Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы, влияющие на эффективность Р-элемент зависимой трансформации DROSOPHILA MELANOGASTER и анализ трансформированных линий

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Факторы, влияющие на эффективность Р-элемент зависимой трансформации DROSOPHILA MELANOGASTER и анализ трансформированных линий"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМЕНИ В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

РГ6 од

На правах рукописи УДК 595.773.4

ПРОХОРОВА

Алла Владимировна

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ Р-ЭЛЕМЕНТ ЗАВИСИМОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ОЯОБОРШЬА МЕЦШООАЗТЕЯ

И АНАЛИЗ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЛИНИЙ

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степеии кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Лаборатории функциональной морфологии хромосом (заведующий лабораторией, доктор биологических наук, профессор А. В. Зеленин) в Институте молекулярной биологии имени В. А. Эигельгардта РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук В. Е. Барский; кандидат биологических наук Н. Г. Шосгак.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук Л. И. Корочкин;

доктор биологических наук Н. А. Чуриков.

Ведущая организация — Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова. Биологический факультет.

Защита состоится « г// » . . . . 1994 г.

в «/У^ часов на заседании диссертационного ученого совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В. А. Эигельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Эигельгардта.

Автореферат разослан «

.4Г. » 1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А. М. Крицын

ВВЕДЕНИЕ

Разработка техники устойчивой интеграции экзогенной ДИК в геном организма-реципиента считается одним из важнейших достижений в области молекулярной биологии и генетики. Особенно плодотворной оказалась эта техника при работе с таким классическим объектом, как Drosophila melanogaster. Для трансформации дрозофилы используют векторы на основе одного из мобильных элементов дрозофилы, а именно Р-элемента. Впервые эта возможность была продемонстрирована Спрадлингом и Рубином. В первых же работах было показано, что семейство Р-элемснтов может быть использовано для интеграции в геном дрозофилы экзогенной ДНК [Spradling A Rubin,1982, 1983 ]. Этот подход позволяет достигать высокой эффективности трансформации и получать линии, несущие в своем геноме фрагменты ДИК с разным генетическим содержанием. Интеграция осуществляется в стволовых клетках зародышевого пути после микроинъекции соответствующих векторов в полярную плазму ранних эмбрионов дрозофилы [La ski et.al., 1986]. Используя разработанный подход, в геном дрозофилы вводили самые различные гены как самой дрозофилы, так и других организмов. С помочью Р-злемент зависимой трансформации изучалось влияние ¿труктуры промотора и самого гена на эффективность его проявления, выявлялись регуляторные последовательности генов, влияющие на экспрессию интегрированных копий, а также изучалась экспрессия химерных генов, сконструированных генно-инженерными методами [ Shermoen et al.,1987;Mann et a 1.,1990;Grunder et al.,1993J. Однако, ряд вопросов, связанных с самой техникой трансформации, оказался недостаточно изучен. Кроме того, для каждого интегрированного гена представляет интерес изучение взаимодействия его с мутантными вариантами самих генов дрозофилы.

Цель и задачи работы: В настоящей работе была поставлена цель: на конкретных генетических моделях отработать условия эффективного и надежного метода интеграции ДНК в геном дрозофилы и изучить закономерности проявления маркерного гена

"mini-white" в трансформированных Линиях. В связи с этим были сформулированы следующие задачи:

1. Оптимизация техники Р-элемент зависимой трансформации дрозофилы с целью повышения выживаемост-н инъецированных особей.

2. Изучение эффективности проявления фенотипического маркера 'mini-white" в зависимости от места его интеграции.

3. Изучение взаимодействия интегрированного гена "mini-white" с мутангным геном lozenge в-зависимости от взаиморасположения этих генов.

Научная новизна работы: 2 ходе работы обнаружено, что дестабилизация мутантного локуса sn при Р-элемент зависимой трансформации Drosophila me 1 anegaste г и интеграция транспоэона являются независимыми событиями. Показано, что устойчивость к антибиотику ( 8 у потомков мух, инъецированных векторами, содержащими ген "neo", не всегда связана с истинной интеграцией этого гена в геном. На основании анализа сайтов интеграции транспоэона CaSpeR сделано заключение о том,, что вектор-помощник, источник транспозазы, может функционировать в эписимальксм состоянии в ряду нескольких делений стволовых клеток зародышевого пути трансформантов G0 . Разработана ие-радиоактивная методика гибридизации in situ ДНК, меченной диетилентриаминохлорплатиной (диенП), с политенными хромосомами дрозофилы. Обнаружено супрессорное влияние мутантного локуса lzb реципиентиой линии . на эффективность проявления интегрированного гена "mini-white".

Практическая ценность работы: Получены 129 независимых сублиний, содержащих интегрированный транспозон CaSpeR с геном "mini-white". Эти сублинии представляют интерес для дальнейшего изучения экспрессии гена "mini-white" и его взаимодействия с мутантным локусом lzb. Предложена новая среда для проведения инъекции и инкубации инъецированных эмбрионов. В опытах по гибридизации in situ на политенных хромосомах опробована оригинальная методика модификации ДНК- зондов. Эта методика рекомендована для использования при скрининге большого числа клонов вследствие быстроты получения ответа.

Апробация работы : Результаты работы были представлены на VI Всесоюзной конференции по биологии и генетике дрозофилы (Одесса, 1989), на конкурсе молодых ученых Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта (Москва, 1989), на III конференции "Геном человека 1993" (Черноголовка, 1993), на семинарах лаборатории функциональной морфологии хромосом ИМБ.

Структура и обьеы работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена па 75" страницах машинописного текста, содержит о таблиц, 22 рисунков и U5 названий библиографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЯДЕНИЕ 1. Влияние различных факторов на эффеитмвноеть трансформации.

Для успешной интеграции экзогенной ЛИК в геном Drosophila melanogaster суиестсены два комплекса факторов, а именно: факторы, непосредственно алияюэде на процесс встраивания тракспозсна в хромосомы (размер переносимой конструкции, состояние генома реципиентной линии, степень активности ферментной системы, обеспечивающей инсерцию транспозона и т.д.: Karess, 1983; Ким и др., 1991), и факторы, обусласливающие яизнеспособность эмбрионов после инъекции (условия транфор-мации для создания необходимой по численности популяции инъецированных имаго G0 , в потомстве которых предполагается вести поиск трансформантов).

1.1 Влияние структуры вектора - источника активной транс-поз азы~ на различные этапы трансформации.

Сравнивали действие векторов, автономных Р-элементов: ртг 25.1 и рС( ( гу* )&2—3 ], структура которых указана на рис.1 (N1 и 2),м неавтономного Р-элемента: pn25.7wc [Karess к Rubin, 1984]. Трансформацию проводили микроииъекцией ДНК в полярную плазму ранних эмбрионов линии у* sn" sew® Drosophila melanogaster. "Мишенью" для транспозазы являлись две копии дефектного неавтономного Р-элемента в локусе sn. Имаго G0 скрещипали индивидуально с исходной линией. Потомство от

rtfsy

- IV ! . Г

Ы

i y¿g-

sv рис

Ш

3L

pixs SP

рис.1. Структурные схемы векторов:

1. Автономный полноразмерный Р-элемент: ртг25.1 [Spradling & Rubin,1982];.

2. Автономный Р-элемент без интрона между 2-м и 3-м экзо-нами: рС[ ( гу+)Д2-3] [ Laski ,19S6J;

3. pUCnsn neo [Steiler к Pirrotta, 19851;

4. A4x neo [предоставлен Ю. В. Ильиным - ИМБ РАН);

5. леоД4л [предоставлен Ю.В.Ильиным - ИМБ РАН].

□ - ген пеог под промотором гена hsp70; а - последовательность плазмиды pUC»; о - концевые повторы Р-элементаж V - полилинкер.

о

скретиваний (в ) анализировали на наличие мутантных признаков по появлению фенотипа! 8П* и вп* . Эффективность трансформации оценивали по доле мутантных мух С0 в 96%, давших трансформированное потомство, от общего числа фертильных инъецированных особей.

Таблица 1. Эффективность трансформации линии у* бп" ее мг* различными Р-элементами.

Конструкция вектора Концентрация ДНК (мг/мл ) Число инъецированных эмбри-. онов Число выживших особей <°о) Число фертильных особей <Go> Число транс-формирован- ных особей <v Эффективность трансформации (*)

ртг25.1 0,1 470 97 60 8 13

рл25. 7wc 0,15 260 59 53 7 14

рС( г у* )42-3 0,1 240 19 15 2 14,5

Результаты экспериментов (табл.1) показывают, что выживаемость мух, выросших из инъецированных эмбрионов, зависит от природы вектора. Она примерно одинакова в опытах с использованием ртг25.1 и prr25.7wc и существенно ниже в опытах с использованием рС[ ( гу* )Д2-3 ]. В потомстве мух, инъецированных РС{ ( гу* )Д2—3], наряду с трансформированными особями, имевшими фенотип sn* или sn" , встречались и трансформанты-мозаики, у которых на скутеллуме и тораксе были щетинки сразу трех фенотипов: sn", sn" и sn* Известно, что сплайсинг РНК транс-позазы векторов prt25.7,wc и ртг25. 1 происходит только в клетках зародышевого пути, а фермент искусственно сплайсирован-ного Р-элемента активен во всех тинах клеток дрозофилы [Robertson et al.,1988], Появление трансформантов-мозаиков в нашем эксперименте подтверждает наличие актйвной транспозазы во всех тканях инъецированного эмбриона. Пониженная жизнеспособность" объясняется в этом случае тем, что активный фермент в соматических клетках оказывает на них негативное действие, что вызывает гибель эмбрионов на ранних стадиях развития. Величины эффективности трансформации, полученые в данном эксперименте, были равны для всех трех векторов.

-б-

1.2 Влияние инкубационной среды на жизнеспособность инъецированных эмбрионов.

Первые две среды (табл 2) обычно применяются а работах, связанных с микроинъекцией в эмбрионы дрозофилы, зарубежными исследователями. Мы показали, что использование медицинского вазелинового масла в сочетании с парафиновым клеем, повышает выживаемость инъецированных эмбрнонш. Предлагаемая среда, в которой инкубируются дехорионизированные эмбрионы и проводится весь процесс ищсроинъекции, более доступна отечественному экспериментатору.

Таблица 2. Влияние инкубационной' срслд на вььккааемость инъецированных эмбрионов.

N Масло Число инъецированных эмбрионов Число личинок I стадии Число ЕЫЖИИ- ших в %

1 Vo I talefIOS (France) 200 36 18

2 Haiocarfaou ; (USA) 200 27 13

3 Вазелиновое масло 200 53 26

2. Трансформация линии y+sn®sc «а Drosophila nclanogaster векторами, содержащими селективны^ маркер - ген neo.

Предполагалось выяснить, происходит ли одновременно с дестабилизацией локуса sn (фенотип sn" ) транспозазон векюра-помоиника встраивание транспозона с маркерным геном преимущественно в Х-хромосому или аутосомы.

Маркером инеерции служил бактериальный ген neo, кодирующий фермент кминогликозидтрансферазу. ^гот фермент ин?ктиви-рует антибиотик широкого спектра действия геиетнцин (С118) ^трансформированные личинки дрозофилы погибают на корме, содержащем 041 в концентрации 1 мг/мл. 1рансформанты,содержащие ген neo, выживают и :мют потомство.

На рисунке 1 нрнвелелм iтруктурные схемы транспоэоьов, содержащих ген Эти конструкции вместе с векгором-помошни-

ком были микроиньецированы в полярную плазму ранних эмбрионов линии у*бп* бс V Сго$орЫ1а melanogaster. Первичных трансформантов отбирали в потомстве инъецированных особей по фенотипу и »пе. Для получения сублиний трансформантоа скрещивали индивидуально с исходной линией. Потомство пер-вйчных трансформантов (0г ) проверяли на устойчивость к антибиотику 04[а, в концентрации 1мг/мл, т.е. вели поиск особей, содержащих интегрированные копии транспозона (табл.3). Через каждые три дня инъецированных особей от эмбрионов до стадии куколок выдерживали по 1-му часу в условиях теплсвого шока ( 37° С).

Таблица^З. Трансформация Drosophila melanogaster линии у* sn" se v/' конструкциями, содержашими ген neo под промотором гена hsi>70.

Номер опыта Конструкция вектора Концентрация иньеци-рован-ной- лнк (мг/мл) Число инъецированных эмбрионов Число выживших особей Число фер-тильных особей <°о> Число транс-формн-рован-ных особей <°, )

sn пеог

1 pUChsh neo 0,1 140 9 7 2 2

рС[гу'Д2-3] 0,1

2 Д4хпео ртг25. 7. wc 0,7 0,15 240 31 26 2 2

3 пеохЛ4 рл25.7.wc 0,7 0,15 200 32 24 3 2

Шесть клонов иэ семи с измененным фенотипом 5П дали потомство, выживающее на корме с антибиотиком. Однако только у одного клона (к22), трансформированного конструкцией риСЬяЬпео, выживаемость личинок в присутствии 04) была сравнима с контролем", т.е. достигала 80-9006. В остальных

Позитивным контролем в этих экспериментах служила линия, содержащая ген "neo" в Х-хромосоме, любезно предоставленная нам Нирротой.

случаях до стадии иыаго развивалось 10 - 20% личинок, причем инкубация в условиях теплового шока не улучшала, а скорее ухудшала выживаемость.

Мы попытались определить локализацию гена neo в политен-ных хромосомах сублиний, выживающих на корме с антибиотиком G<le, с помощью гибридизации in siau. Для приготовления препаратов политенных хромосом слюнные хелезы выделяли из личинок, выросших на корме с антибиотиком. В качестве зонда, использовали как плозииду, служившую для трансформации, так и участок, соответствующий гену neo« полученный при переваре исходной ДНК соответствующими рестрикчазами. В геноме сублинии к22 были обнаружены две копии транспозона pUChsh neo. Они располагаются в районе 47В хромосомы 2R и в районе 74D хромосомы 3L (рис.3). Во всех остальных клонах ген neo в политенных хромосомах при гибридизации in situ обнаружен не был.

Блот-гибридизационный анализ геномной ДНК всех сублиуий проводили с теми же зондами, что и при гибридизации in situ. Только в геноме к22 был обнаружен фрагмент ДНК, соответствующий по размеру транспочону pUChsli neo.

Полученные данные позволяют предположить, что дестабилизация локуса sn экзогенным Р-элементом и интеграция транспозона, являются независимыми событиями. Ни локус sn, ни его

* ¿V?-":. V - .-,> . - . -

* ч "Ч1 ч>

V" ■■ •

\ - • \ ' i;/:4'*.. ; ; . J

Рис.3 Гибридизация in situ плазмнды pUChsh neo с препаратом политенных хромосом клона-трансформанта к22.

ближайшее окружение, ни сама Х-хромосома не являются мишенями для преимущественного встраивания транспозона при Р-эле-мент зависимой трансформации линии с фенотипом sn* .

Низкую выживаемость личинок шести сублиний на корме с антибиотиком можно объяснить двумя причинами. Первая - транс-позон в клетках этих сублиний существует в эписомальном состоянии и слабо экспрессируется. Эта транзиентная экспрессия не регулируется hsh промотором. Конструкции содержат плаз-мидный репликон и могут однократно реплицироваться в клеточном цикле. Это предположение кажется мало вероятным, т.к. при получении сублиний проходит несколько поколений, а эпи-сомы, если они и существуют, наследуются и распределяются в клетках неравномерно и впоследствии теряются.

Вторая причина - неравномерное распределение антибиотика в корме. На такую возможность указывал Пиротта в личном сообщении, рекомендуя применять нам другие маркеры трансформации, например ген 'white" в составе транспоэона CaSpeR. В ,своей работе он, как и мы, сталкивался с трудностями адекватной интерпретации результатов, основанных на отборе трансформантов по выживаемости личинок Drosophila на корме с антибиотиком G,, „ .

11 в

Ь л

3. Трансформация линии <t~lz /х х yvrf Drosophila mclanogaster конструкцией CaSpeR, содержащей ген "mini-»hitс".

Для трансформации использовали линию Drosophila melano-gaster w~lzb/x x у w f. В этой линии у самок сцепленные X-хромосомы содержат стабильный мутантный аллель "w""- белые глаза [Driver et al.,1989], а Х-хромосома самцов кроме "w~", 'несет инсерцмониый аллель 1гь- измененная форма глаз (Волошина и Голубовский, 1986). В эту линию вводили конструкцию CaSpeR, содержащую ген "mini-white", совместно с вектором-помощником pn25.7wc. Ген "mini-white" восстанзвливает цвет глаз (красный) у особен "w~".

Взрослых .инъецированных особей G0. скрещивали индивидуально с неинъецирова\|ными самцами или самками исходной линии. Всего было получено 15 фертильных самок и 25 самцов GQ . От каждой фертильной самки G0 в среднем было получено 100-150 потомков, от самцов 0Q до 300 потомков. В потомстве трех самок

sal Д

-МЛ I.

mint - WAU*

Рис.2. Структурная схема ¡вектора CaSpeR.

а - последовательность ллазмиды рUC9;

Ь - концевые повторы Р-элсмента; - полилинкер.

и одного самца были обнаружены пучки особей с окрашенными глазами (трансформанты). Доля трансформированных особей в потомстве Cj составляла от 6 до 57%.

Мы классифицировали всех особей на 7 групп визуально по нарастанию интенсивности окраски глаз от белой до красной, где w0 - белоглазые; wt - светло-желтые; - интенсивно-желтые; w3 - средне-оранжевые; vt - ин-теисивио-оранжевые; -#5-кирпичные; w6- красные.

От нескольких, произвольно выбранных из каждой семьи, трансформантов были получены суСлинии. От потомства самки СИ были получены сублинии на все варианты окраски глаз.

3.1. Локализация интегрированных копий гена "mini-'.vhite" в геноме трансформированных линиТП При трансформации вектором CaSpeR цвет глаз мутантных особей зависит от двух факторов: от количества встроившихся копий и от сайта интеграции в геноме ("эффект положения") [ laurie-Ahlberg 4 Stam,1987; Levis et al.,1989; Dutton & Chovnic, 1991; Baksa et al.1993].

Для локализации гена "mini- white" в наших сублиниях мы использовали два метода (табл.4, 5):

1. Метод генетической локализации. Особей каждой анализируемой сублмнии скрещивали индивидуально с линией w~Cy/l;D/sb, имеющей фенотипические маркеры ро II и III хромосомах .

2. Метод гибридизации in situ на политенных хромосомах. В качестве зонда использовали плазмиду CaSpeR, меченную радиоактивным тритием и нерадиоактивным производным диенП (диэти-лентриаминохлорплатина), Совместно с Институтом органической

химии (М,Ф.Турчинский, Т.П.Колесник) нами была разработана оригинальная методика гибридизации in situ политенных хромосом с препаратами ДНК, меченными производными диенП. Принцип метода заклачается в том, что меченная диенП ДНК выявляется специфическими антителами (получены А.Н.Поверенным и В.М.Киселевой, Институт медицинской радиобиологии), которые, в свою очередь, обнаруживаются с помощью стандартной фосфатаз-ной реакции. Достоинство методики определяется тем. что ДНК после линеаризации метится с помощью химической реакции в отсутствии ферментов. На препаратах политенных хромосом, после проведения всех этапов гибридизации in situ видны диски ярко окрашенные 5-бром-4-хлор-индолилфосфатом и нитрого-лубым тегразолием (синий цвет). Окрашенные диски соответствую » местам локализации изучаемой ДНК. Сравнительный анализ результатов гибридизации in situ с другими нерадиоактивными зондами (биотип, дигоксигенин) показывает, что разработанный нами подход, применим для выявления различных ДНК-последова-тельностей в полигенных хромосомах.

При этом были получены следующие результаты: во всех сублиниях от самца С4, ген локализован в третьей хромосоме, цвет глаз - кирпичный. Волвсех сублиниях от самки СЗ, ген локализован в сцепленных X Х- хромосомах, цвет глаз - оранжевый. Во всех сублиниях от самки С13- ген локализован во второй хромосоме,.цвет глаз - желтый. Очевидно, что в каждом из этих случаев встраивание транспозона в хромосомы произошло в одной стволовой клетке, в предмейотической фазе формирования гонад.

Наиболее интересные результаты получены при анализе сублиний от самки СИ . Потомство Gf этой самки состояло из 37-ми белоглазых особей и 50-ти особей с различной интенсивностью окраски глаз. Это указывает на то, что трансформация произошла на очень ранней стадии зародышевого пути. Инсерции произошли во вторую, третью и сцепленные X Х-хромосомы, при этом разные^сублинии несли разные наборы трансформированных хромосом (XX; 2; 3; X X +■ 2; X X + 3; 2 + 3). Всего было обнаружено 15 разных сайтов интеграции транспозона ( см.табл.4 ).

Таблица 4. Локализация гена "mini-white" в геномах сублиний - трансформантов.

Сублинии1 Хромосомы Локализация. на хромосомах

о"С4 С4-52 31 75D

$СЗ СЗ-61 XX 9В

$С13 С13-80 2R 42В

$С11 С11-6 С11-10 С11-11 С11-13 "С11-16 С 31 — 18 С11-20 С11-24 С11-25 С11—42 XX XX, 2R XX, 11 ¿R 2R+3L 2L+3L 3L 3R _2R хх, 3L 12E-F 18Е,19F,42А 54D 53С.76А.79Е 28А.79Е 66С 87D-F 42А 12E-F.71C

1— В таблице приведена локализация гена в одной из идентичных сублиний.

Каждыи Gt трансформант обозначен соответствующими символами: j! и 0'- пол трансформированной особи, С - сокращенное

название конструкции CaSpeR, число 3, 4, Н и 13 - порядковый номер инъецированной особи, вторая цифра - порядковый номер суОлинии. Например, обозначение С4-52 показывает, что сублиния была получена от трансформанта под номером 4, а 52 -"порядковый номер сублинии.

Возникает вопрос, является ли полученное разнообразие следствием одномоментного встраивания, произошедшего в одной клетке зародышевого пути самки СП, или же трансформация происходила неоднократно и в разных стволовых клетках. О том, что инсерции в X Х-хромосомы происходили в 2-х разных клетках-предшественницах, прямо свидетельствуют данные по локализации транспозона методом гибридизации in situ. Так, в сублинии С11—16 обнаружен сайт интеграции 12E-F, а в сублинии С31—10 - сайты 18Е и 19F. Полученное разнообразие объясняется трансформацией трех или бол ее клеток зародышевого

пути у самки С11. Встраивание происходило и в дочерних клетках. Вектор-помощник сохраняется в эписомальном состоянии в ряду нескольких делений стволовых клеток, обеспечивая дополнительное встраивание транспозона в уже трансформированные или новые хромосомы (линии Cll-16, С11-42).

В сублиниях, полученных после трансформации геном "mini-white", изменение цвета глаз сопровождается интеграцией перенесенного гена и это подтверждается in situ гибридизацией. Хотя маркер "mini-white" требует трудоемкого фенотипи-ческого отбора мух по окраске глаз (просмотр каждой особи в потомстве ), он имеет ряд преимуществ перед селективным маркером' пео. Во-первых, по окраске глаз можно достоверно сказать, что трансформация произошла, и, во-вторых, без дополнительного молекулярного анализа можно судить об эффективности экспрессии интегрированного гена. Основным недостатком использования гена пео является то, что на корме с антибиотиком могут выживать особи, не содержащие этот ген, или, возможно, содержащие его в эписомном состоянии.

3.2. Характер наследования окраски глаз, трансформантами, несущими интегрированный ген "mini-white". •

Из полученных сублиний были произвольно выбраны 45 (30 сублиний от <j> С11, и по 5 сублиний от остальных трансформированных особей). В таблице 5 представлены характеристики полученных сублинуй (приводятся характеристики лишь уникальных сублиний).

3.2.1. Наследование окраски глаз.

Характер доминирования гена "mini-white" определяли сравнением фенотипов гетеро- и гомоэоготных самок, чтобы исключить возможное влияние локуса lozenge ( !zb ). По данным, приведенным а таблице 5, видно, что в большинстве случаев ес i роенная копия гена "mini-white" (у гетерозиготных особей) не лблалчет полной экспрессией. Наиболее сильно этот эффект выражен I! сублинии С11-13. В сублинии С11-20 этот эффект не наблюдался. В последнем случае, по-видимому, проявляется полная выраженность гена.

В полученных сублиниях преобладает окраска глаз средней интенсивности (w3-4).Jlnuib у двух сублиний: С4-52 и С11-13

ТАБЛИЦА 5. Окраска глаз у самок в гетеро- и гомозиготном состоянии гена "mini-white".

Название линии

Окраска глаз

гетерози-готы

гомозиготы

Локализация на

хромосомах

с4-52(3L ) c3-61(xxj с13-80(_2к ) cll-6(xx ) с11-10( х>,2R.) с 11 — 11( хх,2-я ) с 11 -13( 2R) с11-16(2R+3L) с 11-16 (2R ) cll-16 [3Lj cll-18( 2L+3L) cll-18 (2L) с 11-18 (31) с 11-20( 3L ) с 11-24(3R) с 11-25( 2R ) с 11-32? 3-я ) с 11-42( хх, 3L)

ч4

мЗ v 1 »3 w4 v4 w2 v5 w2

w3 w2 wl k-2 w2 w2 w3 w4

w6 w3 w2 w3 w4 w6 w6 w6 w4 w6 w6 w4 w3 w2 w3 w4

M'6 i»6

75D 9B 42B 12E-F 18E,19F.42A

54D 53C.76A.79E $3C 76A.79E 28A.79E 28A 79E 66C 87D-F 42A

12E-F.71C

-- г сублиниях cil-ll и С11-32 локализация гена "mini-white" была определена только генетически.

красный цвет глаз (у гомозигот w6) обусловлен интеграцией одной копии гена. Б остальных случаях красный цвет глаз обусловлен аддитивным действием двух или трех копий интегрированного гена (в сублиниях С11-10, Cll-16, С11-18 и др.). Перемещение гена всего лишь на несколько дисков приводит к существенному изменению его экспрессии: так, в сублинии С13-80: 42В цвет глаз - w2, а в сублинии Cll-25: 42А - w4. Таким образом, можно считать, что один и тот же ген в заЬисимости от окружения или от места встраивания может проявлять разную степень экспрессии и, как полную, так и неполную выраженность.

3.2.2. Дозовая компенсация.

Известно, что гены, локализованные й Х^хромосоме, такие как SDS3, SDS4, Hsp82 и другие, способны к дозовой компенсации при переносе их в аутосомы при условии, что они содержат определенные участки 5' фланкирующей области [ Kramm et al..

1985; Bourouis i Rihards,' 1985; Wohlwill к Bonner, 1991]. Для проверки того, подвергается ли ген "mini-white" дозовой компенсации, мы сравнили цвет глаз у гетерозиготных самцов lz* и у самогс Iz* , содержащих ген "mini-white" в аутосомах. Цзет глаз у самцов во всех исследованных сублиниях был сильнее, чем у самок, что свидетельствовало о том, что ген "mini-white" подвергается дозовой компенсации. Эти результаты согласуются с выводом о том, что 300 п.н. 5' фланкирующей области гена "raini-white" достаточны для дозовой компенсации его экспрессии [Klemenz et а 1. , 1987].

3.3. Влияиле мугантного гена lozenge на проявление гена mini- white" в трансформированных сублиниях.

Известно, что различные псевдоаллели гена lozenge оказывают супрессорное влияние на гены vermilion и scarlet на уровне транскрипции [Clayton, 1958]. В наших опытах было обнаружено влияние мутаитного аллеля 1 zb на ген "mini-white". Влияние мутации lzb на ген "mini-white" анализировали, сравнивая фенотипы самцов и санок, потомков от различных скрещиваний (табл.б).

В восьми случаях мутация lzb незначительно ослабляет окраску глаз у самцов, гетерозиготных по гену "mini-white", по сравнению с самцами, содержащими нормальный ген \z* (табл.6, колонки 2 и 3). В трех сублиниях изменения цвета глаз у гетерозиготных по грпу "mini-white" трансформированных особей под действием мутантного гена lzb не наблюдается.

Интересна избирательная супрессия гена "mini-white" в сублинии С11—16. В этом случае произошло встраивание одной копии гена "mini-white" во вторую хромосому (53С) и двух копий - в прицентромерный район третьей хромосомы (76А и 79Е). Самцы генотипа ii* со вставкой "mini-white" в третьей хромосоме имеют фенотип w5, а генотипа 1zb - фенотип wl (колонки 1 и 2). В то же время, во второй хромосоме этой сублинии (53С) наблюдается обычная супрессия гена "mini-white", (самцы lz* и lzb имеют цвет глаз - w2 и wl). Избирательная супрессия в третьей хромосоме, скорее всего, связана с интеграцией гена "mini-white" п сайт 76А, т.к. в сайте 79Е супрессия выражена слабо (lz*- w2 и lzb- wl; см. табл.6).

' ТАБЛИЦА 6. Влияние мутации 1гь на интенсивность окраски глаз трансформированных линий в различных скрещиваниях.

1 2* 3* 4* 5*

Локализация гена

$

пол о'1 о*

состояние гетеро- гетеро- гомо- гомо-

гена зиготы зиготы зиготы зиготы на

mini-white хромосомах

S.

N. COCTO-

N. яние

Наи^ч гена lzb lz4 lzb 1 z*

мено-N. 1 z

вание >ч

ЛИНИИ

C4-52 w5 w5 w5 w6 75D

С13-80 wl wl wl w2 42В

cll-11 wl w2 w2 w4 —

с 11—13 w3 w3 w5 w6 54D

cll-16 wl w2 w3 w4 53С

cll-16 wl w5 — w6 76А.79Е 28А

с 11—18 w2 w3 w3 w4

cll-18 wl w2 w2 w3 79Е

с11—20 wl w2 w2 w3 66С

с 11-24 wl ____-> Wt, • 2 тг»_г

cll-25 wl w2 w2 w4 "42А"

cll-32 w3 — vr5 w6 —

cll-42 wl w2 ' w2 w3 71С

2-я колонка: самцы с гетерозиготным состоянием гена "mini-

white", содержащие мутацию lz ;

3-я колонка: самцы с гетерозиготным состоянием гена "mini-■ white", содержащие нормальный ген 1z ;

4-я колонка: самцы с гомозиготным состоянием гена "mini. white", содержащие мутацию lz ;

5-я колонка: самки с гомозиготным состоянием гена "mini-

white", содержащие нормальный ген lz.

Если ген "mini-white" находится в гомозиготном состоянии (сравнение 3-й и 4-й колонок), то ослабление.его активности мутацией 1zb наблюдается при всех его локализациях и это-ослабление соответствует примерно одной условной цветовой единице .

виводи

1. Разработана новая среда для проведения трансформации дрозофилы, при которой происходит наилучшее выживание инъецированных Эмбрионов.

2. Эффективность Р-элемент зависимой трансформации, доля фертильных и доля выживших особей по-разному зависят от природы вектора - источника транспоэазы.

3. Изменение фенотипа локуса sn, вызванное экзогенным Р-элементом, происходит независимо от интеграции транспозона, содержащего исследуемый ген.

4. Анализ мзст интеграции гена "mini-white" у трансформированных особей позволил предположить, что вектор - источник транспозазы активен в течение нескольких делений генеративных клеток дрозофилы.

5. Экспрессия гена "mini-white" супрессируется мутантным геном 1гь , и это подавление зависит от местоположения встроенной копии "mini-white".

Список работ, опубликованных m isms, диссертации,

1. Прохорова A.B., Шостак Н.Г., Евгеньев М.Б., Барский U.E. Получение особей Drosopila melanogaster линии y*sn*sc w* , трансформированных серией векторов на основе Р-элемента, с помощью* микроинъекции в ранние эмбрионы. 1989, Генетика, т.25, N11, с.2076-2078.

2. Прохорова A.B., Шостак М.Г., Евгеньев М.Б., Барский В.Е. Эффективность трансформации Drosopila melanogaster линии y*sn"sc w* серией векторов на основе Р-элемента с помощью микроикьекции в ранние эмбрионы. 1989, VI Всесоюзное совещание по проблемам биологии и генетики дрозофилы, Одесса, 7-12 сентября, тезисы докладов, с.77.

3. Шостак Н.Г., Прохорова A.B., Барский В.Е., Архипова И.Р., Любомирская Н.Б., Евгеньев М.Б., Ильин Ю.В. Получение линий Drosophiia melanogaster, содержащих копии мобильного элемента МДГ-4, введенного в геном дрозофилы с помощью котрансфор-мации. 1989, VI Всесоюзное совещание по проблемам биологии и генетики дрозофилы, Одесса, 7-12 сентября.тезисы докладов, с.97.

4. Турчкксккй 15.Ф., Колесник Т.Б.. Прохорова A.B., Киселева В.И., Поверенный A.N. Создание набора реагентов для гибриди-зационного анализа in situ. 1993, II! конференция "Геном человека- 93", Черноголовка, 10 - 12 марта, тезисы докладов, с.156.

5. Прохорова A.B., Волошина М.А., Шостак Н.Г., Барский В.Е., Голубовский М.Д. Получение и первичный генетический^анализ трансформантов Drosophiia melanogaster линии V\zb/х х ywf, содержащих ген "mini-white", интегрированный в геном при Р-элемент зависимой трансформации. 1994, Генетика, т.30, N7, стр.135-144.