Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХРОМОСОМНЫХ ТРАНСЛОКАЦИЙ И ЗАМЕЩЕНИЙ У НЕКОТОРЫХ ФОРМ ЯРОВОЙ ТРИТИКАЛЕ

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХРОМОСОМНЫХ ТРАНСЛОКАЦИЙ И ЗАМЕЩЕНИЙ У НЕКОТОРЫХ ФОРМ ЯРОВОЙ ТРИТИКАЛЕ"



На правах рукописи

ДИВАПГУК МИХАИЛ ГЕОРГИЕВИЧ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХРОМОСОМНЫХ ТРАНСЛОКАЦИЙ И ЗАМЕЩЕНИЙ У НЕКОТОРЫХ ФОРМ ЯРОВОЙ ТРИТИКАЛЕ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена на кафедре генетики и в центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К А Тимирязева

Научный руководитель:

кандидат биологических наук А. А. Соловьев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. В. Пыльнев кандидат сельскохозяйственных наук А. В. Сергеев

Ведущая организация: кафедра генетики Московского государственного университета имени М В. Ломоносова

Защита состоится « 24 » мая 2007 г в 13 час на заседании диссертационного совета Д 220.043 10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К А. Тимирязева по адресу 127550, г Москва, ул Тимирязевская, 49 Факс: (495)-976-0894

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им НИ Железнова РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева.

A p'N

Автореферат разослан «X, У^ » апреля 2007 г. и размещен на сайте http //www timaiad ru

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.И. Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Яровая тритикале обладает высоким потенциалом продуктивности и в сочетании с высоким качеством зерна может быть использована в различных направлениях. Недостаточная селекционно-генетическая проработка этой культуры препятствует широкому внедрению этой культуры в производство. Об этом, в частности, свидетельствуют данные о присутствии в Государственном реестре селекционных достижений, допущенных к использованию в 2007 г. лишь двух сортов этой культуры.

Для яровой тритикале показано широкое использование хромосомных замещений и транслокаций с уменьшением доли генетического материала ржи (Zillinsky, 1980; Gustafson, Lukaszewsky, 1984). Замещения и транслокации хромосом позволяют решать проблемы, характерные для яровой тритикале, как показано в отношении признаков хлебопекарных качеств зерна, устойчивости к прорастанию на корню, толерантности к ионам алюминия, и другие (Rybka, 2003; Oracka and Lapinski, 2006; Wos et al, 2006). Оптимальный хромосомный состав, создаваемый на основе гомеологов А, В, D и R геномов или их плеч и отдельных участков, может служить основой для создания новых ценных форм тритикале с уникальными наборами хромосом и с определенными характеристиками в зависимости от направления использования и места выращивания (Mergoum, 2004).

Важным этапом в работе с линиями яровой тритикале, несущими замещения и транслокации является четкая идентификация замещения или транслокации с определением вовлеченных хромосом. Идентификация хромосом и их участков может быть выполнена с использованием различных методов — дифференциального окрашивания, молекулярного маркирования, геномной гибридизации in situ. Применение комплексного подхода с использованием разных методов позволяет осуществлять надежную идентификацию хромосомцых_наборов тритикале......

| ИМР,ш К.А. Тимирязева ;

У?г ... м v. ;к-.тгзпова \

Цель и задачи. Цель исследований состояла в комплексном молекулярно-цитогенетическом анализе линий яровой гексаплоидной тритикале из коллекции кафедры генетики РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева, характеризующихся по ряду хозяйственно-ценных признаков

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи

1. Цитогенетическое изучение линии яровой тритикале 131/7, несущей пшенично-ржаную транс покацию, методами дифференциального окрашивания и геномной in situ гибридизации

2. Разработка комплексной методики идентификации и генетического картирования ржано-пшеничной транслокации на примере линии тритикале 13 1/7

3 Определение геномного состава линий и образцов яровой тритикале PI-587512, Л-22, S-17, Л-24, к-1433, Л-8-4, Л-8-6, Л-26, S-17-4, Л-8-1, Л-8-3, Л-12, Л-13, Л-15

4 Выявление замещений у отобранных линий и образцов с использованием микросателлитных маркеров и геномной гибридизации т situ

5. Скрининг данных отобранных линий и образцов на наличие хроматина D-генома с помощью микросателлитных маркеров и их цитогенетическое изучение с помощью геномной in situ гибридизации Научная новизна результатов исследования. Впервые с помощью комплексного подхода, включающего

микросателлитный анализ, дифференциального окрашивания и геномной in situ гибридизации проведен анализ 15 образцов яровой гексаплоидной тритикале Модифицирован метод совмещения дифференциального окрашивания и геномной гибридизации т situ для идентификации ржано-пшеничных транслокаций Разработана и апробирована методика быстрого скрининга коллекции тритикале на наличие генетического материала генома D на основе хромосом специфичных микросателлитных маркеров. Впервые установлено наличие

замещения 2B/2D и 2RS.2RL-2BL-TpanarcoKaunn у линии 131/7. Впервые установлено наличие 2R/2D замещения у 7 образцов яровой тритикале. Показано наличие четырех вариантов по микросателлитным маркерам хромосомы 2D.

Практическая значимость. Методика скрининга коллекции на присутствие генетического материала D-генома на основе отобранных микросателлитных маркеров может быть использована для быстрого поиска замещенных и транслоцированных форм тритикале с участием этого генома. Оптимизированный метод совмещения дифференциального окрашивания и геномной гибридизации in situ рекомендуется для идентификации ржано-пшеничных транслокаций.

Выявленные формы с 2Я/20-замещением могут быть использованы в качестве исходного материала в селекционном процессе яровой тритикале.

Апробация результатов работы. Результаты работы апробированы на V Международном совещании и Школе молодых ученых по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений «Кариология, кариосистематика и молекулярная филогения растений» (Санкт Петербург, 2005), Международной конференции молодых ученых (Республика Сербия и Черногория, Чачак, 2005), Международной научной конференции РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, посвященной 190-летию со дня рождения первого директора Петровской земледельческой и лесной академии академика Н.И. Железнова (Москва, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объем н структура диссертации; Материалы диссертации

изложены на _ страницах машинописного текста и включает _

рисунков, __ таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает _ наименований, из них_иностранных.

УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальная работа выполнена в 2004-2007 годах на кафедре генетики и в Центре молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева.

Для изучения были взяты. 15 селекционных образцов яровой тритикале из коллекции кафедры генетики РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева, яровая гексаплоидная тритикале линия к-1242 без R/D-замещений, яровая гексаплоидная тритикале линия к-1185, несущая 2К/20-замещение, один образец октаплоидной тритикале ПРАО-1, сорт яровой ржи Селенга, сорт озимой ржи Данковская золотистая, сорта яровой мягкой пшеницы Иволга и Chinese spring, Aegilops tauschn, Ae speltoidos, Triticum monocücum пшеница твердая сорт Безенчукская янтарная и линия IG82775

Изучение хромосомною состава пинии яровой гексаплоидного тритикале 131/7 проводили с применением С-метода дифференциального окрашивания хромосом по методике, разработанной в лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии РАН (Бадаев и др , 1983, Badaev et al, 1990) с некоторыми модификациями

Геномную in situ гибридизацию осуществляли по стандартной методике (Карлов с соав, 1999), с некоторыми модификациями. Анализ флуоресцентного сигнала был проведен на флуоресцентном микроскопе "Axiophot" ("Zeiss", Германия) с соответствующей системой фильтров Для анализа изображений, производили фотосъемку на пленку Fuji 400 После проявки пленку сканировали в компьютер и обрабатывали изображение, используя программу Photoshop CS

ДНК выделяли из молодых проростков по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями

Микросателлитный анализ образцов и картирование точки рекомбинации у линии 131/7 выполняли с помощью следующих SSR-маркеров Xbarc271, Xbarcl49, Xgwm349, Xbarc228, Xbarcl 143, Xgwm539, Xgwm301, Xgwml02, Xgwml57, Xbarcl68, Xgwm484, Xwmclll, Xgwm261, Xbarc270, ХЬагсб, Xbarcl 183,

Xbarcl 148, Xgwml94, Xwmc285, Xbarcl 10, Xwmc233, Xbarc96, ХЬагсЮЗО, Xbarc53, Xwmc506, Xwmc317, Xwmc36I, Xwmc332, Xgwml20, Xwmc441, Xbarcl67, Xbarcl064, Xbarcl 147, Xwmc498, Xwmc592, Xwmc477, Xbarcl3, Xgwm429 (Röder et al., 1998, Somers, Isaac P, 2004, http://wheat.pw.usda.gov).

Идентификацию замещений в линиях тритикале проводили с помощью STS-маркера на локус Sec-2, локализованного в коротком плече 2R хромосомы.(Lee et al., 1994) и микросателлитных маркеров специфичных для хромосомы 2D.

Все праймеры синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва).

Амплификацию осуществляли на амплификаторах «Терцик» («ДНК-технология», Москва). Условия проведения амплификации были индивидуальны для каждого SSR-маркера. В некоторых случаях производили оптимизацию условий амплификации.

Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле с буфером TBE при напряженности поля 6 V/cm. В качестве маркера молекулярного размера использовали «100 bp leader» (Fermentas).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Идентификация хромосомного состава линии яровой гексаплоидной тритикале 131/7 1.1 Разработка стратегии поиска генетического материала D-генома в геноме яровой тритикале

В процессе селекционно-генетических исследований, выполняемых на кафедре генетики РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, создана коллекция яровой тритикале. Ранее для линии 131/7 методом геномной in situ гибридизации было показано, что она несет транслокацию пшеничной хромосомы в ржаную (Карлов с соавт., 2000). Однако хромосомы, вовлеченные в эту транслокацию, не идентифицированы. Данная линия была выбрана в качестве модельной для выработки стратегии по идентификации замещений и транслокаций в линиях яровой гексаплоидной тритикале. Линия является мейотически

стабильной, практически все микросиороциты в метафазе-I имели 21 закрытый бивалент (Соловьев, 2000) Это косвенно свидетельствует о наличии в ее геноме хромосом ni и участков хромосом D-генома

На оонове литературных данных нами были подобраны микросателлитные маркеры на каждое плечо хромосом D-генома (Roder et al, 1998) По результатам анализа амплификации этих маркеров было установлено, присутствие SSR-маркеров, специфичных для хромосомы 2D в геноме линии 131/7 На рис I и 2 представлены результаты электрофоретического разделения продуктов амплификации микросателлитных маркеров Xg\vm349 и Xvvmclll, соответственно специфичных для д чинного и короткого плеча хромосомы 2D

1 23456 7 89 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M

Xgwm349 (243 Ьр) т«ил*»т„« ч с

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M 31 32 33 34 35 36 37 38

Рис. I 1 2 - мягкая пшеница сорт Ивопга 3 - окгатоидная тричикыс сорт Г1РАО-1, 5, 6 7, 8 - твердая пшеница сорт Ьезенчукская янтфная Ч ч твертая пшеница 1иния Ю-82775 10 11 - гибрид Р, тиния 131 7 яровая роль сорт Сетенга 12 13 14,15,16 17 18 19 20 озимая рожь Данковская зозогистая 21 22, 23 24 25 26 27 28 29 30 яровая рожь сорт Сетенга 31 32 -гексаплоидная тритикале к-1242, 33 34 - гсксатоидная гритика 1е тния к-1185 35, ^6, 37, 38 39 40 - гексаплоидная тритикале шния 131/7 М маркер молекузярного размера (100 Ьр Шсг)

Маркеры присутствовали в данной пинии. I ибриде с ее участием, в образцах мягкой пшенице сорте Ивипга и октаплоидной тритикале пинии ПРАО-1, несущих 0-[еном а

также образце гексаплоидной тритикале к-П85,у которого имеется 2К12Т) замещение. У форм пшеницы, тритикале и ржи, у которых геном О отсутствует, продуктов амплификации выявлено не было. Других хромосом генома О в линии 131/7 не выявлено (таблица 1).

Xwmcl 11 243 bp

Рис.2. 1 - мягкая пшеница сорт Иволга; 2 — октаплоидная тритикале сорт ПРАО-1; 3 — гескаплоидная тритикале линия к-1242; 4 — твердая пшеница сорт Безенчукская янтарная; 5 — гексаплоидная тритикале линия к-1185; 6 — гескаплоидная тритикале линия к-1242; 7 — гексаплоидная тритикале линия 131/7; 8 - гибрид F| линия 131/7 х яровая рожь сорт Селенга, M — маркер молекулярного размера (100 bp lader).

Таким образом, с использованием набора SSR-маркеров, специфичных для хромосом D-генома, установлено присутствие в геноме линии тритикале 131/7 генетического материала хромосомы 2D. Данные, полученные на линии к-1185, для которой 2R/2D замещение было установлено ранее (Соловьев, 2000), подтверждают эффективность и корректность выбранной нами стратегии.

Для дальнейшего изучения линии 131/7 были использованы микросателлитные маркеры, специфичные для хромосомы 2D, распределенные по всей хромосоме, и удовлетворяющие условию отсутствия перекрестной амплификации на других пшеничных и ржаных хромосомах (табл. 2). Данное условие связано с тем, что в родословной этой линии

присутствуют неизвестные образцы тритикале Это не позволяет использовать высокии полиморфизм микросател!итны\ маркеров для определения участия родительских геномов в формировании линии

Таблица 1

Результаты амплификации микросателлитных маркеров, специфичных для О-генома у линии тритикале 131/7

Локализация SSR-маркер Наличие амплификации Локал | SSR-изация | маркер Наличие амплификации

1DL Xbarc271 - 4DS 1 Xvvm^SS -

IDS Xbarc 149 - 5DL J Xbarc 110 -

2DL Xgwm349 - 5DS Xwmc233 -

2DS Xwmcl 11 6DL Xbarc 1030 -

3DL Xbarc270 - 6DS Xbarc 196 |

3DS ХЬагсб - 7DL Xbarc53

4DL Xbarc 1183 - 7DS Xwmc506 1

Примечание зди.ь и л<пее + маркер присутствует - - маркер она 1сгв\с1

Таблица 2

Результаты амплификации микросателлитных маркеров, специфичных для хромосомы 2Э у линии тритикале 131/7

Локализация

Наличие амплификации

Е

23 3

Примечание * - токапизация маркеров дана по карте шепчепия Wheat Consensus SSR 2004

**Xbarcl 143 - физически картирован Oil] и Singh в юкусе 2DI 3 9

Анализ результатов показал наличие практически всех отобранных маркеров Отсутствие амплификации маркера Xbarc228 может быть объяснено присутствием нуль-алле 1я по

данному маркеру, либо наличием микроделеции в месте его локализации.

Использование маркеров, специфичных для хромосомы 2D, распределенных по всей ее длине, позволило установить присутствие в геноме линии 131/7 целой хромосомы 2D.

1.2 Идентификация ржано-пшеничной транслокации

Геномной in situ гибридизацией показано наличие в геноме линии 131/7 28 пшеничных хромосом, 12 ржаных и одной пары транслоцированных хромосом. Транслокация включает короткое плечо, центромеру, и часть длинного плеча ржи, и часть длинного плеча пшеницы. Линия мейотически стабильна. В связи с этим нами было высказано предположение, что произошло замещение одной пары пшеничных хромосом А или В генома на пару 2D хромосом, а заместившаяся пара участвует в транслокации в ржаную хромосому. Для подтверждения этой гипотезы нами было проведено совмещение дифференциального окрашивания с геномной in situ гибридизацией линии 131/7 (рис. 3).

Было выявлено, что у транслоцированной хромосомы длинное плечо представлено на ~ 80% материалом пшеницы, а на ~ 20% материалом ржи. Нами четко установлен рисунок дифференциального окрашивания транслоцированной хромосомы. Гетерохроматиновые бэнды в этой хромосоме располагаются в следующем порядке: относительно крупный теломерный бэнд ржаного гетерохроматина в коротком плече, слабый бэнд в проксимальной части длинного плеча в пограничной области, пара средних бэндов пшеничного гетерохроматина (при высокой конденсации хромосом сливающихся в один) в середине длинного плеча.

После анализа рисунка дифференциального окрашивания хромосом нами определено, что в геноме линии 131/7 присутствует замещение 2В хромосомы на 2D хромосому и транслокация длинного плеча хромосомы 2В в хромосому 2R.

Кариотип яровой гексаплоидной тритикале полученный методом С-бэндинга представлен на рисунке 4

Рис. 3 Совмещение дифференциального окрашивания и гибридизации in situ на одной и гой же метафазной пластинке хромосом пиши тритикале 131/7 (генетический материал ржи имеет же гтый цвет пшеницы красный)

Применение только цитологических маркеров для характеристики хромосом не может полностью исключить ошибок в процессе получения и идентификации i енетического материала (Devos et а!, 2000, Pestsova et al , 2000, Sahna et al , 2003) Для проверки данных, полученных методом совмещения С-бэндига и геномной in situ гибридизации, а так же для картирования точки рекомбинации пшеничного и ржаного хроматина, нами были подобраны следующие микросателлитные маркеры на длинное и короткое плечи 2В хромосомы Xwmc317, Xwmc361, X\vmc332, Xgwm 120, Xwmc44I, XbarcI67, Xbarcl064, Xbarcl 139, X\vmc592, Xvvmc477, Xbarcl3, Xgwm429 (рис 5)

Рис. 4. Кариотип дифференциально окрашенных хромосом линии тритикале 131/7

Маркеры Xwmc317, Xwmc361, Xwmc332, Xgwml20, Xvvmc441, Xbarcl67, Xbarcl064, Xbarcll47, локализованные на длинном плече хромосомы 2В, присутствовали в геноме линии 131/7 Маркеры Xwmc592, Xwmc477, Xbarcl3, Xgwm429 отсутствовали в геноме линии 131/7 (рис. 6)

Таким образом, точка рекомбинации находится между маркерами Xwmc592, локус 63,9 сМ, и Xwmc441, локус 76,8 сМ, по карте сцепления (Wheat, Consensus SSR, 2004 NA-SSR-2004-2B, httpV/wheat pw usda gov) По физической карте (Wheat, Physical, SSR, http //wheat pw usda gov) точка рекомбинации располагается в районе C-2BL2-0 36

»о.-: 1

1 '

Mi.:: м \i\irc! 1

мл iii.'t

7!.,S TS.7

•П4

1Ш.Х

li>5.(<

\Kutlfc7 Xwfi«.-*"

4 XjwmlJJO

• Xwi.icM

10-26

M>a clb72-c&

ymr<U>24-28 Xbar c-7-3

Xefcttl-CB

SkdrfSJO

:<>..»;, 74-2B Ktarc rn-2B

Xb-ДгсШ St-23 . X£»ti129-:b

_ XC'.«332-28 - :<f5.f»526-:B

• t <-cl*-:4<eJ

гп:--."*'-

.'.-■»Л"-'...

• iit'-м ч>

Рис. 5. Расположение микросателлитных маркеров на хромосоме 2В, используемые в нашей работе: по карте сцепления Wheat, Consensus, SSR, 2004 (слева) и по физической карте Wheat, Physical, SSR (справа, отмечены цветом). Стрелками отмечены маркеры, локализованные на обеих картах. (http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml).

Xwmc441 (158 bpV Xwmc592(276bp).

^pipp ^ippp шкш mriP мнр

1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 M 3 4 5 6 7

Рис 6 1 - мягкая пшеница Иво ira 2 мягкая пшеница Chinese ьрппа 3 твердая шиеница сорт Ыленчукская янтарная 4 яровая рожь ^орт Ce ieni a > -гьксап юн шая гритикале к 1242 6 7 гексапчоилная тритикале шнняН!'"1 VI маркер vio icKv 1ярною poJMepa ( 100 bp lader)

Таким образом, в пинии тритикале 131/7, наряду с замещением 2B/2D присутствует транслокация 2RS 2RL-2BL

2. Ци гогене тческан характеристика линнй яровой тритикале

Дзя цитогенетического изучения из кочлекции отобраны линии, контрастные по показателю селекционной ценности, а так же образцы к-1433, PI-587512

2.1 Вмяв ¡сане генетического материала генома D в линиях яровой тритикале Первым этапом был скрининг отобранных линий по микросаге 4 1 итным маркерам, специфичным для всех плеч хромосом D-генома В ре$ультате анализа у семи линий выявлено наличие продуктов амплификации по специфичным маркерам для хромосомы 2D С испольюванием специфичными для этой хромосомы маркерами - Xbarc228, Xbarcll43, Xgvvm:>39 Xgvvm301, Xgwm 102, Xgwml57 Xbarcl68, Xgwm484, Xwmclll, Xgwm261 показано наличие v семи линий целой хромосомы 2D

2.2. Идентификация замещений хромосом у тритикале с использованием геномной in situ гибридизации

Геномная гибридизация m situ является удобным методом выявления ¡амещения хромосом и межгеномных транслокаций у аллополиплоидов Цито югический анализ этих линий показал, что

все они являются гексаплоидными. На семи образцах к-1433, Л-22, Л-26, Л-8-1, Л-8-3, Л-8-4, Л-8-6, у которых микросателлитным анализом показано наличие в геноме хромосомы 2D была проведена геномная in situ гибридизация. В кариотипах линий к-1433, Л-26, Л-8-1, Л-8-3 выявлено присутствие 12 ржаных хромосом и 30 пшеничных хромосом (рис. 7).

Рис. 7. Геномная in situ гибридизация на метафазной пластинке хромосом линии к-1433 (генетический материал ржи имеет желтый цвет, пшеницы - красный).

Для образцов Л-8-4 и Л-8-6 установлено расщепление по числу ржаных хромосом. У них присутствуют растения, несущие замещение одной пары ржаных хромосом на пару хромосом 2D (рис. 8.1), растения несущие 14 хромосом ржи и 28 хромосом пшеницы (рис. 8.3), и их гибриды, несущие 13 ржаных хромосом и 29 хромосом пшеницы (рис. 8.2).

Установлено, что образец Л-22 является гексаплоидной, и несет в своем геноме 12 ржаных хромосом и 30 пшеничных, то есть является замещенной. В то же время у данного образца обнаружено растение, геномный состав которого переставлял собой совокупность 11 ржаных и 30 пшеничных хромосом. У этого растения также встречались метафазные пластинки разного геномного состава: 11 ржаных + 1 ржаной

Рис 8 Геномная in situ гибридизация на метафазных п иегинках хромосом образна тритикале Л-8-6 (генетический материал ржи имеет жеттый цвет пшеницы красныи)

Рис 9 I еномная т ши пюридизация на метафазных н 1астинках хромосом образна грн г и кап. 4-22 ([ снегичеекии материал ржи имеет жеттый цвет пшеницы кричный сгретками сказаны тезоцешрики)

ге.юцентрик и 30 пшеничных, 1 I ржаных и 29 пшеничных + 1 пшеничный те юцешрик (рис 9) Данный факт свидетельствует о

цитогенетической нестабильности образца Л-22 и присутствия в ней растений-мозаиков по числу и набору хромосом, что может быть использовано в дальнейших цитогенетических исследованиях.

Таким образом, установлено, что линии к-1433, Л-26, Л-8-1, Л-8-3, Л-22 являются замещенными, а образцы Л-8-4 и Л-8-6 представляют собой совокупность как замещенных так и не замещенных форм.

2.3. Идентификация 2К/20-замещенияу линий яровой тритикале

Для выявления замещения хромосомы 2Б1 на хромосому 21) использовали молекулярный БТЗ-маркер на локус запасного белка Бес-2, картированного в коротком плече хромосомы 21?..

Таблица 5.

Результаты амплификации микросателлитных маркеров ХЬагс228 и Х^тЗО! (пояснения в тексте)

Линия ХЬагс228

к-1433 - -

Л-8-4 -

Л-8-6 ^ + 4 *

Л-26 ч * - +

Л-8-1 ■ -*- + + ч

Л-8-3 - „ + ^ . - - - 4

Л-12 . + - * * ' V * * + .

к-1185 + • -

131/7

Амплификация с этим маркером показала, что в линиях к-1433, Л-26, Л-8-1, Л-8-3, Л-22 локус Бес-2 отсутствует. У образцов Л-8-4 и Л-8-6 показано присутствие локуса Бес-2 на отдельных растениях. Эти данные в сочетании с результатами

микросателлитного анализа и геномной in situ гибридизации, позволяют сделать заключение о присутствии 2К/2Е)-замещения у линий к-1433, Л-26, JI-8-1, JI-8-3, JI-22 и расщепление по этим чромосомам у линий JI-8-4 и JI-8-6 У некоторых линий выявлены нуль-аллели для микросателлитных маркеров Xbarc228, Xgwm301 (табл 5) Можно сделать вывод о том, что в 2К/2ПМамещения\ у линий яровой тритикале из коллекции кафедры генетики РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева участвуют минимум четыре типа не идентичных друг другу хромосомы 2D (в таблице все типы по микросателлитным маркерам выделены разными оттенками серого цвета)

ВЫВОДЫ

1 Разработанная методика скрининга, основанная на совместном использовании дифференциального окрашивания хромосом, микросателлитного анализа и геномной гибридизации in situ, позвоаяет проводить эффективное выявление замещений и межгеномных транслокаций у тритикале

2 Линия яровой тритикале 131/7 несет 2В/20-замещение и 2RS 2RL -2В1^-транслокацию Длинное плечо транспонированной хромосомы представлено материалом хромосомы 2В, короткое плечо, центромера и часть дчинного плеча - генетическим материалом хромосомы 2R

3 Линии яровой тритикале Р1587512, Л-12, S-17, Л-24, S-17-4, 131/16-2, Л-13, Л-15 являются гексаплоидами и не имеют чромосом генома D

4 Линии и образец яровой тритикале Л-26, Л-8-1, Л-8-3, Л-22, к-1433 имеют замещение 2R/2D в отсутствие остальных хромосом D-генома

5 Селекционные образцы Л-8-4 и Л-8-6 являются гексаплоидными Выявлено расщепление по замещению хромосом среди растений этих образцов Присутствуют

растения, несущие замещение одной пары 2Я-хромосом на пару 20-хромосом, растения, несущие 14 хромосом ржи и 28 хромосом пшеницы, и их гибриды, несущие 13 ржаных хромосом и 29 хромосом пшеницы.

6. На основании анализа амплификации микросателлитных маркеров выявлены четыре типа хромосомы 2D, вовлеченных в замещение у линий яровой тритикале из коллекции кафедры генетики РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

РЕКОМЕНДАЦИИ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для быстрого поиска замещенных и транслоцированных форм тритикале с участием генома D рекомендуется использование разработанной методики скрининга коллекции с использованием отобранных микросателлитных маркеров.

2. Оптимизированный метод совмещения дифференциального окрашивания и геномной гибридизации in situ, рекомендуется для идентификации ржано-пшеничных транслокаций.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Соловьев А.А , Карлов Г.И, Дивашук М.Г., Базалеев Н А. Морфологическая и цитогенетическая характеристика транслоцированной линии яровой тритикале 131/7 (Morphological and Cytogenetic Characterization of Translocated Spring Tnticale Line 131/7) // Acta Agriculturae Serbica -2005 - Vol X -№ 19 -P 17-25 (наанглийском языке)

2. Дивашук М.Г., Базалеев Н.А. Морфологическая и цитогенетическая характеристика линии яровой тритикале 131/7 с транслокацией (Morphological and Cytogenetic Characterization ot Translocated Spring Triticale Line 131/7) // Review of scientific papers of the students of agronomy — Cacak, 2005. - P 21-23. (на английском языке)

3. Дивашук М.Г., Базалеев НА, Соловьев А.А. Цитогенетическая характеристика линии тритикале 131/7. // «Кариология, кариосистематика и молекулярная филогения растений» - Тезисы докладов и стендовых сообщений V Международного совещания и Школы молодых ученых по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений, г Санкт Петербург, 12-15 октября 2005 г. - Санкт-Петербург, 2005 - С 30

4 Дивашук М.Г., Карлов Г И, Соловьев А А Использование микросателлитных маркеров для идентификации пшенично-ржаных транслокации у гексаплоидной тритикале // Известия ТСХА — 2007 — Вып 1.-С 61-65

1,25 печ. л.

Зак. 360.

Тир. 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

ZXPS^ tt^'-óc /vс - г,. 65/-

к

JJ'/et: .

^ -

t r

/L -У0->/r Si Sf С J/Г'- h 'jf.&Ji'

'¿C с \ S ¡'¿.г / ; /7 ¿/¿/

y

Л ,

i >

■ i .

/