Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение некоторых вопросов "незаконной" рекомбинации у Bacillus Subtilis

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение некоторых вопросов "незаконной" рекомбинации у Bacillus Subtilis"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И.ВАВИЛОВА

На правах рукописи УДК 579.852.11:579.252.5 577.151.644

ЖВИНГИЛА Донатас Юстинович

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ВОПРОСОВ "НЕЗАКОННОЙ" РЕКОМБИНАЦИИ У BACULOS SUBTIIIS

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЮСКВА - 1991

Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР

Научные руководители: доктор биологических нгук,профессор А.А.Прозоров кандидат биологических наук В.И.Банкиров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.А.Тарасов

доктор биологических наук Б.Н.Ильяшенко

Ведущее учреждение: Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится " "_1992 г.

в ___ час. _____ мин. на заседании специализированного Ученого совета Д002.4Э.01 при Институте общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР по адресу : I17809 ГСП , Москва, В-333, ул.Губкина , 3

С диссертацией можно ознакомиться в бибклиотеке ИОГен им.Н.И.Вавилова АН СССР

Автореферат разослан * * 199 г.

Ученый секрктарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. "Незаконная" или негомологичная рекомбинация является одним из видов генетической рекомбинации. Как и все рекомбинационные события, "незаконная" рекомбинация вызывает рагного рода нестабильность в генно-инженерных конструкциях. Ввиду многообразия форм и ыеханизиов саа процесс "незаконной" рекомбинации изучен в недостаточной степени. Исследования "незаконной" рекомбинации в клетках Bacillus subtilis обусловлены евдЗ и тем, что сенная палочка всё шире используется в генетических работах, так как обладает рядом преимудаств (отсутствие патогеннссти, широкое применение в биотехнологии и др.) по сравнению с такии традиционно обгек-том, каким является Escherichia coli.

При изучении механизмов негоыологичиой рекомбинации у Е subtilis до сих пор остаётся открытым вопрос о влиянии длины участков гомологии на соотнопение систем гошлогичной и "нега^ конной" рекомбинации, не установлен нилшй предел гомологии, кебходимый для работы RecE белка

С другой стороны, некоторые события "незаконной" рекомбинации у В.subtilis,. видимо, вызваны опкбками функции белков, вносящих в молекулы ДНК одно-и двунитевыз разрызы (Bashkirov ot al., 1937,1988; Peijnenburg et al., 1986). К таким белкам относится и ДНК-гираза В.subtilis. Однако до сих пор ничего не известно о характере взаимодействия этого фермента с иолекулаш ДНК, о степени его сайт-специфичности по сравнению с аналогичным энзимом из Е-соП. Нэ изучался и вопрос участия ДНК-гираэы В. subtilis в процессе "незаконной" рекоьйинации.

Дели и задачи исследования. Целью работы было изучение некоторых аспектов "незаконной" рекомбинации у В.subtilis. В сея-

- г -

зи с этим в работе решались следующие задачи:

1) создание удобной системы, позволяющей изучить, как влияет длина участков гомологии на соотношение процессов гомологичной и негомологичной рекомбинации в клетках B.subtilis;

2) определение минимально;, длины участка гомологии, необходимой для работы RecE белка;

3) изучение степени сайт-специфичности ДНК-гиразы В.subtilis;

4) оценка вклада ДНК-гиразы В. subtil is в процесс "незаконной" иэжьалекулярной рекомбинации.

Научная новизна Установлена зависимость частоты рекомбинации от длины участков гошлогии при интеграции плазмиды в хро-шсоыу В. subtil is. Впервые определена усредненная последовательность сайта разрезания ДНК-гиразы В. subtil is. Показано, что существую? кэкоторш отличия в сайтах разрезания ДНК-гираз Rsubtllis и E-coll. Обнаружено, что координаты некоторых сайтов ДНК-гиразы В. subtilis in vivo совпадают с сайтами "незаконной" каклолзкуляркой рекй-йинации.

Практическая ценность. Создана тест-система для изучения рекомбинациошшх процессов у В. subtil is. Показана роль ДНК-ги-рьаы Е subtil is в процессе "незаконной" ыежмолекулярной рекомбинации, что позволяет понять некоторые случаи нестабильности генно-юшгнерных конструкций в клетках В. subtil is.

Апробация работы. Уатериали диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых ИОГен АН СССР (1990), на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Мэсква, 1.990), втором международном семинаре "Gene manipulations in Bacilli" (Holzhau, ГДР,1990), межлабораторном семинаре "йэдекулярные и клеточные механизмы генетических процессов" ИОГен АН СССР (1991). "

Публикации. Во материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 97 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, быеодов и списка литературы. В работе 20 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы включает 116 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы бактерий и плазмиды. В работе использованы следувдие штаммы: Е. coll НВ101; В. subtilis RUB834, BD170, BG314. В работе использованы следующие плазшды: pBJ?322, рЕ194, PJH101, pHV60-14, pUBHO, pBQO, р12, р17, р25, р77, р94, р121, р134. р150, р165, рЕрО, рЕр12, рЕр17, рЕр25. рЕр77, рЕр94, рЕр121, рЕр134. рЕр150, рЕр165.

Среды и реактива Для выращивания бактериальных культур попользовали мясопептонный бульон (ШБ). среду LB (Маниатис и др., 1984). Соответствующие плотные среда содерааги 1.62 агарз. В работе использовали советские и импортные реактивы.

Выделение хромосомной ДНК. ДНК выделяли мина-методой Скурсы ЕШО).

Выделение плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК выделяли палочник методом (Birnboim and Doly. 1979) и методом тепловой денатура-• ции (Holmes end Quigley, 1981).

Рестрикцию ДНК проводили различными рестрикцконными эндо-нуклеазами в условиях, рекомендуемых изготовителями ферментов.

Лигирование ДНК проводили ДНК-лигазой фага Т4 в течение 18 часов при 8-12°С.

Электрофорез ДНК проводился в трис-tcратной буфере в горизонтальной пластине агарозного и в вертикальной пластине поли-акриламидного геля.

Извлечение ДНК из агарозного геля проводили методом заш-

рахивания-оттаивания (Tauts and Renz, 1983) и по методу Дрет-вен с соавторами 'Dretzen et al., 1981).

Шченне ДНК и блогтинг-гибркдизацкя. дик метили используя метод "раосеяной затравки" (Feinberg and Vogelstein, 1983). Перенос ДНК из геля на нейлоновые фильтры проводили по методу Смита и Саммерса (1980) и путем электропереноса с последующей гибридизацией с меченой пробой (Маниатис и др., 1984).

' . Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводил)* по методу Шксама-Гильберта (Maxau and Gilbert, 1977) в тверда фазной модификации (Чувпило и Савченко, 1983).

Трансформацию клеток Е subtil is проводили по модифицировав ному методу Анагностополуса и Спицайзена (1961). E.coli транс формировали с применением хлористого кальция и хлористого руб)' дня (Kushner, 1978).

Излучение протопластов. Протопласты В. subtil is получали с применением лизоцима (Chang and Cohen, 1979).

Определение ^-глюконазной активности. Активность этого фе£ манта определяли по способности гидролизовать углевод ляхенин (Borris and Zeirek, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние длины гомологии на интеграцию плазмидной ДНК в хромосому В. subt i 1 i s.

Интеграция плазмид в участок хромосомы бактерии, не имеющий протяжённой области гомологии с плазмидной ДНК, является одним из случаев "незаконной" (негомологичной) рекомбинации. Цутём секвенирования сайтов интеграции было показано, чтб в них гомология или вобще отсутствовала, или была незначительной (Хасанов и др.. 1985; Prozorov et al.. 1985; Bashkirov et al., 1987). Однако вопрос, при какой длине гомологии встраива-

-5- ,

hug плаз мзды в хромосому В. subtil is идёт только по пути "незаконной" рекомбинации, а при какой "включается" и система гомологичной рекомбинации оставался нерешённым.

1.1. Создание тест-системы для анализа клонов-интегрантов.

Чтобы определить, каков нижкнй предел гомологии, необходимый для гомологичной рекомбинации в клетках В. subtil is, мы сконструировали серию плазмид, несущих фрагменты гена j-глюко-назы B.subtilis (Mjrphy et al. 1984) разной длины . Для этих экспериментов мы использовали плазмиду pHV60-14, состоясую из плазмиды pHV60 (Michel et al., 1983) с клонированным по EcoRI сайту 4.2 т. п. н. участком хромосомы В. subtil is, содержащем bglS ген (рис. 1). Затем EcoRV-Sall фрагмент (165 п. н. ) белок-кодирующей части последовательности bglS гена из плазмиды pHV60-14 переносили в плазмиду ELcoli pJHlOl (Ferrari et al., 1983) на место удалённого EcoRV-Sall участка этой плазмиды (рис. 1). Полученная таким образом плазмида р165- была первой в создаваемой нами серии плазмид. Чтобы получить векторы с укороченными вариантами EcoRV-SalI фрагмента bglS гена, ДНК плазмиды р165 разрезали рестрикционной эндонукяеазой EcoRV и полученные линейные молекулы обрабатывали нуклеазоЯ Ral31. Укороченные варианты плазмид "сшивали" сами на себя ДНК лигаэой фага Т4. Длину укороченных фрагментов участка bglS гена определяли путём секвени-рования ДНК Таким способом были получены плазмиды р150, р134, р121, р94, где длины фрагментов bglS гена составляли 150, 134, 121 и 94 п. н. соответственно. Плазмида р77 была получена путём клонирования Aval-Sail фрагмента плазмиды рЮ5 на место делети-ров.анного EcoRV-Sali участка плазмиды pjHiOl. Участки bglS гена длиной 12, 17, 25 п. н. были синтезированы химическим способом. После их клонирования в EcoRV сайт pJHIOl, были получены плазмиды р!2. pi?, р25. Ориентацию клонированных участков определя-

Pij pJHIOI

Рис. 1. Схема экспериментов по конструированию плазмид рп и рЕрп на примере р1б5 и рЕр165.

Сайты узнавания некоторых рестрикционных эндонуклеаз обозначены: Е - EcoRI, EV - EcoRY, Р - Pstl, S - Sali, X - Xbal. bglS - ген р-глюконазы В.subtilis .

- 7 -

ля при помоиде секЕенирования ДНК

Чтобы можно было эффективнее проводить отбор интегрантов в хромосому В.subtilis, все полученные гибр'/дные плазмиды легировались по Pstl сайту с плазмидой pS194, имеющей ts-pen.'ui:îon (рис. 1). Таким образом, была получена серия плазмид рЕра. Структура полученных плазмид показана на рис. 1, на примере рЕр165. В качестве контроля использовали гибрид рЕ194 и pJHlOl - рЕрО. Эта плазмида не имела участков гомологии с хромосомой В. subtilis.

Наличие ts-репликона позволяло проводить селекцию интегрантов в хромосому на среде МПА с эритромицином при непермиссивной температуре (52°С), так как рост клеток, имеющих пдазмиду в автономном состоянии, при этих условиях сильно подавляется. Количество интегрантов оценивали после 24 часов роста клеток. На рис. 2 показана зависимость частоты рекомбинации от длины участков гомологии между плазмидой и хромосомой бактерии. Каждая точка представляет среднее значение, полученное из трех и более опытов. Частоту рекомбинации вычисляли как отношение числа колоний выросших на селективных чашках при 52°С к общему числу клеток в 1 мл.

Из данных, приведённых на рис. 2 видно, что минимальная длина гомологии между участками плазмиды и хромосомы В. subtilis, при которой ещё идёт эффективная рекомбинация приблизительно равна 70 п. н. Ниле этого предела образование интегрантов, видимо, происходит за счёт "незаконной" рекомбинации.

1.2. Определение типа интеграции плазмид в хромосому.

При интеграции плазмид серии pRpn в хромосому могут образовываться интегранты двух типов в зависимости от того, по какому пути произошла рекомбинация. Если встраивание происходило в разные участки хромосомы за счёт негомологичной реком-

(10~6)

U

Сц с

и 5 ®

s*

* « о

8 з

ÍT

20 69 18В ив 188 Длина гомологии /п.н./

Рис. 2. Зависимость частоты интеграции плазмид в хромосому В. eubtilla от длины участков гомологии. Пунктирной линией указан уровень "незаконной" рекомбинации, выраженный частотой образования bgl+ кнтегрантов.

"12 3 4 5 б 7 8 К

4.2 т.п.н.

Рис. 3. Блоттинг-гибридизация хромосомной ДНК В. subtills

BD170(pEp94) из bgl+ (1-4) И bgl" (5-8) интегрантов, рас-оо

щеплённой EcoRI, с Р-меченым EooRI-BglIl фрагментом гена р-глюкояазы В.subtills. К - хромосомная ДНК из бесплазмид-ного штамма. В.subtills BD170, обработанная EcoRI.

бинации, го функция bglS гена не нарушалась. В результате гомологичной рекомбинации плазмида при интеграции нарушала це-. лоетность bglS гека, что приводило к его инактивации. Колонии с интактным геном образовывали ка селективной среде крупные зоны гидролиза лихенина, которые выявляли путём окрашивания чашек с клонами ингегрантов с помощью 0.1Z конго красного. Та-. кие колонии мы обозначали bgl*. Для каждого варианта плазмид рЕрп проверяли ^-глюконазную активность у 150 клонов-иитегран-тов. Оказалось, что при длине гомологии до 25 п. н. гее ингег-ранты были bel*, т. е. образовались за счёт "незаконной" рекомбинации. У интегрантов плазмид рЕр77, рЕр94, рЕр121, рЕр134, рЕр150 и рЁр165 процент bgl~ клонов составлял соответственно: 59.8%, 82.3%, 94. 4Z, 95.0X, §7 77., 98.2%. Исходя из полненных данных, и данных приведенных на рис. 2, ми определили частоту "незаконной" рекомбинации для каадой плаэмидн серки рЕрп. 3 среднем она была равна 1. 2x10"?.

Справедливость того, что тест на расщепление лихешша адекватно отражает рекомбинационные события, происходите в клетке R'subtilis, была подтверждена результатамиблотти.чг-гкбриди-зации хромосомных ДНК из 4-х bgl* и 4-х Ь^Г клонов, обработанных рестрикционной эндонуклсазоЯ EcoRI, с 5гР-меченым EccRV-Bgl 11 фрагментом fcglS гена У bgl" клонов в хромосомной ДНК отсутствовал фрагмент в 4.2 т. п. н., соответствуй;-.^ участку с bglS геном в bgl+ клонах и в хромосомной ДНК из контрольного штамма, не несущего плазмиды (рис. 3).

Таким образом, мы определили, 4vo минимальная длина гомологии, при которой интеграция плаз.«ид а хромосому В. subtiJ lis происходит за счёт системы гомологичной рекомбинации, составляет примерно 70 п. н. При длинах гомологии менее 70 п. н. эта система не эффективна, и интеграция происходит за счет

"незаконной" рекомбинации с различными участкам хромосомы. Вашкировым и соавторами (Bashkirov et al., 1987) было показано, что интеграция плазмид происходит либо по участкам короткой гомологии между плазмидой и хромосомой, либо по участкам, где гомология полностью отсутствовала. Если интеграцию плазмид в хромосому за счёт коротких участков гомологии можно объяс-я нить при помощи модели ошибочного спаривания (Albertini et al., 1982), то возникновение интегрантов второго типа невозможно объяснить таким механизмом. Предполагается, что такие случаи "незаконной" рекомбинации связаны с ошибками белков, разрезающих и лигирувдис молекулы ДНК. К таким белкам относятся и ДНК топоизомеразы.

2. Изучение сайт-специфичности ДНК-гиразы В. subtiUs.

Как известно, ДНК-гираза, бактериальная топоизомераза II, осуществляет суперспирализацию молекулы ДНК путём внесения временного двухцепочечного разрыва в дуплекс ДНК с последующим залечиванием образовавшейся бреши (Geliert et al., 1976а; Cozzarelli, 1980; Geliert et al., 1983). Способность гиразы катализировать разрыв и воссоединение цепей молекул ДНК дала возможность ряду исследователей предложить гипотезу о непосредственном участии гиразы в "незаконной" рекомбинации и получить ряд подтверждений in vitro на модели рекомбинации между ДНК фага лямбда и плазмиды pBR322 ( lkeda et al., 1982-, Nat to et al., 1984).

К настоящему времени имеются данные об сайтах "незаконной" рекомбинации в клетках В. subtilis (Bashkirov et al., 1988; Dempsey and Dubnau, 1989). Однако до сих пор ничего неизвестно о сайт-специфичности ДНК-гиразы В. subtilis.

2.1. Определение нуклеотидных последовательностей некоторых сайтов разрезания ДНК-гиразы В.subtilis.

- 11 -

Прежде всего мы сконструировали челночную плазмиду pBGO, на которой и проводили исследования сайт-специфичности ДНК-гиразы В. subtil is. При создании этой плазмиды мы "сшивали" плазмиду Е.coli pBR322 (Süteliffe, 1978) ДНК лигазой по уникальному EcoRI сайту с ДНК плазмиды pUBllO (Банкиров и др. 1986) из Staphylococcus aureus. Протопластированные клетки В. subUlis RUB834, несущие плазмиду pBGO, обрабатывали оксоли-новой кислотой (300 мкг/мл) при 37°С в течение 15 мин. Протопласты лизировали добавлением 400 мкл 10Z додецилсульфата натрия. Лизат обрабатывали протеиназой К. чтобы элиминкрозатъ А субъединицы ДНК-гиразы, которые связаны ковалентно с 5'-концом линеаризованных молекул ДНК (Sugino et al. 1980). В результате действия оксолиновой глслоты около 1/3 плазмидных молекул линеаризовалась. В отсутствии антибиотика линеаризация не наблюдалась. Линейная форма плазмидной ДНК выделялась из агарозного геля и после очистки обрабатывалась ДНК полимера-зой I (фрагмент Клёнова) для достройки тупых концов. Затем такую ДНК "сшивали" с линкером уникальной для данной плазмиды рестрикционной эндонуклеазы (в нашем случае Xhol). Под действием ДНК-лигазы линейные молекулы приобретали кольцевую форму и несли на месте разрыва Xhol линкер. Лигированной смесью трансформировали клетки Е. coli НВ101. Было отобрано 150 TetR и 150 Amp колоний. Оказалось, что около 50t клонов содержат плазмиды с Xhol сайтом. 40 плазмид, которые отличались от pBGO только наличием Xhol сайта, были взяты для точной локализации места встройки линкера. Путём секве'нирования были установлены нуклеотидные последовательности, непосредственно окружающие Xhol-линкер. Оказалось, что у 38 плазмид произошла дупликация 4-х пар оснований, прилегающих к последовательности Xhol. Наличие дупликации 4-х пар оснований указывает на образование in

vivo при индукции оксолиновой кислотой разрыва с 5*-выступающими концами длиной в 4 нуклеотида Такой хеоактер разрезания свойственен ДНК-гиразе Е.coli (torrison and Ççzzarelli.,, 1979). Таким образом, при действии ДНК-гиразы В. subtil is происходит симметричный надрез цепей дутяекса ДНК со смешением в 4 нуклеотида.

У одной плазмиды была обнаружена дупликация 1 пары оснований в позиции 405 карты pBR322 (Sutcliffe, 1978), а у другой - 5 п. н. в позиции 3682-3686 карты pUBllO (Банкиров и др., 1986). Нуклеотлдные последовательности и координаты остальных секвекироканных гиразных сайтов показаны на рис. 4. Как видно из рисунка, 38 плазмид представляют 30 разных сайтов: 14 из них расположи« на ДНК pBR322 .а 16 на pUDllO части плаз ¡.яды pBGO. Некоторые сайты встречались более одного раза. Например, гираз-кый сайт в позиции 2038 плазмидной карты pUBllO встречался в трёх секвенкрованкых плазмидах - pBG37, pBG48, pBG76.

Таким образом, определив нуклеотидные последовательности ряда сайтов ДНК-гиразы В. subtil is, мы обнаружили, что некоторые из них встречаются более часто, чем другие (рис. 4). Это может быть связано с относительной "силой" гиразного сайта Некоторые из них, возможно, являются более предпочтительными для молекулы ДНК-гиразы. С другой стороны, это может быть связано с действием антибиотика, применяемого для селекции клонов, на выживаемость некоторых групп трансформантов (Lockston and Morris,1985).

2.2. Картирование гиразных сайтов на плазми'де pBGO.

Для того, чтобы определить относительную "силу" сайтов ДНК-гиразы В. subtil is. мы использовали методический подход, разработанный ранее (O'Connor and Malamy, 1985). Он позволяет картировать гиразные сайты in vivo. Для этого тотальная ДНК штамма В. subtil is RUB834, несущего плазмиду pBGO, после обработки оксолиновой кислотой и додецилсульфатом натрия, подвергалась дейст

а)

pBG

(pBR322)

M (6)

11

(244) 61

(1460) 1

(1598) 14

(1743)

AGGAAT | TCTC ATGTTT TCCTTA AGÄtJl ТАСААА

CGCTAT|ATGC GTTGAT GCGATA TACGICAACTA

GCGCATIGATC GTGCTC CGCGTA CTAGlCACGAG

ATGAAT|GGTC TTCGGT TACTTA CCÄGlAAGCCA

GGCATTIGACC CTGAGT CCGTAA CTÜGlGACTCA

58 GOGGATlGAAC AGGCAG

(2012) CGCCTA CTÍtílTCCGTC

65 GCGGGT|GTCG GGGCGC

(2202) CGCCCA CAGCICCCGCG

45,64 AACTATlCCGG CATCAG

(2263) TTGATA CGCC1GTAGTC

57 GAGAGTIGCAC CATATG (2292) CTCTCA CGTGIGTATAC

20,69 TAATAC|GGTT ATCCAC (2438) ATTATG CCAAITAGGTG

53 AGGАЛА|GAAC ATGTGA (2477) TCCTTTCTTG|TACACT

70 ATATATIGAGT AAACTT

(3274) TATATA CTCAITTTGAA

27,50 TTACATIGATC CCCCAT

(3689) AATGTA СTAG|GGGGTA

68 CAGTGTITATC ACTCAT

(3772) GTCACA ATAG|TGAGTA

pBG

(pOBUB)

СЯ

(387) 35

(1306)

9

(1545)

10

(1559)

37,48,76 (2038)

43

(20S2) 5

(22G3) 71

(22ЕЭ) 75

(2504)

33

(2631) 4

(3310) 55

(3683)

0,25,29 (3753)

72,73 (4152)

66

(4237) 22

(4420)

CTTTATIATTC'ATAAAG GAAATA TAAülTATTTC

TTTTAA|GCAC ACCCTT АЛЛАТТ CGTGITGGGAA

CATTACIGAAC TGGCAC GTAATG CTTGIACCGTG

ACAGAT¡GGTC ATAACC TGTGTA CCAGITATTG3

GAATAGIGGCC CATCAS CTTATC ШЙЛ G7AGTC

CCAAGA|GAGC CATAAA GGTTCT Cf^lGTATTT

GACCCA[ТААЛ CACCAA CTCGGT AfñHGTSGTT

CCTAtJd ICATC C7TCAA GGATTC <Ш?ПСАЛаТТ

ССАТАЯ |C/,SA TTAACC GGTATC cicrl AATTOJ

CCGATT1GTAT ATCCGА CG СТАЛ CATA1 TAÍJGCT

TATTAGtGACA,CATAA7 ATAATC CTOTiGTATTA

TGCTGT1TTTA ТССУТГ ACQАСЛ AAATlAGGAAA

CTGTAClGTTC СТТЛА8 GACATG CAAÜIGAATTC

GCTGGTt ACTT CTAAAT CGACCA TGAAlGATTTA

AAAATC|AATC ТСТТТГ TTTTAG TTAG"|AGAAAA

ACGCAT|AGGC ACAACA TGCGTA.TCCG|TGTTGT

6)

5' . . .Nr N. 3'...H N

Kd Ко N N.

INb N. N N

NN tU Nbl

N N H...3' Na H. Hr..5'

Рис. 4. Нуклеотидние последовательности сайтов ДНК-гираэы Bacillus subtilis in vivo.

вию соответствующих рестрикционных зндонуклеаз. В результате этого должны образоваться фрагменты ДНК определённой длины. Один конец такого фрагмента образуется под действием ДНК-гира-зы, а другой - под действием рестрикционной эндонуклеазн. Образовавшиеся фрагменты ДНК разделяли посредством электрофореза в 52 полиакрнламидном геле. После электропереноса на нейлоновую мембрану фрагменты ДНК выявляли путём гибридизации с соответствующим ЗЗр-уеченцу зондом. Длина фрагментов, выявленных после экспозиции на радиоавтографе, соответствует расстоянию от сайтов ДНК- гиразы В. subtilis до сайтов узнавания соответствующих рестрикционных зндонуклеаз. В качестве стандарта длины служили 32р-меченые Мзр1 фрагменты плазмиды pBR322.

Для приготовления гибридизационных зондов использовали набор 19 коротких рестрикционных фрагментов ДНК размером 298-1034 п. н., перекрывающих нуклеотидную карту плазмиды pBGO.

Таким образом, были картированы наиболее "сильные" гиразные сайты на плазмидах pBR322 и pUBllO с точностью ± 10 п. н. На плаэниде pUBllO было картировано 69 сайтов, а на плазыидэ PBR322 - 60 (рис. 5а,б). В среднем один сайт приходился на 70 п. н. Надо отметить, что после более длительной экспозиции появлялись дополнительные полосы гибридизации, соответствующие "слабым" сайтам разрезания ДНК-гиразы. Некоторые из них указаны на рис. 5а, б пунктирными линиями.

2.3. Определение усреднённой последовательности сайтов разрезания ДНК-гиразы B.subtllis.

Сравнение локализации основных сайтоз разрезания гиразы с данными на рис. 4 позволило установить относительную "силу" сайтов, определенных в результате секвенирования ДНК (рис. 6).

Сравнение нуклеотидных последовательностей 30 сайтов разрезания ДНК-гиразой В. subtilis плазмид pUBllO и pBR322 in vi-

I 11л»

»3 §

а 8

а

5

Рис. 5. Расположение гиразных сайтов на плазмяцах Рив110 и

рВ11322. | _ «сильные" сайты ДНК-гиразы,

сайты ДНК-гиразы с известными нуклеотидными последовательностями, - "слабые" сайта ДОК-гиразы В. зиЪи11з.

г 16 -

caí

titln »Hill

lene Cía НФш ala

I -1 -I i -4 -J С I 1 т II) (6)

u

» Ш([1) I 15(5(1) U ISSiílJ n.il.U 2111(1)

317(1} S i I i

u i и n

II 4

55

ÍK2(1) ИИШ ИИШ Cl«ll »31») 331«(») Ul)(»

12, TJ

ti

22

lltiit

ti 11 11

1

H 51

u

15,M

ir

21. И

Я

Ii

:т,ы к

1,25,1» 3751(1) S

«ИИ) СЯП) «ЭДН

((I) t

Ulli)

H5I¡1)

1591(1) S

ШК1) 2112(1) Ш(!) 22íl(l)

I2J2(1| S

201(1) ■ИЩИ 1271(1)

3S35(» s »T2(u s

с i i i i с

5 I t

( с ? с т ! t TT T t С С

с

с

I i I

Т G С

С Т Т

С С I

1 1 1

I S т

1 1 С i I I

т с

I I 1 I

1 1

Í с

С S

I с С I с с с с с с 1 с i с 1 i

I I 1

С 1 I

1 i с

С 1 т

1 1 т 1 1 с i ( i 1 1

с т т 1 г с т т

С 1 I 1 С I

U 2111 <1 И IT 27

Ц 18 23 23 31 51 7

И 38 U 27 11 11 53

(С 17 2! И 21 3 7

■2 -1 41 (2 С 1 т С

с т { 1

1 Í С i I т ( т с т 1 1

т с с с ! 1

С 1 С 1

SI 13 17 11

3 (3 21 21

7 13 17 21

I 21 17 (1

»3 И »5 ' t7 »I 1 Т I С

(С) (1)

I г с с т I 1 с с с т с с г с т с с с т т с с с

С С 1 с

С ! С

1 к

с с

С 1

т с 1 с

С I I I I т

С I с

17 1С 17 II 21 33 37 21 33 27 11 7 21 57 31 II 11 37 21 13 21 <7 17 23

Рис. 6. Определение усреднённой последовательности сайта разрезания ДНК-гиразы Bacillus subtilis. Представлены нуклеотицные последовательности 30 in vivo гиразных сайтов. Все цепи даны в направлении от 5'к У. Представлены либо прямая (D), либо обратная (I) нити ДОК плазмид pUB11 (MpBR322. Е'обозначает пурин, y -пиримидин, :í - лдабое основание. Основания, показанные в скобках, имеют вторичную предпочтительность. Относительно сильные сайты обозначены буквой si а слабые - w. Место разреза, вносимого ДНК-гиразой в представленную на рисунке цепь, отмечено сплошной вертикальной линией.

vo позволяет вывести ряд правил, которыми, вероятно, "рука-водствуется" гнраза при выборе места разрезания. Для вьшедения обобщенной последовательности рассмотрена возможность наличия двойной симметрии относительно сайта разрезания. Был подсчитан нуклеотиднкй состав для каждого симметричного положения, обозначенного буквами на рис. 4 б. Ог-азалось, что в положениях a, d предпочтительны пурины, в положении b - гуанин, а в положениях с и f - тишн (гуанин). Эти особенности наиболее выражены у "сильных" гиразных сайтов (рис. 6).

С другой стороны, сайты, разрезаемые ДНК-гиразой E.coli in vitro и in vivo, имеют асимметрии по крайней кюре одна из цепей ДНК содержит преимущественно Т (реже G) с 5*- и 3'-стороны разреза (Morrison and Сог^агеIii, 1979; Lockshon and Morris, 1985). Такое se свойство сайтов гиразы B.subtills заметно даже при беглом просмотре последовательностей. Руководствуясь этими симметричными и асимметричными правилами, цепи ДНК 30 сайтов, разрезаемых ДНК-гиразой В. subtil is, были соответствую- ' щим образом сориентированы (как представлено на рис. 6). Это. позволило вывести обобщённую последовательность гиразно-го сайта (показана на рис. б). Видно, что представленная последовательность сайта разрезания ДНК-гиразы В. subtil is в основном симметрична, хотя нуклеотидный состав в каждом положении сориентированных по правилам цепей (рис. б) выявляет до* полнительные асимметричные особенности: правило (С, А)+6 сильнее выражено, чем симметричное ему (G, Т)-б; правило 02 выражено слабее, чем G-2; R-4 выралено лучше, чем Y+4.

Последовательность обобщенного :аЛта ДНК-гиразы В.subtills похожа' в центральной части на последовательность сайта разрезания ДНК-гиразы Е.coli: .

5'-MlNRN^GRYCjtYNYNGNY-3' (Lockshon and Morris. 1985).

Последняя имеет такие более строгие асимметричные правила, как С+2, (Г, G) +3, (в, Т)+8, которые не выявляются в сайтах ДНК-гиразк В. subtilis. Выявляемые сходства и различия в последовательностях разрезания гиразой из грам-отрицательного и грам-положительного микроорганизма отражают, по-видимому, как. эволюционное родство, так и имеющиеся специфические особенности каждого фермента. Об этом свидетельствует, в частности, мень-тая молекулярная масса ДНК-гиразы В. subtilis по сравнению с гиразой E-coli и отличия в антигенных свойствах двух белков.

Сопоставление координат гиразных сайтов, нуклеотидные последовательности которых установлены в данной работе, с координатами сайтов, в которых происходила межмолекулярная "незаконная рекомбинация на плаз«идах pUBllO и pBR322 (Bashkírov et al., 1087,1988) показывает, что только один сайт рекомбинации (ffl81) из 0 на плазмвде pUBllO (Bashkírov et al., 1988) точно совпадает с гиразныы сайтом с установленной нуклеотидной последовательностью, в положении 4420 (рис. 6). Ещз 2 других ре-комбинационныа сайта (tri 01 на pBR322 и "сильный" ре комбинационный сайт р81 на pUBllO) точно коррелируют с гиразными сай-. . гама в позициях 220 и 35 на соответствующих ллаэмидных картах (рис. 5а,б). Интересно отметить, что 2 "слабых" сайта ДНК-гиразы Еsubtllis на pBR322 (координаты 244 и 2263, см. рис. 4а) совпадают с сайтами "незаконной" рекомбинации у Е. coli in vitro в положении 240 (Naito et al., 1984 ) и in vivo в положении 2263 (King et al., 1982).

. Таким образом, на основании приведенных ¿ыше данных можно считать, что определённая часть "незаконных" рекомбинантов в клетках В.subtilis могла образоваться в результате действия ДНК-гиразы. Для более убедительного доказательства необходима большая выборка рекоьйинационных сайтов.

ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система для изучения процессов негомологичной и гомологичной рекомбинации при интеграции плазмид в хромосому Bacillus subtilis. -

2. Установлено, что по меньшей мере при длине гомологии до 25 п. н. рекомбинация между плазмидой и хромосомой В. subtil is происходит исключительно за счёт "незаконной" рекомбинации. Минимальная длина гомологии, необходимая для гомологичной рекомбинации у В. subtil is, приблизительно равна 70 п. н.

а Картированы основные сайты ДНК-гиразы В. subtilis на геномах плазмид pUBllO и pBR322 in vivo.

i. Определены-нуклеотиднь'е последовательности ряда in vivo гиразных сайтов В. subtil is. Впервые установлена усредненная последовательность сайта разрезания ДНК-гкразы этого иикроор-ганизма. Шказано. что имеется ряд отличий в сайг-спещфпное-ти ДНК-гираз из Е.С011 и Rsubtllis.-

5. Обнаружена корреляция между рядом сайтов "незаконной" межмолекудярной рекомбинации'у В. subtilis и некоторым! сайтами разрезания ДНК-пфазы, чго свидетельствует о тон, что определённая часть событий "незаконной" рекомбинации j Е subtilis связана с участием ДНК-гиразы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Башкиров ЕИ., Евингила Д.Ю.. Нуклеотидньа последовательности, разрезаемые ДНК-гиразой Bacillus subtilis in vivo. // Тезисы VII Всесоюзного симпозиума "),пекулярные механизмы генетических процессов" ( ¡foc kr а, 1990)."

2. Zvingila D.J., Bashkirov V. I. Sequence specificity of

Bacillus subtilis DNA gyrase in vivo. // Abstracts of Second Workshop on "Gene manipulations in Bacilli '.Holzhau/Erzgebirge, GDR - 1990.

3. Бажиров E И., Жвингила Д. JCt Нуклеотидные последовательности, разрезаемые ДО1л-гиразой Bacillus subtilis in vivo. // Доклады АН СССР. - 1991. - Т. 316. N 5. - С. 1257-1261.

4. Жвингила Д Ю., Башкиров Е И. Исследование роли ДНК-ги-равы Bacillus subtilis в процессе межмолекулярной незаконной рекомбинации. // Молекулярная генетика, микробиол. и вирусов - 1991. - N 8. - С. 23-25.

5. Bashkirov V. Г., Zvingila D. J. Sequence specificity of Bacillus subtilis DMA gyrase in vivo. // Genetica - 1991. (in press)..

6. Хасанов Ф. К., Евингила Д И., Зайнуллин А. А., Прозоров А. А., Башкиров Е И. Определение минимальной длины гомологичного участка ДНК, необходимой для интеграции плазмид в хромосому Bacillus subtilis посредством гомологичной рекомбинации. // Генетика.- 1S31 (в печати).

7. Khasanov F. К.. Zvingila D. J., Zainullin А. А., Prozo-rov А. А., Bashkirov V. I. Homologous recombination between plas-mid.and chromosomal DNA in Bacillus subtilis requires approximately 70 bp of homology. // Mol. Gea Genet. - 1991 (in press).

Заказ № 292 от 5.12.91 Г.

тираж 100 экз.

Отдел печати хиы.ф-та bilí