Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая рекомбинация в процессе коньюгации у Escherichia К-12

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая рекомбинация в процессе коньюгации у Escherichia К-12"

л- /¿Я

уи

Главное Управление микробиологической прошшнэнностк прп Совете Министров СССР

ВСЕСОШШЙ НШНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОШШЛЕНШХ Ш1КР00ЕГАНИЗМШ

На правах рукописи

ЛАЩОВ Владислав Александрович

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОШШАЦИЯ В ПРОЦЕССЕ КОНЪЮГАЦИИ У езсней1сн1а соы 1с-12

(03,00.15 - генетлка)

Автореферат диссертации на соискание ученой степонп лектора биологических науи

Москва 1981

'■¿мл'.

ссс.:

'Работа выполнена в Ленинградском институте ядерной физики ш.Б .П. Константинова АН СССР.

Офицкал?чые оппоненты: член-корреспондент АМН СССР, профессор А.Г.СМВРОНСКАЯ, доктор биологических наук, профессор А.А.ПРОЗОРСС, доктор биологических наук, профессор В.Б.СЛЩОЛЕЦ.

Ведущее предприятия: Институт цитологии АН СССР, лаборатория радиационной цитологии.

Защита состоится " "_1982 г, в " " чао.

на заседании специализированного совета ДО 25.01.01. при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, Дорожная ул., д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов. '

Автореферат разослан " "_1982 г.

Учений секретарь специализированного совета кавдидат биологических наук

В.К.Гордеев.

- 3 -

В В Е Д Е Н.И Е

Генетическая рекомбинация является одним из важнейших процессов в живой природе. Если еще 7-8 лет назад, говоря о рекомбинация^ ыы ограничились бы указанием на ее главную и очевидную функцию -обмен донорного я рецнпиентного генетического материала и образование гибридного потомства, то теперь, благодаря применению методов генетической инженерии в генетике про- и эукариот, стали ясны те потенциальные возможности, которые заложены в рекомбинации для .реализации таких явлений, как хромосомные перестройки (дупликации, делеции, транслокации и инверсии), регуляция выражения гена, неконтролируемый злокачественный рост и т.д. Иными словами, стала очевидна фундаментальная роль, которую процесс рекомбинации может играть в эволюции.

Новому взгляду на рекомбинацию мы во многом обязаны успеха/л, достигнутым в последние годы, в изучении так называемой незаконной рекомбинации (illegitimate recombination) У прокариот, изучению 13 -элементов и TpaHcn030H0B(starlinger, 1977; 1980). Особенностью этой рекомбинации является ее сайтспецифический характер, обусловленный энзимологической системой как самого is-элемента, или тран-спозона, так и бактериальной клетки. Можно предполагать, что на ранних этапах эволюции сайтспецифическая рекомбинация, обеспечивавшая образование новых генов за счет рекомбинационных событий адди-тивно-эксцизионного типа, могла иметь селективное преимущество. Дальнейшие этапы эволюции могли выдвинуть на первый план более тонкие механизмы, предусматривающие возможности рекомбинационпого обмена между гомологическими структурами ДНК (см., например, Star-linger,1980) . В связи с этим интересен один'из основных результатов нашей работы - сайтспецифический характер общей гомологической рекомбинации у Е. coli . Доказательство этого факта не являлось самоцелью настоящей работы. Он выявился в результате систематических исследований процесса общей рекомбинации, которая проводится в нашей лаборатории на протяжении последних 15 лет.

В качестве экспериментальной системы мы избрали иостконъюга-ционную рекомбинацию. Привлечение других систем рекомбинация, в топ числе и адцитивяо-эксцизнонных (взаимодействие фактора Р с хромосомой, распад плазмнд), анализ которых представляет п самостоятель-'

нки интерес, в основном преследовало цели понимания специфичности явления рекомбинации после конъюгации. Выбор коныагационного способа направленной передачи ДНК не случаен, так как он позволяет пере-! давать и вовлекать в последующую рекомбинацию сколь угодно большие' фрагменты хромосомы е. coll . Это, в конечном итоге, дает возможность анализировать рекомбинациояные свойства хромосомы в целом.

Актуальность проблемы. Хотя явление конъюгации и последующей рекомбинации достаточно интенсивно изучается последние 20 лет, тем не менее, многие гадине вопросы продолжают оставаться предметом дискуссии. К числу их относятся прекде всего уровень рекомбинации (одно- или двунитевая ДНК) после конъюгации, судьба фрагмента до-норной ДНК в постконъпгационных мерозиготах, явление гетерогенности потомства эксконъгагантов. Кларк с сотрудниками определили генетические детерминанты общей рекомбинации и ввели в литературу понятие о так назых еыых путях рекомбинации. Однако биологический смысл этих путей оставался загадкой. В настоящей работе мы попытались обобщит^ данные, имеющиеся в литературе, и собственные данные, чтобы дать единое представление о характере и способах прохождения общей гомологической рекомбинации у Б. coli.

Исследование генетической рекомбинации у такого классического объекта молекулярной генетики, каким является Б. coli, следует отнести к числу фундаментальных вопросов молекулярной биологии прокариот. Результаты настоящей работы могут найти применение во всех лабораториях, изучащих проблемы рекомбинации, репарации и репликации как у про-, так и у эукариот, а также в лабораториях, решавдих прикладные задачи и использующих методы рекомбинационяого анализа в повседневной практике.

Основные залачи работы сводятся к следующему:

- доказательство одно- или двуштевогэ уровня рекомбинации молекул ДНК после конъюгации;

- анализ метаболических путей рекомбинации ;

- судьба донорного фрагмента б конъюгациенной мерозиготе.■

Научная новизна результатов. Впервые описано явление необычной конъюгации, названное "однонитевой конъюгацией", которое характеризуется протеканием рекомбинационного процесса на уровне однонитевой ДНК. Оно детально исследовано и сопоставлено с обычной двуни-тевой конъюгацией. Впервые показан сайтспецифический характер одно-

— д —

го из главных путей общей рекомбинации у е. coli • С использованием различных экспериментальных систем рекомбинации выяснена роль сайтов, названных наш fra , в реализации рекомбинации на разных путях рекомбинации у е. coli. Впервые выявлены необычные промежуточные продукты рекомбинации - замкнутые в кольца структуры донорной ДНК, обнаруживаемые в постконыогационных мерозиготах. Существование таких структур позволяет объяснить одно из самых загадочных явлений постконъпгационной рекомбинации - гетерогенность потомства эксконъ-югантов.

Эксперименталыше материалы, изложешше в диссертации, получены как сайт автором, так и совместно с сотрудниками и аспирантами лаборатории молекулярной и радиационной биофизики ЛИЯФ им.Б .П.Константинова АН СССР, работавшими под его руководства«.

Объем и структура работы. Диссертация содеркит 227 страниц машинописного текста, 25 таблиц, 38 рисунков. Диссертация состоит из "Введения", главы обзорного характера, главы "Материалы и методы", трех экспериментальных глав и "Выводов". Первые разделы 3 и 5-й глав представляют собой краткий обзор литературы, необходимый для постановки задач данной части исследования. Каждая экспериментальная глава заканчивается разделом "Заключение", который подытоживает данную часть исследования. Список литературы включает 233 наименований, в том числе 31 на русском языке.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены. на 15-й научной конференции Института высокомолекулярных соединений АН СССР, Л., 1968; теоретических семинарах по молекулярной генетике, Звенигород, 1968, IS8I; Пущино-на-Оке, 1878; Лута, 1979,Х1У Международном генетическом конгрессе, M., 1978; 17 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", M., 1979; рабочем совещании "Генетика и молекулярная биология плазыид", Лущино-на-Оке, 1980.

Глава I

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И Э1ШЛ010ГМЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ РЕКОМБИНАЦИИ У е. coli К-12

В этой главе, написанной на основе данных литературы и результатов настоящей работы, изложены современные представления о механизме рекомбинации у е. coli • Отмечена роль экспериментального а

теоретического исследования пластических свойств ДНК - сверхскрученности, миграции перекреста и изомеризации .структуры ДНК - в понимании процесса рекомбинации. Кратко рассмотрены разновидности рекомбинации и основные экспериментальные система, используемые для ■ ее изучения. Описаны основные рексмбинационные гены и их продукты (гены гесА ' , гесВС и гвсР ), метаболические пути рекомбинации ( КесВС , реализующийся в клетках reel1" , RecF (гесВС~аЪсВ~) й смешанный ВесВСЗ? (гес+ ) и сайтспецифический характер общей рекомбинации (сайты chi для геоВС -нуклеазы и сайты fre для гипотетической reoF-зависимой эндонуклеазы).

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ и штода

Б данной главе приведен перечень использованных штаммов Е. colj K-I2 (в работе использовали более 150'штаммов, из которых более 100 было сконструировано в лаборатории, см.рис.1) и бактериофагов,содержится пропись сред для работы с бактериями и фагами, описаны методические подробности выполнения экспериментов.

Генетические методы включают методики конъюгации, генерализо- ■ ванной транедукции, мутагенеза, а также рекомбинационный анализ, клональный анализ рекомбинантов и расчет коэффициента сцепленности маркеров.

Рекомбинационный анализ проводили на основе картирующей функции Холдейна w = 1/2(1 - о .которая связывает вероятность рекомбинации w •, физическую дайну отрезка ДНК, на котором протекает рекомбинация, х , и масштаб генетической карты А - среднее статистическое расстояние между двумя соседними кросскнговерами. В эксперименте определяли коэффициент сцепленности маркеров j* как вероятность наследования проксимального неселёктируемого маркера чреда рекомбинантов по дисталыюму селектируемому. Так как jut = 1 -.<' , то, зная 1 , можно вычислить масштаб 7- . Если анализируется несколько неселектируемых маркеров, зависимость - 1 ) от 1 должна быть прямой, котангенс утла наклона которой будет равен ^/2 . Получение такой прямой свидетельствует как о правильности картировав ния маркеров, так и о точности определяемого масштаба Л в данной области картн.

Рис.I. Генетическая карта Б. coli (по Bachmann, Low , 1980). Показаны маркеры, использованные в работе, и направление передачи хромосомы донорами. Показана локализация сайтов fre 11, fre 12 и fre in в горячих областях рекомбинации fre X и fre II, соответственно.

Клоналышй анализ рекомбинантов. Рекомбинантные клоны первичного рассева анализировали методом перепечаток•на наличие про-тотрофного аллеля неселектируемого маркера. Если хотя бы один из заданной выборки клонов вторичного рассева показывал альтернативный генотип, первичный клон считали смешанным. Относительное число смешанных среди общего числа клонов первичного рассева считали долей гетерогенных клонов g}5 в %. Индексы 15 и I показывают, что данная величина найдена при выборке 15 клонов вторичного рассева, анализируемых по одному неселектируемому маркеру. Е работе будут встречаться и большие выборки.

Символ s - степень сложности гетерогенных событий. Запись s = 4/15 означает обнаружение 4 тройных и более сложных наборов генотипов в клоне среди 15 гетерогенных клонов.

Коэотмпцкент сцепленности маркеров. Запись /t/thr+ _leu = 0,96 (300) означает величину сцепленности неселектируемого маркера leu с селектируемым thr , установленную при анализе 300 рекомбинаятных клонов thr+ . Выборка 300 клонов в подобном анализе обеспечивает погрешность в определении величины у« +0,03 в 95$ доверительном интервале (Ыостеллер и .др., 1969). Поэтому в зависимости от необходимой точности анализа выборку варьировали от 100 до 8С0 клонов.

Радкохишческие методы включают радиоактивное самоубийство ре-комбинантов (по методике Fuerat, stent IS5S), радиоактивную метку Д1Ж ^Р или С-тимипои и методики ее измерения, радпоавтографию молекул ДШС (по методике Caima, 1963).

Биохимические методы включают определение активности ß -га-лактозэдазы (по руководству Миллера, 1976), выделение ДЫК плазмид и оценка кх мол.веса (по методике Hansen, 01озп, 1973), обработка ДНК эндонуклеазон рестрикции (по методике Alton, Vapnek, 1978).

Глава 3

СИНТЕЗ ДНК В ХОДЕ КОНЪЮГАЦИИ У Е. coli К-12.

ОДНОНИТЕЗАЯ КОНЪЮГАЦИЯ

0 механизме бактериально"! конъюгации. Основным стимулом к изучению механизма конызгационной перелагай ДНК явилась сформулированная Ф.Жекобом и С.Бреннером теория решшкона и предложенная ими, в частности, репликоновая модель конъюгации (Jacob et al., 1963). Центральное положение этой модели предусматривало запуск специального конъюгационного синтеза ДНК, ответственного за передачу генетического материала донора в реципиент. Это экспериментальное предсказание модели вскоре.было подтверждено ноли методом радиоактивного самоубийства эксконыогантов (Blinkova et al«, 1965) и другими авторами методом радаоавтограйии эксконъюл'антов (Gross, Caro, 1966).

Согласно репликоновоп модели конъюгации вое активные события, связанные с конъгогациокным синтезом ДНК, развиваются в доноре. Со- ' мнения в справедливости этого полокания были впервые высказаны в

• - У -

работе Ф.Бонгеффера, которому удалось отобрать термочувствительную мутацию ВТ43 в гене dnaB подавляющую как вегетативный синтез ДНК в реципиенте в непермпссивных условиях, так и выход рекомбинантов после конъюгации (Bonhoeffer, 1966). Эта работа стимулировала новые исследования, которые и завершились следующим выводом: донор передает лишь одну нить своей ДНК с 5 -конца, передаче нити сопутствует специальный кокьюгациояшй синтез ДНК, этот синтез имеет место в доноре, чтобы заполнить образовавшуюся брешь, связанную с изъятием одной нити, и вероятен в реципиенте (Bonhoeffer, Vielmet-ter, I968;0hki, Tomiaawa, 1968; Rupp, Ihler, 1968).

Возникли вопросы. Нужен ли конъгагационяый синтез ДНК в доноре для передачи ДНК? Нужен ли этот синтез в реципиенте, в чем загадка мутации ВТ43? Какова генетическая детерминированность конъюгацион-ного синтеза ДНК? В какой форме (одно- или двунитевой) ДНК донора приступает к рекомбинации в реципиенте? На каком уровне (одно- или двунитевая ДНК) завершается рекомбинация? Эти вопросы отнвдь не исчерпывают всех деталей сложного многостадийного процесса конъюгации, но они подводят нас к главному вопросу о судьбе донорной ДНК в ходе рекомбинации.

Попытаемся ответить на эти вопросы.

Конъюгациокный синтез ДНК в доноре. Этот синтез оказалось возможным выявить радиометрически за счет подавления в доноре и реципиенте вегетативного синтеза ДНК с помощью термочувствительной по синтезу ДНК мутации dna ВТ43 (непермиссивные условия, 42°С).

На фоне остаточного внедрения радиоактивного тимина в неконысн гирущие доноры и реципиенты наблюдается от 3 до 5 раз превосходящее внедрение за счет конъюгации. Данный конъюгационный синтез протекал только в доноре: он обнаруживался в присутствии налидшссовой кислоты (агента, неизбпрательно подавляющего синтез ДНО, когда донор был устойчив к яду, а реципиент нет, и не обнаруживался, когда донор был чувствителен к яду, а реципиент - нет.

Конъюгационный синтез ДНК в реципиенте. Термочувствительная мутация Т266 в гене dna В (Kohiyama et al., 1966) по своим koiTblo-" гациошшм свойствам отличается от мутации ВТ43. Хотя она так же,как и ВТ4.3, подавляет вегетативный синтез ДНК в непермиссивных условиях, но не ипгибирует выход рекомбипантов.. Для селективной метки конъюгапдонного синтеза в доноре или реципиенте мы использовали шталг.ш thy+ п thy" . Первые внедряют 14С~тимпи на порядок менее

эффективно. Тогда комбинация thy+ и thy" доноров с thy+ и thy"-реципиентами может указать, через какого партнера протекало внедрение радиоактивности в непермиссивных условиях, т.е. какой партнер вел коныогационшш синтез ДНК.

В качестве доноров использовали thy+ или thy" штаммы Hfr н dna БТ42И Р' 0RP-2O6 ctaa БТ43 (мутации ВТ42 и ВТ43 родственны) . Реципиентами служили thy+ или thy" штаммы CRT dna T266 И CR 3443 Clna BT43 .

Анализ 16 возможных комбинаций убеждает нас в том,' что конъюгационный синтез ДНК как в доноре, так и в реципиенте обычно сопровождает конъюгационную передачу генетического материала донора (по данным с мутацией Т266). Мутация ВТ43 - случай исключительный, она селективно подавляет конъюгационный синтез в реципиенте, что и приводит к необычным последствиям, выражающимся в "рекомбинацион-ной дефектности" рецшкента с этой мутацией.

Конъюгационный синтез Д1Ж в реципиенте не требует рекомбинации. Итак, конъюгационный синтез ДНК в реципиенте сопровождает конъюгацию, хотя и не нужен дая собственно передачи донорнсй ДНК. Спрашивается, когда же он протекает, до рекомбинации или после. Чтобы ответить на этот вопрос проследим за поведением донорного фрагмента в реципиентах, не способных к рекомбинации из-за мутации геоА70 . Наблюдете за фрагментом мы вели по способности им производить ß -галактозидазу в реципиентах, лишенных этого свойства из-за мутахши lac V z . Донор Hfr н передает нить ДНК, информационную для синтеза фермента, противонаправленный донор 'Hfr с - неинформационную (Kumar, Szybalski, 1969). Только достройка комплементарной нити без участия рекомбинации может объяснять обнаруженную в опытах способность фрагмента ДНК донора Hfr 0 проводить такой же по мощности синтез фермента в мерозиготах гесА70 , какой дают мерозиготы от донора Ufr Н . Это означает, что в норме однонитевой фрагмент до-норной ДНК в реципиенте быстро достраивается до двунитевой формы.

Однонитевая коныогавдя. Из данных, приведенных в предыдугцих разделах, ясно, что может возникнуть необычная ситуация, когда только одна нить доноркои ДНК окажется в реципиенте и должна будет ре-комбинировать с его ДНК. Этот необычный процесс направленной передачи ДНК, который по своим рекомбинационным последствиям должен скорее напоминать трансформацию, чем конъкгацию, мы назвали "одно-,

нитевая конъюгация". Все дальнейшие эксперименты, описываицие этот процесс, были выполнеш с двумя целяш: проследить качественное отличие "однонитевой конъюгации" от обычной и доказать ожидаешй од-нонитевой уровень рекомбинашш.

Ингибирующее действие экзонуклеаз I и У. Условия, при которых удалось получить трансформацию у е." coli, заключались, прежде всего, в дефектности двух деградацконных экзонуклеаз акцепторной клетки I и У. Повреждение первой (мутация в гене иЪсВ ) повышало выход трансформантов в 4 раза, а дополнительное повреждение второй (мутация в генах reo ВО ) - еще в 5 раз (Oishi, Coaloy, 1972; 1974). Трансформация у разных шкрооргшшзмов протекает на уровне однонитевой ДНК. Это, очевидно, справедливо и для е. coli (Fox, 1978; Buitenwert, Veneaa, 1978). Если однонитевая конъюгация'напоминает трансформацию, то и для нее следует ожидать той ке генетической детерминированности. И действительно, выход рекомбинантов в контрольном штамме ECK 018: <ina ВТ43 гес+ оказался подавленным на два порядка в непермиссивных условиях. У штамма ECK 016: dna ВТ43 гесВС~аЪсВ~ способность к образованию тех ке рекомбинантов при 42°С была в 15 раз выше.

Сравнение о генерализованной трансдукцией. Оценка масштаба генетической карты. При генерализованной трансдукции донорная ДНК в двунитевой форме интегрируется в хромосому реципиента (Sandri , Berger, 1980). Спрашивается, как изменится, коэффициенты сцепленно-сти (котрансдукции) маркеров, если трансдукцию проводить в условиях, соответствующих или однонитевой, или обычной (двунитевой) конъюгации. Результаты анализа представлены в табл.1. Коэффициенты сцеп- . ленности маркеров для однонитевой конъюгации оказались меньшими, чем дая двунитевой: yUi г, гyj^. Отметим такие, что сцеп-леяностп дом разных путей рекомбинации оказались равными x/t/i , Ht = júfy . Это показывает, что масатабы генетической карты в данной области хромосомы не только для обычной, но и для однонитевой конъюгации не зависят от пути рекомбинации.

Коэффициенты котрансдукции для Ree? -пути рекомбинации выше, чем для RccBCF -пути: U7 , >,«е , Бели"ины же котранс-

дукции в реципиентах dáu ВТ43 и dna+ при 42°С оказались одинаковыми: £/<- = ис . ит = M г • Это показывает, что I :етки dna ВТ43 не содержат каких-либо особенностей запрещающих прохождение дву-"

_ i2 - Таблица I

Коэффициенты сцепленности маркеров ara и leu при однонитевой конъюгации и генерализованной трансдукцил реципиентов dna ВГ43 И dna+ при 42°С. Донор - Hfr R4,

Рещгшиент Путь peKOi.. • бина-ции Генотип Сцепленности при

конъюгации трансдукции

и + У ara - leu /^leu+-ara

3GK 018 ЕСК 048 ЕСК 016 ЕСК 046 RocECP Reel1 dna ВТ43 dna+ dan B'j.43 rscEC'ebcí dna+ геоЗС- abol (1) 0,76 (2) 0,96 (5) 0,76 ' (4) 0,96 (5) 0,68 (6) 0,69 (7) 0,88 (8) 0,88

Величины^ определяли при анализе 500 клонов. Цифры в скобках используются в тексте как > yV2 ....

нитевых рекомбинационных процессов, и что в случае однонитевой конъюгации специфика процесса определяется лишь субстратом реком-бинацаонной реакции - однонитевой ДНК донора.

Теперь обратимся к сравнению масштабов генетических карт при однонитевой и обычной конъюгации. Для донора Hfr R4 в рассматриваемой области карты величина А при обычней конъюгации составляет 24 мин. Зная коэффициент сцепленностц (^V = 0,76) и расстояние ызаду маркерами ara - leu но карте (0,3+0,4 мин)' (Bachraan, Low, 1980). мы, используя формулу Холдейна, мояем вычислить параметр Я для однонитевой конъюгации. Он составил приблизительно I шш или 25 МД. Представленная оценка - максимальна. Таким образом, минимальное различие в масштабах карты для обычной и однонитевой конъюгации - 24 раза.

Особенности образования гетерогенного потомства. Рекомбинация при обычной конъюгации сопровождается образованием гзтерогенно-го потомства, что выражается в способнооти отдельных мерозигот вы-щеплять более одного рекомбинактного генотипа.

На рис.2 представлен возможный вариант образования смешанного потомства при однонитевой конъюгации. В данном случае гетероген- '

Р€К0МЬиН4Ц 1Я

¡коррекция

2

Рис.2. Схема образования гетерогенного потомства при одноните-вой конъюгации. I ДНК донора во взаимодействии с дву-нитевой ДНК реципиента; 2 - гетеродуплексная структура рекомбинанта; 3 - коррекция реципиентного аллеля селектируемого маркера; 4 - смешанное потомствй.

ность рекомбинантного клона целиком зависит от наличия стадии коррекции реципиентного аллеля селектируемого маркера к донорпому ал-лелю. Ясно видна одна особешюсть коррекциояного типа гетерогенности: мешанное потомство может состоять только из двух рекомбинант-ннх генотипов, т.е. степень сложности s должна стремиться к "О", тогда как при обычной'конъюгации она, как правило, 3/10.,

Клональный анализ экеконъюгантов на системе тесно сцепленных маркеров thr-ara-leu в скрещивании Hfr с х ECK 016 dim БТ43 госВС" oboB" (RecP-путь) показал следуацие параметры гетерогенности для клонов thr+ : = 23$, s = 10/27 при 37°0 и = 215?, S = I/2I при 42°(J. Изменение величины ' S от 1/2 (37°) до 0/14 (42°) зарегистрировано к для термочувствительных реципиентов ЕесВСР пути. Эти данные убедительно показывают, что однонитевая конъюгация на обоих путях рекомбинации характеризуется вшцеплением ожидаемого двойного набора генотипов в гетерогенном клоне. Это, очевидно, является результатом однонитевой интеграции донорной ДНК в хромосому решшнента.

Доказательство однонитевого уровня рекомбинации после однонитевой конъюгации. Попытки физико-химического анализа непосредственных продуктов рекомбинации, с?оль успешно зарекомендовавшего себя пря. изучении явления трансформации У Вас. subtilio (см.обзор ' Vox, 1978), генерализованной тран'сдукции у Salmonella íhyphiraurlun (Ebel-Tsipsia et al., 1972) и E.coti (Sandri, Berger, 1980),

- 14 - '

лри изучения конъюгации (Oppenheim, Kiiey, I966;siddiqi, Fox, 1973) следует признать неудачными. И причины этого вполне объективны. Размер ожидаемых фрагментов застройки донорной ДНК в хромосому реципиента при конъюгации слишком велик для анализа с помощью уль-трэцентркфуги. Он составляет от 30 до 700 Г.Щ. Поэтому мы остановились на генетических методах сопоставления результатов однокитевой и обычной (двунитевой) конъюгацпй.

Идею экспериментов иллюстрирует схема,-приведенная на рис.3. Мы уже упоминали, что противонаправленные доноры ( Hfr Н и Hfr С) передают разные нити донорной ДНК либо инфорглациспиу«, либо неинформационную для прочтения РНК-пслимеразой и. последующей наработки продукта данного гена. Ген tsz ответствен за синтез рецепторов к фагу Т'6. Схьма показывает, что только в случае однонитэвой рекомбинации при застройке неинформационной нити должна проявиться за-

держка в кинетике вмцепления фенотипа дция и была выявлена в эксперименте.

■tax"

Именно такая ситу-

D

Tsxs

рекомвинА-ция

рекомвиНА-ция

рскомбина-ЦИЯ

Tsx!

Ts;

репликАция d<

+

Рис.3. Схемы фенотшяческого выражения дозорного маркера tax в трансшгьгагонтах в случае: А. - когда реципиент застраивает обе нити донорной ДНК, В - когда реципиент застраивает одну информационную нить ДНК, С - застраивается только неинформационная нить. Доноршй аллель taxB показан черным кружком, рецкпиентный tnxr - полым кружком. Волнистая линия .отмечает информационную нить. Стрелка указывает I момент фенотипического выражения гена tax0 .

к

х

С

х

В принципе описанные эксперименты могут служить тестом для выяснения информативности нитей ДНК в пределах данного гена.

Возможности перехода от однонитевой конъюгации к обычной (дву-нитевой).

1. Конъюгация в условиях фенотипической супрессии мутации в гене dna В .

ВТ43 - термочувствительная мутация миссенс типа. Она способна к восстановлению функциональной активности продукта поврежденного гена при изменении ионной силы среда. Увеличивая концентрацию NaC1 в среде при непермпссивяых условиях, можно обнаружить восстановление активности продукта гена dna в (Ricard, Hirota, 1973). За этим можно проследить, анализируя способность клеток к образованию ре-комбинантов и к ведению синтеза ДНК, например, вегетативного синтеза. В подобном эксперименте нагл удалось проследить не только восстановление двух указанных свойств, но и наблюдать изменение параметров рекомбинации и Л от величин, характерных для однонитевой рекомбинации, до величин, ожидаемых при двунитевой рекомбинации.

2. Изменение гетерогенности потомства при температурном иоке реципиентов dna БТ43 в ходе конъюгации.

Идею экспериментов иллюстрирует схеш, представленные на рис.4..

Схем* А

_±_

a t

СхемдВ +

Т--Т-

■ Д .

"а ; г

СхемлС _+_

-+*"

рекомБиНАЦИЯ

Рекомьи-:

НАЦИЯ

РвКОМБИ-^ГГ НАЦИЯ +

сегрегация -ь

i ГАЦИЯ

Рис.4. Экспериментальные предсказания гетерогенное!., потомства окскснъюгантов dna втлз при трех температурных рехимах конъюгации, Схема Л - при 42и. Схема В - при 37и. Схема С -передача проксимального неселекткруеыого г,spite pa при 42°, а дпстального

селектируемого при 37°С.

+

±

+

+

а

Ь

Но это - идеализированные предсказания. В эксперименте, выполненном по схеме А, следует ожидать проявления ¡соррекцпонной гетерогенности. которую ш описывали выше. Е опыте но схеме В должна выявиться обычная гетерогенность. Наконец, 100/5 гетерогенность, пред-сглзываемол схемой Ciможет быть уменьшена 'за счет коррекциопних явлений.

Результаты эксперимента, систематизированные в табл.2, согласуются с предсказаниями схеш С.

Таблица 2

Anajms гетерогенности клонов dna+ по несе.текткруемаму паркеру lue , отобранных в скрешивании Hfr С х eck 018 dna БТ43 при разных температурных условиях конъюгации

Температура при конъюгации, в °0 N И' fdnaB+ - lac G В %

37 1193 525 0,44 19

5317 TI3 0,02 21,

42/37 1430 256 0,18 46

о.

н - число проанализированных кленов ¿па : ь - среди них реком-биншшшх по 1ао+ . а - доля секториальннх клоноз 1ао+/1ас~ среди рекомбинанткых (к1) , выявляемая на ЭМС- 1ас-агаре.

Итак, варьируя температурный режим конъюгацииоказалось возможным переключать одконитевую конъюгацию на двунитевую и наоборот.

Заключение - Ни начали с описания методического приема, по-зволягадего селективно выделить коньгагационшш синтез ДНК. Использование этого приема позволило нам продемонстрировать наличие специального синтеза ДКК, сопутствующего конъюгации как в доноре, так и в реципиенте. Последний оказалось возмо.чшм запретить о помощью мутации ВТ43 в гене йпа в . Это привело к необычной конъюгации, названной нами "однонитевой", которая характеризовалась: I) резким увеличением частоты рекопбинационных обменов па единицу длшш ДНК; 2} обедненностьго гетерогенного потомства зкскснъюгантов, легко объясняемой однонитевш уровнем рекомбинации мезду еднонлтевнм фрагментом ДШС-донора и хромосомой реципиента; 3) резким усилением вы-

хода рекомбинантов, когда в мерозиготах отсутствовали деградацион-ше зкзонуклеаоы клетки. Все это аналогично рекембинациошштл событиям при трансформации у тз. coli.

Затем привели генетические доказательства ожидаемого одно-нитевого уровня рекомбинации после однонитевой конъюгацииИз экспериментов с генерализованной трансдукцией ясно следовало, что термочувствительные реципиенты йпа ВГ43 способны проводить как одно-нитевые, так и даунитевые рекомбинационяне застройки, т.е. они не являются рекомбинедионно дефектные. Все зависит о» субстрата ре. комбинационней реакции - одно- или двунитевой донорней ДНК. Логично заключить, что при обычной конъюгации, когда донорная ДНК еще до стадии рекомбинации достраивается до двунитевой формы, рекомбинация протекает на уровне двух нитей. В связи с обседаемым вопросом очень показательны эксперименты, демонстрирующие возможность переключения однонлтевой конъюгации на обычную. Переход к условиям фенотипическои супрессии мутации ВТ43 или переход от непершссив-ных к пермиссивным условиям открывает возможности для конъюгацион-ного синтеза ДНК в реципиенте, образования двунитевого фрагмента ДНК донора, проведения рекомбинации на обычном двунитевом уровне с параметрами рекомбинационной реакции, характерными .для обычной конъюгации.

Глава 4

■ САЙТСЖЩШЧЕСКИЙ ШкШР ОБЩЕЙ ЕЕКОМБИНАЩМ У Б. о oll

Сайты frs . До недавнего • времени казалось очевидным, что что гомологическая рекомбинация не может иметь на хромосоме в. coli областей, в которых процесс инициируется преимущественно, т.е. она не может иметь горячих точек. Главным аргументом в пользу этого считалась возможность наблюдать внутригешше рекомбинациошшо обмены вплоть до единичных нуклеотидов. И действительно, такой строгой организации процесса, с какой мы сталкиваемся в случае сайтспецифи-ческой интегратнвной рекомбинации фага А (асимметрия сайтов узнавания, наличие узнакцего белка и т.д.) в сб.чей рекомбинации не обнаружено. Но, как во всяком процессе, основанном на белково-нукле-иновом взаимодействии, в рекомбинации отдельные ну1-1еотидннв послс-! доЕателыюсти могут обладать преныу* "ством во взаимодействии с фор-

- 18 - '

ментом либо из-за структурных элементов узнавания в них заключенных (палиндромы, шпильки), либо из-за преимущественной деспирализа-ции и, следовательно, более быстрого связывания с инициирующим белком.

В последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о существовании горячих точек рекомбинации на хромосоме е. coli • Это относится, прежде всего, к так называемым сайтам chi (обзор stahl, 1979) для гесБС -ыуклеаэы, выступающей в роли одной из'авдонукле-аз рекомбинации. Это относится и к вариациям эффективности интеграции различных маркеров в хромосому Е. coli ври генерализованной трансакции (Shendel, 1977; Newman, Masters, 1980).

В настоящей работе мы опишем сайты fre (от frequent recombination exchange) , обнаруживаемые поме конъюгации на хромосоме Е. colino их способности увеличивать частоту рекомбинэционкых обменов hp единицу длины ДНК в области локализации сайта и,чи группы сайтов. Поэтому мы и начнем с анализа постконъктгацконной рекомбинации. Затем мы привлечем к рассмотрению явления, которые по сути своей являются сайтспецифическими,- это рекомбиналиопные взаимодействия фактора F и хромосомы клетки в ходе мобилизации хромосомы и янтегративной супрессии. Наконец, рекомбинационнкй распад плаз- . ■ мед поможет нам выявить локализацию некоторых сайтов fre .

Масштаб генетической карты на разных путях рекомбинации. Если рекомбинационше обмены равновероятны в любой точке хромосомы Е. coli, то масштаб карты Л , определлкщих среднее расстояние между соседними обменами, должен быть величиной постоянной. Попытки измерить масштаб карты при постконъюгационной рекомбинации предпринимались неоднократно. Он оказывался Б мин (Еакоб, Вольман, 1962), 10 мин(Verhoef, DeHaan, 1966; Wu 1967), 20 мин (Wood, Y/alrasly, IS69). В чем se причина непостоянства параметра X \ в несовершенстве измерений или неравномерности распределения рекомбинационных обменов' вдоль рекомбинирующих xpoi/tocoi.1? Поиск ответа на этот вопрос и привел нас к обнаружению "горячих" областей рекомбинации на хромосоме е. coli . Однако, прсвде всего, оценим масштаб в области карты, лишенной каких-либо аномалий. Такую возможность дает нам донор Ufr R4 (см.рис.1) в области карты ргоЛ - argE . Параметр J оказался большим (24 мин) и одинаковым для RecBCF и песР -путей рекомбинации. '

Области хромосомы с повышенной частотой реконбиназщонних обменов. Локализация областей ¿ге I .и ?ге IX. Ноли для донора И4 зависимость коэффициента сцепленности селектируемого дистаиыюго маркера агвЕ+ с неселектлруемшли проксимальными С/О от расстояния мекду маркерами (1) 'носит ояидаешй экспоненциальный характер, то для донора НГг с ситуация совсем иная. Ее хорошо иллюстрирует рис .5, на котором зависимость « от 1 представлена для обоих доноров в форме удобной для графического определения масштаба Я

Рис.5. Зависимость коэффициента сцепленности ^ селектируемого arg Е с указанными неселектируемыш маркера!.« от расстояния между маркерами по карте Е. coli. Скрещивание доноров Hfr R4 . Ufr с и Hfr CAВ с реципиентом JC 7623 Reer -пути рекомбинации.

Для донора Hfr с масштаб Я перестает быть величиной постоянной (он оценен условно), частота рексмбпнациошшх обменов на еда-гашу длины ДНК возрастает, увеличиваясь по мере приближения к об* ласти 1нс - purE карты. В отличие от R4- этот донор передает некую генетичзскую область, ответственную за увеличение частоты рекомби-надиошых обменов. Назовем эту горячую область f re I , а ейфект пзмепенпя масштаба юрты при рекомбинации в этой области Pre о<ектом.

Рге-эффект наиболее ярко выражен на RecF .-пути (клетки гесВС вЪсВ") рекомбинации, заметен, хотя и слабо, на Кес-ВСР -пути (гео+) и подавлен на RecEC -пути(recF") . Область fre I обнаруживается в постконысгационной рекомбинации и с донором Ufr Н . . Л с помощью доноров я 4 , Р72 и R 25 (см.рис.1) удается локализовать и другую область fre II около гене® argE -ilv . Приблизительная локализа-' ция области fre Iii- между генами trp и hls.

1Ласшта0 Л в горячих областях fre I и fre II составляет I мин для RecF -пути и 5 мин для RecBCE-пути. Отсюда ясны причины различий величин масштабов карты, полученных разными авторш®.

О роли гена гесУ в рекомбинации. Если судить о роли данного гена в рекомбинации по изменению выхода рексмбпкантоЕ, то одиночная мутация гесР" никак себя не проявляет в постконъюгацион-. ной рекомбинации. По этому тесту она заметна только на RecF -цуги. Однако, - оли о рекомбинационной дефектности-судить по частоте обменов на единицу длины ДНК, то мутация recF" в реципиенте придает ему уникальные свойства. Такой реципиент ведет застройку фрагмента донорной ДНК целиком, производя рекомбинацмонные обмены по концам фрагмента. Сколько генетического материала передано донором при конъюгации - столько будет и застроено в хромосому рекомбинанта. Это следует из оценок коэффициентов сцепленности далеко отстоящих маркеров, полученных в скрещиваниях доноров 0R 11 , R 4 и Mi о реципиентом ECK 035 reo?"

Этот результат является первым указанием на существование гесР -зависимой эндонуклеазы рекомбинации.

Мобилизация хромосомы фактором F . Сайты fre и элементы IS.

Ш обратились к анализу явления хромосомной мобилизации в связи с изучением сайтспецифичеокого характера'общей рекомбинации не случайно. Дело в том, что области fre 1и fre II содержат скопления точек начала передачи хромосомы донорами Hfr (см.рпс.1), т.е. сайтов рекоыбинационкого взаимодействия между фактором F _ и , хромосомой е. coli . По современным представлениям такое взаимодействие происходит через элементы is 2 или is з , если оно гесл -зависимое, или через элемент fi , если оно гссА -независимое.

I. Генетическая детерминированность хромосомной мобилизации.

Эффективность мобилизации на Ree?-пути мы условно приняли за. IG0!?. Она оказалась столь высокой, что выход рекомбииантов, дава-

емый ею, сравним с выходом рекомбинантов от доноров Hfr . Этот, уровень мобилизации не зависит от целостности гена recL , но прямо зависит от целостности гена геоР . Второй по эффективности • уровень мобилизации меток дикого типа. Он в 50 раз ниже первого. В известной мере он зависит от целостности генов гесВС и recF , так как повреждение в них образует третий уровень (в 4*6 раз ниже второго). Наконец, четвертый базовый уровень образуют штаммы reel" Он на 4 порядка ниже первого. Итак, мы видам, что мобилизация и описанный выше Pre -эффект имеют,в принципе, одинаковую генетическую детерминированность: резкое усиление на НесЗ? -пути, ярко выраженную гесР -зависимость. Отметим, что речь вдет о мобилизации именно F -фактором, когда рекомбинация инициируется на is -элементах. Мобилизация, фактором I?' - lac, которая со всей очевидностью идет путем рекомбинации, между lac -фрагментом ДНК донора и гомологичным участком хромосомы реципиента, показывает совершенно иные результаты.

2. Карта мобилизации хромосомы Е, coli »

Чтобы уловить корреляцию между местами преимущественной мобп-' лизации хромосош фактором F и областями fre , ш сняли так называемые карты мобилизации для доноров RecP- и ReeBCP -путей рекомбинации клетки . Они оказались одинаковыми для доноров различных путей рекомбинации. Единственное различие, как и ожидалось, било в абсолютном масштабе: на Ree? -пути мобилизация на два порядка выше. Эффективности мобилизации изменялись более чем в 20 раз, принимая максимальное значение около маркера ilv и минимальное -около thyA , Карта демонстрирует по крайней мере две области по- • . вышенной мобилизации. Од^а совпадает с областями fre I и fre III , а' другая - с областью fre II.

■ 3. Модель мобилизации хромосомы фактором F .

Предлагаемая модель учитывает современные представления о механизмах конъпгацноиной передачи донорией ДНК и последующей рекомбинации, а таксе предстгшлсние, развитое Купевшл (1974), о том, что частота полухиазм должна брть значительно вероятнёе частоты хиазм. . ■ Взаимодействие ? -фактора с хромосомой происходят через IS «элвт» мент. Оно начинается п^гсем образования однонитевых _ гзрывов в ода-.' HdKOTJix сайтах р -Фактора и хромосомы, обеспечиваемых reo? -завь-спмой эддоку/леазоГ:. Переброска ДНК. на уровне одно», нити приводит ! к обраяс^ахш?" подухнеаш перекресх coiopoä .может мигрировать в

- 2 с -

пределах is-элеыента. В таком состоянии может начаться передача одной нити ДНК от сайга ori Т фактора F . Так как полухиазма нестабильна, з большинстве случаев ока ревертярует к первоначальному состоянии свободного F -фактора и хромосомы. В редких случаях по-' лухиазма переходит в полную хиазму с образованием стабильного Hfr ,

Интегративна'- супрессия на НесР-пути рекомбинации. Супрессия термочувствительности репликации за счет интеграции фактора Р в хромосому метки (т.е. постановка репликации клетки под контроль F -ренликона) вместе с мобилизацией хромосомы фактором F , являются примерами рекомбинационного взаимодействия г-фактора с-хромосомой. Достаточно очевидно, что оба явления должны иметь одинаковую генетическую детерминированность. Для подтверждения этого мы ограничились проверкой главного предсказания : интегративная супрессия долина резко усиливаться на ВеоР -пути рекомбинации. 1! действительно, на этом лиги супрессия возрастает з 20 раз.

Итак, во всех трех рассмотренных процессах (ностконьвгационная рекомбинация, мобилизация, пнтегративнал с^ттессия) достаточно сложная и идентичная генетическая детерминированность. Сайт-специфичность общей рекомбинации проявляется в инициировании процесса гипотетической recF -зависимой зндоиуклеазой на сайтах £ге , которые могут обнаруживаться в составе ïs-элементов клетки. Теперь мы опишем четвертую экспериментальную систему - распад плазмида, которая, обладая той же генетической детерминированностью, позволяет доказывать сайтспецифическую природу рекомбинации, в ней заключенной, и помогает локализовать сайты fre в горячих областях рекомбинации.

Рекомбинационная нестабильность плазмиды. переносящей область . fxe х. Плазмида 0RF-1 передает фрагмент хромосомы Е» coli, захватывающий всю область fra I или значительную часть ее в следующей последовательности маркеров:puтЕ+ - toxa - ргоС+ -1ао+. Эта плазмида .происходит от донора OR 11 , образовавшегося при интеграции р-фактора в хромосому через элемент 12 з (см.рис.1). Стабиль-' яоегь плазмида в исходном штамме ORF -1/ *f 517 обеспечивается за счет делении е хромосоме клетки всего фрагмента ДНК, заплаченного плаззддой в момент ее образования. Яопс, что яри переносе плазшды в метки с кеделетирсвашюГ: хромосомой, ее структура дэлдна дестабилизироваться за счет рекомбинации, обеспечиваемой протяженной гомологией плазгдцдной Д1ЕС к хромосомой клетки.

- 23 -

1. Рекомбинащюншй распад плазмида на RecBCF-иути.

Электрофоретический и генетический анализ продуктов распада

плазмпдн orp-1 после ее конъюгациояной передачи в реципиент ЛВП57 предполагает следующую схему распада: ону-1 (purE+ - tax° - сгос+ -lao+) F4" = pGK-1 (tax° - ргоС+» 1ао+).Распад происходит сайтспе-цифичеекп, т.е. пс строго определенным местам, часть генетического материала псходно": плазмида с маркером рагЕ+ теряется, образуется новая плазмида рСК-1 с мол.весом 85 +2 МД. Предполагается, что в ее вшцеплеппл принимает участие сайт fre 11 и элемент 13 3 Фактора F .

2. Рексмбшюдиоышй распад плазмида на RecF-пути.

Сочетание электрофореткческого и генетического анализов позволило установить следукщую схему сайтспецифаческого распада плг?.з:.г>!~ да 0RF-1 после передачи в реципиент JC 7623 :

■г 30%, рСК-2 (ргоС+ - 1ас+) + Hfr

ORP-1 v

-*> . рСК-2 +

В 90$ случаев F -фактор оказывается интегрированным в хромосому метки, маркер tnxa теряется, появляется йовая плазмида рПК-2 (мол.вес 54 +2 МД), которая является производной плазмидн рСК-!£. В 10% случаев, наряду со свободным фактором F , выявляется та ле плазмяда рСК-2, а маркер оказывается интегрированным в хро-

мосому метки. Для сбраэоваш!я плазмида рСК-2 необходим новый сайт fre 12, локализованный между генами ргоС и tох .

3. Участие элемента IS 3 в сайтспецифтическоь; распаде плазмида.

Распад плазмида ORF-1 , как правило, сопровождается вшцепле-

!шем фактора f . Последнее очевидно происходит по элементу IS 3, который, кш: мч указывали, использовался при образовании предшественника плазмида ОПР-1 , аггамма Hfr ол 11 . Чтобы доказать точ-ннй характер вуцеплешш фактора ? (и именно'по сайту IS з), ш сравнили рестрпкты F-фактора дикого типа и Р~факторов, внделен-пых из шта?.пов Р+ /pCK-I/АВ I1G7 и /рСК-2/ JC 7623 , после обработки ДШч ? -факторов эидонуглсазсй Вал НХ . Выбор отого фермента спродзляяся удобством расположения саПтов рестрикции на ДНК относительно элемента 13 3 . ''лектрофорегра'.ми реетриктов оказачись пденгг-гнш.ш.

Итак, fre I 1, frs 12и сайт в элементе IG 3 ~ сайты геоЛ п recí -зависимой рекомбинации, усиливающейся па р. ест? -пути.

Рекомбинацконная нестабильность плазмиды, переносящей область frell. Область fre II частично перекриьается плазмидоп í" 14 , структура которой тщательно исследована физическими методами. Плаз-шда-образовалась из штамма Hfr 313 , в котором Р -фактор застроен в хромосому клетки через элемент (Ohtsubo et al., 1974). Как и в случае с 0R2-1, относительная стабильность F'14 в исходном штамме GC 4 17 обеспечивается за счет делении в хромосоме клетки участка ДНК гомологичного бактериальной ДНК плазмиды.

Электрофореграмш плазмиднои ДНК, выделенной iiar.ni из транс-коныагантов Р' 14 с генотипом roo+, гесР~, reoP"abc В™ и гесВО" вЬсВ" , обнаруживают зону ДНК, соответствующую j? -фактору, а в исходном штамме GC 4 17 дополнительно зону, соответствующую плаз-шде РЧ4 . Это указывает не только на recA-незавнсимость вы-щепления фактора F , но и на независимость его исключения от пути рекомбпнации RecEC, НесР или RecECF . Принимая во внимание результаты с ORP-1 , можно заключить, что рекомбинационная нестабильность плазшцщ ï'14 не сопровождается выщеплением" дополнительных структур,способных к авторепликации.

Генетический анализ распада плазмиды РЧ4 позволяет нам локализовать еще одну из горячих точек рекомбинации - сайт fre II 1 г. и указать на наличие горячей точки (или точек) на факторе ^ , что, как и в случае с плазмидой ORF-1 , выражается в образовании стабильных Hfr . Горячие сайты абсолютно гесА и reel' зависимы и чрезвычайно активны именно на RecP -пути рекомбинации. Логично предположить, что горячими сайтами (¡актора Р являются элементы IS 2 и IS з .

Возможности устранения горячих точек рекомбинации. Эффекты сайтспецифической рекомбпнации резко усиливаются на RecF -пути, лишенном двух деградационных нуклеаз (I ¡iï), хотя и заметны на ReoBCP пути. Отсюда ясно',' что эти нуклеазы (особенно гесВС -нуклеаза, об-ладапцая среда прочих и однонитевоп эвдонуклеазной активностью) способны кнтибировать Pre -эффект. Оказалось, что для выявления , плазмидного Pre -эффекта (утраты фрагмента ДНК с геиоа tsx при конъюгационнон передаче плазмиды ORP-1 ) достаточно инакити-роиать гэс1„ -пулеазу. Воздейстнке гесЕС -нук^евзн на сайты fi'S E"u • согед1ше о tuu области ДНК,вероятно, лриводит к инактивации это-10 cJi"a. I.'u yi.TOHOJ'.u.iH, что (:опъпг:и:ион:;ое пролус.чмт.е всей хпс:,;о-

' с or,tu донора Hf г С через клетку-реципиент RecBCF , но не Reef , пути рекомбинации существенно модифицирует хромосому донора, снижая ее потенции к гесА -зависимой гомологической рекомбинации. Это хорошо видно па рис.5, где масштаб карты _Д для донора Hfr CAB ( Hfr С , пропущенный через AB 1157) существенно увеличен да?.е по сравнению с масштабом Л для донора Hfr Н 4 , лишенного горячих точек рекомбинации в области argE - pro А.

Попытаемся представить себе ситуацию устранения сайта fro с помощью гесВС -нуклеазы. Гипотетическая схема содержит одно предположение: сайты fre должны содержать в своей структуре палиндромы. Тогда в момент вхождения одцонйтевой донорной ДНК в реципиент эти сайты, временно принимая шпилечную структуру, могут легко атаковаться однонитевой эндонуклеагой гесВС . Последующая деградация ДНК модифицирует сайт, делая его неузнаваемым для геоР -зависимой эццонуклеазы.

Заключение. Отправной точкой наших исследований было измерение масштаба генетической карты при постконъюгационной рекомбина- • ции. Проведя сравнение физической и генетической карт хромосомы . Е. coli, ш установили следующее: I) масштаб карты зависит от области ДНК, передаваемой донором при конъюгации; в зависимости от -того, какая область хромосомы принимает участие в рекомбинации, масштаб .монет варьировать от 24 мин (при 100 мин карте е. coli ) до I мин (горячая область хромосомы); 2) масштаб карты зависит и от конкретного штампа донора, так так оказалось возможным искусственно создавать штаммы, инертные в инициировании рекомбинационных обменов. Это же доказывает, что инициирование рекомбинации после конъюгации происходят на. донорной ДНК; 3) масштаб карты зависит от реципиента, точнее генотипа реципиента, определяющего Нес -систему рекомбинации, в рамках которой протекает застройка донорной ДНК в хромосому клетки.

Далее мы привлекли к рассмотрению три экспериментальные системы аддитнвно-экецпзнонной рекомбинации: мобилизацию хромосомы фактором р , интегратнвнуг) супрессию, рекомбинационный распад шгаз-ыид. Особенностью первых двух является то, что рекомбинация в них протекает за счет йес -системы донора. Преяде всего,мы показали, что процесс рекомбинации в этих необычных экспериментальных системах подчиняется закономерностям Ree -системы общей рекомбинации.

Затем, используя особенности каждой системы, ш установили связь между горячими сайтами fre и IS-элементами (конкретнее 13 2 и IS 3 -элементами) и локализовали три сайта ire I 1, freI2 и fre II 1 в горячих областях хромосош fre I и fre II, соответственно.

Теперь обратился к генетической детерминированности сайтспеци-фических рекомбинационных собптий. В постконъюгациоиных мерозиготах гесР" п1)актически не происходит рекомбинационных разрывов в донор-ной ДНК.

Иная ситуация наблвдается в мерозиготах гесБС"вЪоБ" . Здесь рекомбинация инициируется в середине хромосомы в горячих областях, названных fre I, fre II и fre III . Масштаб J в них в 20 раз меньше среднего, т.е. частота рекомбинационных обменов очень высокая. Поэтому генетический материал из этих областей часто выпадает при рекомбинации. Этот процесс особенно наглядно можно наблодать на длинном F' , переносящем фрагмент хромосомы с горячей областью fro I. Такой Р' оказывается чрезвычайно нестабильным, подвергаясь гесА-зависимому рекомиинационному распаду на фрагменты, в клетках recBC"sbcB" , более стабилен в клетках гес+ .и абсолютно стабилен в клетках recBC~8bcB~recP~ шш одиночных мутантах гесР"

Отсюда мы заключаем, что продукт гена гесР прямо участвует в сайтспецифической гесА-зависимой рекомбинации.

Что же происходит в {слетках дикого типа? Очевидно первичные разрывы донорной ДНК инициируются той же гесР -зависимой эндонукле-азой, но затем онн интенсивно деградируют с концов под действием экзонуклеаз У и I. В результате в хромосому реципиента интегрируются саше разные фрагменты донорной ДНК, распределенные по закону случая (распределите длин по Пуассону), и эффекты горячих точек оказываются смазанными.

Учитывая вышеизложенное, на наш взгляд, правильнее говорить о реализации чистого'' RecBC -пути в клетках гесР игесР~вЪсВ" , чистого RecP-пути, как и прежде, в клетках гесВС~аЬоВ~ и комбинированного ReaBCP -пути в клетках дикого типа. Биологический смысл i различных путей в различии деятельности эндоцуклеаз (гесВС -нуклеазы и гесР зависимой эндонуклеазы), их определяющих. RecBC -нуклеаза .инициирует рекомс..шацию по сайтам chl , весьма геспо расположенным на хромосоме E.coli , recF-зависимая - по сайтам fre , разбросан' io¡;.j па хромосоме и груинирупдимся в отделышх областях ее. Б отли-

чие от сайтов fre , сайты chi обнаруживаются только при анализе сиотеш тесно сцепленных маркеров и причем при рекомбинации ДНК фагов Л за счет Reo-системы хозяйской клетки. В постконъюгацяошгой рекомбинации сайты chi пока не обнаружены. Можно предложить по крайней мере два объяснения этого факта. Первое СОСТОИТ В ТОМ, что геевс -нуклеаза - концевая, поэтому хотя ее воздействие на ДНК и происходит через сайты chi , по место рекомбинацпонного обмена в конечном счете определяет положение когща фрагмента донорпсй ДНК, Второе объяснение предполагает предусмотренную меткой защиту бактериальной, в отличие от фаговой, ДНК белком от действия нуклеаз клетки, в том числе и гесБО -пуклеазы.

Глава 5

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ЕЕКОЖШАЩЮННЫЕ СТРУКТУРУ И ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОТОМСТВА ЭКСКОНЬЮГАНТОВ

О гетерогенности потомства эксконъдгантов. Это лвле1ше заключаете,! в способности эксконъюганта _ выщепля'ть с'ояее одного генотипа рекомбинантов. Оно имеет более чем 20-летнюю историю своего изу " -ния. Не менее шести моделей было выдвинуто для его объяснения. Такой постоянный интерес к данному явлению связан с надеждами раскрыть мехшшзм рекомбинации через генетический анализ гетерогенности коныогационннх мерозигот, так как нет сомнений в том, что дичина гетерогенности заключена в характере самого рекембинационного процесса.

Современные представления о механизмах реализации гетерогенных событий после конъюгации можно представить в виде следущей ниже схемы, из которой видно, что к числу небанальных механизмов мы относим два: независимого решшкона и тандемной'застройки. Оба механизма едины в о,дном: требовании кольцевания фрагмента донорной ДНК, способного защитить ДНК от действия деградационных акзонуклеаз. Кольцевание вошедшей в реципиент донорной ДНК должно протекать по законам обычной гесА -зависимой рекомбинации, т.е. оно нуждается в областях гомологии, рассредоточетшх по хромосоме в. coli . Такимй областями могут быть сайты fro .

- 23 -Гетерогенность

Банальная

(только двойные наборы генотипов в клоне)

у

За счет рекомби- За счет одно-нации с реплика- нитевой реком-тивной вилкой .бинации хромосомы реципиента

Небанальная

(двойные и более сложные наборы генотипов в клоне)

Протекает через образование промежуточных продуктов рекомбинации - кольцевых структур ДНК

Кольцо образует самостоятельный решшкон

За счет репликона ? -фактора

За счет включения в кольцо

гдного из

репликации клетки

Кольцо интегрируется в хромосому, образуя область таццемной дупликации материала, реплицируется вместе с ней и постепенно вшцепля-ет разнообразное по генотипу потомство

Демонстрация явления гетерогенности на большом статистическом датериале. Клоналышй анатаз 400 клонов hia+atrr , отобранных в скрещивании Hfr н х РА 309, по "двум неселектируемым маркерам ■trp и leu выявил существенную долю гетерогенных клонов (G бо-юо = 31$) при значительной степени сложности событий гетерогенности ( 3 = 28/125).

Гетерогенность потомства эксконъюганта связана с поддержанием его меродиплоидного состояния. Интересующая нас небанальная гетерогенность (s^ 0) обеспечивается рядом независимых и разделенных во времени актов рекомбинации. Это доказывают следущие эксперименты: I) галлоидизацйя одного из маркеров в ходе постконъпгационной рекомбинации не означает того se для других; 2) гетерогенность потомства обнаруживается и после начала деления эксконъюгантов; 3)"радиоактивное самоубийство" фрагмента донорной ДНК (за счет рас-ладов внедрившихся в ДНК атомов Р) не препятствует образованию гетерогенно:о потомства, если трансконъюгант совершил первые деления. Теперь естественно задаться вопросе..!, каково время жизни пост-ко1пл?ациошшх мерозигот, обеспечивающих гетерогенность потомства , эксконъюгантов.

Закономерность распада меродиплоддного состояния зкско1гыоганта. Клоналышн анализ каадого гетерогенного клона позволяет определить соотношение меяду обоими аллелями несслектируемого маркера. Статистический анализ мнокества гетерогенных клопов дает возможность построить функцию их распределения по соотношению обоих аллелей. Она представлена на рис.5 как результат анализа 363 смешанных кленов, отобранных из разных скрещиваний.

Рис.6. Функция распределения

соотношения двух аллелей в' смешанных клонах: на - число гетерогенных клонов:

р - логарифм отношения генотипов в смешанном клоне.

1 - скрещивание Hfr н х РА 309;

2 - скрещивания доноров Hfr н

и Hfr с с реципиентом АВ 712 и его производными.

По оси ординат на рис.6 отложено число смешанных клонов с дакньм соотношением аллелей, а по оси абсцисс - логарифм этого отношения. Использовгише логарифмического масштаба связало с тем, что именно логарифм этого отношения по основании 2 дает число делений первого рекомбиианта к моменту вщэпленпя второго, т.е. Показывает время существования ыерозиготы. Описываемое распределение езтотрично. Это естественный результат равной вероятности интеграции в хромосому рекембинанта донорпого и рецштпентнего аллелей. Максимум распределения приходятся на первое деление рекомбипаитов, а затем функция убывает омпоненднально. Убывание функции в е раз соответствует ~ 3 периодам долента ро.чомбипантоп.

- ои - •

Роль доноров и реципиентов в ооразовании гетерогенного потомства. Чтобы ответить на эти вопросы, ш проанализировали гетерогенность потомства, образующегося при скрещивании 4 доноров (два из которых Hfr н и KL 99 передают ДНК по часовой стрелке, а два других - Hfr с н kl 19 - против) и 3 реципиентов (один из которых, AB 712, оказался штаммом обычным по свойствам гетерогенности, а два других - PC 0212 и ECK 022 - необычными). Выбранные для анализа маркеры были рассредоточены по всей хромосоме Е. coli, так что данные доноры могли передать фрагментами почти всю хромосому е. coli (см.рис.1). Результаты клонального анализа суммированы в табл.3.

Таблица 3

Гетерогенность потомства эксконъюгантов

Скрещивание Донорные маркеры Гетерогенность6

й селек- неселек- о S

Hfr X P*" тивный тивные . 10

I Hfr Н x PC 0212 gal+ thr pro 29 2/22

2 Hfr Н x PC 0212 trp+ thr pro 36 0/9

3+4 Hfr С x PC 0212 ade+ pro thr 38 5/26 ■

S+6+7 KL 16 x PC 0212 trp+ tyr his 66 17/51

&+9+I0 Kb 99 x PC 0212 tyr+ trp hie 24 3/19

II ' Hfr С x AB 712 xyl+ thr pro 31 10/22

12+13 Hfr H x ECK 022 trp+ thr pro 10 2/16

14+16 Hfr С x ECK 022 ade+ pro thr 5 0/3

16 Hfr С x ECK 022 ilv+ pro thr 9 0/9

17+18+19 EL 16 x ECK 022 trp+ tyr his 46 6/37

20 KL 99 .x ECK 022 tyr* trp his 44 I/I5

Донор нгг с в скрещивании с реципиентом АВ 712 показывает большую и разнообразную гетерогенность, не уступающую величинам 0 и' я для донора нгг н в скрещиваниях с реципиентами РА 309 (см. выше). Тот ле нгг С показывает большую, "но менее разнообразную гетерогенность для реципиента РС 0212 г слабую для штамма ЕСК 022. Интересно, что донор нгг н такке показывает подобные результаты. И с этими ко реципиентами другие доноры кь 16 и К1 99 , перс-

дагацие другие области хромосомы Е. coli , показывают высокие величины G .

Итак, мы столкнулись с ситуацией, когда уровень гетерогенности экскоггыагангов определяется как донором, так и реципиентом. ?!о;гло заключить, что для оценки гетерогенности чрезвычайно важна область ДРК е. coli, передаваемая донором в реципиент.

Реципиенты PC G2I2 и особенно производный от него ECK 022, отобранный как трансконъигант gal+ в скрещивании Hfr С х PC 0212, демонстрируют аномальные параметры гетерогенности. 1Лы не стали анализировать природу повреждений геномов штаммов PC 0212 и ECK 022, но мы поняли, что, во-первых, рекомбянационше мутации в геноме реципиента должны существенно влиять на уровень гетерогеггяости их потомства, и, во-вторых, следует отыскать фундаментальный параметр, характеризующий интенсивность рекомбинацпонного процесса в любом случайном реципиенте. Таким параметром оказался коэффициент сцеп-ленности маркеров " или вытекающий из него масштаб генетической карты /( , отражающие частоту рекоглбинационпых обменов на единицу длины ДНК.

Зависимость мезду долей гетерогенных клонов и коэффициентом сцепленкости паркеров. Эта зависимость обратно пропорциональна. Максимум функции <*(/" ) достигается при у* =0,5 (абсолютная не-сцепленнооть маркеров) и величина и —" Ü, при v —I (нолная сцепленпость). Прямая построена на основе 15 скрещиваний с участием доноров типа Ufr К и Hfr С и реципиентннх штаммов KS 23 ^ а также производных штамма AB 712.

Во всех до сих пор проведенных экспериментах нам ни разу не удалось наблюдать отклонения от найденной корреляции: чем више частота рзкомбннацлоняых обменов, тем выше уровень гетерогенных событий. Таким образом, измерив только параметрам , модно оценить ожидаемый уровень гетерогенности ¡слонов в данном скрещивании.

Выбор модели рекомбинации, учитывающий возможность образова-гшя гетерогенного потомства зкеконъюгантов. Б этог.т разделе анализируются данные, позволяющие из четырех возможных моделей небанальной гетерогенности (модели "истощения фрагмента", "концевых избыточностей"(Hopwood,' 1967), "независимого репликона'', "тан-дешой застройки" (рис.7)) отобрать для дальнейшего рассмотрения две последние.

Модель тавдешой застройки содержит уникальное экспериментальное предсказание. В ней первый кроссинговер предопределяет ограниченное число возможностей второго или, другими словами, набор ре-комбинантчых генотипов, выщеплящихся в данной ыерозиготе, предопределен местом синапсиса кольцевого фрагмента донора с хромосомой реципиента. Анализ событий гетерогенности на системе четырех тесно сцепленных маркеров, три из которых принадлежат профагу ¿80: с40--am32-h , а четвертый бактериям (trp) , показывает согласие экспериментальных данных с указанным предсказанием. Но это согласие носит лишь качественный характер. Далее на примере частичного ди-плоида у 137 Ех2-штамш, у которого в диплоидном состоянии постоянно находится до Ъ% генома в области ara - proAB карты Е. coli , доказана принципиальная возможность реализации модели тандемной застройки. Этот дипловд был отобран Кертисом, который измерил и величины его спонтанной и УФ-ивдуцируемой гаплоидизацип (Curtisa, 19Б8). Анализ этих данных и убедил нас в том, что диплоид существует и размножается как тандемно душшцированная структура.

Модель независимого репликона также имеет уникальное экспериментальное предсказание (lotan et al., 1972; ал.рис.8). Если первичную селекцию рекомбинантных клонов проводить по редкому событию,' то вероятность образования гетерогенного клона будет мала, так как она определится произведением вероятностей двух независимых редких рекомбинационных событий. Авторы цитированной работы проверили это предсказание на одной системе маркеров (см.рис.8: а - lacZ , в -laoY . с - phoR )• Результаты оказались в хорошем согласии с моделью независимого репликона.

Убедительная простота данного доказательства заставила нас провести дополнительные исследования на пяти различных экспериментальных системах с участием доноров Hfr с и Hfr н в другой об. ласти карты е. coli thr-carA-ara-leu-proA . Результат оказался обратным ожидаемому: уникальное предсказание для выбранных нами экспериментальных систем не выполнялось. Отсэда можно было заклю-> чить, что если модель независимого репликона и верна, то лишь в определенных областях хромосомы. Недавние результаты, полученные в нашей лаборатории, указывают на наличие в области 1ас-ргоС , с которой работали Лотан и др., нового ori репликации, активность которого зависит от наличия фактора F .

*-6 6Л

к-П э '

\

А Б 6 -Т-1—Г

Рис.7. Схема рекомбинации между хромосомой реципиента (маркеры А, Б, В, Г, Д) и фрагментом ДИК донора (маркеры а,-б, в, г, д) путем тандемнои застройки и вшцепления избыточной ДНК. I - йрагкент замыкается в кольцо и взаимодействует с хромосомой в области Б-В; 2 - первый кроссинговер-застройкя; 3 - последовательность маркеров в тандеме (такая структура способна размножаться);

4 - второй кроссинговеп - внпетливанле избытка ДНК п области В-Г;

5 - рекомбинантная хромосома и кольцо избыточной ДНК.

репликА— Ц'« _£

( \

выщепле-ние

а

а+

тг

РСПЛИКА- +6

ция а +

Вышеп-лени.у

-I V.

ТЕ-

++

+

с

а+

+

с

Рис.8. Варианты рокомбпнационпих событий (А и В), приводящих к гетерогенности по модели независимого рептасона.

Сплошная линия ~ двунитевгя ДНК донора (по стрелкой) и реципиента; , а/+, в/+, сА - иллельные маркеры. Штриховая линия показывает путь рекомблнзционных ОбМЭНОЕ .

Генетическая детерминированность гетерогенности эксконъиган-тов. Роль сайтов fre . Гетерогенность значительно усиливается на RecP -пути по сравнению с йесВСР-путем и отсутствует на RecBC -пути. Иными словами, гетерогенность усиливается на пути рекомбинации, в котором рекомбинация инициируется на сайтах fre , и подавлена, когдагеоР -зависимая эндонуклеаза, воздействующая на эти сайты, не активна. Напомним также, что удаление сайтов fre из хромосомы донора Hfr с (штамм САЕ-5) существенно повышает коэффициент и для постконъюгационной рекомбинации с участием этого донора и, следовательно, понижает величину G

Кинетика рекомбинации на RecBCP и Reeg -путях. Ллойд и Джонсон, используя мутант гесЛ 200 3 , позволяющий обратимо инги-бировать рекомбинацию в непермиссивных условиях, показали, что на RecECF-пути интеграция фрагмента допорной ДНК после конъюгации длится 90 мин при 35°С, кинетика его деградации в непермиссивных условиях (42°С) - быстрая (Lloyd, Johnson, 1979). Мы подтвердили эти данные на примере мутанта recA 44to и показали, что на RecF -пути кинетика интеграции фрагмента при 35°С чрезвычайно замедленная (процесс заканчивается только к 14 ч постконъюгационного периода), и кинетика его деградации при 42°С также очень замедленна.

Промежуточные рекомбинантные структуры донорной ДНК в постконъюгационной мерозиготе. Результаты, описанные в предыдущем разделелегли в основу эксперимента, позволяющего проследить за . кинетикой образования промежуточных рекомбинантных структур, не. чувствительных к действию геевс -нуклеазы. В эксперименте создавали ситуацию перехода эксконъюгантов с RecF на RecBCF -путь с помощью введения в них шгазыиды 1"15 , содержащей гены активно действующей гесво-нуклеазы. Одновременно с введением плазмида на I ч повыпали температуру до 42°С, создавая условия активной деградации донорного фрагмента, не успевшего рекомбинировать и стать устойчивым. По сути дела,мы зондировали состояние фрагмента в различные моменты времени после конъюгации. Результаты показывают, что ужо к 30-Й минуте после конъюгации фрагмент ДНК становится не чув-i ствителен к деградационному действию геевс -нуклеазы. Новое состояние фрагмента возникает гесА -зависимо.

Наиболее правдоподобное объяснение этих данных заключается в наличии стадии рекомбинации, преобразугацей фрагмент донора в коль- ( цевую структуру.

Радиоавтография кольцевых промежуточных рекомбинантшх структур. Кольцевые структуры донорной ДНК были выделены из мерозигот ИесР -пути рекомбинации. Гистограмма, представленная на рис.9, показывает длины 98 найденных колец. Длины находятся в согласии с ожидаемыми по. генетическому анализу.

N

ю ■

л

60

100

Л.

НЛП

200

250

Рис.9. Распределение кольцевых структур ДНК по длинам ь , И- число найденных образцов данной длины.

Шаг гистограммы - ГО/'-

Заключение. Б основе явления гетерогенности лежит способность эксконъюгантов в течение ограниченного ряда поколений размножать свое меродиллоидное состояние. Установлено, что явление гетерогенности свойственно не одному исключительному донору, а постконыога-ционному рекомбинационному процессу в целом. Оно зависит как от донора, так и от реципиента. Зависимость от донора выражается в конкретной области ДНК, которую он проксимально передает при конъюгации, а точнее, в наличии в передаваемой ДИК горячих точек рекомбинации -сайтов £ге . Реципиент определяет собой рекомбинапионше способности мерозиготы, и ото, в первую очередь, выражается в эффективности работы йео-системн клетки (пути рекомбинации, гоо-мутации). Найден параметр, характеризующий эти способности - коэффщиент сцеп-

5

I - 36 -

ленности маркеров, который прямо связан с величиной g

Понимание закономерностей поддержания меродиплоидного состояния эксконъюганта привело нас к формулированию модели посткснъюга-ционной рекшбинации посредством тандемной застройки донорной ДНК в хромосому реципиента. Принципиальная возможность такой ситуации следует из существования тандемно дуплицированных структур в стабильных ыеродиллоидных штаммах е. coli.

Модель тандемной застройки требует существования промежуточной рекомбинантной структуры - кольца донорной ДНК. Замыкание фрагмента донорной ДНК в кольцо способно предохранить донорный материал от действия деградационных экзонуклеаз реципиентной клетки. Именно такие структуры были выявлены на Ree? -пути рекомбинации, на котором рекомбинационный процесс протекает чрезвычайно замедленно. Для этого пути характерна и повышенная гетерогенность потомства эксконъю-гантов. (

Таким образом, генетическая рекомбинация после конъюгации, инициируясь на донорной ДНК (сайтах fre ) с помощью гесР -зависимой эндонуклеазы, протекает путем образования промежуточных рекоы-бинантных структур (колец донорной ДНК), взаимодействие которых с реципиентной хромосомой может приводить к созданию временных тандемно дуплицированных областей ДНК в мерозиготе.

ВЫВОДЫ

1. Процесс передачи донорной ДНК в реципиентпую клетку при конъюгации сопровождается двумя синтезами ДНК, в доноре и реципиенте. Конъюгациошшй синтез ДНК в реципиенте достраивает передаваемую донором одноштевую ДНК до двунитевой формы. Этот синтез находится под контролем гена йлаВ.

2. Мутация BT43 в гене dnaB ингибпрует конъюгационный синтез ДНК в реципиенте, что приводит к необычному процессу постконъю-гацнонной рекомбинации на уровне одной нити ДНК. Этот процесс был

J назван однонитевой конъюгацией.

По своим генетическим характеристикам он резко отличается от обычной конъюгации: а) сильным увеличением частоты рекомбинационных обменов на единицу длины ДНК, б) обедненностью гетерогенного потомства эксконъюгантов.допускахщей объясните этого явления; за счет

коррекции неспаренных оснований, в) значительным увеличением выхода рекомбинантов, когда в конъюгациошшх мерозиготах отсутствуют деградационные экзонуклеазн клетки. Однонитевая конъюгация скорее схояа с трансформацией, чем с обычной конъюгацией.

3. Сравнение генетических параметров однснитевой и обычной конъюгации позволяет пам утверэдать, что рекомбинация после обычной конъюгации протечет на уровне двунитевой ДИК.

4. Ree-система общей рекомбинации со свойственными ей особенностями так называеглых путей рекомбинации, Ее с ВС -пути (клетки ГесР~ И гесР~вЬсВ~ ), RecF -пути (recBC~sbcB~ ) и смешанного RgcBOF -пути (гес+) , успешно функционирует и в необычных рекомбиняционных процессах, приводящих к мобилизации хромосомы футором т , интег-ративной супрессии и распаду плазмид.

Б. Процесс общей рекомбинации в известной мере сайт-специфичен. Он инициируется преимущественно на так называемых сайтах fre Сайты группируются в отдельных местах хромосош е. coli . Это создает обнаруживаемые при рекомбинацпопном анализе "горячие" области рекомбинации: fre I (область lac - purE карты Е. coli ), fre II (область argE - ilv карты). Сайты fre могут входить в состав элементов is 2 и is з хромосош клетки.

6. Рекомбинация, инициирующаяся на сайтах fre , ярко проявляется на RecF-пути, заметна па RecECF-путп и абсолютно подавлена на RecBC-пути. Последнее приводит к парадоксальной ситуации, когда рекомбинапдонше обмены реализуются только по краям фрагмента донор-ной ДНК, переданного в реципиент в ходе конъюгации. В этом случае обмены,очевидно, происходят за счет концевой гесВС -нуклеазн. Отсутствие "внутренних" обменов поедполагает существование геср -зависимой эндонуклеазы рекомбинации.

7. Сайты fra не требуэтея дал глзнеспособности клетки. Они могут быть удалены из хромосош донора. Это приводит к снижению частоты рекомбинацкошшх обменов и доказывает, что racF-зависимая рекомбинация после конъюгации инициируется именно на донорной ДНК. Если сайты fre имеют сходную структуру, то в рассматриваемой ситуации мояно предсказать их взаимодействие друг с другом, что приведет к кольцеванию фрагмента донорной ДНК.

8. Особенностью RecF-пути является замедле!шал кинетика застройки фрагмента донорной ДНК. Это связано с существованием проме-

жуточных рекомбинантных структур, выявляемых радиоавтографией как кольцевые фрагменты донорной ДНК.

9. Существование промежуточных кольцевых рекомбинантных струк-■ тур позволяет объяснить одно из самых загадочных явлений рекомбинации после конъюгации - гетерогенность потомства эксконъюганта. Кольцо фрагмента донорной ДНК может в течение длительного времени неоднократно рекомбинировать или размножаться вместе с хромосомой в состоянии тандемной дупликации, завершая рекомбинацию выщеплением разнообразного по генотипам потомства.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bresler S.E., Lanzov V.A., Blinkova A.A. Mechanism of genetic

recombination during bacterial conjugation of Escherichia coli K-12.

I. Heterogeneity of the progeny of conjugated cells. Genetics. 1967. v.56, p. 105 - 116. с '

2. Bresler S.E., Lanzov V.A. Mechanism of genetic recombination during bacterial conjugation of Escherichia coli K-12. II. Incorportu. tion of the donor ША fragment into recombinant chromosome. Genetica, 1967, v.56, p. 117- 124.

3.Bresler S.E., Lanzov V.A., Lukjaniec-Blinkova A.A. On the.mechs nism of conjugation in Escherichia coli K-12. Mol.Gen.Genst., 1968, v.102, p.269 - 284.

4. Бреслер.C.E., Ланцов В.А., Дукьянец-Блинкова A.A. О механизме конъюгации у Escherichia coll K-12 - Труды ХУ научной конференции ИБС АН СССР. Л.: Наука, 1970, с.247-250.

5. Бреслер С.Е., Ланцов В.А., Манукян Л.Р. Механизм генетической рекомбинации при конъюгации бактерий. Ш. Клональный анализ ' гетерогенного потомства эксконъпгантов на системе близко располо- • женншс друг от друга маркеров. - Генетика, 1970, т.6, Jfc 8, с.116-134,

6. Бреслер С.Е., Ланцов В.А., Лукьянец-Блинкова А.А. Кинетика проявления генетической информации в метках бактерий при конъюгации. - Мол.биология, 1971, т.5, вып.6, с.803-808.

; 7. Бреслер С.Е., Ланцов В.А., Лукьянец-Блинкова А.А. 0 меха- , Ш1зме конъюгации у Escherichia ooli K-12 . П. Коныагационные свойства реципиентов, термочувствительных в отношении синтеза ДНК. -Генетика, 1973, т.9, й 5, с,87- 96.

g> Bresler S.E., Lanzov V.A., Likhachev V.T. On-the mechanism ol conjugation in Escherichia coli K-12. III. Synthesis of UNA in the course of bacterial conjugation. Mol.Gen.Genet., 1973, v.120, p.]25--"131.

g^Bresler S.E., Lanzov V.A., Manukian L.E. Mechanism of gonetie recombination during' bacterial conjugation of Escherichia coli K-12. IV. Heterogeneity of progeny of exconjugants. Hole of donor and recipient strains. Mol.Gen.Genet., 1973, v.123, pl3^7- 353.

10. Бреслер C.E., Вячеславов Л.Г., Калинин В.Л., Кренева P.A., Кушев В.В., Ланцов В.А., МосевиЦкий M .И., -Перумов Д.А., РнбчшгВ.Н. Элементарные процессы генетики, 1973, Л.: Наука, 116-170.

11. Бреслер С.Е., Ланцов В.А., Манукян Л.Р. Механизм генетической рекомбинации при конъюгации бактерий. У. Гетерогенность потомства эксконъюгантов, индуцированная рекомбиногепами. - Генетика, 1974, т.10, № 2, с.145 - 150.

12. Ланцов В.А., Лихачев В.Т. О механизме конъюгации у Escherichia coli £-12 . iy. Конъюгация в условиях фенотипической супрессии мутации в гене dnaB . - Генетика, IS75, т.II, Га 8, c.I04-iI07

13. Бреслер С.Е., Ланцов В.А., Лихачев Е.Т. Механизм генетической рекомбинации при конъюгации бактерий. У1. Однонитевая конъюгация. - Генетика, 1976, т.12, №9, с.61-70.

14. Ланцов В.А. Рекомбинация у бактерий. - Генетика, 1977, т.13, №4, с.710 -734.

15. Бреслер G.E., Горышпн И.Ю., Ланцов В.А. Механизм генетической рекомбинации при конъюгации бактерий. УП. О гетерогенности потомства эксконъюгантов. - Генетика, 1977, т.13, № 5, с.862- 871.

16. Горышин И.Ю., Ланцов В.А. Однонитевай,конъюгация у Escherichia coli K-12 ; особенности образования" reïfepcreitHoro потомст-" па. - Генетика, 1977, т.13, №7, с.1246 -I25I.

17. Бреслер С.Е., Ланцов В.А. Индуцированная рекомбинация у Escherichia coli К-12: рекомбнногенный эффект мутации tif-1 . -Докл.АН СССР, 1970, т.238, IS 3, с.715 - 717.

18. Bresler S.Ii., Krivonogov S.V., Lanzov V.A. Scalo of the ge^-notic nap and genetic control of recombination after conjugation.in Escherichia coli K-12. Hot spots of recombination. Mol.Gen.C-enst., 1978, v. 166, p. 337-346.

19. Бреслер С.Е., Кривоногов С .В., Ланцов В,А. Механизм генетической рекомбинации при конъюгации бактерий. УЖ, Масштаб генетической карты и генетический контроль рекомбинаций. - Генетика, ' 1979, т.15, № 3, 409г 419.

20. Бреслер O.E., Кривоногов C.B., Ланцов В.А. Механизм генетической рекомбинации при конъюгации бактерий. П. Дальнейшее изучение эффекта горячих точек рекомбинации. - Генетика, 1979, т.15, M 3, с.420- 425. :

21. Brealer S.E,, Krivonogov S.V., Lanzov V.A. Genetic determination of the donor properties in Escherichia coli £-12. Phenomena of chromosome mobilization and integrative suppression. IIol.Gen. Genet., 1979, v.177, p.177- 184.

22. Broaler S.E., Goryshin I.Tu«, Laozov,V.A. Single-stranded conjugation in Escherichia coli E-12. Uol.Gen.Genet., 1980, v.177,

P»519- 525. *

23. Кривоногов C.B., Ланцов В.А. Рекомбинация при конъюгации и транодукции у Escherichia coli К-12 : эффекты краев фрагмента донора на разных путях рекомбинации. - Мол.биология, 1980, вып.27, К.: Наукова душа, с.Зг- 5.

24. Ланцов В.А. Однонитевая Конъюгация у Escherichia coli • К-12: сравнение с общей трансдукцией. - Мол.биология, 1980, К.: Наукова думка, вып.27, с.5 - 7.

25. Бреслер С.Е., Горышн И.Ю., Ланцов В.А. Промежуточные структуры ДНК, образующиеся в ходе рекомбинации при конъюгации у Escherichia coli К-12 . - ДоюьАН СССР, 1980, т.251, й 3, 0.717-720.

РТП ЛИЯФ, вак.762,тир.120, уч.-иэд.л.Г.Э; 25/pC-I98Ir. .H-I8I85

БесЕлатно