Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка mini-Mu системы для эффективной интеграции и амплификации генетического материала в хромосому бактерии E. coli в отсутствие селективного маркера

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка mini-Mu системы для эффективной интеграции и амплификации генетического материала в хромосому бактерии E. coli в отсутствие селективного маркера"

На правах рукописи

Саврасова Екатерина Алексеевна

Разработка mini-Mu системы для эффективной интеграции и амплификации генетического материала в хромосому бактерии Е. coli в отсутствие селективного маркера.

03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических

--- х f^427

- Москва 2007 -

003174427

Работа выполнена в лаборатории №3 Закрытого Акционерного общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Научный руководитель:

доктор биологических наук В 3 Ахвердян

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р С Шакулов ФГУП ГосНИИгенетика

кандидат биологических наук, Г И Каратаев

старший научный сотрудник

НИИ эпидемиологии и микробиологии им, Н Ф Гамалеи РАМН

Ведущая организация: Институт общей генетики РАН

Защита диссертации состоится 2007 года в 14ш на заседании

Диссертационного совета Д 21701301 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу 117545, г Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г Г Заиграева

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. При конструировании штаммов-продуцентов различных биологически активных веществ, в частности аминокислот, широко используется амплификация целевых генов в составе плазмид Данный подход имеет ряд недостатков, связанных с последующим использованием плазмидных штаммов в производстве законодательные ограничения; потенциальная нестабильность плазмидных штаммов при росте в неселективных условиях; сложность создания больших групп независимо экспрессирующихся генов в составе одного вектора

В настоящее время предпочтительным является использование бесплазмидных штаммов-продуцентов. При конструировании таких штаммов на первоначальном этапе осуществляется создание в составе плазмид интегративных кассет, содержащих целевые гены или опероны биосинтеза с оптимизированным уровнем экспрессии, затем проводится интеграция данных кассет в бактериальную хромосому с использованием различных механизмов рекомбинации Интеграция генетического материала возможна по механизму общей рекомбинации бактериальной клетки, при условии наличия достаточно протяженной области фланговой гомологии, а также по механизму сайт-специфической рекомбинации, например, бактериофага X (Datsenko К А et al, 2000). Другим подходом является использование свойств транспозирующихся элементов

Транспозоны являются превосходными и широко используемыми генетическими инструментариями. К настоящему времени разработано много различных типов специализированных производных транспозонов Наиболее широко используемыми являются конструкции, полученные на основе элементов Tn5, ТпЮ и бактериофага Ми, также используются конструкции, основанные на элементах ТпЗ и у5 Транспозоны разнообразны по своей природе и свойствам, среди них наиболее хорошо изученным является фаг-1ранспозон Ми. На основе данного элемента были разработаны системы для получения транскрипционных и трансляционных фьюзов, клонирования гп vivo, картирования хромосомы (Groisman Е А et ей., 1984, Casadaban М J et al, 1986, Lowes М et al, 1995).

Разработка нового генетического инструментария, использующего транспозиционные свойтва фага-транспозона Ми, позволяющего эффективно интегрировать генетический материал в хромосому Е coli в отсутствие антибиотических маркеров в составе mini-Mu векторов, является актуальной и практически значимой для биотехнологии, поскольку в настоящее время предъявляются повышенные требования к промышленным штаммам-продуцентам, одним из которых является отсутствие каких-либо антибиотических маркеров в хромосоме штаммов

Дели и задачи работы. Диссертационная работа посвящена разработке эффективной генетической системы на основе фага-транспозона Ми и ее применению для конструирования штаммов-продуцентов различных аминокислот

В ходе работы решались следующие задачи

- Сравнительная оценка эффективности транспозиции транспозонов Тп5, mim-TnlO, MD4041 и MD4041-thrA*BC

- Оценка возможности использования выбранного транспозона для прикладных задач Конструирование модельного штамма-продуцента треонина с использованием транспозонов MD4041-thrA*BC Проверка характеристик полученных штаммов стабильность продукции и число копий mini-Mu кассет.

- Конструирование на основе элемента mini-Mu MD4041 векторов, содержащих антибиотический маркер, обеспечивающих как эффективную интеграцию и амплификацию генов, так и стабильность полученных штаммов.

- Создание на основе mini-Mu MD4041 новой линии интегративных векторов (малокопийных, безмаркерных), необходимых для решения ряда задач при конструировании штаммов-продуцентов, соответствующих повышенным требованиям

- Оценка эффективности использования элементов генетической системы в неселективных условиях

- Применение данной системы при конструировании бесплазмидного безмаркерного штамма-продуцента валина.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана генетическая система для эффективной интеграции и амплификации генетического материала в хромосому Е coli в отсутствие антибиотического маркера на основе фага-транспозона Ми Данная система является удобным генно-инженерным инструментарием, прикладным назначением которого является конструирование бесплазмидных штаммов-продуцентов биологически активных веществ на основе бактерии Е coli

Осуществлено конструирование новых линий интегративных векторов, несодержащих антибиотический маркер внутри mmi-Mu, и показана эффективность их использования при интеграции и последующей амплификации Осуществлено клонирование ряда генов центрального метаболизма и оперонов биосинтеза различных аминокислот, проведено конструирование двух линии интегративных векторов, которые нашли непосредственное применение при создании ряда штаммов-продуцентов

Разработанная система, в частности, малокопийные безмаркерные mim-Mu векторы были успешно использованы в работах НИИ «Аджиномото - Генетика» при конструировании высокопродуктивных штаммов-продуцентов различных аминокислот

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 печатных работы в отечественном журнале, два тезисных сообщения в материалах научных конференций и три патента. Материалы диссертации докладывались на Смотрах-конкурсах работ сотрудников ЗАО «АГРИ» в июне 2004 и июне 2005 года Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре ЗАО

"АГРИ" и секции по молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП ГосНИИгенетика 12 апреля 2007 года

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы» Работа изложена на 158 страницах, включая 53 рисунка и 23 таблицы Список цитируемой литературы содержит 215 источников, в том числе 5_на русском языке

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Сравнительная оценка эффективности транспозиции транспозонов Тп5, mini-TnlO, mini-Mu (MD4041), MD4041-thrA*BC. Высокоэффективная транспозиция вектора mini-Mu (MD4041).

На первом этапе данной работы была поставлена задача сравнения эффективности применения широко используемых транспозонов Для сравнительной оценки эффективности транспозиции были взяты транспозоны Tn5, mini-TnlO и mini-Mu (MD4041) Также был сконструирован ряд производных транспозона MD4041, содержащих в своем составе гены треонинового оперона thrA *ВС с различной локализацией и ориентацией инсерции внутри mini-Mu, которые были проверены на эффективность использования Данная группа транспозонов была названа MD4041-thrA*BC.

1.1 Оценка эффективности транспозиции транспозонов.

Перечисленные выше транспозоны были проверены на предмет эффективности транспозиции- Tn5, mim-TnlO, mini-Mu (MD4041) и MD4041-thrA*BC Была осуществлена транспозиция данных транспозонов в хромосому штамма Е coli С600. Данный эксперимент был проведен при двух температурах 30°С и 37°С Результаты экспериментов по сравненительной оценке эффективности транспозиции приведены в таблице 1

Таблица 1. Эффективность транспозиции Tn5, mini-TnlO, mrni-Mu (MD4041) и MD4041~thrA*BC в хромосому штамма Е coli С600

Транспозоны Наличие термочувствительных генов Эффективность транспозиции при температуре Отношение эффективности транспозиции 37°С/30°С

30°С 37°С

Тп5 - Ю"5 - Ю"6 Ю-5-Ю-6 1

mim-TnlO - 10"4- 10"5 Ю^-Ю'5 1

mini-Mu(MD4041) cts62 Ю^-Ю"6 10"7-10"s 10 г

MD4041- thrA *ВС cts62 10'5 - 10"6 10"7-10"8 10'2

Из полученных данных видно, что при температуре 30°С эффективность транспозиции Тп5, пиш-Ми (МБ4041) и М040414ЬгА*ВС была одинакового порядка 10~5- 10""6, в то время как для тип-ТпЮ она была на порядок выше При

этом наблюдаемая эффективность транспозиции MD транспозонов при температуре 37°С ниже, чем у транспозонов Тп5 и mmi-TnlO Проведенное исследование показало, что эффективность транспозиции MD4041 и MD4041-thrA*BC снижается на два порядка при повьпыении температуры с 30°С до 37°С, тогда как у транспозонов Тп5 и mini-TnlO она не меняется Наблюдаемая зависимость эффективности транспозиции mini-Mu элементов от температуры объясняется тем, что в составе mini-Mu содержится термочувствительный ген с фага Mu, кодирующий синтез белка репрессора Данный ген содержит мутацию cíí62, приводящую к частичной инактивации репрессорного белка при температуре 37°С (VogelJL etal, 1991)

Другим важным критерием эффективности процесса транспозиции является число копий транспозона, встроившихся в хромосому бактерии в течение одного акта транспозиции. Для ответа на данный вопрос была проведена работа по определению числа копий транспозонов в хромосомах штаммов, которые содержали встройки элементов Tn5, MD4041 и MD4041-thrA*BC В данном эксперименте muu-TnlO не рассматривался, поскольку он показал эффективность транспозиции на одном уровне с Тп5 Данные эксперименты проводились методом ДНК-гибридизации по Саузерну Результаты экспериментов суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Эффективность транспозиции Tn5, mini-Mu (MD4041), MD4041-thrA*BC и число копий этих элементов, встроенных в хромосому бактерий (30°С)

Транспозоны Эффективность транспозиции Число копий

Тп5 10'5- 10"* 1-2

mim-Mu (MD4041) 10"5- 10"6 >10

MD4041-thrA*BC 10"5- 10"6 >10

Как видно из данной таблицы, число копий Тп5 составило 1-2 единицы на хромосому, в то время как для MD4041 и MD4041-thrA*BC наблюдаемое число копий было больше 10 при равной эффективности транспозиции 10"5 - 10"6 при 30°С Таким образом, из полученных данных видно, что истинная эффективность транспозиции значительно больше у mini-Mu элементов, чем у Тп5.

1.2. Стабильность полученных штаммов.

Одним из важных свойств штаммов, содержащих инсерции транспозонов в хромосоме, является их стабильность, которую возможно оценить по выживаемости бактерий Данное свойство является важным при дальнейшем использовании транспозонов в качестве генетического инструментария при конструировании штаммов бактерий с заданными характеристиками. С данной целью была проведена оценка стабильности штаммов Е coli, содержащих в хромосоме копии транспозонов Tn5, MD4041 и MD4041-thrA*BC, при температурах 30°С и 37°С Результаты экспериментов приведены в таблице 3

Таблица 3. Стабильность штаммов Е coli, содержащих элементы Tn5, mim-TnlO, mim-Mu (MD4041) и MD4041-thrA*BC, интегрированные в хромосому, при 30°С и 37°С

Штаммы бактерий Выживаемость Число копий транспозонов в

Е coli бактерий при хромосоме бактерии после

температуре $ыращивания при температуре

30°С 37°С 30°С 37°С

С600 Тп5 1,0 1,0 1 1

MG1655"Tn5 1,0 1,0 1 1

С600- MD4041 1,0 Ю-4 >10 >200

С600 .MD4041- 1,0 10* >10 >200

thrA*BC

Как видно из данной таблицы, выживаемость штаммов, содержащих в хромосоме копии Тп5, не менялась в зависимости от температуры Штаммы, содержащие в хромосоме копии mrni-Mu элементов, вели себя иначе При повышении температуры до 37°С титр бактерий падал на 4 порядка Полученные в проведенном эксперименте результаты хорошо коррелировались с данными по числу копий транспозонов в хромосоме бактерий, выращенных при разных температурах Данное исследование проводилось методом ДНК-гибридизации по Саузерну При увеличении температуры до 37°С число копий Тп5 в хромосоме бактерии не изменилось и составило единицу Напротив, число копий MD4041 и MD4041-thrA*BC возросло на несколько порядков при увеличении температуры, что отрицательно сказалось на выживаемости бактерий (табл 3) Данное явление связано с частичной температурной инактивацией репрессорного гена cts62 при температуре 37°С, приводящей к повышенной активности транспозиционных генов, входящих в состав данного транспозона, и, как следствие, к нерегулируемой репликативной транспозиции mim-Mu транспозонов в хромосомах штаммов, что приводит к гибели бактерий

2. Конструирование продуцента треонина с использованием интегративных векторов MD4041-thrA*BC.

Проведенные эксперименты показали, что полученные характеристики относительно транспозонов группы MD соответствуют возможности использования данных элементов в качестве генетического инструментария при конструировании штаммов бактерий с заданными характеристиками, а именно, с повышенной продуктивностью различных аминокислот.

Сконструированные интегративные mim-Mu векторы группы MD4041-thrA*BC, содержащие в своем составе гены треонинового оперона thrA*BC, были использованы для создания продуцента треонина на основе штамма бактерии Е coli TDH6 (ВКПМ В-3420)

2.1. Конструирование продуцента треонина.

Была осуществлена интеграция данных конструкций в хромосому штамма TDH6. Практически во всех случаях наблюдалась эффективная интеграция

транспозона, что сопровождалось накоплением продукции треонина в ферментационной среде (30°С, 48 ч, среда с сахарозой). В результате проведенных экспериментов были отобраны штаммы 6,12,17,18, обладающие повышенным уровнем синтеза треонина (табл 4) Данные штаммы показали продукцию треонина в пределах от 12,0 до 19,5 г/л, а контрольный штамм П)Н6 с плазмидой рУ1С40 (содержащей гены треонинового оперона ИггА*ВС) - 20,4 г/л треонина Число копий данной плазмиды, приходящееся на хромосому, равняется 10 (репликон ИШ^ОЮ). Определение числа копий треонинового оперона в хромосомах данных штаммов методом ДНК-гибридизации по Саузерну показало, что оно составило больше 10 единиц (табл 4). Таким образом, посредством интеграции треонинового оперона 1кгА *ВС в составе векторов группы М04041-АгА*ВС в хромосому штамма ТЕ)Н6, были получены бесплазмидные штаммы, уровень продукции которых был сопоставим с уровнем плазмидного штамма В-3996(ГОН6/рУ[С40).

2.2. Проверка стабильности штаммов-продуцентов.

Была проверена стабильность продукции треонина и числа копий интегрированных кассет Ж>4041-Й1гА*ВС у полученных штаммов. Для этого штаммы отобранной группы инкубировали при температуре 37°С и после рассева на чашках Петри был отобран ряд клонов, которые были обозначены цифрами с дополнительными индексами (например, производные штамма 12 были обозначены как 12-1,12-2,12-6) В отобранной группе штаммов была определена продукция треонина и число копий транспозона методом ДНК-гибридизации по Саузерну Проведенные работы показали, что штаммы, полученные в данном эксперименте, ведут себя неодинаково На основании полученных результатов штаммы были разделены на две группы по признаку увеличения или снижения продукции треонина (табл 4)

Таблица 4. Характеристика штаммов-продуцентов треонина, отобранных после инкубации при температуре 37°С.

Штамм Число интегрированных копий М04041-Й1гА*ВС Треонин, г/л

17* >10 189

17-1 >10 19 5

18* >10 193

18-1 >10 21 5

6* >10 16 5

6-0 4 97

12* >10 17 4

12-1 >10 17 6

12-2 7 12 5

12-6 7 13 2

* Родительские штаммы не подвергали инкубации при 37°С.

Увеличение продукции треонина в первой группе штаммов (17,17-1,18,18-1) коррелировало с увеличением числа копий треонинового оперона в хромосоме бактерий. Результаты ДНК-гибридизации по Саузерну другой группы штаммов (6,6-0,12,12-1,12-2,12-6), в которой наблюдалось уменьшение продукции треонина, показали, что наблюдаемое явление связано с уменьшением числа копий треонинового оперона в хромосоме штаммов. В результате проведенных экспериментов был сделан вывод о том, что наблюдаемая нестабильность штаммов при температуре 37°С связана с экспрессией генов транспозазы, входящих в состав транспозона MD4041. Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о необходимости контролирования процесса транспозиции в целях получения стабильных штаммов-продуцентов Решению данной задачи был посвящен следующий раздел данной работы

3. Конструирование на основе элемента mini-Mu MD4041 векторов, обеспечивающих эффективную интеграцию и амплификацию генов, а также стабильность полученных штаммов.

Задача контролирования процесса транспозиции может быть решена путем разделения функций, кодируемых транспозоном mini-Mu MD4041, на два отдельных модуля интеграционный и транспозиционный Интеграционный модуль (mini-Mu вектор) должен содержать минимальные сайты, необходимые для интеграции (attL- и айй-сайты фага Mu), а транспозиционный (плазмида, конторлирующая синтез транспозазы А и белка-активатора В) - функции необходимые для транспозиции.

Создание двухплазмидной системы было осуществлено в несколько этапов 1) конструирование плазмиды — помощницы, заключающей в себе транспозиционный модуль, 2) конструирование различного вида mini-Mu векторов, 3) проверка эффективности использования разработанной системы

3.1. Конструирование транспозиционного модуля.

Плазмида, используемая в качестве экзогенного источника транспозазы, не должна быть способна к независимой транспозиции, поэтому она не должна содержать оба att-сайта фага Mu Для эффективной интеграции генов, находящихся под контролем сильного PR-промотора фага X, который предполагалось использовать в составе интегративных векторов, необходимо присутствие на транспозазной плазмиде гена, кодирующего термочувствительный репрессор фага X, cl857 Кроме того, транспозазная плазмида должна быть совместима по репликону с интегративным вектором mmi-Mu (репликон рМВ1). В качестве подходящего вектора для транспозиционного модуля нами была выбрана плазмида pcl857j ранее полученная в нашей лаборатории. Плазмида pclgs7 содержит термочувствительный репрессор фага X clg57 на репликоне р15А (pACYC177), совместимом с рМВ1 Конструирование транспозазной плазмиды рМНЮ было осуществлено посредством клонирования транспозиционного модуля из плазмиды pMud4041 в вектор pcl857 Таким образом, полученная транспозазная плазмида-помощник рМНЮ содержит afíi-сайт, репрессорные гены cts62 и пег, гены А и В фага Mu, контролирующие синтез транспозазы и кофактора транспозиции,

соответственно (рис.1). При наличии только одного из att сайтов транспозиция данного вектора не может осуществляться. При повышенной температуре 42°С индуцируется экспрессия транспозазы А и белка активатора В, которые необходимы для транспозиции mini-Mu вектора.

Рисунок 1.Схемы плазмид pMud4041 ирМШО.

3.2. Конструирование mini-Mu векторов, содержащих антибиотический маркер.

Конструирование минимальных mini-Mu векторов было выполнено также на основе плазмиды pMud4041 путем удаления внутренней последовательности между attL- и attR-сайтами фага Mu. В результате проведенной работы были получены два вектора pM-cts-IAS и рМ (рис.2). Вектор pM-cts-IAS содержит в своем составе attL- (445 п.н.) и attR- сайты (118 п.н.), репрессорный ген cts62, LAS-элемент и маркер антибиотической устойчивости к канамицину внутри mini-Mu. В экспериментах in vivo было показано, что LAS-элемент повышает эффективность транспозиции в 100 раз (Harshey R.M. et al., 1989). В ходе работы предполагалось проверить, окажет ли положительный эффект присутствие LAS-элемента в составе интегративного вектора на процесс транспозиции в условиях данной двухплазмидной системы. Другой вектор, рМ, содержит только attL- и attR-сашы фага Mu, а также маркер устойчивости к канамицину (рис.2). Таким образом, были сконструированы минимальные mini-Mu векторы, которые способны осуществлять транспозицию только в присутствии плазмиды рМНЮ, несущей транспозазный модуль. Клонирование в данные векторы предполагалось осуществлять с заменой маркера антибиотической устойчивости, поскольку он совпадает с маркером транспозазной плазмиды рМШО.

Рисунок 2. Схемы плазмид pM-cts-IAS и рМ.

3.3 Оценка эффективности интеграции векторов, содержащих антибиотический маркер.

Полученные векторы были проверены на способность к осуществлению интеграции. С этой целью в данные mini-Mu векторы рМ и pM-cts-IAS было проведено клонирование генов треонинового thrA*BC и лейцинового оперонов leuA *BCD, находящихся под регуляцией собственных промоторов и Р R- промотора фага X. В результате проведенных работ были получены плазмиды: pMcts-thrA*BC-Cm , pM-thrA*BC-CmR, pMcts-PR-thrA*BC-CmR, pM-PR-thrA*BC-CmR, pMcts-PR-leuA*BCD-CmR и pM-PR-leuA*BCD-CmR. Данные конструкции были интегрированы с использованием транспозазной плазмиды рМНЮ в модельные штаммы-продуценты треонина и лейцина в идентичных условиях по стандартной методике (Ахвердян В.З. и др., 2007). В качестве реципиента треонинового продуцента был использован штамм TDH6, а в качестве реципиента лейцинового продуцента - штамм С600. Была проведена оценка эффективности интеграции mini-Mu векторов среди бесплазмидных клонов на основании устойчивости к антибиотическому маркеру, находящемуся внутри mini-Mu. Полученные данные суммированы в таблице 5.

При использовании разработанной системы интеграции необходимо введение в реципиентный штамм двух плазмид, поэтому оценка эффективности интеграции проводилась следующим образом: "Эффективность интеграции mini-Mu" определена как отношение числа интегрантов среди проверенных клонов (по маркеру антибиотической устойчивости внутри mini-Mu или методом ДНК-гибридизации по Саузерну) к общему числу проверяемых клонов, выраженное в процентах. Проверка осуществлялась соответственно после этапов излечивания от обеих плазмид согласно стандартной методике.

Таблица 5. Зависимость эффективности интеграции пиш-Ми с удаленными генами, кодирующими транспозазу (А) и активатор транспозиции (В), от присутствия репрессора сйб2 и сайта газ, активирующего транспозицию в сгв-положении

Вектор mini-Mu Сохраненные сайты и гены Mu Удалены гены Ми Эффективность интеграции, %

MD4041-thrA*BC-KmR attL cts62 ias пег А В attR - ю-5

Mcts-thrA *BC-CmR attL cts62 ias attR пег, А, В 2

Mcts-Ps-ihrA *BC-Cm& attL cts62 ias attR пег, А, В 3

Mcts-Pg-leuA *BCD-mK attL cts62 ias attR пег, А, В 2

M-thrA *BC -CmK attL attR с($62, шя, пег, А, В 99

M-Pg-thrA *BC -CmR attL attR С1ч62, ШЯ , пег, А, В 98

M-Pg-leuA *BCD -CtnK attL attR Шб2, га«, пег, А, В 100

Из данных таблицы 5 видно, что разделение модулей интеграции и транспозиции, а именно, использование двухплазмидной системы привело к значительному увеличению эффективности интеграции (на несколько порядков) Удаление из состава вектора репрессорного гена cts62 и IAS-элемента привело к увеличению эффективности интеграции в 33-50 раз Полученная в данном эксперименте группа штаммов была проверена с использованием метода Саузерна путем гибридизации с меченой ДНК треонинового thrA*BC и лейцинового leuA*BCD оперонов для определения числа копий интегрированных генов Результаты проведенных экспериментов суммированы в таблице 6 и на рисунке 3(8,6)

Таблица 6. Зависимость числа интегрированных копий mini-Mu элементов от присутствия репрессора cts62 и сайта ias, активирующего транспозицию в cis-положении.

Наличие в Эффективность Число копий

Вектор mim-Mu mini-Mu интеграции mim-Mu,

гена cts62 и mim-Mu, в % нтегрированных в

сайта ias хромосому бактерии

Mcts-thrA *ВС -Стк 2 1

Mcts-Pg-thrA *ВС-Стк cts62 tas 3 1

Mcts-Pg-leuA *BCD -Стк 2 1

M-thrA *ВС -Стк 99 1-5

M-PjcihrA *ВС -Стк - 98 1-5

M-Ps-leuA *BCD -Стн 100 1-5

Из данных, приведенных в таблицах 5 и 6 видно, что присутствие в составе интегративного вектора LAS-элемента не оказывает положительного влияния при наличии репрессорного гена cts62, который отрицательно влияет не только на эффективность интеграции, но и на число копий транспозона, интегрированного в хромосому. При наличии репрессорного гена cts62 эффективность интеграции векторов составила 2-3%, а число копий mini-Mu кассет в хромосомах проверяемых штаммов равнялось единице (рис.За). Удаление гена cts62 и IAS-элемента из состава вектора привело к увеличению числа копий mini-Mu (M-thrA*BCTCmR, M-PR-thrA*BC-CmR, M-PR-leuA*BCD-CmR), интегрированных в хромосому бактерии. Как показали проведенные эксперименты, количество интегрированных копий mini-Mu в хромосомах изучаемых штаммов варьировало от 1 до 5 единиц (рис.3б). Количество копий оценивали по числу полос на радиоавтографах и их интенсивности.

123456789 10 123456789 10 11

(а) б)

ш»т тт —•

Рисунок 3. Результаты гибридизации по Саузерну: а) штаммы, содержащие копии треонинового оперона thrA*BC, интегрированного в составе вектора pM-cts-IAS: 1- контроль TDH6, 2-10- изучаемые штаммы (TDH6::Mcts-thrA*BC-CmR); б) штаммы, содержащие копии лейцинового оперона leuA *BCD, интегрированного в составе вектора рМ: 1 - контроль С600, 2-11 - проверяемые штаммы (C600.:M-PR-leuA*BCD-CmR).

Таким образом, разделение модулей интеграции и транспозиции элемента MD4041 привело к повышению эффективности интеграции mini-Mu векторов. Удаление из состава интегративного вектора репрессорного гена cts62 привело к увеличению эффективности процесса интеграции и достигло практически 100%.

Другим важным свойством разработанной двуплазмидной системы является возможность контролируемого увеличения числа копий mini-Mu вектора, интегрированного в хромосому бактерии, при использовании только транспозазной плазмиды. Для этой цели в полученные на предыдущем этапе штаммы-продуценты треонина и лейцина, содержащие в хромосоме интегрированные копии векторов mini-Mu двух видов, была введена транспозазная плазмида рМНЮ и проведена температурная индукция синтеза транспозазы с данной плазмиды согласно стандартной методике. Число копий mini-Mu элементов

в хромосоме полученных штаммов было определено методом ДНК-гибридизации по Саузерну Результаты экспериментов суммированы в таблице 7.

Таблица 7. Зависимость увеличения числа итегрированных копий mmi-Mu после повторной транспозиции с использованием плазмиды рМНЮ от присутствия в составе mim-Mu вектора гена-репрессора cts62 и сайта xas, активирующего транспозицию в сад-положении.

Вектор mini-Mu Наличие в mini-Mu гена cts62 í сайта ms Увеличение числа копий mini-Mu, интегрированного в хромосому

Интеграция Амплификация

Первая Вторая

Mcts-thrA *BC-CmK cts62 ias 1 2 3

Mcts-PR-thrA *BC-Cm" 1 2 i_ з

Mcts-Pjt-leuA *BCD-CmR 1 2 3

M-thrA *BC-CmK - 4 7 12

М-Рд-thrA *BC-CmK 4 7 10

M-PjrleuA *BCD-Cm" 4 7 10

Из данных таблицы 7 видно, что амплификация с использованием транспозазной плазмиды привела к увеличению числа копий mmi-Mu в хромосоме бактерий, причем увеличение наблюдалось в случаях двух видов векторов (рМ и pM-cts-IAS) При использовании интегративного вектора без репрессорного гена процесс амплификации происходил более эффективно, число интегрированных копий mini-Mu было увеличено с 4 до 7 Следует заметить, что процесс амплификации векторов группы pM-cts-IAS был мало эффективен Число интегрированных в хромосому копий mini-Mu увеличилось с единицы до двух, причем амплификация наблюдалась только в менее 5% проверенных клонов, в остальных же число копий оставалось на исходном уровне

Далее полученные таким образом штаммы были проверены на возможность применения второго цикла амплификации Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 7 Из приведенных данных видно, что повторная амплификация также привела к увеличению исходного числа копий mini-Mu вектора в хромосоме реципиентных штаммов Как и в первом цикле, эффективная амплификация наблюдалась у векторов, которые имеют только üttL-и attR-сайты фага Mu (pM-thrA*BC-CmR, pM-PR-thrA*BC-CmR, pM-PR-leuA*BCD-CmR); копийность элементов возросла до 10-12 единиц Следует отметить, что интегрированные после первого и второго этапа копии mini-Mu кассет сохранялись, локализация сайтов интеграции генов thrA*BC и leuA*BCD также не менялась, наблюдалось образование новых копий, что согласуется с репликативной моделью транспозиции фага Mu. Амплификация векторов группы pM-cts-IAS была также мало эффективна. Увеличение числа копий с 2 до 3 наблюдалось в менее чем 5% изученных клонов На основании полученных в ходе проведенных экспериментов данных нами был сделан вывод о том, что более

эффективный процесс интеграции и амплификации наблюдался при использовании векторов mini-Mu, содержащих только attL- и attR-сгжы фага Mu (вектор рМ)

Следует отметить, что при создании штаммов-продуцентов увеличение числа копий определенных генов может быть нежелательно В таких случаях можно рекомендовать использовать вектор pM-cts-IAS, обеспечивающий низкое число копий интегрированных генов

3.4 Стабильность штаммов, содержащих в хромосоме интегрированные

mini-Mu кассеты.

Важной характеристикой полученных штаммов-продуцентов является стабильность продукции Проведенная оценка стабильности штаммов-продуцентов треонина и лейцина, полученных посредством интеграции и амплификации соответствующих оперонов биосинтеза (thrA*BC и leuA*BCD), после инкубации при повышенной температуре 37°С и семи последовательных пересевов в течение месяца показала отсутствие различий в продуктивности штаммов Полученные штаммы поддерживали продуктивность на прежнем уровне, которая составляла 98-100% по отношению к продуктивности исходного штамма.

3.5 Зависимость утраты плазмид mini-Mu вектора и модуля транспозазы от наличия гена-репрессора Mu в составе интегративного вектора.

Проведение работы с использованием двухплазмидной системы показало, что немаловажным критерием оценки эффективности применения системы является утрата плазмид после этапа интеграции, так как для дальнейшего анализа и работы отбираются только те клоны, в которых наблюдается утрата обеих плазмид. Была проведена робота по оценке утраты векторов mmi-Mu и транспозазной плазмиды при проведении экспериментов по интеграции треонинового и лейцинового оперонов в хромосомы реципиентных штаммов Полученные в результате проведенных экспериментов данные свидетельствуют о том, что удаление гена-репрессора Mu cts62 из состава интегративного вектора приводит к увеличению эффективности утраты обеих плазмид (mini-Mu вектора и рМНЮ) в 20-50 раз Таким образом, при использовании векторов группы рМ, содержащих только attL-и attR-сшш фага Mu, эффективность утраты обоих плазмид разработанной системы стала практически 100%

В результате проведенной работы по оценке эффективности интеграции и амплификации 2 групп векторов рМ и pM-cts-IAS, стабильности полученных штаммов-продуцентов и на основании данных по эффективности утраты плазмид, был сделан вывод об эффективности использования данной системы для задач конструирования бесплазмидных штаммов-продуцентов

4. Конструирование малокопийных интегративных векторов mini-Mu, несодержащих антибиотический маркер.

В настоящее время предъявляются повышенные требования к промышленным щтамма-продуцентам, одним из которых является отсутствие антибиотических маркеров в хромосоме штаммов. Проведенные эксперименты показали, что разработанная mini-Mu система поддерживает эффективную интеграцию и амплификацию интегрированных генов в хромосому Е. coli в составе векторов, содержащих антибиотический маркер внутри mini-Mu. Нами было сделано предположение, что полученные результаты свидетельствуют о возможности использования разработанной системы для интеграции генов в хромосому Е. coli в отсутствие антибиотического маркера в составе mini-Mu вектора. С другой стороны, для обеспечения стабильности интегративных mini-Mu векторов, содержащих в своем составе гены, находящиеся под контролем сильного PR-промотора фага X, необходимо использовать векторы с меньшей копийностью. Таким образом, возникла необходимость создания новой линии малокопийных интегративных mini-Mu векторов, в которых предполагалось отсутствие антибиотического маркера внутри mini-Mu. Данная задача была выполнена в несколько этапов. Оценку наличия интеграции в полученных в результате проведенных экспериментов штаммах предполагалось проводить несколькими методами: ДНК-гибридизацией по Саузерну, ПЦР, а также по уровню продукции аминокислоты.

4.1. Конструирование интегративных mini-Mu векторов рМ16 и рМ17.

При конструировании новой линии интегративных mini-Mu векторов в качестве малокопийного репликона была использована производная плазмиды pMW119 - pMWl. Данная плазмида была получена из плазмиды pMW119 (репликон pSCIOl) путем удаления /ас-области и полилинкера. Далее была осуществлена интеграция in vivo элемента mini-Mu MD4041 из бактериальной хромосомы штамма LE::MD4041 в вектор pMWl. В результате проведенной работы была получена рекомбинантная плазмида pMWl::MD4041 (рис.4), далее на основе которой были сконструированы интегративные векторы.

kan (KmR)

Рисунок 4. Схема интегративного вектора pMWl::MD4041.

16

Было проведено удаление внутренней последовательности между «//-сайтами фага Ми и встраивание двух тендемных копий терминатора транскрипции фага ГсЗ, полилинкера для клонирования генов, а также Рк-промотора фага X (вектор рМ17). В результате проведенной работы было получено два вектора рМ16 и рМ17 (рис.5) для клонирования генов под собственной регуляцией, а также под контролем сильного Рк-промотора фага X (соответственно).

гер (pSC101)

(pSC101)

Рисунок 5. Схемы интегративных векторов рМ16, рМ17.

4.2. Определение структуры интегративного вектора рМ17.

Поскольку вектор pMWl::MD4041 был получен путем клонирования гп vivo, необходимо было определить точное место встраивания mini-Mu на векторе pMWl. С этой целью было проведено определение нуклеотидной последовательности вектора рМ17 с использованием в качестве праймеров олигонуклеотидов, комплементарных последовательности attL- и attR-сайтов фага Mu, а также векторной части молекулы. Проведенный анализ результатов определения последовательности нуклеотидов показал, что транспозиция mini-Mu с плазмиды pMud404i в вектор pMWl прошла в районе par-сайта и сопровождалась дупликацией последовательности из 5 п.н. (ggggt). Данная транспозиция является классической встройкой Mu в вектор на основании данных описанных в литературе (Casadaban М. et al., 1991). Дупликация 5 п.н. сайта-мишени подтверждает, что акт встраивания mini-Mu в вектор pMWl является истинным транспозиционным событием. В векторе mini-Mu расположен следующим образом; aííL-сайт фага Mu находится перед геном герА на расстоянии 490 п.н., attR-оаш на расстоянии 470 п.н. от начала гена Ар". Эти результаты соответствуют данным, полученным ранее, на основании рестрикционного анализа. В результате секвенирования вектора pMWl показано, что инверсии и делеции в векторной части молекулы отсутствуют.

5. Эффективность разработанной mini-Mu системы в неселективных условиях.

В данном разделе суммированы результаты экспериментов по оценке эффективности интеграции как многокопийных, так и малокопийных mim-Mu векторов, несодержащих антибиотический маркер. Как было сказано ранее, оценку наличия интеграции при использовании безмаркерных интегративных векторов mim-Mu предполагалось проводить несколькими методами ДНК- гибридизацией по Саузерну, ПЦР, а также по уровню продукции аминокислоты.

5.1. Изучение эффективности интеграции генов биосинтеза аминокислот.

В многокопийном интегративном векторе рМ было осуществлено клонирование оперонов биосинтеза различных аминокислот, треонина, изолейцина, валина и лейцина. Были сконструированы интегративные векторы pMPR-thrA*BC, pMPR-ilvG*MEDA*YC, pMPR-ilG*MEDA, pMPR-leuA*BCD и проведена интеграция данных конструкций в хромосому штамма Е coli С600 Полученные в результате экспериментов клоны после этапа излечивания от плазмид были проверены на наличие интеграции методом ДНК-гибридизации по Саузерну В каждом случае было проверено по 20 клонов. Результаты оценки эффективности интеграции в проведенных экспериментах суммированы в таблице 8

Таблица 8. Эффективность mini-Mu интеграции различных генов в хромосому штамма Е coli С600.

Гены, клонированные в mini-Mu векторах Эффективность интеграции, в%

PjcthrA*BC 95 -100

Ps-ilvG*MEDA*YC 95

PR-ilvG*MEDA 85

PR-leuA *BCD 95

%

Из приведенных в таблице 8 данных видно, что во всех случаях наблюдался высокий процент интеграции от 85 до 100% Полученные данные показывают, эффективность использования разработанной системы в целом и интегративных векторов mini-Mu группы рМ, несодержащих антибиотический маркер, в частности.

5.2. Влияние терминации транскрипции внутри mini-Mu вектора на эффективность интеграции.

Наши исследования также показали важность наличия эффективного терминатора транскрипции внутри mini-Mu вектора для инеграции генов в бактериальную хромосому Е coli. Результаты, подтверждающие данное влияние, были получены на основании экспериментов по интеграции валияового, треонинового оперонов в составе многокопийных и малокопийных интегративных векторов, содержащих и несодержащих эффективные терминаторы транскрипции,

в качестве которых были выбраны двойной терминатор фага fd и терминатор изолейцин-валинового оперона Tllv Были сконструированы интегративные векторы pMPR-ilvG*MED, pMPR-ilvG*MED-2Tfd, pMPR-ilvG*MED-TiIV (репликон pMBl), pM-Aatt-thrA*BC, pM-Aatt-thrA*BC-2Tfd (репликон pSClOl). Интеграция данных mmi-Mu векторов в хромосому штамма £ coli С600 была осуществлена по стандартной методике Полученные клоны были проверены на наличие интеграции методом ДНК- гибридизации по Саузерну и ПЦР методом. В каждом случае было проверено по 20 клонов Результаты экспериментов суммированы в таблице 9

Таблица 9. Влияние присутствия эффективного терминатора транскрипции внутри mmi-Mu вектора на интеграцию генов в хромосому Е cóli

Гены, клонированные в mini-Mu векторах Эффективность интеграции, в%

P¡rilvG*MED 2

Pg-ilvG*MED-2Ta 95

PR-dvG*MED-T¡h 90

A-att-thrA*BC 3

A-att-thrA *BC-2Tfd 80

Как видно из таблицы 9, в отсутствие эффективного терминатора транскрипции эффективность интеграции валинового, треонинового оперонов низкая Введение в данные конструкции двойного терминатора транскрипции фага fd или терминатора транскрипции изолейцин-валинового оперона T,iv повысило эффективность процесса интеграции до 80-95%.

Мы считаем, что причина данного повышения эффективности интеграции заключается в пространственном разрешении транспозиционного комплекса, являющегося обязательным промежуточным соединением в процессе транспозиции. В отсутствие эффективной терминации РНК-полимераза может вызывать пространственные ограничения при образовании транспозосомного комплекса, блокируя связывание транспозазы фага Ми с aft-сайтами

5.3. Эффективность интеграции в процессе первичной транспозиции.

Другой важной характеристикой эффективности процесса интеграции является количество копий интеграционной кассеты, встроившихся в бактериальную хромосому в течение одного цикла. С учетом данного критерия была проведена оценка эффективности интеграции следующей группы генов треонинового оперона thrA*BC, валинового оперона ilvG*MEDA и лещинового оперона leuA*BCD Была осуществлена интеграция многокопийных mini-Mu векторов pMPR-thrA*BC, pMPR-ilvG*MEDA, pMPR-leuA*BCD в хромосому штамма Е coli С600. Полученные в результате экспериментов бесплазмидные клоны были проверены методом ДНК-гибридизации по Саузерну на наличие интеграции Для каждого оперона было проверено по 100 независимо полученных бесплазмидных клонов Результаты экспериментов суммированы в таблице 10

Таблица 10. Эффективность интеграции mini-Mu векторов в хромосому Е coli

Гены, клонированные в mini-Mu векторах Доля штаммов с различным числом копий интегрированных генов, в % от общего числа исследуемых штаммов

1 копия 2 копии 3 копии 4 копии 5 копий

Pg-thrA *ВС 17 23 35 15 10

PR-ilvG*MEDA 15 25 40 15 5

PjrleuA *BCD 20 25 33 15 7

Из приведенных в таблице 10 данных видно, что наиболее эффективно происходила интеграция 3 копий исследуемых интеграционных конструкций, что составило от 33 до 40% от общего числа проверяемых клонов В 25% проверяемых клонов наблюдалось по две копии интегрированных генов Эффективность встраивания одной копии составила от 15 до 20% Интеграция более чем 3х копий наблюдалось с убывающей эффективностью: для четырех составило 15% и для пяти копий - от 5 до 10%. Хорошим показателем эффективности разработанной безмаркерной системы является то, что более 80% проверенных клонов содержит более одной копии интегрированных mini-Mu кассет

5.4. Амплификация mini-Mu кассет, интегрированных в хромосому бактерии.

Важным свойством разработанной системы является возможность дополнительной амплификации ранее интегрированных в бактериальную хромосому генов при помощи транспозазной плазмиды рМНЮ С этой целью в реципиентные штаммы, в которые ранее были интегрированы гены треонинового оперона thrA*BC, валинового оперона ilvG*MED-2Tfd и гены PTS системы транспорта сахарозы scrKYABR, была введена плазмида рМНЮ и осуществлена амплификация по стандартной методике Оценка полученных штаммов на наличие амплификации проводилась методом ДНК-гибридизации по Саузерну В данном исследовании было проведено два последовательных этапа амплификации и на каждом определялось число копий интеграционных mirn-Mu кассет в хромосомах штаммов Данные по эффективности амплификации генов приведены в таблице 11

Таблица 11. Двухэтапная амплификация генов, интегрированных в хромосому Е coh, с использованием транспозазной плазмиды рМНЮ

Гены, клонированные в mini-Mu векторах Амплификация генов, интегрированных в хромосому, с использованием плазмиды рМНЮ

Интеграция Первая амплификация Вторая амплификация

P¡rthrA*BC 4 7 10

PjrilvG*MED-2Tfd 4 7 10

scrKYABR 1 3 5

Как видно из результатов, представленных в таблице 11, в хромосоме изучаемых штаммов исходное количество копий генов треонинового и валинового оперонов составляло 4 единицы После проведения первого этапа амплификации копийность равнялась 7 в обоих случаях Проведенная повторная амплификация позволила увеличить число интегрированных копий до 10 В случае генов PTS системы транспорта сахарозы после проведения первого цикла амплификации число копий равнялось 3 Проведенный затем второй этап амплификации позволил увеличить копийность до 5 единиц.

Значение присутствия в составе интегративного вектора эффективного терминатора транскрипции для процесса интеграции было уже показано ранее Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что его наличие также важно для процесса амплификации

5.5. Эффективность интеграции малокопийных интегративных: mini-Mu векторов.

Была проведена оценка эффективности интеграции безмаркерных малокопийных интегративных mini-Mu векторов. Результаты проведенных экспериментов представлены в данном разделе В малокопийных интегративных векторах рМ16, рМ17 (рис 5) было осуществлено клонирование ряда генов гликолитического пути pfiA (фосфофруктокиназа), pgi (фосфоглюкоизомераза), glk (глюкокиназа), епо (енолаза), генов общего метаболизма ррс (фосфоенолпируваткарбоксилаза), ррс*, pntAB (трансгидрогеназа), aspA (аспартаза), aspC (аспартатаминотрансфераза), а также генов биосинтеза треонина thrA*B и гена asd (аспартат-Р-полуальдегиддегидрогеназа) Полученные mirn-Mu векторы были интегрированы в хромосому штамма Е coli MGI 655 по стандартной методике Затем была проведена оценка эффективности интеграции методом ПЦР среди полученных бесплазмидных клонов с использованием в качестве праймеров соответствующих пар олигонуклеотидов, комплементарных attL- или айй-сайтам фага Mu и определенной последовательности исследуемого гена В каждом опыте была осуществлена проверка 20 клонов Результаты экспериментов суммированы в таблице 12

Таблица 12. Эффективность интеграции в хромосому Е coh генов, клонированных в малокопийных интегративных векторах.

Гены, клонированные в mini-Mu векторах Эффективность интеграции, в %

Рв-pfkA 90 - 100

Рц-PZi-pfkA 85

Ря-Я1к 75

P¡¡ -епо 90 - 100

Рй-ррс* 75

PR-PPC 75 - 90

pntÄB 80 - 90

PR -asd 75

Pr -aspC-asd 95 - 100

Pr -ppc-aspA-pntAB 80 - 100

ppc-aspA-pntAB-Aatt-thrA *B 80

Из данных, приведенных в таблице 12 видно, что во всех случаях наблюдалась высокая эффективность интеграции - от 75 до 100% (данные получены на основании нескольких экспериментов) Таким образом, результаты проведенных экспериментов показывают, что разработанная mini-Mu интеграционная система обеспечивает эффективную интеграцию генетического материала в хромосому Е coh в отсутствие селективного маркера и последующую его амплификацию

6. Использование разработанной интегративной mini-Mu системы для конструирования бесплазмидного штамма-продуцента валина, несодержащего маркер антибиотической устойчивости.

При конструировании штамма-продуцента валина в качестве реципиента был использован штамм V-01. Данный штамм был получен на основе штамма дикого типа Е coli MGI 655 путем последовательного внесения мутаций ilvGS и ileSl 7 посредством Р1-трансдукции

Штамм-продуцент валина V-4 был получен на основе штамма V-01 путем интеграции генов валиного оперона, находящихся под регуляцией PR-npOMOTOpa фага X, из состава плазмиды pMPR-ilvG* MED-2Tfd в бактериальную хромосому штамма V-01 и последующими несколькими этапами амплификации данного оперона при помощи транспозазной плазмиды рМНЮ

На первом этапе конструирования была осуществлена интеграция mini-Mu вектора pMPR-ilvG*MED-2Tfd в хромосому реципиентного штамма V-01 Среди полученной группы штаммов был отобран лучший V-2 на основании результатов ферментации в пробирках (рис 6). Было проведено определение числа копий mini-Mu кассет в хромосоме данного штамма методом ДНК-гибридизации по Саузерну Результаты гибридизации показали, что в хромосоме штамма V-2, полученного после первого этапа интеграции, содержалось 4 копии валинового оперона (рис 7)

Количество интегрированных копий mini-Mu определяли по числу полос на радиоавтогафе и их интенсивности.

Далее при использовании транспозазной плазмиды рМНЮ было проведено два последовательных этапа амплификации mini-Mu кассет pMP¡(-ilvG*ívíED-2Tfd в хромосоме данного штамма V-2. На основании данных по продуктивности полученных штаммов в условиях пробирочной ферментации были отобраны штаммы V-3 и V-4, обладающие повышенным уровнем синтеза валина (рис. 6). В полученных штаммах было проведено определение числа копий валинового оперона методом ДНК-гибридизации по Саузерну. Как показали полученные результаты, в хромосоме штамма V-3 содержалось 7 копий валинового оперона, а в хромосоме штамма V-4 - 10 копий валинового оперона (рис. 7).

Рисунок 6. Относительное поэтапное увеличение продуктивное™ штаммов-продуцентов валина У-01,У-2,У-3,У-4, выраженное в %.

Мд 1655 V-01 V - 2 V-3 V-4

ИВалинЛ/oJ

Этапы

Число копий

Рисунок 7. Результаты гибридизации по Саузерну штаммов, содержащих копии валинового оперона Рк-ПуО*МЕО-2Тга: О - контроль: штамм У-01 (1 копия), 1- штамм У-2 (4 копии), 2- штамм У-З (7 копий), 3- шамм У-4 (10 копий). Данный радиоавтограф наглядно показывает поэтапное увеличение числа копий валинового оперона

Рк-ПуО*МЕО-2Тгс| в хромосомах штаммов.

Таким образом, проведенный повторный цикл амплификации привел к последующему увеличению числа копий валинового оперона с 7 до 10 в хромосоме исходного штамма У-З. Проведенный эффективный процесс амплификации валинового оперона сопровождался поэтапным увеличением

продуктивности штаммов Конструирование штамма-продуцента валина является примером эффективного применения способа увеличения числа копий интегративной кассеты путем последовательной амплификации с использованием только транспозазной плазмиды рМШО В результате проведенной работы был получен бесплазмидный безмаркерный штамм-продуцент валина, в хромосоме которого содержится 10 интегрированных копий валинового оперона.

ВЫВОДЫ

1. Проведена оценка эффективности транспозиции группы транспозонов- Тп5, mini-Tai 0, mini-Mu (MD4041), MD4041-thrA*BC. Показана высокая эффективность транспозиции mmi-Mu транспозонов группы MD Сконструированы штаммы-продуценты треонина с использованием интегративных векторов группы MD4041-thrA*BC. Показана нестабильность полученных штаммов, что явилось результатом высокой активности транспозазы, гены которой входят в состав данного транспозона

2. Проведено разделение интегративного и транспозазного доменов mini-Mu вектора MD4041, и разработана двухплазмидная система Плазмида-помощник рМНЮ кодирует транспозазу А фага Mu, транспозиционный кофактор - белок В, термочувствительный репрессор cts62, репрессор пег и attL-чшт. Интегративный вектор содержит сайты необходимые для интеграции (attL- и attR-сшты фага Mu) и маркер антибиотической устойчивости

3 Проведено сравнительное изучение эффективности интеграции векторов pM-cts-IAS и рМ, в которые были клонированы гены треонинового и лейцинового оперонов Эффективность интеграции составила 98-100% для векторов группы рМ, что было в 30-50 раз более эффективно, чем для векторов группы pM-cts-IAS (2-3%). Проведена оценка эффективности амплификации векторов двух видов При проведении нескольких последовательных этапов амплификации с использованием вектора рМ число копий mini-Mu кассет было увеличено с 4 до 7, а затем до 10 Амплификация векторов группы pM-cts-IAS происходила с такой же низкой эффективностью, как и интеграция, и число копий mim-Mu кассет было увеличено с 1 до 2, а затем до 3 при проведении второго этапа амплификации

4. Проведена оценка эффективности интеграции и амплификации многокопийных и малокопийных интегративных векторов, несодержащих антибиотический маркер. Наиболее эффективные интегративные векторы включают только attL- и attR-сайты фага Mu рМ, рМ16, рМ17. Во всех случаях наблюдался высокий процент интеграции 85-100% (репликон рМВ1), 75-100% (репликон pSClOl)

5. Безмаркерные интегративные векторы были успешно использованы при конструировании генетически стабильного высокопродуктивного бесшгазмидного штамма-продуцента валина, который содержал 10 копий mini-Mu кассет PR-ilvG*MED-2Tfd.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Саврасова Е.А. П «Разработка интеграционной mirn-Mu системы для обеспечения высокоэффективной интеграции и амплификации генетического материала в хромосому бактерии Е coli», Материалы международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнологая», Москва, 28 ноября -

1 декабря, 2006 г, стр. 77-78

2 Саврасова Е.А. // «Интеграционная mim-Mu система применимая для конструирования бесплазмидных штаммов-продуцентов аминокислот на основе Е coli», Материалы четвертого московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 12-16 марта, 2007, том 2, стр 96

3 Ахвердян В 3 , Саврасова ЕЛ., Каплан А М., Лобанов А.О, Вавилова Е Ю , Козлов ЮИ // «Разработка mira-Mu системы, обеспечивающей эффективную интеграцию генетического материала в хромосому бактерии Escherichia coli и его амплификацию» Биотехнология №3, 2007, стр 3-20.

4 Саврасова Е.А., Ахвердян В 3, Лобанов А О, Каплан А М, Вавилова Е Ю., Козлов Ю И // «Создание mmi-Mu системы, лишенной селективных маркеров, для интеграции генов в хромосому бактерии Escherichia coli»

Биотехнология №4,2007, стр 3-17

5 Ахвердян В 3, Саврасова Е.А., Каплан А М, Лобанов А О, Козлов Ю И «Способ получения L-аминокислот, штамм Escherichia coli - продуцент L-аминокислоты» Патент РФ №2229513

6 Ахвердян ВЗ, Саврасова Е.А., Каплан AM, Лобанов АО, Козлов ЮИ «Способ получения L-треонина, штамм Escherichia coli - продуцент треонина» Патент РФ №2244007.

7 Ахвердян В 3 , Саврасова Е.А. «Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia -продуцент треонина и способ получения L-треонина» Патент РФ №2288264

Подписано в печать 18 09 2007 г Исполнено 18 09 2007 г г Печать трафаретная

Заказ № 749 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 \vw\v аиЬие£ега1 ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Саврасова, Екатерина Алексеевна

Введение

Актуальность проблемы

Цели и задачи работы

Научная новизна и практическая ценность работы

Публикации и апробация работы

Структура и объем работы

Обзор литературы

1. Генетическая рекомбинация

1.1. Гомологичная рекомбинация

1.2. Сайт-специфическая рекомбинация

1.2.1. Локусы рекомбинации

1.2.2. Специализированные рекомбипазы

1.2.3. Консервативность

1.2.4. Биологическая роль сайт-специфической рекомбинации

1.2.5. Функциональный кор

1.2.6. Этап расщепления и переноса нити

1.2.7. Область перекрывания

1.2.8. Дополнительные элементы

1.2.9. Контроль эффективности и выбора времени 15 сайт-специфической рекомбинации

1.2.10. Интегративная рекомбинация и рекомбинация исключения 16 в ^-интегразной системе.

1.3. Транспозиция

1.3.1. Два типа реакций транспозиции

1.3.2. Различия между транспозицией и сайт-специфической 19 рекомбинацией

1.3.3. Классы транспозирующихся элементов

1.3.4. Транспозиция на молекулярном уровне

1.3.5. Инсерционные последовательности

1.3.6. Сложные ¡Б-транспозоны I класса

1.3.6.1. Элементы Тп 5 и Тп

1.3.7. Несложные транспозоны II класса

1.3.7.1. Элемент ТпЗ и родственные ему транспозоны

1.3.7.2. Тп 7 - сайтспецифический транспозон

1.3.8. Бактериофаг Ми

1.3.9. Внутримолекулярные и межмолекулярные перестановки

1.3.10. Концевые последовательности транспозонов

1.3.11. Сайты инсерции

1.3.12. Иммунность мишени

1.3.13. Кодируемые элементом транспозазы

1.3.14. Транспозоны в качестве генетического инструментария 32 2. Фаг-транспозон Ми

2.1. Общая характеристика фага Mu Е. coli

2.1.1. Жизненный цикл. Литическое и лизогенное развитие

2.1.2. Физическая и генетическая карты фага Ми

2.1.3. Сайты

2.1.4. Гены

2.1.5. Влияние температуры на Mu-направленный перенос генов

2.2. Модели транспозиции фага Ми. Два механизма транспозиции 38 фага Ми - консервативная и репликативная

2.3. Структура и функции концов генома фага Ми

2.4. Негативная регуляция транскрипции генами с и пег

2.4.1. Репрессор-с

2.4.2. Оператор

2.4.3. Сайты связывания с-репрессора

2.4.4. Репрессор пег

2.4.5. Сайты связывания репрессора пег

2.5. Транспозаза Ми А

2.6. Энхансер транспозиции фага Ми

2.7. Нуклеопротеиновые комплексы в транспозиции Ми

2.8. Кофактор транспозиции - белок В

2.9. Роль белка Ми В в реакции сборки транспозосомы. 51 АТФ-АДФ переключатель

2.10. Модель контроля доставки мишени и переноса нити белком Ми В

2.11. Точки интеграции

2.12. Иммунность мишени

2.13. Репликационные белки Е. coli

2.14. БелкиШРиНи

2.15. Производные фага Mu

2.15.1. Mini-Mu элементы

2.15.2. Системы для клонирования in vivo

2.16. Системы in vitro

2.16.1 Плазмидный мутагенез

2.16.2. Мутагенез генома

3. Современные методы конструирования штаммов-продуцентов

3.1. Биосинтез треонина

3.2. Биосинтез валина 71 Материалы и методы 74 Результаты и обсуждение

1. Высокоэффективная транспозиция вектора mini-Mu (MD4041)

1.1. Сравнительная оценка эффективности транспозиции транспозонов Tn5, mini-TnlO, mini-Mu (MD4041), MD4041-thrA*BC

1.2. Стабильность полученных штаммов

2. Конструирование продуцента треонина с использованием интегративных 101 векторов MD4041-thrA*BC

2.1. Проверка стабильности штаммов-продуцентов

3. Конструирование на основе элемента mini-Mu (MD4041) векторов, 105 обеспечивающих эффективную интеграцию и амплификацию генов, а также стабильность полученных штаммов

3.1. Создание транспозиционного модуля.

Конструирование плазмиды рМНЮ

3.2. Конструирование mini-Mu векторов, содержащих антибиотический маркер

3.3. Оценка эффективности интеграции векторов, содержащих антибиотический маркер

3.4. Стабильность штаммов, содержащих в хромосоме интегрированные mini-Mu кассеты

3.5. Зависимость утраты плазмид mini-Mu вектора и модуля транспозазы от наличия репрессора Mu в составе интегративного вектора

4. Конструирование безмаркерных малокопийных интегративных 120 mini-Mu векторов

4.1. Получение рекомбинантной плазмиды рМ

4.2. Конструирование малокопийного интегративного mini-Mu вектора, неспособного к автономной транспозиции

4.2.1. Конструирование плазмиды рМ

4.2.2. Клонирование терминатора транскрипции в вектор рМ

4.2.3. Конструирование плазмиды рМ

4.2.4. Конструирование интегративных векторов рМ16 и рМ

4.2.5. Определение места встраивания mini-Mu на векторе pMWl 127 и структуры интегративного вектора рМ

5. Эффективность разработанной mini-Mu системы в неселективных 130 условиях

5.1. Изучение эффективности интеграции генов биосинтеза аминокислот

5.2. Влияние терминации транскрипции внутри mini-Mu вектора на эффективность интеграции

5.3. Эффективность интеграции в процессе первичной транспозиции

5.4. Амплификация mini-Mu кассет, интегрированных в хромосому бактерии

5.5. Эффективность интеграции малокопийных интегративных mini-Mu векторов.

6. Использование разработанной интегративной mini-Mu системы для 138 конструирования бесплазмидного штамма-нродуцента валина, не содержащего маркер антибиотической устойчивости.

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка mini-Mu системы для эффективной интеграции и амплификации генетического материала в хромосому бактерии E. coli в отсутствие селективного маркера"

Актуальность проблемы.

При конструировании штаммов-продуцентов различных биологически активных веществ, в частности аминокислот, широко используется амплификация целевых генов в составе плазмид. Данный подход имеет ряд недостатков, связанных с последующим использованием плазмидных штаммов в производстве: законодательные ограничения; потенциальная нестабильность плазмидных штаммов при росте в неселективных условиях; сложность создания больших групп независимо экспрессирующихся генов в составе одного вектора.

В настоящее время предпочтительным является использование бесплазмидных штаммов-продуцентов. При конструировании таких штаммов на первоначальном этапе осуществляется создание в составе плазмид интегративных кассет, содержащих целевые гены или опероны биосинтеза с оптимизированным уровнем экспрессии, затем проводится интеграция данных кассет в бактериальную хромосому с использованием различных механизмов рекомбинации. Интеграция генетического материала возможна по i механизму общей рекомбинации бактериальной клетки, при условии наличия достаточно протяженной области фланговой гомологии, а также по механизму сайт-специфической рекомбинации, например бактериофага X (Datsenko К. A. et al., 2000). Другим подходом является использование свойств транспозирующихся элементов.

Транспозоны являются превосходными и широко используемыми генетическими инструментариями. К настоящему времени разработано много различных типов специализированных производных транспозонов. Наиболее широко используемыми являются конструкции, полученные на основе элементов Tn5, ТпЮ и бактериофага Mu, также используются конструкции, основанные на элементах ТпЗ и yö. Транспозоны разнообразны по своей природе и свойствам, среди них наиболее хорошо изученным является фаг-транспозон Mu. На основе данного элемента были разработаны системы для получения транскрипционных и трансляционных фьюзов, клонирования in vivo, картирования хромосомы (Gro'isman Е.А. et al., 1984; Casadaban М. J. et al, 1986; Lowes M. et al, 1995).

Разработка нового генетического инструментария, использующего транспозиционные свойтва фага-транспозона Mu, позволяющего эффективно интегрировать генетический материал в хромосому Е. coli в отсутствие антибиотических маркеров в составе mini-Mu векторов, является актуальной и практически значимой для биотехнологии, поскольку в настоящее время предъявляются повышенные требования к промышленным штаммам-продуцентам, одним из которых является отсутствие каких-либо антибиотических маркеров в хромосоме штаммов.

Цели и задачи работы.

Диссертационная работа посвящена разработке эффективной генетической системы на основе фага-транспозона Mu и ее применению для конструирования штаммов-продуцентов различных аминокислот.

В ходе работы решались следующие задачи:

- Сравнительная оценка эффективности транспозиции транспозонов: Tn5, mini-TnlO, MD4041 и MD4041-thrA*BC.

- Оценка возможности использования выбранного транспозона для прикладных задач. Конструирование модельного штамма-продуцента треонина с использованием транспозонов MD4041-thrA*BC. Проверка характеристик полученных штаммов: стабильность продукции и числа копий mini-Mu кассет.

- Конструирование на основе mini-Mu MD4041 векторов, содержащих антибиотический маркер, обеспечивающих как эффективную интеграцию и амплификацию генов, так и стабильность полученных штаммов.

- Создание на основе mini-Mu MD4041 новой линии интегративных векторов (малокопийных, безмаркерных), необходимых для решения ряда задач при конструировании штаммов-продуцентов, соответствующих повышенным требованиям.

- Оценка эффективности использования элементов генетической системы в неселективных условиях.

- Применение данной системы при конструировании бесплазмидного безмаркерного штамма-продуцента валина.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Разработана генетическая система для эффективной интеграции и амплификации генетического материала в хромосому Е. coli в отсутствие антибиотического маркера на основе фага-транспозона Mu. Данная система является удобным генно-инженерным инструментарием, прикладным назначением которого является конструирование бесплазмидных штаммов-продуцентов биологически активных веществ на основе бактерии Е. coli.

Осуществлено конструирование новых линий интегративных векторов, несодержащих антибиотический маркер внутри mini-Mu, и показана эффективность их использования при интеграции и последующей амплификации. Осуществлено клонирование ряда генов центрального метаболизма и оперонов биосинтеза различных аминокислот, проведено конструирование двух линии интегративных векторов, которые нашли неиостредственное применение при создании ряда штаммов-продуцентов.

Разработанная система, в частности, малокопийные безмаркерные mini-Mu векторы были успешно использованы в работах НИИ «Аджиномото-Генетика» при конструировании высокопродуктивных штаммов-продуцентов различных аминокислот.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 печатных работы в отечественном журнале, два тезисных сообщения в материалах научных конференций и три патента. Материалы диссертации докладывались на Смотрах-конкурсах работ сотрудников ЗАО «АГРИ» в июне 2004 и июне 2005 года. Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре ЗАО "АГРИ" и секции по молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП ГосНИИгенетика 12 апреля 2007 года.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на 158 страницах, включая 53 рисунка и 23 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 215 источников, в том числе 5на русском языке.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Саврасова, Екатерина Алексеевна

Выводы

1. Проведена оценка эффективности транспозиции группы транспозонов: Tn5, mini-TnlO, mini-Mu (MD4041), MD4041-thrA*BC. Показана высокая эффективность транспозиции mini-Mu транспозонов группы MD. Сконструированы штаммы-продуценты треонина с использованием интегративных векторов группы MD4041-thrA*BC. Показана нестабильность полученных штаммов, что явилось результатом высокой активности транспозазы, гены которой входят в состав данного транспозона.

2. Проведено разделение интегративного и транспозазного доменов mini-Mu вектора MD4041, и разработана двухплазмидная система. Плазмида-помощник рМНЮ кодирует транспозазу А фага Mu, транспозиционный кофактор - белок В, термочувствительный репрессор cts62, репрессор пег и «//¿-сайт. Интегративный вектор содержит сайты необходимые для интеграции (attL- и attR-сайты фага Mu) и маркер антибиотической устойчивости.

3. Проведено сравнительное изучение эффективности интеграции векторов pM-cts-IAS и рМ, в которые были клонированы гены треонинового и лейцинового оперонов. Эффективность интеграции составила: 98-100% для векторов группы рМ, что было в 30-50 раз более эффективно, чем для векторов группы pM-cts-IAS (2-3%). Проведена оценка эффективности амплификации векторов двух видов. При проведении нескольких последовательных этапов амплификации с использованием вектора рМ число копий mini-Mu кассет было увеличено с 4 до 7, а затем до 10. Амплификация векторов группы pM-cts-IAS происходила с такой же низкой эффективностью, как и интеграция, и число копий mini-Mu кассет было увеличено с 1 до 2, а затем до 3 при проведении второго этапа амплификации.

4. Проведена оценка эффективности интеграции и амплификации многокопийных и малокопийных интегративных векторов, не содержащих антибиотический маркер. Наиболее эффективные интегративные векторы включают только attL- и attR-сайты фага Mu: рМ, рМ16, рМ17. Во всех случаях наблюдался высокий процент интеграции: 85-100% (репликон рМВ1), 75-100% (репликон pSClOl).

5. Безмаркерные интегративные векторы были успешно использованы при конструировании генетически стабильного высокопродуктивного бесплазмидного штамма-продуцента валина, который содержал 10 копий mini-Mu кассет PR-ilvG*MED-2Tfd.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Саврасова, Екатерина Алексеевна, Москва

1. Holliday. R. A mechanism for gene conversion in fungi. // Genet. Res. 1964. - V.5. -P.282-304.

2. Kowalczykowski S.C., Dixon D.A., Eggleston A.K., Lauder S.D., Rehrauer W.M. Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli. II Microbiol. Rev. 1994. -V.58.-P.401-465.

3. Kuzminov A. Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage lambda. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - V.63. - P.751-813.

4. Clark A.J, Margulies A.D. Isolation and characterization of recombination-deficient mutants of Escherichia coli K-12. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1965. V.53. - P.451-459.

5. Howard-Flanders P., Theriot L. Mutants of Escherichia coli K-12 defective in DNA repair and in genetic recombination. // Genetics. 1966. - V.53. - P. 1137-1150.

6. Schofield M. A., Agbunag R., Miller J.H. DNA inversions between short inverted repeats in Escherichia coli. II Genetics. 1992. - V.132. - P.295-302.

7. Shen P., Huang H.V. Homologous recombination in Escherichia coli: dependence on substrate length and homology. // Genetics. 1986. - V.l 12. - P.441-457.

8. Bianco P.R., Tracy R.B., Kowalczykowski S.C. DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. // Front. Biosci. 1998. - V.3. - p.570-603.

9. Lusetti S.L., Cox M.M. The bacterial RecA protein and the recombinational DNA repair of stalled replication forks. // Annu. Rev. Biochem. 2002. - V.71. - P.71-100.

10. Lindsley J.E., Cox M.M. Dissociation pathway for recA nucleoprotein filaments formed on linear duplex DNA. // J. Mol. Biol. 1989. - V.205. - V.695-711.

11. Shaner S.L., Radding C.M. Translocation of Escherichia coli recA protein from a single-stranded tail to contiguous duplex DNA. //J. Biol. Chem. 1987. - V.262. - P.9211-9219.

12. Shaner S.L., Flory J., Radding C.M. The distribution of Escherichia coli recA protein bound to duplex DNA with single-stranded ends. // J. Biol. Chem. 1987. - V.262. - P.9220-9230.

13. Bedale W.A., Cox M. Evidence for the coupling of ATP hydrolysis to the final (extension) phase of RecA protein-mediated DNA strand exchange. // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. -P.5725-5732.

14. Clark A. J. Toward a metabolic interpretation of genetic recombination of E. coli and its phages. // Annu. Rev. Microbiol. -1971. V.25. - P.437-464.

15. Clark A. J. Recombination deficient mutants of E. coli and other bacteria. // Annu. Rev. Genet.- 1973. V.7.-P.67-86.

16. Campbell A.M. Episomes. // Adv. Genet. 1962. - V.l 1. - P. 101-145.

17. Gottesman M.E., Weisberg R.A. Prophage insertion and excision. In A. D. Hershey (ed.), The Bacteriophage Lambda. // Cold. Spring. Harbor, Laboratory., Cold. Spring. Harbor., N.Y. -1971. — P.l 13—138.

18. Geliert M., Nash H. Communication between segments of DNA during site-specific recombination. // Nature. -1987. V.325. - P.401^104.

19. Segall A.M., Nash H.A. Architectural flexibility in lambda site-specific recombination: three alternate conformations channel the attL site into three distinct pathways. // Genes. Cells. 1996. - V.1.-P.453-463.

20. Campbell A., Botstein D. Evolution of the lambdoid phages. In R. W. Hendrix J., Roberts W., Stahl F.W., Weisberg R.A. (ed.), Lambda II. II Cold. Spring. Harbor. Laboratory., Cold. Spring. Harbor., N.Y. 1983. - P.365-380.

21. Whitehouse H.L.K. Genetic Recombination: Understanding Mechanisms. // John Wiley and Sons, New York. 1982. - P. 112-116.

22. Nash H.A. Site-Specific Recombination: Integration, Excision, Resolution, and Inversion of Defined DNA Segments. // P.2363-2377

23. Craig N.L., Nash H.A. The mechanism of phage X site-specific recombination: site-specific breakage of DNA by Int topoisomerase. // Cell. 1983. - V.35. - P.795-803.

24. Pargellis C.A., Nunes-Duby S.E., Moitoso L. de Vargas, Landy A. Suicide recombination substrates yield covalent lambda integrase-DNA complexes and lead to identification of the active site tyrosine. // J. Biol. Chem. 1988. - V.263. - P.7678-7685.

25. Hatfull G.F., Grindley N.D. Analysis of gamma delta resolvase mutants in vitro: evidence for an interaction between serine-10 of resolvase and site I of res. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1986. V.83. -P.5429-5433.

26. Klippel A., Mertens G., Patschinsky T., Kahmann R. The DNA invertase Gin of phage Mu: formation of a covalent complex with DNA via a phosphoserine at amino acid position 9. // EMBOJ. 1988. - V.7. - P.1229-1237.

27. Bauer C.E., Hesse S.D., Gardner J.F., Gumport R.I. DNA interactions during bacteriophage X site-specific recombination. // Cold. Spring. Harbor. Symp. Quant. Biol. 1984. - V.49. -P.699-705.

28. Stark W.M., Grindley N.D.F., Hatfull G.F., Boocock M.R. Resolvase-catalysed reactions between res sites differing in the central dinucleotide of subsite I. // EMBO J. 1991. - V.l 1. -P.3541-3548.

29. Weisberg R.A., Enquist L.W., Foeller C., Landy A. Role of DNA homology in site-specific recombination. The isolation and characterization of a site affinity mutant of coliphage X. II J. Mol. Biol. 1983. - V.l 70. - P.319-342.

30. Johnson R. Mechanism of site-specific DNA inversion in bacteria. // Curr. Opin. Genet. Dev. -1991.- V.l. -P.412-416.

31. Ptashne M. A Genetic Switch: Phage X and Higher Organisms, 2nd ed. // Cell Press, Blackwell Scientific Publications, Cambridge. -1992.

32. Bruist M.F., Simon M.I. Phase variation and the Hin protein: in vivo activity measurements, protein overproduction, and purification. // J. Bacteriol. 1984. - V.l59. - P.71-79.

33. Federoff N., Botstein D. The Dynamic Genome: Barbara McClintock's Ideas in the Century of Genetics. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1992.

34. McClintock B. Chromosome organization and gene expression. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1952. -V. 16. - P. 13.

35. Shapiro J.A. Mutations caused by the insertion of genetic material into the galactose operon of £ coll II J. Mol. Biol. 1969. - V.40. - P.93-105.

36. Craig N.L. Unity in transposition reactions. // Science. 1995. - V.270. - P.253-254.

37. Diaz-Aroca E., Mendiola M.V., Zabala J.C., de la Cruz F. Transposition of IS91 does not generate a target duplication. // J. Bacteriol. 1987. - V.169. - P.442-443.

38. Mizuuchi K. Transpositional recombination: mechanistic insights from studies of mu and other elements. // Annu. Rev. Biochem. 1992. - V.61. - P. 1011-1051.

39. Mahillon J., Chandler M. Insertion sequences. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V.62.- P.725-774.

40. Mizuuchi K. Polynucleotidyl transfer reactions in transpositional DNA recombination. // J. Biol. Chem. 1992. - V.267. - P.21273-21276.

41. Polard P., Chandler M. Retroviral integrases and bacterial transposases. // Mol. Microbiol. -1995.-V.15.-P.1-23.

42. Benjamin H.W., Kleckner N. Excision of Tn 10 from the donor site during transposition occurs by flush double-strand cleavages at the transposon termini. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992. -V.89. P.4648-4652.

43. Bainton R., Gamas P., Craig N.L. Tn7 transposition in vitro proceeds through an excised transposon intermediate generated by staggered breaks in DNA. // Cell. 1991. - V.65. - P. 805-816.

44. Fujiwara Т., Mizuuchi К. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. // Cell. 1988. - V.54. - P.497-504.

45. Eichinger D.J., Boeke J.D. 1990. A specific terminal structure is required for Tyl transposition. // Genes Dev. 1990. - V.4. - P.324-330.

46. Craig N.L. Transposition. Escherichia coli and Salmonella (chapter 124), Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt. // Washington D.C., ASM Press. 1996. - P.2339-2362.

47. Льюин Б. Гены. // Москва, Мир. -1987. С.546-561.

48. Ни W.Y., Derbyshire К.М. Target choice and orientation preference of the insertion sequence IS903.// J. Bacterid. 1998.- V.180.-P.3039-3048.

49. Weber P.C. Analysis of Tn5 inversion events in Escherichia coli plasmids. // Mol. Gen. Genet. 1995. - V.248. - P.459-470.

50. Dodson K.W., Berg D.E. Factors affecting transposition activity of IS50 and Tn5 ends. // Gene. 1989. -V.76. - P.207-213.

51. Kleckner N. Regulating TnlO and IslO Transposition. // Genetics, 1990, V.124, P.449-454.

52. Davies D.R., Goryshin I.Y., Reznikoff W.S., Rayment I. Three-dimensional structure of the Tn5 synaptic complex transposition intermediate. // Science. 2000. - V.289. - P.77-85.

53. Abraham L.J., Rood J.I. Identification of Tn4451 and Tn4452, chloramphenicol resistance transposons from Clostridium perfringens. // J. Bacteriol. 1987. - V.169. - P.1579-1584.

54. Grindley N.D. Transposition of Tn3 and related transposons.// Cell. 1983. - V.32. - P.3-5.

55. Bainton R., Gamas P., Craig N.L. Tn7 transposition in vitro proceeds through an excised transposon intermediate generated by staggered breaks in DNA. // Cell. 1991. - V.65. - P.805

56. Stark W.M., Boocock M.R., Sherratt D.J. Site-specific recombination by Tn3 resolvase. // Trends. Genet. -1989. V.5. - P.304-309.

57. Tsuda M., Minegishi K., lino T. Toluene transposons Tn4651 and Tn4653 are class II transposons. // J. Bacteriol. -1989. -V. 171. P. 1386-1393.

58. DeBoy R.T., Craig N.L. Target site selection by Tn7: attTn7 transcription and target activity. // J. Bacteriol. 2000. V.182. - P.3310-3313.

59. Lu F., Craig N.L. Isolation and characterization of Tn7 transposase gain-of-function mutants: a model for transposase activation. // EMBO J. 2000. - V.19. - P.3446-3457.

60. Biery M.C., Lopata M., Craig N.L. A minimal system for Tn7 transposition: the transposon-encoded proteins TnsA and TnsB can execute DNA breakage and joining reactions that generate circularized Tn7 species. // J. Mol. Biol. 2000. - V.297. - P.25-37.

61. Wolkow C.A., DeBoy R.T., Craig N.L. Conjugating plasmids are preferred targets for Tn7. // Genes. Dev. 1996. - V. 10. - P.2145-2157.

62. Peters J.E., Craig N.L. Tn7 transposes proximal to DNA double-strand breaks and into regions where chromosomal DNA replication terminates. // Mol. Cell. 2000. - V.6. - P.573-582.

63. Pato M.L. Bacteriophage Mu. In D. E. Berg and M. M. Howe (ed.), Mobile DNA. II American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1989. - P.23-52.

64. Kleckner, N. Transposon Tn/0. In D. E. Berg and M. M. Howe (ed.), Mobile DNA. II American Society for Microbiology Washington, D.C. 1989. - P.227-268.

65. Benjamin H.W., Kleckner N. Intramolecular transposition by Tn 10. II Cell. 1989. - V.59. -P.373-383.

66. Haniford D., Kleckner N. Tn 10 transposition in vivo: temporal separation of cleavages at the two transposon ends and roles of terminal basepairs subsequent to interaction of ends. // EMBO J. 1994. - V.13. -P.3401-3411.

67. Allison R.G., Chaconas G. Role of the A protein-binding sites in the in vitro transposition of Mu DNA. A complex circuit of interactions involving the Mu ends and the transpositional enhancer. // J. Biol. Chem. 1992. - V.267. - P. 19963-19970.

68. Wiater L.A., Grindley N.D.F. y8 transposase and intergration host factor bind cooperatively at both ends ofyS. // EMBO J. 1990. - V.7. - P. 1907-1911.

69. Weinreich M.D., Reznikoff W.S. Fis plays a role in Tn5 and IS50 transposition. // J. Bacteriol. 1992. - V.174. - P.4530^537.

70. Arciszewska L.K., Craig N.L. Interaction of the Tn7-encoded transposition protein TnsB with the ends of the transposon. //Nucleic. Acids. Res. 1991. - V. 19. - P.5021-5029.

71. Craig N.L. Tn7: a target site-specific transposon. // Mol. Microbiol. 1991. - V.5. - P.2569-2573.

72. Bender J., Kleckner N. TnlO insertion specificity is strongly dependent upon sequences immediately adjacent to the target-site consensus sequence. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992. V.89. - P.7996-8000.

73. Lee C.-H., Bhagwhat A., Heffron F. Identification of a transposon Tn3 sequence required for transposition immunity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V.80. - P.6765-6769.

74. Chandler M., Fayet 0. 1993. Translational frameshifting in the control of transposition in bacteria. // Mol. Microbiol. 1993. -V.7. - P.497-503.

75. Polard P., Chandler M. Retroviral integrases and bacterial transposases. // Mol. Microbiol. -1995.-V.15.-P.1-23.

76. Namgoong S.Y., Harshey R.M. The same two monomers within a MuA tetramer provide the DDE domains for the strand cleavage and strand transfer steps of transposition. // EMBO J. -1998. V.17. -P.3775-85.

77. Berg C.M., Berg D.E. Transposable element tools for microbial genetics. Escherichia coli and Salmonella (chapter 140), Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt. // Washington D.C., ASM Press. 1996. - P.2588-2612.

78. Berg D.E., Howe M.M. Mobile DNA. II American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1989. - P. 105-135.

79. Herrero M., de Lorenzo V., Timmis K.N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. // J. Bacteriol. 1990. - V.172. - P.6557-6567.

80. Taylor A.L. Bacteriophage-induced mutation in E.coli. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA .- 1963. -V.10.-P.60.

81. Symonds N., Toussaint A., Van de Putte P., Howe M. Phage Mu. // New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1987.

82. Mizuichi K., Craigie R. Mechanism of bacteriophage Mu transposition. // Ann. Rev. Genet. -1986. -V.20.-P.385.

83. Abelson J., Boram W., Bukhari A. I., Faelen M., Howe M.M. Summary of the genetic mapping of prophage Mu // J. Virol. 1973.- V.54. - P.90.

84. Stoddart S., Howe M.M. Localization and regulation of bacteriophage Mu promoters. // J. of Bacteriol. 1989. - V.171. -P.3440.

85. Goosen T., Giphart-Gassler M., van de Putte P. Bacteriophage Mu DNA replication is stimulated by non-essential early functions. // Mol. Gen. Genet. 1982. - V.186. - P. 135.

86. Howe M. M. Late genes, particle morphogenesis and DNA packaging. In Phage Mu (ed. Symonds N. et al.). // New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1987. - P.63.

87. Howe M.M. Invertible DNA in phage // Nature. 1978. - V.271. - P.608.

88. Faelen M., Resibois A., Toussaint A. Mini-Mu: an insertion element derived from temperate phage Mu-1.// Cold Spring Harbor Lab.- 1978. P.l 169-1177.

89. Faelen M., Toussaint A. Isolation of conditional defective mutants of temperate phage Mu-1 and deletion mapping of the Mu-1 prophage. // J. Virol. Virology 1976. - P.l 17-124.

90. Vogel J."L., Li Z.J., Howe M.M., Toussaint A., Higgins N.P. Temperature-sensitive mutations in the bacteriophage Mu c repressor locate a 63-amino-acid DNA-binding domain. // J. Bacteriol. 1991. - V.173. -P.6568-6577.

91. Waggoner B., Pato M., Toussaint A., Faelen M. Replication of mini-Mu prophage DNA. // Virology. 1981. - V.l 13. - P.379-387.

92. Akroyd J.E., Symonds N. Evidence for a conservative pathway of transposition of bacteriophage Mu. //Nature. 1983. May 5-ll;303(5912):84-6.

93. Chaconas G., Kennedy D.L., Evans D. Predominant integration end products of infecting bacteriophage Mu DNA are simple insertions with no preference for integration of either Mu DNA strand. // Virology. 1983. - V.128. - P.48-59.

94. Chaconas G., Harshey R.M., Sarvetnick N., Bukhari A.I. Predominant end-products of prophage Mu DNA transposition during the lytic cycle are replicon fusions. // J. Mol. Biol. -1981. V.l 50. - P.341-359.

95. Ohtsubo E., Zenilman M., Ohtsubo H., McCormick M., Machida C., Machida Y. Mechanism of insertion and cointegration mediated by IS1 and Tn3. // Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. 1981. - V.45. -Pt.l. -P.283-295.

96. Craigie R., Mizuuchi M., Mizuuchi K. Site-specific recognition of the bacteriophage Mu ends by the Mu A protein. // Cell. 1984. - V.39(2 Pt 1). - P.387-394.

97. Allison R.G., Chaconas G. Role of the A protein-binding sites in the in vitro transposition of mu DNA. A complex circuit of interactions involving the mu ends and the transpositional enhancer. // J. Biol. Chem. 1992. - V.267. - P.19963-19970.

98. Mizuuchi M., Baker T.A., Mizuuchi K. DNase protection analysis of the stable synaptic complexes involved in Mu transposition. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991. V.88. -P.9031-9035.

99. Mizuuchi M., Baker T.A., Mizuuchi K. Assembly of the active form of the transposase-Mu DNA complex: a critical control point in Mu transposition. // Cell. 1992. - V.70. - P.303-311.

100. Groenen M.A., van de Putte P. Mapping of a site for packaging of bacteriophage Mu DNA. // Virology. 1985.-V.144.-P.520-522.

101. Harshey R.M., Getzoff E.D., Baldwin D.L., Miller J.L., Chaconas G. Primary structure of phage mu transposase: homology to mu repressor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V.82. -P.7676-7680.

102. Goosen N., van Heuvel M., Moolenaar G.F., van de Putte P. Regulation of Mu transposition. II. The Escherichia coli HimD protein positively controls two repressor promoters and the early promoter of bacteriophage Mu. // Gene. 1984 Dec;32(3):419-26.

103. Krause H.M., Rothwell M.R., Higgins N.P. The early promoter of bacteriophage Mu: definition of the site of transcript initiation. //Nucleic Acids Res. 1983. - V.l 1. -P.5483-5495.

104. Krause H.M., Higgins N.P. On the mu repressor and early DNA intermediates of transposition. // Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. 1984. - V.49. - P.827-834.

105. Krause H.M., Higgins N.P. Positive and negative regulation of the Mu operator by Mu repressor and Escherichia coli integration host factor. // J. Biol. Chem.- 1986. V.261. - P.3744-3752.

106. Митькина JI.H. Транспозиция как способ существования: фаг Mu. // Генетика. 2003.- №5. С.637-656.

107. Alazard R., Betermier М., Chandler М. Escherichia coli integration host factor stabilizes bacteriophage Mu repressor interactions with operator DNA in vitro. // Mol. Microbiol. 1992.- V.6.-P.1707-1714.

108. Van Leerdam E., Karreman C., van de Putte P. Ner, a cro-like function of bacteriophage Mu. // Virology. 1982. - V.l23. - P. 19-28.

109. Goosen N., van de Putte P. Regulation of transcription. Phage Mu. Eds.Symonds M., Toussaint A., Van de Putte P., Howe M.M. N.Y.: Cold. Spring Harbor Lab. 1987. - P.41-52.

110. Leung P.C., Teplow D.B., Harshey R.M. Interaction of distinct domains in Mu transposase with Mu DNA ends and an internal transpositional enhancer. // Nature. 1989. - V.338. -P.656-658.

111. Clubb R.T., Omichinski J.G., Savilahti H., Mizuuchi K., Gronenborn A.M., Clore G.M.

112. A novel class of winged helix-turn-helix protein: the DNA-binding domain of Mu transposase. // Structure. 1994. - V.2. - P. 1041-1048.

113. Schumacher S., Clubb R.T., Cai M., Mizuuchi K., Clore G.M., Gronenborn A.M. Solution structure of the Mu end DNA-binding ibeta subdomain of phage Mu transposase: modular DNA recognition by two tethered domains. // EMBO J. 1997. - V.l6. - P.7532-7541.

114. Kim K., Harshey R.M. Mutational analysis of the att DNA-binding domain of phage Mu transposase. // Nucleic. Acids. Res. 1995. - V.23. - P.3937-3943.

115. Rice P., Mizuuchi K. Structure of the bacteriophage Mu transposase core: a common structural motif for DNA transposition and retroviral integration. // Cell. 1995. - V.82. -P.209-220.

116. Baker TA, Luo L. Identification of residues in the Mu transposase essential for catalysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994. V.91. - P.6654-6658.

117. Savilahti H., Mizuuchi K. Mu transpositional recombination: donor DNA cleavage and strand transfer in trans by the Mu transposase. // Cell. 1996. - V.85. - P.271-280.

118. Wu Z., Chaconas G. A novel DNA binding and nuclease activity in domain III of Mu transposase: evidence for a catalytic region involved in donor cleavage. // EMBO J. 1995. -V.14. -P.3835-3843.

119. Levchenko I., Luo L., Baker T.A. Disassembly of the Mu transposase tetramer by the ClpX chaperone. // Genes Dev. 1995 Oct l;9(19):2399-408.

120. Namgoong S.Y., Harshey R.M. The same two monomers within a MuA tetramer provide the DDE domains for the strand cleavage and strand transfer steps of transposition. // EMBO J.1998. V.17. -P.3775-3785.

121. Williams TL, Jackson EL, Carritte A, Baker TA. Organization and dynamics of the Mu transpososome: recombination by communication between two active sites. // Genes. Dev.1999. V.13. - P.2725-2737.

122. Jiang H., Yang J.Y., Harshey R.M. Criss-crossed interactions between the enhancer and the att sites of phage Mu during DNA transposition. // EMBO J. 1999. - V.18. - P.3845-3855.

123. Rijn P., Goosen N., Van de Putte P. Integration host factor of Escherichia coli regulates early- and repressor transcription of bacteriophage Mu by two different mechanisms.// Nucleic Acids Res. 1988. - V.16. - P.4595 - 4605.

124. Leung P.C., Teplow D.B., Harshey R.M. Interaction of distinct domains in Mu transposase with Mu DNA ends and an internal transpositional enhancer. // Nature. 1989. - V.338. - P.656 -658.

125. Surette M.G., Lavoie B.D., Chaconas G. Action at a distance in Mu DNA transposition: an enhancer-like element is the site of action of supercoiling relief activity by integration host factor (IHF). // EMBO J. 1989. - V.8. - P.3483-3489.

126. Surette M.G., Chaconas G. A protein factor which reduces the negative supercoiling requirement in the Mu DNA strand transfer reaction is Escherichia coli integration host factor. //

127. J. Biol. Chem. 1989. - V.264. - P.3028-3034.

128. Watson M.A., Chaconas G. Three-site synapsis during Mu DNA transposition: a critical intermediate preceding engagement of the active site. // Cell. 1996. - V.85. - P.435-445.

129. Mizuuchi M., Baker T.A., Mizuuchi K. Assembly of phage Mu transpososomes: cooperative transitions assisted by protein and DNA scaffolds. // Cell, 1995, V.83, P.375-385.

130. Baker T.A., Luo L. Identification of residues in the Mu transposase essential for catalysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V.91. - P.6654-6658.

131. Adzuma K., Mizuuchi K. Target immunity of Mu transposition reflects a differential distribution of Mu B protein. // Cell. 1988. - V.53. - P.257-266.

132. Levchenko I., Yamauchi M., Baker T.A. ClpX and MuB interact with overlapping regions of Mu transposase: implications for control of the transposition pathway. // Genes. Dev. 1997. -V.11.-P.1561-1572.

133. Maxwell A, Craigie R, Mizuuchi K. B protein of bacteriophage mu is an ATPase that preferentially stimulates intermolecular DNA strand transfer. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1987. V.84. - P.699-703.

134. Teplow D.B., Nakayama C., Leung P.C., Harshey R.M. Structure-function relationships in the transposition protein B of bacteriophage Mu. // J. Biol. Chem. 1988. - V.263. - P.10851-10857.

135. Hung L.H., Chaconas G., Shaw G.S. The solution structure of the C-terminal domain of the Mu B transposition protein. // EMBO J. 2000. - V.19. - P.5625-5634.

136. Chaconas G., Giddens E.B., Miller J.L., Gloor G. A truncated form of the bacteriophage Mu B protein promotes conservative integration, but not replicative transposition, of Mu DNA. // Cell. 1985. - V.41. - P.857-865.

137. Hung L.H., Chaconas G., Shaw G.S. The solution structure of the C-terminal domain of the Mu B transposition protein. // EMBO J. 2000. - V.19. - P.5625-5634.

138. Coros C.J., Sekino Y., Baker T.A., Chaconas G. Effect of mutations in the C-terminal domain of Mu B on DNA binding and interactions with Mu A transposase. // J. Biol. Chem.2003. — V.278. — P.31210-31217.

139. Adzuma K., Mizuuchi K. Interaction of proteins located at a distance along DNA: mechanism of target immunity in the Mu DNA strand-transfer reaction. // Cell. 1989. - V.57. -P.41-47.

140. Yamauchi M., Baker T.A. An ATP-ADP switch in MuB controls progression of the Mu transposition pathway. // EMBO J. 1998. - V.17. - P.5509-5518.

141. Kamp D., Kahmann R. Two pathways in bacteriophage Mu transposition? // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1980. - V.45. - P.329-336.

142. Manna D., Breier A.M., Higgins N.P. Microarray analysis of transposition targets in Escherichia coll: the impact of transcription. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V.101. -P.9780-9785.

143. Greene E.C., Mizuuchi K. Target immunity during Mu DNA transposition. Transpososome assembly and DNA looping enhance MuA-mediated disassembly of the MuB target complex. // Mol. Cell. -2002. V.10. - P.1367-1378.

144. Toussaint A., Faelen M. 1974. The dependence of temperate phage Mu-1 upon replication functions of E. coli K-12. // Mol. Gen. Genet. 1974. - V. 131. - P.209-214.

145. Lavoie B.D., Chaconas G. Site-specific HU binding in the Mu transpososome: conversion of a sequence-independent DNA-binding protein into a chemical nuclease. // Genes. Dev. -1993.-V.7.-P.2510-2519.

146. Mizuichi K., Craigie R. Mechanism of bacteriophage Mu transposition. // Ann. Rev. Genet. 1986.-V.20.-P.385.

147. Faelen M. Useful Mu and mini-Mu derivaties. // Virology. 1976. - P.l 17-124.

148. Faelen M., Toussaint A. Bacteriophage Mu-1: a tool to transpose and to localize bacterial genes. // J. Mol. Biol. 1976. - V.104. - P.525-539.

149. Casadaban M.J., Cohen S.N. Lactose genes fused to exogenous promoters in one step using a Mu-lac bacteriophage in vivo probe for transcriptional control sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V.76. - P.4530-4533.

150. Casadaban M.J., Chou. J. In vivo formation of gene fusions encoding hybrid b-galactosidase proteins in one step with a transposable Mu-lac transducing phage. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V.81. - P.535-539.

151. Hughes K.T., Roth J. R. Conditionally transposition-defective derivative of Mu dl(Amp Lac). // J. Bacteriol. 1984. - V.159. - P. 130-137.

152. Sonti R.V., Keating D.H., Roth. J.R. Lethal transposition of Mud phages in Rec'strains of Salmonella typhimurium. // Genetics. 1993. -V.133. -P. 17-28.

153. Elliott T. Transport of 5-aminovulinic acid by the dipeptide permease in Salmonella typhimurium. // J. Bacteriol. 1993. - V.175. - P.325-331.

154. Benson N.R., Goldman B.S. Rapid mapping in Salmonella typhimurium with Mud-P22 prophages. // J. Bacteriol. 1992. - V.174. - P. 1673-1681.

155. M. Lawes, S. Maloy. Mud SacI, transposon with strong selectable and counterselectable markers: use for rapid mapping of chromosomal mutations in Salmonella typhimurium. II J. Bacteriology. -1995. -V. 177 P. 1383 - 1387.

156. Castilho B.A., Olfson P., Casadaban M.J. Plasmid insertion mutagenesis and lac gene fusion with Mini-Mu bacteriophage transposons. // J. Bacteriol. 1984. - V.158. - P.488-495.

157. Faelen M., Toussaint A. Stimulation of deletions in the Escherichia coli chromosome by partially induced Mucts62 prophages. // J. Bacteriol. 1978. -V.136. - P.477-483.

158. Groisman E.A., Castilho B.A., Casadaban M.J. In vivo DNA cloning and adjacent gene fusing with a mini-Mu-lac bacteriophage containing a plasmid replicon. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1984. -V.81. P.1480-1483.

159. Groisman E.A., Casadaban M.J. Mini-Mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing. // J. Bacteriology. 1986. - V.168. -P.357 - 364.

160. Higgins N.P., Moncecchi D., Manlapaz-Ramos P., Olivera B.M. Bacteriophage Mu DNA replication in vitro. // J. Biol. Chem. 1983. - V.258. - P.4293-4297.

161. Schaller H., Otto B., Niisslein V., Huf J., Herrmann R., Bonhoeffer F. Deoxyribonucleic acid replication in vitro. // J. Mol. Biol. 1972. - V.63. - P. 183-200.

162. Higgins N.P., Manlapaz-Ramos P., Gandhi R.T., Olivera B.M. Bacteriophage Mu: a transposing replicon. // Cell. 1983. - V.33 - P.623-628.

163. Giphart-Gassler M., Goosen T., van Meeteren A., Wijffelman C., van de Putte P. Properties of the recombinant plasmid pGPl containing part of the early region of bacteriophage Mu. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. -1979. 43 - Pt.2 - P. 1179-1185.

164. Fuller R.S., Kaguni J.M., Kornberg A. Enzymatic replication of the origin of the Escherichia coli chromosome. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1981. -V.78. - P.7370-7374.

165. Mizuuchi K. In vitro transposition of bacteriophage Mu: a biochemical approach to a novel replication reaction. // Cell. -1983. V.35. - P.785-794.

166. Craigie R., Mizuuchi K. Mechanism of transposition of bacteriophage Mu: structure of a transposition intermediate. // Cell. 1985. - V.41. - P.867-876.

167. Craigie R., Arndt-Jovin D.J., Mizuuchi K. A defined system for the DNA strand-transfer reaction at the initiation of bacteriophage Mu transposition: protein and DNA substrate requirements. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985. V.82. - P.7570-7574.

168. Dale E.C., Ow D.W. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -V.88.-P.10558-10562.

169. Posfai G., Koob M., Hradecna Z., Hasan N., Filutowicz M., Szybalski W. In vivo excision and amplification of large segments of the Escherichia coli genome. // Nucleic. Acids. Research. 1994. -V.22. - P.2392-2398.

170. Cherepanov P.P., Wackernagel W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. // Gene. 1995. -V.158.- P.9-14.

171. Peredelchuk, M.Y., Bennett, G.N. A method for construction of E. coli strains with multiple DNA insertions in the chromosome.// Gene. -1997.-V. 187.- P.231-238.

172. Datsenko K.A, Wanner B.L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2000. V.97. - P.6640-6645.

173. Roberts R.B., Cowie D.B., Abelson P.H., Bolton E.T., Britten R.J. Studies of biosynthesis in Escherichia coli. //Carnegie Institution, Washington, D.C.- 1995.-Publication 607.-P.406-417.

174. Cohen G.N., Stanier R.Y., Le Bras G. Regulation of the biosynthesis of amino acids of theaspartate family in Coliform bacteria and Pseudomonads. // J. Bacteriol. 1969. - V.99. - P.791-801.

175. Szczesiul M., Wampler D.E. Regulation of a metabolic system in vitro: synthesis of threonine from aspartic acid. // Biochemistry. 1976. - V.15. -P.2236-2244.

176. Stadtman E.R., Cohen G.N., Lebras G. Feedback inhibition and repression of aspartokinase activity in Escherichia coli. II Ann. N. Y. Acad. Sei. -1961. V.94. - P.952-959.

177. Theze J., Saint-Girons I. Threonine locus of Escherichia coli K-12: genetic structure and evidence for an operon. // J. Bacteriol. 1974. - V.l 18. - P.990-998.

178. Theze J., Margarita D., Cohen G.N., Borne F., Patte J.C. Mapping of the structural genes of the three aspartokinases and of the two homoserine dehydrogenases of Escherichia coli K-12. //J. Bacteriol. 1974. - V.l 17. - P.133-143.

179. Haziza C, Stragier P, Patte JC. Nucleotide sequence of the asd gene of Escherichia coli: absence of a typical attenuation signal. // EMBO J. 1982. - V.l. - P.379-384.

180. Freundlich M. Multivalent repression in the biosynthesis of threonine in Salmonella typhimurium and Escherichia coli. II Biochem. Biophys. Res. Commun, 1963, V.10, P.277-282.

181. Gardner J.F., Smith O.H. Operator-promoter functions in the threonine operon of Escherichia coli. Hi. Bacteriol. 1975.-V.124.-P.161-166.

182. Kolter R., Yanofsky C. Attenuation in amino acid biosynthetic operons. // Annu. Rev. Genet. -1982.-V.16. -P. 113-134.

183. Guardiola J., De Felice M., Lamberti A., Iaccarino M. The acetolactate synthase isoenzymes of Escherichia coli K-12. // Mol. Gen. Genet. 1977. - V.156. - P.17-25.

184. Blatt J.M., Pledger W.J., Umbarger H.E. Isoleucine and valine metabolism in Escherichia coli. XX. Multiple forms of acetohydroxy acid synthetase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. - V.48. - P.444-450.

185. Umbarger H.E. Evidence for a negative-feedback mechanism in the biosynthesis of isoleucine. // Science. 1956. - V.123. - P.848.

186. De Felice M., Squires C., Levinthal M., Guardiola J., Lamberti A., Iaccarino M. Growth inhibition of Escherichia coli K-12 by L-valine: a consequence of a regulatory pattern. // Mol. Gen. Genet. -1977.-V.156.-P.1-7.

187. Squires C.H., De Felice M., Devereux J., Calvo J.M. Molecular structure of ilvIH and its evolutionary relationship to ilvG in Escherichia coli K12. // Nucleic Acids Res. 1983. - V.ll. -P.5299-52313.

188. Lawther R.P., Wek R.C., Lopes J.M., Pereira R., Taillon B.E., Hatfield G.W. The complete nucleotide sequence of the ilvGMEDA operon of Escherichia coli K-12. // Nucleic Acids Res. -1987. V.15. -P.2137-2155.

189. Ramakrishnan Т., Adelberg E.A. Regulatory mechanisms in the biosynthesis of isoleucine and valine. 3. Map order of the structural genes and operator genes. // J. Bacteriol. 1965. -V.89. -P.661-664.

190. Nargang F.E., Subrahmanyam C.S., Umbarger H.E. Nucleotide sequence of ilvGMEDA operon attenuator region of Escherichia coli. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1980. V.ll. -P.1823-1827.

191. Lawther R.P., Lopes J.M., Ortuno M.J., White M.C. Analysis of regulation of the ilvGMEDA operon by using leader-attenuator-galK gene fusions. // J. Bacteriol. 1990. -V.172. - P.2320-2327.

192. Chen J.W., Bennett D.C., Umbarger H.E. Specificity of attenuation control in the ilvGMEDA operon of Escherichia coli K-12. // J. Bacteriol. 1991. - V.173. - P.2328-2340.

193. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. // Москва. Мир. - 1984.

194. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. // Москва. Мир. - 1976.

195. Peng. L., Shimizu. К. Global metabolic regulation analysis for Escherichia coli K12 based on protein expression by 2-dimensional electrophoresis and enzyme activity measurement. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V.61. - P. 163-178.

196. Castilho B.A., Olfson P., Casadaban M.J. Plasmid insertion mutagenesis and lac gene fusion with mini-mu bacteriophage transposons. // J. Bacteriol. 1984. - V.158. - P.488-495.

197. Dazins A., Kent N.E., Buckwalter M.S., Casadaban M.J. Bacteriophage Mu sites required for transposition immunity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V.85. - P.6826-6830.

198. Castilho B.A., Casadaban M.J. Specificity of mini-Mu bacteriophage insertions in a small plasmid. // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 1339-1343.