Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Неравный кроссинговер в гетерозиготных тандемных дупликациях у Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Неравный кроссинговер в гетерозиготных тандемных дупликациях у Escherichia coli"

/

На правах рукописи

Прокопьев Василий Валерьевич

НЕРАВНЫЙ КРОССИНГОВЕР В ГЕТЕРОЗИГОТНЫХ ТАНДЕМНЫХ ДУПЛИКАЦИЯХ У ESCHERICHIA COLI

03 00.15 - Генетика

0031619GG

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003161966

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий Федерального государственного унитарного предприятия Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов «ФГУП ГосНИИгенетика»

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор [В.В. Суходолец Научный консультант

кандидат биологических наук И.В. Манухов

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор A.C. Миронов, ФГУП ГосНИИгенетика

доктор биологических наук, профессор А А Прозоров, Институт общей генетики РАН

Ведущая организация

Кафедра генетики и селекции биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова

Защита состоится » у^О^ои? 2007 г в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д217.013 01 при ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу. 113545, Москва, 1-ый Дорожный проезд д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП ГосНИИгенетика

Автореферат разослан » О 2007 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета , _

кандидат биологических наук Г.Г. Заиграева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Исследование механизмов рекомбинации в тандемных дупликациях у бактерий занимает важное место в изучении взаимосвязи репликации и рекомбинации В таких системах генетический обмен может приводить, прежде всего, к гаплоидизации, те распаду самой дупликации, что можно считать равнозначным образованию делеции рекомбинационным путем [Lovett S Т et al, 1993, Bieme Н et al, 1997, Galxtski T et al, 1997] Таким образом, исследование механизмов и генной регуляции рекомбинационных обменов в гетерозиготных тандемных дупликациях является еще одним фрагментом, связывающем воедино «три Р» (рекомбинация, репарация и репликация) молекулярной генетики

В подавляющем большинстве работ, связанных с изучением рекомбинации в дупликациях, используются относительно небольшие повторы гомологичных сегментов хромосомы Но интерес также представляют и более протяженные, включающие от 25 до 300 и более тыс п н, тандемные дупликации, стабильность которых обеспечивается присутствием негомологичной вставки в одной из копий тандемного повтора В результате исследований дупликаций данного типа выявлено, что в процессе рекомбинации они выщепляют не только гаплоидные сегреганты, а самые различные продукты обмена между повторами ДНК, включая сегреганты сохранившие диплоидное состояние Исследование полученных рекомбинантов позволяет более детально изучать механизм рекомбинации

Неравный кроссинговер, происходящий между сестринскими хромосомами у бактерий, как и кроссинговер, происходящий между хромосомами различного происхождения, приводит к образованию тандемных дупликаций, а также множественных амплификаций генов

Для образования тандемных дупликаций путем неравного кроссинговера необходимо, чтобы в процессе репликации происходил сдвиг гомологичного соединения сестринских хромосом Мишенью для неравного кроссинговера при образовании дупликаций и затем областью стыка между двумя гомологичными повторами ДНК могут служить гомологичные опероны рибосомальных РНК (ггп), а также короткие прямые повторы ДНК длинной 1020 пн [Edlund Т et al, 1981, Whonskey S К et al, 1987]

В настоящее время приято считать, что образование дупликаций является эволюционно сложившимся механизмом повышения активности генов Изучение рекомбинации в протяженных тандемных дупликациях у Escherichia coli - один из эффективных подходов к выяснению механизмов рекомбинации, а также ее связи с такими генетическими явлениями как репарация и репликация

Предыстория работы

В 1991 году впервые было сообщено о создании гетерозиготной тандемной дупликации с помощью конъюгационного скрещивания у Escherichia coli К-12 [Суходолед В В, 1991] Данная дупликация была получена как результат рекомбинации двойных мутантов по генам deo-ouepoim: deoA deoB Тп5 и deoC deoD с образованием стабильных гетерозигот типа deoA deoB Tn5IdeoC deoD в конъюгационных скрещиваниях Оперон deoCABD расположен на 99 5 минуте генетической карты Е coli, в проксимальной области штамма HfrH (ОпТ - 97 мин) Гены этого оперона контролируют обратимые реакции катаболизма нуклеозидов дезоксирибоальдолазу (deoC), тимидинфосфорилазу (deoA), фосфопентомутазу (deoB) и пуриннуклеозидфосфорилазу (deoD) Мутации deoB блокируют утилизацию нуклеозидов всех типов, тогда как мутации deoC - всех типов дезоксирибонуклеозидов Мутации deoA - всех типов пиримидиновых дезоксирибонуклеозидов Мутации deoD блокируют утилизацию всех типов пуриновых нуклеозидов Дупликации, полученные в этих скрещиваниях, имели дикий фенотип по генам deoCAB, и отличались от истинных рекомбинантов Deo+ сохранением антибиотикоустойчивости (наличие транспозонной вставки Тп5 в гене deoB) В тоже время все дупликации имели мутантный фенотип по гену deoD из-за нарушения транскрипции, связанной со вставкой транспозона в предшествующем по направлению транскрипции гене deoB Другим доказательством образования гетерозиготных дупликаций была их способность к выщеплению сегрегантов родительского типа deoC deoD и deoA deoB .Tn5

Полученная таким путем дупликация до настоящего времени используется как модельная система для изучения гомологичной рекомбинации Работа с данной модельной системой является удобной вследствие прямого соответствия изменений фенотипических и генотипических свойств штамма, что показано на таблице 1

Таблица 1. Соответствия фенотепических маркеров генотипу исследуемых штаммов

Генотип Фенотип

Хоттингер Km Тимин 3* Аденозин 300 Глюкоза Тимин 25 Глюкоза Тимидин 20 Аденозин 1000 Тимидин 1000

deoCdeoD - + + - - -

deoA deoB Tn5 + - - + - -

deoCdeoD/deoA deoB Tn5 + + + + + +

Deo+ - + + + + +

*цифрами указаны количества мкг/мл добавляемого в среду вещества

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение роли неравного кроссинговера в выщеплении сегрегантов из штаммов Е coli с тандемными дупликациями, гетерозиготными по генам fiteo-оперона Определение основных путей рекомбинации в генетическом обмене в гетерозиготных тандемных дупликациях

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи

1 Определить роль неравного кроссинговера при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации, где гетерозиготность обусловлена вставкой транспозона Тп5 в гене deoB в одной из копий тандема Определить вероятность образования сегрегантов с сохранением тандемного повтора и с образованием гаплоида

2 Определить соотношение частот внутрихромосомного или межсестринского обмена при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации с нарушением гомологии, связанной со вставкой транспозона Тп5 в deoB гене одной из копий тандема

3 Определить соотношение частот внутрихромосомного или межсестринского обмена при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации с нарушением гомологии, связанной с делецией 638 н п затрагивающей гены deoB и deoD одной из копий тандема

4 Выявить влияние генов RecBCD и RecF путей рекомбинации на генетический обмен между прямыми повторами ДНК в протяженных тандемных дупликациях

5 Определение уровня экспрессии recA-промотора в исследуемых штаммах с гетерозиготными тандемными дупликациями

6 Определение причины конститутивного SOS-ответа в клетках мутантных по генам deoC deoD thyA

Научная новизна и практическая ценность работы

Путем конъюгационного переноса гетерозиготной тандемной дупликации D4 (deoA deoB Tn5IdeoC deoD) в геном штамма JC7623, дефектного по генам recBC sbcBC, был получен штамм СМ1700 На основе штамма СМ1700, при помощи трансдукции, был получен штамм дефектный по гену recF (recF332 ТпЗ) Показано, что частоты образования сегрегантов DeoD+ у штаммов rec, recBC sbcBC и recBC sbcBC recF существенно не отличаются Это свидетельствует о том, что в исследуемой модели рекомбинационный обмен между прямыми повторами ДНК в протяженных гетерозиготных тандемных дупликациях Escherichia coli является recBC- и recF- независимым процессом

Впервые показано, что в исследуемой тандемной дупликации, а также в одном из родительских штаммов (deoC deoD thyA) конститутивно активирован SOS-ответ SOS-ответ определялся по превышению уровня экспрессии гесА и

colD промоторов в исследуемых штаммах по сравнению со штаммом дикого типа HfrH

В работе показано, что при наличии вставки (Тп5) в одной из копий тандемного повтора в дупликациях типа deoA deoB Tn5IdeoC deoD, ведущим рекомбинационным механизмом при генетическом взаимодействии двух гомологичных повторов ДНК в тандемной дупликации является неравный кроссинговер, действующий на уровне сестринских хромосом, или «хроматид»

На дупликации типа А25 deoD-deoB / deoC17 deoD8 thr Tn9, не содержащей транспозонной вставки в deo-опероне, гетерозиготность которой обеспечивается делецией 638 н п. затрагивающей гены deoB и deoD в одной из копии тандема показано, что частота образования сегрегантов DeoD+ сходна с частотой образования сегрегантов DeoD+ на модели deoA deoB Tn5IdeoC deoD Рекомбинация между прямыми повторами в дупликациях А25 deoD-deoB / deoCl7 deoD8 thr .Tn9 происходит путём внутрихромосомного обмена

Апробация работы и публикации

Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 2 Всероссийских и Международных конференциях Основные положения диссертации отражены в 5 публикациях, из которых 3 статьи и 2 материалов конференции Диссертация была апробирована на заседании Секции Ученого Совета «Генетика микроорганизмов» от 22 марта 2007г, на семинаре «Неравный кроссинговер в гетерозиготных тандемных дупликациях» 25 сентября 2007г

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа содержит страницу машинописного текста, 12 рисунков, 7 таблиц Библиография включает 132 литературных источников отечественных и зарубежных авторов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования являлись 12 штаммов Escherichia coli К-12 Данные о происхождении и характеристика всех использованных в работе штаммов представлены в таблице 2 В работе так же был использован бактериофаг PI vir полученный из ВКПМ (Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов) ГосНИИгенетика

Таблица 2. Характеристика штаммов Escherichia coli К-12, использованных в работе

Название ffir Генотип Происхождение

Р-678 F" thr leu rpsL lac gal mal xyl mtl thi коллекция института (получен от д-ра Ф Жакоба)

.ГС7623 Г 1/1 г 1еи ргоА Ыз аг%Е грзЬ: гесВ21 гесС22 *ЪсВ15 ¡ЬсС происходит из штамма д-ра А Кларка Данный штамм был получен при содействии д-ра С Кулакаускаса (ШБА, Франция) [КивЬпет Б II й а1,1971]

1СТ>1310 Р 1гр36%1уи (вир) %1уВъху11$х гугТ(5ир) гесР Ти? СН1504 [ОипрЯ : йа1, 1989]

СМ1517 НйгН ¿еоА28 скоВ Тп5 г/гг 1ас ш1р8 ЛуА получен из штамма СМ1321 [Суходолец В В, 1991]

СМ1516 Н£гН ЛеоСП (1еоВ8 гЫ 1ас Ыр8 гкуА получен из штамма СВ780 [Суходолец В В, 1991]

В310 Б' йеоВ /Йг 1еи йи аг% 1куА ?йг гесА13/Р' Д25 (1еоВ-(1еой г/гг+ штамм получен в ВКПМ -Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика

Н&Н Н&Н прототроф из коллекции лаборатории (ГосНИИгенетика)

СМ1622 ШгН Ы[(1еоА28(1еоВ Тп5ШеоС17 0ео08] и<1р 1куА 1асУ&1 СМ1516хСМ1517 [Суходолец В В и др , 1996]

СМ1546 Нй*Н йеоСП <1ео08 гкг Тп9 ис1р ЛуА 1асУ Чи получен в результате внесения трансдукцией (фаг Р1) транспозоного маркера Лг Тп9 в штамм СМ1516 [Суходолец В В , 1998]

СМ1700 Р 04 \deoB Тп51йеоС17 ¿1еоВ8] 1еи ргоА йц аг%Е гЫ гесВ21 гесС22 $ЬсВ15бЬсС СМ1622 х 1С7623

СМ 1702 Р Как СМ1700, но гесИ32 ТпЗ СМ1700 х 1СОШО (Р1)

СМ1701 ШгН Д25 <1еоВ-йеоО ийр ГЙуА 1асА ¡асУАи Получен введением в СМ1546 путём конъюгации делеции Д25 от штамма В-310, несущего эту делецию на половом факторе

Среды и условия культивирования бактерий. В качестве полноценной среды для роста клеток использовали бульон Хоттингера, изготовленный на основе мясного гидролизата в ГосНИИгенетика, агаризованный бульон Хоттингера, в который при приготовлении твердых сред добавляли агара 15%, также использовался Ь-бульон и агаризованный Ь-бульон При работе с тиминовыми ауксотрофами в среду добавляли тимидин (5мкг/мл) В работе использовалась агаризованная минимальная среда М9 [Миллер Дж, 1976] В качестве источника углерода использовали глюкозу (0 2%), а также тимидин или аденозин в составе селективных сред ТсЖЛООО и АН1000, соответственно — по 1000 мкг/мл В среду АШООО в качестве источника тимидиловой кислоты добавляли тимидин (50 мкг/мл) Также использовали глюкозную среду с аденозином (300 мкг/мл) и тимином (3 мкг/мл) - 01А11ТЗ При изготовлении селективных сред добавки в минимальную среду вносили в следующих

концентрациях (мкг/мл). тиамин (Bi) - 1, гистидин — 40, аргинин — 25, пролин -40, канамицин - 40, стрептомицин - 200, тимидин - 20, тимин - 25 Бактерии выращивались при 37°С в течение 24-72 часов и более (в зависимости от задачи эксперимента)

Генетические методы исследования.

Конъюгационное скрещивание типа HfrxHfr проводили путем скрещивания культуры донора (~108 кл/мл) и реципиента(~109 кл/мл) в объемном соотношении 1.2. Фенокопию штамма Hfr получали путем длительной (18 часов) инкубации при 37°С в условиях интенсивной аэрации. Конъюгационную смесь инкубировали в течение часа и высевали на селективные среды Рекомбинационные клоны получали через 72 часа инкубации при 37°С

Трансдукция. Суспензию бактерий реципиентного штамма в физ растворе с CaClz заражали фагом PI vir, размноженном на донорном штамме при множественности заражения - 1 Через 20 минут инкубации при 37 °С в смесь добавляли цитрат натрия и высевали на селективную среду

Анализ генотипа рекомбинантов, полученных в коньюгациошшх и трансдукционных скрещиваниях, а также донорных свойств штаммов по неселектируемым маркерам проводили метод реплик

Получение клонов сегрегантов DeoD+ осуществляли путем высева суспензий бактериальных штаммов на среду AR1000 с последующей инкубацией чашек при 37°С не менее 72 ч.

Определение свойства Hfr определяли по наличию рекомбинантов на среде со стрептомицином и газоном штамма Р678

Определение чувствительности клеток к УФ-свету. Определение резистентности штамма к ультрафиолету проводили с применением эмпирически подобранной дозы (290 эрг/мм2), источником света УФ 254 нм служила лампа БУВ-15

Молекулярно-биологические методы исследования.

Выделение и очистку хромосомной ДНК проводили при помощи метода экстракции щелочным фенолом [Маниатис и др , 1984]

Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием реактивов фирмы «АмплиСенс», специально подобранных праймеров, синтезированных фирмой «Синтол», с помощью амплификатора ТерцикМС-2 «ДНК технология»

Электрофорез фрагментов ДНК проводили в агарозном геле в ТАЕ-буфере с использованием агарозы «Sigma» [Маниатис и др, 1984], при напряжении электрического поля 15 В/см, с использованием ДНК-маркеров фирмы «Fermentas»

Выделении и очистку ДНК из арагганого геля проводили с использованием набора для очистки амплифицированной ДНК фирмы «Sigma» (США), согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Секвениронание очищенных ПЦР-фрагменте в ДНК проводили по методу Сен rep a [Sengeret al., 1977], используя автоматический секвенагор.

Компьютерный анализ подбора праймеров и анализ нуклеотидпых последовательностей, полученных при секвенировании проводили при помощи компьютерных программ: NSBI Blast2, Oligo 6.31, Oligonucleotide Properties Calculator, Vector NT! suite 9.

Исследование уровня экспрессии recA гена в клетках проводилось при помощи сенсорных плазм ид pDEWRecA и pDEWColD, несущих ¡mCDABE -гепы Photorhabdus luminescens под контролем Р г ее А и PcolD промоторов соответственно. С помощью полученных биосенсоров по уровню люминйецеиции можно было судщ ь об активности РгесА и PcolD промоторов.

Трансформация проводилась путём электропорации при 2500 В, и длин не импульса 10 мс. Электро компетентны с клетки получали трёхкратным отмыванием культуры выращенной до OD 0,8 в бидистиллрованной воде.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Влияние основных путей рекомбинации КесВС и RecF на неравный генетический обмен в гетерозиготных тандем и ых дупликациях.

Не смотря на то, что в дупликациях типа deoA deoli:;Tn5/deoC deoD присутствует аллель deoD\ он фенотипически ие проявляется из-за полярного эффекта траиснозоиной вставки в предшествующем гене deoB. Но все дупликации данного типа с высокой частотой выщепляют сегреганты deotjT (способные катаболизировать пуриповые нуклеозиды).

Для образования клонов deoD*, штаммы, содержащие тандемные Дупликации, высевались па среду с аденозином (AR1000) в качестве единственного источника углерода. Отпечатки суспензии исследуемых штаммов, выросшие на такой среде, имеют характерную форму, отличающую их от прототрофных по гену deoD штаммов (рис 1),

фня Рекомбинанты DeoD+

А' Прототрофы DeoD*

Рисунок I. Морфология отпечатков суспензий, давших рскомбииантов на среде с аденозином.

В нашей работе была изучена относительно стабильная дупликация Б4 в штамме СМ1622 размером ~46 тпн Было показано, что среди выщепляемых ею сегрегантов БеоВ+ диплоиды по генам ¿/ео-оперона составляют 72% Для образования диплоидных и гаплоидных сегрегантов ВеоБ+, селектируемых на среде АШООО, требуется перекрест в короткой области хромосомы - между генами йеоВ и е!еоО (рис 2) В 28% случаев дупликация распадалась (рис. 2 сплошная линия)

хромосомами в дупликации Е)4 при образовании гаплоидных (сплошная линия) и диплоидных (пунктир) сегрегантов ОеоБ4

Не смотря на это, вьпцепление сегрегантов происходит с очень высокой частотой, приближающейся к 100% при достаточно длительной инкубации чашек Образование рекомбинантов БеоБ+ растянуто во времени, что можно наблюдать при высеве на чашки с селективной средой АН1000 достаточно густых суспензий бактериальных клеток в этом случае через 72 часа роста наблюдается появление только небольшого числа нормальных (крупных) колоний и большого числа мелких микроколоний, отстающих в росте Это означает, что практически каждая клетка, несущая дупликацию имеет шанс выжить на селективной среде

Для изучения влияния КесБ-пути и ЯесВСБ - пути рекомбинации на межсестринскиий обмен, тандемная дупликация Б4 (с1еоА ёеоВ.-Тп5 / (1еоС йеоП), была перенесена из штамма СМ1622 в геном штамма ГС7623 (гесВС яЪсВС) путем конъюгации Полученный таким образом штамм получил название СМ1700 Путем трансдукции с использованием фага Р1 мутация геср была перенесена в СМ1700, полученный штамм назвали СМ1702 Полученные штаммы СМ1700 и СМ1702, а также исходный штамм СМ1622 были использованы для определения частоты образования сегрегантов ВеоБ+ на селективной среде АШООО, содержащей аденозин в качестве единственного источника углерода и энергии для роста. В таблице 3 представлены данные образования сегрегантов БеоП* штаммами различного генотипа по генам г ее, несущими дупликацию Т)4 Все штаммы образуют сегреганты ОеоВ+ с очень высокой частотой Среди исследованных штаммов у СМ1622 была обнаружена высокая частота образования рекомбинантов, близкая к 0 9 Мутации гесВС хЬсВС гесР снижают частоту рекомбинации незначительно В то же время,

частота образования сегрегантов ОеоБ+ в гесА-мутантах значительно снижена и составляет менее 0 01

Таблица 3 Частота образования сегрегантов Оес©+ штаммами различного генотипа по

Штамм Исследуемый генотип Количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии по результатам их тестирования на средах Сегреганты DeoD+, %

AR1000 Хоттингера

СМ1622 тес+ 1 1 х 109 1 2 х 10* 92

СМ1625 гесА' - - <1

СМ1700 recBC sbcBC 74x10" 1 1 х 10" 67

СМ1702 recBC sbcBC recF 7 1 х 10* 1 0 х 10" 71

Тот факт, что мутация recF в геноме, дефектном по основному пути рекомбинации RecBCD, не влияет на способности бактерий к образованию рекомбинантов DeoD+, очевидно, свидетельствует в пользу того, что рекомбинационный обмен между прямыми повторами ДНК в гетерозиготных тандемных дупликациях на исследуемой модели является не только recBC-, но и recF- независимым

2. Определение уровня экспрессии гесЛ-промотора в исследуемых штаммах с гетерозиготными тандемными дупликациями.

Высокая частота вьпцепления сегрегантов DeoD+ послужила поводом для исследования уровня экспрессии recA-промотора в штаммах несущих дупликацию D4 С помощью биосенсеров Ree А luxCDABE и СоШ •luxCDABE, полученных транскрипционным слиянием промоторов гесА и соЮ генов и lux-оперона Photorabdus luminenscens нами был проверен уровень транскрипции гена RecA в штамме СМ1622, штаммах СМ1516 (deoC deoD thyA) и СМ1517 (deoA deoB Tn5 thyA), а также в штамме дикого типа HfrH (Рис 3) Было обнаружено, что уровень RecA в штаммах, несущих мутации deoC deoD на фоне тиминовой ауксотрофности (thyA) в 22 раза превышает уровень RecA, в штамме дикого типа и CM1517(cfeoA deoB Tn5 thyA) Причем, генотип deoC deoD thyA проявлял себя повышенным уровнем экспрессии recA-промотора как в штаммах несущих дупликации D4 так и в одном из родительских штаммов СМ1516 (deoC deoD thyA) На рисунке 3 представлены данные люминисценции в штаммах СМ1516, СМ1517 и HfrH несущих плазмиду pDWColD в зависимости от OD Уровень люминисценции штаммов, несущих плазмиду pDWColD свидетельствует об уровне экспрессии промоторов, регулируемых RecA-LexA системой Превышение люминисценции штамма СМ1516 (deoC deoD thyA), несущего плазмиду pDWColD, по сравнению с диким типом HfrH (pDWColD) на всех стадиях роста культуры указывает на то что, на фоне мутаций deoC deoD thyA наблюдается конститутивный SOS-ответ в клетках

Рисунок 3. Уровень люминисцсшши в штаммах CMJ516, СМ1517 и HfrH несущих плазмиду pDWCplD в зависимости от OD.

200030

+ Г |! Г;>ч'; .1 ip: Ч. rtiy.V

i Г.М15Ш1»«А it«i"Tn5 IhyA)

-лнкеДнал I t

(цршйгфоф)) ——~ Attlttrfn im К M1Ü10

pit-c ii.fi,': ifi,.!

----- illr^ll'.4 . ■ f.l 1 1

<1i4m :li-J. Г-

H00000 1200000

lpÜOOOO

■ßÖOODO

£ S

ЧБООООО

äooooo

0,3 О.д 0,5 0Jb г-i ■ и-гг.'.1 платность

Мутация по гену <1еоС, кодирующей дезокеирибоальдолазу приводит- к накоплению в клетке дсзоксирибозо-5-фосфата. Мутация но гену с!еоВ, кодирующего фос фопеито м утаз у, на фоне мутации АеоС приводит к

блокированию накопления дезоксирибозо-5 фосфата. Нами было показано, что уровень люиинисценщш штаммов несущих двойную мутацию но генам 4еоС (1еоВ трансформированных плазмидой pDWColD не превышал уровень люминисценции штаммов дикого типа. На основании этого можно предположил, что повышенный уровень экспрессии экспрессии гесА-промотора связан с накоплением в клетке дезоксирибозо-5-фосфата.

Таким образом, показано, что высокий уровень экспрессии ЯесА-1ххА -индуцибельных промоторов связан с мутантным генотипом 4еоС ёеоО ЛуА, а ие собственно с дупликацией В4

2, Роль неравного кроссинювера при гомологичном рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации, со вставкой транше зона Тп5 в гене deoB в одной из копий тандема.

В результате изучения генетически маркированных дупликаций у Escherichia coli выяснилось, что часть рекомбинантон, выщепляемых дупликациями на селективных средах, сохраняют диплоидное состояние. Но у таких дупликаций обычно происходит ого м озигоч иван и с по некоторым генам тандема, что может быть следствием неравных генетических обменов между сестринскими хромосомами.

12

Неравный кроссинговер между сестринскими хромосомами в области дупликации должен приводить к образованию двух реципрокных продуктов -гаплоидных сегрегантов и трипликаций Но трипликации обычно нестабильны и регистрируются в опыте в качестве вторичных сегрегантов

В проведённой нами работе был сделан анализ 20 диплоидных сегрегантов БеоВ+ Ктк независимого происхождения, полученных у дупликации Б4, описанной ранее

Сегреганты БеоО+, у которых диплоидное состояние сохраняется, имеют полный фенотип БеоС+ ВеоА+ БеоВ+ БеоБ* Ктк Для получения независимых сегрегантов данного типа 20 отдельных колоний штамма СМ1622 из рассева на полноценной среде были взяты для получения 20 суспензий, из которых после посева образцов суспензий с помощью репликатора на среду АШООО было отобрано по одному сегреганту БеоО+ Кт .

Образование диплоидных сегрегантов, способных расти на аденозине, возможно лишь при освобождении аллеля ¿еой+ из под влияния полярного эффекта транспозона Тп5 в результате перемещения рекомбинационным путем в копию не содержащую транспозона Теоретически возможны два варианта такого перемещения При внутрихромосомном обмене селектируемый рекомбинант ОеоБ+ Кщк остается гетерозиготным по гену йеоД т к. мутантная аллель гена ¿¡еоБ перемещается в зону полярного эффекта транспозона (Рис 4а) В случае неравного обмена между сестринскими хромосомами рекомбинант ОеоО+ Ктк огомозигочивается по селектируемому аллелю ЛеоЪ* (Рис 46)

Таким образом, образование диплоидных сегрегантов БеоБ+ Ктк теоретически может произойти как в результате неравного сестринского обмена, так и в результате внутрихромосомного обмена

а С с" ** в* г

с* «г р» в+ \

С* А" В» В" „ С" В+ -,—_—_^—,—:—,—,—

б

С* 1Г У» Р* „ с* в* Р"

>

1

...,„" г ■ I г

«•г«»»* с'аГРТ?

Рисунок 4 Схематическое изображение двух возможных путей образования диплоидных сегрегантов ОеоО+ Ктк у штаммов, несущих дупликации Ш а - внутрихромосомный обмен, б - неравный сестринский обмен

Таким образом, задачей исследования было определение фенотипически неразличимых комбинаций аллелей — с1еоВ Тп5 ёеоО или ¿еоВ Тп5 ¿еоБ* содержащихся в полученных диплоидных сегрегантах Для этого в рассеве каждого диплоидного рекомбинанта на полноценной среде был выделен спонтанный рекомбинант ЕНтН йеоА йеоВ .Тп5 (фенотип ЬеоА БеоВ БеоБ Ктк)

Для получения необходимого гаплоидного сегреганта в большинстве случаев было достаточно проверить 50 колоний исходного штамма Частота образования сегрегантов Н1тН йеоА deoB Тп5 по суммарным данным составляет 3 6% (49/1350), что приблизительно соответствует частоте образования гаплоидных сегрегантов другого типа йеоС 4 5% (61/1350) Определение того, какой из аллелей гена йеоИ (мутантный или дикий) содержат полученные сегреганты ШгН йеоА ¿еоВ Тп5, проводили генетическим путем, а именно при помощи скрещивания полученных гаплоидов со штаммом СМ1516, несущим туже самую мутацию в гене ¿еоО Данная мутация, согласно полученным нами результатам секвенирования гена йеоО в штамме СМ1516, представляет собой выпадение одного нуклеотида (С) в положении 563, что приводит к сдвигу рамки считывания

Образование рекомбинантов йеоН? в конъюгационных скрещиваниях штамма СМ1516 и гаплоидов ШгН йеоА ¿еоВ Тп5, может происходить лишь в том случае, если последние несут аллель йеоБ дикого типа (Таб 4) В качестве контрольного скрещивания производили отбор рекомбинантов ВеоС+ БеоА+ БеоВ+ на среде ТЖЮОО

Все рекомбинанты ВеоБ+ (РеоА+ ВеоВ+), полученные в проведенных скрещиваниях (проверено 320 колоний), наследовали аллель deoC донора, а рекомбинанты БеоС+ БеоА+ БеоВ+ (проверено 320 колоний) - аллель deoD' в соответствии со схемой представленной на рисунке 5

Таблица 4 Результаты конъюгационных скрещиваний штамма СМ1516 (Н£гН ¿еоС ¿¡еоО) и гаплоидных сегрегантов РеоР' (Н<тН йеоА 4еоВ Тп5) полученных из штамма СМ1622 (Р4)

№ клона* Число рекомбина на селективных с шов редах**

тамооо лиюоо

1 2 3

1 14 15

2 36 о***

3 18 36

4 14 37

5 15 9

6 36 42

7 104 48

8 124 56

9 23 10

10 31 139

И 131*** 13

1 2 3

12 41 89

13 148 54

14 42 51

15 59 23

16 42 52

17 154

18 20

19 53 32

20 48 47

*Номера гаплоидов соответствуют номерам диплоидных штаммов ЮеоС+ - производных СМ1622,

** В 0,01 мл конъюгационной смеси, *** В 0 1 мл конъюгационной смеси

Согласно полученным данным 17 из 20 штаммов Н£гН йеоА йеоВ Тп5, участвовавших в конъюгационном скрещивании на среде АШООО, стали БеоВ+, т.е они несли ген дикого типа. Три штамма, сохранившие фенотип ОеоБ~ были проанализированы на присутствие гена ¿еоИ в ПЦР, где в качестве контроля использовали 4 гаплоидных штамма, ставших БеоО+ в скрещивании с СМ1516, и штаммы дикого типа по генам ¿ео-оперона ШгН

С" А+ В+ I)' ЫЫ

_М , , , I 1 ' ь __

д с+ А~ Вп П+ ЪЬг

Рисунок 5. Конъюгационная мерозигота скрещивания ШгН е/еоА с1еоВ .Тп5 (реципиент) х Н&Н (¡еоС <1еоО (донор) Рекомбинанты йеоС~ обозначены сплошной линией,

сегреганты е!еоС+ ¿еоА+ ¿еаВ+ (1еоР~ - пунктиром

В результате проведения ПЦР было выяснено, что указанные штаммы не обнаруживали наработку ПЦР продукта гена ЛеоИ Данный результат может быть объяснен образованием делеций в области гена с!еоО, примыкающей к району локализации транспозона Тп5 в соседнем гене (1еоВ В тоже время все контрольные штаммы, использованные в эксперименте, давали наработку ПЦР - продукта гена йеоВ. Делетирование гена йеоЬ у некоторых гаплоидных сегрегантов может быть связано с транспозирующей активностью Тп5 в прилегающей к нему области хромосомы Во всяком случае, ни один из исследованных нами 20 штаммов ¿еоА <1еоВ .Тп5 не наследовал мутантного аллеля гена йеоО, что однозначно свидетельствовало о преимущественном участии неравного кроссинговера в рекомбинациях между тандемными повторами ДНК в дупликации типа йеоА йеоВ Тп51йеоС йеоЭ при нарушении гомологии между тандемными повторами ДНК связанной со вставкой транспозона

Таким образом, в 17 из 20 случаев при образовании рекомбинантов DeoD+ генетический обмен происходит путем неравного кроссинговера между сестринскими хроматидами

3. Роль неравного кроссинговера при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации с нарушением гомологии, связанной с делецией 638 н.п. затрагивающей гены deoB и deoD одной из копий тандема.

В другой части нашей работе мы попытались выяснить, не зависит ли высокая частота образования рекомбинантов DeoD+ от присутствия транспозона Тп5 непосредственно в области рекомбинационных перекрестов, приводящих к экспрессии аллеля deoD в дупликации Для этой цели были получены дупликации, не содержащие транспозонной вставки в ¡¿ео-опероне

Для получения стабильных дупликаций данного типа нами был использован штамм СМ1546, несущий транспозонную вставку (Тп9) в треониновом гене (0/100 минута генетической карты Escherichia coli) Другим штаммом, использованным для получения дупликации был штамм СМ 1701, несущий делецию Д25, которая затрагивает гены deoD и deoB ¿feo-оперона Было определено, что А25 имеет протяженность 638 п н (начинается с 947 п н гена deoB и заканчивается 303 п н гена deoD)

В скрещиваниях СМ1546 (донор) х СМ1701 на селективной среде содержащей тимин (25 мкг/мл), хлорамфеникол (10 мкг/мл), но не содержащей треонина производили отбор сегрегантов Thr+KmR, несущих дупликации А25 deoD-deoB IdeoCl 7 deoD8 thr Tn9

Как ожидалось, дупликации этого типа должны были выщеплять сегреганты DeoD+ в результате внутригенной рекомбинации между мутациями deoD8 и Д25 Таким образом, для образования рекомбинантов DeoD+ перекрест должен происходить в относительно короткой области хромосомы длиной в 260 п н (с 563 до 303 п н)

Нами показано, что частота образования сегрегантов DeoB+ DeoD+ на селективной среде с аденозином в качестве единственного источника углевода составляет 10-20% от числа высеянных клеток с дупликациями Однако в отличие от выщепления сегренантов DeoD+ дупликациями типа deoA deoB TnSIdeoC deoD, где выщепление было растянуто во времени, количество сегрегантов DeoB+ DeoD+, выщепляемых дупликацией Д25 deoD-deoB / deoC17 deoD8 thr Tn9 не увеличивалось уже через 72 часа инкубации чашек Это показывает, что в отсутствие выраженного нарушения гомологии между двумя повторами расстояние в 260 п н является достаточно большим для того, что бы рекомбинационный процесс завершился сравнительно быстро

Ранее нами было показано, что в дупликациях типа deoA deoB Tn5 / deoC deoD основной путь образования диплоидных рекомбинантов DeoD+ является неравный кроссинговер, что было показано на основании выщепления

огомозигоченых сегрегантов, образование которых возможно лишь при неравном межсестринском обмене между копиями тандемной дупликации

В тоже время проведенный нами анализ диплоидных сегрегантов БеоВ* БеоВ+, выщепляемых дупликацией А25 (1еоО-с1еоВ / с1еоС17 с1еоВ8 йп Тп9, не выявил присутствия среди них форм, огомозигоченых по сцепленному с йеоВ8 рецессивному гену йеоС17 Это означает, что образование сегрегантов БеоБ+ в данном случае протекало за счет внутрихромосомного обмена, а не за счет неравных межсестринских обменов

По данным таблицы 5 видно, что дупликации №1, 2, исходя из преимущественного вьпцепления ими гаплоидов Жг+ЛеоС~ , должны иметь порядок копий указанный на рисунке 6а Тогда как дупликации №3,4, вьпцепляющие как гаплойды th.fd.eoC~, так и йг"#еоС~, противоположную последовательность, представленную на рисунке 66

Таблица 5. Генотип сегрегантов РеоО+, выщепляемых дупликациями типа Д25 йеоО-йеоВ / с!еоС17 (1ео08 Лг Тп9 ___

Число сегрегантов РеоР+

№ Диплоиды Гаплоиды*

дупликации ТЫ-СтЬ ТЪг+Спгё ТЬгХтК Всего

ОеоЕМ- БеоС" ОеоЮ+ БеоС" ПеоБ+ БеоСГ

1 14 0 2 44 0 2 62

2 8 0 0 46 0 0 54

3 37 0 0 2 0 28 67

4 32 0 0 16 0 20 68

*Некоторые сегреганты данного типа могли представлять собой диплоиды огмозигоченные по гену йг+

В случае варианта 6а для образования гаплоидного сегреганта БеоВ+ БеоО+ достаточно одного перекреста, в случае варианта 56 необходимо три перекреста Данная закономерность имеет место независимо от того, происходит ли межсестринский неравный кроссинговер или внутрихромосомный обмен

В+ О-Лг71'

С* ДВ--0-Цн+

—I—I—I—I—ь-

"ТТУ

„ть ^ г*

С" А- В+ О" Ни-111 С* А+ЛВ--0~Й1Г4

С+ V ДВ"-0-Лг+ . С" А+ В* О-Лг11' / ___I _ _1 - -I- -I- .Ц . I. -Д_____^

у " I I-1 Г 1 7" 'I 1-1 I I ==-

/ (Г С А+ В" [Гйн™

Рисунок 6. Образование диплоидных рекомбинантов БеоО+, гомозигот (сплошная линия) и гетерозигот (пунктир) по аллелю ЛеоСГ дупликациями типа Д25 йеоО-йеоЬ МеоС17 ёеоЪ8 1кг Тп9 а, б - см объяснения втексте

Но если происходит неравный кроссинговер между сестринскими хромосомами, то дупликации всех типов должны выщеплять около половины диплоидных сегрегантов БеоВ+ (г/гг+ Стк), огомозигоченные по аллелю йеоС* Как показано на рисунке 6 при любой последовательности копий в дупликации один из двух возможных вариантов диплоидов БеоБ+ должен быть огомозигочен по аллелю с1еоС~ В действительности диплоидных сегрегантов БеоБ+ БеоС" не обнаруживается Отсюда следует, что диплоидные сегреганты БеоБ+ образовались не путем сестринского обмена, а в результате внутрихромосомной рекомбинации

Альтернативное объяснение полученных данных может состоять в том, что все сегреганты фенотипа БеоВ+ Т1зг+ Сша на самом деле представляют собой трипликации хромосомных сегментов, образовавшихся в результате неравного сестринского обмена И действительно, трипликации должны быть первичным продуктом такого обмена Однако в норме трипликации протяженных хромосомных сегментов нестабильны и их сохранение маловероятно Поэтому вывод об участии внутрихромосомного обмена в образовании сегрегантов БеоВ+ в отсутствии нарушения гомологии ДНК непосредственно в районе рекомбинации нам кажется наиболее вероятным

выводы

1. Гомологичная рекомбинация между повторами гетерозиготной тандемной дупликации Й4 (йеоА (1еоВ Тп5!<1еоС скоП), происходит по пути неравного кроссинговера Образование сетрегантов ОеоБ+ происходит преимущественно с сохранением тандемного повтора

2. Частота межсестринского обмена при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации Б4 (йеоА йеоВ Тп51йеоС йеоВ) составляет не менее 85% при образовании сегрегантов ОеоБ+

3. При гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации с нарушением гомологии, связанной с делецией 638 н п затрагивающей гены йеоВ и с1еоО одной из копий тандема рекомбинация происходит по пути внутрихрмосомного обмена

4. Влияния мутаций по генам гесВСО ьЬсВС и гесБ на частоту генетического обмена между прямыми повторами ДНК в протяженной тандемной дупликации Б4 (йеоА йеоВ 1ъ5/йеоС ¿еоП) не обнаружено

5. В штаммах несущих мутации по генам ЛеоС с1еой гкуА повышен уровень экспрессии гесА-промотора, что свидетельствует о конститутивном ЗОБ-ответе

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Суходолец В В , Прокопьев В В Неравный генетический обмен в тандемных дупликациях у Escherichia coli может представлять особый путь гомологичной рекомбинации//Генетика 2005 Т 41 №3 С 307-311 (Sukhodolets V V, Prokop'ev V V Unequal geneGc exchange in Escherichia coli tandem duplications may represent a special pathway of homologous recombination // Rus J Genetics 2005 V 41 №3 P 233-236) Прокопьев В В , Суходолец В В Неравный кроссинговер - основной путь гомологичной рекомбинации в тандемных дупликациях у Escherichia coli //Генетика 2005 Т 41 №8 С 1038-1044 (Prokop'ev V V, Sukhodolets VV Unequal crossing over is the principal pathway of homologous recombination m tandem duplications of Escherichia coli II Rus J Genetics 2005 V 41 №8 p 844-849)

Прокопьев В В Механизм неравного кроссинговера в гетерозиготных тандемных дупликациях у Escherichia coli (С 52-53) / Материалы международной школы-конференции молодых ученых Системная биология и биоинженерия, Москва 28 ноября - 2 декабря 2005 г - М МАКС Пресс, 2005 -252с

Прокопьев В В , Суходолец В В. Неравный кроссинговер у Escherichia coli, как механизм исправления генных повреждений в гетерозиготных тандемных дупликациях (V 75 С 208) / Биология - наука XXI века 10-я Пущинская школа конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН (Пущино 17-21 апреля 2006 года) Сборник тезисов_

Прокопьев В В . |Суходолец В В.| Изучение рекомбинации в гетерозиготных тандемных дупликациях у Escherichia coli II Генетика 2005 Т 43 №4 С 570-574 (Prokop'ev VV, Sukhodolets VVf Studying recombination in heterozygous tandem duplications m Escherichia coli II Rus J Genetics 2007 V 43 №4 P 570-574)

Подписано в печать 08 10 2007 г Исполнено 09 10 2007 г. Печать трафаретная

Заказ № 846 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прокопьев, Василий Валерьевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.Неравный кроссинговер в тандемных дупликациях.

1.1. Неравный кроссинговер у Escherichia coli.

2. Модельная система для изучения гомологичной рекомбинации.

2.1.Deo-onepo H.

2.2. Получение тандемных дупликаций.

2.3. Механизм образования тандемных дупликаций.

2.4. Изучение гомологичной рекомбинации в модельной системе deoA deoB::Tn5/deoC deoD.

3. Генная регуляция хромосомных перестроек.

3.1. Генная регуляция рекомбинации прокариот.

3.2. Влияние основных путей рекомбинации на частоту образования дупликаций и межсестинский обмен в гетерозиготных тандемных дупликциях.

3.3. Эффект мутаций по генам recQ, uvrD, recJна образование дупликаций.

3.4. Рекомбинация в гетерозиготных тандемных дупликациях на фоне мутации по гену гесА.

3.5. Влияние мутаций по генам ruvABC на рекомбинацию между прямыми повторами ДНК в штаммах Е. coli, несущих протяжённые тандемные дупликации.

3. Неравный кроссинговер между сестринскими хромосомами как путь адаптивной рекомбинации.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Объекты и методы исследований.

1. Штаммы и условия культивирования.

1.1. Бактериальные штаммы.

1.2. Среды и условия культивирования.

1.3. Плазмиды.

1.4. Реактивы.

2. Методы исследований.

2.1. Генетические методы исследования.

2.1.1. Конъюгационное скрещивание.

2.1.2 Трансдукционное скрещивание.

2.1.3. Анализ генотипа рекомбинантов.

2.1.4 Получение клонов сегрегантов DeoD+.

2.1.5. Определение свойства Hfr.

2.1.6. Определение чувствительности клеток к УФ-свету.

2.2. Молекулярно-биологические методы исследования.

2.2.1. Выделение и очистка хромосомной ДНК.

2.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.2.3. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.2.4. Выделение и очистку ДНК из агарозного геля.

2.2.5. Секвенирование фрагментов генов deo-оперона.

2.2.6. Выделение плазмидной ДНК методом щелочной экстракции.

2.2.7. Трансформация ДНК в Е. Coli.

2.2.8. Исследование уровня экспрессии гесА.

2.3. Компьютерный анализ.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

1. Определение вероятности образования сегрегантов с сохранением тандемного повтора и с образованием гаплоида.

2. Влияние основных путей рекомбинации RecBC и RecF на неравный генетический обмен в гетерозиготных тандемных дупликациях.

3. Определение уровня экспрессии гесЛ-промотора в исследуемых штаммах с гетерозиготными тандемными дупликациями.

4. Роль неравного кроссинговера при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации, со вставкой транспозона Тп5 в гене deoB в одной из копий тандема.

5. Роль неравного кроссинговера при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации с нарушением гомологии, связанной с делецией 638 н.п. затрагивающей гены deoB и deoD одной из копий тандема.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Неравный кроссинговер в гетерозиготных тандемных дупликациях у Escherichia coli"

В последние годы активно обсуждается феномен взаимоотношений трёх основных генетических механизмов: рекомбинации, репарации и репликации. Причём наиболее актуальным направлением является выяснение связи между процессами репликации и рекомбинации. Большинство исследований в этой области направлены на изучение роли белков участвующих в этих процессах, таких как RecA, RecBCD, RecFOR, RuvABC, RecG и других. В генетическом контексте важное место в изучении взаимосвязи репликации и рекомбинации занимают исследования рекомбинации в тандемных дупликациях у бактерий. В таких генетических системах генетический обмен может приводить, прежде всего, к гаплоидизации, т.е. распаду самой дупликации, что можно считать равнозначным образованию делеции рекомбинационным путём [Lovett S.T. et al., 1993; Bierne H. et al., 1997; Galitski T. et al., 1997.]. Показано, что частота образования делеций в тандемных дупликациях зависит от состояния генов, кодирующие основные ферменты репликации - ДНК-полимеразу (PolIII) и геликазу репликационной вилки DnaB [Saveson C.J. et al., 1997]. Правда в некоторых случаях образование делеций тандемными дупликациями может быть RecA-незавиеимым.

В подавляющем большинстве работ, связанных с изучением рекомбинации в дупликациях, используются относительно небольшие повторы гомологичных сегментов хромосомы. Но интерес также представляют и более протяженные, включающие от 25 до 300 и более тыс. п.н., тандемные дупликации, стабильность которых обеспечивается присутствием негомологичной вставки в одной из копий тандемного повтора.

В результате исследований дупликаций данного типа выявлено, что в процессе рекомбинации они выщепляют не только гаплоидные сегреганты, а самые различные продукты обмена между повторами ДНК, включая сегреганты сохранившие диплоидное состояние. Исследование полученных рекомбинантов позволяет более детально изучать механизм рекомбинации.

Важно отметить, что образование рекомбинантов различного типа, происходящее в условиях селективного давления внешней среды имеет сходство с так называемыми «направленными», или «адаптивными» мутациями, которые во многих отношениях отличаются от спонтанных мутациях в делящихся клетках. Эти мутации возникают только после воздействия нелетальных селективных факторов, при отсутствии клеточного деления и без повышения общего уровня неселектируемых мутаций [Foster P.L., 1993].

Неравный кроссинговер, происходящий между сестринскими хромосомами у бактерий, как и кроссинговер, происходящий между хромосомами различного происхождения, является непосредственным механизмом, который приводит к образованию тандемных дупликаций, а также множественных амплификаций генов [Anderson R.P. et al., 1979;].

Для образования тандемных дупликаций путём неравного кроссинговера необходимо, что бы в процессе репликации происходил сдвиг гомологичного соединения сестринских хромосом. Мишенью для неравного кроссинговера при образовании дупликаций и затем областью стыка между двумя гомологичными повторами ДНК служат гомологичные опероны (ггп) рибосомальных РНК [Anderson R.P. et al., 1981], а также короткие прямые повторы длинной ДНК длинной 10-20 пн [Edlund Т. et al., 1981., Whoriskey S.K. et al., 1987].

Приято считать, что основной функцией образования дупликаций является повышение активности генов [Anderson R.P. et al., 1979].

Изучение рекомбинационных обменов в протяжённых тандемных дупликациях у Escherichia coli - один из эффективных подходов к выяснению механизмов рекомбинации, а также её связи с такими генетическими явлениями как репарация и репликация.

Предыстория работы.

В 1991 году впервые было сообщено о создании гетерозиготной тандемной дупликации с помощью конъюгационного скрещивания у Escherichia coli К-12 [Суходолен В.В., 1991]. Данная дупликация была получена как результат рекомбинации двойных мутантов по генам deo-оперона: deoA deoBv.Тп5 и deoC deoD с образованием стабильных гетерозигот типа deoA deoBv. Tn5/deoC deoD в конъюгационных скрещиваниях (Рис 1.).

B::Tn5 + + + .

С А \ / D С А В D \У > -V X -J S > S v B::Tn5 + + +

С А \ / D и CAB D

Ч > )\( > >#L ) > )=>—

Рис.1. Получение тандемных дупликаций.

Дупликации, полученные в этих скрещиваниях, имели дикий фенотип по генам deoCAB, и отличались от истинных рекомбинантов Deo+ сохранением антибиотикоустойчивости (наличие транспозонной вставки Тп5 в гене deoB). В тоже время все дупликации имели мутантный фенотип по гену deoD из-за полярного эффекта вставки транспозона в предшествующем (по направлению транскрипции) гене deoB. Другим доказательством образования гетерозиготных дупликаций была их способность к выщеплению сегрегантов родительского типа: deoC deoD и deoA deoBv.Tn5.

Полученная таким путём дупликация до настоящего времени используется как модельная система для изучения гомологичной рекомбинации.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение роли неравного кроссинговера в выщеплении сегрегантов из штаммов Е. coli с тандемными дупликациями, гетерозиготными по генам deo-оперона. Определение основных путей рекомбинации в генетическом обмене в гетерозиготных тандемных дупликациях.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Определить роль неравного кроссинговера при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации, где гетерозиготность обусловлена вставкой транспозона Тп5 в гене deoB в одной из копий тандема. Определить вероятность образования сегрегантов с сохранением тандемного повтора и с образованием гаплоида.

2. Определить соотношение частот внутрихромосомного или межсестринского обмена при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации с нарушением гомологии, связанной со вставкой транспозона Тп5 в deoB гене одной из копий тандема.

3. Определить соотношение частот внутрихромосомного или межсестринского обмена при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации с нарушением гомологии, связанной с делецией 638 н.п. затрагивающей гены deoB и deoD одной из копий тандема.

4. Выявить влияние генов RecBCD и RecF путей рекомбинации на генетический обмен между прямыми повторами ДНК в протяжённых тандемных дупликациях.

5. Определение уровня экспрессии гесЛ-промотора в исследуемых штаммах с гетерозиготными тандемными дупликациями.

6. Определение причины конститутивного SOS-ответа в клетках мутантных по генам deoC deoD thyA.

Научная новизна и значимость работы.

Путём конъюгационного переноса гетерозиготной тандемной дупликации D4 (deoA deoB::Tn5/deoC deoD) в геном штамма JC7623, дефектного по генам recBC sbcBC, был получен штамм СМ1700.

На основе штамма СМ1700, при помощи трансдукции, был получен штамм дефектный по гену recF (recF332::Tn3). Показано, что частоты образования сегрегантов DeoD+ у штаммов rec, recBC sbcBC и recBC sbcBC recF существенно не отличаются. Это свидетельствует, что в исследуемой модели рекомбинационный обмен между прямыми повторами ДНК в протяжённых гетерозиготных тандемных дупликациях Escherichia coli является recBC- и recF- независимым процессом.

Впервые показано, что в исследуемой тандемной дупликации, а также в одном из родительских штаммов (deoC deoD thyA) конститутивно активирован SOS-ответ. SOS-ответ определялся по превышению уровня экспрессии гесА и соЮ промоторов в исследуемых штаммах по сравнению со штаммом дикого типа HfrH.

В работе показано, что при наличии вставки (Тп5) в одной из копий тандемного повтора в дупликациях типа deoA deoB::Tn5ldeoC deoD, ведущим рекомбинационным механизмом при генетическом взаимодействии двух гомологичных повторов ДНК в тандемной дупликации является неравный кроссинговер, действующий на уровне сестринских хромосом, или «хроматид».

На дупликации типа А25 deoD-deoB/deoC17 deoD8 thr::Tn9, не содержащей транспозонной вставки в deo-onepoHe, гетерозиготность которой обеспечивается деледией 638 н.п. затрагивающей гены deoB и deoD в одной из копии тандема показано, что частота образования сегрегантов DeoD+ сходна с частотой образования сегрегантов DeoD+ на модели deoA deoB:\Tn5/deoC deoD. Рекомбинация между прямыми повторами в дупликациях А25 deoD-deoB/deoC17 deoD8 thr.:Tn9 происходит путём внутрихромосомного обмена.

Практическая значимость работы.

Результаты представленной работы могут быть использованы для дальнейшего изучения особенностей гомологичной рекомбинации между протяженными повторами хромосомных сегментов. Полученные в работе данные также могут быть использованы для создания модельных систем изучения гомологичной рекомбинации в бактериальных клетках.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 2 Всероссийских и Международных конференциях. Основные положения диссертации отражены в 5 публикациях, из которых 3 статьи и 2 материалов конференции. Диссертация была апробирована на заседании Секции Учёного Совета «Генетика микроорганизмов» от 22 марта 2007г, на семинаре «Неравный кроссинговер в гетерозиготных тандемных дупликациях» 25 сентября 2007г.

Структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы. Работа содержит 94 страницы машинописного

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Прокопьев, Василий Валерьевич

выводы

1. Гомологичная рекомбинация между повторами гетерозиготной тандемной дупликации D4 {deoA deoB::Tr\5/deoC deoD), происходит по пути неравного кроссинговера. Образование сегрегантов DeoD+ происходит преимущественно с сохранением тандемного повтора.

2. Частота межсестринского обмена при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации D4 (deoA deoB::Tn5/deoC deoD) составляет не менее 85% при образовании сегрегантов DeoD+.

3. При гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации с нарушением гомологии, связанной с делецией 638 н.п. затрагивающей гены deoB и deoD одной из копий тандема рекомбинация происходит по пути внутрихрмосомного обмена.

4. Влияния мутаций по генам recBCD sbcBC и recV на частоту генетического обмена между прямыми повторами ДНК в протяжённой тандемной дупликации D4 (deoA deoB::Tn5/deoC deoD) не обнаружено.

5. В штаммах несущих мутации по генам deoC deoD thyA повышен уровень экспрессии гесА-промотора, что свидетельствует о конститутивном SOS-ответе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прокопьев, Василий Валерьевич, Москва

1. Злотников К.М., Суходолец В.В., Бауманис Г.Э. Картирование генов контролирующих метаболизм нуклеозидов у Е. coli II Генетика Т. 5. С. 114-119.1969.

2. Каменева С. В., Каляева Э. С., Алиханян С. И. Изучение генетической основы различной количественной потребности в тимине у тиминовых мутантов Е. coli К-12//Генетика. 1965. №1. С. 100-105.

3. Кольцов Н. К. Проблема прогрессивной эволюции // Биол. журн. 1933. Т. 2. №4-5. С. 475-500.

4. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук Молекулярное клонирование / перевод с английского под редакцией акад А.А. Баева и д-ра биол. наук К.Г. Скрябина Москва «Мир» 1984

5. Мёллер Г. Г., Прокофьева-Бельговская А. А., Косиков К. В. Неравный кроссинговер у мутантов Ваг, как результат удвоения меленького участка хромосомы // Доклады АН СССР. 1936. Т. 1. С. 83-84.

6. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М., «Мир», 1976.

7. Оно С. Генетические механизмы прогрессивной эволюции. М.: Мир. 1973,227с.

8. Пухова Е. С., Багманис Г. Э. Чуканова Т. И., Суходолец В. В. Природа мутации устойчивости к рибозидам у тиминовых ауксотрофов Е. coli К-12//Генетика. 1972. Т. 8. №11. С. 90-99.

9. Серебровский А. С. Гены scute и achete у Drosophila melanogaster и гипотеза их дивергенции // Доклады АН СССР. 1938. Т. 19 (1-2). С. 7781.

10. Стенчук Н. Н., Суходолец В. В. 1969. Генетическое изучение мутации устойчивости к рибозидам у тиминовых ауксотрофов Escherichia coli К-12//Генетика. №11. С. 106.

11. Стенчук Н.Н., Суходолец В.В. Генетическое изучение мутаций устойчивости к рибозидам у тиминовых ауксотрофов Е. coli К-12 // Генетика Т. 5. С. 106-118.1969.

12. Суходолец В. В. Гинетический прогресс и природа генетических рекомбинаций 2-е изд. М.: Биоинформсервис, 1996. 195с.

13. Суходолец В. В. Механизмы вертикальной эволюции // Успехи соврем, биол. 1997. Т. 117. №5 С. 517-533.

14. Суходолец В. В., Алиханян С. И. Ген чувствительности к тимидину (td) у Е. coli К-12: фенотипическое проявление и локализация на хромосоме // Генетика. 1965. №2. С. 47-53.

15. Суходолец B.B. Значение рекомбинации, происходящей в процессе репликации ДНК // Молекуляр. биология. 2006. Т. 40. №2. С. 369-371.

16. Суходолец B.B. Неравный кроссинговер у Escherichia coli II Генетика. 2006. Т. 42. №11. C.1526-1535.

17. Суходолец B.B. Неравный кроссинговер в конъюгационных скрещиваниях у Escherichia coli К-12 // Генетика. 1991. Т. 27. №1. С.27-38.

18. Суходолец В.В. Повышение частоты неравного кроссинговера в клетках мутантов recBC в конъюгационных скрещиваниях у Escherichia coli К-12 // Генетика. 1993. Т. 29. №5. С. 748-759.

19. Суходолец В.В. Принципы организации прокариотического генома // Генетика. 1992. Т. 28. №1. С. 28-37.

20. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов. М., «Мир». 1965. 555с.

21. Хейс У. Генетика бактерий у бактериофагов. М.: Мир 1965. 555с.

22. Abdulkarim F., Hughes D. Homologous recombination between the tuf genes of Salmonella typhimurium II J. Mol. Biol. 1996. V. 260. P. 506-522.

23. Ahmad S.I., Barth P.T., Pritchard R.H. Properties of a strands of E. coli lacking purine nucleoside phosphorilase // Biochim. Biophys. Acta, V. 161. P.581-589. 1969.

24. Ahmad S.I., Kirk S.H., Eisenstark A. Thymine metabolism and thyminless death in prokaryotes and eukaryotes // Annu. Rev. Microbiol. 1998. V. 52. P. 591-625.

25. Aibl H., Lands W.E.A. A new, sensitive determination of phosphate // Anal. Biochem. V. 30. P. 51-57. 1969.

26. Alikhanian S.I., Iljina T.S., Kaliaeva E.S., Kameneva S.V., Sukhodolec V.V. A genetical study of thymineless mutants of E. coli K12 // 1966. Genet. Res. V.8. P.83.

27. Anderson R. P., Roth J. R. Gene duplication in bacteria: alternation of gene dosage by sister-chromosome exchanges // Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 1979. V. 43. P. 1083-1087.

28. Anderson R.P., Roth J.R. Spontaneous tandem genetic duplications in Salmonella typhimurium arise by unequal recombination between rRNA (rrn) cistrons // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 3113 3117.

29. Anderson R.P., Roth J.R. Tandem genetic duplications in Salmonella typhimurium: Amplification of the histidine operon // J. Mol. Biol. 1978. V. 126. P. 53-71

30. Bachman B.J. Linkage map of Escherichia coli K-12, Ed.8 // Microbiol. Rev. 1990. V. 54. P.130-197.

31. Bachman В.J., Low K.B., Taylor L.A. Recalibrated lineage map of E. coli K-12. Bacteriol. Rev., V. 40. 116-167. 1976

32. Barbour S.D., Nagaishi H., Templin A., Clark A.J. Biochemical and genetic studies of recombination proficiency in E. coli, II Rec revertants caused by indirect suppression of Rec" mutations // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1970. V. 67. P. 128-135.

33. Benson E.F., Collier S. Lloyd R.G. Evidence of abortive recombination in ruv mutants of Escherichia coli K-12 // Mol. Gen. Genet. 1991. V. 225. P. 266272.

34. Bi X., Liu L.F. recA-independent and rec^-dependent interamolecular plasmid recombination: differential homology requirement and distance effect // J. Mol. Biol. 1994. V. 235. P. 414-423.

35. Bierne H., Vilette D., Ehrlich S.D., Michel B. Isolation of a dnaE mutation which enhances RecA-independent homologous recombination in the Escherichia coli chromosome // Mol. Microbiol. 1997. V. 24. P. 1225-1234.

36. Bierne H., Vilette D., Ehrlich S.D., Michel B. Isolation of a dnaE mutation which enhances RecA-independent homologous recombination in the Escherichia coli chromosome // Mol. Microbiol. 1997. V. 24. P. 1225-1234.

37. Bonney R.J., Wienfeld H. Regulation of thymidine metabolism in E. coli K-12: optimal condition for the assay of 1,5-phosphodeoxyribomutase in ultrasonic extracts //J. Bacteriol. V. 103. P. 650-655. 1970.

38. Bridges О. B. The bar "gene" as duplication // Science. 1936. V. 83. P. 210211.

39. Buxton R. S., Hammer-Jespersen K., Hansen T. D. Insertion of bacteriophage lambda into the cfeo-operon of Escherichia coli K-12 and isolation Plaque-Jorming transducing bacteriophage //J. Bacteriol. 1978. V. 136. P. 668.

40. Cairns J., Foster P.L. Adaptive reversion of a frameshift mutation in Escherichia coli// Genetics. 1991. V. 128. P. 695-701.

41. Chaudhury A.M., Smith G.R. Escherichia coli recBC deletion mutants // J. Bacteriol. 1984. V. 160. P. 788-791.

42. Clark A.J. Recombination deficient mutants of E. coli and other bacteria // Ann. Rev. Genet. 1973. V. 7. P. 67-86.

43. Clark A.J. Toward a metabolic interpretation of genetic recombination of E. coli an its phages // Ann. Rev. Microbiol. 1971. V. 25. P. 437-464.

44. Clark A.J., Margulies A. Isolation and characterization of recombination-deficient mutants of Escherichia coli K-12 // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1965. V. 53. P. 451-459.

45. Clark A.J., Sandler S.J. Homologous genetic recombination: the pieces begin to fall into place // Crit. Rev. Microbiol. 1994. V. 20. P. 125-142.

46. Copaldo-Kimball F., Barbour S.D. Involvement of recombination genes in growth and viability of Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1971. V. 106. P. 204-212.

47. Dimpfl J., Echois H. Duplication mutation as an SOS response in Escherichia coli: enhanced duplication formation by a constitutively activated RecA // Genetics. 1989. V. 123. P. 255-260.

48. Dixon D.A., Kowalczykowski S.C. Homologous pairing in vetro stimulated by the recombination hot spot, Chi // Cell. 1991. V. 66. P. 361-371.

49. Edluand Т., Normark S. Recombination between short DNA homologies causes tandem duplication. //Nature. 1981. V. 292. P. 269-271.

50. Edlund Т., Normark S. Recombination between short DNA homologous causes tandem duplication//Nature. 1981. V. 292. P. 269-271.

51. Emmerson P.T., Howard-Flanders P. Cotransduction with thy of a gene required for genetic recombination in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1967. V. 93. P. 1729-1731.

52. Foster P.L. Adaptive mutation: The uses of adversity // Annu. Mol. Microbiol. 1993. V.47. 467-504.

53. Foster P.L., Trimarchi J.M. Adaptive reversion of a frameshift mutation in Escherichia coli by simple base deletion in homopolymeric runs // Science. 1994. V. 265. P. 407-409.

54. Foster P.L., Trimarchi J.M., Mourer R.A. Two enzymes, both of which process recombination intermediates, have opposite effects on adaptive mutation in Escherichia coli II Genetics. 1996. V. 142. P. 25-37.

55. Galitski Т., Roth J.R. Pathways for homologous recombination between chromosomal direct repeats in Salmonella typhimurium II Genetics. 1997. V. 146. P. 751-767.

56. Gallant J., Spottwood T. The recombinogenic effect of thymidilate starvation in E. coli merodiploids // Genetics. 1965. V. 52. P. 107-118.

57. Gilbert W. Starting and stopping sequences for the RNA polymerase. / RNA polymerase. 193-205. Eds. R. Losick, M. Chambirlin. Cold. Spring Harbor, N.-Y. 1976.

58. Gillen J.R., Willis D.K., Clark A.J. Genetic analysis of RecF pathway of genetic recombination in Escherichia coli K-12 I I J. Bacteriol. 1981. V. 145. P. 521-532.

59. Hammer-Jespersen K. Nucleoside catabolism // Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganisms / Ed. A. Munch-Petersen. L.: Acad. Press. 1983. P. 2003-258.

60. Hammer-Jespersen K., Munch-Petersen A. Multiple regulation of nucleoside catabolizing enzymes: regulation of the deo-operon by the cytR and deoR gene products //Mol. Gen. Genet. 1975. V. 137. P. 325.

61. Hammer-Jespersen K., Munch-Petersen A. Phosphodeoxyribomutase from E. coli. Purification and some properties // Eur. J. Biochem. V. 17. P. 397-407. 1970.

62. Hammer-Jespersen K., Munch-Petersen A., Nygaard P., Schwartz M. Induction of enzyme involved in the catabolism deoxyribonucleosines and ribonucleosides in E. coli K-12 // Eur. J. Biochem. V. 19. P. 533-538. 1971.

63. Hanada К., Ukita Т., Kohno Y. et al. DNA helicase is a suppressor of illegitimate recombination in Escherichia coli II Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 3860-3865.

64. Harris R.S., Longerich S., Rosenberg S.M. Recombination in adaptive mutation// Science. 1994. V. 264. P. 258-260.

65. Harris R.S., Ross K.J., Rosenberg S.M. Opposing roles of the Holliday junction processing systems of Escherichia coli in recombination-dependent adaptive mutation // Genetics. 1996. V. 142. P. 25-37.

66. Hart M.G.R. Thymine starvation and genetic damage in E. coli II J. Gen. Microbiol. 1966. V. 45. P. 489-496.

67. Heath J.D., Weinstock G.M. Tandem duplications of the lac region of the Escherichia coli chromosome // Biochimie. 1991. V. 73. P. 343-352.

68. Hill C.W., Grafstrom R.H., Harnish B.W., Hillman B.S. Tandem duplications resulting from recombination between ribosomal RNA genes in Escherichia coli II J. Mol. Biol. 1977. V. 116. P. 407-425.

69. Hillman J.D. Mutant analysis of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase in E. coli II Bichem J. V. 179. P. 99-107.1979.

70. Horri Z.-I., Clark A.J. Genetic analysis of the RecF pathway to genetic recombination in Escherichia coli K-12: isolation and characterization of mutants // J. Mol. Biol. 1973. V. 80. P. 327-344.81. http://genolist.pasteur.fr/colibri/genome.cgi

71. Kalckar H.M. The enzymatic synthesis of purine rybosides. J. Biol. Chem. V. 167. P. 477-485. 1947.

72. Kushner S.R., Nagaishi H., Clark AJ. Indirect suppression of recB and recC mutation by exonuclease I deficiency // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. P. 1366-1370.

73. Kushner S.R., Nagaishi H., Templin A., Clark A.J. Genetic recombination in Escherichia coli. The role of exonuclease I // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1971. V. 68. P.824-827.

74. Lin R.-J., Capage M., Hill C.W. A repetitive DNA sequence, Rhs, responsible for duplication within the Eschericia coli K-12 chromosome // J. Mol. Biol. 1984. V. 177. P. 1-18.

75. Lloyd R.G., Benson F.E., Shurvinton C.E. Effect of ruv mutation on recombination and DNA repair in Escherichia coli K-12 // Mol. Gen. Genet. 1984. V. 194. P. 303-309.

76. Lloyd R.G., Buckman C. Identification and genetic analysis of sbcC mutation in commonly used recBC sbcB strains of E. coli K-12 // J. Bacteriol. 1985. V. 164. P. 836-844.

77. Lloyd R.G., Low K.B. Homologous recombination // Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and molecular biology / Eds Neidhardt F.C et al. Washington, DC: ASM Press, 1996. P. 2236-2255.

78. Lloyd R.G., Thomas A. On the nature of RecBC and RecF pathways of conjugal recombination in Escherichia coli // Mol. Gen. Genet. 1983. V. 190. P. 156-161.

79. Lomax M.S., Greenberg G.R. Characteristics of the deo operon: role in thymine utilization and sensitivity to deoxyribonucleosides // J. Bacteriol. V. 96. P. 501-514.1968.

80. Lombardo M.J., Rosenberg S.M. radC102 of Escherichia coli is an allele of recG И J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 6287-6291.

81. Lovett S.T., Drapkin P.T., Sutera V.A., Jr., Glickman-Peskind T.J. A sister-strand exchange mechanism for rec^-independent deletion of repeated DNA sequences in Escherichia coli II Genetics. 1993. V. 135. P. 631-642.

82. Lovett S.T., Drapkin P.T., Sutera V.A.J., Gluckman-Peskind T.J. A sister-strand exchange mechanism for rec^-independent deletion of repeated DNA sequences in Escherichia coli II Genetics. 1993. V. 135. P. 631-642.

83. Lovett S.T., Kolodner R.D. Identification and purification of a single-strand-DNA-specific exonuclease encoded by the recJ gene of Escherichia coli H Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 2673-2631.

84. Mahajan S.K. Pathways of homologous recombination in Escherichia coli II Genetic recombination / Eds. R. Kuchelapati, G.R. Smith, Washington, D.C.: Amer. Soc. Microbiol., 1988. P. 87-140.

85. Mahajan S.K., Datta A.R. Mechanisms of recombination by the RecBC and RecF pathway following conjugation in Escherichia coli K-12 // Mol. Gen. Genet. 1979. V. 169. P. 67-78.

86. Markert C.L., Shaklee J.B., Whitt G.S. Evolution of gene // Science. 1975. V. 1989. P. 102-114.

87. Masters M., Newman B.J., Henry C.M. Reduction of markers discrimination in transductional recombination//Mol. Gen. Genet. 1984. V. 196. P. 85-90.

88. Mishel В., Ehrlich S.D., Uzest M. DNA double-strand breaks caused by replication arrest // EMBO J. 1997. V. 16. P. 430-438.

89. Mishel В., Flores M.J., Viguera E. et al. Rescue of arrested replication forks by homologous recombination // Proc. Natl Acad. USA. 2001. V. 98. №15. P. 8181-8188.

90. Munch-Petersen A. On the catabolism of deoxyribonucleosindes in sells and sells extracts of E. coli II Eur. J. Biochem. V. 15. P. 191-201.1968.

91. Nakayama K., Irino N., Nakayama H. The recQ gene of Escherichia coli K-12: molecular cloning and isolation of insertion mutations // Mol. Gen. Genet. 1985. V. 200. P. 266-271.

92. Nakayama K., Kusano K., Irino N., Nakayama H. Thymine starvation induced structural changes in E. coli DNA // J. Mol. Biol. 1994. V. 243. P. 611-620.

93. Okada Т., Torii H., Kuno S. Relationship between the site of genetic block in thymineless mutants and the enzyme activity in deoxyribonucleoside catabolism in E. coli II Jap. J. Genet. V. 44. P. 193-205.1969.

94. Razzell W.E., Khorana H.G. Purification and properties of a pyrimidine deoxyriboside phosphorilase from E. coli II Biochim. Biophys. Acta, V.28. P. 562-571. 1958.

95. Rosenberg S.M., Longerich S., Gee P., Harris R.S. Adaptive mutation by deletions in small mononucleotide repeats // Science. 1994. V. 265. P.405-407.

96. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 74. P. 5463-5468.

97. Saveson C.J., Lovet S.T. Tandem repeat recombination induced by replication fork defects in Escherichia coli requires a novel factor, RadC // Genetics. 1999. V. 152. P. 5-13.

98. Savison C.J., Lovett S.T. Enchanced deletion formation by aberrant DNA replication in Escherichia coli II Genetics. 1997. V. 146. P. 457-470.

99. Seigneur M., Bidnenko V., Ehrlich S.D., Mishel B. RuvAB acts at arrested replication forks // Cell. 1998. V. 95 P. 419-430.

100. Sharpies G.J., Ingleston S.M., Lloyd R.G. Holliday junction processing in bacteria: Insights from the evolutionary conservation of RuvABC, RecG and RusA//J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 5543-5550.

101. Shinagava H., Makino K., Amemura M. et al. Structure and regulation of the Escherichia coli ruv operon involved in DNA repair and recombination // J. Bacteriol. 1988. V. 170. P.4322-4329.

102. Shyamala V., Schneider E., Ames G.F. Tandem chromosomal duplications: role of REP sequences in the recombination event at the join-point // EMBO J. 1990. V. 9. P. 939-946.

103. Smith G.R. Homologous recombination in procaryotes // Microbiol. Rev. 1988. V. 52. P. 1-28.

104. Sturtevant A. H. The effects of unequal crossing over at the bar locus in Drosophila//Genetics. 1925. V. 10. P. 117-147.

105. Sukhodolets V. V. Organisation and evolution of the bacterial genome // Microbiol. Sci. 1988. V. 5. P. 202-206.

106. Sukhodolets V.V. Organization and evolution of the bacterial genome // Microbiol. Sci. 1988. V. 5. P. 202-206.

107. Switzer R.L. . Regulation and mechanism phosphoribosyl-pyrophosphate synthetase. II. Exchange reactions catalyzed by the enzyme // J. Biol. Chem. V. 245. P. 283-295. 1970.

108. Switzer R.L. Regulation and mechanism phosphoribosyl-pyrophosphate synthetase. I. Purification and properties enzyme from Salmonella typhimurium II J. Biol. Chem. V. 244. P. 2854-2863. 1969.

109. Tartof K.D. Unequal crossing over then and now // Genetics. 1988. V. 120. P. 1-6.

110. Tlsty Т. E., Albertini A. M., Miller J. H. Gene amplification on the lac region oiE. coli II Cell. 1984. V. 37. P. 217-224.

111. Walsch J. B. Sequence dependent gene fast enough to escape conversion? // Genetics. 1987. V. 117. P. 543-557.

112. Whoriskey S. K., Nghiem V.-H., Leong Ph.-M. et al. Genetic rearrangements and gene amplification in Escherichia coli: DNA sequences at the junctures ofamplified gene fusions // Genes and development (Cold Spring Harbor Lab.). 1987. V. l.P. 227-237.

113. Whoriskey S.K., Nghiem V.-H., Leong Ph.-M. et al. Genetic rearrangement and gene amplification in Escherichia coli: DNA sequences at the junctures of amplified gene fusions // Genes and Development. 1978. V. l.P. 227-237.

114. Zavilgelsky G.B., et al., Action of 1,1-dimethylhydrazine on bacterial cells is determined byhydrogen peroxide, Mutat. Res.: Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. (2007), doi: 10.1016/j.mrgentox.2007.07.012

115. Zeig J., Maples V.F., Kushner S.R. Recombination levels of Escherichia coli K-12 mutants deficient in various replication, recombination, or repair genes //J. Bacteriol. 1978. V. 134. P. 958-966.

116. Zupancic T.J., Marvo S.L., Chung J.H. et al. RecA-independent recombination between direct repeats of IS50 // Cell. 1983. V. 33. P. 629-637.

117. В заключении считаю своим долком принести глубокую благодарность моему научному руководителю доктору биологических наук, профессору

118. Виталию Влидимировичу Суходольцу|, а также моему научному консультанту кандидату биологических наук Илье Влидимировичу Манухову за научное и практическое руководство работой.

119. Выражаю благодарность Г.Б. Завильгельскому, В.Ю. Котовой за прдоставленные плазмиды и за консультации, обсуждение результатов и ценные практические рекомендации при выполнении практической части .