Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение факторов, влияющих на биосинтез L-аспарагиновой кислоты в Pantoea ananatis и Escherichia coli

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение факторов, влияющих на биосинтез L-аспарагиновой кислоты в Pantoea ananatis и Escherichia coli"

На правах рукописи

КУВАЕВА ТАТЬЯНА МИХАИЛОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА БИОСИНТЕЗ L-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ В PANTOEA ANANATIS И ESCHERICHIA COLI

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0 5 СЕН 2013

005532737

Москва 2013

005532737

Работа выполнена в лаборатории №3 Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Каташкина Жанна Иосифовна.

Официальные оппопенты:

Козлов Дмитрий Георгиевич кандидат биологических наук, ФГУП «ГосНИИГенетика».

Голденкова-Павлова Ирина Васильевна доктор биологических наук, профессор РГАУ-МСХА имени М.К. Тимирязева.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Зашита диссертации состоится года в 14® на заседании

диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИГенетика»

Автореферат разослан О-^Ц^СбОи 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат химических наук, доцент

Т.Л. Вогошина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время L-аспарагиновая кислота (L-Acn) находит широкое применение в пищевой, химической промышленности и медицине (Magnuson at al., 2007; Иежица и Спасов, 2007; Cash et al., 2010). Для химической промышленности L-Acn является перспективной "технологической платформой" для синтеза биодеградируемых полимеров и аминированных аналогов таких мировых химических "бестселлеров", как 1,4-бутандиол, тетрагидрофуран и гамма-бутиролактон, используемых в производстве ПАВ, ингибиторов образования минеральных отложений в водных системах, ингибиторов коррозии, супер-абсорбирующих полимеров, усилителей роста растений, растворителей и пластмасс (Werpy and Petersen, 2004; Hasson at al, 2011).

Современное промышленное производство L-Acn основано на ферментативном аминировании фумаровой кислоты с использованием иммобилизованного фермента аспартазы или иммобилизованных бактериальных клеток с высокой аспартазной активностью. Кроме того, L-Acn получают из малеиновой кислоты в мембранной реакторной системе с использованием бактериальных клеток с высокими активностями малеат изомеразы и аспартазы (Yukawa et al, 2010). В обоих случаях, в качестве исходного сырья используются продукты переработки нефти (фумарат, малеат), что существенно ограничивает перспективы использования данной технологии в связи с растущими ценами на нефтепродукты. В этой связи микробиологический синтез L-Acn из возобновляемых и дешевых углеводов (по аналогии с известными примерами биотехнологического производства L-глутаминовой кислоты (L-Глу), L-лизина, и т. д.) мог бы стать перспективной альтернативой современному производству L-Acn из субстратов, получаемых из нефти.

Pantoea ananatis AJ13355 - новый объект биотехнологии. Эта бактерия первого уровня био-безопасности, принадлежащая к роду Enterobacteriacea, обладает хорошими ростовыми характеристиками на простых средах с глюкозой или сахарозой. Она способна расти при умеренно низких значениях pH среды (от 4,5) в присутствии насыщающих концентраций L-Глу (Moriya et al., 1999) и устойчива к высоким концентрациям ряда других органических кислот. В настоящее время на основе штамма AJ13355 сконструирован продуцент L-Глу и внедрён в производство новый процесс ферментации, при котором культивирование клеток сопровождается кристаллизацией конечного продукта (Izui et al, 2003; Izui et al, 2006). P. ananatis AJ13355 можно рассматривать как перспективную био-платформу для производства различных метаболитов с низкой изоэлектрической точкой, таких как L-Глу, L-Acn и др. Поэтому исследование метаболизма данной бактерии и решение задач метаболической инженерии с целью создания штаммов-продуцентов на её основе является актуальной и практически значимой задачей.

Цель и задачи работы

Диссертационная работа посвящена изучению генетических факторов, влияющих на биосинтез L-Acn клетками P. ananatis и поиску альтернативных путей ассимиляции аммония для продукции аминокислот в штаммах энтеробактерий Escherichia coli и P. ananatis.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. теоретически реконструировать и экспериментально подтвердить функциональность путей биосинтеза и катаболизма L-Acn клетками P. ananatis;

2. выявить генетические факторы, необходимые для продукции L-Acn в клетках P. ananatis;

3. изучить возможность использования природного гена gdhA для увеличения продукции L-Acn штаммом-продуцентом P. ananatis-,

4. найти и биохимически охарактеризовать потенциальные «биосинтетические» (аммонийфиксирующие) аспартатдегидрогеназы из бактерий, принадлежащих к первому уровню биологической безопасности;

5. проверить возможность использования гетерологичной аспартатдегидрогеназы в качестве дополнительного фермента, обеспечивающего ассимиляцию аммония клетками Е. coli.

Научная новизна и практическая значимость работы

Проведена теоретическая реконструкция путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой кислоты клетками P. ananatis. Проведена экспериментальная проверка функционирования предсказанных путей в P. ananatis, выявлены генетические модификации, необходимые для продукции L-Acn, и осуществлено конструирование штамма, продуцирующего L-Acn.

В ходе работы обнаружено, что идентифицированная ОРС gdhA из p. ananatis кодирует НАДН-зависимую глутаматдегидрогеназу. Показано, что усиление экспрессии данной ОРС комплементирует отсутствие глутаматсинтазы. Впервые показаны преимущества использования НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы для продукции L-Acn.

В работе клонированы гены аспартатдегидрогеназ из бактерий Polaromonas sp., Rhodopseudomonas palustris и Bradyrhizobium japonicunr, соответствующие ферменты очищены и биохимически охарактеризованы. Согласно полученным данным, ферменты из B.japonicum и R. palustris могут быть отнесены к анаболическим, участвующим в ассимиляции аммония. Введение аспартатдегидрогеназы из B.japonicum в штамм-продуцент L-аргинина на основе Е. coli привело к увеличению продукции в 2 раза.

Публикации и апробация работы

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК, и 2 патента РФ. Материалы диссертации дважды докладывались автором на конкурсе работ молодых сотрудников НИИ Аджиномото-Генетика (Москва, 2008; Москва, 2010).

Апробация диссертации состоялась на совместном семинаре Научно-технического совета НИИ Аджиномото-Генетика и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП ГосНИИгенетика 20 мая 2013 года.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на страницах, включая рисунков и <3.5 таблиц. Список цитируемой литературы содержит источников, в том числе /5"на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Теоретическая реконструкция и экспериментальная проверка путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой кислоты в Pantoea ananatis

Объектом исследования является бактерия Pantoea ananatis из семейства Enterobacteriaceae. Природный штамм Р. ananatis AJ13355 был селектирован в 1990-х годах из почвы чайной плантации Ивата-Ши (Япония) по способности к росту на умеренно кислой среде в присутствии насыщающих концентраций L-Глу и прошел тест на биологическую безопасность.

В 2002 году была определена полная нуклеотидная последовательность генома Р. ananatis AJ13355, после чего силами нашей лаборатории была составлена его подробная аннотация. Данный геном состоит из двух кольцевых молекул ДНК: 4555536 п.н. хромосомы (NCBI GenBank: АР012032.1) и 321744 п.н. плазмиды рЕА320 (NCBI GenBank: АР012033.1) (Нага et al„ 2012).

На основе анализа полной нуклеотидной последовательности и полученной аннотации были реконструированы возможные пути биосинтеза и катаболизма L-Acn в клетках Р. ananatis AJ13355 (Рисунок 1). Для построения данной схемы учитывались известные метаболические карты для Е. coli и S. typhimurhim как наиболее изученных представителей энтеробактерий. Практически все идентифицированные открытые рамки считывания (ОРС) Р. ananatis были ортологичны белкам из Е. coli с высокой степенью идентичности по аминокислотной последовательности, за исключением ОРС глутаматдегидрогеназы и глутаматсинтазы.

В данной работе была проведена экспериментальная проверка предложенной схемы биосинтеза и катаболизма L-Acn в Р. ananatis, включавшая конструирование штаммов, содержащих делеции ключевых генов предполагаемых путей, анализ фенотипа полученных мутантов, и, в ряде случаев, измерение активности соответствующих ферментов.

Для конструирования делеций использовали метод XRed-зависимой интеграции полученных в ПЦР двухцепочечных фрагментов ДНК, ранее успешно адаптированный для использования в Р. ananatis силами нашей лаборатории (Katashkina et al., 2009). Для получения штаммов с множественными делециями использовали метод переноса маркированной

з

мутации с помощью электропорации геномной ДНК. Данные по фенотипам основных полученных мутантов суммированы в таблице 1.

L-Аспартат

Глюкоза

1

Глюкозо-бФ

in WkAPykF ■ Пир ppsA

рскА

О А

„ таеВ тщ «• Пир. , . Малат

sfcA

fumABC/ ---

I ' Глиоксилат

Фумарат -Изоцитрат

асеЕ aceF IpdA

Ацетил-КоА

,(frdABCD)

sdhABCD

Сукцинат

а-кГ

NH4*

icdA НАД(Ф)Н НАД(Ф)"

L-Глу

АДФ АТФ, NH,

Рисунок 1 - Предполагаемая схема путей биосинтеза и катаболизма L-Acn в Р. ananatis AJ13355 и ее сравнение с метаболической картой Е. coli. Курсивом черного цвета указаны названия гомологичных кодирующих рамок Р. ananatis и Е. coli, красным цветом отмечены кодирующие рамки Р. ananatis, не имеющие гомологов в Е. coli; зеленым цветом отмечены гены Е. coli, отсутствующие в геноме Р. ananatis. Сокращения: Глюкозо-бФ - глюкозо-6-фосфат; ФЕП - фосфоенолпируват; Пир - пируват; Ацетил-КоА - ацетил-коэнзим А; ОА -оксалоацетат; а-кГ - а-кетоглугарат; Сук-КоА - сукцинил-коэнзим А.

Было обнаружено значительное сходство рассматриваемого метаболизма у Р. ananatis и Е. coli, а именно: 1) Идентифицированные ОРС Р. ananatis aspC и tyrB действительно кодируют ферменты, обладающие активностью аспартатаминотрансферазы. Реакция аспартатаминотрансферазы является ключевой для биосинтеза L-Acn в Р. ananatis. 2) Показано, что идентифицированная ОРС ррс действительно кодирует ФЕП-карбоксилазу. Как ив Е. coli, ФЕП-карбоксилаза из Р. ananatis ингибируется L-аспартатом, а инактивация гена ррс приводит к строгой ауксотрофии по L-Глу. 3) Подтверждено функционирование предсказанных ОРС Р. ananatis gltA и sucA, кодирующих цитратсинтазу и субъединицу компонента Е1(0) а-кетоглутаратдегидрогеназы соответственно.

Синтез глутамата. В результате анализа генома P. ananatis было предсказано наличие ключевых компонентов для двух альтернативных путей синтеза L-Глу: 1) с помощью глутаматдегидрогеназы, и 2) с помощью совместного функционирования глутаматсинтазы и глутаминсинтазы (ГС/ГОГАТ путь). В геноме P. ananatis были идентифицированы ОРС, кодирующие белки, ортологичные известным глутаматдегидрогеназе GdhA из Thermotoga maritima (Kort et ai, 1997) (аминокислотная идентичность 54%) и глутаминсинтазе GlnA из Е. coli (Alibhai and Villafranca, 1994) (аминокислотная идентичность 90%). Также была обнаружена ОРС gltB, кодирующая белок, ортологичный большой субъединице предполагаемой глутаматсинтазы из Agrobacterium tumefaciens (68% аминокислотной идентичности).

В клеточном экстракте дикого штамма Р. ananatis SC 17(0), выращенного в аэробных условиях на минимальной среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода, обнаруживалась активность глутаматсинтазы (0,039 ± 0,002) Е/мг, что подтверждает присутствие в клетках активного фермента. (В работе за 1 Е активности принимали убыль 1 мкмоль субстрата или образование 1 мкмоль продукта за 1 мин.) В то же время, активность глутаматдегидрогеназы в тестируемых условиях (с НАД(Н) или НАДФ(Н) в качестве кофакторов) была ниже детектируемого уровня (<0,002 Е/мг). В отличие от Е. coli, делеция предсказанной ОРС gltB в штамме Р. ananatis SC 17(0) привела к строгой ауксотрофии по L-Глу (штамм нуждался в добавления L-Глу в количестве 0,5 г/л даже на богатой аммонием среде М9). С другой стороны, делеция ОРС gdhA существенно не повлияла на аэробный рост Р. ananatis на глюкозе.

Таким образом, установлена единственность пути биосинтеза L-Глу посредством совместного функционирования глутаматсинтазы и глутаминсинтазы. Идентифицированная ОРС Р. ananatis gltB, кодирующая глутаматсинтазу, необходима для биосинтеза L-Глу.

ОРС gdhA кодирует НАДН-зависимую глутаматдегидрогеназу. Для того чтобы выяснить, кодирует ли предсказанная ОРС gdhA Р. ananatis активный фермент, была проведена замена ее природной регуляторной области на гибридный промотор Р,ас. При индукции промотора с помощью ИПТГ в клеточных экстрактах штамма SC 17(0)?,acgdhA-AgltB, в отличие от штамма с неизмененной регуляторной областью, обнаруживалась активность НАД(Н)-зависимой глутаматдегидрогеназы для прямой и обратной реакций (0,23 ± 0,03) Е/мг и (0,026 ± 0,003) Е/мг соответственно; активность с НАДФ(Н) не детектировалась. Таким образом, показано, что идентифицированная ОРС gdhA из Р. ananatis действительно кодирует НАДН-зависимую глутаматдегидрогеназу. Усиленная экспрессия gdhA комплементировала делецию гена gltB в Р. ananatis.

Утилизация аспартата и глутамата в качестве источника углерода. Природный штамм Р. ananatis может эффективно использовать L-Acn и L-Глу в качестве единственного источника углерода. Для того чтобы прояснить, каковы пути катаболизма этих соединений, был проведен фенотипический анализ ряда делеционных мутантов. Результаты анализа, суммированные в таблице 1,

s

указывают на то, что аспартазная реакция, осуществляемая продуктом идентифицированной в клетках Р. апапайз ОРС оурЛ, является ключевым этапом утилизации Ь-Асп. Можно предположить, что, в свою очередь, утилизация Ь-Глу происходит путем переноса аминогруппы с Ь-Глу на оксалоацетат в реакции аспартатаминотрансферазы с образованием а-кетоглутарата и Ь-Асп. Затем образовавшийся Ь-Асп утилизируется в реакции аспартазы с высвобождением аминогруппы в виде аммиака, а а-кетоглутарат утилизируется в кетоглутаратдегидрогеназной реакции цикла Кребса. Данные, приведенные в таблице 1, подтверждают, что инактивация одного из этих этапов (АярА, АврС/ТугВ, ЭисА) блокирует рост Р. апапаПэ на Ь-Глу.

Таблица 1 - Рост мутантов Р. апапаЧз в минимальной среде М9 с глюкозой, аспартатом или глутаматом в качестве единственного источника углерода

Генотип Фенотип*

Дикий тип Прототроф; L-Глу"1"; L-Acn+ '

AaspCAtyrB Ауксотроф no L-Acn и L-тирозину; L-Глу"; L-Acn+

AaspA Прототроф; L-Глу"; L-Acn"

AgllB Ауксотроф по L-Глу; L-Глу'1'; L-Acn1"

AgdhA Прототроф; L-Diy^L-Acn1"

Appc Ауксотроф по L-Глу

AsucA Частичный ауксотроф по лизину, метионину, ДАЛ; L-Глу"; L-Acn'

Agl/A Ауксотроф по L-Глу; L-Acn'

* Ь-Глу+1'\ Ь-Асп+ и означает способность (или неспособность) расти на данных аминокислотах как единственном источнике углерода.

2 Генетические факторы, необходимые для продукции L-Аеп в Р. ananaíis

На основе подтвержденной схемы путей биосинтеза и катаболизма L-Acn и L-Глу, были сделаны следующие предположения о факторах, необходимых для продукции L-Acn клетками Р. ananaíis-. 1) повышение активности анаплеротических реакций (ФЕП-карбоксилазной или пируваткарбоксилазной); 2) снижение активностей цитратсинтазы и малатдегидрогеназы; 3) повышение активности аспартатаминотрансферазы; 4) снижение активности а-кетоглутаратдегидрогеназы; 5) повышение скорости аминирования а-кетоглутарата за счёт увеличения глутаматдегидрогеназной или глутаматсинтазной активности; 6) инактивация аспартазы.

Чтобы проверить сделанные предположения и определить факторы, критические для продукции L-Acn клетками Р. ananaíis, была разработана следующая схема введения модификаций и культивирования штаммов.

Для предотвращения нежелательного расходования оксалоацетата в цикле Кребса, в штамм Р. ananaíis SCI7(0) была введена делеция гена glíA. Полная инактивация цитратсинтазы (в результате делеции gllA) в Р. ananaíis приводила к зависимости от добавления L-Глу. В то же время, добавленный

L-Глу предполагалось использовать в качестве донора аминогруппы для продукции L-Acn. Чтобы блокировать нежелательную деградацию образующегося в реакции переаминирования а-кетоглутарата, мы ввели делецию гена sue А, инактивирующую а-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс. Таким образом, а-кетоглутарат, образующийся в результате переноса аминогруппы с L-Глу на оксалоацетат в аспартатаминотрансферазной реакции, далее может использоваться для повторного аминирования а-кетоглутарата с образованием L-Глу (фиксации аммония в реакциях глутаматсинтазы/глутаминсинтазы, глутаматдегидрогеназы). Чтобы

блокировать утилизацию L-Acn, ввели делецию гена aspA.

В результате на базе Р. ananatis SC 17(0) были сконструированы штаммы, содержащие делеции Agil А, Д sucA и Д aspA, как все одновременно, так и в попарных комбинациях. Чтобы обеспечить высокую активность ФЕП-карбоксилазы, устойчивую к ингибированию L-Acn, мутантный аллель Е. coli ppcK620S (Yano и Izui, 1997) был клонирован в составе интегративного вектора pMIV-5JS. Для повышения активности аминирования а-кетоглутарата в Р. ananatis мы выбрали экспрессию чужеродной глутаматдегидрогеназы из Е. coli вместо усиления ГС/ГОГАТ пути, требующего расхода АТФ. Чтобы повысить активность аспартатаминотрансферазы, ОРС asp С из Е. coli была клонирована в составе плазмиды pMW118-PlacUV5-!acI под контролем P/^uvs-lacl элемента.

Данные, суммированные в таблице 2, показывают, что критическим для продукции L-Acn клетками Р. ananatis является сочетание, по крайней мере, четырех факторов, а именно, повышения активностей ФЕП-карбоксилазы и глутаматдегидрогеназы, а также инактивации (или существенного снижения активностей) цитратсинтазы и а-кетоглутаратдегидрогеназы. Дополнительная инактивация аспартазы также заметно улучшила продукцию L-Acn. Полученный штамм Р. ananatis, ЗД-S, с делениями трех генов, asp A, gltA и sue А, может рассматриваться в качестве базового штамма-продуцента L-Acn.

Инактивация генов рукА и pykF. Как показано в таблице 2, штамм P. ananatis 3A-S[RSFGP], содержащий делеции генов asp A, gltA, sucA в хромосоме, а гены ррс и gdhA из Е. coli в составе плазмиды RSFGP, накапливал до 0,7 г/л L-Acn при культивировании в пробирках. В то же время, наблюдалось накопление до 2-3 г/л аминокислот, для которых пируват является общим предшественником, а именно, L-валина, L-лейцина и L-аланина. Для предотвращения непродуктивной конверсии ФЕП в пируват, в ЗД-S штамм последовательно ввели делеции ДрукА и ДpykF. Выяснилось, что блокирование генов обеих пируваткиназ (но не одного из них) значительно снижает накопление упомянутых аминокислот. Таким образом, на основе полученного штамма P. ananatis, 5A-S, с множественными делениями ДaspA, AgltA, AsucA, АрукА и ApykF можно проводить дальнейшее конструирование вариантов, продуцирующих L-Acn. Несмотря на чрезвычайно медленный рост, штамм 5A-S[RSFGP] с дополнительными делециями генов пируваткиназ накапливал L-Acn больше, чем контрольный штамм 3A-S[RSFGP] (Таблица 3).

Таблица 2 - Влияние генетических факторов на продукцию L-Acn штаммами Р. ananatis*

Штамм Плазмида Делеции Амплификация L-Acn, г/л Конечн. L-Глу, г/л

AG - aspA, gltA - <0,1 ОД

SG sucA, gltA <0,1 3,0

AS aspA, sucA <0,1 3,0

ЗД-S aspA, sucA, gltA <0,1 1,6

AG pMIVK620S aspA, gltA _„ K620S ррс <0,1 <0,1

SG sucA, gltA <0,1 0,4

AS aspA, sucA <0,1 2,0

ЗД-S aspA, sucA, gltA <0,1 1,8

ЗД-S pMWgdhA aspA, sucA, gltA gdhA <0,1 2,0

AG RSFGP aspA, gltA ррс, gdhA 0,1 0,3

SG sucA, gltA 0,4 2,5

AS aspA, sucA 0,7 16,0

ЗД-S aspA, sucA, gltA 0,7 2,1

AS RSFGP, pMWaspC aspA, sucA ррс, gdhA, aspC 1,0 14,7

ЗД-S aspA, sucA, gltA 0,7 2,5

^¿Л-О ¡.НУ 1 У V ил/иьуп, ДИСП, ____111 '__— _

* Культивирование в пробирках 48 часов (глюкозы 40 г/л, Ь-Глу 3 г/л). Для штаммов, содержащих рМДУозрС, добавляли 1мМ ИПТГ. Представлены усредненные данные для 3 независимых культур.

Таблица 3 - Влияние делеций генов пируваткиназ рукА и pykF на продукцию L-Acn штаммами Р. ananatis*

Штамм Плазмида Делеции Амплифика ция ОП S9S L-Acn, г/л Ост. L-Глу, г/л Ост. глюкоза, г/л

ЗД-S RSFGP aspA, sucA, gltA ррс, gdhA 12,0 0,7 2,1 0,0

5A-S RSFGP aspA, sucA, gltA, pykA, pykF ррс, gdhA 2,0 0,9 2,5 >25

__РУЯ/1, уум _____

* Культивирование в пробирках 48 часов (глюкозы 40 г/л, Ь-Глу Зг/л). Представлены усредненные данные для 3 независимых культур.

Интеграция аллеля ppcK620S и отбор штамма, устойчивого к L-Acn.

Чтобы обеспечить ФЕП-карбоксилазную активность, устойчивую к ретроингибированию, нативный ген ррс был делетирован в штамме 5A-S, а мутантный аллель Е. colippcK620S, кодирующий ФЕП-карбоксилазу, устойчивую к ингибированию L-Acn, был амплифицирован в полученном штамме с помощью системы mini-Mu интеграции с использованием сконструированной интегративной плазмиды pMIVK620S. R62cs

Полученные интегранты, названные 5ДР2, содержали аллель ррс с маркером устойчивости к Сш. В результате сравнительного анализа уровня накопления аспартата полученными интегрантами в среде с удвоенной концентрацией L-Глу (6 г/л) (что обеспечивало продукцию L-Acn без амплификации гена глутаматдегидрогеназы), был отобран штамм 5ДР2-36.

Штамм 5АР2-36 с интегрированным геном ррс " накапливал 1,6 г/л L-Acn при культивировании в описанных условиях, что заметно больше уровня накопления L-Acn штаммом, содержащим плазмиду с тем же геном (Таблица 4). В сравнении с другими интегрантами в отобранном 5ДР2-36 варианте по оценке устойчивости к Сш, а также по результатам измерения ФЕП-карбоксилазной активности можно было предполагать наличие

„ K620S

единственной интегрированнои копии гена ррс

Теоретически, возможность дальнейшего успешного конструирования штамма, синтезирующего L-Acn, могла ограничиваться устойчивостью клеток к конечному продукту. Проверка роста штамма 5АР2-36 на средах с высокими концентрациями L-Acn показало существенное снижение его устойчивости к аспартату (15 г/л) по сравнению со штаммом дикого типа (>45 г/л). Поэтому на основе безмаркерного производного штамма 5ДР2-36 были отобраны спонтанные мутанты, устойчивые к 30 г/л L-Acn. Среди них был выбран штамм 5AP2R с таким же уровнем накопления L-Acn, как у родительского штамма.

Измерение активности ФЕП-карбоксилазы в клеточных экстрактах штаммов SC 17(0) с природным геном ррс и 5AP2R с делецией ррс и амплификацией ppcK620S, показало, что по уровню активности фермента штамм 5AP2R близок к исходному SC 17(0). В тоже время, активность ФЕП-карбоксилазы в 5AP2R практически не ингибируется L-Acn, в отличие от штамма дикого типа (Таблица 5).

Таблица 4 - Влияние аллеля ppcK620S из Е. coli на продукцию L-Acn штаммами Р. ananatis*

Штамм Плазмида Делении Амплифика ция ОП„, L-Acn, г/л Ост. L-Глу, г/л Ост. глюкоза, г/л

5ДР - aspA, sucA, gltA, рукА, pykF, ррс 5,4 0 6,0 34,7

5ДР2-36 - miniMu ppcK620S 8,4 1,6 6,0 0

5ДР PMIVK620S ррсК6Ш 7,4 1,0 6,0 0

* Культивирование в пробирках 48 часов (глюкозы 40 г/л, Ь-Глу 6 г/л). Представлены усредненные данные для 3 независимых культур.

Таблица 5 - Активность ФЕП-карбоксилазы в клеточных экстрактах штаммов Р. ananatis,

г- I- K620S

содержащих замену природного гена ррс на ген Ь. coli ррс

Штамм* Активность ФЕП-карбоксилазы, Е/мг

L-Acn, 0 мМ L-Acn, 20 мМ

SC 17(0) природный ррс 0,25 ±0,01 <0,01

5AP2R ___K620S ррс 0,34 ±0,01 0,24 ±0,01

* Клетки выращены в среде М9 с глюкозой (10 г/л), L-Глу (1 г/л) и L-Лиз, L-Мет, DL-ДАП

(по 0,1 г/л).

Инактивация малатдегидрогеназы и глюкозодегидрогеназы. Далее, для блокирования нежелательного превращения оксалоацетата в малат, делеция гена mdhA, кодирующего малатдегидрогеназу, была введена в штамм 5AP2R.

Ранее в экспериментах по культивированию штаммов-продуцентов L-Глу в лабораторных ферментерах наблюдалось накопление значительного количества глюконовой кислоты в культуральной жидкости. Глюконовая кислота образуется из глюкозы в глюкозодегидрогеназной реакции. P. ananatis содержит все гены, ответственные за синтез как белковых, так и кофакторных компонентов, необходимых для функционирования глюкозодегидрогеназы (Andreeva et ai, 2011). Для предотвращения нежелательной конверсии глюкозы в глюконовую кислоту, ген gcd, кодирующий глюкозодегидрогеназу, был делетирован в штамме 5AP2R.

Показано положительное влияние инактивации как малатдегидрогеназы, так и глюкозодегидрогеназы на продукцию L-Acn (Таблица 6). После объединения обеих мутаций Amdh и Aged в одном штамме положительный эффект сохранился. Полученный в результате бесплазмидный штамм накапливал до 1,2 г/л L-Acn.

Как видно из таблицы 6, введение плазмиды, несущей ген глутаматдегидрогеназы из £ coli, приводило к значительному увеличению накопления L-Acn для всех представленных штаммов. Таким образом, как и следовало ожидать исходя из приведённых выше данных об отсутствии глутаматдегидрогеназной активности в клетках Р. ananatis дикого типа, аминирование а-кетоглутарата до L-Глу является узким местом для продукции L-Acn в клетках Р. ananatis.

Таблица 6 - Влияние мутации Amdh и Agcd на продукцию L-Acn штаммами Р. ananatis* на фоне введения гена gdhA из Е. coli в составе плазмиды pMWgdhA и без него

Штамм Описание Orijpj L-Acn, г/л Конечн. L-Глу, г/л Ост. глюкоза, г/л

5ДР2Я** контроль 3,5 0,14 2,5 0,0

5AP2RM-S A mdh 3,2 0,36 1,5 0,0

5AP2RG Aged 5,8 0,5 2,2 0,0

5AP2RMG-S Amdh, Aged 7,4 1,2 2,1 7,4

5AP2R[pMW^A^l контроль 6,0 1,7 2,9 5,1

5 Д Р 2 R M-S f р MWgdhA J A mdh 7,2 3,7 2,9 3,6

5AP2RG[pMWffiflMl Aged 5,5 2,4 3,0 8,4

5AP2RMG-S[pMW^W] Amdh, Aged 5,5 4,5 3,3 12,0

* Культивирование в пробирках 72 часа (глюкозы 40 г/л, Ь-Глу 3 г/л). Представлены усредненные данные для трех независимых культур; ** 5&Р2К=8СП(0)Аа!рАА*исА&ё11ААрукАд>рукРА5ркАррс гЫшМи(р/>ск"0).

ю

3 Использование НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы из P. ananatis для продукции L-аспартата

Обычно, анаболические глутаматдегидрогеназы из различных организмов, включая Е coli, С. glutamicum, S. cerevisiae, катализируют НАДФН-зависимое аминирование а-кетоглутарата. Описаны НАДН-зависимые глутаматдегидрогеназы из организмов, принадлежащих к разным родам (Kujo and Ohshima, 1998; Jahns, 1996; Kort et al„ 1997; Ruiz et al„ 2003; Ryushi Kawakami et al., 2007; Hammer and Johnson, 1988; Boles et al„ 1993), но ферменты этого типа никогда не использовались для микробиологического синтеза аминокислот. Истинная функция таких ферментов in vivo до конца не выяснена. Большинство НАДН-зависимых дегидрогеназ, и, по крайней мере, некоторые НАДН-глутаматдегидрогеназы, в природе выполняют катаболическую функцию (Hammer and Johnson, 1988; Boles et al., 1993), и неочевидно, могут ли они обеспечить эффективное аминирование а-кетоглутарата в бактериальных штаммах-продуцентах.

Если проследить за теоретическим потреблением и синтезом восстановленных кофакторов при биосинтезе L-Acn, то оказывается, что в процессе биосинтеза 1 моля L-Acn из глюкозы образуется 1 моль НАДН в реакции глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (из гликолиза) и расходуется 1 моль НАДФН при аминировании оксалоацетата. Поэтому использование НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы для продукции L-Acn может иметь преимущества с точки зрения обеспечения баланса восстановленных кофакторов.

Учитывая, что ОРС gdhA из Р. ananatis кодирует именно НАДН-зависимую глутаматдегидрогеназу, представлялось интересным оценить возможность ее применения для синтеза L-Acn в уже созданном генетическом окружении. Для усиления экспрессии кодирующего этот фермент гена gdhA, его регуляторная область была изменена на гибридный промотор Ршс в штамме-продуценте L-Acn Р. ananatis 5AP2RMG-S. Экспрессия гена gdhA под контролем промотора Ptoc в полученном штамме 5AP2RMG-P,acgdhA была подтверждена появлением активности глутаматдегидрогеназы даже в отсутствие индукции ИПТГ ((0,024 ± 0,003) Е/мг с НАД+); добавление ИПТГ в среду увеличивало уровень активности еще в 4 раза. Как видно из таблицы 7, введение активного аллеля гена gdhA из Р. ananatis привело к значительному (в 5 раз) увеличению накопления L-Acn по сравнению с родительским штаммом 5AP2RMG-S. По сравнению со штаммом 5AP2RMG-S[pMWgc№/l], в котором был экспрессирован ген НАДФН-глутаматдегидрогеназы из К coli (Таблица 7), наблюдалось значительное (в 1,5 раза) увеличение накопления конечного продукта (при его неизменном массовом выходе 15%) за счёт улучшения ростовых характеристик и более полного потребления глюкозы.

Таким образом, продемонстрированы возможные преимущества использования найденной НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы для продукции L-Acn, по крайней мере, в использованных условиях культивирования.

Ii

Таблица 7 - Влияние увеличенной экспрессии gdhA из P. ananatis на продукцию L-Acn штаммами P. ananatis*

Штамм ОП595 L-Acn, г/л Конечн. L-Глу, г/л Ост. глюкоза, г/л

5AP2RMG-S контроль 7,4 1,2 2,1 7,4

5AP2RMG-P,«£Í/M P. ananatis gdhA 8,2 6,1 3,1 1,4

5AP2RMG-SfpMWsrf/¡/i] Е. coli gdhA 5,5 4,5 3,3 12,0

* Культивирование в пробирках 72 часа (глюкозы 40 г/л, Ь-Глу 3 г/л). Представлены усредненные данные для трех независимых культур.

Тем не менее, необходимость использования в биосинтезе аспарагиновой кислоты глутамата в качестве донора для аминотрансферазной реакции ограничивает возможности дальнейшего улучшения штамма-продуцента. С этой точки зрения, интересной альтернативой представляется поиск возможностей синтеза L-Acn путем прямого акцептирования аминогруппы оксалоацетатом, например, с помощью аспартатдегидрогеназ.

4 Новые L-аспартатдегидрогеназы из мезофильных бактерий Polaromonas sp., Rhodopseudomonas palustris и Bradyrhizobiumjaponicum

На данный момент охарактеризованы только 4 прокариотические L-аспартатдегидрогеназы (КФ 1.4.1.21, АДГ), для которых in vitro показан катализ как окислительного дезаминирования L-Acn, так и восстановительного аминирования OA с использованием НАД(Ф)+/НАД(Ф)Н в качестве кофактора (Li et al., 201 la;. Li et al, 201 lb; Yang et al., 2003; Yoneda et al., 2006). Однако in vivo основной функцией термофильных АДГ из Thermotoga maritima (АДГ,та) и Archaeoglobus fulgidus (АДГяГи) является, по-видимому, катализ окислительного дезаминирования L-Acn до промежуточного продукта реакции -иминоаспартата, который далее используется в пути биосинтеза НАД+ de novo (Yang et al., 2003; Yoneda et al., 2006). АДГ из мезофильной почвенной бактерии Ralstonia eutropha (АДГге„), по-видимому, in vivo участвует в катаболизме L-Асп для обеспечения клеток азотом и углеродом (Li et al, 2011b). Биологическая роль недавно обнаруженной АДГ в клетках мезофильной бактерии Pseudomonas aeruginosa, (АДГряе) не установлена; тем не менее, в экспериментах Ли и соавт. (Li et al., 2011а) удалось использовать способность этого фермента аминировать OA в разработанных авторами системах биоконверсии фумарата или сукцината до L-Acn. Однако возможность использования гена АДГрас для прямого микробиологического синтеза L-Acn не показана, и, более того, ограничена тем, что Р. aeruginosa является условным патогеном для человека и относится к группе второго уровня биологической безопасности.

Кроме того, при конструировании штаммов-продуцентов важно иметь набор генов, кодирующих ферменты, различающиеся по своим каталитическим свойствам, и, в частности, по кофакторной специфичности. Это дает возможность в экспериментах in vivo подобрать фермент, в наибольшей

12

степени отвечающий существующим в клетке пулам субстратов и кофакторов, что, в свою очередь, определяется как генетическими свойствами конкретного штамма-продуцента, так и условиями его культивирования. Что касается известных мезофильных АДГ, то АДГгеи является предпочтительно НАД(Н)-зависимым ферментом, а АДГрае имеет двойную, НАД(Н) и НАДФ(Н), кофакторную специфичность, тогда как примеров НАДФ(Н)-специфических АДГ нет.

Таким образом, поиск и биохимическая характеристика потенциальных «биосинтетических» (аммонийфиксирующих) АДГ из мезофильных бактерий, принадлежащих к первому уровню биологической безопасности, по-прежнему остается актуальным как для дальнейшего конструирования штаммов-продуцентов L-Acn методами метаболической инженерии, так, возможно, и для разработки новых процессов биоконверсии и ферментативного катализа.

4.1 Поиск анаболических АДГ в геномах бактерий

К моменту начала работы были охарактеризованы только термофильные АДГ,та (Yang et al., 2003) и АДГаГц (Yoneda et al., 2006). Стоит отметить, что mini-Mu-зависимая интеграция гена, кодирующего АДГ|та, в хромосому штамма-продуцента P. ananatis 5AP2R улучшила способность штамма к синтезу L-Acn в 2-2,5 раза. Поиск гомологов АДГ,та (NCBI protein_id:NP_229443.1) по базе данных NCBI был проведен с помощью компьютерной программы BLASTP (http://ncbi.nlm.nih.gov). Гомологи АДГ,та с высокой (более 65%) идентичностью были найдены в термофильных бактериях рода Thermotoga; гомологи с относительно низкой (35-45%) идентичностью найдены в термофильных представителях рода Thermosipho, а также термофильных и метаногенных археях; в мезофильных бактериях были найдены гомологи только с очень низкой (25-35%) идентичностью. Поэтому выбор потенциальных мезофильных АДГ только на основе сравнений аминокислотных последовательностей представлял определенную трудность, и нужны были дополнительные критерии.

Мы попытались найти новые АДГ на основе анализа расположения в геномах генов предполагаемых АДГ, учитывая, что зачастую гены, кодирующие ферменты со схожими функциями, имеют схожее генетическое окружение.

Известный ген ТМ1643 из Т. maritima, кодирующий АДГ,та, образует оперон вместе с nadA и nadC генами, кодирующими хинолинат-синтетазу А и никотинат-нуклеотид-пирофосфорилазу соответственно (Рисунок 2а). Гены гомологов АДГ,та, найденные в археях, включая A. fulgidus, и термофильных бактериях имеют такую же организацию как в Т. maritima, т.е. сцеплены с nadA и nadC. По аналогии с АДГ,та (Yang et al., 2003), можно предположить, что потенциальные АДГ из этой группы in vivo катализируют окислительное дезаминирование L-Acn до иминоаспартата, который далее используется в пути биосинтеза НАД+ de novo. Поэтому данная группа генов гомологов АДГ,та была исключена из рассмотрения для поиска анаболических АДГ.

Другая группа, включающая гены гомологов АДГ(та , которые сходным образом организованы в гипотетический оперон (Рисунок 26) вместе с генами предполагаемых альдегиддегидрогеназы, тиаминпирофосфат-зависимого белка, дегидрогеназы, транскрипционного регулятора, a-ß гидролазы и белка с cupin доменом, была выявлена в геномах бактерий из рода Burkholderia, видов Р. aeruginosa, Polaromonas sp, R. eutropha, Cupriavidus taiwanensis, Mesorhizobium sp. BNC1, Serratia proteamaculans. Из указанной группы генов со сходным генетическим окружением для дальнейшего исследования мы выбрали ОРС Врго_3686 из Polaromonas sp., бактерии первого уровня биологической безопасности.

а) Т. maritima

г) В. Japonlcum _

<_и нищ н

MFS-П LysR-P АДГ ДГ

Рисунок 2 - Генетическое окружение известной АДГ1та из Т. maritima (а) и исследуемых в

работе гомологов АДГщ,, из Polaromonas sp. (б), Я palustris (в) и B.japonicum (г). Сокращения: ДГ - короткая цепь дегидрогеназы; С-Р - белок, содержащий Cupin домен; Гид - a-ß гидролаза; IclR-P - транскипционый регулятор IclR семейства; ТПФ - тиамин-пирофосфат-зависимый белок; АлДГ - альдегиддегидрогеназа; ABC - ABC транспортер; ГБ - гипотетический белок; АП - моновалентый катион/Н+ антипортер; MFS-П - MFS пермеаза; LysR-P - транскипционый регулятор LysR семейства.

Многие гомологи АДГ,та не поддавались вьщелению в подгруппы по схожим соседям в геномах. Среди них была обнаружена группа предполагаемых АДГ в геномах азотфиксирующих бактерий, что, в частности, могло свидетельствовать о наличии дополнительного пути фиксации аммония в результате биосинтеза L-Acn в этих микроорганизмах. К тому же, согласно современной модели углеродного и азотного обмена между симбиотическими бактериями и растениями, L-Acn наряду с аммонием и L-аланином, образовавшиеся в бактероиде, секретируются в цитозоль растительной клетки в качестве носителей азота (Prell and Pool, 2006). И хотя, в основном, образование L-Acn в бактероидах происходит путем трансаминирования OA за счет активности ААТ (Rastogi and Watson, 1991; Lodwig et al„ 2003), в то же время, в бактероидных экстрактах Rhizobium lupini была экспериментально

зарегистрирована активность АДГ (Kretovich et al., 1981). Поэтому для дальнейшего исследования мы выбрали продукт, кодируемый ОРС Ы16567 из симбиотической азотфиксирующей бактерии Bradyrhizobium japonicum USDA 110, и его гомолог с высокой (74%) идентичностью из свободноживущей Rhodopseudomonas palustris НаА2 (ОРС RPB_0147). Отметим, что выбранные RPB_0147 из R. palustris и Ы16567 из В. japonicum имеют различных соседей в геномах (Рисунок 2в и 2г).

Необходимо сказать, что к моменту окончания работы в печати появились данные об очистке и характеристике двух мезофильных ферментов АДГрае из Р. aeruginosa (Li et al., 201 la) и АДГгеи из R. eutropha (Li et al., 201 lb). Оказалось, что выделенная вторая группа генов потенциальных АДГ, входящих в гипотетический оперон (Рисунок 26) с генами альдегиддегидрогеназы и тиаминпирофосфат-зависимого белка, действительно содержит представителей, для которых АДГ функция была подтверждена экспериментально. Тогда мы провели поиск функциональных партнеров АДГрае по базе данных известных и предсказанных взаимодействий между белками STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes) fhttp://string-db.org).

STRING-анализ выявил в геноме P. aeruginosa возможную принадлежность гена АДГрас к единому оперону совместно с генами предполагаемых альдегиддегидрогеназы (РА3504), тиаминпирофосфат-зависимого белка (РАЗ506), дегидрогеназы (РА3507), транскрипционного регулятора (РА3508), a-ß гидролазы (РА3509) и белка с cupin доменом (РАЗ510). STRING-анализ подтвердил, что подобный оперон, состоящий из генов-гомологов, присутствует в большой группе протеобактерий, включая отмеченную нами Polaromonas sp. Кроме того, выяснилось, что гены гомологов АДГрМ и NadA из Р. aeruginosa являются соседями в геномах других организмов, а именно архей и бактерий из рода Thermotoga, Thermosipho. Таким образом, выделенные ранее первая группа генов предполагаемых АДГ с генетическим окружением как у АДГ,та (Рисунок 2а) и вторая группа предполагаемых АДГ с окружением, приведенным на рисунке 26 для Врго_3686 из Polaromonas sp., согласуются с результатами STRING-анализа.

STRING-анализ показал, что выбранная нами ОРС Ы16567 из азотфиксирующей В. japonicum находится в генетическом окружении, отличном от окружения АДГрас, и, более того, в геноме В. japonicum обнаруживаются с очень низкой идентичностью гомологи функциональных партнеров АДГрае. В то же время, с высокой идентичностью гомологи функциональных партнеров Ы16567 из В. japonicum обнаруживаются в геноме отмеченной нами R. palustris. Поэтому можно предполагать, что выбранные ОРС из В. japonicum и R. palustris могут кодировать ферменты, выполняющие схожую функцию в клетках, но, в то же время, отличную от функции АДГрае или АДГ геи-

Таким образом, в дальнейшей работе особое внимание было уделено следующим генам предполагаемых АДГ: Врго_3686 из Polaromonas sp., Ы16567 из В. japonicum и RPB_0147 из R. palustris.

4.2 Экспрессия выбранных генов предполагаемых АДГ в Е. coli

Структурную часть выбранной ОРС Врго_3686 из Polaromonas sp. клонировали в составе экспрессионного вектора рЕТ-22Ь(+) для синтеза нативного белка. Структурные части ОРС RPB0147 из R. palustris и Ы16567 из В. japonicum с оптимизированным для трансляции в Е. coli кодоновым составом, были химически синтезированы и клонированы в составе экспрессионного вектора рЕТ-15Ь для синтеза гибридных белков с N-концевым ГиСб-лидером. Экспрессия генов осуществлена под транскрипционным контролем индуцибельного промотора, узнаваемого РНК-полимеразой бактерифага Т7, в специализированном реципиентном штамме Е. coli BL21(DE3). Через 3 ч индукции в клетках логарифмически растущей культуры наблюдалось накопление белкового продукта с электрофоретической подвижностью, ожидаемой для АДГро], Гис6-АДГфа и Гис6-АДГЬ;а. Доля целевых белков в растворимой фракции составила 10-15% от суммарного растворимого белка. Индукция сопровождалась появлением АДГ активности в грубых экстрактах рекомбинантных штаммов.

4.3 Очистка и биохимическая характеристика новых дегидрогеназ

Нативный фермент АДГро| был очищен в несколько этапов: осаждение раствором сульфата аммония, анионообменная и аффинная хроматографии. Чистота полученного белкового препарата была более 90% (Рисунок 3) и они обладали АДГ активностью, детектируемой по образованию НАДН в реакции дезаминирования L-Acn при 28°С (Таблица 8). Молекулярный вес нативного фермента АДГро! оценили с помощью гель-фильтационной хроматографии в (49 ± 12) кДа (в диапазоне между 29 и 66 кДа). Поэтому, учитывая массу мономера в 27,6 кДа, можно сказать, что в активной форме белок АДГро| существует как гомодимер.

Гибридные с Гисб-лидером АДГгра и АДГЬ> были очищены с помощью аффинной металл-хелатной хроматографии. Чистота полученных препаратов белков была более 90% (Рисунок 4) и они обладали АДГ активностью, детектируемой по образованию НАДФН в реакции дезаминирования L-Acn при 28°С (Таблица 9).

Рисунок 3 - Очистка нативной АДГро|. 1,7 — белковые маркеры молекулярных масс,

2 - растворимая фракция клеточного экстракта BL21(DE3)[pET-ADH-P] (30 мкг), 3 - фракция после осаждения в растворе сульфата аммония (30 мкг), 4 -фракция после анионообменной хроматографии (4,6 мкг), 5,6 - фракция после аффинной хроматографии (6,6 мкг и 3,3 мкг).

1 2 3 4 5 6 7 т

Таблица 8 - Очистка нативной АДГро1 из Е. coli

Этап очистки Общий белок, мг Общая активность, Е Удельная активность*, Е/мг Выход, % Степень очистки, раз

Клеточный экстракт 375,28 127,355 0,339 100 1

Сульфат аммония 38,19 101,192 2,650 79 8

Анионообменная хроматография (DEAE Sepharose Fast Flow) 2,95 43,304 14,679 34 43

Аффинная хроматография (HiTrap Blue HP) 1,00 26,150 26,150 20 77

Рисунок 4 - Очистка рекомбинантных АДГгра и АДГь,»; а - очистка Гис6-АДГгра;

1 - растворимая фракция клеточного экстракта ВЬ21(ОЕЗ)[рЕТ15-А1ЭН-Яр], 2,4 - очищенный Гис6-АДГгра (12 и 3 мкг), 3 - белковые маркеры молекулярных масс; б - очистка Гисб-АДГ^а; 1 - растворимая фракция клеточного экстракта ВЪ21 (БЕЗ) [рЕТ 15-АЕ>Н-ВД, 2,3 - очищенный Гисс-АДГЩа (5 и 2 мкг), 4 -маркеры.

Таблица 9 - Очистка рекомбинантных АДГфа и АДГь,» из Е. coli

Фермент Этап очистки Общий белок, мг Общая активность, Е Удельная активность*, Е/мг Выход, % Степень очистки, раз

АДГфа Клеточный экстракт 48 30,2 0,62 100 1

Аффинная хроматография (НвТгар НР) 1,8 5,7 3,1 19 5

AflTbja Клеточный экстракт 95 14,1 0,15 100 1

Аффинная хроматография №Тгар НР) 1,8 7,5 4,2 53 28

АДГ активность определяли стандартным методом по образованию НАД(Ф)Н в реакции дезаминирования Ь-Асп, которое детектировали фотометрически по изменению поглощения света с длинной волны 340 нм. Однако прямого определения продуктов прямой и обратной реакций,

17

катализируемых ранее охарактеризованными АДГ (АДГ1та, АДГаЛ1, АДГрае и АДГгеи) не проводилось. Поэтому образование L-Acn в реакции восстановительного аминирования OA, катализируемое in vitro ГиСб-АДГгра, было подтверждено ВЭЖХ (Рисунок 5а). В свою очередь, образование OA и ионов аммония в реакции окислительного дезаминирования L-Acn, катализируемой Гис6-АДГгра, было подтверждено капиллярным электрофорезом (Рисунок 5в) и ВЭЖХ (Рисунок 56) соответственно. Сходные результаты были получены с Гнсв-АДГц. и АДГрЫ как в реакции аминирования OA, так и дезаминирования L-Acn.

(а)

, » LU L-Асл 20

10 5 0

0 2 4 б 8 10 12 14 16 МИН Ю

5 МИН

LU 15

II «

-Л-Л- I—

О 2 4 6 8 10 12 14 16 МИН

III.

L-Acn *

L

0 2 4 6 8 10 12 14 16 МИН

мВ

8

18 20 22 мин 2 мВ

OA

5 МИН

12 14 16 18 20 22 МИН

Рисунок 5 - Определение продуктов реакций, катализируемых ГиСб-АДГфа, методом ВЭЖХ и капиллярного электрофореза. Ферментативное образование L-Acп (а), ЫН) (б) и ОА (в); I - стандарты Ь-Асп и ЫН4+ в водном растворе, стандарт ОА в растворе реакционной смеси без фермента; II - стартовая реакционная смесь (аналогичная картина наблюдалась в контрольной реакционной смеси без субстрата или фермента после инкубирования);

III - после инкубирования при 28°С.

По оптимальным значениям рН, АДГр01 отличается от обоих ферментов из азотфиксирующих бактерий ГиСб-АДГгра и Гис6-АДГЬ]а. В реакции дезаминирования Е-Асп для АДГрЫ наблюдали широкий максимум активности при рН 9,8-11,0; а для Гис6-АДГгра и Гис6-АДГь]а максимум активности был при значении рН 9,8. В реакции аминирования ОА максимум активности для АДГро| наблюдали при рН 9,0-9,8; а для Гис6-АДГгра и Гис6-АДГЬ]а максимум активности сдвинут в сторону более низких рН 8,0-9,0. При этом активность

18

аминирования OA была значительно выше активности дезаминирования для всех очищенных ферментов, и особенно для Гис6-АДГь]а.

Внутриклеточный pH в бактероидах В. japonicum, клетках R. palustris, а также Е. coli и других энтеробактериях и нейтрофилах по разным оценкам находится в диапазоне значений pH 7,0-8,0 (Bhandary and Nicolas, 1985; Rolin et al., 1989; Harwood and Gibson, 1986; Wilks and Slonczewski, 2007; Laane et al., 1979; Ленгелер и др., 2005). При pH 7,0-8,0 активность дезаминирования L-Acn всеми очищенными ферментами Гис6-АДГгра, Гис6-АДГ^а и АДГро| in vitro не детектировалась, тогда как активность аминирования OA снизилась несущественно относительно своего максимально детектируемого уровня. Поэтому можно предполагать, что при физиологических pH эти ферменты катализируют аминирование OA в сходном окружении в клетках R. palustris, В. japonicum и Polaromonas sp., а также, что соответствующие ферменты могут быть использованы для выполнения аналогичной функции в искусственно создаваемых продуцентах L-Acn на основе рекомбинантных клеток Е. coli или других энтеробактерий.

4.4 Субстратная специфичность и кинетические параметры новых АДГР„|, Гис6-АДГгр. и Гис6-АДГм

Анализ субстратной специфичности дегидрогеназ показал, что очищенные АДГ^, Гис6-АДГгра и Гис6-АДГь> имеют высокое сродство к OA и L-Acn с использованием соответствующих кофакторов НАД(Ф)Н/НАД(Ф)+, но, например, не к а-кетоглутарату, пирувату, а также к ряду других проверенных субстратов (Таблица 10).

Таблица 10 - Субстратная специфичность АДГр„1 и рекомбинантных АДГгра и АДГуа

Субстрат Фермент

АДГ,«! АДГгра АДГуа

Восстановительное аминирование*, %

Оксалоацетат 100 ±6 100 ±2 100 ±2

а-кетоглутарат <0,2 2,0 ±0,1 1,4 ±0,1

Пируват <0,2 0,9 ±0,1 0,4 ±0,1

а-кетобутират <0,2 <0,2 <0,2

Кетоизовалериат <0,2 <0,2 <0,2

Кетометилвалериат <0,2 <0,2 <0,2

Окислительное дезаминирование**, %

L-аспартат 100 ±8 100 ±8 100 ±11

L-глутамат <2 4,5 ± 0,4 6±1

L-аланин <2 <2 <2

* Для реакций аминирования АДГ,», за 100% принята активность с ОА и НАДН равная 54 Е/мг (рН 9,8). Для реакций аминирования ГиСб-АДГ^,. и Гис6-АДГ^а за 100% принята активность с ОА и НАДФН равная 16,5 и 51 Е/мг соответственно (рН 9,0). ** Для реакций дезаминирования АДГры за 100% принята активность с L-Acп и НАД* равная 24 Е/мг (рН 9,8). Для реакций дезаминирования Гисб-АДГгр» и Гис6-АДГь,а за 100% принята активность с L-Acп и НАДФ+ равная 4,4 и 5,6 Е/мг соответственно (рН 9,8).

Для всех выделенных ферментов были исследованы кинетические параметры реакций аминирования OA и дезаминирования L-Acn в области оптимальных рН (Таблица 11). Кривая насыщения по НАДН для АДГры была ближе к сигмоиде с положительным коэффициентом Хилла (1,71 ± 0,13), чем к классической гиперболе Михаэлиса-Ментен. Однако, кривые насыщения по OA, аммонию и НАДФН для АДГры представляли собой гиперболы. На основании этого можно предполагать, что нативный фермент АДГро| имеет два активных центра, которые связывают НАДН кооперативно. Кривые насыщения для Гисе-АДГфа и Гис6-АДГь|а представляли собой классические гиперболы Михаэлиса-Ментен.

Сравнение значений kKJKM в отношении кофакторов показало, что очищенная АДГро! обладает двойной НАДН/НАДФН специфичностью с предпочтением к НАДН (в 3-5 раз), чем к НАДФН (Таблица 11). Поэтому по специфичности к НАДН, новая АДГро! занимает промежуточное положение между известными Гис6-АДГгеи (Li el al., 2011b) и АДГрае (Li et al., 2011a). Отметим, что ген, кодирующий новую АДГроЬ имеет генетическое окружение сходное с таковым у генов АДГ R. eutropha и P. aeruginosa, что позволяет предположить общность биологической функции продуктов этих генов. По каталитической эффективности кпрямой и обратной реакций, новая АДГро| катализировала аминирование OA с НАДН или НАДФН значительно быстрее (в 4 или 13 раз), чем дезаминирование L-Acn, что отличает АДГр01 от всех ранее охарактеризованных АДГ (см. Таблица 11). Таким образом, на основании полученных данных, новая АДГро] может быть использована для создания штаммов-продуцентов аминокислот, в частности, L-Acn, в применении к анаэробным или микроаэробным процессам (НАДН/НАД+ » 1).

Анализ кинетических параметров выявил подгруппу новых АДГ, АДГфа и АДГЬ;а из азотфиксиругащих бактерий. Сравнение значений ккт/Км по кофакторам для Гис6-производных этих ферментов показало, что оба они значительно более специфичны к НАДФН (на 1-2 порядка), чем к НАДН. Судя по каталитической эффективности kKXt прямой и обратной реакций, оба фермента катализировали аминирование OA с НАДФН значительно быстрее (в 7-8 раз), чем дезаминирование L-Acn. Высокое сродство к НАДФ(Н) и более быстрое аминирование OA новыми ферментами Гис6-АДГгра и Гис6-АДГЬя отличает их от ранее охарактеризованных АДГ (см. Таблица 11).

Кажущееся значение Км для Гис6-АДГ^а по аммонию (4,3 мМ) значительно меньше аналогичных Км для Гис6-АДГфа, АДГ^ и известных из литературы значений для АДГрае, Гис6-АДГгеи и АДГаГи (Li et al., 2011а; Li et al., 2011b; Yoneda et al., 2006) (Таблица 11). Для кажущихся значений Км по OA наблюдается обратная тенденция (Таблица 11).

Необходимо отметить, что экспериментально определенные параметры для Гис6-АДГгра и Гисв-АДГч. характеризуют не нативные ферменты, а гибридные белки с Гис6-пептидом HaN-коице, что, возможно, несколько меняет их функциональные характеристики. Тем не менее, даже эти экспериментально определенные параметры косвенно свидетельствуют о возможности выполнения новыми ферментами функции восстановительного аминирования

20

ОА в своем природном биологическом окружении. Действительно, оцениваемая в 12 мМ концентрация КН4+ в бактероидах В. ]иротсит (&гее?ег, 1989) вполне физиологична для фермента, имеющего Км - 4,3 мМ. Учитывая при этом, что отношение НАДФН/НАДФ+ = 2,7 в условиях, имитирующих нахождение бактероидов В. ]аротсит в клубеньке (Га/¡та е? а/., 1988), логично предположить участие АДГЬя в ассимиляции аммония за счет катализа аминирования ОА до Ь-Асп для обеспечения нужд бактероида и поддержания симбиоза с растением.

Таблица 11 - Кинетические параметры нативной АДГр01 и рекомбинантных ЛДГгра и АДГ^а в сравнении с параметрами известных АДГ: АДГгсц (£;' е/ а1, 2011Ь), АДГрас (•£.»' е/ а!., 2011а), АДГаш (Уопес1а е/ Ы„ 2006) и АДГии е/ а!., 2003)

Параметр Км, мМ; Агкат, 1/с; ¿„Дм, 1/(мМхс) АДГро|* АДГгра АДГ^а АДГгеи АДГрае АДГаГц АДГипа

Восстановительное аминирование оксалоацетата

Условие рН 9,8 28°С рН 9,0 28°С рН 9,0 28°С рН 8,2 37°С рН 8,2 37°С рН 7,5 50°С

ОА Км 2,2±0,3 9,2±0,9 21±6 2,32 2,12 1,2 -

^кат 33,8±1,4 14,2±0,7 48±6 - 68,4 - -

кшт/Км 15 1,5 2,3 - 32,3 - -

ЫН4С1 Км 33±3 11,3±1,1 4,3±0,7 14,9 10,1 167 -

^кат 38,1±1,4 10,3±0,3 24,7±0,9 - 62,0 - -

^кат/КМ 1,17 0,91 5,7 - 6,14 - -

НАДФН Км 0,40±0,06 0,21±0,05 0,032±0,005 - 0,052 - -

ккат 45±5 19±2 41±2 - 80,2 - -

110 90 1300 - 1542 - -

НАДН Км 0,19±0,04° 0,068±0,005б 4,5±0,4 0,25±0,04 0,061 0,045 0,014 —

ккит 63±8" 37±2б 5,2±0,3 26,2±1,4 - 70,5 - -

340а 540б 1,1 100 - 1567 - -

Окислительное дезаминирование Ь-аспартата

Условие рН 9,8 28°С рН 9,8 28°С рН 9,8 28°С рН10,2 37°С рН 9,8 37°С рН11,3 50°С рН 9,8 же

1,-Асп 1,3±0,2 13,4±0,5 27±4 2,30 4,87 0,19 0,067

^кат 12,0±0,4 2,86±0,04 7,3±0,4 - 59,7 - 0,78

кют/Км 9,3 0,21 0,28 - 12,3 - 11,6

НАДФ+ Км 0,51±0,03 0,102±0,011 0,12±0,02 7,43 0,47 0,32 0,72

кквт 3,46±0,07 2,33±0,07 6,2±0,2 - 46,1 - 7,2

ккл/Км 6,7 23 53 - 98,1 - 10,0

НАД+ Км 0,42±0,01 7,0±0,3 10±3 0,97 0,47 0,11 0,25

ккат 14,7±0,1 1,59±0,03 3,3±0,5 - 62,9 - 1,2

кют/Км 34,6 0,23 0,33 - 133,8 - 4,7

* Для АДГр01 в реакциях насыщения по НАДН наблюдался сигмоидный характер кинетической кривой, поэтому приведены кинетические параметры, определенные как по уравнению Михаэлиса-Ментен ("), так и по уравнению Хилла (6). Знак "-" - нет данных.

Интересно, что в геноме R. palustris НаА2 (NCBI Ref. Seq.:NC_007778.1) находятся гомологи глутаминсинтазы и глутаматсинтазы, но не найдено гомолога ГДГ, играющей ключевую роль в азотном метаболизме во многих микроорганизмах. Поэтому, с учетом свойств идентифицированной АДГгра, возможно, именно этот фермент контролирует ассимиляцию аммония в виде L-Асп, а L-Acn является универсальным донором аминогруппы в клетках R. palustris.

Таким образом, в работе найдены и охарактеризованы новые АДГ из мезофильных азотфиксирующих бактерий В. japonicum и R. palustris. На основании полученных данных, оба фермента могут быть отнесены к биосинтетическим, участвующим в ассимиляции аммония, и могут быть использованы для создания штаммов-продуцентов аминокислот, в частности, L-Acn, а также, в рамках данной задачи, в качестве объектов рациональной или комбинаторной белковой инженерии с целью конструирования АДГ с оптимальными кинетическими свойствами.

5 Экспрессия АДГ из В. japonicum приводит к увеличению продукции L-аргинина штаммом-продуцентом Е. coli

С точки зрения способности к ассимиляции аммония, среди охарактеризованных АДГ наилучшими кинетическими характеристиками обладала АДГ из В. japonicum (Таблица 11). Восстановительное аминирование ОА, катализируемое Aflrbja может рассматриваться как дополнительная "точка фиксации" иона аммония наряду с реакциями, катализируемыми ГС и ГДГ. Очевидно, эта дополнительная реакция может быть в особенности полезна для биосинтеза L-Acn и аминокислот, для которых L-Acn является донором аминогруппы или предшественником (L-треонин, L-лизин, L-аспарагин, L-аргинин). В частности, образующаяся из L-Глу молекула аргинина (L-Apr) включает 4 атома азота, происходящие из аминогрупп двух молекул L-Глу, глутамина и L-Acn. Поэтому можно было ожидать, что увеличение скорости аминирования оксалоацетата за счёт увеличения аспартатаминотрансферазной и глутаматдегидрогеназной активностей или введения аспартатдегидрогеназы приведёт к улучшению продукции L-Apr соответствующим штаммом-продуцентом.

Для проверки возможного влияния экспрессии гена АДГЬ|а на продукцию L-Apr был выбран штамм-продуцент Е. coli 3S2ih'A+ (Gusyatiner et al., 2005). Кассета, содержащая синтетический ген АДГЬ]а с оптимизированным для трансляции в Е. coli кодоновым составом, была интегрирована в хромосому штамма 382ilvA+ в выбранный локус вместо гена рерА. В указанной кассете транскрипция гена АДГЬр находилась под контролем искусственной регуляторной области, включающей мутантный промотор гена nlpD Е. coli и SD фага Ф10. Полученный штамм 382/7vA АрерЛ::P„//jSiф,0-aspD, содержащий ген АДГ^а, показал улучшенную способность к производству L-Apr по сравнению с родительским 382ilvA+ и контрольным 3&2ilvA'ApepA штаммами (Таблица 12). Экспрессия гена АДГЬ^ в штамме-продуценте 3 S2ilvA ¥ЬрерЛ: :Р„/;)Ч,ф i a-aspD подтверждена появлением АДГ активности в

22

клеточном экстракте этого штамма ((0,137 ± 0,011) Е/мг с НАДФН в качестве кофактора).

Таблица 12 - Влияние экспрессии гена АДГ из B.japonicum на продукцию L-Apr

Штамм* ОП540 L-Аргинин, г/л

382//V/T родитель 22,1 ±0,9 4,4 ± 0,2

3&2ilvA*ApepA контроль 22 ±2 4,8 ± 0,9

3 %2ilvA* АрерА ::P„w,n ц-aspD с АДГь, 24 ±3 8,0 ±0,8

* Культивирование в пробирках 72 часа при 32°С (глюкозы 48 г/л, (Ш^БС^ 35 г/л).

Одновременно была проверена способность аспартатдегидрогеназы АДГ^а обеспечивать необходимый для роста уровень синтеза L-Acn у штамма дикого типа с неизмененной (в отличие от продуцента L-Apr) потребностью в L-Acn как метаболическом предшественнике. Для этого геномный локус, содержащий экспресссионную кассету с геном АДГуа, был перенесен в штамм MG\655AaspCAtyrB, ауксотрофный по L-Acn. Оказалось, что введение кассеты с геном АДГ^а не восстанавливало рост штамма MG\655AaspCAtyrB на минимальной среде с глюкозой и L-тирозином без добавления L-Acn. Тем не менее, экспрессия гена АДГ^а в штамме-продуценте L-Apr с иным генетическим окружением, наличие которого предполагает эффективную утилизацию L-Acn при синтезе целевого продукта, явно привела к функционированию фермента АДГЬ> в сторону синтеза L-Acn и, как следствие, к существенному повышению способности штамма к накоплению L-Apr.

Таким образом, показана принципиальная возможность использования АДГь|а для увеличения продукции L-Apr штаммом-продуцентом Е. coli.

выводы

1. Проведена теоретическая реконструкция и экспериментальная проверка функционирования путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой и L-глутаминовой кислот клетками P. ananatis.

2. Обнаружено, что идентифицированная ОРС gdhA из P. ananatis кодирует НАДН-зависимую глутаматдегидрогеназу. Показано, что усиление экспрессии данной ОРС комплементирует отсутствие глутаматсинтазы.

3. Выявлены генетические факторы, необходимые для продукции L-Acn клетками P. ananatis, и сконструирован штамм, продуцирующий L-Acn. Показаны преимущества использования НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы из Р. ananatis для увеличения продукции L-Acn.

4. Клонированы гены аспартатдегидрогеназ из бактерий Polaromonas sp., Rhodopseudomonas palustris и Bradyrhizobium japonicum; соответствующие ферменты очищены и биохимически охарактеризованы. Согласно полученным данным, ферменты из В. japonicum и R. palustris могут быть отнесены к анаболическим, участвующим в ассимиляции аммония.

5. Введение аспартатдегидрогеназы из В. japonicum в штамм-продуцент L-аргинина на основе Е. coli привело к увеличению продукции в 2 раза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Katashkina J.I., Нага Y., Golubeva L.I., Andreeva I.G., Kuvaeva Т.М., Mashko S.V. Use of the X Red-recombineering method for genetic engineering of Pantoea ananatis. BMC Molecular Biology. 2009; 10:34.

2. Мохова O.H., Куваева T.M., Голубева Л.И., Колоколова A.B., Каташкина Ж.И. Бактерия, принадлежащая к роду Pantoea, - продуцент L-аспартата или метаболита, являющегося производным L-аспартата, и способ получения L-аспартата или метаболита, являющегося производным L-аспартата. Патент РФ №2411289, 2011.

3. Нага Y., Kadotani N., Izui H., Katashkina J.I., Kuvaeva T.M., Andreeva I.G., Golubeva L.I., Malko D.B., Makeev V.J., Mashko S.V., Kozlov Y.I. The complete genome sequence of Pantoea ananatis AJ13355, an organism with great biotechnological potential. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012; 93(1):331-341.

4. Куваева T.M., Каташкина Ж.И., Киверо А.Д., Смирнов C.B. Новые НАДФН-специфичные L-аспартат дегидрогеназы из мезофильных азотфиксирующих бактерий Rhodopseudomonas palustris и Bradyrhizobium japonicum. Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т.49. № 2. С.155-164.

5. Куваева Т.М., Смирнов C.B., Иванова О.Н., Киверо А.Д., Каташкина Ж.И. Бактерия семейства Enterobacteriaceae - продуцент L-аспартата или метаболитов, производных L-аспартата, и способ получения L-аспартата или метаболитов, производных L-аспартата. Патент РФ № 2472853, 2013.

Подписано в печать:

16.08.2013

Заказ № 8664 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш„ 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куваева, Татьяна Михайловна, Москва

Закрытое Акционерное Общество «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика»

На правах рукописи

04201 361 091

Куваева Татьяна Михайловна

«Изучение факторов, влияющих на биосинтез L-аспарагиновой кислоты в Pantoea ananatis и Escherichia coli»

03.01.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Каташкина Жанна Иосифовна

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ................................................6

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................7

Актуальность проблемы...................................................................................7

Цель и задачи работы.......................................................................................8

Научная новизна и практическая значимость работы....................................9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРТУРЫ.......................................................................10

1.1 Ь-аспарагиновая кислота: применение и перспективы...........................10

1.1.1 Применение Ь-аспарагиновой кислоты.............................................10

1.1.2 Современное производство Ь-аспарагиновой кислоты....................11

1.1.3 Перспективы микробиологического синтеза Ь-аспарагиновой кислоты из углеводов..................................................................................13

1.2 Метаболизм Ь-аспарагиновой кислоты в энтеробактериях и потенциальные мишени для метаболической инженерии штамма-продуцента ......................................................................................................15

1.2.1 Аспартатаминотрансфераза...............................................................15

1.2.2 Взаимные превращения фосфоенолпирувата, оксалоацетата и пирувата.......................................................................................................17

1.2.3 Цикл Кребса........................................................................................20

1.2.4 Аспартаза и деградация Ь-аспарагиновой кислоты..........................23

1.2.5 Семейство аспарагиновой кислоты...................................................24

1.3 Ассимиляция азота (аммиака) в энтеробактериях..................................25

1.3.1 Источники азота..................................................................................25

1.3.2 Ассимиляция аммиака и внутриклеточные доноры азота................26

1.3.3 Глутаминсинтетаза и регуляция ассимиляции аммиака...................31

1.3.4 Транспорт М^/Шз...........................................................................35

1.4. Аспартатдегидрогеназы...........................................................................38

1.4.1 Термофильные АДГ1та и АДГаш необходимы для биосинтеза НАД+ ......................................................................................................................40

1.4.2 Мезофильные АДГгеи и АДГрае как катаболитные ферменты...........42

1.4.3 Возможное применение аспартатдегидрогеназ................................43

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................45

2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды.......................................................45

2.2 Среды и реактивы.....................................................................................48

2.3 ДНК-манипуляции....................................................................................49

2.4 PI трансдукция клеток Е. coli...................................................................50

2.5 Электротрансформация клеток Р. ananatis плазмидной ДНК................50

2.6 Электротрансформация клеток Р. ananatis геномной ДНК....................50

2.7 Конструирование интегративных кассет для инактивации генов в хромосоме Р. ananatis.....................................................................................51

2.8 Конструирование интегративной кассеты для замены собственного промотора гена gdhA Р. ananatis на искусственный промотор Ptac..............51

2.9 Конструирование интегративной кассеты для делеции гена ррс

Р. ananatis........................................................................................................52

2.10 IRed-зависимая интеграция двухцепочечных фрагментов ДНК в хромосому Р. ananatis.....................................................................................53

2.11 nnt/Xis-зависимое удаление селективного маркера из хромосомы

Р. ananatis........................................................................................................53

2.12 Конструирование плазмиды pMWas/?C.................................................54

2.13 Конструирование интегративной плазмиды pMIVK620S....................54

2.14 Интеграция mini-Mu-кассеты в хромосому Р. ananatis........................55

2.15 Определение ферментативных активностей в клеточных экстрактах. 55

2.16 Интеграция гена ТМ1643 Т. maritima в хромосому Р. ananatis...........56

2.17 Конструирование плазмиды pET-ADH-P..............................................57

2.18 Конструирование плазмид pET15-ADH-Rp и pET15-ADH-Bj.............58

2.19 Очистка аспартатдегидрогеназ...............................................................58

2.20 Определение активности аспартатдегидрогеназы................................60

2.21 Интеграция гена, кодирующего аспартатдегидрогеназу из

В. japonicum, в хромосому Е. coli...................................................................61

2.22 Аналитические методы...........................................................................63

2.23 Определение оксалоацетата, ионов аммония, L-аспарагиновой и L-глутаминовой кислот..................................................................................63

2.24 Определение концентрации L-аргинина................................................64

2.25 Олигонуклеотиды....................................................................................64

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................67

3.1 Сравнение путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой кислоты в Е. coli и Р. ananatis..........................................................................................67

3.1.1 Реконструкция путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой

кислоты в Р. апапаНБ на основании полной нуклеотидной последовательности генома........................................................................67

3.1.2 Экспериментальная проверка предложенной схемы путей биосинтеза и катаболизма Ь-аспарагиновой кислоты в Р. апапаШ.........74

3.1.2.1 Аспартатаминотрансферазная реакция..........................................74

3.1.2.2 Фосфоенолпируват-карбоксилазная реакция.................................76

3.1.2.3 Синтез глутамата.............................................................................77

3.1.2.4 ОРС gdhA кодирует НАДН-зависимую глутаматдегидрогеназу .. 79

3.1.2.5 Утилизация аспартата в качестве источника углерода..................81

3.1.2.6 Утилизация глутамата в качестве источника углерода.................82

3.1.2.7 Утилизация фумарата......................................................................84

3.2 Генетические факторы, необходимые для продукции Ь-аспартата в

Р. апапайБ........................................................................................................86

3.2.1 Роль делеций АаярА, ^ЬА и ЬзисА, а также амплификации генов ФЕП-карбоксилазы, глутаматдегидрогеназы и

аспартатаминотрансферазы в продукции Ь-аспартата..............................87

3.2.2 Инактивация пируваткиназ РукА и РукБ..........................................91

К6208

3.2.3 Интеграция аллеляррс и отбор штамма, устойчивого к Ь-аспартату..................................................................................................93

3.2.4 Инактивация малатдегидрогеназы и глюкозодегидрогеназы..........95

3.2.5 Использование НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы из

Р. апапайБ для продукции Ь-аспартата......................................................96

3.3 Новые Ь-аспартатдегидрогеназы из мезофильных бактерий

Polaromonas sp., Rhodopseudomonas palustris и Bradyrhizobium japonicum ........................................................................................................................100

3.3.1 Поиск анаболических аспартатдегидрогеназ в геномах бактерий. 101

3.3.2 Экспрессия выбранных генов предполагаемых аспартатдегидрогеназ в Е. coli..................................................................106

3.3.3 Очистка и биохимическая характеристика новых дегидрогеназ ... 108

3.3.4 Субстратная специфичность и кинетические параметры новых АДГроь ГиСб-АДГгра и Гис6-АДГЬ]а.............................................................113

3.3.5 Различия аспартатдегидрогеназ из двух подгрупп на основе ферментативной кинетики........................................................................117

3.3.6 Различия в кофакторной специфичности аспартатдегидрогеназ из Polaromonas sp. и В. japonicum на основе гомологичного моделирования пространственных структур......................................................................119

3.3.7 Экспрессия аспартатдегидрогеназы из В. japonicum приводит к увеличению продукции L-аргинина штаммом-продуцентом Е. coli......124

ВЫВОДЫ..........................................................................................................127

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ....................................................128

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

L-Acn

L-Глу

ОА

а-кГ

ФЕП

Глюкозо-бФ

Ацетил-КоА

АТФ

АДФ

Ф„

НАД/НАДН

- L-аспарагиновая кислота;

- L-глутаминовая кислота;

- окасалоацетат;

- а-кетоглутарат;

- фосфоенолпируват;

- глюкозо-6-фосфат;

- ацетил-коэнзим А;

- аденозин-5'-трифосфат;

- аденозиндифосфат;

- неорганический фосфат;

- никотинамидадениндинуклеотид, окисленный/восстановленный;

НАДФ/НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, окисленный/восстановленный;

ААТ - аспартатаминотрансфераза;

ГОГАТ - глутаматсинтаза;

ГС - глутаминсинтетаза;

ГДГ - глутаматдегидрогеназа;

АДГ - L-аспартатдегидрогеназа;

АДГШ1а - АДГ из Thermotoga maritima;

АДГаш - АДГ из Archaeoglobus fulgidus\

АДГГеи - АДГ из Ralstonia eutropha;

АДГрае - АДГ из Pseudomonas aeruginosa;

АДГpoi - АДГ из Polaromonas sp.

АДГгра - АДГ из Rhodopseudomonas palustris',

АДГ^а - АДГ из Bradyrhizobium japonicum;

ОРС - открытая рамка считывания;

SD - последовательность Шайна-Далгарно;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

Гис - гистидин;

Арг - аргинин;

Иле - изолейцин;

Про - пролин;

L-Лиз - L-лизин;

L-Мет - L-метионин;

DL-ДАП - БЬ-2,6-диаминопимелиновая кислота;

L-Тир - L-тирозин;

Ар - ампициллин;

Сш - хлорамфеникол;

Km - канамицин;

Тс - тетрациклин;

ИПТГ - изопропил-ß-D-1 -тиогалактопиранозид;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил) 1 -пиперазинэтансульфоновая кислота;

трис - трис(гидроксиметил)аминометан;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее время L-аспарагиновая кислота (L-Acn) находит широкое применение в пищевой, химической промышленности и медицине (Magnuson et al., 2007; Иежица и Спасов, 2007; Cash et al., 2010). Для химической промышленности L-Acn является перспективной «технологической платформой» для синтеза биодеградируемых полимеров и аминированных аналогов таких мировых химических «бестселлеров», как 1,4-бутандиол, тетрагидрофуран и гамма-бутиролактон, используемых в производстве ПАВ, ингибиторов образования минеральных отложений в водных системах, ингибиторов коррозии, супер-абсорбирующих полимеров, усилителей роста растений, растворителей и пластмасс (Werpy and Petersen, 2004; Hasson et al., 2011).

Современное промышленное производство L-Acn основано на ферментативном аминировании фумаровой кислоты с использованием иммобилизованного фермента аспартазы или иммобилизованных бактериальных клеток с высокой аспартазной активностью. Кроме того, L-Acn получают из малеиновой кислоты в мембранной реакторной системе с использованием бактериальных клеток с высокими активностями малеат изомеразы и аспартазы (Yukawa et al., 2010). В обоих случаях, в качестве исходного сырья используются продукты переработки нефти (фумарат, малеат), что существенно ограничивает перспективы использования данной технологии в связи с растущими ценами на нефтепродукты. В этой связи микробиологический синтез L-Acn из возобновляемых и дешевых углеводов (по аналогии с известными примерами биотехнологического производства L-глутаминовой кислоты (L-Глу), L-лизина, и т. д.) мог бы стать перспективной альтернативой современному производству L-Acn из субстратов, получаемых из нефти.

Pantoea ananatis AJ13355 - новый объект биотехнологии. Эта бактерия первого уровня био-безопасности, принадлежащая к роду Enterobacteriacea, обладает хорошими ростовыми характеристиками на простых средах с глюкозой или сахарозой. Она способна расти при умеренно низких значениях рН среды (от 4,5) в присутствии насыщающих концентраций L-Глу (Moriya et al., 1999) и устойчива к высоким концентрациям ряда других органических кислот. В настоящее время на основе штамма AJ13355 сконструирован продуцент L-Глу и внедрён в производство новый процесс ферментации, при котором культивирование клеток сопровождается кристаллизацией конечного продукта (Izui et al, 2003; Izui et al, 2006). P. ananatis AJ13355 можно рассматривать как перспективную био-платформу для производства различных метаболитов с низкой изоэлектрической точкой, таких как L-Глу, L-Acn и др. Поэтому исследование метаболизма данной бактерии и решение задач метаболической инженерии с целью создания штаммов-продуцентов на её основе является актуальной и практически значимой задачей.

Цель и задачи работы

Диссертационная работа посвящена изучению генетических факторов, влияющих на биосинтез L-Acn клетками P. ananatis и поиску альтернативных путей ассимиляции аммония для продукции аминокислот в штаммах энтеробактерий Escherichia coli и P. ananatis.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. теоретически реконструировать и экспериментально подтвердить функциональность путей биосинтеза и катаболизма L-Acn клетками P. ananatis',

2. выявить генетические факторы, необходимые для продукции L-Acn в клетках P. ananatis;

3. изучить возможность использования природного гена gdhA для увеличения продукции L-Acn штаммом-продуцентом P. ananatis;

4. найти и биохимически охарактеризовать потенциальные «биосинтетические» (аммонийфиксирующие) аспартатдегидрогеназы из бактерий, принадлежащих к первому уровню биологической безопасности;

5. проверить возможность использования гетерологичной аспартатдегидрогеназы в качестве дополнительного фермента, обеспечивающего ассимиляцию аммония клетками Е. coli.

Научная новизна и практическая значимость работы

Проведена теоретическая реконструкция путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой кислоты клетками Р. ananatis. Проведена экспериментальная проверка функционирования предсказанных путей в Р. ananatis, выявлены генетические модификации, необходимые для продукции L-Acn, и осуществлено конструирование штамма, продуцирующего L-Acn.

В ходе работы обнаружено, что идентифицированная открытая рамка считывания (ОРС) gdhA из Р. ananatis кодирует НАДН-зависимую глутаматдегидрогеназу. Показано, что усиление экспрессии данной ОРС комплементирует отсутствие глутаматсинтазы. Впервые показаны преимущества использования НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы для продукции L-Acn.

В работе клонированы гены аспартатдегидрогеназ из бактерий Polaromonas sp., Rhodopseudomonas palustris и Bradyrhizobium japonicum', соответствующие ферменты очищены и биохимически охарактеризованы. Согласно полученным данным, ферменты из В. japonicum и R. palustris могут быть отнесены к анаболическим, участвующим в ассимиляции аммония. Введение аспартатдегидрогеназы из В. japonicum в штамм-продуцент L-аргинина на основе Е. coli привело к увеличению продукции в 2 раза.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРТУРЫ 1.1 L-аспарагиновая кислота: применение и перспективы

1.1.1 Применение L-аспарагиновой кислоты

В настоящее время L-Acn находит широкое применение в пищевой и химической промышленности, а также медицине.

Основная часть L-Acn, ежегодно производимого в мире (около 7000 тонн), используется для синтеза аспартама - низкокалорийного сахарозаменителя, входящего в состав многих пищевых продуктов (Magnuson et al., 2007). Аспартам представляет собой дипептид L-Acn и L-фенилаланина; методы промышленного производства аспартама разработаны и постоянно совершенствуются {Yagasaki and Hashimoto, 2008).

L-Acn входит в состав лекарственных препаратов, применяемых для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний (Иежица и Спасов, 2007; Спасов и др., 2007; Iezhitsa et al., 2004), а также для лечения печеночной энцефалопатии (Cash et al., 2010).

Для химической промышленности L-Acn является перспективным исходным продуктом для синтеза полимеров (Werpy and Petersen, 2004). Полимеры на основе L-Acn были разработаны в начале 1990-х годов, и было обнаружено, что они обладают важными свойствами, такими как биодеградируемость, биосовместимость, водорастворимость, высокая абсорбирующая способность. Способы синтеза полиаспарагиновых кислот и исследования их биодеградируемости детально рассмотрены в обзорах (Thombre and Sarwade, 2005; Roweton et al., 1997). Считается, что полимеры на основе L-Acn смогут заменить биологически не разлагаемые поликарбоновые кислоты (в частности, полиакриловую кислоту), которые в основном применяются как ингибиторы образования минеральных отложений в системах водяного охлаждения и обработки воды, и как диспергирующие агенты в ПАВ (чистящие вещества), красках и процессах бумажного производства (Hasson et al., 2011; Low et al., 1996). Имеются

10

примеры использования полиаспарагиновых кислот как экологически безопасных ингибиторов коррозии стали {Silverman, 1995; Craddock et al., 2006), а также в качестве биогенного компонента для синтеза ПАВ (Gross and Kalra, 2002) и супер-абсорбирующих полимеров (Katritzky et al., 2001). В сельском хозяйстве полиаспарагиновые кислоты применяются для улучшения роста растений (http://vvww.nanochemso1utions.com/; Reisch, 2002). Возрастает интерес к полиаспарагиновым кислотам как к биосовместимым полимерам для биомедицинского и фармацевтического использования (системы переноса лекарств, инженерия тканей, импланты) {Niggemann and Ritter, 1996; Hayashi andIwatsuki, 1990; Won et al, 1998).

В последние годы все более привлекательной становится идея о своего рода «унификации» исходных веществ, призванных стать базовыми для синтеза целого набора разнообразных химических материалов, важных для развития современных технологий (Werpy and Petersen, 2004). В качестве одного из таких базовых веществ, или так называемых «технологических платформ», рассматривается, в том числе, и L-Acn, который возможно использовать, в частности, для синтеза аминированных аналогов таких мировых химических «бестселлеров», как 1,4-бутандиол, тетрагидрофуран и гамма-бутиролактон, применяемых в производстве растворителей и пластмасс ( Werpy and Petersen, 2004).

1.1.2 Сов