51C-XRCC3 [11, 12] и Rad51 C-Rad51В-Rad51D-XRCC2 [13]. Все пять белков, составляющих эти белковые комплексы, являются паралогами белка Rad51 [7, 14].

Обращает на себя внимание то, что белок Rad51C является участником обоих выявленных к настоящему времени комплексов. И это предполагает его определяющие функции в регуляции процесса ГР у высших. Возникает вопрос, так ли это? Имеющиеся на сегодня данные неоднозначны. С одной стороны, клеточные линии (RAD51C'') цыпленка DT40 проявляют менее сильные фенотипические дефекты в мишенной рекомбинации и в образовании спонтанных хромосомных аберраций, чем клеточные линии с дефектами по другим генам RAD51 [15]. С другой стороны, фенотипическое проявление мутации по гену RAD51C у дрозофилы при воздействии ионизирующего облучения характеризуется нарушением гомологической мейотической рекомбинации и дефектом репарации ДНР ДНК. Это приводит к образованию крупных хромосомных аберраций и доминантных "деталей" в половых и соматических клетках. При этом нормальный аллель RAD51C' показывает мощный материнский эффект, спасающий гомозигот-потомков RAD51Cу матерей, гетерозиготных по данной мутации [16, 17].

Недавние наблюдения [18] выявили резольвазную активность в грубых экстрактах человеческих клеток HeLa. То есть ту активность, которая необходима для завершения ГР через "разрешение" промежуточных рекомбинационных (или Холидеевских) структур. Оказалось, что эта активность требует неповрежденного (интактного) белка Rad51C и его комплексообразующего партнера белка XRCC3. Эти данные позволяют предположить, что Rad51C принимает прямое участие в конечных стадиях ГР в качестве, если не самой резольвазы, то ее активатора.

Одноклеточная зеленая микроводоросль Chlamydomonas reinhardtii - это перспективный объект биотехнологии. С. reinhardtii является модельной системой для исследования таких фундаментальных проблем, как: светопоглощение, фотосинтез, фототаксис, биогенез хлоропластов [19, 20]. У этого одноклеточного организма, обладающего 17 хромосомами, уровень гомологичной рекомбинации на три порядка ниже, чем негомологичной рекомбинации. Это явление характерно, скорее, для высших эукариот включая человека. У высших различные повторяющиеся последовательности ДНК занимают большую часть генома. При этом ГР может дестабилизировать структуру генома, и, следовательно, она должна быть не только ослабленной, но и тонко отрегулированной для своевременного функционирования в соответствующем месте и в нужное время.

Вторым модельным объектом наших биохимических исследований была одноклеточная зеленая микроводоросль С. reinhardtii. К моменту начала наших исследований ее система ГР, лежащая в основе рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК, была весьма слабо изучена. В последние годы реализуется программа секвенирования генома С. reinhardtii. В геноме были выявлены разнообразные нуклеотидные повторы. И было получено объяснение низкого уровня ядерной ГР относительно негомологичной рекомбинации. Анализ геномной и EST библиотек у микроводорослей С. reinhardtii позволил клонировать последовательность кДНК гена

ЯАВ51С. В настоящей работе ген КАВ51С был экспрессирован, выделен и очищен его продукт. Были также изучены основные биохимические и рекомбинационные активности белка Кас151С [21]. Показано, что белок Кас151С из С. гетЬагйШ идентифицируется как типичный представитель субсемейства рекомбинационных 11ас151 С-подобных белков высших.

В нашей работе получено подтверждение консервативности функций белков семейства Кас151 из разных царств эукариот на примере термотолерантных дрожжей Р. ап^иБга и микроводорослей С. гетЬагйШ.

Дели и задачи исследования.

Целями данной работы являлись демонстрация и анализ основ термостабильности дрожжевого белка Яас151 из Р. ащШа и выявление рекомбинационных активностей белка 11ас151С из микроводорослей С. геткагЛи.

Для достижения этих целей были решены следующие задачи:

1. Клонирован ген ВАВ51 из термотолерантных дрожжей Р. а^Ша.

2. Выделен белок Кас151Ра.

3. Исследованы рекомбинационные и термодинамические характеристики белков Кас151ра из Р. ащт1а и 11ас151 Зс из 5. сггеу'тае.

4. Выделен белок Яа<151 С-Шз6 и Кас151С из С. гетЬагйШ.

5. Выявлены рекомбинационные характеристики белка Кас151С-Н1з6.

Научная новизна.

Впервые клонирован ген ЛАИЗ1 из метилотрофных термотолерантных дрожжей РгсЫа способных к выживанию при температуре 50°С. Впервые показано, что белок 11а(151 из Р. angusta обладает термозависимыми характеристиками. При температуре выше оптимальной для роста клетки-хозяина (~40°С) по сравнению с 37°С:

1. уменьшается время образования и энергия активации АТФазной активности комплекса белка 11а(151ра и онДНК;

2. появляется способность комплекса катализировать ключевую реакцию ГР -реакцию обмена протяженных молекул ДНК.

Впервые показано, что белок Кас151С из водорослей С. геткаг&и способен:

1. образовывать нуклеопротеиновый филамент на онДНК;

2. катализировать реакцию замещения нитей ДНК.

Впервые получены доказательства консервативности функций белков семейства Кас151 из разных царств эукариот на примере термотолерантных дрожжей Р. angusta и водорослей С. reinhardtii.

Научно-практическая значимость.

Результаты работы показывают сходство механизма ГР у низших и высших эукариот. Полученные данные могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов гомологической рекомбинации у различных эукариотических организмов. Теоретические результаты работы могут быть использованы в учебных спецкурсах по молекулярной биологии, читаемых на биолого-медицинских факультетах высших учебных заведений.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых Петербургского института ядерной физики (Гатчина, 2000-2005 г.); VIII, IX и X Международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004-2006 г.); Международной конференции "Chlamy 2004" Abstracts of 1 Ith International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas (Kobe, Japan, 2004 г.), Политехническом Симпозиуме "Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона" (Санкт-Петербург, Россия, 2004 г.), Международной конференции "The N.W. Timofeeff-Ressovsky conference" (Ереван, Армения, 2005 г), Международной конференции "Chlamy 2006" Abstracts of 12th International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas (Portland, Oregon, USA, 2006).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Белок Rad51pa обладает биохимическими активностями, необходимыми для образования рекомбинационного пресинаптического комплекса.

2. При температуре 40-42°С, оптимальной для роста клетки-хозяина, по сравнению с контролем при 37°С изменяются три характеристики пресинаптического комплекса [Rad51 Ра: :онДНК:: АТР]:

• уменьшается время образования комплекса;

• уменьшается энергия активации АТФазной активности комплекса;

• появляется способность пресинаптического комплекса катализировать реакцию обмена протяженных молекул ДНК.

3. Белок Rad51CCr из водорослей С. reinhardtii обладает следующими биохимическими активностями: днДНК;

ДНК-зависимая АТФазная активность; способность к образованию нуклеопротеинового филамента в присутствии АТФ на он- и ДНК-трансферазная активность нуклеопротеинового филамента.

Список сокращений.

В® - ГР - гомологическая рекомбинация

NHEJ - non-homologous end joining - негомологичное связывание концов нитей ДНК

DNA - ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

RNA - РНК - рибонуклеиновая кислота онДНК - однонитевая ДНК днДНК - двунитевая ДНК tRNA - тРНК - транспортная РНК

MB - molecular beacon -молекулярный бикон

DSB - ДНР - двунитевые разрывы ДНК

JM - joint molecule - сцепленная молекула ДНК

HJ - СХ - соединение Холидея аа - аминокислота п - н - нуклеотидный остаток bp - нп - нуклеотидная пара

S.pombe - дрожжи Schizosaccharomyces pombe

S. cerevisiae - дрожжи Saccharomyces cerevisiae

P. angusta - дрожжи Pichia angusta

H. polymorpha - дрожжи Hansenulapolymorpha

Название дрожжей H. polymorpha, используется в тексте наряду с названием P. angusta.

C. reinhardtii - водоросли Chlamydomonas reinhardtii

D.melanogaster - дрозофила или плодовая мушка Drosophila melanogaster Н. sapiens - Homo sapiens

E. coli - Escherichia coli

Rad51sc- белок Rad51 из Saccharomyces cerevisiae Rad51Sp- белок Rad51 Schizosaccharomyces pombe Rad51Pa- белок Rad51 из Pichia angusta Rad51CCr- белок Rad51C из Chlamydomonas reinhardtii

Rad51Ccr-His6- белок Rad51C из С. reinhardtii, содержащий полигистидиновый тракт на С-конце последовательности

Rad51Hs- белок Rad51 из Homo sapiens Rad51CHS - белок Rad51C из Homo sapiens RecAEc- белок RecA из E. coli RadAjviv - белок RadA из Methanococcus voltae RecAHpyi - белок RecA из Helicobacter pylori

-11

SSBEc- онДНК-связующий белок из Escherichia coli RPA - репликационный фактор А

БСА - BSA - Bovine Serum Albumin - бычий сывороточный альбумин ATPase - АТФаза

IB - inclusion bodies - водонерастворимые фракции белков или тельца включения

LD - лактат дегидрогеназа

РК - пируват киназа

PEP - фосфоенолпируват

DTT - дитиотрейтол

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота NADH -Nicotinamid-Adenin Dinucleotid-Hydroeen ATP или АТФ - аденозин-5'-0-(трифосфат) ATP-y-S - Аденозин-5'-0-(3-тиотрифосфат).

Трис - трис-(оксиметил)-аминометан(2-амино-2-оксиметилпропан-1,3 -диол) IPTG - ИПТГ - изопропил-р-О-тиогалактозид SDS - ДСН - Na-додецилсульфат

FPLC - fast protein liquid chromatography - система для быстрой белковой хроматографии ПЦР - полимеразная цепная реакция

FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer - флюоресцентный резонансный энергетический перенос

PAAG - ПААГ - полиакриламидный гель

VC - объем колонки

ТСА -ТХУ - трихлоруксусная кислота

STmp - salt titration midpoint - Концентрация соли (мМ) при которой скорость гидролиза АТР снижается в два раза, kcat - ЧИСЛО оборотов

Км - константа Михаэлиса Т - температура t - время

К\ - константа инактивации pi - изоэлектрическая точка U - unit - единица каталитической активности

EST - Expressed Sequence Tags - маркеры экспрессированных последовательностей MW - молекулярная масса

LD37 - Lethality Dose - Летальная доза, при которой количество выживших клеток уменьшается до 37%.

ФИД - фактор изменённой дозы. ГО - ионизирующее облучение X - длина волны (нм)

А2бо - оптическая плотность при X =260 нм. А280 - оптическая плотность при Х=280 нм.

1 ед. А2бо (1 ед. А2во) - количество вещества, которое при растворении в 1 мл растворителя создает в последнем оптическую плотность А2бо=1 (А28о=1)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шалгуев, Валерий Иванович, Санкт-Петербург

1. Bianco PR, Tracy RB, Kowalczykowski SC: DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. Frontiers in Bioscience (online journal) 1998, 3:560-603.

2. Roca AI, Cox MM: RecA protein: structure, function, and role in recombinational DNA repair. Progress in Nucleic Acid Research & Molecular Biology 1997, 56(129): 129-223.

3. Yoshioka K, Yumoto-Yoshioka Y, Fleury F, Takahashi M: pH- and salt-dependent self-assembly of human Rad51 protein analyzed as fluorescence resonance energy transfer between labeled proteins. JBiochem (Tokyo) 2003, 133(5):593-597.

4. Shinohara A, Ogawa H, Matsuda Y, Ushio N, Ikeo K, Ogawa T: Cloning of human, mouse and fission yeast recombination genes homologous to RAD51 and recA. Nat Genet 1993, 4(3):239-243.

5. Brendel V, Brocchieri L, Sandler SJ, Clark AJ, Karlin S: Evolutionary comparisons of RecA-like proteins across all major kingdoms of living organisms. Journal of Molecular Evolution 1997, 44(5):528-541.

6. Webb BL, Cox MM, Inman RB: Recombinational DNA repair the RecF and RecR proteins limit the extension of RecA filaments beyond single-strand DNA gaps. Cell 1997, 91(3):347-356.

7. Symington LS: Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and doublestrand break repair. Microbiol Mol Biol Rev 2002, 66(4):630-670.

8. Shalguev VI, Kil YV, Yurchenko LV, Namsaraev EA, Lanzov VA: Rad51 protein from the thermotolerant yeast Pichia angusta as a typical but thermodependent member of the Rad51 family. Eukaryot Cell 2004, 3(6): 1567-1573.

9. Roth D, Wilson J: Illegimate recombination in mammalian cells. In: Genetic Recombination. Edited by Kucherlapati R, Smith GR. Washington, DC: ASM Press; 1988: 621-653.

10. Gupta RC, Bazemore LR, Golub El, Radding CM: Activities of human recombination protein Rad51. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997, 94(2):463-468.

11. Kurumizaka H, Ikawa S, Nakada M, Eda K, Kagawa W, Takata M, Takeda S, Yokoyama S, Shibata T: Homologous-pairing activity of the human DNA-repair proteins Xrcc3.Rad51C. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98(10):5538-5543.

12. Masson JY, Stasiak AZ, Stasiak A, Benson FE, West SC: Complex formation by the human RAD51C and XRCC3 recombination repair proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98(15):8440-8446.

13. Masson JY, Tarsounas MC, Stasiak AZ, Stasiak A, Shah R, Mcllwraith MJ, Benson FE, West SC: Identification and purification of two distinct complexes containing tlie five RAD51 paralogs. Genes Dev 2001, 15(24):3296-3307.

14. Schild D, Lio Y, Collins DW, Tsomondo T, Chen DJ: Evidence for simultaneous protein interactions between human Rad51 paralogs. J Biol Chem 2000, 275(22): 16443-16449.

15. Takata M, Sasaki MS, Tachiiri S, Fukushima T, Sonoda E, Schild D, Thompson LH, Takeda S: Chromosome instability and defective recombinational repair in knockout mutants of the five Rad51 paralogs. Mol Cell Biol 2001, 21(8):2858,2866. ^

16. Khromykh YM, Varentsova ER, Sarantseva SV, Kotlovanova LV: New characteristics ofDrosophila mutation Rad(2)201Gl: epigenetic transmission of a repair defect via meiosis and association with the Rad51C gene. Dokl Biol Sei 2004, 395:163-165.

17. Khromykh YM, Varentsova ER, Sarantseva SV, Kotlovanova LV: Drosophila genes controlling homologous recombination and repair of double-strand DNA breaks. Usp Sovrem Biol 2004, 124:223-233.

18. Liu Y, Masson JY, Shah R, O'Regan P, West SC: RAD51C is required for Holliday junction processing in mammalian cells. Science 2004, 303(5655):243-246.

19. Harris EH: Chlamydomonas as a Model Organism. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 2001, 52:363-406.

20. Grossman AR, Harris EE, Hauser C, Lefebvre PA, Martinez D, Rokhsar D, Shrager J, Silflow CD, Stern D, Vallon O et ah Chlamydomonas reinhardtii at the crossroads of genomics. Eukaryot Cell 2003, 2(6):1137-1150.

21. Shalguev VI, Kaboev OK, Sizova IA, Hagemann P, Lanzov VA: Identification of Chlamydomonas reinhardtii Rad51C: Recombinational Characteristics. Molecular Biology 2005, 39(1):98—104.

22. Clark AJ: recA mutants of E. coli K12: a personal turning point. Bioessays 1996, 18(9):767-772.

23. Roberts JW, Roberts CW, Craig NL, Phizicky EM: Activity of the Escherichia coli recA-gene product. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 1979, 43:917-920.

24. Ogawa T, Wabiko H, Tsurimoto T, Horii T, Masukata H, Ogawa H: Characteristics of purified recA protein and the regulation of its synthesis in vivo. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1979, 2(909):909-915.

25. Kowalczykowski SC, Dixon DA, Eggleston AK, Lauder SD, Rehrauer WM: Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli. Microbiological Reviews 1994, 58(3):401-465.

26. Roca AI, Cox MM: The RecA protein: structure and function. CRC Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 1990, 25(6):415-456.

27. Shibata T, Das Gupta C, Cunningham RP, Radding CM: Purified Escherichia coli RecA protein catalyzes homologous pairing of superhelical DNA and single-stranded fragments. Proc Natl Acad Sei USA 1979, 76(4):1638-1642.

28. McEntee K, Weinstock GM, Lehman IR: Initiation of general recombination catalyzed in vitro by the RecA protein of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA 1979, 76(6):2615-2619.

29. Story RM, Weber IT, Steitz TA: The structure of the E. coli RecA protein monomer and polymer. Nature 1992, 355(6358):318-325. \

30. Story RM, Bishop DK, Kleckner N, Steitz TA: Structural relationship of bacterial RecA proteins to recombination proteins from bacteriophage T4 and yeast. Science 1993, 259(5103):1892-1896.

31. Cao J, Combs C, Jagendorf AT: The chloroplast-located homolog of bacterial DNA recombinase. Plant Cell Physiol 1997, 38(12): 1319-1325.

32. Flory J, Tsang SS, Muniyappa K: Isolation and visualization of active presynaptic filaments of RecA protein and single-stranded DNA. Proc Natl Acad Sei USA 1984, 81(22):7026-7030.

33. Nishinaka T, Ito Y, Yokoyama S, Shibata T: An extended DNA structure through deoxyribose-base stacking induced by RecA protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997, 94(13):6623-6628.

34. Cox MM: The bacterial RecA protein as a motor protein. Annu Rev Microbiol 2003, 57:551-577.

35. Story RM, Steitz TA: Structure of the RecA Protein-ADP complex. Nature 1992, 355(6358):374-376.

36. Xing X, Bell CE: Crystal Structures of Escherichia coli RecA in a Compressed Helical Filament. J Mol Biol 2004, 342(5): 1471-1485.

37. Sandler SJ, Satin LH, Sam ra HS, Clark AJ: recA-like genes from three archaean species with putative protein products similar to Rad51 and Dmcl proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research 1996, 24(11):2125-2132.

38. Sandler SJ, Hugenholtz P, Schleper C, DeLong EF, Pace NR, Clark AJ: Diversity of radA genes from cultured and uncultured archaea: comparative analysis of putative RadA proteins and their use as a phylogenetic marker. JBacteriol 1999, 181(3):907-915.

39. Kil YV, Baitin DM, Masui R, Bonch-Osmolovskaya EA, Kuramitsu S, Lanzov VA: Efficient strand transfer by the RadA recombinase from the hyperthermophilic archaeon Desulfurococcus amylolyticus. J Bacteriol 2000, 182( 1): 130-134.

40. Seitz EM, Brockman JP, Sandler SJ, Clark AJ, Kowalczykowski SC: RadA protein is an archaeal RecA protein homolog that catalyzes DNA strand exchange. Genes & Development 1998, 12(9): 1248-1253.

41. Woods WG, Dyall SM: Construction and analysis of a recombination-deficient (radA) mutant of Haloferax volcanii. Molecular Microbiology 1997, 23(4):791-797.

42. Komori K, Miyata T, Daiyasu H, Toh H, Shinagawa H, Ishino Y: Domain analysis of an archaeal RadA protein for the strand exchange activity. J Biol Chem 2000, 275(43):33791-33797.

43. Komori K, Miyata T, DiRuggiero J, Holley-Shanks R, Hayashi I, Cann IK, Mayanagi K, Shinagawa H, Ishino Y: Both RadA and RadB are involved in homologous recombination in Pyrococcus furiosus. J Biol Chem 2000, 275(43):33782-33790.

44. Inwood W, Kane S, DiRuggiero J, Robb F, Clark AJ: The RadB protein from Pyrococcus does not complement E. coli recA mutations in vivo. Mol Genet Genomics 2001, 265(4):683-686.

45. Shinohara A, Ogawa H, Ogawa T: Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell 1992, 69(3):457-470.

46. Bezzubova O, Shinohara A, Mueller RG, Ogawa H, Buerstedde JM: A chicken RAD51 homologueis expressed at high levels in lymphoid and reproductive organs. Nucleic Acids Res 1993, 21 (7):1577-1580.

47. Maeshima K, Morimatsu K, Shinohara A, Horii T: RAD51 homologues in Xenopus laevis: two distinct genes are highly expressed in ovary and testis. Gene 1995,160(2): 195-200.

48. Shinohara A, Ogawa H, Ogawa T: Structure and function of RAD51 gene in eukaryote., Nippon Rinsho 1995, 53(l):239-249.

49. Shinohara A, Gasior S, Ogawa T, Kleckner N, Bishop DK: Saccharomyces cerevisiae recA homologues RAD51 and DMC1 have both distinct and overlapping roles in meiotic recombination. Genes to Cells 1997, 2(10):6I5-629.

50. Klimyuk VI, Jones JD: AtDMCl, the Arabidopsis homologue of the yeast DMC1 gene: characterization, transposon-induced allelic-variation and meiosis- associated expression. Plant J 1997, 11(1):1-14.

51. Bishop DK, Park D, Xu L, Kleckner N: DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell 1992, 69(3):439-456.

52. Diener AC, Fink GR: DLH1 is a functional Candida albicans homologue of the meiosis-specific gene DMC1. Genetics 1996,143(2):769-776.

53. Nara T, Saka T, Sawado T, Takase H, Ito Y, Hotta Y, Sakaguchi K: Isolation of a LIM15/DMC1 homolog from the basidiomycete Coprinus cinereus and its expression in relation to meiotic chromosome pairing. Mol Gen Genet 1999, 262(4-5):781 -789.

54. Nara T, Yamamoto T, Sakaguchi K: Characterization of interaction of C- and N-terminal domains in LIM15/DMC1 and RAD51 from a basidiomycetes, Coprinus cinereus. Biochem Biophys Res Commun 2000, 275(1):97-102.

55. Nara T, Hamada F, Namekawa S, Sakaguchi K: Strand exchange reaction in vitro and DNA-dependent ATPase activity of recombinant LIM15/DMC1 and RAD51 proteins from Coprinus cinereus. Biochem Biophys Res Commun 2001, 285(l);92-97.

56. Sato S, Seki N, Hotta Y, Tabata S: Expression profiles of a human gene identified as a structural homologue of meiosis-specific recA-Iike genes. DNA Res 1995, 2(4):183-186.

57. Karlin S, Weinstock GM, Brendel V: Bacterial classifications derived from RecA protein sequence comparisons. JBacteriol 1995, 177(23):6881-6893.

58. Myung K, Kolodner RD: Induction of genome instability by DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. DNA Repair (Amst) 2003, 2(3)':243-258.

59. Pierce AJ, Stark JM, Araujo FD, Moynahan ME, Berwick M, Jasin M: Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol 2001, ll(ll):52-59.

60. Paques F, Haber JE: Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology & Molecular Biology Review (Washington, DC) 1999, 63(2):349-404.

61. Cox MM, Goodman MF, Kreuzer KN, Sherratt DJ, Sandler SJ, Marians KJ: The importance of repairing stalled replication forks. Nature 2000,404(6773):37-41.

62. Michel B, Flores MJ, Viguera E, Grompone G, Seigneur M, Bidnenko V: Rescue of arrested replication forks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98( 15):8181-8188.

63. Kolodner RD: Guarding against mutation. Nature 2000, 407(6805):687-689.

64. Richardson C, Jasin M: Recombination between two chromosomes: implications for genomic integrity in mammalian cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2000, 65:553-560.

65. Symington LS: Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and doublestrand break repair. Microbiol Mol Biol Rev 2002, 66(4):630-670, table of contents.

66. Krejci L, Van Komen S, Li Y, Villemain J, Reddy MS, Klein H, Eiienberger T, Sung P: DNA helicase Srs2 disrupts the Rad51 presynaptic filament. Nature 2003, 423(6937):305-309.

67. Bianco PR, Tracy RB, Kowalczykowski SC: DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. Front Biosci 1998, 3:D570-603.

68. Wu TC, Lichten M: Meiosis-induced double-strand break sites determined by yeast chromatin structure. Science 1994, 263(5146):515-518.

69. Cao L, Alani E, Kleckner N: A pathway for generation and processing of double-strand breaks during meiotic recombination in S. cerevisiae. Cell 1990, 61(6): 1089-1101.

70. Sun H, Treco D, Schultes NP, Szostak JW: Double-strand breaks at an initiation site for meiotic gene conversion. Nature 1989, 338(6210):87-90.

71. Ohta K, Shibata T, Nicolas A: Changes in chromatin structure at recombination initiation sites during yeast meiosis. EMBO J 1994, 13(23):5754-5763.

72. Fan Q, Xli F, Petes TD: Meiosis-specific double-strand DNA breaks at the HIS4 recombination hot spot in the yeast Saccharomyces cerevisiae: control in cis and trans. Mol Cell Biol 1995, 15(3):1679-1688.

73. Liu J, Wu TC, Lichten M: The location and structure of double-strand DNA breaks induced during yeast meiosis: evidence for a covalently linked DNA-protein intermediate. EMBO J1995,14(18):4599-4608.

74. Keeney S, Giroux CN, Kleckner N: Meiosis-specific DNA double-strand breaks are catalyzed by Spoil, a member of a widely conserved protein family. Cell 1997, 88(3):375-384.

75. Bergerat A, de Massy B, Gadelle D, Varoutas PC, Nicolas A, Forterre P: An atypical topoisomerase II from Archaea with implications for meiotic recombination. Nature 1997, 386(6623):414-417.

76. Sun H, Treco D, Szostak JW: Extensive 3'-overhanging, single-stranded DNA associated with the meiosis-specific double-strand breaks at the ARG4 recombination initiation site. Cell 1991, 64(6): 1155-1161.

77. Rattray AJ, Symington LS: Multiple pathways for homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 1995, 139:45-56.

78. Resnick MA: The repair of double-strand breaks in DNA; a model involving recombination. J Theor Biol 1976, 59(1):97-106.

79. Szostak JW, Orr WTL, Rothstein RJ, Stahl FW: The double-strand-break repair model forrecombination. Cell 1983, 33(l):25-35.

80. Petrini JH, Bressan DA, Yao MS: The RAD52 epistasis group in mammalian double strand break repair. Seminars in Immunology 1997, 9:181-188.

81. Ogawa T, Shinohara A, Nabetani A, Ikeya T, Yu X, Egelman EH, Ogawa H: RecA-like recombination proteins in eukaryotes: functions and structures of RAD5I genes. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1993, 58:567-576.

82. Ayora S, Piruat JI, Luna R, Reiss B, Russo VEA, Aguilera A, Alonso JC: Characterization of Two Highly Similar Rad51 Homologs ofPhyscomitrella patens. JMol Biol 2002, 316:35-49.

83. Li ZF, Golub El, Gupta R, Radding CM: Recombination Activities of Hsdmcl Protein, the Meiotic Human Homolog of RecA Protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997, 94(21 ):11221-11226.

84. Lovett ST: Sequence of the RAD55 gene of Saccharomyces cerevisiae: similarity of RAD55 to prokaryotic RecA and other RecA-like proteins. Gene 1994, 142(1):103-106.

85. Johnson RD, Symington LS: Functional differences and interactions among the putative RecA homologs Rad51, Rad55, and Rad57. Mol Cell Biol 1995, 15(9):4843:4850.

86. Dresser ME, Ewing DJ, Conrad MN, Dominguez AM, Barstead R, Jiang H, Kodadek T: DMC1 functions in a Saccharomyces cerevisiae meiotic pathway that is largely independent of the RAD51 pathway. Genetics 1997, 147(2):533-544.

87. Chanet R, Heude M, Adjiri A, Maloisel L, Fabre F: Semidominant mutations in the yeast Rad51 protein and their relationships with the Srs2 helicase. Mol Cell Biol 1996, 16(9):4782-4789.

88. Donovan JW, Milne GT, Weaver DT: Homotypic and heterotypic protein associations control Rad51 function in double-strand break repair. Genes Dev 1994, 8(21):2552-2562.

89. Basile G, Aker M, Mortimer RK: Nucleotide sequence and transcriptional regulation of the yeast recombinational repair gene RAD51. Mol Cell Biol 1992, 12(7):3235-3246.

90. Ogawa T, Yu X, Shinohara A, Egelman EH: Similarity of the yeast RAD51 filament to the bacterial RecA filament. Science 1993 , 259(5103): 1896-1899.

91. Sung P: Catalysis of ATP-dependent homologous DNA pairing and strand exchange by yeast RAD51 protein. Science 1994,265(5176):1241-1243.

92. Sugiyama T, Zaitseva EM, Kowalczykowski SC: A single-stranded DNA-binding protein is needed for efficient presynaptic complex formation by the Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry 1997, 272(12):7940-7945.

93. Zaitseva EM, Zaitsev EN, Kowalczykowski SC: The DNA binding properties of Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry 1999, 274(5):2907-2915.

94. Conway AB, Lynch TW, Zhang Y, Fortin GS, Fung CW, Symington LS, Rice PA: Crystal structure of a Rad51 filament. Nat Struct Mol Biol 2004, 11(8):791-796.

95. Benson FE, Stasiak A, West SC: Purification and characterization of the human Rad51 protein, an analogue of E. coli RecA. Embo Journal 1994, 13(23):5764-5771.

96. Morita T, Yoshimura Y, Yamamoto A, Murata K, Mori M, Yamamotp H, Matsushiro A: A mouse homolog of the Escherichia coli recA and Saccharomyces cerevisiae RAD51 genes. Proc Natl Acad Sei USA 1993, 90(14):6577-6580.

97. Muris DF, Vreeken K, Carr AM, Broughton BC, Lehmann AR, Lohman PH, Pastink A: Cloning the RAD51 homologue of Schizosaccharomyces pombe. Nucleic Acids Res 1993, 21(19):4586-4591.

98. Walker JE, Saraste M, Runswick MJ, Gay NJ: Distantly related sequences in the a- and ß-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. EMBO J 1982, l(8):945-951.

99. Shin DS, Pellegrini L, Daniels DS, Yelent B, Craig L, Bates D, Yu DS, Shivji MK, Hitomi C, Arvai AS et al\ Full-length archaeai Rad51 structure and mutants: mechanisms for RAD51 assembly and control by BRCA2. Embo J2003, 22(17):4566-4576.

100. Stoiy RM, SteitzTA: Structure of the recA protein-ADP complex. Nature 1992, 355(6358):374-376.

101. Wu Y, He Y, Moya IA, Qian X, Luo Y: Crystal structure of archaeai recombinase RadA: a snapshot of its extended conformation. Mol Cell 2004, 15(3):423-435.

102. Yu Z, Chen J, Ford BN, Brackley ME, Glickman BW: Human DNA Repair Systems: An Overview. Environmental and Molecular Mutagenesis 1999, 33:3-20.

103. Ronen A, Glickman BW: Human DNA Repair Genes. Environmental and Molecular Mutagenesis 2001,37:241-283. .

104. Albala JS, Thelen MP, Prange C, Fan W, Christensen M, Thompson LH, Lennon GG: Identification of a novel human RAD51 homolog, RAD51B. Genomics 1997, 46(3):476-479.

105. Dosanjh MK, Collins DW, Fan W, Lennon GG, Albala JS, Shen Z, Schild D: Isolation and characterization of RAD51C, a new human member of the RAD51 family of related genes. Nucleic Acids Res 1998, 26(5): 1179-1184.

106. Cartwright R, Dunn AM, Simpson PJ, Tambini CE, Thacker J: Isolation of novel human and mouse genes of the recA/RAD51 recombination-repair gene family. Nucleic Acids Res 1998, 26(7):1653-1659.

107. Cartwright R, Tambini CE, Simpson PJ, Thacker J: The XRCC2 DNA repair gene from human and mouse encodes a novel member of the recA/RAD51 family. Nucleic Acids Res 1998, 26(13):3084-3089.

108. Pittman DL, Weinberg LR, Schimenti JC: Identification, characterization, and genetic mapping of Rad51d, a new mouse and human RAD51/RecA-related gene. Genomics 1998,49(1): 103-111.

109. Johnson RD, Liu N, Jasin M: Mammalian XRCC2 promotes the repair pf DNA double-strand breaks by homologous recombination. Nature 1999,401(6751):397-399.

110. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M: XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev 1999, 13(20):2633-2638.

111. Masson JY, Stasiak AZ, Stasiak A, Benson FE, West SC: Complex formation by the human RAD51C and XRCC3 recombination repair proteins. Proc Natl AcadsSci USA 2001, 98(15):8440-8446.

112. Sigurdsson S, Van Komen S, Bussen W, Schild D, Albala JS, Sung P: Mediator function of thehuman Rad51B-Rad51C complex in Rad51/RPA-catalyzed DNA strand exchange. Genes Dev 2001, 15(24):3308-3318.

113. Wiese C, Collins DW, Albala JS, Thompson LH, Kronenberg A, Schild D: Interactions involving the Rad51 paralogs Rad51C and XRCC3 in human cells. Nucleic Acids Res 2002, 30(4):1001-1008.

114. Liu N, Schild D, Thelen MP, Thompson LH: Involvement of Rad51C. in two distinct protein complexes of Rad5I paralogs in human cells. Nucleic Acids Res 2002, 30(4): 1009-1015.

115. Miller KA, Yoshikawa DM, McConnell IR, Clark R, Schild D, Albala JS: RAD51C interacts with RAD5IB and is central to a larger protein complex in vivo exclusive ofRAD51. J Biol Chem 2002, 277( 10):8406-8411.

116. Lio YC, Mazin AV, Kowalczykowski SC, Chen DJ: Complex formation by the human Rad5IB and Rad51C DNA repair proteins and their activities in vitro. J Biol Chem 2003, 278(4):2469-2478.

117. Takata M, Sasaki MS, Tachiiri S, Fukushima T, Sonoda E, Schild D, Thompson LH, Takeda S: Chromosome instability and defective recombinational repair in knockout mutants of the five Rad51 paralogs. Mol Cell Biol 2001, 21 (8):2858-2866.

118. Takata M, Sasaki MS, Sonoda E, Fukushima T, Morrison C, Albala JS, Swagemakers SM, Kanaar R, Thompson LH, Takeda S: The Rad51 paralog Rad51B promotes homologous recombinational repair. Mol Cell Biol 2000, 20(17):6476-6482.

119. French CA, Masson JY, Griffin CS, O'Regan P, West SC, Thacker J: Role of mammalian RAD51L2 (RAD51C) in recombination and genetic stability. J Biol Chem 2002,277(22): 1932219330.

120. Godthelp BC, Wiegant WW, van Duijn-Goedhart A, Scharer OD, van Buul PP, Kanaar R, Zdzienicka MZ: Mammalian Rad51C contributes to DNA cross-link resistance, sister chromatid cohesion and genomic stability. Nucleic Acids Res 2002, 30(10):2172-2182.

121. Moynahan ME, Cui TY, Jasin M: Homology-directed dna repair, mitomycin-c resistance, and chromosome stability is restored with correction of a Brcal mutation. Cancer Res 2001, 61(12):4842-4850.

122. Moynahan ME, Pierce AJ, Jasin M: BRCA2 is required for homology-directed repair of chromosomal breaks. Mol Cell 2001, 7(2):263-272.

123. Venkitaraman AR: Chromosome stability, DNA recombination and the BRCA2 tumour suppressor. Curr Opin Cell Biol 2001, 13(3):338-343'.

124. Xia F, Taghian DG, DeFrank JS, Zeng ZC, Willers H, Iliakis G, Powell SN: Deficiency of human BRCA2 leads to impaired homologous recombination but maintains normal nonhomologous end joining. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98(15):8644-8649.

125. Lisby M, Rothstein R: Localization of checkpoint and repair proteins in eukaryotes. Biochimie 2005, 87(7):579-589.

126. Kato M, Yano K, Matsuo F, Saito H, Katagiri T, Kurumizaka H, Yosiiimoto M, Kasumi F, Akiyama F, Sakamoto G el al: Identification of Rad51 alteration in patients with bilateral breast cancer. J Hum Genet 2000, 45(3):133-137.

127. Hughes AL: Gene duplication and the origin of novel proteins. Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102(25):8791-8792.

128. Braybrooke JP, Spink KG, Thacker J, Hickson ID: The RAD51 family member, RAD51L3, is a DNA-stimulated ATPase that forms a complex with XRCC2. J Biol CHem 2000, 275(37):29100-29106.

129. Mazin A: An Ensemble of Proteins that Repairs DNA Double-Stranded Breaks in Eukaryotes. Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня Бреслеровские чтения 2002:298-309.

130. Chen G, Yuan SS, Liu W, Xu Y, Trujillo K, Song B, Cong F, Goff SP, Wu Y, Arlinghaus R et al: Radiation-induced assembly of Rad51 and Rad52 recombination complex requires ATM and c-Abl. J Biol С hem 1999, 274(18): 12748-12752.

131. Yu X, Jacobs SA, West SC, Ogawa T, Egelman EH: Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98(15):8419-8424.

132. Yang SX, Yu X, Seitz EM, Kowalczykowski SC, Egelman EH: Archaeai RadA protein binds DNA as both helical filaments and octameric rings. Journal of Molecular Biology 2001, 314(5):1077-1085.

133. Guerra E, Chye PP, Berardi E, Piper PW: Hypoxia abolishes transience of the heat-shock response in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Microbiology 2005, 151 (Pt 3):805-811.

134. Pignocchi C, Berardi E, Cox BS: Nitrate reduction and the isolation ofNitNmutants in Hansenula polymorpha .Microbiology 1998, 144:2323-2330.

135. Cabeca-Silva C, Madiera-Lopes A: Temperature relations of yield, growth and thermal death in the yeast Hansenula polymorpha. ZAllg Mikrobiol 1984, 24:129-132.143. van Uden N: Temperature profiles of yeasts .Adv Microb Physiol 1984, 25:195-248.

136. Madeira-Lopes A, Placido MT, Cabeca-Silva C: Comparative study of the temperature profiles of growth and death of the pathogenic yeast Ciyptococcus neoformans and the non-pathogenic Cryptococcus albidus. J Basic Microbiol 1986, 26(l):43-47.

137. Harris EH: The Chlamydomonas Sourcebook. A Comprehensive Guide to Biology and Laboratory Use. Academic Press, San Diego 1989.

138. Boynton JE, Gillham NW, Harris EH, Hosier JP, Johnson AM, Jones AR, Randolph-Anderson BL, Robertson D, Klein TM, Shark KB et al\ Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science 1988, 240(4858):1534-1538.

139. Kindle KL, Schnell RA, Fernandez E, Lefebvre PA: Stable nuclear transformation of Chlamydomonas using the Chlamydomonas gene for nitrate reductase. J Cell Biol 1989, 109(6Ptl):2589-2601.

140. Goldschmidt-Clermont M: Transgenic expression of aminoglycoside adenine transferase in the chloroplast: a selectable marker of site-directed transformation of chlamydomonas. Nucleic Acids Res 1991, 19(15):4083-4089.

141. Kindle KL: High-frequency nuclear transformation of Chlamydomonas reinhardtii. Proc Natl Acad Sci USA 1990,87(3):1228-1232. ^

142. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor NY 1989.

143. Остерман ЛФ: Хроматография белков и нуклеиновых кислот.: М: Наука.; 1986.

144. Захаров ИА, Кожин СА, Кожина ТН, Федорова ИВ: Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. 1984:144.

145. Birnboim НС, Doly J: A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res 1979, 7(6):1513-1523.

146. Rao VB: Direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Anal Biochem 1994, 216(1):1-14.

147. Laemmly UK: Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227:680-685.

148. Namsaraev E, Berg P: Characterization of strand exchange activity of yeast Rad51 protein. Molecular & Cellular Biology 1997, 17(9):5359-5368.

149. Cox MM, McEntee K, Lehman IR: A simple and rapid procedure for the large scale purification of the RecA protein of Escherichia coli. J Biol Chem 1981, 256(9):4676-4678.

150. Griffith J, Shores CG: RecA protein rapidly crystallizes in the presence of spermidine: a valuable step in its purification and physical characterization. Biochemistry 1985, 24(1): 158-162.

151. Gassmann M, Thommes P, Weiser T, Hubscher U: Efficient production of chicken egg yolk antibodies against a conserved mammalian protein. FASEBJ1990, 4(8):2528-2532.

152. Poison A, von Wechmar MB, Fazakerley G: Antibodies to proteins from yolk of immunized hens. Immunol Соттип\Ш,9(5)-А95-5\4.

153. Laemmly UK, Favre M: Maturation of head of bacteriophage T4. JMol Biol 1973, 80(2):575-599.

154. Craig NL, Roberts JW: Function of nucleoside triphosphate and polynucleotide in Escherichia coli recA protein-directed cleavage of phage lambda repressor. Journal of Biological Chemistry 1981, 256(15):8039-8044. '

155. Lohman TM, Overman LB: Two binding modes in Escherichia coli single strand binding proteinsingle stranded DNA complexes. Modulation by NaCl concentration. J Biol Chem 1985, 260(6):3594-3603.

156. Namsaraev EA, Berg P: Branch migration during Rad51 -promoted strand exchange proceeds in either direction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1998, 95(18):10477-10481.

157. Sugiyama T, Zaitseva EM, Kowalczykowski SC: A single-stranded DNA-binding protein is needed for efficient presynaptic complex formation by the Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein. J Biol Chem 1997, 272(12):7940-7945.

158. Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976, 72:248-254.

159. Kreuzer K, Jogeneel CV: Methods Enzymol 1983, 100:144-160.

160. Kowalczykowski SC, Eggleston AK: Homologous Pairing and DNA Strand-Exchange Proteins. Annu Rev Biochem 1994, 63:991-1043.

161. Flory J, Radding CM: Visualization ofRecA protein and its association with DNA: a priming effect of single-strand-binding protein. Cell 1982, 28(4):747-756.

162. Williams RC, Spengler SJ: Fibers ofRecA protein and complexes ofRecA protein and single-stranded фХ174 DNA as visualized by negative-stain electron microscopy. JMol Biol 1986, 187(1):109-118.

163. Kaboev 0, Luchkina L, Shalguev V, Andreichuk Y, Kulikov V, Kozarenko A, Lanzov V: Improved RecA-assisted fluorescence assay for DNA strand exchange reaction. Biotechniques 2006, 40(6):736, 738.

164. Кассандрова ОН, Лебедев BB: Обработка результатов измерений. 1970.

165. Corpet F: Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucl Acids Res 1988, 16(22):10881-10890.

166. Aihara H, Ito Y, Kurumizaka H, Yokoyama S, Shibata T: The N-terminal domain of the human Rad51 protein binds DNA: structure and a DNA binding surface as revealed by NMR. JMol Biol 1999, 290(2):495-504.

167. Eggler AL, Inman RB, Cox MM: The Rad51-dependent pairing of long DNA substrates is stabilized by Replication Protein A. Journal of Biological Chemistry 2002, 277(39280-39288).

168. Bedale WA, Cox M: Evidence for the coupling of ATP hydrolysis to the final (extension) phase of RecA protein-mediated DNA strand exchange. J Biol Chem 1996, 271(10):5725-5732.

169. Kil YV, Glazunov EA, Lanzov VA: Characteristic thermodependence of the RadA recombinase from the hyperthermophilic archaeon Desulfurococcus amylolyticus. JBacteriol 2005, 187(7):2555-2557.

170. Glazunov EA, Kil Y, Lantsov VA: Two types of temperature dependence of homologous recombinases in archaea: the properties of the Desulfurococcus amylolyticus recombinase. Dokl BiolSci 2001,379:389-392.

171. Namsaraev EA, Berg P: Rad51 uses one mechanism to drive DNA strand exchange in both directions. Journal of Biological Chemistry 2000, 275(6):3970-3976.

172. Baumann P, West SC: The human Rad51 protein: polarity of strand transfer and stimulation by hRP-A. Embo J 1997, 16( 17):5198-5206.

173. Sigurdsson S, Trujillo K, Song B, Stratton S, Sung P: Basis for avid homologous DNA strand exchange by human Rad51 and RPA. J Biol Chem 2001, 276(12):8798-8806.

174. Rice KP, Eggler AL, Sung P, Cox MM: DNA pairing and strand exchange by the Escherichia coli RecA and yeast Rad51 proteins without ATP hydrolysis: on the importance of not getting stuck. J Biol Chem 2001, 276(42):38570-38581.

175. Fasullo M, Giallanza P, Dong Z, Cera C, Bennett T: Saccharomyces cerevisiae rad51 mutants are defective in DNA damage-associated sister chromatid exchanges but exhibit increased rates ofhomology-directed translocations. Genetics 2001, 158(3):959-972.

176. Shalguev VI, Kil Y, Yurchenko LV, Lantsov VA: Temperature dependence of HpRad51, the central protein of the homological recombination in the yeast Hansenula polymorpha. Dokl Biochem Biophys 2002, 387:328-330.

177. Tombline G, Fishel R: Biochemical characterization of the human RAD51 protein. I. ATP hydrolysis. J Biol Chem 2002, 277(17): 14417-14425.

178. Sung P, Stratton SA: Yeast Rad51 recombinase mediates polar DNA strand exchange in the absence of ATP hydrolysis. Journal of Biological Chemistry 1996, 271(45):27983-27986.

179. Wetmur JG, Wong DM, Ortiz B, Tong J, Reichert F, Gelfand DH: Cloning, sequencing, and expression of RecA proteins from three distantly related thermophilic eubacteria. Journal of Biological Chemistry 1994, 269(41):25928-25935.

180. Zaitseva EM, Zaitsev EN, Kowalczykowski SC: The DNA binding properties of Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein. J Biol Chem 1999, 274(5):2907-2915,

181. Chervyakova D, Kagansky A, Petukhov M, Lanzov V: L29M. substitution in the interface of subunit-subunit interactions enhances Escherichia coli RecA protein properties important for its recombinogenic activity. JMol Biol 2001, 314(4):923-935.

182. Bazemore LR, Takahashi M, Radding CM: Kinetic analysis of pairing and strand exchange catalyzed by RecA. Detection by fluorescence energy transfer. Journal of Biological Chemistry 1997, 272(23): 14672-14682.

183. Gupta RC, Folta-Stogniew E, Radding CM: Human Rad51 protein can form homologous joints in the absence of net strand exchange. J Biol Chem 1999, 274(3):1248-1256,

184. Shim KS, Schmutte C, Tombline G, Heinen CD, Fishel R: hXRCC2 enhances ADP/ATP processing and strand exchange by hRAD51. J Biol Chem 2004, 279(29):30385-30394.

185. Gupta RC, Golub E, Bi B, Radding CM: The synaptic activity of HsDmcl, a human recombination protein specific to meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98(15):8433-8439.

186. Grogan DW: The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea. Trends Microbiol 2000, 8:180-185.

187. Bernardi G: Isochores and the evolutionary genomics of vertebrates. Gene 2000,241:3-17.

188. Bernardi G: Compositional constraints and genome evolution. JMolEvol 1986, 24:1-11.

189. Wada A, Suyama A: Local stability of DNA and RNA secondary structure and its relation to biological functions. Prog Biophys Mol Biol 1986, 47:113-157.

190. Galtier N, Lobry JR: Relationships between genomic G+C content, RNA secondary structures, and optimal growth temperature in prokaryotes. J MolEvol 1997,44:632-636.

191. Hurst LD, Merchant AR: High guanine-cytosine content is not an adaptation to high temperature: a comparative analysis amongst prokaryotes. Proc R Soc Lond 2001, 268:493-497.

192. Muto A, Osawa S: The guanine and cytosine content of genomic DNA and bacterial evolution. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 84:166-169.

193. Bernardi G: The vertebrate genome: isochore and evolution. Mol Biol Evol 1993, 10:186-204.

194. Musto H, Naya H, Zavala A, Romero H, Alvarez-Vain F, Bernardi G: Correlations betweengenomic GC levels and optimal growth temperatures in prokaryotes. FEBSLett 2004, 573:73-77.

195. Marashi S-A, Ghalanbor Z: Correlations between genomic GC levels and optimal growth temperatures are not 'robust'. Biochem Biophys Res Commun 2004, 325:381-383.

196. Dosanjh MK, Collins DW, Fan W, Lennon GG, Albala JS, Shen Z, Schild D: Isolation and characterization of RAD51C, a new human member of the RAD51 family of related genes. Nucleic Acids Res 1998, 26(5): 1179-1184.

197. Baumann P, West SC: The human Rad51 protein polarity of strand transfer and stimulation by Hrp-A. EMBO Journal 1997, 16( 17):5198-5206.

198. Namsaraev EA, Baitin D, Bakhlanova IV, Alexseyev AA, Ogawa H, Lanzov VA: Biochemical basis of hyper-recombinogenic activity of Pseudomonas aeruginosa RecA protein in Escherichia coli cells. Molecular Microbiology 1998, 27(4):727-738.

199. Baitin DM, Lanzov VA: Induction of recombination by the bacterial RecA protein depends on the stability of the RecA-DNA complex. Dokl Biochem 2000, 371(l-6):43-45.

200. Baitin DM, Zaitsev EN, Lanzov VA: Hyper-recombinogenic RecA protein from Pseudomonas aeruginosa with enhanced activity of its primary DNA binding site. J Mol Biol 2003, 328(l):l-7.

201. Bakhlanova IV, Lantsov VA: Recombinational properties of the chimeric recA genes (Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli): gene regions responsible for the recombinational activity of the protein encoded. Dokl Biol Set2000, 371(1-6): 168-171.

202. Sano Y, Kageyama M: The sequence and function of the recA gene and its protein in Pseudomonas aeruginosa PAO. Mol Gen Genet 1987, 208(3):412-419.

203. Zaitsev EN, Zaitseva EM, Bakhlanova IV, Gorelov VN, Kuz'min NP: Cloning and characteristics of recA gene in Pseudomonas aeruginosa., Genetika 1986, 22(11):2721-2727.

204. Sano Y: Role of the recA-related gene adjacent to the recA gene in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 1993, 175(8):2451-2454,

205. Ehrlich M, Norris KF, Wang RY, Kuo KC, Gehrke CW: DNA cytosine methylation and heat-induced deamination. Biosci Rep 1986, 6:387-393.

206. Petukhov MG, Kil IV, Lantsov VA: Nature of protein thermal resistance: stability of alpha-helices of RecA proteins of the thermophilic bacteria., DoklAkad Nauk 1997, 356(2):268-271.

207. Petukhov MG, Baitin DM, Kil IV, Lantsov VA: Optimal rigidity of the protein structure: three classes of rigidity in the eubacterial RecA protein family., DoklAkad Nauk 1998, 362(1):118-121.