Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение молекулярных механизмов незаконной рекомбинации в клетках Bacillus subtilus (с использованием плазмидных систем)

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение молекулярных механизмов незаконной рекомбинации в клетках Bacillus subtilus (с использованием плазмидных систем)"

?í« 011

... n УЛ' > ^

r " MU 0 n (4 «•

tj^

российская дкддрния ейук

институт молекулярной биологии им. 3. а. энгельгардта

На правах рукописи УДК 575.114.А

' EfiffiKHPOH Владимир Иванович

изучение молекулярных механизмов незаконной рекокбянацин б клетках baciblgs sü3?ibis ( с зсяользобднеем клазкздкя СИСТЕМ )

03.es.(33 - Мслэ)с;-лпр::а.1 .Сиозсгля

Дчссерт«|{яя в ряде натчиого дсклада па еокскакие зггексД степени доктора каук

Косква - 1SS3

/

Работа выполнена в Институте общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН и Институте биологии гека РАН

ОФИЦИАЛЬНЫЕ' ОППОНЕНТЫ:

Салганик Р.И., академик РАН, до'ктор биологических наук, профессор Ильин "В.-¡0.академик РАН,' доктор биологических наук, профессор ^ ДебабовВ.Г., чл.-корр. РАН, доктор

биологических наук, профессор ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Центр "Еноинхенерия" РАН

.уз .. мла 1933г '10,

•Защита состоится " ' " ' ХЭЗЗг в'^л'час. на заседании Специализированного совета в Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, ял.Вавилова, д.32.

С диссертацией ио^но ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Диссертация з виде научного доклада разослана.

1933 г.

'12

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

ЙКТУАДЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Рекомбинация ДНК является ключевым биологическим процессом в клетках бактерий, животных и растений, обеспечивающим обмен генетической информации. Различают два основных типа рекомбинации. Первый - гомологичная рекомбинация - происходит между протяженными участками гомологичных последовательностей ДНК и обеспечивается ээолюционно выработанными для этого клеточными знзиматическими системами. Гомологичная рекомбинация происходит при коньюгации, трансдукции и трансформации у бактерий, в митозе и мейозе у эукариоткческих организмов. Второй негомологичная, или незаконная, рекомбинация - приводит к объединению молекул ДНК, имеющих лиаь очень короткие участки гомологии или же неимеющих гомологии вовсе. Она описана при интеграции и эксцизии плазмид, фагов и вирусов; при транспозициях мобильных генетических элементов; при некоторых инверсиях, дупликациях и делециях ДНК, и других перестройках генома. Незаконная'"рекомбинация может осуществляться либо специфическими знзиматическими системами, включающими по крайней мере один неклеточный компонент, кодируемый фаговыми, вирусными или транспозоновыми генами (в таком случае она называется сайт-специфической рекомбинацией), либо может быть вызвана действием неспецифических по отношению к ней белковых факторов, как ухе известных, так и пока неидентифицированных. однако, молекулярные механизмы собственно незаконной рекомбинации, в отличие от сайт-специфической остаются мало иследованными, несмотря на ее большой вклад как в процессы геномных перестроек, так и в судьбу рекомбикантных молекул ДНК при генно-инженерных манипуляциях.

Незаконная рекомбинация, как и гомологичная, может происходить как между участками одной молекулы ДНК (внутримолекулярная , рекомбинация), например, при образовании делеций и эксцизии плазмид и вирусов из генома, так и между молекулами ДНК (межмолекулярная рекомбинация) при образовании коинтегративных плазмид, интеграции плазмид и вирусов в геном и т.п. Эти два основных типа ДНК/ДНК взаимодействия, наряду, с. особенностями участвующих в нам субстратов (топология, конформация, наличие одно- или двуцепочечных разрывов, хроматиновая структура) и специфическими особенностями данной клеточной системы - являются теми факторрш, которые, в основном, и определяют судьбу молекул . ДНК при незаконной рекомбинации, в связи с этим необходимо отметить, что в отличие от гомологичной рекомбинации, для которой идентифицированы основные контролирующие ее гены, незаконная рекомбинация гораздо менее изучена. Практически, не идентифицировано ни одного гена, мутация в котором, по крайней мере, хотя бы частично ингибировала незаконную рекомбинацию. поэтому предложенные исследователями модели, объясняющие незаконную рекомбинацию,

принципиально отличаются друг от друга, и в их основе лежат самые разнообразные аспекты метаболизма ДКК (см.обзор Anderson, 1987). То есть, по-видимому, в отличие от системы гомологичной рекомбинации, наиболее изученной у Escherichia coli (обзор Smith, 1988; Mahajan, 1988), "системы незаконной рекомбинации" клетки, как таковой не существует.

Впервые незаконная рекомбинация была описана в клетках E.coli Франклин (1967) при изучении спонтанных делеций, как рекомбинация независимая от функции гена гесА - ключевого гена энзиматической системы гомологичной рекомбинации. В последующем сходные результату были получены рядок исследователей (MullerHill ar.d Kania,- 1974; Ghosal and Saedler, 1979; Foster et al.,

1981).

Изучение незаконной рекомбинации проводилось рядом групп в основном в клетках E.coli. В качестве модельной системы исследовалось возникновение спонтанных делеций

(внутримолекулярная рекомбинация) в lac (Farabaugh et al.,1978; Albertini et al., 1982; Schaaper et al., 1986) н trp-(Wu et al., 1S80) оперонах, a также в гибридных плазмидах (Jones et al.,

1982). Сада же,- мохно отнести и проводившиеся исследования эксцизйи гранспозонов .(Boss et al., 1973; Sonoer et al., 1981; Egner and Berg,> 1981; Foster et al., 1S81). Хотя при эксцизии некоторые дехеции могли возникать за счет сайт-специфической рекомбинации, тем иа менее, сильная вариабильность делеционных 1 концов свидетельствует, что за исключением специальных случаев, она не отвечает за появление большийства спонтанных делеций. В результате этих исследований было установлено, что делеции часто происходят кехду прямики повторами ДНК размером 5-10 п.о. Короткие прямые повтора, но меньаего размера (2-5 п.о.), обнаружены и местах делеций в эукариотических клетках (Koth et al., 1985). Образование спонтанных делеций в плазыидаз, несущих вставку репортерного гена, изучалось и в клетках Eacillus subtilis (Lopez et al., 1984; Peijnenburg et al., 1988;1989).Такая структурная плазмидная нестабильность, характеризовалась относительно высокой долей делеций меаду. участкани ДНК не имеющими прямых коротких повторов.

Выбор в качестве модели незаконной рекомбинации делеционной структурной нестабильности плазмид объясняется, как широкой распространенностью делеций, как явления, так и удобством их анализа на плазмидиок репликоне (картирование, секвеиирование ДНК). Сложность хе анализа продуктов меямолеку^ярной незаконной рекомбинации, по-видимому, определила относительно малое число исследований посвященных этому вопросу. Наиболее последовательно в этом направлении работала группа Икеды с системой рекомбинации in vitro (Ikeda et al..1981, 1982, 1984; Ikeda, 1988; Bas et al-, 1988).

Актуальность изучения молекулярных механизмов незаконной рекомбинации, особенно в ее мехмолекулярнон варианте, тесно связана с проблемами горизонтальной эволюции и трансгенеза, а в клетках животных и растений с проблемами гемотерапии и получения трансгенных организмов. Решение последних связано в основном с разработкой способов направленной интеграции генов в геном за счет гомологичной рекомбинации, т.к. крайне высокая скорость незаконной рекомбинации (на 3 порядка выяе, чем гомологичной) сильно затрудняет обнаружение встройки вводимой в клетку ДНК в гомологичный участок генома (Capecchi, 1990). В результате этого векторная ДНК за счет незаконной рекомбинации интегрирует в различные участки генома, где ее экспрессия, как правило, неэффективна. Поэтому решение проблемы оптимизации направленной интеграции гена в клетках высших зукариот непосредственно связано с выяснением как молекулярных механизмов незаконной рекомбинации, так и причин ее столь высокой частоты. Хотя и делались отдельные попытки выделения и анализа продуктов межмолекулярной незаконной рекомбинации в культурах клеток животных (Wilson et al., 1982; O'Rear and Temin, 1982; Ruley and Fried 1903; Anderson et al., 1984) вопрос остается малоизученным, в частности из-за сложности анализа и отсутствия удобных модельных систем. В связи с этим представляется важным и актуальным изучение молекулярных механизмов незаконной рекомбинации иа прокариотических моделях, что и предпринято в настоящем цикле исследований проведенных на бактерии Bacillus subtilis.

Вас.subtilis является наиболее изученной в генетическом и нолекул.чрно-биологическом аспектах грам-положительной бактерией. Вас.subtilis и другие родственные ей бациллы широко используются в современной биотехнологии, для продукции веществ для пищевой промышленности, и медицины, благодаря их непатогенности для человека и хивотных, а также их • способности секретировать целевые продукты из клетки. В клетках Вас.subtilis незаконная рекомбинация была описана, как явление независимое от Функционирования гена гесЕ - основного гена контролирующего гомологичную рекомбинацию, аналога гесА гена E.coli. Это и делеционная структурная нестабильность полученных in vitro гибридных плазмид (Gryczan and Dubnau, 1973; Grandi et al., 1981; Lopez et al., 1984; Hahn and -Dubnau, 1985), и меяпяазмидная рекомбинация (Fujii and Sakaguchi, 1980), и интеграция плазмиды рЕ194 в хромосому бактерии (Hoferaeister et al., 1983). Однако, к началу представленных здесь исследований механизмы незаконной рекомбинации в Вас.subtilis оставались малоизученными. Лишь сравнительно недавно были предприняты систематические исследования механизма возникновения спонтанных ^еяеций (Peijneiiburg et al., 1988, 1989).

Все вышесказанное, а также многолетний опыт работы автора с Вас.subtilis, * определило выбор этого микроорганизма в качестве объекта исследования молекулярных механизмов незаконной рекомбинации.

ЦЕЛЬ Е ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящего исследования было выяснение молекулярных механизмов незаконной рекомбинации в клетках Вас.subtilis. В связи с этим бы» поставлены следующие задачи:

- Разработать модельные плазмидные системы межмолекулярной незаконной рекомбинации.

Установить взаимосвязь гомологичной и незаконной рекомбинации при малых величинах гомологии ДНК. Определить минимальную длину участка гомологии при ДНК/ДНК взаимодействии, необходимую для гомологичной рекомбинации.

- Выяснить генетический контроль незаконной рекомбинации и выявить Факторы, влияющие на ее частоту.

Определить нуклеотидныг последовательности сайтов незаконной рекомбинации при интеграции плазмид в бактериальный геном или неродственный плазмидный репликон, их спонтанной эксцизии из хромосомы и "незаконной" амплификации. Обобщить данные по пуклеотндному контексту рёксмбинационных сайтов.

- Определить сиквенс-специфичность ДНК гиразы Вас.subtilis in vivo. Провести точное картирование сайтов действия ДНК гиразы разной "силы" на плазмидных репликонах, используемых в модельных системах незаконной рекомбинации. Оценить вклад ДНК гиразы б широкий спектр явлений незаконной рекомбинации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТУ.

- Впервые создана оригинальная система, позволяющая одновременно оценивать скорости гомологичной и незаконной рекомбинации мезаду плаэмидной и хромосомной ДНК. Установлено, что 70 п. о. - это минимальная длина участка гомологии, необходимая для гомологичной рекомбинации между плазмидой и хромосомой Вас.subtilis.

- Впервые определен« особенности первичной структуры ДНК сайтов межмолекулярной незаконной рекомбинации в клетках Вас.subtilis на моделях интеграции температурочувстзитедьной по репликации плаэмвды рЕ194 и ее производных в хромосому или неродственный плазмидный репликон.

- Впервые определена полная нуклеотидная последовательность канамицик-резистенткой плазмиды S.avu-eus pUBllC (4545 п.о.) -базового вектора дяя генно-инженерных млнипуляций в Вас.subtilis.

- Впервые разработана модельная система межмолекулярной незаконной рекомбинации, основанная на коинтеграции ts-репликока рЕ194 (к его производных) и плаэмиды pBD17 (mini pUB110).

Обнаружена "горячая точка" мезплазкидной незаконней рекомбинации на ДНК плазкид рЕ194 п рЪ'ВИЙ. Постулировано участие неидентифицировгнной рэкомбинагы Вас.subtilis.

Обнаружена гесЕ-независимая сайт-специфическая рекомбинация мегду плазкидаш: рОВ110 и рЕ194. Установлено, что рекомбинация происходит в пределах кор-последователькостей сайтов размером 10 п.о.

- Впервые обнаружен феномен гесЕ-независимой "незаконной амплификации" интегрированных в геном плазкид. Показана ключевая роль в этом процессе рзпликационного белка плаэмиды рЕ194 и предложена модель молекулярного механизма такой амплификации.

Впервые определена сиквен с-специфичн ость ДНК-гиразы Вас.subtilis in vivo. Проведена оценка роли ДНК-гираэы в незаконной рекомбинации у Вас.subtilis.

Впервые выявлена обобщенная последовательность сайта незаконной рекомбинации, независимой от коротких- трактов -гомологии. Выдвинуто предположения о ведущей роли ДНК топоизомеразы Т Вас.subtilis в механизме рекомбинации этого типа:

<ШРОБ£ЦНЯ РЙБОТЕ.

Основные результаты работы докладывались на различных отечественных к международных конференциях и рабочих совещаниях, в том числе на VII Европейском созещакии по" генетической трансформации, Париж (1984); на Всесоюзной кокФеренции"НсЕые направления биотехнологии", Пущино (1384); на Всесоюзной конференции "Гибридные плазкидц и экспрессия плазкидных генов", Пущико (1984); на X Всесоюзном созещании по программе "Пдазмида", (1985); на VI и VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессе:;", Москва (1987; 1990), на VIII Европейском совещании по генетической трансформации, Упсала, Швеция (198В); на 1-ом Рабочем совещании "Генные манипуляции в бациллах", Хуфхаус, ФРГ (1936); на 11-ом Рабочем совещании "Геккне манипуляции вбьциллах", Хольцхау, ФРГ (1990); на семинаре .Института генетики человека (МПС) в Здикбурге, Шотландия (1S91); на семинаре Базельского института иммунологии , Базель, Езейцария (1991); ка семинаре Отдела молекулярно-генетических проблей Института общей генетики РАН, Москва (1939); на семинаре "Хромосома" Института молекулярной биологии РДН, Москва (1992).

структура РАБОТЫ.

Диссертация излохена з настоящей брошюра з форме научного доклада. Основная часть результатов получена лично автором или б сотрудничестве с Д.Ю.Жвингидой, Б.Конрад, Н.М.Лакомовой, Е.Ф.Лосевой, Г.В.Савченко, К.М.Стоиловой-Длшевой, С.К.Павловой, Ф.К.Касановым, Ю.Хофемейстгрон, что отрахеио в публикациях по теме диссертации. Всем коллегам автор приносит благодарность за помощь в выполнении экспериментов. Автор выражает признательность проф. А.А.Прозорову за постоянный интерес и обсуждение работа.

МЕТОДЫ

В работе использованы различные яодекудярно-биодогичвские, генетические и гекно-инженерные методы: трансформация и трансдукцкя бактерий; выделение и анализ шгазмидмсй, Фаговой -и хромосомной ДЕК; рестрикцнонный анализ; электрофорез ДНК; получение мечежих проб ДНК; Сауэерн бдот-гибридизация ДНК; гибридизация колоний; выделение и встраивание фрапзентоэ ДНК в векторные молекулы для клонирования; определение нукдеотидных последовательностей ДНК; создание ганомнцх библиотек и и>: скрининг; и другие методы в общепринятой идя собственной модификации.

РЕЗУЛЬТАТЕ ЙССЛЕДОВаЕНЙ 2 ИХ ОБСУДДЕШЕ

1. Для гомологично?; рехокбыаацнн кезд? плазяхдой и хромосомой необл од и»; о 10 п. о. гокологан.

Ключевыми этапами гомологичной рекомбинации являются спаривание . гомолог;:чких областей молекул ДНК и последующий обмен цепей ДНК, приводящий к образовании гетеродуплексной ДНК. В E.coli этот процесс осуществляется НесА белком (Kadding, 1982). ВесА белок способствует образованию in vitro стабильных гетеродуплексов мезду молекулами ДНК, имеющими 151 п.о. гомологии, но us эффективен при гомояогки в 30 п.о. (Gonda and Radding, 1983). Однако, in vivo для заметной рекомбинации достаточно 20-40 и.о. гомологии (Watt et al., 1985; King and Richardson, 19B8). Более того, даге при гоиологии в 13 п.о. под воздействием продукта гена НесА наблюдалось десятикратное увеличение рекомбинации мегду Фагом X и плазмидой рБК322. Однако, похохий эффект продукта гена recE Bac.subilis in vivo не наблюдался (Hofemeister et al., 1983; данные раздела 2.2).' Поэтому возникает вопросы: каков минимальный размер участка гомологии при дзк/дтс взаимодействии необходимый для гомологичной рекомбинации в Вас.subtilis? ; какой характер носит взаимосвязь между незаконной и гомологичной рекомбинациями при

малых величинах гомологии ДНК? Ответ на эти вопроса наиболзе важен для системы межмолгкулярной рекомбинации, особенно при взаимодействии плазмиды и хромосомы (gene targeting направленной интеграции генов в хромосому).

Для изучения этого вопроса была разработана система, позволяющая отличить события незаконней и гомологичной рекомбинации при интеграции плазмиды в хромосому. Система включала серив плазмкд, производных тгмпературочузстБительной (ts) по репликации, эритромицинустойчивой (Em1-) плазмиды рЕ194, способной к спонтанной интеграции в различные места хромосомы Вас.subtilis за счет незаконной рекомбинации (Hofer.eister et al., 1983). Селекция иктеграптов легко осуществлялась при 52°С (непермиссивная t°) на среде с Em. Встраивание коротких фрагментов ДНК, гомологичных хромосоме, в ts-плазмиду, их введение s клетг;и Eac. subtilis и выращивание таких клеток при 32°С с последующей селекцией Епг-::эловиЯ при 52°С могло приводить к возникновению двух типов интэгрантов С см.рис.1). Первый тип - рекскбинакта возникающие за счет гомологичной рекомбинации, второй - за счет нсзг?:ок::сй рекомбинации. Чтобы отличить эти два типа рекомбинационниз: событий били сконструированы производные рЕ194, несущие вставки различной длины bglS гена Вас.subtilis, кодирующего в-глпконазу. Как видно из рис.1, гомологичная рекомбинация будет приводить к инактивации bglS гена и Emr bgl- феиотипу интегрантов. Незаконная рексибинац-ля - к Emr bgl~ фенотипу интегрантов. EcoRV-Sall фрагмент центральной it одкрувг;сй части генг bglS длиной 165 п. о. был клонирован по этим же сайтам в интегративкый вектор Вас.subtilis pJH101. Используя куклеазу Ва131, были получены делеционные произпедны*;, содержащие фрагменты размером 77, 94, 121, 134 !! 150 п. о., в одинаковой ориентации. Три олигонуклеотида размером 12, 17 и 25 п.о. были синтезированы и клонированы в том зге направлении р EcoEV сайт pJH101 (рис.1). Чтобы полученные плазмиды могли реплицироваться в Вас.subtilis, к чим бал присоединен ts-репликон рЕ194. Таким образом, гибридны? плагкиды, несущие вставки.bglS гена различной длины и ъз-реплакон, после интеграции в хромосому за счет незаконной или гомологичной рекомбинации придавали клеткам Em1- фенотип.

Частота рекомбинации подсчитывалась» как количество сезиикавиих Епг интегрантов на число жизнеспособных клеток в 1 ■ !«. Колонии интегрантез -проверяли на bgl-*- фенотип на среде с 0.2% лихенином по появлению зон гидролиза после окрашивания чапек 0. IS конго красным. Б кахдек 'Случае проверялось 1Ь0. интегрантов. Зависимость частоты рекомбинации от длины участка гомологии ДНК показана на рис.2. Частота рекомбинации проявляет линейную зависимость от длины гомологии между субстратами з промежутке 77-165 п.о. Однакп, при более коротких гомологиях частота рекомбинации немного уменьшается и достигает величины

дгяна гоцокогня

„ „„ с ьгхг ЕсоДЦ 5.1161 имтятс]-лйтамт ¡етсе«:! 165 ьР

ет.......егиая----—йаюггйг йтс&с! т ь?

г^ш.........йоте-шсяйтштр^С! т Ьр

цдё...........СИПА-—-гйТ66ТйТ|5Шс] 121 Ьр

..............Кй»&---:-:-ШбПйТЙТСЩ И Ър

..................тсгк;-шеям )етссос1 тг ър

......................;....ЙТ1Ш^ШтСТС1ЛТСЯЙй1С!аи]. 2Б 1>р

....................................сс«*асдасййпге 17 ъР

.........................................стсшсалай ¡х$ь] 12 ър

ЕсоЯМ

Рас.1. С хека эксперииентал^яой см стеки.

Хромостшназ Д2Х - тсисая , ЪлХБ гек - свгтяая прлхсуго^ь:;ая стрелка. чериыд вгишютшшмх - участок гомологж: ДВК. Пропсхгн-носгь нуклеогадной гспогогни пхазхздпого субстрата с хромосомных Ъв1В ггном кокагака г ¡завей яасты расГокодогичяые последовательности о6озе2.тсез прошюпаш буквам и сяхозк&ши доодаыя;. деягтироваЬшв нуааесгасз: - точкгли; части вехторкых ЕсоНУ сайтов - строчит™ бусваяа.

ЧАСТОТА РЕКОНБИНАПИН

(1Э-6) 6

5

4

3

26 60 163 143

ДЛЕНА (п.е.)

lea

Рис.2. Зависимость частот» рекомбинации от протяженности

гомологии субстратов. ( а ) - средние значеаиа частот двгх или Солее измерений в

гее» слетках; С л ) - средкиг значения частот s мсЕ- клетхах; (О ) - ытчиехенпнй уровень незаконной рекокбевадик (как частота вогнихноввти bel* рехокбияаятоа)

примерно 1.1 х 10~7 в промежутке 0-25 п.о. Зависимость явно носит нелинейный характер в .промежутке 25-77 п.о. Частота рекомбинационного фона для плазмиды без вставки составляет примерно 1.0 к 10-7. В отличие от представленных на рис.2 данных, в системе рекомбинации мехду ДНК фага X и рВН322 в E.coli наблюдалось возрастание частоты рекомбинации на два-три порядка при гомологии 20 п.о., по сравнению с контролем без гомологии, при этом выборочный рестрикциониый анализ показал наличие реципрокного кроссинговера внутри этого участка (Shen and Huang, 1986; King and Richardson, 1985). В нашей системе, наоборот, оказалось, что при длине гомологии до 25 п.о. включительно, все интегранты были bgl*, ■ т.е. образовались исключительно за счет незаконной рекомбинации. При гомологиях 77, 94, 121, 134, 150 и 165 п.о. было'установлено, что 59.8%, 82,3%, 94.4%, 95$, 97.7% и 98.2% рекомбинантов имели bgl-фенотип, т.е. возникли в результате гомологичной рекомбинации. Вычисленная на основании этих данных частота незаконной рекомбинации составила примерно 1.2 х 10-7, т.е. ее скорость была постоянна для гомологий в пределах всего исследованного

интервала 0-165 п.о. В гзсЕ-зтамне гомологичная рекомбинация не была обнаружена, а частота интеграции пяазмид в хромосому определялась полиость» механизмами незаконной рекомбинации (см.рис.2).

адекватность нашей bgl- тест-системы типу рекомбинации была доказана блоттинг-гибридизацией хромосомной ДНК из ряда bgl-Hbgl- интегрантов. Таким обргзом, установлено, что 25 п.о. гомологии мехдуДЯК субстратами недостаточно для гомологичной рекомбинации плазмиды и .хромосомы в Вас. subtilis. Лишь при 77 п.о. возникновение примерно половины интегрантов обусловлено гесЕ-зависимой. гомологичной рекомбинацией. Линейная -

экстраполяция данных пропорционального участка графика к нулевому значению гомологичной рекомбинации позволила установить, что пр;:мерно 70 п. о. является минимальной топологией, необходимой для эффективной гомологичной рекомбинации между кольцезой плазиидой и хромосомой.

Критическая величина для гомологичной межмолекуляряой экстрахромосомиой рекомбинации аевду . и рВК322 составляет 30-40 п. о. в E.coli гесА-*- (King and Richardson, 1988; Shen and Huang, 1986). 25 п.о. являются минимумом гомолог::« для мезыолекулярной рекомбинации в клетках дрожаей и млекопитающих (Ann et al., 1988; Ayares et al., 193S). Однако, определение критической величины гомологии для ДЯХ/дак реяомбинационного взаимодействия с участием хромосомного субстрата нг проводилось ни иа про-, ни на эукариотическиг моделях. В связи с эт:ш, определения наки минимальная длина гомологии при взаимодействии ,плазмида-хромосона мояет отразить нг только особенности рекомбикационной машины Вас.subtilis (в частности, размер участка ДНК, необходимый для "посадки" рекомбкяаз), но и специфику рекомбинации между "голой" ДНК и слоаноорганизовакной структурой хромосомной ДНК.

Таким образом, в про- и эукариотая, система гомологичней рекомбинации неэффективна при протя^енностях гомологичных участков менее 25-70 п.о., и судьба таких молекул ДНК определяется ухе механизмами незаконной рекомбинации.

2. Незаконная рекомбинация пря спонтанной интеграция пдазмид в геном Вас.subtilis.

2.1. Интеграция плазиид в хромосому Вас.subtilis является не сайт-спецификесейм, а универсальным процессом незаконной рекомбинации.

Температурочувствительная (ts) по репликации, эритромицин-устойчивая (Етг) плазмида Staphylococcus aureus рЕ1Э4, способная размножаться в клетках. Вас.subtilis, может спонтанно интегрировать в геном этой бактерии {Hofemeister et al., 1983).

hindixx

PKC.3. Int-сайг.' pK194, 1?SGÍ0, pSG23, £G3132.--- pE194;

- PC194, ■ i - SBES22; et, e2, еЗ, e4, gl, g2, g3, Ъ2, bî, и - Int-сайта.

При этом интеграция происходит в разные участки генома с очень низкой частотой - 3-5 х 10~в. Несмотря на низкую частоту интеграции, ts репликация плазмиды позволяет проводить селекцию интегрантов 'яри непермиссивной температуре (50°С) на среде с Em. Низкая частота этого явления и независимость от ключевого гес-гена' - гесЕ - свидетельствует, что процесс носит характер незаконной рекомбинации. Однако, не ясно, является ли процесс сайт-специфическим и уникальным для рЕ194, или нзт, и кохет ли быть использован как модель для изучения общей незаконной рекомбинации. Для выяснения этого вопроса мы проверили возмохность интеграции в хромосому гибридных плазмид, содержащих, помимо рЕ134, последовательности других плазмид: 1) PGG10 (En1-, Cm1-) - гибрид рЕ194 (Em~) и другой плазмиды S.aureus рС194 (Cm*); 2) pGG20 (Em*, Тс*) - гибрид рЕ134 и плазмиды Е.coli рВК322; 3) pGG102 (Cm*) - плазмида pGSIB со вставкой 3.2 т.п.о. полностью чужеродной ДНК из генома пиеница. Все три плазмиды реплицировались только за счет ts репаикона рЕ194 (см. рис.3) и имели детерминанты антибиотикустойчивости для селекции клонов интегрантов. Была получена серия клонов, со встроенными в хромосому, прототрофного штамма Bac.subtilis SB25 гибридными плазмидами,. в той числе ауксотрофы рЁ194::his- и pGG10:-.arg" (интеграция в гены hisA и argF согласно проведенному картированию с поясщьа трансдуциоующего Фага ÄR9). Для определения локализации плазмидных сайтов интеграции (Int-сайтов) использовался следующий принцип: если хромосомную ДНК хлона-интегранта разрезать одной иди двумя рестриктазами, делящими плазмиду на несколько фрагментов, то после Саузерн гибридизации с меченной плазмидной ДНК, на радиоавтографе должен исчезать тог Фрагмент ДНК, кг котором находился Int-сайт, а вместо него долхиы появиться два новых фрагмента, возникающие в результате размыкаккя кольцевой молекулы плазмиды при встраивании ее в хромосому. Таким образом, исследуя поведение перекрывающихся фрагментов плазкидной ДНК в реетриктах разных эндонуклеаз, можно локализовать Int-сайт, т.е. сайт незаконной реципрокной рекомбинации. Пример картирования Int-сайтов приведен на рис.4. в результате этих экспериментов сайты рекомбинации били обнарувены и картирована на ДНК плазмид pel94 и рБВ322 а также на эукариотической ДНК. Полозекие Int-сайтов показано на рис.3. Эти -данные свидетельствуют о том, что интеграция ?Е194 в геном Bao.eubtilis не является сайт-специфическим процессом присущим только этой плазмида, т.к. Int-сайты обнаруживаются и на неродственных плазмидах S.aureus и E.coli, и на ДНК эукариотического проискохдекия. Таким образок, интеграция плазмзд в .тромосоиу Bac.subtilis является следствием собственно незаконной рекомбинаций и может слугить удобной моделью этого процесса.

Mspl

Mspl Mspl Mspl

J_ -L-L

Вогпн! м1р1Вд'|Д Borr.fiIН;

Mspl

Mspl

Сш'

Hin^m

Pst; ^

"L

7 i "Tl^H-г~

Ipalpstl Hindm Mspl Ира I Mspl Bern HI -AI-J

ti M'na

ab cd

- AÍ

. a2 -

-A -A _

В " 8 . . Ci

B..JSV B B

Aj

Рис.4. Картирование Int сайта на плазмнде pGG102.

fl. Схематическое изображение метода картирования Int сайта.

ий - фрагмент ДИК, исчезающий на радиоавтографе после рестрикции,

|=з- клонированный фрагмент ДНК пяенкцы,

---- Int сайт.

B. Встроенная в хромосому плазкида pGG132. В охни стая линия -

- хромосомная ДНК. CI, С2 и Al, Д2 - фрагменты ДНК, возкикаюцие из MspX-C и BamHI+Pstl-A фрагментов pGQ102 в результате интег-ративной рекомбинации (сн. С). .

C. Гибридизация 32Р-меченной pGG102 с переварами pGG102 (1 нг) BamHI+Pstl (a), Mspl (с), Hind 111(e) и с хромосомной ДНК (1 нг) интегранта соответственно (Ь, d, f)

2.2. Нутациа гес149 подавляет незаконную рекоа6инац»ш.

Для ответа на вопрос, существует ли какая либо взаимосвязь между межмолекухярной незаконной рекомбинацией и гомологичной рекомбинацией, было проверено влияние разных гес-мугаций Вас.subtilis на частоту интеграция плазмид. Оказалось,' что большинство извгстнмх rec-мутантоз не влияют на частоту процесса. Однако, плейотропная мутация гес149, с нарушениями гомологичной рекомбинации неизвестной природы, снизала частоту рекомбинации н»ле урозня чувствительности применяемой нами системы - 1 х 10-0. Практически все кутации, оказывающие влияние на незаконную рекомбинацию в 2. coli, polA, lig, ssb, dam, uvrD, niutHLS (Couksll and Yanofsky, 1970; Lundhlad and Kleckner, 19B2), стимулируют ее. Recl49 - первая известная мутация, подавляющая незаконную рекомбинацию. Однако, т.к. соответствующий ген не клонирован и его белковый продукт не идентифицирован, механизм влияния гас149 на незаконную рекомбинацию не ясен.

2.3. Особенности первичной структуры сайтов рекомбинации.

Для выяснения механизма незаконной рекомбинации при интеграции плазмид в хромосому Bac.subtili3 необходимо определить, какие нуклеотидные последовательности участвуют в этом процессе. Сравнение нукле.отидных последовательностей участков плазмид рЕ194, рС194 и рВЕ322, содержащих Int-сайты, не выявило каких-либо специфических гомологичных

последовательностей. Поэтому было предпринято клонирование рекомбинациокных . стыков плазмида-хроыосома у 4-х независимых интегрантов плазм иды pGG20: Ы, Ь5 (встройка за счет Int-сайтов на рЕ194) и Ь2 и Ь4 (координаты Int-сайтов на РВН322 - 36123757, 3329-3410). Т.к. плаэмидные мономеры не трансформируют компетентные клетки Вас.subtilis, было использовано преимущество бирепликонной плаэмиды pGC-20 реплицироваться в клетках E.coli. Клонирование проводили по следующей схеме: хромосомная ДНК интегрантов расцеплялась рестрнктазой, не имеющей сайтов на PGG20 (Belli, Saal}, лягировалась в условиях, способствовавших преимущественному образованию мономеров, и . проводилась трансформация E.coli НН101 по маркеру Тс». Рециркуляризация Фрагментов ДНК, состоящих из pGG20 и прклег&чил хромосонных последовательностей приводила к образованию гибридных плазмид, структура которых изображена на рис.5. Фрагменты плазмид, содержащие нуклеотидные последовательности рекомбинационных стыков ДНК били идентифицированы блоттинг-гибридизацией, переклонировакы в вектор рЧС19 и секвснированы. Результаты представлены на рис.6.

Рис.5. Рекомбнианткые плазмнда, содерзаедге сгъаси ДЗК "пяазшда--хромосома", полученные путея рециркуларкэацаи хромосомных фрагментов и "спасения" в клетках H.coli. Стреяками показано направление секвенкрова.нкя.;--хромосомная ДЕК; ». ,- г... ■ - рЕН322;

Г " '.I - р2194.

ьг

3721 3755

ioct3cgetcci3c!ltic0m!ci2acaag2aagit р£к322

ct gataaaagOTCSCASCGMCTCA!;* ACTAi-GTT J1

L ICCITCGGTCCSOCtlilCcttstcaceoscsgatc J2

3349 3333

г тссАелитессгслстссасиссгоыг,л?.ис рзюгг

L 'i-CaMAGTTSCC^ACTCaocgtcetta-tEsaaESO J1

Ь5

1714 174S

ATtJMCMCW/^CGIAGiATPIAAl^GiKyUIG pS194 **

ASaAiCiAdGAAICaT^tatattttataatatcs «1 ' от

Ы

1842 1876

рВ134

2A5ULU2Xr®U.GCateetteaac.-tcctot5tab3o J1 . ^ttcstottcMt^GASCSrexUCTAACAGI J2

Рис.6. Нуклеотпднце последовательности, учасгвугя?не в незаконной рекомбинации при интеграции ts-плазмнд в гене* Вас. subtilis. Показаны последовательности в ргкомбинактных стыках ДВЕ (Л и J2) к в ксгодяыг сайтах рекомбинации на рВН322 н рЕ194. Хромосомные и тазмидкые последовательности представлены строчными и пропнелнки буквами, s - гокологка в точкам кроссоэера.• ;

Из результатов по секвенированию можно заключить, что рекомбинантЬ2 образовался за счет рекомбинации между короткими (8 п.о.) участками гомологии (обозначены звездочками на рис.6). Рядом с участками стихов ДНК, через один нуклеотид, у ияте-грантов Ь2 и Ь4 находятся дополнительные гомологии длиной 6 и 5 п.о. Б случае интеграции за счет Int-сайтов рЕ194 (Ы и Ъ5) рекомбинация происходит независимо от наличия какой-либо гомологии между последовательностями ДНК (М) или имеется совпадение только 2-х. нуклеотидов (Ь5). Куклеотидные последовательности стыков ДНК у Ы и Ъ5 имев? между собой существенную гомологии. Это свидетельствует, что интегранты Ь1 и Ь5 возникли в результате одного рекомбинационного механизма. Т.о. налицо два типа межмолекулярной незаконной рекомбинации: первая, с участием коротких участков гомологии между взаимодействующими молекулами ДНК, и, вторая, с участием полностью негомологичных ДНК сайтов.

Интеграция плазмид в хромосому Bac.subtilis за ,счет коротких участков гомологии ДНК может быть объяснена механизмом "рекомбинации выбора копии" (copy choice), легшим в основу самой популярной модели незаконной рекомбинации, получившей название"проскальзывание с неправильным спариванием"(slipped mispairing) и предложенной для объяснения дедеций (Franklin, 1967). Эта модель основывается на предположении, что при репликационном синтезе второй нити ДНК в результате неправильного спаривания меяду повторами ДНК происходит перескок репликационного комплекса с одного повтора на другой, при эток однонитевой участок ДНК между повторами выпетливается. В дальнейшем репарация вновь образованного гетеродуплекса (Efs-tratiadis et al., 1982), иди второй раунд репликации (A.lhertini et al., 1982) приведут к потере последовательностей ДНК между повторами. В канем случае, межмолекулярной рекомбинации, можно предположить, "что неправильное спаривание конца реплицирующейся цепи ДНК с частично комплементарной последовательность» в ереии другой молекулы ДНК, приводит к образованию коинтеграта, при этом дополнительный участок топологии, придегапаий к стыку ДЩК (см.рис.6), может _служить "якорем" удерзивагада эту цепь дак в бреши.

Другой тип коинжгграцам, без участия гомологии ДНК между рекоибинациониыяи сайтами (см.рис.6, Ь1 и' Ь5), необъясним с помощью модели "проскальзывания репликации с неправильным спариванием". Механизм такой рекомбинации может быть объяснен.s райках другого общего предположения, выдвинутого Франклин, для объяснения образования спонтанных дслеций. Он заключается в том, что энэккы, раэрез&юцкг и иоссоединякяцие RH, как часть своей нормальной функции, делают это и на последовательностях практически неимеющих гомологии. Згг модель, получившая название "ошибок разрыва и воссоединения ДНК", активно разрабатывалась

группой Х.Икеда, который показал, что ДНК гираза E.coli и Т4 ДНК топоизомераза способны вызывать незаконную рекомбинацию в системе in vitro между фагом Хи плазмидой pBR322 (Ikeda et al., 1982, 1984; Ikeda, 1986). При этом два двухсубъединичных комплекса, находящихся на разных молекулах, после внесения временного двуцепочечного разрыва, войдя в физический контакт, обмениваются субъединицами, что приводит к реципрокной рекомбинации связанных с ними последовательностей ДНК (Naito et al., 1984). По аналогии, возникновение рекомбинантов Ы и Ь5 мояет быть объяснено действием неидентифнцированной "рекомбиназы" Вас.subtilis, являющейся ДНК топоиэомераэой I или II типа, или другим белком разрезающим ДНК.

Таким образом, на основе представленных данных можно сделать выводы: 1) интеграция плазмид в хроиосояу происходит в результате реципрокной -рекомбинации по механизму, подобному предложенному Campbell (1962); 2) существует, по-крайней мере, два различных механизма незаконной рекомбинации, приводящие к интеграции плазмидных репликонов в хромосому Вас.subtilis.

3. Кегплазмидная незаконная рекомбинация.

3.1. Спонтанная кскнтеграцкя плазмид - модельная система мехплазнидной незаконной рекомбинации.

Клонирование и секвенирование рекомбинационных стыков ДНК при интеграции плазмид в хромосому достаточно трудоемкий процесс для получения представительной выборки нуклеотидных последовательностей ДНК, непосредственно участвующих в незаконной рекомбинации. Поэтому была разработана другая система межмодекулярной незаконной рекомбинации, основанная на образования межплаямидных коинтегратов.

Мы предположили, что ts-плазмида может интегрировать не только в хромосому бактерии, но и в другой неродственный плазкидный репликон, находящийся в той же клетке. Т.о. после \ инкубации клеток при 52®С на среде с Em, будут выживать клетки, в' которых ts-плазмида встроилась з хромосому или в другую "резидентную"плазмиду, реплицирующуюся при данной температуре. Знание - нуклеотидных последовательностей реконбинируюяих родительских плазмид и относительная" легкость манипуляций с плазмидньши ДНК сделали - бы эту систему межмолекулярной рекомбинации .-более удобной для анализа рекомбинационных продуктов.

Полные нуклеотидные последовательности ts-плазмид рЕ194 и pGG20(pE194+pBR322) известны (Horinouchi and Vfeisblum, 1982; Sutcliffe, 1978). Из-за отсутствия подходящих плазмид с известкой нуклеотидной последовательностью, которые

реплицируются в Вас.subtilis, мы решили взять, в качестве

"пдазмиды-резидента", базовый вектор для клонирования в этом микроорганизме - канакицин-резистентную (Кто*') плазмиду S.aureus рОВИИ и определить ее полную нуклсотидную последовательность,

3.1.1. Полная нуклеотидная последовательность и Функциональна« карта: канакицки-резкстеатиой плазииди S.aureus PÜB110.

Плазмида PÜB110 размером 4,5 т.п.о. сообщает клеткам Бас.subtilis устойчивость к канамицину (Km) и неомкцииу (Нео), а такхе к блеомицину (Bleo) и содержится в клетке в количестве 40 копий. На ее основе были сконструированы разнообразные плазмидные векторы для клонирования ДНК в Вас.subtilis и E.coli (Gryczan et al., 1980; йомантас и др., 1980; Ehrlich et al., 1982) и селекции промоторов (Donelli and Sonenshein, 1384; Банкиров и др., 1988), а такхе космады (Aadreoli, 1985). Однако, полная нуклеотидная последовательность pDB110 была неизвестна. Для секвенирования плазмида рОВ110 была клонирована в двух ориентация» в векторе pUCig. стратегия килссеквенирования заключалась в получении ступенчатых делеций с одного из концов вставки с помощью куклеазы S1, способной производить двуцепочечкые разрывы ДНК, статистически равномерно по всей длине плаэмиды, в специальных условиях (см. Еашкиров и др., 1986). Секвенирование делеционкых производных "рИС13-рОВ110" гибрида проводилось по методу Максана и Гилберта. Таким образом, была определена нуклеотидная последовательность обеих цепей ДНК PÜB110.

Физическая карта плаэмиды pUB110 представлена на рис.7.

Рос. ?. P«цимни—» харта PUBiiO, Раестотая в

ш. Иммво оимрм то«ш room циицв ■ e« ваврм-ленве. Обоиачавы чешрв открыл» радов ептымтая, tto/gtpyn-щн полшивтвды А, В, С о D

Указаны сайты разрезания некоторыми рестриктаэлми и четыре белок-кодмрузцис области. Сака последовательность приводится на рис.8 (приложение), где указаны как продукты трансляции открытых рамок считывания (орс),.так и потенциальные сайты связывания с 16S рРНК 2ac.subti.lis (S.D. последовательности) с AG от -16 до -18. S ккал/моль). 'Полная нуклеотидная последовательность pUBllß составляет 4545 п.о. и содержит чгтыре открытые рамки считывания, способные кодировать полипептиды А, В, С, и D с молегужгркцки кассакк 49.5; 38.8; 28.8 и 9.5 КД соответственно. Эти данное согласуются с массамм 4-х белков, обнаруживаемы;; в ш;кк-клетках Bac.suotilis. Полипепткд А это Рге белок, оеугцйстллязщий сайт-специфическую рекомбинацию меаду плазмидани, содержащими поелгдоватсльпосгь-мишекь - Ноа сайт (рис.8, нуклеотхды 3£5-4ß5). Некоторые аспекты такой рекомбинации описаны в разделе 3.5..2. Погнпептид В - ВерВ бглок, плазмидный репяккгционвий белок, инициирующий репликацию PÎJ3110 внесением одноцепочечиого разрыва 2 оридкине (ori) репликации. Полипептид С - какамицин-нук.ле'отидилтр'кс^ераза, цнактквкрувдая антибиотик канзм.чцик и обеспечивающая резистентность к ному. Золипепткд D -бялок обеспечивающий резистентность к антибиотику блеомицику.

3.1.2. сай1-г;пеццфмтэскаа рекомбинация пяазмкдами

яропсЕодкт в ::ор-у-э.ст:;е ESA сайта еазг'зре:: 10 и.о.

Для проверки воз:;с.ткости интеграции ts-плазмиды в неродственный' рспликон, первоначально использовали сгамм Вас. subtilis SB25, содержащий плаамиду рЕ194 (ts, Em1") и "резидентную" плагмкду pQBliQ (Кг.,~). Таким образом, проводя селс::цко по маркеру актибаотикустсйчкзости (Еш~) ts-плаамиду PE1S4 при нгпернисскзкой для ое репаикгдкк температуре ( 52°С) в npKcyj'evBHa температуроустойчивой плазмида рШШ0, отбирали Кшг Eia=---колонии. Эти колонии проверяли на наличие кояктегративных, т.е. тялелн*" ллаз;.:зд. оказалось, что подавляющее большинство Кшг Em*- клонов содержало. тяяелые плазиидн, хотя отдельные клоны содержали толы:с плаащ'ду сОЗНЙ. Лослсднге свидетельствовало о зстраг.вяиии p3I94 s хромосому этих клонов. Частота образования кокнтегратов составила. 5,4 х 10~в. Такат же картгетг наблюдалась пр» получении кглнтегратов плазиид в гес--атгммах - гесЕ4 и roc 149. однако, частота кокнтеграцки а мутанте гес149 била еншигна бочее чек ::а порядок. Растрихзиснный анализ копитегративинх плазкнд из разни« итамкоя" показал полную их иден!кчность. Одинаковая структура рекокбинакткых плазмид, наряду с высоко:". (5 s 10-®), относительно незаконной интеграции плазккд в хрокосому (3-5 х 10-в), частотой ns образования, свидетельствовала о ток, что кы имеем дело с сайт-специфическим процессов. Фрагменты, содерхацие рекомбинактные стыки ДНК двух коинтзграгивных плазккд из гесЕ4 мутанта и одной из гос-^-штамма,

были клонированы, а их нуклеотидные последовательности определены-(рис.9).

31*1 __* р-S207

TG^AGAGCACAOqSTTTAAOC^CTTAATTACCSAAGTAMTAAGTCTAGTGTGTTAGACTTTATGAA pS194

* ** «»иго«»« * ж * ») f* -тг tcgcaeaecacacactttat---eaa-tata-aactatietetattatactttacttor pOBI10

<06 __L_-_ 354

TCGTAGAflCACACGGTTIAACGACTTAATTACGAASTAAATAAGTCTAGTGTGTTAtacb't'tact'te J1

* «* «****»*«*» * ж * * * tcgoaeaecacnoactttat----gaa-tato-aaetatafftetffttaa&CTTTATSAA J2

Рис.9. Последовательности нукаеотидов родительски: и рекоабпнант-ныж плазнид при сайт-специфической рекомбинации между рЕ194 к рОВ110. Показана область частичной гохояогки плазяяд - ESA сайт. * - неправильно спаренные основания; прописные буквы - последовательность рЕ194; строчные буквы - рПВ110. Рамкой выделен кор- уча сток. Цифрами указаны координаты нуклеотидов. J1 и J2 -рекокбинантные стыки ДНК- Стрелки - инвертированный лоьтор.

Оказалось, что рекомбинация между рЕ194 и рОВ110 у исследованных коинтегратов произошла в областях плазмид, имеющих значительную гомологию нуклеотидных последовательностей: 63 нуклеотида на рЕ194 и 49 нукдеотидов на P0S110 (рис.9). Эти области состоят из полностью гомологичного консервативного кор-участка длиной в 10 нуклеотидов, фланкированного последовательностями с менее четкой гомологией. Наличие не'спаренных оснований позволило точно локализовать место кроссинговера. Во всех случаях коинтеграты образовались в результате одиночного кроссинговера, произошедшего в пределах кор-участка. Обнаруженные нами нуклеотидные последовательности, . по которым произошла рекомбинация между р£194 и р0В110 очень похохи на HSA-последовательности, участвующие в образовании коинтегратов плазмид р£194 и pTISI в клетках Staphylococcus aureus при плаамидной трансдукции (Hovick et al., 19S4). Б S.aureus кроссинг-овер проходил всегда в пределах НЗа-сайта, но в разних его точках, что по мнении авторов свидетельствует о его обеспечении обцей системой гомологичной рекомбинации S.aureus, но элективно .функционирующей лишь на коротких участках гомологии. ВесЕ-нззависимость процесса б Вас.subtilis свидетельствует . об отсутствии " влияния системы гомологичной рекомбинации на образование коинтегратов. Более того, отсутствие конверсии (коррекции неспаренных оснований) ДНК в пределах RSa-сайтов, в отличие от данных Hovick at al.(1984), отсутствие рекомбинации в ваших опытах при использовании вместо pUBllB плазмиды pBD17 (рО3110 без HpsXX С-фрагмекта, содержащего RSa-сайт), а тгкге наличие палиндромов, . способных образовывать

шпилечные структуры с- кор-учасгками в их петлях (рис.9), указывает на bsa-зазискмуи сайт-специфическую рекомбинацию. Двуосевая симметрия имеется и в других сайтах участвующих в сайт-специфической рекомбинации,, таких как res (ТпЗ), рагВ (CUDF13) и loxP (PI).

Наши данные были подтверждены для коинтеграции плазмид рЕ194 и рТ181 в клетках S.aureus (Gennaro et al., 1987), хотя авторам не удалось, в отличие от нас, показать точную локализацию точки кроссинговера. в петле шпилечной структура RSA-сайта. Одна'ко, было докааано, что рекомбинация осуществляется Рге-бел::ои, кодируемым самими ялазмидами ( ope А плазмид рЕ194 и рТ182.).

При сравнении аминокислотных последовательностей орс й плазмид рЕ194, PÜB110 и рТ181 выявляется значительная гомология N-концевых участков Рге-белков. RSа-сайты трех плазмид так" же гомологичны (рис.9) и находятся на расстоянии 60-70 куклеоткдов перед инициирующими трансляцию ATG кодонами. Как и в плаэмиде рТ181, RSA-сайт ptJBllB и его кор-последовательность перекрываются с потенциальным промотором гена pre (рис.13). Промотор tnpH гена в ТпЗ-^S и большинство промоторов din генов (кодирующих иняертазы) так re перекрываются со своими сайтами кроссинговера, а продукт гена tnpR действует как репрессор своего собственного синтеза (Beffraz,,1SC3; Plasterk and Putte, 1984). По-видикоку, синтез Ргз белка саморегулируем, и определяется его конкуренцией с транскрипционным фактором за перекрывающиеся участки связывания.

Применением метода анализа сдвига полос и Футпринтинга было показано нг.личие в клетке ДЯК-связыващегося фактора, специфичного по отношению к RSA-последовательности. Фракции белков штамма Вас. subtilis,содержащего pOEllB, после хроматографии на DEAE- к гепарин-сефарозе, анализировались на связывание .с 32?-меченным фрагментом рВВ110 (57 п.о., координаты: 343-393), содержавши ЕБл-сайт. Две фракции содержали белок связывающийся с фрагментом (рис.10). Взаимодействие было специфичным и полностью подасляло« 100-кратным избытком немечениого конкурента (рис.10). В опытах по футпринтингу было установлено, что Селок протестирует участок фрагмента длиной 38 п.о. (координаты рШЗИЗ: 355-392), вклвчавций -35 и -10 области промоторов и паяиндронную структуру с кор-последовательностью (рис.10). Эксперименты по ДНК метилированию вия'вили существенные для связывания бенка гуанозины, в том числе легащие в петле кор-последовательности, где происходит кроссинговер. тем не иеиее нам не удалось обнаружить ДНК-никирукдеП активности белка нк в одной из цепей кор-участка. НБл-посладозатольности. Отсутствие никиругзщей активности белка и участче коровых гуаноэннов в связывании белка предполагает, что он является, вероятно, транскрипционным фактором, конкурирующим с Pre белком за

— -Г -SrsS-i 332

1 2 3

-1355

Рис.10. Присутствие н специфичность белг;ового фактора из клеток Вас.subtilic, связывающегося с область» Е£а сайта (°2?-»|еченнй 57 п.о. фрагмент PDB110).

Л. Футпринт-анализ связывания белкового Фактора, к - расцепление ДНКаэой в отсутствие белка (контроль).

Б. Анализ сдвига полос в П£йГ. 1 - контроль (без добавления белков); 2 - 3.мкг фракции 29; 3-3 мкг Фракции 29 + 100 нг немеченой конкурентной ДНК. В. 5*- область гена pre, кодирующего Pre белок. Указаны "-35" и "-10" ,области промотора, участок связывания белка, са*т связывании рибосомы (S.D.) и первый Met белка Pre. Стрелки' - палиндром SS«.. * - гуаноэкмы, существенные для связывания белка.

RSfKop

ACACTTTATGAATATAAAGTATAGTGTCTTATACTTTACTTGGAAGG----AAAflftAflCGATTTACATATG

I * I * » * * I 1 S.D. "bet

-35 -10

связывание с областью кор-участка, перекрывающегося с промотором. Тем самым может обеспечиваться механизм саморегуляции синтеза Pre белка.

Таким образом, сайт-специфическая рекомбинация между плазмидами pUB110 и pElSl происходит в кор-последовательности RSa-сайта и обусловлена действием плазмидного Pre белка, образование которого саморегулируется за счет перекрывания собственного промотора с сайтом рекомбинации.

3.2. Спонтанная кокятгграция пяазмцд: определение и анализ нукжеотидкых последовательностей, участвувг;их в рекомбинации.

Таким образом, наша модельная система для изучения мегплазмидной незаконной рекомбинации состояла кз ts-плазмиды р£194 (или pGG20: pE194+pBR322) и плазчиды "резидента" pBD17 (PÜB110 без Hpall С-фрагмента, вклвчавщего RSA-сайт),' чтобы исключить сайт-специфическую рекомбинацию, вызываемую Рге-белком. Дхя удобства мы будем использовать вместо наименования "pBD17" ее родительское название рОВ110.

Чтобы ' избежать возможного влияния продукта гена гесЕ4 на рекомбинацию между участками случайной короткой гомологии, как это наблюдалось в гесА системе E.coli, (Edlund and Normark, 19B1; King st al., 1982) мы использовали два recE- штамма с двумя парами плазмид: pGG20/pOB110 и pE194/püB110. Тридцать Eras-колоний, выросших ка 52°С, были проверены на наличие больших гибридных плазмид. Большие коиктеграгкые плазмиды были обнаружены, помимо "резидентной" плазмиды рПВ110, в 40% клонов. Остальные клоны содержали только PUB110, что свидетельствовало об интеграции ts-плазмид в хромосоку (см.раздел 2). Таким образом, происходит "спасение" ts-плазмид при непермиссивной температуре путем их интеграции в репликон pUB110, с той же частотой, что и в геном бактерии, 1-3 х 10-®. Был проведен рестрикционный анализ девяти коиитегративных плазмид pGG20::pUB110, а также идентификация и клонирование в вектор pTJC19 Alul-фрагментов, содержащих рекоибикантные стыки ДКК. Эти коинтеграты, названные "серией g", для удобства были обозначены сдедусчим образом: например, коинтеграт pGG20::pOB110-g81, Как просто g61.

Коинтеграты типа рЕ194::pUB110 получали не путем первоначаного выращивания бактериальной колонии в богатой среде в течение ночи при 32°С, как обычно", а выращиванием в минимальной среде Спицайзена в течение 4,5 часов. Ранее мы обнаружили, что такая процедура увеличивает частоту незаконной рекомбинации при интеграции рЕ194 в хромосому Bac.subtilis в 50100 раз. Было важно выяснить, есть ли отличия в спектре интегрантов (конечная локализация ts-плазмиды в геноме "резидентной" плазмиды и участвующие в рекомбинации нуклеотидные

последовательности), обусловленные такого рода стимуляцией незаконной ^рекомбинации. Оказалось, что и при такой процедуре примерно половина из 70 проанализированных Ет* клонов содержит гибриднае плазмиды. 13 независимых коинтегративных плаэмид (обозначенных, как плазмиды "серии -Ь") были подвергнуты рестрикционному анализу. После идентификации фрагментов, содержащих рекомбинантные стыки ДНК, они были клонированы, как ЗаиЗА Фрагмента в полиликкер плазмиды рОС1Э,

Нуклеотидние последовательности обоих рекомбинантных стыков ДНК были определены для 9 коинтегративных плазмид "серии г" н 13 коинтегративных плазу^д "серии 1". На рис.11 суммированы данные по межпяаэмидной рекомбинации.

Ы . Ь2 Ы Ь5

? ? ? - у_

сйголюзоте

Ркс.11. Схема, образования коянтегратов. Ндазивды н рВВ322,

составляющие р<3320,. предс-гдвдсвн, как отдольоте репяиконы. Сайты мехплагмидноя реискбиищни представлены сдздуещнкя санводами: (▼ ) - осяозноЯ ргксгзггаацногтвй ссйт (к81-семейство коивтегратов: 381, е92, 2151, гт, 5282. е292, еЗЯЗ. 1:132. «41, -Ь231, Ъ551, ■Ь641); (Я) - сайты'интеграции в хромосому; (V ) - другие сайты коинтеграцня, Г 1 - дедецж: р0В110 Брс.11 С-фрагмента с НБа сайтом. Ъ1, Ъ2, Ъ4 н Ь5 - сайта интеграция в хромосому.

Для удобства р£194 и рВН322, входящие в состав pGG20, представлены как отдельные репликоны. Показаны также 4 сайта интеграции pGG20 в хромосому Вас.subtilis. Как видно, сайты рекомбинации между р£7В110 и рЕ134 локализованы в основном в пределах орс Я pUB110, тогда как соответствующие сайты на рЕ194 распределены по всему плазмидному геному, за исключением ermC гена, по которому велась селекция. Однако, межплазмидная рекомбинация (gSl-семейство коинтэгрантов) происходила более часто в предпочтительных сайтах геномов рЕ194 и рОВ110 (12 из 22 проанализированных гибридов). Относительная ориентация последовательностей рЕ194 и pUB110 отличается в интегрантах g21, t3U, t531 и t23,, Ъ541, t581, t611, g81, gl81. Это видно из рис.12 на котором представлены нуклеотидные последовательности рекоибинациокных стыков ДНК.

Среди 22 проанализированных плазмид обнаружено 9 типов рекомбинантов. В 8 случаях рекомбинация произошла в коротких участках нуклеотидной гомологии родительских плазмид (9-15 п.о.). Два рекомбинанта (g21 и t382) возникли путем реципрокной рекомбинации - между участками гомологии длиной 15 п.о. Два других (t23 и t611) - с участием 14 п.о. гомологии, тогда как t531, t581 и gl81 - с участием 11, 10 и 9 п.о. гомологии. Короткий участок 10 п.о. гомологии участвовал в образовании рекомбинанта t311. Эта же последовательность перекрывается с участком длиной 9 п.о., но принимавшем участие в рекомбинации с другим сайтом на рШ3110 (gl81). У единственного рекомбинанта между рОВ110 и PBR322 гомология в области кроссинговера составляла 9 п.о. Только один рексмбинант (t541) не имел гомологии мезду рекомбинационными сайтами. Горячие точки рекомбинации мезду РЕ194 и рОВ110 (gei-семейство) имели гомологию размером 11 п.о.

Сравнение спектра возникающих рекомбинантов "серии g" и "серии t" не выявило значительных отличий. В обоих случаях около половины рекомбинантов возникали в результате рекомбинации в горячей точке. Следовательно, стимуляция рекомбинации происходила не за счет увеличения частоты возникновения ^.рекомбинантов типа g81. Более того, ни один из типов рекомбинантов не превалирует при стимуляции рекомбинации. Таким образом,- стимуляция рекомбинации носит общий, а не специфический характер.

Возникновение. мехплазмидных рекомбинантов имеющих, в результате рекомбинации дупликации -нуклеотйдных

последовательностей размером 9-15 п.о., может быть объяснена с помощью механизма "рекомбинации выбора копии" (copy choice). Одно из. следствий этой модели - возрастание эффективности рекомбинации с увеличением размера участка гомологии. Тем не менее, в наших опытах более чем половина рекомбинантов (семейство g81) имеет дупликацию 11 п.о., и только лишь 4 из 22 рекомбинантов имеют более выраженную гомологию размером 14

3296 3265

CIg^ICAAATCA!CJUTffiKmjAICITgCCg pE194

Атст5АД15ИИтг^с1сстс1тсос$ ptrai 1 о 144 175

141 110

ACgCTgmpCAIAATCAAAGgfllgCCggAG pE194

G^GSlajgT^HllgSiAigASAGGGAAlA pUB110 235 —< —26?

1977 1946- -

YljLft.CTTGTTraTGGTCTGCC'rAg'EggKtG'IG pE194

4437 -"WB

1972 ' 1936

гаодитасстст^с^уккн^д рБ1Э4

■ pDBIIO

71

gai

892

g21, ±332

t23, t6l1

£181

t311

3568 ' 3357

gGICgAAgJGC^CT^CCaAAimAOGITg

44 -T3

1282 1251 МСТтаДАДйАСАДтата^ТСАДаАДАДААД

GAAAIGTCAGS^Agll'^G^TSTfecCGGgil 315 ;

985 ' 954

ТтаСАСИДААСАГААААААСААССИтаААС

AGACAGciA^raIinlA^AAA$TTTGGlA 4273 :

230 T99

GCAGCACGCCAgAGTGACTGGCGAIGCEGECG

rallAAAAAClTlGllIBrGCgGOGAGAGAJA 4026 . ~ 3355

342 311

тагССАТС1А!СДСАСП!АСЖгСЧ!И!СААА.СТСТ

CAAAICAMCGACGGAlAAAgAAATlsiAAaC 2671 : :—25?D

"TT3

PE194 рТШПО

PE194 рОВПО

РЕ1Э4 pUBIIO

pBH322 pUBIIO

PE194 pDBHO

S303 VI32 g151 t141 gl 71 t281 g282 t551 • g292 t641

t531

t581

g.101

t541

Рис.12. Еуклеотндиае последовательности кехпхазмидной незаконной рекомбинации. Доказав« родительские гслазмидние последовательности ДВЕ. Указаны координаты первого и последнего основания каждой последовательности согласно Sufccliffe (1978) для рВВ322, Borincachi and Heisblum (1982) для РЕ194., Бажкиров и др. (1986) для рОВ110. Рекомбинантные последовательности ДНК подчеркнуты. * - гомология между двумя посаедова.тежьностнин.

л.o.(t23, teil) или 15 п.о.(g21, t382). С другой стороны это может . свидетельствовать о сиквенс-специфичности рекомбинации в горячей точке, обусловленной действием неизвестной рекомбиназы. Другое следствие обсуждаемой модели - достаточность самого участка гомологии определенной длины для синапсиса с таким же участком ДНК другой молекулы; нуклеотидный контекст Фланкирующих последовательностей не должен играть существенную роль при "рекомбинации выбора копии" межмолекулярного типа. Хотя для внутримолекулярной рекомбинации (образование делеций) существенную стимулирующую роль может играть наличие близлежащих инвертированных повторов, сближающих гомологичные участки и тем самым способствующих их неправильному спариванию.

Для проверки последнего следствия рассматриваемой модели, был проведен эксперимент по изучению роли последовательностей ДНК франкирующих 11 п.о. участок горячей точки мехплазмидной рекомбинации типа g81.' Схема этого эксперимента представлена на рис.13. Прецизионная замена нуклеотидного контекста даже одного из флангов основного рекомбинационного сайта в ялазмиде pUB110 оказала значительный эффект на спектр возникающих рекомбинантов. Среди 8 независимых коинтегративных плазмид, как показало секвенирование рекомбинационных стыков ДНК, не было обнаружено ни одной,возникшей за счет рекомбинации в горячей точке (g81-' типа), вместо ожидавшихся 50Х. Такой эффект специфики последовательностей, фланкирующих основной сайт межплазмидной рекомбинации, не может быть объяснен механизмом "рекомбинации выбора копии", в котором критическим фактором является лишь длина участков гомологии. Он может быть следствием уменьшения величины сайта необходимого для - сиквенс-специфического связывания и/или разрыва ДНК неизвестным белком-рекомбиназой. Важность не только коровых, но и Фланкирующих последовательностей в . эффективности разрезания ДНК гиразой E.cöll была показана Fisher et al. (1986). Таким образом, эти данные дают возможность предположить, что незаконная мехплазмидная рекомбинация в горячей точке происходит за счет X действия сиквенс-специфической рекомбиназы. Такой рекомбиназой может быть топоизомераза X или топоизомераза II типа (например, ДНК- гираза). Т.е. рекомбинация в горячей точке может происходить за счет "ошибок разрыва н воссоединения" ДНК этими или другими энзимами; аналогично тому, как было описано Ikeda et al. (1982, 1984, 1986) для незаконной рекомбинации in vitro между фагом А и плазмидой рВН322, обусловленной действием ДНК гиразы E.coli и Т4 ДНК топоиэомеразы II. Хроме тбго, полное отсутствие гомологии между последовательностями участвующими в образовании рекомбинанта t541 (см.рис.12), как и рекомбинантов Ы и Ь5 (см.рнс.6), также напоминает ситуацию с некоторыми ракомбинантами, возникшими в результате действия ДНК топоизомераз. Однако, в наших экспериментах не было обнаружено

п- .1: \ Н1.

*

ВаиЩ

лислзл

1У

И ¿р Р £ у | ^

■ 1 1 "-змадссаи ,. .АсастслаШпАС...

ЁшпН!

<¡31

К»Р <

9

И

ЭТЕ1 Л»

*

. .сстАавллпэюзлассвочх.глдАМтд.'

X

рекоьбинациа в горячей точка ' не происходит

и

Рис. 13. Схема эксперимента по изучению роли последовательностей ДО!, фланкиртюяхх 11 п.о.-участок горячей точки мехллазмкхноя рекомбинации. & - делегированная последовательность ДВЕ (1-23 куглеогид рОВ110); в - последовательность горячей точки рекомбинации.

рВ194- Ы рЕ194 531 ртго1ю ga1 ровно г541

А А А Л сЪгстоаате Ъ1 С 2 5! 2 рВ124 4541

Рис. 14. Сравкежс рекаиоНЕацаожшж сайтов. Вертикальные егрехкк к раккк - то-так и г^аггиа сроиогк<?ннЕ кроссинговера. Завтрнжован-наг область - гомология метя? послздоватедьностякк.

каскада реакций оСмекг субъодинииами между молекулами ДНК гнраэы при рекомбинации, осуществляемой этой « другими топоиэомераэами II типа (1кева ее а1., 1882; Мс-ггэ с! а!., 1983).

Результата сравнения нуклеотиднах последовательностей рёкомбннациошзгх сайтов, пред ста» яеннме ка рис.14, показывают их существенное совпадение дяг. одного хромосомного интегранта (Ь1) и двух кегштазкидкак коинтегрантов, »81 (. горючая точка рекомбинации, вкл»ч«»щая короткий участок гомологи 11 п.о.) и (без гомологии). Более того, сайта, участвующие в образовании рекомбинантов Ы и -541, гомологичны попарно. Аналогичная закококерност* в литературе на оп:;сама. Сходство манду, нуклеотвдныии послгдоват,зяьносткми кнеющики (горячая точка кеаплазмидной рекомбинации г81) идя цекмеющими (Ъ1 и Ъ541) гомологе» в. местах кроссингогера является дополнительным подтверждением того, что в образовании коинтагрантов я81-типа определяющим является не само наличке гомологии 11 п.о. между гее-сайгами плазикд, а специфичность их нуклеотидных последовательностей. Более того, можно заключить, что короткие трактк гомологии а местах кроссингоьера, часто наблюдаемые при незаконных рекомбинациях в разных системах, по-видимому, пвхяюгея не просто случайными совпадениями нуклеотидкьгх последовательностей обеспечивающими рекомбинацию, а. отражают сходство последогагельностей ДНК, узнаваемых сиквенс-спецяфическима рекомбкназами, в том числе и топоиэомеразаки.

Таким образом, есть основания предполагать, что по крайней мере часть рекомбкнационных событий обусловлена действием нгиззестной рекомбиназы Вас. гиЬЪШз, узнающей «.разрезающей специфические последовательности ДНК в указанных на рис.14 точках. К сожалении, неоднократные попытки идентифицировать

нереципрокных рекомбинантов, обычно возникающих в результате -

специфическое связывание бактериальных белков, используя методы торяожеиия - подвижности короткого фрагмента ДНК, содержащего основной сайт иехлдазмидноЯ рекомбинации, и футпринтинга, не дали однозначного результата.

4. Сиквенс-специфичность ДНК-гиразы Вас.subtilis

В системе in vitro была установлена способность топоизомераз II типа (ДНК гиразы E.coli, Т4 ДНК топоизомеразы, топоизомеразы I тимуса теленка) вызывать гесА-независимую незаконную межмолекулярную рекомбинацию. Отражают ли эти in vitro реакции реальные процессы незаконной рекомбинации происходящие in vivo? Частично да. Marvo et el.(1983) описали серию делеций, происходящих in vivo мезду короткими . участками гомологии похожими на рекомбинационные сайты обнаруженные в системе in vitro и "сходными с последовательностью обобщенного ДНК гиразного сайта разрезания. Нуклеотидные последовательности других делеционных концов не были похожи на ДНК гираэные сайты. Более того, не было обнаружено ни одного рекомбинационного события в сайтах предпочтительного разрезания pBR322 ДНК гиразой (Naito et al., 1984). Учитывая эти факты, для ответа на вопрос об участии ДНК гиразы в образовании рекомбинантов в наших in vivo экспериментальных системах, необходимо было установить сиквенс-специфичность ДНК гиразы Вас.subtilis in vivo. Для решения этой задачи использовались два подхода. Первый: определение точной локализации двуцепочечных разрывов ДНК, вызванных действием гиразы, на нуклеотидной карте двух плазмид -PBR322 и pQBlia. Второй: картирование сильных и слабых гиразных сайтов на обеих плазкидах.

4.1. Определение нуклеотидкых последовательностей сайтов разре зания ДНК гиразой Вас.aubtilis.

ДНК гираэа, связываясь с ДНК, вносит в нее временный двуцепочечный разрыв, образуя ковалентный ДНК~белковый комплекс. При этом запасеяная энергия фосфодиэфнрной связи используется в дальнейшем для воссоединения разрыва (Geliert et al., 1980; Sugino et al., 1977,1978). оксолиноввя кислота - ингибитор гиразы - стабилизирует и продлевает время жизни интермедиата тирада,-ДНК, тэаимо*«*ст«гя с А-субъединицей фермента (Kreuzer and Alberts, 1984). Таким .образом, лизис с помощь» SDS протопластов клеток Вас.subtilis, предварительно обработанных оксолиновой кислотой, приводил к линеаризации содержащейся в них ллаЗхиди »BGA {РВЕ322 и sOBlMR, объедикетше ne Есой!). Дниейная Форма -nia зип а и извлекалась из геля, и после удаления протеиназой К . А-субъединицы энзима с 5" концов ДНК, обрабатывалась Фрагментом . Кленова ДНК полимеразы I для достройки тупых кояцов. Дв..|ее лигяромьимси в сайты плазцидиой линеаризации вводили Xhol

»во да

(9323223 (ровна)

54 /ЯО&АТ 1ТСТС АТСГГТ ВО СГГТАТ! АТТС АТАААС

(6) ТССГТА ¿2ЙГ1ТАС1ЛА (38Т) СААА1А ТАбЩТАГПС

11 ГОСТА! IАТСС етГВАД 35 ТТТТА1|ССАС АСССГГ

(244) СССА1А ТДСЗ1СААСГА (1 ЗВВ) ААААТТ СЕТС)ТСОСАА

вг асасАт (алтс. етсстс я адыс|е«с тахис

(146в) СМЯТА С£АО|САОИД ' (1545) (ЗТДАГО СГГШАСОВТО

I АГОААТ'ОГГС ТТСЗГГ 1Я АСАЛАТ(ССТС АТА4СС

(1535) ЫСГГА £52Па*<ЮСА (1553) ГЗТСТА СЙ5] ТЛГГСЗ

14 <ЯСЯТ|САСС СТОИТ ЗТ,48,76 ОА4Т£С1ОТСС САХСШЗ

(1743) ССОТАА СТЗЛВАСТСА (2838) СТТАТС ССМЮТаПС

50. оазВДТ|СААС 4ВВСАС 43 • ссмсЦадсс САТААА

(2012) 0&СС1А СГиИТОЯТС (2052) СКГГТСТ СВДвТАТТТ

65 сиясст&хтассссвс 5 ОАСССА^ТАЛЛ САССАА

(2202) ОЕСССА с2с]ссхсс3 (2Ш6В) СТСЕОТ АГГ^ОТгГГГ

<5,64 ААС1А1|аС0в,СА1аи; Т1' <ХТАД|САТС СТТСАА

(2263) ТТЗАТА СССС|ОГИГГГС (2280) (КиКПС ОТЙЛСААСТТ

57 ОАЩСЦЭМ СМАЮ 75 ССАТ№{Ы5А ТТААСС

(2232) СТСТСА СПИ]ЕТАТАС (2£3<) ССТАТС СК1)ЛАТТ№

2В.В9 ТЛАТАСЮаТТ ЛТССЛС 3! ССУ.ГТ(СТЛТ АГССПА

(2438) АТТАТП сШПТАССТС (2631) СОТАА САГА|ИСЗСТ

53 АСЕААЛ|ЗААС АЮТЯА 4 ГАТЫС[г4СА САТААТ

(24ТТ) 10СТГТ СЙПТАСАСТ (3318) АТААТС С1СТ10ГАТГА

70 АТЛТАТ(аМТА1АС1Т 55 ТОСТСТ!ТГГ< ТССГГТ

(3274) ТАТАТА СТСА!ТТТСАА (3683) АССДСА АААТ|АЕОААА

27,50 ТТЛС1Т|ДАТС ССССАТ 8.25.2Э СГОЫС1еТ1С'СГМАД

(3689) ААТаТА СТАЕЛиаМТА (3753 ) 0АСАТВ^СЛЛГ|1ААГГС

С8 САПОГ |ТАТС АСТСАТ 72.73 ®ПСКГ[/СТТ СТАААТ

' (3772) СТСЬйА АХ1& |ТО«СТА С 4152) ССАССАТЗАЦОАТГСА

86 АААЮТ(МТС ТСГГТТ

(4237) ТГПМ ТТАЩАСДАЛА

22 АСССЛТ{/ЯСС АСДАСА

(442в) тяая» гссо)1сттвт

/

5"...к» и. н< к^ [к». к. '■: я е н в...з-

3"...В -8 8 К Я Н в. Яа.| В. Яа Н.

Рис. 15. Точки линеаризации 39 пдазчвд серки рВЗ, индуцированные оксодиновой кислотой. В скобках.указано положение ва плазиидных картах рОВ110 (Базвкиров и др., 1986) ,и рЩ322 (БсЛса^ЙЕе, 1978). Точки разреза обозначена линией. На нкхней часта рксунса - диаграмма гиразного сайта. Буква обозначает сккыетряч|ше полояйнкя оснований ДНК.

линкер и проводили трансформацию клеток E.coli. Среди отобранных 150 Tet= ¡} 150 Аир* клонов 50% содержали плазниды с Xhol сайтом. 40 плазмид', которые отличались от pBG3 только наличием Xhol сайта, были взяты для определения нуклеотидннх последовательностей, фланкирующих Xhol линкер.' Оказалось, что у 38 плазиид произошла дупликация 4-х п.о. последовательностей РЁН022 или рШ5110, прилегающих к линкеру. Такая дупликация плазмидных последовательностей указывает на образование in vivo при индукции оксолиновой кислотой разрыва с 5'-выступающими концами длиной в 4 нуклеотида. Такой характер разрезания ДНК свойственен гираэе Е..coli (Morrison and Cozsarelli, 1979). Таким образом, при действии гиразы Bac.subtilis происходит симметричный надрез дуплекса ДНК со смещением в 4 нуклеотида.

Нуклеотидные последовательности и координаты

сехвенированных гиразных сайтов показаны на рис.15. Как видно из рисунка, 38 плазмид представляют 3G разных сайтов: 14 сайтов на PBR322 и 16 на PÜBU0 части плазмиды p2Gs3. Некоторые нуклеотидные последовательности сайтов гиразы встречаются более часто, чем другие. Это может быть связано с относительной "силой" гираэного сайта. Однако такая корреляция мо*ет не отрахать реальную "силу" сайта, а бить следствием процедуры селекции трансфоркантов, влияющей на выживаемость некоторых групп трансформантов.

4.2. Картирование гиразныг сайтов на п^азмиде pBG0.

Для того, чтобы учесть относительную "силу" гиразных сайтов при выведении контекстных правил, определяющих сиквенс-специфичность гиразы, использовался второй подход, позволяющий картировать гиразние сайты in vivo с точностью +10 п.о. на плазмидном геноме. Он основан на том, что после обработхи оксолиновой кислотой и SDS протопластов штамма Bac.aubtilis ГОВ834 (pBG0), переваривание тотальной ДНК рестриктазой приводит к образованию семейства фрагментов ДНК. один конец таких Фрагментов образуется под действием гиразы, а другой - под действием реетриктазы. После электрофореза в ПААГ и электропереноса на'нейлоновую иембраиу эти фрагмента выявляли гибридизацией с соответствующим 3£Р-маченим зондом. Ъ качестве зондоз использовали ксбор 20 -коротких рестрикцаонных фрагментов ДНК размером 3130-680 п. о., перекрывающих куклеоткдку» хкрту плазмиды pBG0. Длина фрагментов, выявляемых после радиоавтографии, соответствовала растояннэ от гнравного сайта до cajJ^A, . еоотцтствующа* рвстрикт«.»«. , Таким оерьзом, было илртировано - 60 и 69 наиболее "сильных" гиразных свйта на плаэмндах рВК322 и рйВИЗ соответственно (см.рнс.16). В среднем один сайт приходился на каждые 70 п.о. После более длительной

Рис.16. Карт» гиразних сайтов аа пдаэмидад рПВ110 и рВВ322. "сильные" сайта ДВЕ гиразы, : - "слабые" сайта ДНК гиразц,

сайта ДШК гиразц с известными кукдеотяднымя ^ последовательностями.

экспозиции появлялись дополнительные полосы гибридизации, соответствующие "слабых" сайтам разрезания гиразы.

4.3. Определение консенсус-последовательности ДНК, разрезаемой гиразой Вас.subtilis.

Сравнивая локализацию основных картированных гиразных сайтов с координатами сайтов на рис.15, была определена относительная "сила" секвенированных сайтов. При этом секвенированный сайт гиразы относили к "сильному", если он совпадал с картированным "сильным" сайтом с точностью +10 п.о. Если такого совпадения координат не. было, сайт рассматривался, как "слабый". Так как картирование гиразных сайтов кз было абсолютно точным, не исключено, что какой-то из "слабых" секвенированных сайтов, расположенный рядом с картированным "сильным", мог быть ошибочно отнесен к категории "сильных". Однако, обратные ошибки, когда "слабый" сайт мог быть отнесен к "сильным" исключались. Для выявления правил,- определяющих сайт-специфичность гиразы Вас.subtilis, был проведен сравнительный анализ 30 гиразных сайтов представленных на рис.15. Поиск правил двойной симметрии, в пределах участка в 40 п.о:, включающего разрезаемую гиразой последовательность ДНК, выявил: 1) предпочтение А в положениях а и d (см.рис.16); 2) G в положении Ъ; 3) Т (вторично G) в положении с и 4) G (вторично Т) в положении f. эти особенности наиболее выражены у "сильны::" • сайтов.

На рис. 17 представлены результаты ориентации цепей ДИК. 19 относительно "сильных" сайтов были соориентированы так, чтобы наиболее предпочтительный G (положение Ь) попал с 3' стороны разреза в положение -2. Это правило выполнялось однозначно только для 7 сайтов: 80, 75, 38, 4, 54, 20 и 68. В результате такой процедуры стало очевидным предпочтение нуклеотида Т (реже G) в положении-3, и А в положении -4. Поэтому оставшиеся сайты, имеющие G в положении Ъ на обеих цепях (61, 1, 57, 53, 27, 35, 14, 43, 8, 58), были соориентированы согласно этим правилам. Оставшиеся 2 "сильных" сайта 37 и 10, а также все "слабые" сайты были соориентированы аналогичным образом.

Основываясь ка этом анализе была выведена консенсус-последовательность, разрезаемая ДНК гиразой. Вас.subtilis in vivo. Некоторые из предложенных правил похожи на правила, установленные Lockshon и Morris (1985) для гиразы E.coli, что указывает на наличие наиболее существенных для гираз из грам-пояохигельнах и грам-отрицатглькых бактерий ДНК-детерминант. Различия в консенсус-последовательностях двух гираз могут быть обусловлены не просто присущими им различиями в предпочтении того или иного детерминанта для контакта Фермент-ДНК, а таким фактором, как модуляция реакции разрезания физиологическими

-8 -7 -8 -5 -4 -3 -2 -1 +1 +2 +3 -Й +5 +6 +7 +8

в Я А "Т а А Г С А Т N С

(Т) (в) (С) (А)

Сайт ' Кесто Сила

гиразы» разреза сайта

РО3110 J

80 387(1) 2 С Т Т т А т в А А Т А Т А А А е

35 1306(1) Б А А а в в т 6 Т 6 С Т т А А А А

9 1545(1) V й Т в с С А с т Т С в т А А Т с

10 1559(1) Б (3 г т т А т с А С с А т С Т г т

37,48,76 2338(1) Б с т а А Т и о в с с с т А Т т с

43 2062(1) Б т т т А Т в б С т с Т с Т т а а

5 2068(1) И. т Г в а т в 7 т т А т <з б с т с

71 2280(1) И т т Е А А с С А т а с т 7 А в с

75- 2504(1» г с с А Т А (3 Б А б А т т А А с с

38 2631(13) Б с с б А Т т в Т А Т А т С С в А

4 3318 (О 3 т А Т Т А а в А С А С А т А А Т

55 3683(1» к т С С Т Й т Т Т т А т С с Т Т т

8.25,29 3753(1) г с т т А А в В А А С в т А С А в

72,73 4152(0) » в с Г в в т А С т т с т А А А т

66 4237(1) «г А А А А а А в А т т б А Т Т Т т

22 4420(1) я 1 С т Т а т (5 С с т А т в С б т

рВВ322

54 6(1) 5 А А А С А т в А б А А т т а С т.

11 244(1) Ъ А Т С А А с в С А т А Г А а С б

61 1460(0) Б В с в С А т' в А т с 5 т а с т с

1 1598(0) Б . А . т Б А А т в г т с Т т с Б б т

14 1743(1) Б А с Т С А б в с т с А А т б с с

58 2012(0) Б г с Б С А Т Б А А с А Я а С А с

65 2202(0) К е с С в б т в т С а а а а С б с

45,64 2263(0) V А А . С т А т б с (Г я с А т с А с

57 2292(0) б <3 А г А С т В с А с ,с А т А Т б

20,69 2438(0) б Г А А Т А с. в т т А Т с С А с

53 2477(1) б т С А С А т в т т с т т т с С - т

70 3274(0) V . А т А т А т в А * в т А А А с Т т

27,50 3689(0) б Т т А с А -Т Га А т с "С С с с А т

68 3772(1) Б А г а А в т в А т А А с А с т а

я» 23 10 40 17 27 27 90 13 17 10 17 10 17 10 23 33

ХА 30 23 23 33 57 7 3 43 20 20 37 20 33 27 30 7

хт 30 40 27 30 13 59 7 23 47 27 23 57 30 17 30 37

хс 17 27 10 20 3 7 0 20 17 43 23 13 20 47 17 23

Рис.17. Консенсус-последовательность сайта разрезания ДНК гяразы Вас. заЬ-ЫИг. Представлены нукхеоткднве последовательности 30 1п гираз-

них сайтов. Все цепи ДШС дави в 5*- 3* направлении. Представлены либо пря мая (С), либо обратная (I) нити ДВЕ пхазкнд. 8 - относительно .сильные сай ты, Я - слабые. Полохегаге "разреза, вносимого ДОК гяразов в представженнув на рисунке цепь, указано сохоаяой вертикальной линией, а. в комплементарну цепь - вертикальной пунктирной жинией. В обозначает пурин, Т -пиримидин, N - л»бое основание. Основания в скобках нкевт вторичное предпочтение. «■ - обозначает номер плазмяхи серии рШ.

условиями клетки. В целом консенсус-последоаатзльность гирази Вас.subtilis более симметрична, чей гиразы E.coli¿ котя процентный нуклеотидный состав в кагдом симметричном положении проявляет некоторую ассиметриш. Значительная ассимметрия видна з -3 и +3 положениях.

Сопоставление координат секвенированных гиразкых сайтов с координатами сайтов межмолекулярной рекомбинации (см.разделы 2.3 и 3.2) показывает точное совпадение лишь одного рекомбинационного сайта (gl81) из девяти, идентифицированных на PÜB110, с гиразным сайтом в полояении 4420 на этой плазмиде. Два других рекомбкнационных сайта (gl01 на рЕЕ322 к основной сайт мехплазмидной рекомбинации g81) точно коррелируют с гираэнами сайтами в позициях 220 и 35 на соответствующих плазмкдных картах (рис.17). Заслуживает внимания и совпадение двух "слабых" сайтов гиразы Вас.subtilis на рВК322 (координаты 244 и 22БЗ, рис.15) с сайтами незаконной рекомбинации у E.coli in vitro в положены: 240 (Naito et al., 1984) и in vivo в пояогении 22S3 (King et al., 1982). Поиск корреляции между сайтами гиразы и незаконной рекомбинации с помощью метода статистических весов, ггрогеденный совместно с Рогозиным И.Б. и Кель А.Э. (ИЦиГ со РАК, Новосибирск) не выявил достоверной связи мехдуч ними. Таким образом, на оснований вышесказанного мохно заключить, что лишь небольшая часть событий мехмолекуляриой незаконной рекомбинации в Вас.subtilis могет быть обусловлена действием ДНК гиразы.

5. Спонтанная эксцизия интегрированных в хрокосому плазггпд.

Плазкида рЕ194 способна как к автономной репликации в клетке, так и к интеграции в различные участки хромосомы кли в геком неродственной ей плазмиды (Раздели 2 и 3). Интеграция РЕ194 является обратимым процессом: ауксогрофные инсерционкые мутанты могут ревертировать с частотой 10~е - 10-в (Hofemeicter et al., 1983; . данная работа). Такая реверсия приводит к возникновению прототрофних клеток с (1) транслокацией копии РЕ194 в новый хромосомный сайт, (2) точно вьщепнввейся автономной рЕ194, или (3) автономными эксцизиоияыми плаамидами, содержащими вставку хромосомной ДШС. Такие ргаьрски лелеются гесЕ-независимыми, следовательно происходят . по моканизку незаконной рекомбинации. Для того, чтобы цонать кекаиизи а специфичность такой внутримолекулярной рекомбинации, совместно с лабораторией Ю.Хофекайстера (институт генетики и исследования растений, Гатерслебен, ФРГ) было проведено изучение спонтанной неточной эксцизии плазмиды PE1S4. '

5.1. Структура эксциэионких лхаэмнд.

Исследовалась эксцизая плазмиды РЕ194 из 6 интеграционных штаммов: а::рЕ194, d: :рЕ194, f::pE194, g::pE194, lys::t>E194,

риг::рЕ194. Во всех шести штаммах интеграция произошла в разные участки хромосомы Вас. зиЪЪШа, используя разные Гп-Ь-сайты плазмиды рЕ194 (см.рис.18).

А

зм-зчет

Рис.18. ЬгЬ-сайты рЕ194, участвующие в интеграции в гроносому в штаммах РЕ194::а, рЕ194: :(1, рЕ194: --В, рК19-1: рЕ194:: 1у5, рЕ194::риг. Указаны координаты ЬгЬ-сайтов (черные сектора).

Для выделения автономных- эксцизионных плазмид, частично очищенные лизаты клеток инсерционних итаммов подвергали СзС1-EtBr центрифугированию. Нигде, кроме штамма е::рЕ194, не было обнаружено полосы плазмидной ДНК. Однако, после Фракционирования градиента и трансформации штамма гесЕ4 было пожучено в среднем 'по 10 колоний, Еаг трансформантов. Траксформанти содержали как плазмиды с молекулярным весом идентичным рЕ194, так и более тяжелые. Таким образом, были получены эксцизионные плазмиды рЁ'а1, рЕ'а2, рЕ'аЗ, рЕ'сИ, рЖ'й2, рЕ'гЗ, рЕ'риг, рЕ"1уа,

вероятно, возникшие в результате неточной эксцизии рЕ194 из хромосом соответствующих интегративных штаммой." 1 Рестрикционяый анализ показал, что 9- эксцизионных плазмид

несли вставки Д8К от 1 до 6 т.п.о. Различалось три типа плазмид. Плазмиды I типа (рЕ'риг, рЕ*(31, рЕ'аЗ, рЕ^ и рЕ'г), как и II типа (рЕ*а1, рЕ'а2 и рЕ'1уб), содержали частично гомологичные вставки ДНК в районе рЕ194 с координатами 764-1090. Саузерн гибридизация показала, что при этом плазмиды I типа сохранили все последовательности рЕ194 (плазмиды "аддитивного" типа),

тогда как плазмиды II типа содержали делении РЕ194 ДНК различной величины со стороны левого стыка рЕ194 и хромосомной ДНК (плазмиды "с замещением" части плазмидной ДНК на хромосомную). Плазмида III типа (pE'd2) содержала вставку ДНК в области рЕ194 между координатами 1942 и 2141.

5.2. хромосомы.

Вуклеотидные последовательности стыков рЕ194

Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов содержащих стыки плазмидной и хромосомной ДНК из различных эксцизионных плазмид I типа показало,' что правый и левый стыки содержат прямой повтор последовательности 13 п.о. 5"-GGGGAGAAAACAT-3', гомологичной участку рЕ194 между координатами 864 и 876 (рис.19). Было установлено, что плазмида pE*d2 (III тип) имеет в обоих стыках повторяющийся тетрануклеотид 5'-ТССС-3", соответствующий последовательности рЕ194 с координатами 1995-1998 (там же). Секвенирование ДНК выявило, что последовательности нуклеотидов рЕ194 сохранены полностью в прилегающих к стыку участках плазмиды, что подтверждает "аддитивный" характер плазмид I и III типа. Более того.

(А) Плазмиды TTTTTGGGGTTATTTA

I типа и

II типа»> aaggaectgaaatccc

TTTTTGGGGTTATTTA

GGGGAGAAAACAT

GGGGAGAAAACAT

GGGGAGAAAACAT

AGGGGGGTACTACGAC j>E194 AGGGGGGTACTACGAC J1 -tacfftactacgcagtg' J2

Плазмида III типа (pK*d2).

GCAGTTTATGCA GCAGTTTATGCA tsttacactccc

TCCC

TCCC ****

TCCC

TTAACTTACTT pE194 eagggct-ttet J1 TTAACTTACTT J2

(Б)

-1.2—+-0.7S-H

в S* E SkBXPSePv X SB

|j | II W

4 * »5 • •• . _ i* t « • •2 ) -i* »C S B

В Sm >- ......... t-^ •В PA X S В l_- Г. l ,-2-1-1-1-1

S В

рк'аз pt'al ft'mZ tX'*3

Рис.19. (fi) Нуклеотдние последовательности спив плазмндяоД и хромосомной дшс в тедшоим пдаанадал. Пост и «и последвмтсльности в

рекомбниантшх стыках ДКК (J1 к J2) к в I»-t-сайте рК194. Хужосаииче и плаэмндные последовательности представлены строчшжи и прошсвдмя буквами. * - гомодсг-ия в участке рекомбинации (в рамке). »J плазмиды II ткпа имеют только J1.

(Б) Частичная рестряхцхонная карта четырех эксцизионных плазмид I и II типа, представлении* в линейном виде. ДЕХ PE1S4 представлена . светлым прямоугольником. А - AccI, В - Bell, Е - EcoHI, F - Pstl, Pv - PvuII_S .- Sacl, Sa - Saal, Sp - SphI, X - Xbal.

и

секвениревание общих для плазмид I и II типа Smal-EcoRI (265 п. о.) фрагментов хромосомной вставки, непосредственно прилегающих к правому стыку ДНК плазмидв и хромосомы, показало идентичность их последовательностей. Эти данные доказывают, что перед тем как выщепиться плазмида рЕ194 была встроена в хромосому за счет реципрокной рекомбинации по короткому участку гомологии длиной 13 п.о. (плазмиды I и II типа) или 4 п.о. (плазмида d2).

5.3. Неточная эксцизия пдаэмиды рЕ194 часто происходят после ее транслокацик из первичных интеграционных сайтов в один и тот асе вторичный сайт.

Таким образом, 8 из 9 эксцизиоккых пхазкид, выделенных из 6 различных интеграционных штаммов, содержат по крайней мере один идентичный стык ДНК плазмида-хромосома, что находится в противоречии с различным местоположением Int-сайтов на рЕ194 в исходных интегрантах. Частичная схожесть вставок ДНК в разных плазмидах I и II типа поднимает вопрос о происхождении этих вставок из уникального участка хромосомы, либо из множественных, но идентичных по последовательности ДНК участков. Саузерн гибридизация показала, что одинаковый для 8 плазмид 32Р-меченый Фрагмент Smal-EcoRI гибридизуется лишь с одним хромосомным EcoRI фрагментом около 8 т.п.о., что свидетельствует в пользу первого предположения. Более того, гибридизация Smal-EcoRI пробы с EcoRI переварами хромосомной ДНК исходных рЕ194-интегрантов показала (рис.20), что только э интегранте g::рЕ194 плазмида встроилась

_ EcoRl Hindi

ВР2Й d apurfyj ВИ f f d a pur^T.^

ж я» «а» т ' ф -4,4

ж ' }

i -2,о

Рис.20. Саузерн гибридизация перевара хромосомной ДНК различных интеграционных итакиов и контрольного гатамиа ВВ224. После двунаправленного блоттинга фильтры гибридизовали либо (Д) с 32Р-мече-ным 265 п.о. Бяа1-ЕсоН1 фрагментон, или (Б) с згр_Иеченой ДНК ре1э4. Бва.Т.-ЕсоЕ1 фрагмент был субклонирован из рЕ'еЗ в рОС19. Стрелка - уроиосс.'?!шй Фрзгионт 7,0 т.п. о.

непосредственно в 8 т.п.о. ЕсоЩ фрагмент хромосомы, из которого и происходит, по крайней мере, часть вставок ДНК восьми эксцизионных плазмид. Представленные данные показывают, что в популяции клеток интгграитов происходит транслокация рЕ194 из первичного интеграционного сайта во вторичный сайт, являющийся местом исходной интеграции плазкиды у мутантного штамма е::рК194. Этот вторичный хромосомный сайт ("Е-область") является, вероятно, предпочтительным сайтом для транслокации и/или неточной эксцизии,' приводящей к возникновению эксцизионных плазмид I и II типа, несущих участки ДНК "е-области."

5.4. Нуклеотидные последовательности, участвующие в процессе эксцизионной рекомбинации.

Для того, чтобы определить структуру "я-обгасти" и нукдеотидные последовательности эксцизионных сайтоз на пяазмидной. и хромосомной ДНК, более подробно была изучена структура двух плазмид {рЕ'еЗ и рЕ'аЗ) "аддитивного" типа и двух (рЕ'а.1 и рЕ'а2) "с замещением" части плазмидной ДНК на хромосомную. Две первые плазмиды несли вставки хромосомной ДНК размером 2.2 и 1.6 т.п.о. Две другие, с делецйями части рЕ194, -5.3 и 2.0 т.п.о. соответственно. Били определены нуклеотидние последовательности вставок хромосомной ДНК четырех эксцизионных плазмид и делеционных стыков ДНК "рЕ194/хромосома" плазмид рЕ*а1 и рЕ"а2. Эти данные позволили реконструировать нуклеотидну» последовательность "Ё-области", которая представлена на рис.21 (приложение).Правильность реконструкции "^-области" была прове-ена серией экспериментов по блоттинг-гибридизации хромосомной ДНК исходного бесплагмвдного Нес- штамма, расщепленной рядом рестриктаз, с 32Р-мечеными фрагментами хромосомного происхождения, выделенным» из эксцизионных плазмид. При этом использовали в качестве зондов 4 фрагмента представляющих различные части "в-области": зонд- I - нуклеотиды 108-346, зонд 2 - 347-608 (5ща1/ЕсоЕ1 фрагмент), зонд 3 - 2907-3907 (Вс11/Бас1 фрагмент) и зонд 4 - -5243-5694. Было установлено полное соответствие между .длиной гибриднзующихся фрагментов ДНК и данными секвенирования. Частичная рестрикционная карта "е-области" хромосомы представлена на рис.22. Здесь же указаны сайты эксцизии рЕ194.

Секвенирование показало, что вставки хромосомной ДНК эксцизизионных плазмид. имеют следующие координаты (п.о.): 1792429 (рЕ'йЗ), 1-1614 (рЕ'аЗ), . 334-2418 (рЕ'а2) и 334-5694 (рЕ*а1). В "я-оБласти" обнаруживаются 11 потенциальных рамок считывания с довольно сильными сайтами связывания рибосом, способных кодировать полипептиды с молекулярными массами 4, 32, 7, 32, >17, 23, 9, 11, 13, 3, 12 И) (рис. 21). Не было обнаружено какой-либо существенной гомологии между 11 потенциальными полипептидами и пептидными базами данных. Оба

;egiisTiced part

Ркс.22. Карта хромосомной "в-области". Цифрами обозначены длины рестрикционках фрагментов (т.п.о.). Светлыми пронумерованными прямоугольниками обозначены участки ДНК, соответствующие гибри-дизационннк зондам. Черный прямоугольник - рЕ194. Указано место интеграции р3194. Точки неточной эксцизни на плазкидной и хромо-соияой ДНЕ обозначены символами: (4 ) - эксцизионная плазмида РЕ'еЗ; (□ ) - pK'al; (v) - рЕ'а2; (V) - рК'аЗ. pre, егш и rep обозначает гены бггха пхазмидиой рекомбинации, эритроиицинрезис-тентности и репликационного белка соответственно. Е - KcoEI Я - Hiadlll, Р -■ PstJ.. . '

pE'g3

pE'al

рЕ'а2

рЕ'аЗ

159

B.subtilis сайт 1 AGTCGCGATATCCTTACAGG 2410

B.subtilis сайт 2 ' GCTGCCGTCAGCGTGTCCAT

;__198

CTTTCAAAAAAGCGCAGAGC 2449

GGCTCTAACAATTGTTGTCG стых GCTGCCGTCAGCGTSTCCAT CTTTCAAAAAAGCGCâGâGC

B.subtilis сайт nE194 стык

B.subtilis сайт " " "¿2194 стык

5575 • 5694

AGGCGATTCâGTTTTTCCTT 3156

GAGACATGCTACACCTCCGG

3117

ATAATAAATATATATAAACG

AGGCGATTCAGTTTTTCCTT ATAATAAATATATATAAACG

2339

CTTTTATATATGCTBCCGTC

- 3505- , , _____

TTTTCCTTACCGTATTCATT

2438

AGCGTGTCCATGGC7CTAAC ... 3466

TTCTAGAAACTCCAAGCTAT

СТГГГАТАТДТестеСШТС TTCTAGAAACTCCAAGCTAT

B.subtilis сайт 1 ___.•.......

1595

В.subtilia сайт 2 TTGCACATTTTAATACCGAT

1 20 TTACCGTCAAAGTCCTTACA 1634

ATTCATTACCCAAGCGG3GC

стык TTGCACATTTTAATACCGAT TTACCGTCAAAGTCCTTACA

Рис.23. Еуклеотидные последовательности эксцизионных сайтов.

сайта эксцизии плазмид pE'g3 и рЕ'аЗ находятся в пределах орс 5 и орс 2 (ск.рис.21). Один из сайтов экснизим рЕ"а2, плазмиды XI типа, расположен в орс 2,а другой на плазмиде рЕ194 (координаты 3485-3486). Вторая ллазмида II типа - pE'al - образовалась за счет рекомбинации между хромосомным сайтом (см.рис.21, З'-конец последовательности) и рЕ194 (нуклеотиды 3136-3137). Таким образом, плазмиды II типа, pE'al и рЕ'аЗ имеют делеции последовательностей ДНК рЕ194 мехду нуклеотидаки 3137-3728/1-876 и 3486-3728/1-876 соответственно. Сайт интеграции рЕ184 в "g. область", расположенный в орс 5, обозначен последовательность» из 13 п.о. в рамке (нуклеотиды 334-346), соответствующей участку рЕ194 с координатами 864-876. Этот Int сайт, находящийся в участке ori-репликацик рЕ194, участвовал в интеграции в хромосому еще в трех независимых случаях (Dempsey and Dubnau, 193S), что свидетельствует о возмогной связи репликации плазмиды рЕ194 с процессами интеграции и транслокации. Нуклеотидные последовательности родительских ДНК, участвующие в эксцизионной рекомбинации и рекомбинантные стыки ДНК представлены на рис.23. Видно, что нуклеотидные последовательности родительских рекомбинационных сайтов негомологичны.

5.5. Консенсус-последовательность незаконной рекомбинации, независимой от коротких трактов гомологии ДНК.

Незаконная рекомбинация рЕ194 при ее интеграции в бактериальную хромосому или негомологичную плазмиду происходит либо между участками, имеющими короткие нуклеотидные гомологии (2-15 п.о.), либо не имеющими гомологии вовсе (см. разделы 2 и 3). На .основании сходства последовательностей ДНК ряда сайтов было постулировано участие в незаконной рекомбинации обоих типов неидентифицированного рекомбинационного фактора (раздел 3). Основываясь на общей сходстве процессов интеграции рЕ194 в геном к ее эксцизии (частота обоих процессов составляет в среднем 10-они recE-независимы и могут происходить между полностью негомологичными последовательностями ДНК) был проведен анализ нуклеотидного контекста рекомбинационных сайтов с целью выявления возможной консенсус последовательностй-мишени для гипотетической рекомбиназы. Для этого проводили выравнивание нуклеотидных последовательностей сайтов "независимой от коротких участков гомологии" рекомбинации относительно' положения рекомбинационного разрыва ДНК. Данные приведены в Таблице 1а. Консенсус-последовательность получена в результате подсчета процентного содержания каждого из четырех нуклеотидов. Предпочтительным считался нуклеотид имеющий более, чем 50X содержание в данной позиции или два куклеотида с обдам % содержанием более 70%. Наиболее важными особенностями этой консенсус-последовательности является предпочтение С в -4

Таслмца la. Коксгясгс-поелгдоватехьзость прк рекокбннацмн рЕ194

Pesen:- ДШС 'Хоордкыата Нтадеотлдяая пссхедовагёдьпость j Неточные '

бета»? ' -. _ , - - -

рЗ'вЗ SP ем. 171-156 г» Т Т А с A G GiC T T T с AAA Дгшвая

ss-сз грс». 2422-2437 G T G Т С С A T 40 G С T с ï A A работа

SPCи. 2411-2428 С T G С С G Т С V A G С G T G T С -//-

р!Га2 P¡as4 3403-3478 Т Д Т Ï с A T TI T T С T A G A A

pS'al хрея. SS3S-5S04 т т т т с С TT».. . . _ . . .

pS'al pSlS-1 3130-3145 Â с с т с С G G ♦ A T A A T AAA

рЗ'аЗ. хрж. 1-8 . . . . »TT A С С G Г С

р2*аЗ хрок. 1В07-1822 А ТА с с G A T» A T T С A TÍA -//-

Ы хром. ■ ■ - - - — Т С Т т с A С TV A С T T A AAA Beahklrav

Ь1 рЕ1Э4 1849-1384' С T"G А с С G Ai T А G A T T T T -. et al.

Ь5 • зровз. - т А Т т с A T A A T A T Д T T T (1987)

Ь5 pIUS-4 1723-1738 G А А т с G T A G A A T T T A A -//-

С хрем. - . . . . . _ (G С G G T A TA ' Denpsey

SÖSCM г; p21S4 813-833 А A G А с С TT» TT T G A G G T •■ and

гтамя С - - - Т " А т с С G G m. . i- .... - Boboau

Eis«» С 934—919 G T G т с С A T ÍT1G T С с ATT (1989)

Brasa D гром. - С G G А с с GE A A A T T С G G -//-

trtcrDj 3> SE194 923-933 С А А А с А А {А TA A A T AAA -//- •

tS41 PÜ3110 2383-2843 т С G А с С G А A A T AAA Basbkirov

tô-li pSISi 334-319 т А Т Т с ACT рус T T с T T T et al.'

азг ' ICT110 31-18 А T T T T T.T (1988)

c81 - pS194 3375-3360 CTOACCSA A T T T T A С G -//-

Консенсус HTGTCCHTÍ7TTTTTTT

пос^едовагегьносп.: - Д(Т)А (А) ДА A AAA

Таблица 15. Консенсус при форЕШроваяии делацкй 7 B.snbtllis

pGSlB

pGG10

Вв72

«672 ••

pLS782

pLS702

yCSTSe

рШШ

pI£T21

■um

pLSTM PUTT«

pCF5-108

РШГ5-28 PGP5-10S

rcrs-sr

FGF5-34

|6И-Й ssk-Ш

pC134 pSlSi

ровхш poaiie

K&UC -■fllM M.1X . mJM

iraix.

ИОН ■»IX

lacZ P

P—P.

panP

P*P

lxcZ

panP

IscZ..

P«"P

lacZ

lacZ

p«aP

- 478-493 3701-3713 ' 1829-1844 2958-2S73

525-513 3173-31S8 • 78€-eei 1749-1784 345-380 3296-3314

348-333 31М-Э174 irs-iea 4атт-«кз 120-105 4547-4532 4X16—4103

122-1ЯТ 4085-3991

- 312-297 -204Ф-2034

672-887 38Ы-М42 З«та-З4вв 87-52

Т С А Т

■ а т т а

G T А Т т Т А А С С TT А А Т Г с с.а т GG а Т ATAS .T T t А с т а г т с т а g с с т С А А т CACA TT т с Т Т а С TAC а С А А T ITH ■С в С T

с с т с

С G T Т A G T Т T А А А

С А С TV С А С AG А» А С CCACtCT С T G T VT_A С CT А

С G G С _

CGC® CA С А ТЩ T в С A G СИ G С С T TtG С С А Ï С t G А С С A AVA Т С A T T t А А CC6CUC С с АШ а т С Т ТЩ С G С С G ОН С С А С С «А А С С G G V T А С С

С А

ТС]

ES

А А

С G

СбТШб С G АС* С С С А АПО С А С С G S * T T

T T A G AG G A A A T G T G A T -A.A ATT G T CT T T T С T С G G T T T AAA С G G ATA С G A' T G С ATA G G T АТС CCA A A T AGG ACT T T A

CAT A A С T С A T G A CTG" ATT T С-A AAA TAC T С T A С С CAT AGG A T . G A С A AT T . . TAG T T . T С T С AT ATT С G . GTT CAA

собственные

-//Lopez .et al. . (1984) • -//-- -

-//-Feijnenbarg ert &1.(1988) -//-

-//- -

Таблица 16. (про&олхскке) -

pGPS-ЛЗ penF 349-334 A Ï т A С A & T m G T A A G T A

psnP 5399-5385 T т т T С С С G I А А Т С T С ,

PGP5-84 penP 14-29 т с т С С A А. В A A G Т T T A A -II-

penP 4325-4340 G с А A С T G AI Т G G A A A С C

pG?5-S0 penF 629-614 С т т T С С А С f T А Т С С с T A

lacZ 3695-3680 G G с A С С А Y 4G С С G T G G G

PGP5-8 penF 5320-5305 А С А A С А G A ♦ С G T G С A С A

PGP5-33 pen? 248-233 А А т A С С А A Т G A G G T A A

penF 516-501 А Т т A С А Т A т ö T A A G A T

pGPS-66 lacZ 2662-2651 Т С с A С С А С4Л T A С . . . -II-

PGP5-73 penF 516-501 А т т A С А Y А T G T A A G A T -II-

3acZ 3372-3958 Т т т T С С С С т G A T С С T .

pGFS-102 penF 622-607 С т А T С С С А С A G T С T T

penP 5372-5360 . . A С А G CtïtCA T te G

SGP5-12 penP 274-259 À А G T С А ТГС T С G A л G С A -II-

penP 5174-5134 С С G G С С ele т Y G . . . . . -H-

FGP5-61 penP 461-446 G т T T С С л с G. С G G Л с A

lacZ 3S93-3S79 Т т T T С С G С S3 T G А T A Л .

PGP5-79 penP 187-172 А А A с С А Y etc T G С G с с Y -II-

lacZ 4ИЗ-41ЯЗ С С С G С Т С YÍG С T . . . . . -//-

PGP4-26 pan? 4369-4354 Г с T 'T С с G с te T G С Л а с A Peljneaburg

pGP4-19 penP 465-451 А с с T с s T т С С A С CG G et ul.(lSCS)

lacZ 2695-2600 G а с A с с A Я G С C-G Y G G G -II-

PGP4-13 penP 494-478 G с A A с с G т »т т T Y Y С G G -II-

PGP4-11 pon? •367-352 С А A A с с T 9 Y A A T G A G A -II-

lacZ 3104-3089 С Т G A CG A M А С G С С т a C

PGF4-44 penP 232-247 А т 7 A с с T с А Т T G G T A T -II-

laaZ 3446-3461 С G С T с с A с А AGG T A A A

PGP4-46 penF 43S7-43&2 G А A A с с G Y » с G A T A T T С -II-

pGP7—14 penP 548-533 А С A T С А A A t T С T ТА С A A -II-

реяр 4408—439S А т С С с с A Т * А Y G G A .

PGP7-13 lacZ 3405-3391 С с A G С GIC С Ale CAT С С

pGPT-ЗЙ penF 5472-5458 Т G T A С С G А 1 А Г G T G С A -II-

EoacescTC НИТГССЕНШКИИНЯК

последовательность: A А -(А)

Вгрткаалыше стрелки к раг:г;: обозначав? тсчзск и участки кросскнговерл. Вуклестнхы в скобках имгзт вторкчное предпочтение.

положении, а такте С(А) в -3 и Т или- А в -5 положении. Более того, последовательности, лежащие с 3' стороны разреза, обогащены А и Т.

Попытки определить консенсус-последозательность незаконной рекомбинации в Йас.subtilis предпринимались Dempsey and Dubnau

(1983) для интеграции рЕ194 в хромосому, а также Lopez et al.

(1984) и Peijnenburg et al. (1988, 1939) для спойтанкнх делеций при структурной плазквдкой нестабильности. Однако, в обоих случаях сравнивались вместе последовательности ДНК ' сайтов рекомбинации двух основных типов, как с участием коротких участков гомологии, так и без гонологии, что-делало невозможным точно локализовать точку кроссинговера. В результате, предложенные авторами обобщенные • последовательности сайтов рекомбинации слабо выражены и мало соответствуют реальным -сайтам. Однако если рассмотреть только лишь делеционные сайты не имеющие совпадений—более, чем в 3 куклеотида, то можно обнаружить, что получающаяся консенсус-последовательность "не зависящего от гомологии" процесса образования делеций - Т/А-Т/А-C-C(A)-K-N - 4> - N - очень сходна с консенсус-последовательностью

незаконной рекомбинации- с участием рЕ194 (см. Таблицу 16). Обе имеют сильное предпочтение С в -4 позиции, а также Т/А в -5 и С(А) в -3 позициях. Такое сильное предпочтение того или иного нуклеотида в определенных положениях вблизи точки рекомбинационного разрыва при интеграции-эксцизии рЕ194 и при образовании делеций в Вас. subtilis указывает на- неслучайное распределение точек рекомбинации. С другой стороны, сходная "вырожденность" нуклеотидных последовательностей сайтов разрезания и их неслучайное распределение на ДНК являются характерными для бактериальных и эукариотических ДНК топоиэомераз. Известно, что топоизомеразы II типа способны осуществлять незаконную рекомбинацию in vitro (Ikeda 1982, 198S; Bae et al. , 1988). Более того, Shuman "(1989) показал, что ДНК топоизомераза I вируса осповакцины стимулирует int-неэависимую эксцизию профага DE3 in vivo в клетках E.coli. При этом точки эксцизионной рекомбинации имели неслучайное распределение и могли находиться на хромосомных и на фаговых последовательностях ДНК, как и в случае неточного выщепленик рЕ194 (плазмиды II типа)(см.рис.22). Точки, эксцизчи интегрированных вирусных последовательностей в клетках млекопитающих так же свидетельствуют об участии топоизомеразы I в незаконной рекомбинации (Bullock et al., 1984).

Нуклеотидные последовательности сайтов интеграции-эксцизии PE194 (Таблица 1а) не обнаруживают сходства с сайтами разрезания ДНК гиразы Вас.subtilis (см.раздел 4). С другой стороны, полученная консенсус-последовательность для интегративиой-зксцизионной рекомбинации (см.Таблица 1а), как и для образования делеций (см. Таблица 16), очень похожа на обобщенную последовательность разрезания одноцэпочечной ДНК клеточными топоизомеразами I типа из E.coli и грам-положительного микроорганизма М. luteus in vitro - 5*-C-N-N-H -{.N-3' - (Tse et al., 1980; Dean et al., 1982). Цитидин в -4 положении, обнаружен у 90% последовательностей разрезаемых этими топоизомеразами, как и в случае незаконной рекомбинации, исследуемой в настоящей работе. Более того, в сайтах действия бактериальной топоизомеразы I часто обнаруживаются Т/А-Т/А-Т/А

последовательности (Kirkegeard et al., 1984), присутствующие в точках рекомбинаций с участием рЕ194 и делеций (см.Таблицы 1а и 16). Такин образом, похоже, что ДНК топоизомераза I является медиатором неточной эксцизии рЕ194 из хромосома, а также незаконной рекомбинации, независимой от коротких трактов гомологии ДНК, при интеграции рЕ194 и структурной делеционной нестабильности плазмид.

6. Фвнсхен "незаконной амплификации" плазмкд.

G. 1. Два типа амплификации интегрированной в генок плазмиды.

Ллазмида, интггркрованная в бактериальный геном за счет незаконной рекомбинации, оказалась способна не только к спонтанной эксцкзии, но и к амплификации е составе хромосомы. Этот Фенонек был обнарухен в клоне, .в котором ts-плазнида pGGlS находилась в интегрированном состоянии в области хромосомного структурного гена argF и имеющем arg- фаногип. Плазмида pGGlß, встроенная б геном в количестве едкой копки, определяет устойчивость клеток к 5 мкг/ил хлорамфениюла (Cr.). Для получения амплификации отдельные колонии erg- кнтегранга последовательно пересевали в жидкой богатой среде, содерга^ей возрастающие концентрации Си, при 32°с. Были получен« клони устойчивые к разным концентрациям .антибиотика (вплоть до 50 мкг/мл Cm). Экспериментами по б.чзттикг,-гибрид камки было доказано, что повышенная устойчивость к Cm обусловлена амплификацией плазмидкых последовательностей в составе бактериальной хромосомы, а не наличием автономно реплицирующейся эксцизионной плазмида. Более того, гибридизация расцепленной Sau3A ДНК из' двух клонов cl и с2, устойчивых к 50 «кг/мл Сш, показала что характер амплификации у них различается (см.рис.24): у клона с?. акплкфицирована не эсг последовательность pGG10 и появляется нсеый дополнительный амплифкцкровашшй фрагмент (К-фр^гмент), Еключапдий пс-вкдк:-.оиу стыки поьторов плазмиди; у клона с2 ялплифнцирог£.к& acsi последовательность плазнкды. Дс^ситогогкма рвдког.чтогрйфа (рис.24) свидетельствует о наличии 1в копий акикфкцпоовйнкых последовательностей ДНК, то есть возр&см.кие числа копий пряно пропорционально увеличению дози Си. Выборочная проверка характера амплификации у других высокоусгойчивых клонов показала наличие только этих двух равновероятных типов аип.ч:»>и:ж.п.ии. На основании данщ'х по ДНК гибридизации сияа установлена структура амплифякационнык кепкй, представленная i:a рис.25. Таким образок, судестзует два различных механизма амплификации: первый -амплификация плазмидных посдгдогательпосгей по участкам стыков ДНК плазмида/хроиосома ("точная акпхчфк::ац;:я"), гтерой амплификация строго определенного участка, состоящего из части плазмидной и хромосомной последовательностей ДНК ("кгточаая амплификация").

Амплифнк&ция интегрированной> в геном -ts-плаэыиды pGG 10 имела ряд особенностей. Она била нестабильной: при снятии селективного давления антибиотика происходила погеря амплифииировакныу. структур. Например, через 10 генераций лить IX клеток сохранял исходный уровень амплификации (10 копий).

¿аиЗА

Sa »ЗА

Cm Со pSSiO

км«С2 Cm ^

pfifitt

ет» I—

.с

"О

Рис.24. дак гибридизация хромосомной ДОК из кхонов cl и с2 (pGG10::argF), устойчивых к 50 мхг/мх Ст. Гибридизационный зонд - 32P-pGG10.

Амплификации не наблюдаюсь при выращивании клеток при 43-52°С -температуре непермиссивной для репликации pGG10, что указывало на роль репликативного аппарата пхазмиды рЕ194. Введение мутаций гесЕ (запрещающей гомологичную рекомбинацию) и гвс149 (снижающей частоту и незаконной интеграции плазмид в хромосому) в arg-интегрант не запрещало процесс амплификации. Таким образом, в отличие от описанных случаев гесЕ и гесА зависимой амплификации в E.coli и Bac.subtilis (Yong, 1984; Edlund and Normark, 1981), гесЕ-независимая амплификация в нашем'случае может,быть отнесена к разряду незаконных рекомбинационных событий. Этот феномен может быть условно назван "незаконной амплификацией".

A32' AS4 AS»

«pH fey.^ (cgt ermC repE jeep J>re

d iтшшишитшпшг •....■ . UzJgL. ь —I— в —«-F—L- с

f

~Cr

«

l

> •

=C! 1-

А Л

«1

tJ

A

A 31

«V

_»_

ь

_»_

=J-

Рис.25. Точная и неточная амплификация плазмвды pGSiB. I | - РЕ194; ушт/тл - рС194. А. В, Се т.д. - Sau3A фрагменты pGG10; J1 и J2 - Sau3A фрагменты, содержащие стыки плаэмндной и хромосомной ДНК- ASI, AS2 и ASI, AS2 -сайты амплификации! X - дополнительный гиплифнцкрованный БаиЗА фрагмент.

6.2. Молекулярный механизм и модель "незаконной амплификации".

Споктаная амплификация у бактерий, как правило, связана с наличием интактной системи гомологичной рекомбинации и наличием гомологичных последовательностей, фланкирующих амплифицируемый участок ДНК. Роль гомологичных последовательностей, по которым происходит амплификация, могут играть ггп гены (Stark and Wahl, 1984; Wilson and Morgan, 1985), несовершенные повторяющиеся последовательности (например, rhs-последсвателъности генома Е.coli) (Lin et al., 1Э84), IS элементы (Chandler et al., 1979). Вообще, наличие, любых гомологичных последовательностей, ориентированных в виде прямых повторов, может приводить к амплификации лежащей между ними последовательности (Peterson and Rownd, 1985). Известна амплификация по фланкирующим повторам размером от 5.0 т.п.о. до 5-12 п.о. (Nacano et al., 1984). Как правило, амплификация зависит от наличия функционально активной системы гомологичной рекомбинации, хотя а ряде случаев наблюдали гесА-независимую амплификацию (George and Levy, 1983; Chandler et al., 1979). Однако, эта независимость не была абсолютна: незаконная и гомологичная рекомбинации, по-видимому, последовательно вовлечзны в процесс амплификации. А именно, редко зозникающая мезду короткими участками гомологии гесА-независимая дупликация, (сотни п.о.) в дальнейшем служит структурной основой recA-зависимой амплификации.

Тэмпгратурочувсгвительиость и гесЕ-независимость

аиплкфихацин" интегрированной з геном плаэмяды pGG10 ставят вопрос о механизме такой аиплифихации. Наибольший интерес представляет "неточная амплификация" pGGlQ. Для его выяснения из геномной библиотеки arg-;:30Ha ,cl с "неточной амплификацией" ДНК были проклонированы Sau ЗА и КраН Х-Фрагменты, содержащие стыки ДНК амплификац;юпных копий (AU - amplification unit). Используя их в качестве зондов был проклонирован EcoRI фрагмент хромосомной ДНК (размером 0.7 т.п.о.), содержащий исходный хромосомный сайт амплификации AS1 (см.рис.25). Данные секвенирования полностью подтвердили предложенную нами схему амплификации (см.рис.25). Действитэльно, в случае клона cl один из сайтов амплификации (AS1) находится на.геномной ДНК, другой (AS1') - на ДНК pGG10, а рекомбинантннй стык - в Х-фрагменте. Нуклеотидные последовательности,. участвующие в амплификации представлены на рис.26. Оказалось, что амплификация происходит мезду участками короткой- гомологии ДНК длиной 11 п.о., распологэнными на хромосоме и встроенной плазмиде. При этом плазмидный участок расположен точно в петле паяккдромной структуры точки иачала репликации (ori(+)) плазмиды рЕ194, где находится сайт нккирования ДНК плазмидным репликационным белком RepF. нахождение одного из сайтов амплификации в сиг-последова-

AC G T A С С

А С I 7 G-C G-C G-C G-C G-C G-C Л-Т T-A

5- -cggcsatcatTACTACGACCTgaacacsgg......//......GGGGAGAAAACA GGTSTCCATTST- 3 *

рояосожиз да (arl+> область <sE194

S'-cggsgatoatrACTACGACCTCCCCCCTAGGTGTCCATTGT-3* £Л€ЗШ$1!Са1№ОШШЯ сгак Д2Е

FHC.2S. Еукхгстидные последовательности? участвующие в неточной амплифшсацин плазмиды pGGlB.

тельности ori(+) рЕ194 указывает на прямое участке -s-реплакативного аппарата плазииды в механизме "неточной амплификации" к объясняет температурочувствительность последней. По-видимому, инициация амплификации связана с

температурочувствительным процессом никированкя дуплексной ДКК EepF белком в специфическом cor-участке пл&змидного ori(+).

Структура амплийикационных единиц, гесЕ-независимость и температурочувствктельность амплификации, а так же данные по нуклеогидным последовательностям сайтов амплификации позволили предложить адекватную модель механизма "незаконной неточной амплификации", названную моделью "никирования ориджина с последующим неправильным спариванием" (origin-nicking - slipped mispairing model). Согласно этой модели (рис.27) амплификация инициируется ts-зависимым пикирование« ДНК рЕ194 белком RepF в сог-последователь-ности ori, как это обачно происходит при rolling-circle репликации рЕ194 в автономном состоянии (а). Далее происходит ошибочное спаривание в растущей вилпе хромосомной репликации последовательности 11 п.о. oxi(+) с таким re коротким участком гомологии, расположенным на хромосомной ДНК (б). С З'-конца разрыва, образованного Hep? белком, начинается синтез ДЕК, копирующий участок от хромосомной 11 непоследовательности до 5' конца инициирующего разрыва (в). Прикрепленный к 5"-концу RepF белок способен по завершении репликативного синтеза воссоединять разрыв, а завершение раунда храхосомной репликации приводит к образованию структуры с дупликацией АО (г). Последующие циклы такого гесЕ-независимого

огЗД_ .

-ГШ i-Ш-

Ш )-Ш

V

-Е2-

—£23-

-W2Z

-са-

V

Ряс. 27. Модель Гнхкароваюю оридхнва. реохшатш - неправильное сарпии' незаконно!! атияфххацкн. Светхдо прямоугольник -ашмзд, эаатряхомяяиА npnoirontna - короткий участок гомологах. овгхсяеная в тексте.

процесса приводят к появлению амплифицированных структур с множеством копий АО (д).

Таким образом, пикирование плазмидной ДНК инициирующим репликацию белком и наличие короткой гомологии между последовательностью плазмидного ori репликации и определенным участком на хромосомной ДНК, расположенным на расстоянии не более 10 т.п.о. (по данным ДНК гибридизации) от сайта интеграции PGG10 в argF ген, приводит к неточной амплификации строго определенного участка ДНК. Хотя последовательности гомологичные амплификационному сайту (11 п.о.) встречаются в структуре ori ряда плазмид грам-положительных бактерий, где служат ник-сайтами для репликационных белков соответствующих плазмид (pLSl, pLB4, PADB201), участок хромосомной ДНК, содержащий эту последовательность, в наших экспериментах не мог обеспечивать репликацию плазмид в Вас.subtilis при наличии транс-активного RepF белка, следовательно, вряд ли он входит в состав Функционального хромосомного ori, например, критической плазмиды или дефектного фага, интегрированных в геном бактерии.

Обнаруженная нами "незаконная амплификация" является первым примером участия функционально-значимых нуклеотидных

последовательностей в процессе амплификации гемной ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны модельные плазмидные системы для изучения межмолекулярной (спонтанная интеграция ts-плазмид в хромосому или неродственный плазмидный репяикон) и внутримолекулярной (спонтанная неточная эксцизия из генома интегрированных в него плазмид) незаконной рекомбинации в Вас.subtilis.

2. Установлено, что минимальная длина участка гомологии, необходимая для гомологичной рекомбинации между плазмидой и хромосомой в клетках Вас.subtilis составляет 70 п.о. При меньших длинах гомологии интеграция плазмид в геном определяется исключительно процессами незаконной рекомбинации.

3. Определено, что межмолекулярная незаконная рекомбинация является гесЕ-независимым процессом; носит реципрокный консервативный характер; не зависит - от большинства гес-генов Вас.subtilis, за исключением гес149; стимулируется в 50-100раз в минимальной среде.

4. Установлено, что незаконная рекомбинация происходит, используя в качестве сайтов рекомбинации короткие участки гомологии ДНК (4-15 п.о.), либо, полностью негомологичные нуклеотидные последовательности.

5. Определена полная нуклеотидная последовательность и функциональная карта канамицин-резистентной плазмиды S.aureus р0В110 (4545 п.о.) - базового вектора для генно-инженерных манипуляций в Вас.subtilis.

6. Обнаружена гесЕ-независимая сайт-специфическая рекомбинация

между плазмидаки рGBl10 и рЕ1Э4. Установлено, что рекомбинация происходит в пределах кор-последовательности Я5а сайтов плазмид размером 10 п.о., перекрывающейся с промотором плазмидного гена, кодирующего Рге-рекомбииазу.

7. Обнаругена "горячая точка" межплазмидной незаконной рекомбинации на плазмидах pUB110 и PE1S4, представленная гомологичными последовательностями размером 11 п.о. Получены данные, исключающие механизм "рекомбинации выбора копии", и постулировано участие сихвенс-специфической рекомбиназы Bao.3ubtíli5.

8. Установлена сиквенс-специфичность ДНК-гиразы Вас.subtilis in vivo. Построены ка.рты сильных и слабых гиразных сайтов на плазмидах рОВ110 и pBR322. Предложена консенсус-последовательность разрезания ДНК гиразой Bac.subtilis in vivo. Оценен вклад гиразы в события незаконной рекомбинации в Bao.subtilis.

9. Выявлены структурные особенности внутримолекулярной незаконной рекомбинации при эксцизии интегрированной в геном плазмид« рЕ194. Установлено, что эксцизия • рЕ194 из различных мест хромосомной интеграции происходит преимущественно после транслокации плазмидн в специфическую) "g-область" хромосомы. Определена последовательности ДНК "g-области" и точек эксцизии. Основная роль в механизме эксцизионной рекомбинации отведена ДНК топоизсмеразе I.

10. Установлена обобщенная последовательность сайта незаконной рекомбинации, независимой от коротки:: трактов гомологии ДНК. Сделан вывод о зедущей роли ДЯК гопоизомерази I в механизме незаконной реконбинаци этого типа.

11. Обнаружен феномен гесЗ-независимой "незаконной амплификации" интегрированной в геном плазмиды. Определено, что "неточная амплификация" происходит между короткими прямыми повторами 11 п.о., один из которых является кор-последовательностью ori(+) репликона рЕ194. Установлена ключевая роль плазмидного белка RspF - инициатора репликации рЕ194. Предложена оригинальная модель молекулярного механизма "неточной амплификации".■

СЕЯСОК РАБОТ, ОПУБЛВКОБДВДНХ ПО ТЕИН ДгССЕРТАЩШ.

Банкиров В.И., Прозоров A.A. Плазмидиая трансформация у Bacillus subtilis (обзор). -Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 1983, т.1, Н10, с. 2-12.

Банкиров B.JÍ., Хасанов Ф.К. Исследование механизмоз рекомбинации и коррекции плазмид у Bac.subtilis. V Всесоюзный симпозиум "Молехулярные механизмы генетических процессов", Тгзиса докладов, Москва, 1983, с. 130-131.

Банкиров В.И., Хасанов <5, К., Глумова Е.Ф., Ирич В.Ю., Прозоров A.A. Экспериментальное встраивание эукариотической ДНК

в хромосому бактериальной клетки. -Докл. АН СССР, 1984, т.276, с. 1491-1494.

Prozorov A., Bashkirov V., Khasanov F., Glumova E. The use of integrative vectors in insertion of non-homologous eukoryotic and prokaryotic ША in Bacillus subtilis chronosome. -Abstracts of 7th European Meeting on Genetic Transformation, Paris, 1984, p.79.

Bashkirov V., Khasanov F., Prozorov A.A. Sone features of integration of plosmids with temperature-sonsitive replication in Bacillus subtilis chromosome. - Ibid., p.102.

Башкиров В.И., Хасанов Ф.К., Глумова Е.Ф., Нроэороз А.А. Получение и использование интегративных вектороз дгя астраивання чужеродной ДНК в хромосому В.subtilis. -Тезисы Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнология", Пуцицо, 1984, с.4. • . - -

Башкиров В.И., Хасанов Ф.К., Глумога Е.Ф., Павлова С.И., Прозоров А.А. Интегративные плазмиды, как источник создания инте тратимых векторов и их применение для включения негомологичной зукариотическсй и прокариотической ДНК в хромосому бактериальной клетки. -Тезисы Всесоюзной конференции "Гибридные плазмиды и экспрессия плаэиидных гонов", Пущино,

1984, с. 8.

Хасанов Ф.К., Башкиров В.И., Прозоров А.А. Особенности встраивания теипературочувстайтельных плаэмид в хромосому Вас. subtilis.' -Там же, с. 15.

Prozorov A.A., Bashkirov V.I., Khasanov F.K., Yrich V.Y. Insertion of eukaryotic DMA into the Bacillus subtilis genone by means of a temperature-sensitive plasmid vector. -Geue, 1985, p. 39-46.

Бапккров Б.И., Хасанов Ф.К., Глумова Е.Ф., Ирич В.Ю., Прозоров А. Д. Интеграция эукариотической ДНК в хромосому бактерии.-Генетика, 1985, т.21, с. 201-209.

Хасанов <s.k., Башкиров В.И., Прозоров Р..А. Изучение интеграции различных плаэмид в хромосому Eac. "subtilis. Генетика, 1985, т.21, с. 1616-1625.

Хасанов Ф.К., Баикиров В.К. ВасЕ-независим»я интеграция температурочувствительных плаэкид в хромосому Вас.subtilis. -Б Сб. "Стабильность и изменчивость генома", Наука, Москва, 1935, с. 46-52.

Хасанов Ф.К., Бавкиров В.И., Прозоров А.А. Амплификация температуро-чувствительных плазмид в хромосоме Вес.subtilis. X Всесоюзное совеяание по программе "йлазмида", -В' Сб.тезисов докладов "Проблемы переноса генетической информации", Пущино,

1985, с. 185.

Баикиров В.И. Пути интеграции чужеродной ДНК в хромосому бактерий. -В Сб."основные направления генетики микроорганизмов", "Наука", Москва, 1985, с. 70-78.

Башхиров В.Я., Мильлина Н.З., Прозоров А.Д. Полная нуклеоткдная последовательность и функциональная карта канамицин-резистентнсй плазмиды pUB110 из Staphylococcus аигеиз. -Генетика, 1966, с. 1081-1092.

Залкиров В.Й. Рекомбинация между плазмидой и хромосомой в клетках Eac.subtilis. -Материалы 3-й международной молодежной шкоды-конференции по генетике, (Варна, 1988), София, 1987, с.47-65.

Банкиров З.И., Лакомова Н.М., Прозоров A.A. RecE-независимая рекомбинация плазмид в клетках Бзс.subtilis. Генетика, IS6S, т.22, с. 2750-2757.

Bashkirov V.I., Lakomova N.M., Prozorov А.Л. RecE-independent recombination of plasmids in Вас.subtilis cells. -Abstracts of 8th European Meeting on Genetic Transformation, Uppsala, Sweden, 1S86, p. 43.

Khasanov F.K. , Bas'nhirov V.X., Pro2orov A.A. Amplification of the plasmids, integrated into the Вас.subtilis chromosome.-Ibid*!, p. S2,

Вашкиров В.И. Молекулярные механизмы незаконной рекомбинации у бактерий. 5-й Съезд ВОГЙС, Москва, 1387 -Тезисы докладов, т.6, с. 218.

Павлова С.И., Яасаноз Ф.К., Башкироз В.И., Прозоров ft.А. Интеграция плазмиды, несущей гены триптофанового метаболизма Hftc.meaentericus в хромосому Вас.subtilis. -Генетика, 1987, т.23, с. 261-257.

Банкиров В.И., Хасанов Ф.К., Прозоров А.Я. Нуклеоткдкые последовательности, вовлеченные в процесс незаконной рекомбинации между плазмидной и хромосомной ДНК у Вас.subtilis. -Докл. АН СССР, 1387, т.295, с. 973-97S.

Хасанов Ф.К., Баткиров В.Я., Прозоров Я.А. Амплификация плазмидной ДЕК в хромосоме Бас.subtilis. -Генетика, 1987, т.23, с. 14-20.

Банкиров В.И., Хасанов Ф.К., Лакомова Н.М. Незаконная рекомбинация и амплификация у Вас.subtilis. -VI Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1987, Тезисы докладов, с. 155.

Baahkirov 7.I., Khasanov F.K., Prozorov A.A. Illegitimate recombination in Вас.subtilis: nucleotide sequences in recombinant DNA junctions. - Mol.Gen.Genet., 1987, v.210, p. 578-580.

Bashkirov V.I., Stoilova-Disheva " M.M., Prozorov A.A. Intarplasniidic illegitimate recombination in Вас. subtilis.-Mo1.Gen.Genet., 1988, v.23, p. 465-470.

Хасанов Ф.К., Вашкиров В.И. Амплификация плазмидной ДНК, встроенной в хромосому Вас.subtilis. -В Сб. "Проблемы молекулярной и популяционной генетики", "Наука", Москва, 1988, с. 32-35.

Банкиров В.И. Молекулярные • механизмы интеграции плазмид в хромосому бактерии. -В Сб."Молекулярная генетика микроорганизмов "Наука", Москва, 1988, с. 5Т-68.

Башкиров В.И., Стоилова-Дишева М.К., Прозоров А.А. Межплазкидная незаконная рекомбинация в клетках Вас.subtilis. -Колек. генетика, микробиология и вирусология, 1988, N11,42-18.

Bashkirov V.I. Illegitimate recombination and amplification in Вас.subtilis. -Biol.Zent.bl., 198S, v.107, p.682. '

Башкиров В.И., Хвингила _' д.ю. Нуклеотидные

последовательности, разрезаемые ДНК-гиразой Вас.subtilis in vivo. -VII Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы . генетических процессов", Москва, 1990, Тезисы докладов, с. 196.

Savchenko . G., Conrad В., Bashkirov V., Hofemeister J. Nucleotide sequences of sites,' involved in plasmid pE194 excision from Вас.subtilis chromosome. -Abstracts of the Second Workshop on Gene Manipulations in. Bacilli, Holzhau/Erzgebirge, FEG, 1990, p. 37. ' - J ' '

Zvingila D., Bashkirov V. Sequence specificity of Вас. subtilis DHA gyrase in vivo. -Ibid., p. 48.

Башкиров В.И., Xaсанов Ф.К., Лакомова_ H.M. Незаконная рекомбинация"' —и ацплификация —у Вас. subtilis. -В Сб.: "Молекулярные . механизмы генетических процессов", Москва, "Наука", 1990, с. 237-243. -

Хвингила. Д.Ю., Башкиров В.И. Исследование роли ДНК-гиразы Вас.subtilis . в процессе - • межмолекулярной незаконной рекомбинации.-Молек".генетика, микробиология и вирусология, 1991,. N3, с. 23-25.

Башкиров . В.И., Хвингила Д.Ю. Нуклеотидные

последовательности,""., разрешаемые .ДНК гиразой- Вас-.-subtilis in-vivo. -Докл. АН СССР 1991, т.316, с.1257-1261

Bashkirov V.I.-, Zvingila D.J. Sequence specificity of Вас. "subtilis DNA gyrase in vivo. -Genetica, 1991, v.85, p.3-12.

Хасанов Ф.К., Хвингила Д.Ю., Зайнуллин А.А., Прозоров А. А. . Башкиров В.Е. Определение минимальной длины гомологичного участка ДНК, необходимой для интеграции плазмид в хромосому Вас.subtilis посредством гомологичной рекомбинации. -Генетика,

- 1992у.~'Т.- 28, -стр-___38-45-- .__... ' .

Khasanov F.K., Zvingila D. J.., Zainullin'Д. A., Frozorov A. A. Bashkirov V.I. Homologous recombination between plasmid and chromosomal DNA in Вас.subtilis requires approximately 70 bp of homology. -Mol.Gen.Genet., 1992, v.2347 p. 494-497

Conrad "В.; Bashkirov V.," Hofemçister J. Imprecise excision of plasmid pE194 from the chromosome of Вас.subtilis pE194 insertion, strains. -J.Bacteriol., Ï9S2, v.174 , p. 6997-7002

SaaSICBbfll) HiniX

eaAjGSACKCCTCt ua i ' ■ T^^GOI^ lca

* i * lauagtaici II 11 >ricm

nA^^L-'jG^cIl^^aihsfAppAr^r^ir^-jV^ILauI^uai^acnyp.LL^uTr1 i1 ni wpLjal^g^hi-L^girsrcrtlrTjrLY^Glg^ftrCl

iKiWC----------

TGAJL'A.1c"ctGi GJ.AACCQTArriiajt^iCirrriccciG "

Stnrti. S.3.

____Hpül

csmMsssscicmic^iKsuTKrcGCTCTiTOcixuiCcieTTC^ 400

11 -i CCSACJLXACCCCGreGCTGXAGCTgCJLCT;CA3attGTGIGmW> liT'.TJ i CTAgnCACACACqi. - . . -----

GTOC^^GGCGr^^GJCCC^^AA^^ ''nnnni^iiimi^wywm^lffrw ^

»Ol

tccmccccccxuxcctGic^csiosiiir'imcrecTiTOciaOT 60u

Mail

TCCCIATOygAlylTCJCCCTWKICnGCTESftCC&JLAXCCCACACrCAGrl I f!l I Tl 11 ITTtrUJTCTCrgCCbUÜCTLSTCgXlCCgiaLi. ,„

H 1 "T-l 1J tttr-.Xr.lT^y.J ! 11 I If^l 1 Linviri-^A^ 700

12>oI iokl Kiel

rj;rf crrcjAXUAGcrr 11 TG 11 iTTcragrecsMy^T^cTccüxtiTCTjsacirxctccj^^

Hin

spoHEmn • sinii - aüüi

1100

GGccAcrcj^uanfjcccccsgct^cOT: i OT in-rn«

_ - ®»II _

itUicctucrioiiSiXLcimriKUitUimcri^ra^ 1200

■ ta'VLi.-viiirZ^&Ilkevl/^/.rO^GyrFtcGlj 3tart 0

_ EaeriX

gTTAGGGSAAAGTf. > i IG / T*

S.D.

AG^ACCCTTrAIKiOTIA^CSOT.lCAl»!^^ 1 «00

iosracGGiJimAra^rusMsciiunrcMGci^^

fohl * Kall Sinti

«5STC»£CraieiiJ^GGI*IGCCiimG»Cii^HKi.C^ 15C0 CTCCAGTAGCAAOremCCAiJ^r-CAjUlACmcWLGCiGATAEi^

CCJLSAACggTCyCAOASTCCCAAAEiSSScACAa, TTACGlt }goo

GACCC^GCGCiCGiBCimiClGlJCCGArGittoGACCiiTC^ 1700

Awll

GCMCOTSACiOGiiimicGccmra^auiimmcia^^ ,

Elafl EatUI üiail

fr^rr i^ttXX: rinriTT

CCjUÎJlTÎCC^CCrilATTtCAraiACiATCTTCjLrtCTrrCrrCTCtXCTCi

ктмсаишт » >ет»тагсяА<ЦА<ааАС^СААСАСАТС>к^»цтААСс>с:ац^

1Л1

ТАатгаостттастААА^вААТОТтссжоАССАагеттетткаестлг^ .

; гзоо

Н..ГП

AjLT¿feGTxGAfT¿t^acwcnTtucccGSC men я^йАгйли^^ттА^л^А^&^А&сатт^сетс^мссп/.-ггАГст^лс

End В CluIor^«îb«t^AmïLyali^ufcpJLanîrntlutil»UtIleS«r?frlGi

Bla/I

GI«aAraACCMAJUAACC«MCÎUUCAÏACTWGTÏtAaCCaAA^ "

Lmai&ixzixcœœsîizai&tjjj&ttoxe^^ -¿и*.

__TeûIBitttl cbol

ссА1игнссА(Лгтсс1аьтсссолггвгттссо1ттх»1тгя^^ 2700

EjefI BlaTI

TcmoccTiirascAAAAw^resACTbJUTtGtTrcACGii^imv^ -600

AraAAÇC5iAjuiAG<nrmAAcmoGriAOAiAiic^

э Jrp ч* 'Д a ^ VclCyaViU^i"-: » t ,-ÍIt

iii ¿¿ААСААСАГГГГТАГТААГГТ^^ЧГАТ'Г^САХ'.^ЛГГС^С-ССА. 2900

АлгесиоАосатгааиалАсгстгАГКААГгсттесссАгаяш

rrAGaAACKGCIA^nUCÎGrnGiCJJ^EAjLiTTJJ.iUAGCM^ 39JQ

EcoBII

стгшмлсгаслсаислАссттттоАПсгАгоситстгасдтстот^ -..„о

CAAAT'IATr^.AAGTCS^T СТТУ: * Jt

laql

ACCTiJ<rrrCJUAGJLUaCC(UCJUACWCZAJUJ^AAXTJLlGAf^r¿AítMÍÍKCT Axí^JrfuljeAreGluQlyTbrGluíJeAreGlalyaíjrGllU^uIleGillAl^^

AGAAGTÏCAJU(?mKJACA2ÎÀCCGiraTCTTnSTCrCCAT<Krcra ij^Q

ICnCAASTTTCATrAGTTCtAAÏCGCÏAAAACAJUAOA(ttGCTAXClGAGÏGUAACGTGAA^

■ rí Valley V.-ilAr^'crLyjCluÀBp^»

ттАСбАтоА1ЛА«ста(ЯАМАГЛАттггс1ОТС5кии»ии.1^ rtj*Il»3«rS«ÁeAÉroCymEet S'.c-Tt S S.Í.1

ССАЛСШТГГгАА0аетЯ5САА1АЯЯИиШ1САСА1АС|^^ 35OO

cîriGCTtAjiAATiGCCJuuAerîAïaAjLirrTîGiraAïGx«

Ubolïnql

G?AlCAAC&?AAGAAAGAACAAC??CA¿AACC¿?CAAAAAAJlGACACCT3'PTCAGGTGCITTrTT?E" --ÏAIAAACTCitTCCCTGATCTCGACTICGr 3S00

- « LguSTfa«tGíyflnA»p*r¿¿BtArsC

Mí

j(U¿iAAmccAiuGccuiACíCAAíCAAGTrMSCAAG*AAAAíccAA<uímccw

ti oRI

CTACAJUC^C^TTAAJAACœrïTÎXUGGCrTrTliGCCCÎCTÇTACCra

C«GTÄGGG*UArCTM0CXUAAiraCCGAAAAtTS^ACACAT5CAA^^

TtiAWCiatAiTmaieiciJuigicf.Hrmu'iiw; та «стидАЫАтсдсттАцуг-ггАИАлАтссстстАецеАсеАстЦАИГг AXTXAGCGAATJÜ^lTCrCJUlAITTCIbAAGII f>n>l(^CGTÏGAGIAAIACTACSAAA?CTJ.AAACtiJ?rTACCGAGA?TCTC?GS7GATATJLAAA

TCTIIAAMIGC2CjLlGM«mCTtAA»KmtA2TCTCTCCKCAmClGTAC^ .

ЬП.уа^. у Ш «ГЛ .'^Ч»^!^.H ynt ^^T^W-.l.n-^l^ .4.» y^ft^y,,-^ Д^Тг'.угТ.СТЕГЕ) npjtnqi jpU

3700 3BG0 3900

JL^mrggACCASgTI < Ц' HTCTCGGIGCAA

схггизедщця^ш'зюкшхгяцгайй&с»^ 44oo

-^..bP-ny.l .^-.-.T.T^ ^T.L.-.-ii . I—-T' if- ЬI "г I

Рис.8. Полная щгклготндназ последовательность плазкида рОВ110. Увазази сгйти рестрикции для некоторая эедопуслеаз к otitpkiks рзгтап счигованяз. 3-D. - вероятна сайт свигагаяпя ри5осойы. Еодчзгкнута нуеяеотиды кеяплеигнтаряне З'-хонцэвоЯ последова-твнъаостя 1GS рРШС. Sac.subfcills. Приведена аиняохнслоишг последовательности аоддауекнг поеяпоитядоз. Стрсхкакя показана палгдадрci.iEE структура HSa сайта.

GD7DKCTKLC(4K7TQKQHM [ТТЛССОТО/^аТСПТАСЛСАСТ^СЛЛСОСАГЩЛТТАЛАЛААСТОСТГТТОА-ГТАТТЛ

Г I T О И В irbTHKHDiqOr I T ДАААТССТТСССАГШАААТЛААСАПСАСОТГТТСДТтетСАЛТСМАТСАТАТАтаАСА

гвтвхвхтххихатлхокслТ

TAATCATACOATTCATUTTTOACrTCCTCATffAATATOAOTOGCGtArArcCTTACACOCT

К 1. Т A C LMXT7DBKEDGÏAHK тТСААМЛЛ0(Х»С/ЙА£ЗСАТГТСТОТОЛААТ(7ТСТТТСТТСАТсасссоТТаСОТТГТТС

OrTDQIlFDBTÏRÏSIBbATr ССОАЛОТААТСТПСТСТОАААТСАтаАТАСТСАСОАААСТСТЛТАТСЛАОАОСТОТОЛТТ

S К I. S lAtTTCAocrce

КЕКГХХТАГГТ ,___

ттттстттлтАттаптслстасатАПТАСат.-Дгатг

К M V Q 1 8 P 11 lEQXQPFQ X H I* V ТГСАГСАСАСОТДТЛОАОООАТТААТАтеСССТТСАССезвОАЛАСаЗАТСАПЛАТАОА

M & H Start CK»5

ТТАиССЛТОССа^САССаЗ^ШОТАаЛАТТТЛТПТМТАТТТТЛТЛСОаТЛСГЛТЛ AATOCATAAACACQTAAAQTAttTCACTTAÄTTAATATTCATCATATATAACTTTTCTAC

матлтАпссств1спсАлоАаииААослггелас1таААясамтгс1Т1ААТЛ

АЛОАТСШМТТСЛЗТСЛттетСГСАТОАТАЗЕАТТСТТААГСДОТСССТГПТАТТА «TBiBibrti. í о в к а г a и к

Т1Г1ТАСОТТСТтазтаАМ1ТМСОаА1А1ААТЛСЛССв1С1ТТСОСЛЛАООАСАТ(ЯТ

а Т КХ вТТЬТЬАВТ ГвВМвЬЛ геШ11;1СС1СТиШСС.\СОАОС.\ССАатаС1;1СООТДТЛасео[:АСАТЛССЛЛСАаС

лавятат, ахвт'ххтт-ьгьтя сасссаатесакмггсссАмтетлтАгГОАСТТСстгсегсатгмгоаяласАслтт

ЛЛВТЬХВ Х-В УЬЬ'АаВЗЬРВа етстастолсдсоАятттаттттссстслстллтАЛЛзсоссотитолАОАоостттсс

р г г i s з i l a s о i к л в г. s. г а к CGOA,WMAOAIOCmOlAITAiIflAAO/eciOAICTCOOOaTaTAGaaAESWCCTIT

ЯХГХХТРВДВЕХГХ'ЬЛбЯХВ'

ттомтААмгапсмажятстсистттсмтелАттАААастссАтвсттлго свьлкхлхд-ь'гхудртгЕхх

ТТСОТАТЛЛаОСТТТАЛТОвСЯТОТССАОИСААТААЛТОСООбОаТАМТТССТСАЛТ

ГВвЬГ1ГЯ8Д .10ЧНЭв»7И0Ь ОГАТОЛТТВСЛМГЛАЛШЖЛАТЗСЛЛТССССТОСАТОГССТОЛАЛАЛСВТОССССАА

BDixcr, i. oaDïeatTitbibe АТСАТСТААТТСАСЛАу^СОАОАСЛСТМтеТТТТТСОТОАЛПСйТТТТСЛЛРАТТАОЛЭА

лсасхсвггтахкакГАигв

ТаСАТСЛСС1МТАТТТЗеТСТА№АСАССТС1А111ТССССГГВМС0САГГТТСтаА

120 180 240 300

зев

420

160 5«г ■

sou

вва тги.

Т60 310

1020 1090 114Я 1JEO 12в0

I- Ц X Т Я M Stert owe

TATCTOCrCAT/SOaCATAGCCTTCAISSStaSTTTAAATIICt^CTrrtCACBftA'ÏOC 132Я

тТСТ1АГГОА1ВСАСАТТСТАГПМТААШШШМЯТАААаААТваАААТООААЛО 1380

Etait ОКИ ИХ 1ER'

МТСАТТСАаТЛТЛТТТаСАОТТТТТАСаСОТОАГГТаЗЙТТСТТТТАТТТАТССССА 1140

11вт1стгьат1г^вг1тла

ААИТ1ТАОЛЛЛАЛСПАААССаАСААА.ШАаЛАТАООСССОССОПСА1ТОСТТТТТА1 15М

игпкткр'ткке«

АСАТММТ0ТТАТАЛТТТСТСТСа11А10АААЛЛа!и14И2Ш1АТСААтаТЛТОЛЛАаА 1560

Bt<ut ОПГ2 И X X

ЛАСТСААМСССССиВДАЛДЛЙЛТСАЛ/.САЗСТСггеСАСЛГГТТЛАТАСССлХттСЛТ 1520 I а.И ABXKZKQtiLBtblPXfZ

TACCCMOCG<KGCTTTCÏcrGATCACTTrrCTAOAIACTOT3ATOTCAOGOAAAOTCAO 1680 тело L.G LIirbBIVMSOKTB

ссссастоАтттлпсдатотсасслттоастсААОсстгтсаАсссстатттАслсАМ та l'ABbA OTAlaEBbWTPÏÏTQ

ACITaCASQTAÏATTAA'KKICQaTCACCP.CMATTaTroCTCAaTTATTAOaTaCAOAaAA 1000 Ь Л В L H А У- Т Р ITA QLLOAKK

АЛМСАЯААЯАТТСССТГТАСТОтТАСААЯСтаТЛТЛСаТООССОСОСТТСТТАаСАТ 1*80 KQKipïTT b«..ATTTAAt.I.E I

CGCCQTTTTAQtQATÎtKtATATOCTOCAQTtOACCTTA'TTCTTCOCTOATTQAACCTTtJA 1020 Л T L Г хатЛАГ.ВЬХЬОВЬИЬВ

^гслоотасдлгсгяАтаетАмеАсптттАТСЛстжллттсотттАтттат 1900 I B VB Q I А К В ? Ь В Ь О t ip L Г Г

ЭТАСАССОтеТТЗАаАТСЛТТСАТСаЛСТСАТТА1МЛААААС13АОЛП1САССАТОАТОА,1 2SH0

гттьхвгхвньакгнтгки!

TÂCACTCAQTTCTCTTCCAATCAATTTîGTATTOAATTATOTÎ.TTTA'ICTXtSSGGMOTT 210в

■тьвеь.рхкгтг.нгтгхуакг

CGOAATGCCGOCA^TTOOACOTQTAGQCOCGGQÍtrírGCATCCQCOTTAACTTACTOQTO 2180 вМРАЬвОТОАОЬЛбЛЬТТЧС

ТЛТЛТОСЛТСЛТСЛв1ТТТГТеЛГГЛПСЛТААЛАЛСССАСЯ5ГТТТСТОАЛТАСПСаЛТ 222В iciiBTxxiBKHAPranrsi

TtTTCTTACCATOVATA/ifl'fTCTCTTGQAAAßCATQC/iAA/JITTTQCTC/iAAATCOOQCT 220е

Г1>Т'НТКГ8«КАСКНЬЬКХа(.

*

ссо1лттоетттссооататтттггвмлоп/аслттт1оасА(;сп!тсАСост1стсАТ гз<в рхахлтгтхтахгллттььи

SaRXrb E»BI00P t96KQTS амсслттгтслтлсмтзлсслтсасатссслсс.чсзолсссАтАлтггтосстстст глав ЕВГВТ ТТХАвааЛЛМКГЛОЬ

8

К13ГА Л 'ГЬ тви|ЛВТ171РЯБД

глАт*тлтастассатс№Сятатс®АТКклстдАСААТто1тетсаяАТ1таААпса 2460 ОАтаАСйгясттазтгглАтсоотагттсттсллсэттатстояААТссвтссоалАлт ЗОЕВ

LYIIb-FSACPH I.» I Я А Ь В I. IdTBeTLB'OIBPKI

PAAK KLSAP. BYLKIPUHIAI C3CGC&AjtCAGCGGiTCAGCTAGGTTTGTCTTTCGAAGGTATTTCCTTGAGATCCACTCT 3720

GaTCCAECCCOTlTTAAEaAjaCAOGirXCATAMCtlAAICaaCATCATOArGGCaAIC 2520 AQTAYQbQbS7&G ISLI1&TL

PXZRKVAAelBKHLSCIAFIl СаСГТСАЗСТЛПаСЛГССаАСТТЛЛЛАГГААААЛАвОТАТААваСТТААСаССТТАТАС зтви

оасгтоттаттсАСТОсовсстотАтссттттА1Т!МлаАко.иА71иоасвсАта гбов ASAIASOLKLKKV*

Y V Ш-art СЯГ7 CnTrraA7TAAT0AtTCCATTtlAIA0aiCCAATATATTTCTTCTICaUlACCAT0T«lC0 3043

7лсА(ггТ1ЯОА£хш^гатастсс^огаАСАС4осА01Т7ТААТ1ТАтаетсхАгт 20<я

ATAACAGGTTCATTA'mTTCAATTTCTCTTCAGCTCTCTGAGCATCCCTTCTQTTTQTQ ЗСЕЯ

TCAacTTrcauiacraiTeccGCACoaAicTAonaAOCAncjifliamTACAAAa»raT 2703

Start ОЕГЗ V TCCGG7GAGCTC?TAACGCATTCATT7TAATATCACCTA£T7CTTTOATGTCAAG7ACGA 3000

GAACTATACGCTTOCGGKOacTTTrGTCTCTiACTUseiCATiauccrrccaaTcaa'rTA 27бя TATCA0cticGccaASAAcciciicTCTaii3CGaaiAATCoi:cATOCA0Ai7a7ACGca 4В2И

NYTlAAAiYBYWYlaLPYGY .

OACG3TCT7CTTTCTrTTTaCaaiAIAATCCACOaATAACCSCrrCCCCaCATOCA7C.-.T 4080

TATGGTCGGTAMTTTACAAGCUTCiXiTGCATTCGGCYATTGSA'fTCGATTAATAQCGGG 2В2Я ' . .

areTJiBbOAra,y»:aiiAO аата^атвсАСАСсататсс^АТМ^татайсмпА/мттааттАСАГСАТ 4 ни

ACTCGCCGCCGQACCAflTTQGGGTQTTTTTCAGQC7i33CAAAAC7GCAAAAACUTTATTC 2083 »I BHTKLHSBXT

LAAa AV aLrjULAK!. ЧКВУБ СТАТОЛТСТС1ТССАТ0АТЛ1САаСТАААТАСТСАГС0ТСТТСААА71СаАВСаТТТТаТ 42BB

аСА1ЦЛАСААСАСАТТТАДДЛШШ11ШЩи10АКЯ5СА6ААА/1САЛАААА17Л7ТСаЛ 2840 Y3DLCHJ, DHIDH ilt'CAK ILK

а К Ч а X * 2 tart от UAKHKKLlfS CACG0AGTCCAAQCACCXiA\GG7CAV7GATATCCA7TTCT77GCAAGCQTlt3A7GA£lCTC 4260

ВГАТСТПСССЛаСАГООСЯАААССАТСАаГГСААСАТОаГАТОАААСААТСаАааАЯАС 3033 OKB LLP LTEBHAriPDOHHR

YbS«aAXTIB3TMYSiIEXT TTGTTTTCTTAGCAGCGGCAACGTTTCCCGATTCGCCAAAAATGGATCGCCGATATTTCT 4320 OJ

ТаА7СССААТТСаАТТТА7ВСС1,СААСЛЯАСССТПГТа1САГГСАСААТ1ТАА/ВАВССА 3363 GUKCJLIACAYTVPIDKKHHL

DPMSIYA'BTDPVY IHHLXSQ GCCCATTTCACCTAAAQTGGOGCAGGCATACGIAACGGGAATaTCTTTTTTTCTGTTTAA 43DB

aAA7CTtGCCTITAACTATAAAATAAACOaTATT7TTATAaAI0A7GAaQAC07A7ACTr 3X20 AILeAYOTOKDDPHPLIYLV

МЬЛГНТКХЯЗХГХО&.КОТГЬ OaCAATOAGaOCTGCOACTCCATATOATICATCAYCAGGaTaAOOCAGaAnACTAaYAe 4440

QCCTAIACT0AAA0AATGG0CC7TTOAAa7CACACAIS0ATCAAllAQCATTTAAAAACICC 318Я H X X H Start ОНИ 4VTF PKKBIQ

p I (. К 2 H A 1 I V T aDQEB.LKTP ATOTTCTTTCATTATTATTnACCGIIITCTTTAAACTGTGAACGGTTTTTCGCTGATTTG 4600

TATCCAC7ATAITATTCXreaA0rrtDICA3AGlaAGAGAn'rAiATBTTTCTTATCTaAA 324B L S I А Ь К a O Г Е В О A Н Ь" L R Н К" К" '

IB Y I IHK F YHVHDL Г V Б Y V К CAaAGAAATTOCCAQTT7ACCaCCOCaCAOOTCICCCGCCAT7AA7AAACOalITTC;7TC 466В

AGAATTGGTCCAXCTCAArCAaAArACTGrGAAAAflCGAAGAAQCC»3AAaACC7X3TATCA 3533 VTTYSTb d BAYIWa EXTKta

KLiBLHeMTTKe BKAZabYB AACIACCdialATTCAGTCAAOCCnCAaCAIAAATCCASCCIICTTCTOTTTTCAAGCC 4620

CGCCCT7A7AAAACCaT7TDAtCTTOIOArTCAMmTTATAOAABAAATGTACAAAAA 3360 YH YPGNQXIKAQBY'TVHAHn

ALIKAiDbi lBirrxKHYKS AACGCGGTAAflGCCCGTTGCCXTTGATTTTTOCCTGATGATAAGTGACaTTTGCATTCCa 4000.

CAC/JffiCCTTCAGCTTCAGGCGCAimABATAWATTACIGMtTGAGCBCTCCGGTCAI 3420 IYAYYTMNKBHbBABYBGTT

TBLQLQAQKEMIT2I.BAPVI AA7ATACaCAACA/iCCaTCATaTTC7TTTCATTTAAaTOCGCTaAA7AAaAACCrrn7GQT 4740

caiacTaTTTCACAGcaTCGOAcracnflCcrrrMTaMAGAXATTaAiACMTCcacGC 3400 TILHIYYPHDAYIIKLBAQVD

YLYBBTQ.Lbi.bl.OaiB.TTp-.A ■ GGTTTCTAAATGGAYATATACAGGGCGaTCCGCATATCGTTCTAAAGATCCTTGCACATC 4000

CAAGCTGATTATGGAAAACACACTGCATCAATGTGCGAAAAAAAAGGTGACACAACTGTA 3G40 то111ТдтеА1саСТТТ HTOATOCTCCCClCrtlCX

TATTGATTTGTCAGGAGTACCTOTGATTGATACGATGGTTGCCCATCAGCTGTTCAGTCT 3630 TCfGTATGTAATTTGACCAGCTGATATTTCACAGCCGGTTCGAGCTGTGAATTCACAATG 4B20 IDbBafAYI-biMVAaGbiBI,

CGCTGAATCGCCGCAAAATATTTTTCCAGCATCGGTTT7CCGAGTCTTCGA70TG77CaT 491)0

»Егло-ЧПАЬБ ТТАТССААОАЯСТСААВАТСААЮаССТСТССТАСОИСТСТПСОТСАТСАТатаОаМЗЛО 6040

Я 11 И *.\Ь Е А Т А К Т 1ЕКПН1> Н ЕЬагЪ 011ЯЯ АХСВОТТАТТСеАААатаЛАЯСАТАвасТТТСАСТАТеТОТПАТСЛПаТССАТОаТСТ '5100

• МСБ11ХС1. 1ВМЬЧГ ТОСХССЕПА'ПЗТСТТАСАТАСАТаАААТаАТТАТАСАТЛАТАТАТССЛХСйОСТаЛААА 6160

ОССАААоаССТСААТОТСТТТГХ^ОаСССаТТТССАСТТСАОТТСТОААААСаТАААСА вгги

ЬААСаМГЯВГТГЛКООБГГК АаАпслооасАосссАТАТАССАпстаААтатАЛААогеттсомиттоАЛААтоапсл бюи

ВТТГЬ01Ь Ь1.1ТРА1Т0Ь1.а ТОТТАМСАААИОСССОАТСАасАООаТААТПОТСааСОСААТАТАТТОТААОАТЛССЯ 8340

V а У Ь Р Ь П К ЛОЕАГЬЬЬРЬАБ . лсттоАТЛСАатсасАпссягттазстсстгсстсАЛАслАТАЛолагааслмоссалА' 5400

ТСВОГЬВААТ В1лг» ОВТ11

АСАСАссдассАЛАЛлаАЕААаСАасслсатсссгссостттстаслсссастсастоАЛ ыои

САтатссвстеисАасАМТлссссААтаоипааслтАлтсАтаАЛтбтпссАасв 6520

ТТАААСООАТОасОСТСООСЛДаеттоГХС > 1111 ГОСТГАЛеСеДТАСАеСССААМасТ 5660. сг>

м

ОААТВСОАОСМаАЛаКСААШТААазААТЕЭАаССбТАТТаОАЛШСССАаАТОАТаАС 5640

и

АСОааСТаССВСААТСВАААОВаССАСТААГГДСАВОООАТТСАИ Л1Т ЬССТТТ 6684

Рне.31. Впиаоткдна* послелооатмшостк "в-овисгя-. Пот«кцна*ьки« саЯти сншваш» рибосом еоотвпстпюам о.р.с. 1-11' ПОДЧОрКЩГТЫ. Пом«д0ВаТОЛЫ!ОСТЬ Нз 13 П.О., заключенная в рамку, - сайт (р«}пнт«грамнй рк184. места неточной »ксцкэни обозначат Т«Н11 ХИ СИМВОЛАМИ, КАК И 1£Л рНС.22.