Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Составной транспозон Tn5 и элемент IS50 у Escnericnia coli K-12: транспозиция и ее контроль, структурно-функциональная организация транспоназы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Составной транспозон Tn5 и элемент IS50 у Escnericnia coli K-12: транспозиция и ее контроль, структурно-функциональная организация транспоназы"

САНКТ-ПЕТЕРБ7РИЖИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

2LB_ад____:_

! fqr;

•'•■-' На правах рукописи

ЗИЛЬБЕРГЛЕЙТ Аркадий Самуилович

СОСТАВНОЙ ТРАНСП030Н Тп5 И ЭЛЕМЕНТ IS50 У Escherichia coli К-12; ТРАНСПОЗИЦИЯ И ЕЕ КОНТРОЛЬ,

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТРАНСПОНАЗЫ

%

fC3.00.l5 -- генетика)

Автореферат диссертации на соискание ученей стенени кандидата биологических наук

Сашст-Петербург

1 :>94

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики ЛетерОургекрго института ядерной физики им.Б.П.Константинова РАН.

Научный руководителе - -доктор биологических наук, профессор

В.А.ЛАНЦОВ.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Т.С.ИЛЬИНА, - доктор биологических наук, профессор К.В.КВИТКО..

Ведущее учреждение - Институт молекулярной генетики РАН,

Москва.

Защита состоится " СХУО 199л. г. в »/7» час.

на заседании Специализированного совета Д 063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.15 - "Генетика" при Санкт-Петербургском государственном университете (Санкт-Петербург, Университетская 'набережная, Т/9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан "%7" __ "_ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Л.А.МАМОК

Актуальность теш. Мобильные генетические элементы (м.г.э.) - это фрагменты ДНК в составе геномов, обладающие особенной структурой и высокоавтономные в отношении своего главного свойства - способности к транспозиции, т.е. к перемещению себя или своих копий в различные новые точки генома.

М.г.э. вызывают кнеерционные мутации и вовлекаются в разнообразные события незаконной рекомбинации: образование делоций, дупликаций, инверсий, слияние репликонов и т.п.

В круг фундаментальных биологических проблем, связанных с исследованием м.г.э., входят выяснение молекулярных мехагшзмов упомянутых процессов, выявление и исследование генетических детерминант, вовлеченных в их осуществление и регулирование, выявление эволюционной ролл м.г.э. и размеров их вклада в генетическую изменчивость организмов. Для ряда конкретных м.г.э. достигнуты значительные успехи в изучении их механизмов транспозиции, роля, играемой при этом их собственным;! и "хозяйскими" генами и т.д.

Однако, дагсе в отношении таких интенсивно исследуемых объектов, как бактериальные составные транспсзони Тп5 и ТпЮ, многие детали связанных с ними генетических процессов остаются новыяс-покш'ми. J3 связи с этим представляет значительный интерес, дальнейшее исследование процесса транспозиции и структурио-фушедио-нальнои организации его важнейших детерминант - бслков-тронспо-каз.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование механизма и регуляции транспозиции составного бактериального транспсзона Тп5 к его модуля - IS50. В соответствии с этим били поставлены следующие экспериментальные задачи.

1.Исследовать кинетику накопления событий транспозиции в развивающейся популяции В.coli.

2.Получить доказательства консервативности механизма транспозиции Тп5 и TS50.

3.Сконструировать и исследовать Тп5-подобше транспозо1Ш с видоизмененными белками-детерминантами транспозиции - ропрессо-ром и транспоназой.

4.Используя компьютерные метода, провести структурно-функциональный анализ семейства транспоназ IS-элементсв и транс-поназы IS50, в частности.

Научная новизна и практическая значимость работы. Работа содеркит новые дашше, касающиеся частоты наследуемых транспозиций транспозонов Тп5 и ТпЮ, механизма транспозиции Тп5 и структурно-функциональной организации балков Тпр и Inh - транспоназы и репрэссора транспозиции у Тп5.

Впервые снята кинетика накопления наследуемых транспозиций' Тп5 и ТпЮ в развивающейся популяции E.coli.

Измерена равновесная частота тандемных дупликаций определенного района хромосомы E.coli, и показано ее постоянство во времени и независимость от ряда рекомбинационных и рзпликзциошых детерминант.

Показано, что частота наследуемых в потомстве транспозиций Тп5, оказавшегося в составе тандемной дупликации, возрастает по сравнению с обычным случаем на два порядка величины. Этот эффект объясняется одновременным принятием двух гипотез: а) о "консервативности" механизма транспозиции Тп5 и б) о преобладании для Тп5 транспозиций in с ta (в пределах одного репликона) над транспозициями In trana (между разными репликонами).

Сконструированы пять рекомбинантных транспозонов на основе Тп5 с различными С-концевыми дополнениями к транспоназе и ре-проссору. Определены соответствующие последовательности ДНК. Показано, что С-концевые дополнения к транспоназе и репрессору Тп5 способны дифференцированно и в широком диапазоне изменять частоту транспозиции и степень транспозиционной иммунности соответствующих рекомбинантных транспозонов по сравнению с транспо-зоном Тп5 дикого типа.

С помощью специальных программных средств проведен поиск мотивов ДНК-белкового и белок-белкового взаимодействия в первичных последовательностях транспоназ IS-элементов. Показано, что доминирующим мотивом взаимодействия с ДНК является для них мотив гомеодомена. Для транспоназы Tn5(IS50) обнаружены белки-гомологи; в ее первичной последовательности распознаны_ сайты ДНК-белкового и белок-белкового взаимодействия. На основании

этих данных проведена функциональная разметка пэрзичной последовательности "транспоназы и репрессора Тп5.

Полученные данные углубляют понимание особенностей процесса транспозиции Тп5 и позволяют предложить функциональную модель транспсназного димера.

Агсробация работы. Основные положения работы были представлены на симпозиуме "Генетическая рекомбинация и экспрессия генов у микроорганизмов", (1984), на VJ генетическом симпозиуме СССР-ФРГ', (1985), на VI Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", (1987), на V съезде BOItoC, (1987), на семинарах отделения молекулярной и радиационной биофизики ГШЯФ РАН, на семинаре отдела биохимии Висконсинского университета, Мэдисон, CHIA, (1989), на семинаре отдела микробиологии Техасского университета, Остин, США (1989).

Публикации. По теме диссертации, опубликованы 3 статьи и 4 тезиса докладов.

Структура и объеи работы. Диссертация состоит из I.ВВЕДЕНИЯ, II.ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ, Ш.ЗКСПЕРИШП'АЛЬНОЙ ЧАСТИ, 1У.0БСУЗД£И1Я РЕЗУЛЬТАТОВ, V.ВЫВОДОВ и VI.СПИСКА ЛНТЕРАТУта (263 ссылки, из га« на русском языке - 7). Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 17 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ.

Частота транспозиции Тг.5 и Tn1Q в развивавшейся популяции S.coli, В основе разработанной нами экспериментальной системы, предназначенной для измерения частоты наследуемых транспозиция Тп5 и-ТпЮ, лежит маркировка одного гена этими двумя транспозонями. Использовали штамм ECK100-51Q (АБ1157 ргоЛ*: :Тп5, ТлЮ), в котором транспозоны были тесно сцеплены: коэффициент котрзпедукции маркеров KmR(Tn5) и TcR(Tn10) составил не менее 0,993. События транспозиции выявлялись рвксмбинэ''ионной заменой этого лскуса из локус: дикого типа (ргоЛ*) в ходе трансдукппи фагом Plvir. Так, трянсдуктанта PlvJr(ECK100 pru44)*ECK100-510, ото<5ряжшо по сч:о-соОности расти на среда без пролина, в от^утстьип искомых событий буду'/ иметь фенотип P:-o*Kn:sToK, в случае транспозиции TnS -

Pro"KmRTcs, в случав транспозиции ТпЮ - Pro*KmsTcn. Наряду с этими фенотипами встречается и фенотип Pro*KmRTcR, соответствующий дупликации исходного локуса proA::Тп5,Тп10.

Рассмотрим развивающуюся популяцию клеток, каждая из которых в начальный момент времени содержит транспозон в одном и том зке сайте. Доля меток, претерпевших транспозицию за время i, х, определяется формулой

х = 1 - e-pt, где р - частота транспозиции;

1X1(1 -х) р _--

На рис.1 а ' и 16 представлены экспериментальные зависимости х от t для Тп5 и ТпЮ в различных условиях и для различных штаммов E.colt.

Полученные зависимости позволяют вычислить' частоты наследуемых транспозиций для Тп5 и ТпЮ, которые составляют:

рТпв = 2.5*1О-^ (клетка)-1•(генерация)-1, рТпЮ = 2«3'10_6 (клетка)-1•(генерация)-1.

Частота наследуемых событий транспозиции не зависит от реком-бинационного генотипа клеток, т.к. зависимости х от t совпадают для ЕСК100-510 дикого типа и ЕСК101-510 гесБС sbcB аЪсС.

Рис.1а.Накопление транспозиций Тгб в популяциях ЕСК100-5Ю и ЕСК101-5Ю. По оси абсцисс - время в клеточных генерациях; по оси ординат - доля клеток, претерпевших транспозицию (в %). ° - ЕСК100-510; в - Е0К101-5Ю.

OJO

а 4>

0,05

36 72 108 M 180 216 252 283 Ж 360 396 432

Рис.1(5.Накопление транспозиций Тп10 в популяциях ЕСК100-510 и 35СК101-5Ю в присутствии тетрациклина и без него. По оси абсцисс - время б клеточных генерациях; по оси ординат - доля клеток, претерпевших транспозицию (в %). 0 - ЕСК100-5Ю, пассирование без тетрациклина; в -ЕСК101-5Ю пассирование без тетрациклина; D - ЕСКЮО-510, пассирование с тетрациклином; а ~ ЕСК101-510, пассирование с тетрациклином.

Частота спонтанных дупликаций, включающих ген ргоА хромосош E.colt.

Данные о частоте встречаемости тандемных дупликаций района хромосош E.colt, включающего ген рюА, приведены в табл.1.

Табл.1. Частоты встречаемости дупликаций области гена ргоА хромосош Е.соИ в штатах различных генотипов

Штамм Существенный Доля кле"ток^

генотип

несущих дупликацию,

ЕСК100-510 ЕСК101-510 ЕСК102-510 ЕСК103-510

гес*

гесВС sbcB sbcC

0,4 i 0,2 0,3 - 0,1 0,3 - 0,1 0,4 - 0,1

гесР polA

На протяжении 400 генераций от момента выделения отдельного клона, частоты встречаемости дупликаций: сохранялись постонннимн,

- о -

т.е. измерялась равновесная концентрация дупликаций района ргоА в популяции. На этом равновесии не сказывается изменение "рекомбинационного фона" и дефект ДНК-полимеразы I.

Частота транспозиции Тп5, оказавшегося в составе тандеыной дупликации.

На рис.2 схематически представлена структура тандемных дупликаций, отбираемых нами в описанных выше экспериментах. Присутствуя в геноме клетки, такая дупликация придает ей фенотип Рго*КшнТск. Рекомбинационный распад дупликации по области 1 приводит к возникновению фенотипа Рго'КпГ^с5®. Распад по области 3 -к фенотипу Рго"КтиТс'1. Область 2 очень мала, поэтому в отсутствие специальной селекции рекомбинационные события по этой области не обнаруживаются. Наряду с упомянутыми выше фенотипами, при распаде дупликаций к I с большой частотой обнаруживали и фенотип Рго+КткТс5:. Ш предположили, что его возникновение объясняется

Рис.2. Схема дупликаций, ргоА::Тп5,Тп10 ргоА* использованных в работе.

-1—| о ► |—|—| ~|—|- Цифрами и горизонтальными

1 1 штрихами обозначены гомо-

— — 3 логичные области, рекомби

нация по которым призодит к принципиально разным фенотипам, о - Тп5; > - ТпЮ.

транспозицией Тп5 с последующим распадом дупликации. Действительно, трансдукционный анализ 10 клонов такого типа показал, что Тп5 находится в них уже вне гена ргоА.

Поскольку в этом случае транспозиции Тп5 могут быть зафиксированы по фенотипу только на фоне событий рекомбинационного распада определенной полярности- (по области 1, рис.2), частота транспозиции Тп5 будет определяться по формуле

1п(1-ы*/м) р„ ~ [- .

где м - количество образовавшихся фенотипов Рго*Кт*Тс15, а N -суглма ф---нст1!Поя Рго^КпГТс3 и Рго^КлГТся.

Лла окопорим-знтоз яс измерению частоты транспозиции Тп5 в ¿тих условиях били выбраны 4 независимо отобранных клона дупли-

каций. Средняя частота транспозиции Тп5 в этом случае составила

р„Тп5 = 1.3.10-2 (генерация)-1 •(клетка)-1, что примерно на два порядка выше величины, найденной наш для Тп5 ранее. •

Мы предполагаем, что при транспозиции из состава тандемкой дупликации наследуются такие события, которые не могут быть унаследованы в обычном случав. Это возможно, если:

1.транспозиция Тп5 происходит по консервативному механизму, оставляя двунитевой разрыв й донорном сайте;

2.подавляющая доля событий транспозиции Тп5 происходит 1п с1з, т.е. в пределах одного и того же репликона.

Таким образом, в обычной ситуации подавляющая доля транспозиций Тп5 не наследуется. Уникальная возможность наследования консервативных транспозиций Tn5 ln cia предоставляется дупликацией исходного сайта внедрения. В этом случае рекомбинационное спасение молекулы ДНК, несущей двунитевой' разрыв, становится весьма вероятным, благодаря обширной гомологии по его краям. Учитывая оценки частоты встречаемости тандемных дупликаций в геноме E.aoll и частоты наследования транспозиций Тп5 з рассмотренных случаях, можно утверждать что tn vivo транспозиция из состава тандемных дупликаций составляет до 30% от общего пула .наследуемых транспозиций Тп5.

Рекомбинантные траиспозоны Тп5 с С-кокчевши дополнениям к гену траиспоназы и репрессора.

Два транспозон-специфических белка, существенных для транспозиции Тп5, кодируются одним из образующих его IS-элементсв -IS50R. Первый из этих белков - трэнспоназа, Tnp, (476 пминокис- • лот (ак), 58 кДа), абсолютно необходим для транспозиции. Второй, ингибитор транспозиции, inh (421 ак, 54 нДа), является укороченной на 55 ак с N-конца транспоназой и обеспечивает транспозиционную иммушюсть - подавлг-...w транспозищш экзогенного гомологичного тронспозона или lS-элемента.

Отбор и структурный анализ различных мутаций в Тпр и Inh необходимы дня понимания молекулярных механизмов действия этих ферментов. Сйоей задачей га ставили получение набора p-jKovíOK-

*

нантных мобильных элементов с максимально широким спектром изменений этих.активностей.

Основой для конструирования рекомбинантных элементов послужила следующая особенность структуры Тп5: уникальный для 1Б50 сайт рестрикции В£1П расположен так, что замена внутреннего BglII-фpaгмeнтa Тп5 на любой другой приводит, как правило, к устранению стоп-кодона в рамке считывания белков Тпр и 1гШ и, как следствие этого, к С-концевым дополнениям этих белков. 1Б50Ь 1Б5СЖ

в а

Кш $ ±_

---1-1 Тп5

вё/в я „ вё/в

бт

Н н

4,

вб/в н н ве/в

_± бт 2 2

В5

ctgtctcttgaTCAgatct.....

АСи транспоназа (476 ак)

БТОР репрессор (421 ак)

Тп5-Рб2 ! ТГ15-РС4

я

* у Кт Тр ±_

Вё ВТ Ч ' Бё

_± I То |

[>•—-—> I ТП5-АР2

| Тпб-Ш

Ве/В о Вй __1 ! То г £_

ТП5-КС6

Рис.З. Существенные элементы структуры рекомбинантних транс-позоноб Тп5. Кт - канамицин; Тс - тетрациклин (рНК248); бт - гептамкцин (фрагмент рРН1Л); Тр -триметоприм (фрагмент, включающий ген /гс2 фага Т4); В§ - В§111; В - ВашН1; Н - Н1гнШ1; Б - Бла1; Н1 -Е<;оШ.. Тп5~Рб2 отличается от Тп5~Р04 как и Тп5-Кб1 от Тп5-КС5 ориентацией внутреннего ВдИГ-фрэгмента.

На рис.3 изображены структуры пяти сконструированных наш рекомбинантных трансгозонов.

Эффективность репрессии транспозиции (транспозиционную иммунность) для рекомбинантных транспозонов определяли в опытах типа "прызкок с фага" (\-hop), используя специально сконструированную экспериментальную систему. Она включала штамм-реципиент ЕСК560 Su° гесА5б и дефектный по репликации, рекомбинации и интеграции фаг - донор транспозона Tri5 дикого типа: х551г (к Ъ221 О Р red nin::Tn5). ЕСК560 трансформировали плазмидами с рекомбинант-ными транспозонами, а затем с помощью х551г измеряли в штаммах-трансформантах частоту транспозиции Тп5 дикого типа.

На рис.4 представлены результаты измерений иммунности для всех описанных выше транспозстюв в веде зависимости выхода траяспозактов от концентрации фага-донора Тп5. Как видно, наряда с тривиальной полной утратой иммунной способности (Tn5-KG6) и сравнительно небольшими изменениями этой активности (Tn5-AF2, Tn5-PG2), наблюдается и случай гипериммушюсти (Tn5-PG4), когда выход транспозантов подавлен з 15-20 раз сильнее, чем для Тп5 дикого типа. Весь диапазон изменений! репрессорной активности составляет ТО раз.

Рис.4.Зависимости выхода транспозантоз от концентрации фага - донора Тп5, снятые для разливших резидентных транспозонов. 1 - резидентный транспозоя отсутствует; 2 -Тп5-Ш1 (дгясий тип); 3 - Тп5- Р02; 4 - Тп5-Р^4; г> -тпз-ксб; 6 - Тп5-КС1; 7 - Тп5-АР2.

Эффективность транспозиции рекомбинантных транспозонов измеряли в опытах типа "mating-out", предварительно протрансформиро-вав плазмидами с исследуемыми транспозонами штамм-донор ЕСК603 (MR31/}" pro lac). Реципиентом служил штамм ЕСК086 (как АВ1157, но гесАбб). В потомстве трансконъюгантов, селектируемых по детерминанту устойчивости транспозона, определяли долю не унаследовавших маркеры плазмида, первоначально несшей транспозон.

Результаты измерения частоты транспозиции рекомбинантных элементов представлена как доля (в процентах) от частоты транспозиции Тп5 дикого типа в табл.2.

Табл.2.Сравнительная частота транспозиции рекомбинантных транспозонов,

Транспозон TnS-PG2 Tn5-PG4 Tn5-KG1 Tn5-KG6 Tn5~Aí'2 'Tn5

частота

транспозиции,Ж 240 33 6 2 14 100

С-концевые области генов транспоназы и репрессора рекомбинантных транспозонов были секвенированы. Однако, анализ изменений элементарных свойств белков (заряд, гидрофобность), вносимых соответствующими С-концевыми дополнениями, не позволил однозначно сопоставить их с изменениями в частоте транспозиции и степени иммунности, т.е. в активностях транспоназы и репрессора. Понимание природы описанных изменений требует понимания структурно-функциональной организации этих белков.

Структурно-функциональный анализ первичной последовательности транспоназы IS50 Транспоназы 15-элементов, образующие изофункциональное семейство, в целом негомологичны между собой. Мы предприняли поиск их гомологов в банке PIR (1993), содержащем 97154 белковых последовательности. Поиск проводили с помощью программы "GOMOLA", (Институт цитологии и генетики РАН, Новосибирск). Б результате

были обнаружены два белка с высокой степенью гомологии к транс-поназе IS50 - бычья пакреэтическая рибснуклеаза (ЕС 3.1.27.5; 140 ак; PIR Index:JX0056. Точных совпадений - 48 (29,4%); с учетом консервативных замен - 56 (34,3%)) и рибонуклеаза Т1 из PentctUtvm chrysogenum (ЕС 3.1.27.3; 102 ак; PIR Index:А23620. Точных совпадений - 33 (30,2%); с учетом консервативных замен -40 (36,7%)). Последовательность первого выравнивается с фрагментом 160-314 из Tnp IS50, а второго - с фрагментом 36-129 (Рис.5). Этих наблюдения позволяют выдвинуть гипотезу о наличии у транспоназы IS50 двух нуклеазных сайтов.Логично приписать одному из них функцию расщепления доноркой, а другому - мшенной ДНК.

Ни одного случая значимой протяженной гомологии не было обнаружено для трэнспоназ IS10, IS1B6, IS640, IS1380. Гомологи, обнаруженные нами для транспоназ IS30, TS492, IS26, принадлежали к разным белковым супорсемействам. Поэтому, хотя транспоназы рада IS-элементов допускают выравнивание их последовательностей и несомненно родственны, изофункциснальное семейство транспоназ IS-элементов в целом оказывается семейством конвергентного Tiira.

Используя программные средства, разработанные в ИЦиГ РАН, мы провели распознавание в аминокислотных последовательностях транспоназ следующих мотивов ДШ-белкового и белок-белкового взаимодействия (результаты в табл.3):

1. «-спираль - поворот - с«-спираль. 2.Гомеодомен. (Полного мотива гомеодомена в последовательностях транспоназ ми не обнаружили, но с высокой частотой находили его фрагмент - вторая спираль' - поворот - третья спираль). 3."Лейциноьая застежка" (leucine zipper). (В последовательности транспоназы IS50 мы обнаружили только "димеризационный мотив", тогда как в последовательности транспоназы IS10 - полный мотив "лейциновой застежки"). 4."Цинковый палец" (Zn-flnger) Б.Цинк-связывающий домен СС-СС- типа.

Данные табл.3 хорошо согласуются с гипотезой о принадлежности анализируемых белков к изофункщюнальному семейству: в каждой из белковых последовательностей обнаружены мотани специфического ДНК-с'йякыр£ния, срел<-;ее число" распознанных мотивов на IS-элемент

Таблица 3.Распознавание функциональных мотивов в аминокислотных последовательностях транспоназ IS-элементов. (*) -соответствующий белок - гипотетическая транспоназа

IS-

элемент

IS50

Координаты распознанных функциональных мотивов

Zn-связ. Цинковый Гомеодомен «-спираль- Лейциновая СС-СС палец (спирали 2,3) поворот- застежка домен СС-КН а—сгшрзль (в скобках -

позиции Leu) _ о —4 5 6

252-282 35-54 (265-272-279)

360-390 107-126 (349-355-363) только лейци-новый мотив

IS10

27-57 53-83 111-141 191-221 219-249 259-289

53-130 (116-123-130)

IS1

8-36

20-50 213-243

225-244

IS186

171-201 252-282 314-344

TS986, ORF В*

38-68 58-88 211 -241

IS630*

80-110 138-168 246-276

1 2 .3 4 5 6

233-263

15640* - - 80-110 -

183

204-228

ВСЕГО

-белок-ДНК 1 1 21 4 1

-белок-белок - - 3

составляет 3,6, причем лишь в дьух последовательностях эта величина заметно отклоняется от среднего. Выявлен доминирующий мотив специфического ДНК-связывания: "«-спираль 2 - поворот -«-спираль 3" из гомеодомена. Из суммарно распознанных 28 мотивов ДНК-связывания этот мотив составляет 75% (21 случай). Учитывая, что для анализа были привлечены негомологичные белки, можно сделать следующий вывод: наличие мотива а-спираль '2 - поворот -а-сшфаль 3 гомеодомена является существенным и характеристическим свойством для семейства транспоназ 18~элементов.

В последовательности транспоназы 1350 (рис.5) распознано 4 мотива ДНК-связывания, один из которых расположен з И-концевой области, отсутствующей у белка-репрессора 1пЬ. Последнее дает возможность предположить, что именно структура сх-спираль - поворот - а-сшграль в позициях 35-54 ответственна за специфическое связывание с концам К50 (1п1г, в отличие от Тпр, не связывается с концами 1350).

Выделяет транспоназу 1Б50 наличие двух мотивов "лейциновой застежки", позволяющее строить конкретные гипотезы о мехашгаме ее димеризации и взаимодействия с белком 1пЬ. Мотивы гомеодомена •и "лейцяновых застежзк" перекрываются: в одном случае - полностью, а в другом - частично. Этот факт хорошо согласуется с существующей гипотезой о том, что димеризация транспоназы 1550, предшествующая ее связыванию с ДНК, подавляет транспоназную ак-

31-52 67-86

-16- inh

i---;—*

ct-поворот-«

к

Yra'YKNPNVSAEAIRKAGAMQTYKMQlff^ 120

............а—по*ворот"-<ч"

SNVIAVCDKEADI^«iQDRMl№Ü?VVI^IfflPRKDVESGLYLIDHm^ 240

Leu-застежка ▼ * ▼

IPWGVYDKRGKRKNKPAWUSLSLRSGRim^ 300

"го^ОДомен, спирали ьеи-застежка

* T

LTGri)VTiS]ia^LIÍVIDIYTHRYmiEEPIüaV/Ka,ÜAGAí¿ 360

*

420

гомеодоман, спирали 2,3 SLQWA'XMATAPXGGFMDSKETGIASWGAbWEQVrEL^ 476

Рис.5.Транспоназа IS50: сводные данные по первичной структура. Жирным шрифтом выделены распознанные мотива ДНК-

связывания. Подчеркивания: ......... - область гомологии с

риСонуклеазой Т1; —— - область гомологии с панкреатической бычьей рибонуклеазой. Надстрочные стрелки обозначают остатки лейцинов, входшцих в "лейциноьме застежки". Вукви над строкой - описании «утащш. Другие пояснения ь тексте.

тивность, и лишь обратная последовательность событий: связывание' 'ftip с концом(ами) IS50 а затем - образование димэра Тпр-Тпр может повлечь за собой транспозицию.

Две известные мутации в транспоназэ IE50, 2К110 и РК345 повы-иают общую частоту транспозиции, активность транспоназа In ircms и взаимодействуют in vitro с концевой последовательностью J.S50 кнпчо, чем белок дикого типа, о чем свидетельствует образование n-jHijx типов комплексов ДНК-белок в опытах по ДНК-ретэодации в

гель-электрофорезе. ЕК110 картируется в распознанном нами мотиве а-спираль - поворот - »-спираль, гипотетически ответственном за специфическое взаимодействие с концом IS50, а IK345 - в области, примыкающей с N-концэ к одному из распознанных нами мотивов го-меодомена.

Б заключение отметим, что функциональная разметка Tnp IS50 согласуется и с данными, относящимися к специфичности выбора мишени транспозиции у IS50. При выборе мишени транспозиции IS50 проявляет выраженное предпочтение к "шпилечным" структурам ДНК. Т.к. IS-элемент (транспозон) также способен образовывать в ходе транспозиции "шпильку" (или по крайней мере петлю ДНК со сближенными концами элемента), то реакцию транспозиции Tri5 (IS50) следует рассматривать как реакцию разрыва и воссоединения нитей при взаимодействии двух "шпилечных структур" ДНК. Восемь гипотетических сайтов связывания ДНК, которыми, согласно напшм данным, обладает димер транспоназы, как раз и способны связать восемь двунитевых "хвостов" двух взаимодействующих шпилечных структур ДНК - мишенной и донорной.

ВЫВОДЫ

1.Частота наследуемых событий транспозиции элементов Тп5 и ТпЮ составляет в развивающейся популяции E.colt К-12, соответственно,

рТп5 = 2,5-Ю-4 (клетка)-1 • (генерация)-1, рТп10 = 2«3,10"6 (метка)-1 • (генерация)-1.

2.Частота встречаемости дупликаций района хромосомы E.coli К-12, включающего ген ргоЛ, составляет в развивающейся популяции 0,ЗЖ-0,4Ж и не зависит от целостности генов recB, recC, recF, polA.

3.Частота наследуемых событий транспозиции элемента Тп5 из состава тандемной дупликации повышена по сравнению с обычным случаем на два порядка и составляет

РвТп5 = 1.3.10-2 (генерация)-1•(клетка)-1.

Этот факт свидетельствует в пользу консервативности механизма транспозиции Тп5 и сильного преобладания для этого элемента внутримолекулярной транспозиции над межмолекулярной. В рамках

предлагаемого объяснения этого эффекта оказывается, что треть наследуемых событий транспозиции Тп5 происходит из состава спонтанных тавдемкых дупликаций области, где внедрен транспозон.

4.С-концезые дополнения к генам транспоназы и репрессора Тп5 в широком диапазоне изменяют частоту транспозиции и степень транспозиционной иммунности соответствующих рекомбинантшх транспозонов по сравнению с транспозоном Тп5 дикого типа. Таким образом, размер и строение С-концевых областей транспоназы и репрессора оказываются существенными для функции этих белков.

5.Компьютерные методы анализа аминокислотных последовательностей негомологичных транспоназ IS-элементов демонстрируют конвергентный характер этого семейства белков и выявляют существенные общие черты их структурю-функциональнсй организации: наличие в среднем четырех мотивов специфического связывания ДНК с подавляющим преобладанием среди них мотива гомеодомена.

6.В первичной структуре транспоназы IS.50 распознаны четыро мотива специфического связывания ДНК: два мотива «-спираль -поворот - a-спираль и два мотива гомеодомена; а также два мотива белковой димерязацки "лейциновая гастенаа". Данные функциональной разметки первичной последовательности транспоназы IS50 согласуются с существующими данными о взаимодействии транспоназы с белком-репрессором и последовательностям! ДНК элемента и мишени.

ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ даССЕР1ВДШ.

I -Лрк.С.Зильберглейт, К.Ю.Горышш, В.А.Ланцов. Транспозиции ■ составных элементов Тп5 и ТпЮ и дупликации в геноме Escherichia coll К-12. Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. (1S87) 5: 11-15.

2.И.Ю.Горышин, Арк.С.Зяльберглейт, В.А.Ланцов. Дупликации ДНК выявляют скрытые транспозиции элемента Тп5 в геноме Escherichia coll К-12. Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. (1987) 5: 16-19.

3. Арк.С.Зильберглейт, И.Ю.Горышин, В.-А.Яанцов. Транспозиция и иммунность у составных транспозонов: анализ рекомбинантных элементов Тп5 с измененными активностями транспоназы и репрессора. ДАН ССОР (1990) т.312, N3, 734-737.