Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях

Вахитов, Тимур Яшэрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях"

ВАХИТОВ Тимур Яшэрович

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФУНКЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ НА ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННОМ И МЕЖВИДОВОМ УРОВНЯХ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ВАХИТОВ Тимур Яшэрович /

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФУНКЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ НА ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННОМ И МЕЖВИДОВОМ УРОВНЯХ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Работа выполнена в ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства России.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Яковлева Елена Павловна Суворов

Александр Николаевич Рыбальченко Оксана Владимировна

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный институт вакцин и сывороток

Защита диссертации состоится «20» апреля 2007 г. в 15°° часов на заседании Диссертационного совета Д 212.230.04 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (Технический университет)» по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного технологического института (Технического университета). Замечания и отзывы по данной работе, заверенные печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу: 190 013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26, СПбГТИ(ТУ), Ученый Совет

Автореферат разослан «28 » фг^рчХ^лЛ 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

Т. Б. Лисицкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Интерес к коммуникативным связям бактерий объясняется их высокой значимостью для решения научных и практических задач биотехнологии, медицины, здравоохранения и сельского хозяйства. В настоящее время механизмы коммуникации преимущественно связывают с так называемым «чувством кворума» [Ридиа е1 а1., 1994] - способностью бактерий «ощущать» плотность собственной популяции путем выделения и последующей рецепции особых низкомолекулярных соединений - автоиндукторов. Автоиндукторами могут являться как специализированные соединения, например ацилированные лактоны гомосерина (АГЛ) или модифицированные олигопептиды (МОПы), так и неспециализированные вещества. К последним относятся автоиндукторы второго типа (АИ-2), образующиеся путем спонтанного превращения обычного внутриклеточного интермедиата - 4,5-дигидрокси-2,3-пентандиона. Существуют данные, свидетельствующие о том, что в регуляции задействованы и другие неспециализированные метаболиты, например индол, и даже обычные (кодируемые) аминокислоты.

Автоиндукторы «чувства кворума» участвуют в регуляции биолюминесценции, споруляции, агрегации, формировании биопленок, конъюгации, синтезе антибиотиков, экзоферментов, факторов вирулентности и некоторых других соединений. Синтез самих автоиндукторов зависит от плотности популяции, однако до сих пор не ясно, контролируется ли сама плотность популяции межклеточными контактами или полностью определяется внешними факторами (состав среды и др.), то есть регулируется на более высоком уровне.

Согласно установленным в экологии закономерностям, полноценная система саморегуляции численности у микроорганизмов должна включать следующие обратные связи: 1) положительная связь, обеспечивающая инициацию и рост культуры; 2) отрицательная связь, способствующая замедлению роста, его остановке и пре-адаптации культуры к новым условиям; 3) положительная связь, повышающая выживаемость при оптимальной для данных условий плотности культуры; 4) отрицательная связь, приводящая к снижению выживаемости, если плотность культуры по какой-то причине превысила оптимальный уровень.

Установленным для бактерий можно считать только наличие связи, обеспечивающей остановку роста культуры. Эксперименты с культурами высокой плотности в 70-е - 80-е годы прошлого века показали, что функции ингибиторов роста выполняют накапливающиеся в среде продукты метаболизма: кислоты, спирты и некоторые

другие соединения. Их действие, однако, рассматривалось не как регуляторное, а как неспецифическое, связанное с закислением среды, понижением мембранного потенциала и некоторыми другими причинами.

Значительно меньше известно об автостимуляторах роста. По одним сведениям бактерии выделяют эти соединения преимущественно в лаг-фазе, по другим -на протяжении всего роста. Все известные попытки идентифицировать эти соединения, включая и самые последние (Weichart & Kell, 2001), оказались безуспешными. Практически не изучены до сих пор явления саморегуляции выживаемости бактерий. В последние годы эти вопросы рассматриваются с позиций программируемой клеточной гибели (апоптоза), направленной преимущественно на лизис зараженных вирусом бактерий и обеспечение за их счет питательными веществами оставшихся клеток.

Имеющихся в настоящее время знаний недостаточно для ответа на вопрос о существовании или отсутствии у бактерий системы саморегуляции численности. Особый практический интерес представляет исследование процессов саморегуляции у представителей нормальной микрофлоры человека и пробиотиков, использующихся для коррекции микрофлоры. Это послужило одной из причин выбора в качестве основного объекта штамма первого отечественного пробиотика Е. coli М-17 (препарат колибактерин). Эксперименты с другими бактериями показали, что те же методы могут быть успешно применены для изучения аналогичных процессов у других микроорганизмов, по крайней мере тех, которые обитают в сходных экологических условиях организма человека.

Решаемые в диссертации задачи находятся в тесной связи с наиболее актуальными проблемами биотехнологии (управление ростом микроорганизмов), медицины (разработка пробиотических препаратов, изучение механизмов их действия, проблемы развития инфекционных заболеваний, эпидемий и т.д.), охраны среды (очистные сооружения, очистка почв), экологии, эволюции и некоторыми другими.

Настоящая работа выполнена в рамках ряда научно-технических программ, в том числе: федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения" по государственному контракту № ГНТД/ГК-055 от 14.01.2000 г; по государственным контрактам № 43.600.14.0055 от 27.01.2003 г, № 43.600.11.10484.4 от 18.03.2004 г, программы «Интеграция». В настоящее время работы продолжаются по Государственному контракту № 40.003.06.0 от 29.12.2005 «Разработка иммунобиотиков для повышения эффективности вакцинных препаратов».

Целью работы являлось экспериментальное обоснование существования системы саморегуляции численности и развития популяций бактерий, поиск и комплексное изучение эффектов саморегуляции в популяциях и более сложных микробных сообществах, идентификация автостимуляторов роста и других материальных носителей коммуникативных связей, изучение их действия на рост, выживаемость, антагонистическую активность и другие характеристики бактерий и их популяций, практическое подтверждение возможностей использования авторегуляторов и принципов авторегуляции в биотехнологических и медицинских целях.

В ходе выполнения работы были поставлены следующие основные задачи:

1. Разработать адекватные поставленной цели методы контроля и изучения механизмов развития бактериальных популяций.

2. С позиций авторегуляции провести комплексное исследование роста и голодания бактерий с использованием современных микробиологических, биохимических и биофизических методов. В ходе этих исследований доказать существование обратных связей, регулирующих выживаемость бактерий, подтвердить факты кооперативного поведения бактерий в процессе выращивания культур (автостимуляция и самосинхронизация роста) и выявить новые свойства саморегулируемых систем.

3. Изучить механизмы взаимодействия бактерий в рамках двух альтернативных гипотез: опосредованное взаимодействие путем выделения медиаторных соединений и непосредственное взаимодействие путем прямых (физических) контактов или полей.

4. Изучить биологические свойства исходных и фракционированных экзоме-таболитов, полученных при различных способах выращивания и в процессе голодания культур различной плотности.

5. Выделить и идентифицировать химические медиаторы межклеточных контактов, изучить их биологические свойства и динамику в процессе роста и голодания культур, исследовать действие экзометаболитов на развитие колоний различных штаммов и видов бактерий.

6. Создать из идентифицированных соединений модельные композиции, изучить их биологические свойства в сравнении со свойствами отдельных метаболитов и низкомолекулярной фракции нативных растворов метаболитов. Разработать подходы для повышения биологической активности композиций.

нистическую активность бактерий в смешанных культурах, их влияние на состав микробиоценоза лабораторных животных, токсическое действие на организм хозяина и течение искусственно вызванного язвенного процесса.

Методологической и теоретической основой работы являлись труды академиков С.С. Шварца, A.C. Хохлова, работы 70-80-х годов прошлого века группы авторов УНЦ АН (P.A. Пшеничное, С.Я. Барихин, А.Г. Ткаченко, В.П. Коробов, О.Н. Октябрьский, Г.В. Смирнова, и др.), Н.С. Печуркина с соавторами, Г.И. Эль-Регистан, А.Н. Козловой, A.C. Капрельянца, Г.А. Осипова, В.А. Светличного и некоторых других отечественных и зарубежных исследователей, а также работы в области микроэкологии человека Л.Г Перетца, Н.М. Грачевой, И.Б. Куваевой, Б.А. Шендерова, В.М. Бондаренко, чл.-корр. АМН И.В. Домарадского с соавторами, академика АМН A.A. Воробьева с соавторами и ряда других исследователей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментальные данные, в совокупности являющиеся доказательством существования у Е. coli и родственных микроорганизмов (S. marcescens, S. enteritidis и др.) системы саморегуляции численности и развития популяций, включающей позитивную и негативную регуляцию ростовых процессов (инициация роста, скорость роста, торможение и остановка роста) и выживаемости.

2. Идентификация в качестве автостимуляторов роста Е. coli М-17 янтарной и глутаминовой кислот; инициация роста бактерий низкими концентрациями ацетата.

3. Использование бактериями в качестве авторегуляторов численности и развития популяций неспециализированных соединений, в том числе обычных (кодируемых) аминокислот и низших карбоновых кислот.

4. Синергизм и специфичность действия авторегуляторов, в силу которых автостимуляторы роста одного штамма могут ингибировать рост родственного микроорганизма, сочетание нескольких соединений проявляет большую активность, чем индивидуальные вещества, сходные эффекты на различные штаммы оказывают различные соединения или/и различные комбинации этих соединений.

5. Участие идентифицированных продуктов метаболизма в регуляторных процессах более высоких уровней (смешанные культуры, микробиоценозы, взаимодействия с организмом хозяина).

6. Перспективность использования авторегуляторов в составе пробиотических препаратов и продуктов функционального питания.

Научная новизна.

Сформулированы критерии, позволяющие судить о наличии или отсутствии системы авторегуляции численности и развития популяций данного вида (штамма) бактерий. Показано, что система авторегуляции у Е.соН М-17 полностью отвечает сформулированным критериям. Аналогичные системы выявлены для других штаммов Е.соН, Б. тагсезсепв, Б. епЛвгИкИй и некоторых других микроорганизмов.

Впервые доказано существование и изучены свойства негативных регуляторов выживаемости бактерий (УГ-факторов) - низкомолекулярных экзометаболитов, ускоряющих гибель клеток при высокой плотности их популяции.

Определены условия возникновения колебаний численности при голодании бактерий. Показано, что эти колебания происходят преимущественно в культурах переходной (сверхкритической и субкритической) плотности, являются следствием «неустойчивости» состояния популяции как динамической системы и возникают в результате попеременного действия стимуляторов роста и УГ-факторов.

Разработаны методы выделения автостимуляторов роста микроорганизмов. С использованием этих методов впервые идентифицированы автостимуляторы роста бактерий, которыми для Е.соН М-17 оказались янтарная и глутаминовая кислоты.

Получены новые данные относительно биологической активности ацетата-впервые показано, что ацетат является не только ингибитором, но и стимулятором роста бактерий и может выполнять функции плотностно-зависимого регулятора развития их популяций. Предложено новое объяснение, согласно которому выделение ацетата и других метаболитов обусловлено их регуляторными функциями на популяционном уровне, а не наличием «дефектов» в организации внутриклеточного метаболизма.

Показано, что идентифицированные автостимуляторы, а также ряд других аналогичных соединений (аминокислот, продуктов брожения и т. д.), могут осуществлять коммуникативные функции на межвидовом уровне, например, стимулировать рост собственного штамма и подавлять развитие других штаммов, и наоборот, регулируя таким образом соотношение видов в смешанных культурах и микробиоценозах.

физиологической активности собственной микрофлоры хозяина. В опытах на лабораторных животных показана эффективность подобной композиции (Актофлор-С) при коррекции дисбиотического состояния и в лечении язвенного процесса.

Полученные данные являются основой для формирования нового направления, посвященного выявлению и изучению регуляторных функций «неспециализированных» метаболитов.

Результаты работы защищены Авторским свидетельством №1638156 (1990), и Патентами России №2090612 (1997), №2180576 (2002) и №2233875 (2004), имеется решение на выдачу патента по заявке №2005108334.

Практическая и теоретическая значимость.

Результаты работы нашли применение при выращивании пропионовокислых и молочнокислых бактерий на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов. Разработанные в диссертации методы позволили повысить стабильность и стандартность выпускаемых бактериальных препаратов и одновременно сократить на 15-20% время культивирования, количество потребляемой чистой воды и жидких отходов.

Разработаны подходы для создания лечебно-профилактических препаратов на основе низкомолекулярных метаболитов микроорганизмов (Актофлор). Показана возможность конструирования их синтетических аналогов (Актофлор-С) с повышенной активностью и улучшенными физико-химическими характеристиками. Актофлор и Актофлор-С прошли цикл испытания на отсутствие общей, хронической и специфической токсичности в институте токсикологии МЗ РФ. Исследования в СПб МАПО показали, что Актофлор в составе биологически активной добавки Неовитал-пребиотик оказывает положительное влияние на состав кишечной микрофлоры и самочувствие больных. В экспериментах на животных показана эффективность применения Актофлор-С при дисбактериозах и язвенных поражениях. Оба препарата используются в качестве биологически активной добавки (ХБО при РАН «Фирма Вита»), Отмечается положительное влияние Актофлора на микрофлору кожи, структуру и прочность волос. На основании успешного применения Актофлора для восстановления микрофлоры у больных хроническими хламидиозами (ВМедА им. С.М. Кирова) сделан вывод о целесообразности его использования самостоятельно или в сочетании с бактериальными препаратами. В последнем случае эффективность действия тех и других препаратов увеличивалась. Полученные результаты изложены в монографии коллектива авторов ВМедА «Хламидийные инфекции» (СПб, 2003). Опубликованные в открытой печати данные использовались при создании аналогич-

ного Актофлору препарата «Микростим» («Пермское НПО «Биомед»), определении методических подходов для оценки его бактериотропного действия и при создании концепции перспективного применения метаболитных комплексов в технологии производства пробиотических препаратов.

Разработанные в диссертации методические подходы применяются для изучения пролиферативной активности эукариотических клеток при разработке и тестировании активности антиопухолевых препаратов (лимфолитин) [Тяготин и др., 1996, 1998]. Материалы работы используются в научно-исследовательской практике, учебных процессах, в лекционных курсах, пособиях для врачей, статьях, монографиях, дипломных работах, диссертациях, в глобальной сети Интернет и могут являться теоретической основой для формирования новых направлений исследований, в том числе: 1) поиск систем саморегуляции, аналогичных изученным, у других микроорганизмов и на других уровнях организации (развитие тканей, органов, популяций растений и животных); 2) выяснение молекулярных механизмов действия неспециализированных регуляторов: аминокислот, карбоновых кислот, спиртов и других продуктов с использованием методов геномики и протеомики; 3) разработка нового поколения пробиотиков, обладающих повышенным терапевтическим действием за счет введения в их состав регуляторных факторов, и совершенствование системы отбора новых штаммов пробиотиков; 4) совершенствование биотехнологических процессов путем использования закономерностей саморегуляции развития популяций.

Итоги работы позволяют поставить вопрос о расширении понятия «авторегулятор» и включить в круг регуляторных соединений ряд неспециализированных в этом отношении метаболитов. Это создает теоретические предпосылки для реконструкции эволюции регуляторных систем, начиная от регуляторных функций элементарных метаболитов (С02, NO, НСООН, СН3СООН, аминокислот и других простейших органических веществ) и кончая сложными специализированными соединениями пептидной, белковой или иной природы.

Практическое использование результатов работы подтверждено соответствующими публикациями и Актами о внедрении. Препарат Актофлор отмечен дипломом первой степени и медалью Недели высоких технологий в Санкт-Петербурге (1215 июня 2001 г), за его разработку автор диссертации награжден медалью лауреата Всероссийского выставочного центра (постановление от 30.12.93г № 55-Н).

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность начальнику лаборатории прикладной микробиологии Гос.НИИ ОЧБ, в которой была выполнена работа, к.х.н. Л.Н. Петрову за постоянное внимание к работе, проф. A.M. Королюку (С-

Пб педиатрическая академия) и проф. В.М. Бондаренко (НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) за помощь и полезные консультации, а также сердечно благодарит всех коллег и студентов, в сотрудничестве с которыми выполнена работа.

Апробация работы. По материалам работы сделано 20 пленарных (устных) докладов, в том числе на 1-й Отраслевой конференции «Актуальные проблемы биотехнологии», Кольцово, 1988 (1-я премия); Всесоюзной конференции «Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов», Пущино, 1989; Международной конференции «Biotechnology St. Peterburg'94».- St.Petersburg, Russia, 1994; 7-ой, 8-ой и 9-ой Международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001; Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», Санкт-Петербург, 2002; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004; 7-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме "Санкт-Петербург - Гастро-2005", Конференции «Коммуникация у бактерий», Москва, 2005; симпозиуме «М.М. Тереховский (1740-1796) и развитие экологической микробиологии», С.-Петербург, 2006; более 26 стендовых сообщений на Международных, Всесоюзных, Всероссийских и других конференциях. Результаты работы обсуждены на научно-техническом совете ФГУП Гос.НИИ особо чистых биопрепаратов 26.12.05.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 работы, из них 13 статей в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных результатов докторских диссертаций, 5 авторских свидетельств и патентов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 8 глав основной части, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 473 источника, в том числе 189 на русском и 284 на иностранных языках. Работа содержит 47 таблиц и 52 рисунка. Общий объем работы 561 страница.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы отмечается, что проблема саморегуляции развития микробных популяций возникла практически одновременно с разработкой методов культивирования бактерий - в конце 19 - начале 20 века. В первой половине 20 века был накоплен фактический материал, позволивший связать основные характеристики клеток с плотностью их популяции. Был изучен состав стимулирующего рост дрожжей комплекса «биос», включающего преимущественно витамины и аминокислоты и различающегося для разных видов и штаммов дрожжей. Приводятся современные данные по составу продуктов метаболизма Е. coli, экспрессии соответст-

вующих генов, влиянию продуктов обмена на клетки. Анализируются данные гено-мики и протеомики, подтверждающие регуляторные функции некоторых экзометабо-литов. Обсуждается рост колоний микроорганизмов, механизмы «чувства кворума» и перспективы его использования в медицине. Заключительная часть посвящена роли экзометаболитов микрофлоры в ее взаимодействии с макроорганизмом. Все эти данные используются в дальнейшем при интерпретации собственных результатов.

Материалы и методы исследования. В работе использовались штаммы бактерий из коллекции Гос.НИИ ОЧБ: Escherichia coli М-17; E.coli BL-21; E.coli K-12; E.coli K-165 (дефектный по гену rpoH); E.coli 075; Serratia marcescens В-10-М-1; Salmonella enteritidis; Lactobacillus acidophilus (Д-75 и Д-76); Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 21815; Bifidobacterium adolescentis MC-42 и некоторые другие.

Стандартное выращивание Е. coli М-17 осуществляли на глкжозо-минеральной среде М-9 или ее модификации - среде М-17 при 37°С и рН 7,2-7,4. Культуру выращивали в колбах на качалке (0,75 л со 150 мл среды, 150-170 об/мин, плотность засева 0,2-0,4 D460), барботажным способом (в 10-литровая бутыль с 6 л среды, принудительной аэрацией, подпиткой и коррекцией рН) и в ферментаторах АКЛ-10 и Microferm с рабочим объемом 7 и 12 литров при автоматическом поддержании рН (7,2-7,4), концентрации глюкозы (около 0,3 г/л) и кислорода (4060%). Конечная оптическая плотность (ОП) составляла: 6-8 единиц D460 (3-5*109 кл/мл) для качалочной, 15-25 Одво для барботажной и 25-50 D46o для ферментаторной культур.

Е. coli К-12 и Е. coli К-165 выращивали на среде NBE (Serva) с глюкозой (3 г/л) на качалке при 30°С; S. marcescens - на МПБ на качалке при 32°С; S. enteritidis - на среде М-9 с 0,5 г/л глюкозы и 12 мл/л АПБ. Лактобациллы выращивали на среде МРС (Serva), обезжиренном молоке и среде Г-58 (в г/л: глюкоза - 2,5, KH2PO4-1,2, K2HPO4-1,2, MgS04*7H20-0,4, FeS04x7H20-0,02, MnS04x4H20-0,032, NaCI-0,02, дрожжевой экстракт (ДЭ)-10, аскорбиновая к-та-0,3). Высевы проводили на триптозный агар (Ferak Berlin) с 1% глюкозы. В. adolescentis МС-42 выращивали на кукурузно-лактозной среде с 0,15% агара при 37°С. Высевы осуществляли в пробирки с той же средой с 0,5% агара.

Спектры мутности регистрировали на 2-5 длинах волн в диапазоне 460-620 нм (СФ-46 с диафрагмой для уменьшения малоуглового рассеяния). Волновой экспонент (п) вычисляли по методу наименьших квадратов для регрессии: IgD = В-n*lgA. Диаметр колоний измеряли при помощи программы "ВидеоТесТ-Морфо 3.2". Концентрацию микроорганизмов определяли в счетной камере или в суспензии

латексных частиц известной концентрации, размер клеток - с использованием системы компьютерного анализа «Иста-Видеотест».

В экспериментах по голоданию выращенные клетки суспендировали в среде голодания (Н20, 0,9% раствор NaCI или других солей) и хранили под ватно-марлевыми пробками при 21±1°С. При диализном хранении мешки с горловинами для отбора проб и с 20 мл клеточной суспензии помещали в сосуды со средой и хранили при постоянном перемешивании. В опытах с активированным углем (Serva, Norit А) суспензию угля в 0,9% NaCI помещали в диализные мешки, а мешки погружали в сосуды с клеточной суспензией с ОП около 30 Ü4eo- При голодании разделенных диализной мембраной культур, одну из них помещали в диализный мешок и погружали в другую культуру. Параметры кривых выживаемости вычисляли по уравнению: N±on=N0-Kxt (N - выживаемость, on - стандартное отклонение, К - средняя скорость гибели, t - время). Для определения активности факторов гибели испытуемые пробы разводили и использовали в качестве среды голодания тест-культуры плотностью lOD^o- На основании кривых выживаемости вычисляли показатель ускорения гибели: Пуг=(Г7Гмакс)*100%, где Г=(Т/Г}-1, Гмакс=(Тк/Тми„)-1, Тмин- наименьшее из Tso, а Т, и Т0- Т50 контрольной и опытной культур.

Активности стимуляторов роста определяли по способности инициировать рост E.coli М-17 при низких (50-50000 кл/мл) плотностях засева и по изменению скорости роста культур. В первом случае клетки разводили средой М-9 с глюкозой, разливали в пробирки по 2 мл, добавляли кратные разведения тестируемого препарата и инкубировали 1-2 суток при 37°С. Об активности препарата судили по разведению, в котором регистрировался рост культуры. Во втором методе засевали 107-108 кл/мл и выращивали в статических условиях или на качалке. Активность препаратов оценивали по относительному приросту биомассы за время t: On5t=(Don-Do)/(Dic-D0), где Don и Dk - ОП опытной и контрольной культур, Do - начальная ОП.

Препараты экзометаболитов АРК-1 и АРК-2 получали в соответствии с разработанными Регламентом и ТУ. Е. coli М-17 выращивали в ферментаторе до D460=45±5 (30±5 млрд. кл/мл). Ультрафильтрат КЖ (жидкий АРК-1) лиофильно высушивали, а клетки суспендировали в Н20 до D46Os200 и хранили при (20±1)°С под ват-но-марлевыми пробками. После снижения выживаемости до 30-50% (4-5 сутки) получали ультрафильтраты КЖ (АРК-2), которые лиофильно высушивали. Препараты автостимуляторов L delbrueckii и В. adolescentis представляли собой ультрафильтраты КЖ, полученных после выращивания бактерий на соответствующих средах.

Действие препаратов на рост смешанных культур изучали на среде М-9 с глюкозой без перемешивания при 37°С. Соотношение бактерий варьировали при сохранении их общей концентрации 4*104- 2*106 кл/мл. Результаты оценивали по конечному соотношению клеток двух штаммов (высев на среду Эндо) и по следующим показателям: ФЭР (фактор эффективности роста) = N4/N0 (No и N4 - численность на 0 и 4-й час роста); ИС (индекс стимуляции) = ФЭР0П / ФЭРК0„ (ФЭР on ~ с препаратом, ФЭРкон- без препарата); Рут (показатель угнетения) = ФЭРСМеш/ФЭРчист. Коэффициент антагонистической активности (Кда) для E.coli М-17 в смешанной культуре с E.coli К-12 вычисляли по формуле: каа(М-17/к-12)=[Руш(М-17)]/[Руга(к-12)]. Аналогично вычисляли Кда для других бактерий. Выживаемость в смешанных культурах E.coli и S.enteritidis изучали в солевой среде М-9 при 37°С и общей концентрации бактерий 0,3*109 кл/мл. Антагонистическую активность лактобацилл определяли на триптоз-ном агаре по стандартной методике штрихового подсева.

Флуоресцентный анализ осуществляли на спектрофлуориметре Hitachi 65060. Концентрацию ДНК определяли путем ее окрашивания бромистым этидием (БЭ) и 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (ДАФИ). Количество суперскрученной плазмидной ДНК - по разности флуоресценции окрашенных БЭ препаратов до и после нагревания в буфере с рН 12, проницаемость бактерий - по флуоресценции при их окрашивании БЭ. Мембранный потенциал определяли с использованиям красителя 1,1'-дигексил-2,2'-оксикарбоцианина (СС6, Serva).

Хроматография на сеФадексах G-10. G-25 и TSK-геле HW-40 осуществляли на колонках размером от 24*1 до 100*2,5 см в воде, 0,01 М NH4HCO3, 0,01 М трис-HCI (рН=7,4), и 0,1% ТФУ. Для препаративного разделения на колонку 100*2,5 см с TSK-гелем наносили 1,5-2 г АРК-1. При гидрофобной хроматографии на колонку "Labar" (24*1 см) наносили 0,1 г метаболитов. Элюцию проводили постадийно: 0,1% ТФУ, 0,1% ТФУ с 5, 25, 50% и 100% 2-пропанола. Для ионообменной хроматографии использовали сорбенты Dowex AG, 50W*2 (катионообменная хроматография) и Dowex 1*2 (анионообменная хроматография). Предварительные эксперименты проводили на микроколонках объемом 150 pi. В случае катионообменной хроматографии элюцию осуществляли сменой 20 мМ формиатно-аммонийных буферов с рН 2,55; 3,08; 4,50; 6,14 и 2N NH4OH. Фронтальную анионообменную хроматографию проводили на микроколонке объемом 0,7 см3, препаративную - на колонке 2,5*20 см. Для сорбции метаболитов из ультрафильтратов КЖ анионит переводили в формиатную форму, на колонку наносили 50 мл ультрафильтрата и элюировали ступенчатым градиентом рН от 6,7 до 3,1. Препаративную хроматографию среднего давления и хроматографию высокого давления осуществляли на колонке с обращенной фазой (Partisil 10

ODS-3, Whatman, 8*250 мм, хроматограф Hewlett Packard HP 1090). Разделение осуществляли в воде; в воде с ацетонитрилом (от 0 до 30-80%); в 0,1% ТФУ и 0,1% ТФУ с градиентом ацетонитрила.

Аналитические методы. Сухой вес, влажность, зольность и т.п. определяли стандартными методами. Спектры 1Н-ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker СХР 300 (100-300 накоплений) в D2O. Рентгеновские Фотоэлектронные спектры (РФС) - на приборе PHI 5400 (Perkin-Elmer), УФ-спектры - на спектрофотометре Hitachi-ЗЗО, масс-спектры - на приборе ММ 7070 HS (VG) в режиме FAB MS с ионизацией атомами аргона (8 кВ). Для аминокислотного анализа использовали AccQ-Tag Method анализа флуоресцирующих производных и метод анализа DABS-производных аминокислот. Разделение осуществляли на приборе HP 1090 (колонка Waters Delta Рак (Millipore) 3,9x150 мм с октадецилцеллюлозой (Cíe)).

Экспериментальные данные обрабатывали статистически, используя параметрические и непараметрические критерии достоверности. Повторность всех экспериментов составляла не менее 3-х раз.

1. Саморегуляция роста в периодических культурах Е.соЧ.

С позиций авторегуляции анализировалась вся биотехнологическая схема выращивания: рост инокулята в колбах на качалке, барботажное культивирование в бутылях, периодическое выращивание в ферментаторе.

Рост культуры в большинстве случаев происходил неравномерно. В начале (сразу после лаг-фазы) и конце роста (непосредственно перед стационарной фазой) наблюдались синхронные деления бактерий, сопровождавшиеся быстрым увеличением показателя светорассеяния п. Между синхронными делениями отмечались колебания п с меньшей амплитудой, которые могли быть связаны с автономным ростом двух субпопуляций - быстро и медленно растущих клеток (г- и К-стратегов) образующих, соответственно, крупные и мелкие колонии на минимальных агаровых средах. Клетки каждой из субпопуляций делились согласованно, однако циклы размножения в субпопуляциях не совпадали. В результате этого культура в целом росла асинхронно, но наблюдались периодические изменения среднего объема бактерий и соответствующие им колебания п. В специально оборудованном ферментаторе с постоянной заменой среды рост происходил без синхронных делений и медленнее, чем в обычном ферментаторе. Это предполагало, что выделяемые бактериями вещества стимулируют рост культуры и способствуют ее самосинхронизации. При изучении биологической активности нативных растворов экзометаболитов подтвер-

дилось, что эффект стимуляции увеличивается в начале роста, а затем падает и сменяется эффектом ингибирования (рисунок 1).

час Время, час

1 - кривая роста; 2-5 - стимулирующая активность экзометаболитов: 2 - нативный раствор; 3 - концентрированный (в 1,2 раза) нативный раствор; 4, 5 - нативный раствор, разбавленный в 4 и 40 раз; 6 - динамика ингибиторов роста (вычислена на основе кривых 2-5).

Рисунок 1 - Биологическая активность внеклеточной среды при выращивании Е. coli М-17 в ферментаторе

Концентрирование растворов приводило к смещению пика активности влево, ближе к началу культивирования, а разбавление - вправо. При разбавлении в 40-50 раз зависимость приобретала монотонно возрастающий характер. Объяснить эти закономерности можно было либо накоплением ингибиторов, действующих только при сравнительно высоких концентрациях, либо тем, что одни и те же соединения стимулировали рост в низких концентрациях и подавляли его в высоких. В первом случае концентрация ингибиторов может быть вычислена путем сравнения кривых активности, полученных без разбавления нативных растворов и при их разбавлении

(рисунок 1). Таким образом, имеющиеся в литературе противоречия относительно динамики стимуляторов могли быть объяснены тем, что в одних экспериментах анализировались нативные растворы метаболитов, а в других - их разведения.

Более подробное изучение показало, что перед синхронным делением концентрация стимуляторов роста в среде увеличивается, а в процессе деления - падает. Это может означать, что выделяют стимуляторы преимущественно растущие клетки, а поглощают - делящиеся или только что разделившиеся. Рост культуры при низких плотностях засева (1*105 кл/мл) отличался тем, что протекал при низкой концентрации стимуляторов, незначительно возраставшей только перед стационарной фазой. Культура росла медленно, а клетки стационарной фазы отличались небольшими размерами. Спектральными методами было показано, что концентрация ряда веществ в среде увеличивалась пропорционально концентрации клеток, другие соединения (например, рибофлавин) начинали интенсивно выделяться только при определенной плотности культуры. Концентрация по крайней мере одного из флуоресцирующих веществ увеличивалась в процессе синхронного деления, а затем уменьшалась, то есть изменялась так же, как и концентрация стимуляторов роста.

Таким образом, при изучении росТа были подтверждены и систематизированы следующие эффекты кооперативного поведения бактерий: самостимуляция и само-ингибирование роста; синхронные деления клеток, сопровождающиеся изменениями биологической активности внеклеточной среды; подразделение популяции на две автономно размножающиеся субпопуляции быстро и медленно растущих клеток; согласованное выделение и поглощение ранее выделенных веществ.

2. Саморегуляция численности в голодающих культурах

Выживаемость и физиологические характеристики клеток при голодании в жидких средах существенно зависели от плотности их популяции. В соответствие со скоростью гибели бактерий и характером кривых выживаемости весь диапазон концентраций бактерий был разделен на ряд поддиапазонов, различающихся по величине параметров, получаемых при регрессионном анализе кривых выживаемости. С наибольшей скоростью клетки гибли в культурах низких и сверхвысоких плотностей. Оптимальными для их выживания оказались некоторые промежуточные (критические) концентрации (таблица 1). Низкое значение 1М0 (для культур сверхвысокой плотности) являлось показателем экспоненциальной гибели бактерий. Значения Ыо>100%, получались при линеаризации кривых с лаг-периодом, величина которого была пропорциональна разности (N0-100%). Высокие значения стандартного откло-

нения (ам) получались для кривых с колебаниями выживаемости, что послужило основой для выделения диапазонов субкритических и сверхкритических концентраций.

Таблица 1 - Средние значения Т5о и параметров линейной регрессии: N=N0 - Ю, пблученные при анализе кривых выживаемости Е.соН М-17

Плотность суспензии Оптическая плотность, D КОЕ, млрд/мл T5o±ST> сутки <Tn, % N0. % Число опытов

низкая 0,005 0,002 5±1 8 101 7

субкритическая 0,1-1,0 0,04-0,6 11±1 16 106 16

критическая 2-5 0,6-2,0 14±1,7 10 103 9

сверхкритическая 9-13 3-11 11±1 18 113 10

высокая 18-40 7-20 7±1 12 105 11

сверхвысокая 50-200 20-150 5±0,7 10 98 16

Обозначения: Т50 - время гибели 50% клеток; N - концентрация колониеобразую-щих единиц (КОЕ, %); К - скорость гибели бактерий (%/сутки), 1 - сутки голодания.

Частичное удаление низкомолекулярных экзометаболитов путем диализа или сорбции позволяло увеличить выживаемость бактерий в суспензиях высокой плотности. Если же эти соединения удалялись практически полностью (высокая интенсивность диализа), то скорость гибели бактерий вновь увеличивалась. Для культур плотностью ниже критической удаление метаболитов приводило только к уменьшению выживаемости. Низкомолекулярные метаболиты культур высокой и низкой плотности (ВП- и НП-метаболиты) различались по своему биологическому действию. ВП-метаболиты, добавленные в культуры плотностью Ю10 КОЕ/мл и выше, ускоряли гибель бактерий, а НП-метаболиты на выживаемость практически не влияли. Это позволило предположить, что культуры высокой плотности выделяют особые, ускоряющие гибель вещества (УГ-факторы). Максимальная активность УГ-факторов наблюдалась при снижении численности популяции приблизительно на 50%, затем она падала и полностью исчезала при выживаемости около 109 КОЕ/мл. На культуры низкой плотности (5х106-5х107 КОЕ/мл) УГ-факторы действовали только при разведении нативных растворов в 103-107 раз, поскольку при меньших разведениях содержащиеся в них продукты автолиза служили субстратом для роста тест-культуры. Минимальная действующая концентрация УГ-факторов при этом составляла не более десятков пикограмм в миллилитре. Кроме УГ-факторов в КЖ культур высокой (включая сверхкритическую) и сверхвысокой плотности содержались стимуляторы

роста бактерий. Их концентрация, как и концентрация УГ-факторов, была тем выше, чем выше плотность голодающей популяции. При наличии колебаний численности максимумы активности УГ-факторов приходились на начальные этапы возрастания КОЕ и совпадали с падениями активности стимуляторов роста. Гибель культур сверхвысокой плотности или в условиях интенсивного диализа сопровождалась монотонным увеличением показателя светорассеяния - п. В других условиях изменения п носили более сложный характер и зависели от состава выделяемых метаболитов, предположительно от содержания стимуляторов роста и УГ-факторов.

Процесс голодания культур высокой плотности можно было разделить на ряд последовательных стадий. На первой из них, лаг-периоде, выживаемость практически не менялась, но снижался мембранный потенциал и увеличивалась проницаемость цитоплазматической мембраны, причем все эти процессы ускорялись при добавлении нативных растворов УГ-факторов. В конце лаг-периода значительно увеличивалось число бактерий, чувствительных к действию дезоксихолата, затем наступало быстрое снижение выживаемости клеток. В процессе голодания происходила как деградация, так и репарация клеточных структур, причем направленность процесса (деградация или репарация) определялась соотношением стимуляторов роста и УГ-факторов. На заключительной стадии голодания активизировались процессы автолиза, о чем свидетельствовал рост концентрации растворенных органических соединений и изменение спектральных характеристик сред. При снижении выживаемости до 3-0,1% резко возрастала высеваемость бактерий после их инкубации в средах, содержащих стимуляторы роста; предположительно это было связано с реактивацией покоящихся форм бактерий [Вахитов, Петров, 1992].

В процессе голодания уменьшалось количество внутриклеточной ДНК, одновременно происходило накопление экстраклеточной двухцепочечной ДНК. Ее наличие в среде не влияло на скорость гибели бактерий. Оставшаяся внутриклеточная ДНК более не деградировала, то есть была защищена от действия присутствовавших в среде ДНКаз. Факт выделения в среду ДНК позволил предположить возможность обращения процесса, то есть ее поглощения клетками. В дальнейшем это предположение подтвердилось в работах зарубежных авторов, доказавших существование спонтанной трансформации у грамотрицательных бактерий. С экологических позиций присутствие ДНК вне клеток или внутри них в защищенном от ДНКаз виде можно расценивать как один из механизмов сохранения генофонда для последующего его использования оставшимися бактериями [Вахитов, Яшина 1990].

Все изучаемые параметры (п, окрашиваемость клеток бромистым этидием, чувствительность к дезоксихолату, мембранный потенциал, реакция плазмолиза и

др.) зависели от плотности культуры. При определенных условиях эти показатели периодически изменялись, что свидетельствовало о наличии в популяции управляющих связей. В отсутствие этих связей все процессы должны были бы иметь монотонный характер и не зависеть от плотности популяции.

Использование тест-культур низкой плотности позволило сопоставить динамику УГ-факторов и стимуляторов роста на протяжении всего цикла развития, начиная от засева культуры и кончая стадией голодания в условиях, обеспечивающих колебания численности бактерий (рисунок 2) [Вахитов 1999].

1 - концентрации КОЕ; 2 - концентрация УГ-факторов; 3 - концентрация стимуляторов роста. Все данные выражены в % к максимальному значению на этапе роста культуры (с 1 по 9,5 час)

Рисунок 2 - Изменение численности микроорганизмов и биологической активности среды в процессе роста и последующего голодания Е. coli М-17

Как видно из представленных данных, в лаг-фазе роста (качалка) активность УГ-факторов была сравнительно низка, а затем быстро возрастала. Ее максимум приходился на первую половину экспоненциальной фазы, затем концентрация УГ-факторов снижалась и вновь возрастала к началу стационарной фазы. Колебания численности в процессе дальнейшей инкубации культуры (37°, без перемешивания) сопровождались аналогичными колебаниями концентраций стимуляторов роста и УГ-факторов. Максимумы активности последних соответствовали при этом начальным этапам роста численности КОЕ и совпадали с падениями активности стимуляторов роста. Таким образом, можно было предполагать, что УГ-факторы

являются причиной хорошо известного, но малоизученного феномена - падения выживаемости в лаг-периоде роста, а колебания численности вызваны попеременным действием УГ-факторов и стимуляторов роста. Чтобы подтвердить это предположение была разработана математическая модель, включающая два уравнения [Вахитов, Яшина 19906]:

dt К J

где X - плотность популяции; Y - исходное количество субстрата; R - интегральный показатель активности среды; X, - константа, критическая плотность популяции.

Первое уравнение описывает зависимость скорости роста от активности среды (R), концентрации клеток и количества неизрасходованного субстрата (Y-X), а второе - экспериментально обнаруженную зависимость активности среды (R) от плотности популяции (см. рисунок 1Б). Из второго уравнения видно, что при росте популяции показатель R сначала,увеличивается, а после достижения плотности Хк начинает падать. R является интегральным показателем активности среды: значение R>1 означает стимуляцию роста метаболитами среды, если 1>R>0 происходит ингибирование роста, а при R<0 преобладает действие УГ-факторов, то есть наблюдается гибель бактерий. Решения системы качественно правильно описывают основные закономерности развития: снижение выживаемости с увеличением плотности голодающей культуры, колебания численности при плотности, близкой к Хк, увеличение лаг-периода с уменьшением плотности засева, а также ряд известных из литературы закономерностей, например, ускорение гибели при внесении субстрата.

Обмен метаболитами через диализную мембрану приводил к изменению выживаемости и свойств голодающих культур. При совмещении разновозрастных культур выживаемость у «молодой» уменьшалась, а у «старой» - увеличивалась. Аналогичным образом изменялась и устойчивость клеток к дезоксихолату. В случае культур одного возраста, но разной плотности, выживаемость плотной культуры увеличивалась, а менее плотной - уменьшалась. Можно полагать, что при этом происходило поглощение УГ-факторов менее плотной либо «молодой» культурами.

Выживаемость E.coli К-12 и S. marcescens зависела от концентрации сходным с E.coli М-17 образом. Однако при высокой плотности клеток скорость гибели S.marcescens оказалась выше, чем E.coli М-17. Клетки термочувствительного

штамма Е.соН К-165 гибли быстрее, чем родительского E.coli К-12. Возможно, что белки теплового шока оказывали протектирующее действие или влияли на синтез/распад УГ-метаболитов. Современные взгляды на проблему авторегуляции позволяют с некоторыми оговорками назвать УГ-соединения факторами апоптоза бактерий. Аналогичную функцию, заключающуюся в ограничении численности популяции, могут выполнять фактор (fe, «убивающий фактор», а также вещества, выделяемые в присутствии ускоряющего гибель субстрата.

В целом, приведенные выше данные позволяют рассматривать рост и голодание как единый саморегулируемый процесс, направленный на поддержание численности популяций в оптимальных для данных условий пределах.

3. Биологические свойства препаратов автостимуляторов роста

Обычно для инициации роста автотрофной культуры на глюкозо-минеральной среде необходимо, чтобы исходная плотность популяции превышала некоторое критическое значение. Решающим фактором, однако, может являться не плотность популяции, а количество засеянных клеток. В наших экспериментах было показано, что для Е.соН М-17 при концентрации 105 кл/мл рост наблюдался только при объеме культуры 100 мл или больше, при плотности 10е кл/мл необходимый для роста объем составлял 10 мл, а при концентрации 107 кл/мл - всего 1 мл. Это возможно в том случае, когда рост популяции обеспечивали не все бактерии, а лишь немногочисленные клетки, способные расти без стимуляторов роста. Приведенные данные позволяют полагать, что частота этих клеток в популяции не превышала 10'5-10"®.

Рост на среде с АРК наблюдался даже при засеве единичных клеток. При минимальных дозах препаратов (для АРК-1 около 40 мкг/мл) культура росла с длительным (около 24 часов) лаг-периодом. При увеличении дозы АРК до 2 мг/мл лаг-период сокращался до 1-2 часов. Максимальные значения фактора эффективности роста (кратность увеличения КОЕ за 4 часа роста: ФЭР=КОЕ4/КОЕ0) были получены при выращивании в стационарных условиях при засеве около 103 кл/мл. При меньших плотностях засева проявлялось ингибирующее действие кислорода. По этой причине аэрируемые культуры (качалка) в диапазоне концентраций 102-105 кл/мл росли медленнее статических, а при более высоких концентрациях клеток - быстрее. Во всех случаях, однако, значения ФЭР для качалочных культур были много ниже его максимальной величины (около 300). Это означает, что предпочтительным для Е. coli М-17 являлся рост в статических условиях при засеве около 103 кл/мл. Время генерации при этом составляло 19-21 мин, что совпадало с его генетически детерминированным пределом.

В дальнейших экспериментах изучалось действия АРК при выращивании Е. coli М-17 в колбах на качалке при сравнительно высоких плотностях засева. В этих условиях рост культуры на минимальной среде с АРК был быстрее, чем без АРК, но медленнее, чем на богатой среде. На среде с АРК клетки имели меньший размер и большую устойчивость к повышенной температуре (52°С, 15 мин). Вероятно это было связано с индукцией белков стационарной фазы, в том числе и БТШ. Добавление дрожжевого экстракта (ДЭ) к богатой среде ускоряло рост культуры, а АРК - не влияло на рост, либо замедляло его, что свидетельствовало о различиях в механизмах стимулирующего действия АРК и ДЭ.

АРК обладали специфичностью действия и, в то же время, стимулировали рост не только Е. coli М-17, но и других микроорганизмов. Специфичность действия выражалась в том, что максимальные индексы стимуляции (ИС) были получены для штамма М-17, чуть меньшие - для родственного микроорганизма {E.coli К-12) и еще более низкие - для бактерий других видов (S.enteritidis и S. marcescens). В опытах с лактобактериями симбионтами человека (Lacidophilus Д-75 и Д-76) стимулирующий эффект был больше 1000%, но отсутствовал в экспериментах с L.bulgaricus, в норме симбионтом не являющейся. Аномально высокими оказались ИС для бифидобакте-рий, причем их собственные автостимуляторы повышали ИС в значительно меньшей степени, чем АРК. Этим можно объяснить высокую приживляемость бифидобакте-рий и лактобацилл при их совместным применением с колибактерином.

Добавление АРК к смешанным культурам E.coli М-17 с Е. coli К-12 или с S. enteritidis изменяло соотношение скоростей роста в пользу E.coli М-17 приблизительно в 2,6 раза. При голодании выживаемость E.coli М-17 была выше в смешанной культуре, чем в чистой, и еще больше повышалась при добавлении АРК. Выживаемость S.enteritidis, напротив, падала и в том, и в другом случае. Наличие АРК, таким образом, увеличивало антагонистическую активность E.coli М-17 как при росте, так и при голодании, причем сами препараты бактерицидным действием не обладали. Аналогичным образом АРК влияли на антагонистическую активность L. acidophilus Д-75 и Д-76: их добавление в смешанную культуру L. acidophilus Д-75 и S. enteritidis приводило к почти 100-кратному снижению содержания S.enteritidis. При добавлении фруктоолигосахаридов (ФОС) аналогичный эффект не превышал 50%. Размер зоны угнетения роста S. enteritidis лактобациллами на плотной среде с АРК увеличивался в 1,75 раза, а на среде с ФОС - всего в 1,1 раза. АРК, таким образом, повышали антагонистическую активность ¡..acidophilus значительно эффективнее, чем ФОС. Кроме того, АРК способствовали уменьшению клеток, а ФОС - увели-

чению. Результаты этих исследований позволили поставить вопрос об использовании АРК для восстановления микробиоценозов человека и животных.

4. Выделение и идентификация автостимуляторов роста

На первом этапе работы был разработан хроматографический метод, позволявший контролировать биологическую активность непосредственно во фракциях метаболитов. Разделение проводили на TSK-геле HW-40 в 0,01 М трис-HCI буфере (рН=7,4). Стимуляторы и ингибиторы роста при этом локализовались в двух соседних группах фракций: 23-26 и 27-30, а УГ-факторы - в 22-23 (УП) и 29-31 (УГг), причем фракции УГг содержали соединения с аминогруппами. Активность фракций стимуляторов роста была выше активности ДЭ и исходных АРК. Из этого следовало, что, в отличие от ДЭ, стимулирующая активность АРК определяется действием индивидуальных веществ, а не суммой всех компонентов.

Фракции стимуляторов и ингибиторов роста имели сходные спектры флуоресценции (максимум при 430 нм), но спектры первых отличались меньшей интенсивностью, а в спектрах возбуждения флуоресценции вторых имелся дополнительный максимум (293 нм). В составе всех фракций выявлялось по 3 соединения с аминогруппами и с одинаковой для всех фракций электрофоретической подвижностью. Величина Rf одного из них была близка к Rf лизина, а двух других - превышала ее. Во фракциях стимуляторов роста преобладало 1-е соединение, а во фракциях ингибиторов - соединение с максимальной Rf. По величине Rf соединения активных фракций (22-31) отличались от лейцина, аланина, валина, ацетата, полиаминов, глюкозы, никотиновой кислоты, нуклеозидфосфатов и некоторых других соединений. В масс-спектрах (FAB MS) присутствовало 4 основных и 3 минорных компонента. Отношение массы к заряду для всех компонентов не превышало 252, что свидетельствовало о низком молекулярном весе всех авторегуляторов.

Хроматографические данные (TSK-гель HW-40), полученные при фракционировании компонентов среды на разных стадиях роста культуры, позволили предположить существование, по крайней мере, трех автостимуляторов. Их соотношение изменялось в процессе культивирования, и было различным в стационарной фазе и на лаг-периоде. Это означало, что при пересеве бактерий происходило перераспределение автостимуляторов между клетками и средой. После 3-х последовательных стадий очистки (на TSK-геле в нейтральных условиях, на октилсиликагеле и TSK-геле в кислых условиях) удалось получить две фракции стимуляторов роста с органическими аминами в одной из них.

Для идентификации стимуляторов роста требовалось повысить эффективность фракционирования метаболитов. Использование методов экстракции на первой стадии выделения оказалось неэффективным из-за высокой гидрофильности искомых веществ. Стимуляторы роста слабо взаимодействовали с катионными сорбентами, но хорошо сорбировались анионообменными смолами. В методе фронтальной анионообменной хроматографии раствор АРК непрерывно пропускали через колонку с сорбентом, что приводило к сорбции компонентов препарата, а затем к их последовательному вытеснению в порядке возрастания константы связывания. Профиль элюции при этом выглядел как последовательное ступенчатое увеличение биологической активности элюируемых смесей. Число ступеней (рисунок 3), позволяло полагать, что в КЖ имелось не 2-3 (см. выше), а 56 активных компонентов. Это представление о поликомпонентном составе стимулятора роста легло в основу дальнейшей стратегии поиска его составляющих.

Фракция

Рисунок 3 - Фронтальная анионообменная хроматография на микроколонке с йСМЕХ 1x2 в ОН-форме

Первой стадией в разработанном способе препаративного выделения активных компонентов являлась их сорбция на анионообменной смоле. При использовании растворов лиофилизированных препаратов сорбент переводили в ОН"-форму, а для выделения метаболитов из нативных растворов колонку уравновешивали фор-миатным буфером с рН 6,7. Элюцию начинали с рН 4,7, активные фракции собирали после уменьшения рН до 3,1. На второй стадии использовали гидрофобную хроматографию среднего давления (рисунок 4), в ходе которой были выявлены две группы

активных фракций - 1-3 и 11-13. Аминокислотный анализ показал, что основным компонентом 1-й группы являлась глутаминовая кислота. В дальнейшем была доказана ее способность стимулировать рост Е.соП М-17.

ю см

1,5 1

О 0,5 0

I I I I

(О

яГ

I I I I I I I I

11111111111

I I I I г

т-1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 Фракция

А - профиль элюции; Б - стимулирующая активность (по оси ординат отложена оптическая плотность тест-культуры)

Рисунок 4 - Вторая стадия очистки стимуляторов роста на колонке с обращенной

фазой Partisil 10 ODS.

Вещества 2-й группы образовывали флуоресцирующие продукты в реакции с резорцином, характерные для дикарбоновых кислот. В ходе их дальнейшей очистки (рисунок 5) максимальная активность была выявлена в 15-й и близлежащих фракциях. Она оказалась заметно ниже исходной активности, что свидетельствовало о си-нергическом действии разделяемых компонентов. Реакция с резорцином выявила наличие компонентов с двумя или более карбоксильными группами, а результаты тонкослойной хроматографии в двух системах растворителей (н-бутанол: уксусная кислота: вода (4:1:5) и этиловый спирт: аммиак: вода (80:5:15)) позволяли полагать, что этими соединениями являются лимонная и янтарная кислоты. Наличие этих кислот было подтверждено методами 13С- и 1Н-ЯМР спектроскопии. Изучение активности показало, что янтарная кислота обладает выраженным стимулирующим эффектом и более активна в смеси с лимонной кислотой. Сама лимонная кислота оказывала слабый эффект, либо не оказывала его вообще.

(О

I I I

0,9 л

о 0,6-

о 0,3 ■

0 I I I I I I I I I I I I I I Г"

0 2 4 6 8 10 12 14

т—г

16 18

Фракция

А - профиль элюции; Б - стимулирующая активность

Рисунок 5 - Третья стадия очистки стимуляторов роста (ТЭК-гель Н\ЛМ0, 0,1% ТФУ)

При химическом анализе более 30 препаратов АРК-1 и АРК-2 выяснилось, что в АРК-1 преимущественно содержались (в порядке убывания): ацетат, лактат, фор-миат, валин, сукцинат, аланин, глутамат и лизин; в АРК-2 - сукцинат, ацетат, фор-миат, лактат, глицин, аланин, валин, глутамат, аспартат и лизин. В значительно меньших количествах обнаруживались другие аминокислоты, имелись нуклеотиды, фолиевая кислота и рибофлавин. После гидролиза в препаратах увеличивалось содержание глутамата и аланина, появлялись пролин, аргинин, что свидетельствовало о присутствии этих аминокислот в связанном виде. Активность композиции, составленной из 20 идентифицированных соединений, оказалась не ниже, чем у прототипа (АРК-1). Это означало, что активность АРК-1 определялась совокупным действием идентифицированных соединений.

Биологическая активность всех соединений была изучена в широком диапазоне концентраций. Это позволило разделить компоненты АРК на 3 группы: 1) автостимуляторы роста, к которым кроме идентифицированных сукцината и глутамата были отнесены метионин, лизин и ацетат; 2) автоингибиторы (ацетат, аланин, аспартат, гистидин, формиат, цистеин); 3) нейтральные соединения. Действие ингибиторов усиливалось с увеличением их концентрации. Так, при концентрации аланина 0,3 мМ отмечалось незначительное замедление роста, при 16 мМ оно приобретало выраженный характер, а при 33 мМ рост вообще отсутствовал. Ацетат, отнесенный и

5. Состав и биологические свойства экзометаболитов бактерий

к стимуляторам, и к ингибиторам, занимал в регуляции роста особое место. Характер его действия менялся в зависимости от концентрации: при высоких концентрациях он ингибировал рост культуры, а при более низких (0,1-10 мМ) - проявлял стимулирующую активность (ОПБ>1). Отсутствие соответствующих данных в доступной литературе позволяет полагать, что способность ацетата стимулировать рост Е.соН обнаружена нами впервые. При увеличении концентраций других стимуляторов их активности (ОПБ) возрастали до определенного предела (ОПБтах), а затем не изменялись или уменьшались, но оставались больше 1. Это позволило оценить каждый стимулятор двумя показателями: собственно ОПБта* и минимальной концентрацией (МК), при которой его активность достигала максимума. Значения ОПБтах уменьшались в ряду: сукцинат > глутамат > метионин > ацетат > лизин, а значения МК возрастали в ряду: сукцинат = метионин (0,6 мМ)< лизин (1,4)2 глутамат (1,5)< ацетат (2,2). Сукцинат, таким образом, являлся наиболее активным (наибольшее ОПБтах) и максимально эффективным (наименьшая МК) стимулятором. В составе КЖ действие стимуляторов определялось не только их свойствами, но и концентрацией. Оказалось, что для стационарной культуры вклад стимуляторов в общую активность практически совпадал с их положением в приведенном выше «ряду активностей». При пересеве культуры концентрации стимуляторов уменьшались. В связи с этим возрастала роль ацетата и значительно падали вклады глутамата, метионина и лизина.

Для изучения совместного действия метаболитов были составлены смеси, содержащие все идентифицированные компоненты АРКИ (Комп-1), все стимуляторы роста (Естим), все ингибиторы роста (Хинг), стимуляторы с нейтральными веществами и некоторые другие. Активность этих композиций уменьшалась в следующем ряду: Комп-1 >1с™м+нейтральные вещества>1сти„>индивидуальные стимуляторы, что подтверждало синергическое действие стимуляторов роста и способность нейтральных веществ повышать их активность. Эти данные хорошо согласовались с результатами фронтальной хроматографии.

Характер действия экзометаболитов зависел от плотности культуры и стадии ее роста. Алании инициировал рост Е.соН М-17 при низкой плотности засева, но ингибировал его при высоких плотностях. Лактат, цитрат, пируват, валин были активны в тесте по инициации роста, но незначительно ускоряли рост в колбах на качалке. Внесение сукцината и глутамата на экспоненциальной стадии увеличивало выход биомассы, а ацетата, валина, аланина и лактата - уменьшало. Эти же концентрации валина (0,7-1,5 мМ), внесенные в начале культивирования, практически не влияли на рост, а ацетата (0,75-1,7 мМ) - стимулировали его. Изучение динамики идентифицированных соединений показало, что сразу после засева культуры происходил

обмен метаболитами между клетками и окружающей средой. При не слишком большом разбавлении культуры в среду выделялись стимуляторы роста, если же разбавление было велико, то, напротив, имевшиеся в среде стимуляторы поглощались клетками. Следствием этого являлось значительное удлинение лаг-фазы. Поскольку все соединения попадали из среды во внутриклеточный пул, увеличение продолжительности лаг-фазы объяснялось не их недостатком, а разрывом коммуникативных связей бактерий.

При выращивании в колбах основным продуктом являлся лактат, а при выращивании в ферментаторе - ацетат. Если исходная концентрация ацетата была недостаточна, то рост не начинался, пока она не достигала порогового значения. Лактат усиливал действие ацетата. Пируват выделялся преимущественно при выращивании в колбах, а формиат и валин - в ферментаторе, различны были соотношения и других метаболитов. Общая стимулирующая активность среды изменялась так же, как и концентрации стимуляторов: увеличивалась в начале роста, при возрастании концентрации ацетата, и на завершающей стадии, одновременно с увеличением концентраций ацетата и сукцината (рисунок 6). Как уже отмечалось, оба возрастания предшествовали синхронным делениям культуры. Наличие у метаболитов регуля-торных функций нашло подтверждение в недавних молекулярно-биологических исследованиях. Так, методами геномики и протеомики было показано, что при добавлении ацетата в среду культивирования E.coli 37 белков повышают, а 60 понижают экспрессию. Формиат подавлял синтез 10 из 37 индуцировавшихся ацетатом белков (Arnold et al„ 2001; Kirkpatrick et al„ 2001). Имеются сведения о регуляторном действии пропионата.

Добавление Комп-1 в среду роста смешанной культуры E.coli М-17 и S.enteritidis в концентрации 0,125 мг/мл приводило к увеличению содержания (показатель ИАА) E.coli М-17 более чем в 3 раза. При увеличении дозы добавки ИАА уменьшался. Действие индивидуальных метаболитов зависело от их концентрации и соотношения клеток конкурирующих штаммов. Высокую активность проявляла композиция из ацетата (1,5 мМ), формиата (1,25 мМ) и цитрата (0,02 мМ). Поскольку E.coli М-17 выделяет ацетата больше, чем другие штаммы, можно полагать, что ацетат является одним из важнейших факторов ее антагонистической активности.

Выживаемость S.enteritidis и при голодании в чистых культурах подчинялась тем же закономерностям, что E.coli М-17 и S. marcescens (см. выше). Оптимальная для выживаемости S.enteritidis плотность, однако, оказалась ниже, чем у E.coli М-17 (рисунок 7 А), и составляла около 108 кл/мл, что могло быть следствием более интенсивного выделения стабилизирующих метаболитов.

Рисунок 6 - Динамика экзометаболитов в процессе роста культуры Е.соН М-17 в

ферментаторе

В смешанных культурах выживаемость Э.еМегШсЛз уменьшалась (рисунки 7 А и 7 Б), хотя сам вид кривой Т50 практически не изменялся. У Е.соН М-17 оптимальный для выживаемости диапазон концентраций оказался шире, чем в чистых культурах, и сдвинулся в область низких плотностей. Вероятно метаболиты З.еМепйсЛв повы-

шали выживаемость и ускоряли гибель не только собственного штамма, но и Е.соН М-17.

18 15 12

в 12 ш

Ь- 8

А - чистые культуры, Б - смешанные культуры. По оси абсцисс - логарифм концентрации клеток.

Рисунок 7 - Зависимость времени гибели 50% клеток популяции от ее плотности

Как видно из таблицы 2, при одинаковом содержании Е.соН М-17 и Б-еМе/ШсИв (50:50) итог конкуренции зависел от их общей концентрации. С ее увеличением содержание Е.соН М-17 увеличивалось. В диапазоне концентраций 5*106-10е кл/мл обычно сохранялось исходное соотношение видов. Добавление цистеина, цитрата, глутамата и валина приводило к сдвигу соотношения в пользу Е.соН М-17. Значительно эффективнее, однако, оказалась композиция из всех идентифицированных компонентов АРК-2 (Комп-2). Таким образом, и при голодании антагонистическая активность Е.соН М-17 являлась следствием совокупного действия ее метаболитов.

Таблица 2 - Голодание Е.соН М-17 и S.enteritidis в смешанной культуре

Плотность культуры, кл/мл 2*Ю10 5*10® 109 108 5*107 5x10® 106

Содержание Е.соН М-17 на 12 сутки голодания, % 95±5 82±8 64±8 52±5 49±6 48±5 32+6

6 7 8 9 10 11

Комп-2, как и ее прототип АРК-2, ускоряла гибель E.coli М-17 в культурах высокой (25*109 кл/мл) плотности. Среди ее компонентов наиболее активным стимулятором гибели E.coli М-17 оказался глицин. Его добавление ускоряло гибель культуры, а удаление из состава Комп-2 приводило к увеличению выживаемости. Ацетат и, возможно, некоторые другие метаболиты способствовали генерации колебаний численности бактерий. При увеличении численности ацетат поглощался клетками, а затем, в процессе их гибели, вновь возвращался в среду, но уже в несколько меньшем количестве. Действие индивидуальных соединений отличалось от их совокупного действия. Типичным примером являлся формиат, способность которого повышать или понижать выживаемость определялась наличием других соединений.

Для выяснения популяционных механизмов авторегуляции и получения дополнительной информации об активности индивидуальных соединений, их действие изучалось в экспериментах на плотных средах при различных концентрациях. Для сравнения активности компонентов АРК использовали одинаковую для всех метаболитов концентрацию - 50 мкг/мл. В таблице 3 все метаболиты разделены на классы и перечислены в порядке убывания активности. Как видно из этих данных, сукцинат значительно слабее стимулировал рост Е. coli BL, чем Е. coli М-17, и подавлял рост S. enteritidis. Лактат стимулировал только рост Е. coli М-17, а рост других штаммов полностью подавлял. Подтвердились данные (Budrene & Berg, 1995) о том, что аспа-рагиновая кислота, ингибировавшая рост E.coli М-17, является в то же время стимулятором роста других штаммов E.coli.

Таблица 3 - Действие экзометаболитов Е. coli М-17 при выращивании бактерий на

плотных средах

Характер действия Е. соН М-17 Е. coli BL 5. ел/виШв

Стимуляторы Актофлор-С, сукцинат, метионин, валин, цистеин, сукц+глут, изолей-цин, глутамат, лизин, ацетат, глицин фенилаланин, аспартат, изолейцин, триптофан, метионин, глутамат, Актофлор-С, ацетат, сукцинат, сук+глут метионин, Актоф-лор-С, изолейцин, лейцин, сук+глут, глутамат, валин, фенилаланин, лизин, аланин, глицин

Ингибиторы Аспартат, аланин, индол, гистидин лактат, аланин, индол, гистидин, формиат лактат, сукцинат, ацетат

Нейтральные лактат, формиат, фенилаланин, триптофан, лейцин валин, глицин, лейцин, лизин, цистеин аспартат, индол, триптофан, формиат, цистеин

Эти принципиальные различия явились веским доказательством специфичности метаболической регуляции. Кроме того, метаболиты влияли не на всю популяцию, а только на ее отдельные части - субпопуляции, что приводило к повышению гетерогеннности и появлению или усилению бимодальности в распределении колоний по размеру. Можно полагать, что субпопуляции, как и различные виды микроорганизмов, стимулируют рост друг друга, обмениваясь соответствующими метаболитами, и формируют их пул, общий для всей популяции. По численности субпопуляции могут значительно различаться. Так, например, частота клеток, растущих в минимальной среде без добавок экзометаболитов, по нашим данным и данным других авторов составляла всего 10'5-10"7. Доминирующими в данных конкретных условиях могут быть всего несколько субпопуляций, но при изменении условий им на смену могут придти другие субпопуляции, отличающиеся культуральными и морфологическими свойствами. Возможно, что смена типа доминирующей популяции является причиной кажущейся невоспроизводимости ряда физиологических экспериментов.

Результаты, полученные при определении активности метаболитов на плотных и жидких средах, хорошо согласовались между собой. Имелись, однако, и некоторые различия. Такие соединения как аспартат, аланин, лактат, ингибировавшие рост того или иного штамма на плотных средах, могли инициировать рост на жидкой среде, поскольку в последнем случае их действие проявлялось не на субпопуляци-онном, а на популяционном уровне, и для проявления стимулирующего эффекта достаточно было инициировать рост всего одной из многих тысяч клеток.

6. Разработка и свойства модельной (синтетической) композиции бактериальных экзометаболитов - Актофлор-С.

Работа над синтетической композицией состояла из нескольких этапов. Сначала были получены 17 образцов АРК-1, различающиеся по активности и составу, определен состав этих образцов и проведен поиск корреляционных связей между составом и активностью препаратов. Далее осуществлялась статистическая обработка результатов и выбор состава базовой композиции Актофлор-С. При этом учитывались данные предыдущих этапов, активность метаболитов и их композиций, а также их динамика в процессе роста культуры. На заключительном этапе осуществлялась коррекция состава.

Содержание органических компонентов в препаратах АРК-1 варьировало от 6 до 80%. Оставшаяся часть приходилась на гидратную воду и неорганические компоненты. В пересчете на органическое вещество препараты в среднем содержали 8,5% аминокислот и 91,5% карбоновых кислот. Содержание первых варьировало от

1 до 24%, а вторых - от 76% до 99%. Активность препаратов зависела от их концентрации и плотности засева. Так, при концентрации 2 мг/мл максимальной активностью обладал 5-й препарат, а при концентрации 0,25 мг/мл - 3-й. Несмотря на это, активные в одном из тестов препараты обычно проявляли близкую активность и в других испытаниях. Благодаря этому удалось отобрать 7 высоко активных препаратов (3-5,11,13 и 16), а из их числа выделить группу 4-х наиболее активных - №№ 35 и 16. В целом активность препаратов коррелировала с количеством органических веществ. Два из наиболее активных препаратов (3 и 16), однако, содержали всего 10 и 6% органического вещества. Средний состав всех препаратов мало отличался от среднего состава наиболее активных и высокоактивных препаратов. Аналогичный вывод касался и содержания отдельных компонентов, даже если они являлись наиболее активными стимуляторами. При выборе состава Актофлор-С руководствовались определенными принципами, специально выработанными для регламентации количественного и качественного состава препарата. На основании этих принципов в состав базовой композиции были включены ацетат, формиат, лактат, сукцинат (в сумме 86%) и аминокислоты: аланин, валин, глутамат, глицин, метионин, лейцин, аспартат и цистеин. При сравнении стимулирующего действия Актофлор-С и наиболее активных препаратов АРК (№3 и №5) выяснилось (рисунок 8), что Актофлор-С был активен при уменьшении концентрации до 1,5-2 мкг/мл, АРК №3 - до 30 мкг/мл, а АРК №5 - приблизительно до 20 мкг/мл. Таким образом, Актофлор-С оказался приблизительно в 15 и 10 раз активнее препаратов №3 и №5. При использовании регрессионного анализа разница оказалась чуть меньше - 5-10 раз. Высокая активность Актофлор-С объяснялась оптимальным соотношением компонентов, а также отсутствием балластных веществ и ряда ингибиторов роста. Поскольку при создании композиции невозможно было учесть все варианты взаимного влияния метаболитов, следующей задачей являлась проверка адекватности состава и его коррекция. В результате этой работы в состав препарата был добавлен лизин, увеличены концентрации сукцината и метионина и уменьшено содержание лактата, формиата и ацетата, что привело к увеличению активности препарата приблизительно в 1,5 раза.

В экспериментах на плотных средах Актофлор-С стимулировал рост Е.соН М-17 эффективнее, чем каждый из его компонентов (таблица 3) и предложенный нами ранее стимулятор из 4-х веществ: ацетата, лактата, сукцината и глутамата [Вахитов и др., 2004]. Действие Актофлор-С отличалось высокой стабильностью, не сопровождалось увеличением гетерогенности колоний по размеру и падением эффективности высева. Как и прототип (АРКИ), Актофлор-С обладал специфичностью действия, то есть в значительно большей степени стимулировал рост Е.соН М-17, чем Е. со// В1.

и S. enteritidis (см. таблицу 3), подавлял рост E.coli 075. Добавление Актофлор-С (0,1 мг/мл) в смешанную культуру Е.со//' М-17 и E.coli 075 приводило к уменьшению процентного содержания последнего с 80% (содержание при засеве) до 1% и менее. В контрольной культуре (без препарата) в этих условиях происходило практически полное вытеснение штамма М-17. Актофлор-С стимулировал рост и оказывал выраженное влияние на антагонистическую активность L. acidophilus Д-75 и Д-76 в отношении музейных и клинических штаммов P. aeruginosa, С. freundii, 4-х штаммов S. aureus, К. oxitoxa, Enterobacter sp. В экспериментах in vitro размер зон задержки роста тест-культур этих бактерий увеличивался в 1,6-5 раз. Антагонистичекую активность условно-патогенной микрофлоры (Staphylococcus aureus 299) Актофлор-С, напротив, ослаблял.

■ I

0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 Концентрация, мг/мл

0,12

Рисунок 8 - Зависимость активностей препаратов №3, №5 и базовой композиции Актофлор-С от их концентраций

Фармакологическая активность препаратов Актофлор была показана в серии совместных работ с Военно-медицинской академией и некоторыми другими организациями [Позняк и др., 2001, 2002; Вахитов и др., 2002]. Изучение фармакологической активности его синтетического аналога - Актофлор-С, проводилась с Институтом токсикологии МЗ России на модели дисбакгериоза, вызванного свинцовой интоксикацией, и экспериментального язвенного поражения. Применение препарата приводило к восстановлению эубиоза и ускоряло заживление язв (таблица 4).

Таблица 4 - Лечение язвенного процесса препаратом Актофлор-С

Время, сутки Количество язв

Без лечения Лечение Актофлором-С

3 26±2 15±3

7 37±3 9±2

20 10±1 1±1

Таким образом, Актофлор-С оказался эффективным при лечении дисбакте-риозов и язвенных поражений желудочно-кишечного тракта. В целом доклиническое изучение показало, что Актофлор-С малотоксичен и в условиях длительного (90 суток) применения не вызывает нарушений биохимических показателей крови крыс и собак, не оказывает негативного действия на основные физиологические системы и внутренние органы, при внутрижелудочном введении не вызывает раздражающего эффекта. Препарат не оказывает аллергизирующего действия, не угнетает иммунную систему, не обладает мутагенным эффектом и не оказывает отрицательного действия на репродуктивную функцию.

Перед прототипом Актофлор-С имеет следующие преимущества: меньшая себестоимость, простота изготовления и контроля качества, отсутствие аллергенов и потенциально токсичных микробных метаболитов, большая удельная активность и насыпная плотность. Высокое содержание солей летучих жирных кислот в препарате позволяет при лечении не только воссоздать привычный для микрофлоры и макроорганизма метаболический пейзаж, но и обеспечить дополнительное питание клеткам эпителия, что должно способствовать восстановлению эубиоза не только на ре-гуляторном, но и на трофическом уровнях.

ВЫВОДЫ

1. Получены экспериментальные данные, в совокупности являющиеся доказательством существования системы саморегуляции численности и развития популяций бактерий, включающей основные коммуникативные связи, необходимые для позитивной и негативной регуляции роста и выживаемости.

2. При голодании бактерий обнаружены следующие эффекты саморегуляции:

а) рост выживаемости под действием низкомолекулярных экзометаболитов в

культурах низкой плотности; б) падение выживаемости под действием низкомолекулярных экзометаболитов в культурах высокой плотности; в) обеспечение максимальной выживаемости пулом низкомолекулярных экзо-

метаболитов в диапазоне средних (критических) концентраций клеток; г) генерация колебаний численности под действием экзометаболитов в двух поддиапазонах, промежуточных между диапазоном критической концентрации и диапазонами низких и высоких концентраций бактерий; д) согласованное протекание репарации клеточных структур бактерий, регулируемое экзометаболитами культуры; е) опосредованное метаболитами взаимное влияние на выживаемость раз-деленных диализной мембраной «молодой» и «старой» или разбавленной и плотной культур.

3. При изучении роста подтверждены и систематизированы эффекты кооперативного поведения бактерий: самостимуляция роста, самоингибирование роста, синхронные деления клеток в начале и конце роста, подразделение популяции на две автономно размножающиеся субпопуляции быстро растущих и медленно растущих клеток.

4. Впервые выделены и идентифицированы автостимуляторы роста бактерий. Доказана химическая природа других авторегуляторов численности и развития популяций и сообществ микроорганизмов, показано, что наиболее активными стимуляторами роста Е. coli М-17 являются янтарная и глутаминовая кислоты, метионин, лизин и ацетат. Ингибиторами роста этого штамма, помимо известных продуктов брожения, являются аспарагиновая кислота, аланин, гистидин, индол и некоторые другие соединения.

5. Изучены основные свойства автостимуляторов, к ним относятся: а) высокая специфичность действия, проявляющаяся на субпопуляционном и более высоких уровнях, в силу которой автостимуляторы роста одного штамма могут ингибировать рост родственного микроорганизма, и наоборот; б) синергическое действие, приводящее к усилению эффекта при совокупном действии нескольких или всех автостимуляторов роста; г) модулирующее действие нейтральных (не обладающих собственной активностью) метаболитов, приводящее к усилению действия автостимуляторов.

6. Обнаружено, что ацетат, основной продукт выделения у £. coli и ряда других микроорганизмов, проявляет свойства как позитивного, так и негативного регулятора. Характер действия ацетата зависит от его собственной концентрации, плотности культуры, ее физиологического состояния и стадии развития. В лаг-фазе ацетат стимулирует рост культуры и нивелирует действие ингибиторов роста. Высокие концентрации ацетата на более поздних стадиях ингибируют рост и усугубляют действие других ингибиторов. При голодании ацетат способствует

генерации колебаний численности. Все эти свойства позволяют отнести ацетат к плотностно-зависимым регуляторам развития культуры.

7. Изучены процессы обмена метаболитами: показано, что при росте и голодании бактерий выделение автосгимуляторов и других метаболитов может чередоваться с их поглощением. При уменьшении концентрации автостимуляторов ниже необходимого для роста предела происходит их выделение в среду. Если это невозможно, культура развивается по менее эффективному, независимому от авторегуляторов пути.

8. Согласно полученным данным, феномен выделения ацетата и других продуктов аэробно растущими бактериями, не имевший ранее удовлетворительного толкования, может объясняться их регуляторными функциями. При определенных условиях популяции очевидно выгоднее не утилизировать эти соединения, а использовать их в качестве регуляторов.

9. Показано, что низкомолекулярные экзометаболиты бактерий участвуют в регуляции межвидовых взаимоотношений: стимулируют рост симбиотических бактерий, способствуют вытеснению штаммов, «чуждых» данному микробиоценозу, и позитивно влияют на хозяина, способствуя тем самым сохранению собственной экологической ниши.

10. На основе результатов работы был создан препарат низкомолекулярных экзометаболитов бактерий, предназначенный для нормализации микрофлоры человека (Актофлор) и его искусственный аналог (Актофлор-С), стимулирующий рост штаммов пробиотиков в концентрации 1 мкг/мл и выше, и повышающий их антагонистическую активность значительно эффективнее, чем Актофлор. Получены данные, свидетельствующие о фармакологической активности обоих препаратов.

11. Совокупность приведенных в работе данных позволяет утверждать, что коммуникационные и регуляторные функции в развитии бактериальных популяций и их ассоциаций принадлежат пулу низкомолекулярных экзометаболитов: карбоновых кислот, аминокислот и некоторых других. Уникальность такой системы заключается в том, что условия для перехода популяции в определенное физиологическое состояние создает не одно регуляторное вещество, а комплекс выделяемых метаболитов, индивидуальный для каждого штамма микроорганизмов. Этот способ регуляции не требует специализированных регуляторов и структур, предназначенных для их распознавания, и по этой причине отличается универсальностью, высокой экономичностью и адаптивностью к окружающим условиям.

12. Результаты работы являются основой для формирования нового направления, посвященного выявлению и изучению регуляторных функций неспециализированных метаболитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вахитов Т.Я., Алексин Л.М, Ососкова Л.И. Роль внутрипопуляционных факторов на стадии отмирания Escherichia coli IIIV Всес. конф. «Управляемое культивирование микроорганизмов»,-Пущино, 1986.-С.55-56.

2. Вахитов Т.Я., Огородников О.Н., Алексин Л.М. Спектрофотометрический анализ развития бактериальных популяций // Биофизика микробных популяций - Красноярск, 1987.-С.101.

3 Вахитов Т.Я., Куликов С.В., Яшина О.Ю., Морозова Э.Н., Ососкова Л.И. Принцип Олли в популяциях микроорганизмов // В сб.: Отечественный производственный опыт. Микробиологическая промышленность. - М.: ВНИИ СЭНТИ, 1988,- Вып.4.-С.9-12.

4. Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю., Куликов С.В. Ауторегуляция численности в популяциях Escherichia coli II Всес. конф. «Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов».-Пущино, 1989.-С.14.

5. Стефаненко Л.И., Куликов С.В., Морозова Э.Н., Яшина О.Ю., Вахитов Т.Я. Хрома-тографическое разделение компонентов бактериальных культуральных жидкостей II В сб.: Передовой производственный опыт в медицинской и микробиологической промышленности, рекомендуемый для внедрения.- М.: ВНИИ СЭНТИ, 1989 - Вып.З- С.25-26.

6. Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю. Описание кинетики роста и выживания микробной популяции с учетом ауторегулирующих ее развитие факторов II В сб.: Передовой производственный опыт в медицинской промышленности, рекомендуемый для внедрения,- М: ВНИИ СЭНТИ, 1990,- Вып.2,- С.24-26.

7. Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю. Способ получения аутоактиватора роста для культивирования Escherichia coli II А.с. СССР № 1638156,1990.

8. Krasnikova L.V., Salahova I.V., Petrov L.N., Verbitskaya N.B., Alexin L.M., Sorvin S.V., Vahitov T.Ya. Vasilenko G.K. Biotechnological aspects of the prodaction of beverrages for the treatment and profilaxis of serum lactis // Inter, conf. on medical biotechnology, immunization and AIDS.- Leningrad, 1991.- P.7-13.

9. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Выживаемость клеток Escherichia coli при хранении в суспензиях различной концентрации II Микробиология,- 1992.- Т.61.- Вып.6.-С.1087-1095.

10.Vakhitov T.Ya., Protasov Е.А., Kulikov S.V., Petrov L.N., Korolyuk A.M. Growth auto-stimulators of bacteria with a wide range biological activity // Abstr. Intern. Conf. «Biotechnology St. Peterburg'94».- St.Petersburg, Russia, 1994,- P.78-79.

11. Vakhitov T.Ya., Tyagotin Yu.V., Petrov L.N. The effect of the growth autostimulators of Escherichia coli on the human tumor cell activity // Abstr. 3rd Intern. Conf. on AIDS, Cancer and Related Problems.-St.Petersburg, 1995,-P.83.

12-Тяготин Ю.В, Вахитов Т.Я., Рыбакова Л.П. Изменение под действием лимфоти-лина связывания этидий бромида с ДНК и роста опухолевых клеток в культуре // Тезисы 4-ой Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы»,-СПб., 1996,-С.87.

13.Королюк A.M., Вахитов Т.Я. Влияние ауторегуляторов роста на размножение нормальной и условно патогенной кишечной микрофлоры // Матер. VII Съезда

Всерос. об-ва эпидемиологов, микробиологов, и паразитологов,- М„ 1997.-Т. 1.-С.267-268.

14. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Вахитов Т.Я. Конструирование препаратов для лечения и профилактики дисбактериоза на основе представлений об эндоэкологии человека // Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы».- 1997.- Т.1.-№ 1.— С.161-162.

15. Вахитов Т.Я.,Петров Л.Н., Яшина О.Ю. Стимулятор роста бактериальной культуры. Патент России № 2090612,1997.

16. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Вахитов Т.Я. Теоретические основы конструирования новых препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов// Матер, конф. «Современная микробиология. Состояние, достижения и перспективы»,-СПб, 1998,- С.83-84.

17.Тяготин Ю.В., Полоцкий А.Е., Вахитов Т.Я., Тутова И.Ю., Рыбакова Л.П. Экспериментальное изучение биопрепарата лимфолитин как антипролиферативного и противоопухолевого средства // Вопросы онкологии.- 1998 - Т.44,- № 1.- С.92-96.

18. Вахитов Т.Я., Виснольд Н.В., Протасов Е.А., Петров Л.Н. Выделение и идентификация аутостимуляторов роста Escherichia coli М-17 II Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы».- 1999 - Т.З.- № 1.- С.116-117.

19.Вахитов Т.Я., Толпаров Ю.Н., Момот Е.Н. Петров Л.Н., Свентицкий Е.Н. 1Н-ЯМР-анализ препаратов аутостимуляторов роста Escherichia coli М-17 II Там же,-С.117.

20. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Добролеж О.В. Ауторегуляция роста бактерий и ее роль в поддержании качественного и количественного состава микрофлоры человека // Там же.-С.117.

21.Вахитов Т.Я. Колебания численности бактерий в процессе голодания II Биофизика,-1999,- Т.44.- Вып.З.- С.503-504.

22.Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Добролеж О.В., Толпаров Ю.Н., Петров Л.Н. Роль янтарной кислоты в сохранении жизнеспособности и антагонистической активности Е. coli М-17 II Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы»,- 2000-Т.4.— № 1.- С.31.

23.Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю., Петров Л.Н., Королкж A.M. Изучение действия препарата аутостимуляторов роста Escherichia coli М-17 (препарат «Актофлор») на рост чистых и смешанных культур бактерий // Журн. микробиол.- 2000,- №3,-С.20-24.

24. Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Влияние препаратов «Актофлор» на выживаемость Escherichia coli М-17 и Salmonella enteritidis при голодании в смешанных культурах II Журн. микробиол,- 2000,- №6,- С.67-68.

25. Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Задаура Е.Ю. Сравнительное изучение действия препаратов аутостимуляторов роста Escherichia coli М-17 и фруктоолигосахаридов на рост и антагонистичекую активность лактоба-цилл // Журн. микробиол,- 2001.- №3,- С.80-83.

26. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Разработка новых пребиотиков на основе аутостимуляторов роста нормальной микрофлоры человека II Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы».- 2001.- Т.5.- № 1.- С.95.

27. Позняк А.Л., Лобзин Ю.В., Петров Л.Н., Вахитов Т.Я. Диагностика и принципы рациональной терапии дисбактериозов кишечника у больных хламидиозами, протекающими с системными проявлениями //Там же.- С.106.

28. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Ауторегуляторы роста нормальной микрофлоры как основа для создания новых пребиотиков // Матер, междунар. научно-практич.

конф. памяти Г. И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования».- М., 2002.- С.17-18.

29.Вахитов Т.Я.,Петров Л.Н., Борц М.С., Николаева Е.Г. Биоактивная добавка для косметических средств. Патент России № 2180576,2002.

30.Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Шалаева О.Н., Петров Л.Н. Экзометаболиты пробиоти-ков как фактор восстановления микробиоценоза человека // Матер, междунар. научно-практич. школы-конф. «Цитокины. Воспаление. Иммунитет».- СПб., 2002.- С.24.

31. Момот Е.Н., Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Метаболическая регуляция в развитии культур бактерий пробиотиков II Там же.- С.28.

32. Позняк А.Л., Петров Л.Н., Вахитов Т.Я. Влияние препарата Актофлор на микрофлору кишечника у больных хроническими мочеполовыми хламидиозами // Там же.- С.ЗО.

33. Вахитов Т.Я., Протасов Е.А, Виснольд Н.В, Толпаров Ю.Н., Петров Л.Н. Выделение и идентификация аутостимуляторов роста Escherichia coli. II Журн. микро-биол,- 2003.- №2,- С.7-12.

34. Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Шалаева О.Н., Петров Л.Н. Состав и биологическая активность экзометаболитов Escherichia coli М-17. // Журн. микробиол,- 2003,-№6.- С.20-25.

35. Момот Е. Н., Вахитов Т.Я. Действующее начало препарата-пребиотика Актофлор II Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. II Московского междунар. конгр,- М.: ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им. Д.И.Менделеева, 2003 - Ч. 2.-С.135.

36. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты // Матер, междунар. конф. «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы».- М., 2004.- С. 95-96.

37. Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Петров Л.Н. Стимулятор роста клеток бактерий Escherichia coli. Патент России № 2233875, 2004.

38. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Перспективы создания антипатогенных лекарственных средств // Folia ORL et PR.- 2004,- V.10.- №3-4.- Р.48-59.

39. Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Толпаров Ю.Н. Динамика и функции экзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichia coli М-17 II Журн. микро-биол.- 2005.- № 1.- С. 16-21.

40. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты // Журн. микробиол.-2005.-NB5.-C.108-114.

41. Петров Л.Н., Бондаренко В.М., Вахитов Т.Я., Воробьев А.А. QS-системы у бактерий и перспективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов // Вестник Российской АМН,- 2006,- №1.- С.38-45.

42. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М., , Воробьев А.А. Перспективы создания пробиотических препаратов на основе чувства кворума у бактерий II Журн. микробиол.- 2006 - № 3,- С.105-113.

43. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Регуляторные функции экзометаболитов бактерий // Микробиология.- 2006.- Т.75 - №4.- С.483-488.

44. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М., Шалаева О.Н. Стимулятор роста микроорганизмов «Полифлор» и препарат для лечения желудочно-кишечного тракта. Патент на изобретение (решение о выдаче патента от 26.07.2006, заявка №2005108334).

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Вахитов, Тимур Яшэрович

ВВЕДЕНИЕ.И

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Проблема саморегуляции развития микробных популяций. Исторический обзор.

1.1.1 Стимуляция роста культур продуктами собственного обмена.

1.1.2 Самоингибирование и остановка роста.

1.1.3 Стадии роста.

1.1.4 Физиологические изменения в процессе роста.

1.1.5 Морфологические изменения в процессе роста.

1.1.6 Рост колоний на плотных питательных средах.

1.2 Продукты метаболизма при различных условиях выращивания Escherichia coli.

1.2.1 Аэробный рост на различных субстратах.

1.2.2 Микроаэрофильные и анаэробные условия роста.

1.3 Экспрессия генов при росте культур на полных и минимальных средах.

1.3.1 Зависимость экспрессии генов от скорости роста.

1.3.2 Независимая от скорости роста экспрессия генов.

1.3.3 Рост культуры на ацетате.

1.4 Физиологическая роль выделяемых продуктов обмена.

1.4.1 Авторегуляция внеклеточного рН и его влияние на экспрессию генов.

1.4.2 Действие ацетата и других анионов короткоцепочеч-ных жирных кислот.

1.5 Кворум-зависимые реакции бактерий.

1.5.1 Регуляторные функции ацилированных лактонов го-мосерина.

1.5.2 Пептидные регуляторы грамположительных бактерий.

1.5.3 Кворум-зависимые системы Vibrio harveyi и межвидова: коммуникация бактерий.

1.5.4 Использование механизмов межклеточной коммуникации в медицинских целях.

1.6 Метаболиты бактерий как фактор симбиоза микрофлоры и ее хозяина.

1.7 Метаболическая регуляция в развитии популяций высших организмов, ее экологическая и эволюционная роль.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Культуры бактерий и условия их хранения.

2.2 Стандартное выращивание Escherichia coli М-17.

2.3 Выращивание E.coli К-12, Е. coli К-165, S. marcescens и S.enteritidis.

2.4 Спектрофотометрический контроль роста.

2.5 КОЕ, размер колоний, концентрация и размер бактерий.

2.6 Условия голодания, выживаемость, численность и повреж-денность микроорганизмов.

2.7 Параметры кривых выживаемости бактерий.

2.8 Биологическая активность экзометаболитов E.coli М-17.

2.9 Получение препаратов экзометаболитов.

2.10 Действие экзометаболитов на рост чистых и смешанных культур.

2.11 Действие экзометаболитов на выживаемость в смешанных культурах.

2.12 Сравнение действия АРК и фруктоолигосахаридов.

2.13 Флуоресцентный анализ.

2.14 Хроматографические методы.

2.15 Аналитические методы.

2.16 Статистическая обработка результатов.

Глава 3 САМОРЕГУЛЯЦИЯ РОСТА В ПЕРИОДИЧЕСКОЙ

КУЛЬТУРЕ Escherichia coli.

3.1 Спектрофотометрический контроль роста.

3.2 Спектральные характеристики внеклеточной среды.

3.3 Биологическая активность метаболитов внеклеточной среды.,.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях"

Актуальность работы. Быстро выросший за последние годы интерес к коммуникативным связям бактерий объясняется осознанием высокой значимости этих вопросов для решения научных и практических задач в области биотехнологии, медицины, здравоохранения и сельского хозяйства. В настоящее время механизмы коммуникации преимущественно связывают с так называемым «чувством кворума» [Fuqua et al., 1994] - способностью бактерий «ощущать» плотность собственной популяции путем выделения и последующей рецепции особых низкомолекулярных соединений - автоиндукторов.

Автоиндукторами могут являться как специализированные соединения, например ацилированные лактоны гомосе'рина (АГЛ) или модифицированные олигопептиды (МОПы), так и не специализированные вещества. К последним относятся автоиндукторы второго типа (АИ-2), образующиеся путем спонтанного превращения обычного внутриклеточного интермедиата - 4,5-дигидрокси-2,3-пентандиона. Существуют данные, свидетельствующие о том, что в регуляции задействованы и другие неспециализированные метаболиты, например индол, и даже обычные (кодируемые) аминокислоты.

Автоиндукторы «чувства кворума» участвуют в регуляции самых различных процессов, перечень которых постоянно расширяется. К ним относятся: биолюминесценция, споруляция, агрегация, формирование биопленок, плодовых тел и клеток-швермеров, конъюгация, синтез антибиотиков, экзоферментов, факторов вирулентности и некоторых других соединений. Синтез самих автоиндукторов зависит от плотности популяции, однако до сих пор остается дискуссионным вопрос о том, контролируется ли она собственными внутрипопуляционными механизмами или полностью определяется внешними факторами (состав среды, аэрация, температура, рН и т.д.), то есть регулируется на более высоком уровне (микробиоценоз или искусственное поддержание параметров среды).

Согласно установленным в экологии закономерностям, полноценная система саморегуляции численности и развития популяций должна включать 4 основные регуляторные связи, обеспечивающие оптимальные для данных условий скорость размножения и продолжительность жизни (выживаемость) организмов. Это позволяет отнести к контролирующим численность и развитие популяций микроорганизмов следующие связи: 1) положительная обратная связь, обеспечивающая инициацию и последующий рост культуры; 2) отрицательная обратная связь, способствующая замедлению роста, его остановке и адаптации культуры к новым условиям еще до полного исчерпания субстрата; 3) положительная обратная связь, повышающая выживаемость бактерий при оптимальной для данных условий плотности культур; 4) отрицательная обратная связь, приводящая к снижению выживаемости, если плотность культуры по какой-то причине превысила оптимальный уровнь.

В настоящее время установленным для бактерий можно считать только наличие отрицательной обратной связи, обеспечивающей остановку роста культуры. Эксперименты с культурами высокой плотности в 70-е - 80-е годы прошлого века показали, что функции ингибиторов роста выполняют накапливающиеся в среде продукты метаболизма: кислоты (муравьиная, уксусная, молочная, пропионовая и др.), спирты (метанол, этанол, пропанол и т.д.) и некоторые другие соединения. Их действие, однако, не рассматривалось с позиций авторегуляции, расценивалось как неспецифическое и, в соответствие с этим, объяснялось закислением среды, понижением мембранного потенциала и некоторыми другими причинами.

Значительно меньше известно об автостимуляторах роста. Содержащие эти соединения фильтраты культуральных жидкостей используются на практике для ускорения роста микроорганизмов или для реактивации их покоящихся форм (Эль-Регистан, 2005), однако информация относительно природы и биологических свойств самих автостимуляторов весьма ограничена и противоречива. По одним сведениям бактерии выделяют эти соединения преимущественно в лаг-фазе, по другим - на протяжении всего роста. Безуспешными оказались и все известные попытки идентифицировать автостимуляторы, включая и самые последние из них (Weichart & Kell, 2001). Практически неизвестными до сих пор оставались явления саморегуляции выживаемости бактерий. В последние годы эти вопросы рассматриваются в литературе с позиций программируемой клеточной гибели (апоптоза) бактериальных культур (Engelberg-Kulka & Glaser, 1999), направленной преимущественно на лизис зараженных вирусом бактерий и обеспечение за их счет питательными веществами оставшихся клеток.

Все это говорит о том, что имеющихся в настоящее время знаний недостаточно для ответа на вопрос о существовании или отсутствии у бактерий системы саморегуляции численности. С практической точки зрения значительный интерес для исследования процессов саморегуляции представляют представители нормальных симбионтов человека и пробиотиков, использующихся для коррекции микрофлоры. Это послужило одной из причин, по которым в качестве основного объекта изучения в настоящей работе был выбран штамм первого отечественного пробиотика Е. coli М-17 (препарат колибактерин). Эксперименты с другими бактериями показали, что те же методы могут быть успешно применены для изучения аналогичных процессов у других микроорганизмов, по крайней мере тех, которые обитают в сходных экологических условиях организма человека.

В ходе выполнения работы были поставлены следующие основные задачи:

4. Изучить биологические свойства исходных и фракционированных экзометаболитов, полученных при различных способах выращивания и в процессе голодания культур различной плотности.

7. Выяснить роль внутрипопуляционных регуляторных процессов в регуляции биологических систем более высокого уровня. С этой целью изучить влияние идентифицированных экзометаболитов и их композиций на рост, выживаемость и антагонистическую активность бактерий в смешанных культурах, их влияние на состав микробиоценоза лабораторных животных, токсическое действие на организм хозяина и течение искусственно вызванного язвенного процесса.

Методологической и теоретической основой работы являлись труды академиков С.С. Шварца, А.С. Хохлова, работы 70-80-х годов прошлого века группы авторов УНЦ АН (Р.А. Пшеничнов, С.Я. Барихин, А.Г. Тка-ченко, В.П. Коробов, О.Н. Октябрьский, Г.В. Смирнова, и др.), Н.С. Печур-кина с соавторами, Г.И. Эль-Регистан, А.Н. Козловой, А.С. Капрельянца, Г.А. Осипова, В.А. Светличного и некоторых других отечественных и зарубежных исследователей, а также работы в области микроэкологии человека

Л.Г Перетца, Н.М. Грачевой, И.Б. Куваевой, Б.А. Шендерова, В.М. Бонда-ренко, чл.-корр. АМН И.В. Домарадского с соавторами, академика АМН А.А. Воробьева с соавторами и ряда других исследователей.

Основные положения, выносимые на защиту:

5. Участие идентифицированных продуктов метаболизма в регуля-торных процессах более высоких уровней (смешанные культуры, микробиоценозы, взаимодействия с организмом хозяина).

6. Перспективность использования авторегуляторов в составе пробио-тических препаратов и продуктов функционального питания.

Научная новизна.

Сформулированы критерии, позволяющие судить о наличии или отсутствии системы авторегуляции численности и развития популяций данного вида (штамма) бактерий. Показано, что система авторегуляции у E.coli М-17 полностью отвечает сформулированным критериям. Аналогичные системы выявлены для других штаммов E.coli, S. marcescens, S. enteritidis и некоторых других микроорганизмов.

Разработаны методы выделения автостимуляторов роста микроорганизмов. С использованием этих методов впервые идентифицированы автостимуляторы роста бактерий, которыми для E.coli М-17 оказались янтарная и глутаминовая кислоты.

Получены новые данные относительно биологической активности ацетата: впервые показано, что ацетат является не только ингибитором, но и стимулятором роста бактерий и может выполнять функции плотностно-зависимого регулятора развития их популяций. Предложено новое объяснение, согласно которому выделение ацетата и других метаболитов обусловлено их регуляторными функциями на популяционном уровне, а не наличием «дефектов» в организации внутриклеточного метаболизма.

Показано что идентифицированные автостимуляторы, а также ряд других аналогичных соединений (аминокислот, продуктов брожения и т. д.), могут осуществлять коммуникативные функции на межвидовом уровне, например стимулировать рост собственного штамма и подавлять развитие других штаммов, и наоборот, регулируя таким образом соотношение видов в смешанных культурах и микробиоценозах.

Созданы не имеющие аналогов искусственные (модельные) композиции метаболитов бактерий, не отличающиеся по биологическим свойствам от нативных растворов метаболитов или значительно превосходящие их по способности стимулировать рост бактерий. Впервые выдвинуто положение о возможности использовать эти композиции для нормализации состава и повышения физиологической активности собственной микрофлоры хозяина. В опытах на лабораторных животных показана эффективность подобной композиции (Актофлор-С) при коррекции дисбиотического состояния и в лечении язвенного процесса.

Результаты работы защищены Авторским свидетельством №1638156 (1990) и Патентами России №2090612 (1997), №2180576 (2002) и №2233875 (2004), получено решение на выдачу патента по заявке №2005108334.

Практическая и теоретическая значимость.

Результаты работы нашли практическое применение при выращивании пропионовокислых и молочнокислых бактерий на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов. Разработанные в.диссертации методы позволили повысить стабильность и стандартность выпускаемых бактериальных препаратов и одновременно сократить на 15-20% время культивирования, количество потребляемой чистой воды и жидких отходов.

Разработаны подходы для создания лечебно-профилактических препаратов на основе низкомолекулярных метаболитов микроорганизмов (Ак-тофлор). Показана возможность конструирования их синтетических аналогов (Актофлор-С) с более высокой биологической активностью и улучшенными физико-химическими характеристиками. Препараты Актофлор и Ак-тофлор-С прошли соответствующий цикл испытания на отсутствие общей, хронической и специфической токсичности в институте токсикологии МЗ РФ. Исследования в СПб МАЛО показали, что Актофлор в составе биологически активной добавки Неовитал-пребиотик оказывает положительное влияние на состав кишечной микрофлоры и самочувствие больных. В экспериментах на животных показана эффективность применения Актофлор-С при дисбактериозах и язвенных поражениях. Оба препарата используются в качестве биологически активной добавки (ХБО при РАН «Фирма Вита»). Отмечается положительное влияние Актофлор на микрофлору кожи, структуру и прочность волос. На основании успешного применения Актофлор для восстановления кишечной микрофлоры у больных хроническими хла-мидиозами (ВМедА им. С.М. Кирова) сделан вывод о целесообразности его использования самостоятельно или в сочетании с бактериальными препаратами. В последнем случае эффективность действия тех и других препаратов увеличивалась. Полученные результаты изложены в монографии коллектива авторов ВМедА «Хламидийные инфекции» (СПб, 2003).

Опубликованные в открытой печати данные использовались при создании аналогичного Актофлору препарата «Микростим» («Пермское НПО «Биомед»), определении методических подходов для оценки его бактерио-тропнош действия и при создании концепции перспективного применения метаболитных комплексов в технологии пробиотических препаратов.

• поиск систем саморегуляции, аналогичных изученным, у других микроорганизмов и на других уровнях организации (развитие тканей, органов, популяций растений и животных);

• выяснение молекулярных механизмов действия неспециализированных регуляторов: аминокислот, карбоновых кислот, спиртов и некоторых других продуктов с использованием современных методов ге-номики и протеомики;

• разработка нового поколения пробиотиков, обладающих повышенным терапевтическим действием за счет введения в их состав регу-ляторных факторов, и совершенствование системы отбора новых штаммов пробиотиков;

• совершенствование биотехнологических процессов путем использования базисных закономерностей саморегуляции развития популяций.

Итоги работы позволяют поставить вопрос о расширении понятия «авторегулятор» и включить в круг регуляторных соединений ряд неспее циализированных в этом отношении метаболитов. Это создает теоретические предпосылки для реконструкции эволюции регуляторных систем, начиная от регуляторных функций элементарных метаболитов (СО2, N0, НСООН, СН3СООН, аминокислот и других простейших органических веществ) и кончая сложными соединениями пептидной, белковой или иной природы.

Практическое использования результатов работы подтверждено соответствующими публикациями и Актами о внедрении. Препарат Актофлор отмечен дипломом первой степени и медалью Недели высоких технологий в Санкт-Петербурге (12-15 июня 2001 г), за его разработку автор диссертации награжден медалью лауреата Всероссийского выставочного центра (постановление от 30.12.93г № 55-Н).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Вахитов, Тимур Яшэрович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема межклеточной коммуникации у микроорганизмов привлекала внимание исследователей практически с момента зарождения микробиологии. Первоначально она ограничивалась решением двух основных вопросов: почему микробная популяция не начинает расти, если ее плотность слишком низка, и почему она прекращает рост после достижения определенной плотности. В дальнейшем круг проблем был существенно расширен (см. разделы 1.1.1-1.1.6). В последние годы проблему межклеточной коммуникации связывают с решением широкого спектра биотехнологических проблем, в том числе и с перспективой создания нового поколения лечебных препаратов, альтернативных антибиотикам, но не оказывающих губительного влияния на микрофлору человека.

Настоящее исследование сформировалось как продолжение работы, направленной на решение двух важных прикладных задач - получение стандартной биомассы микроорганизмов и увеличение сроков хранения бактериальных суспензий высокой плотности. Уже в самом начале работы выяснилось, что оба процесса (рост и голодание) являются по сути саморегулируемыми, и путь к их совершенствованию лежит через понимание механизмов коммуникативных связей бактерий. Всю дальнейшую работу в этом направлении можно разделить на ряд последовательных этапов.

Первый этап был посвящен выявлению фактов саморегуляции в процессе роста и голодания бактерий. На втором этапе с использованием хро-матографических и других физико-химических методов была проведена идентификация регуляторов роста бактерий. Одновременно (3-й этап) изучались биологические свойства выделенных из КЖ низкомолекулярных экзометаболитов. На четвертом этапе решались задачи практического применения результатов - создание препаратов для использования в биотехнологических и медицинских целях. По существу на этом этапе осуществлялась проверка значимости полученных результатов и правильности сделанных на их основе выводов.

Основная трудность первого этапа заключалась в том, что согласно господствующим воззрениям тех лет регуляторные контакты между клетками могут осуществляться только у высших организмов, а изучение межклеточных взаимодействий у микроорганизмов и поиск соответствующих регуляторных соединений априори полагались бесперспективными (см. раздел. 1.1). В этой ситуации само существования регуляторных связей требовало весьма серьезной аргументации.

К саморегулируемым процессам, как известно, относятся процессы с обратной связью, позволяющей системе развиваться по заданной программе, своевременно изменять собственное состояние, реагировать на изменения окружающих условий и четко их отслеживать. Одним из признаков систем с обратной связью является наличие неустойчивых колебательных режимов, характеризующихся периодическим изменением контролируемых параметров [Коган, 1977; Пригожин, Стенгерс, 1986; Николис, Пригожин, 1990; Баблоянц, 1990]. По этой причине важным направлением работы был поиск самосогласованных периодических и непериодических изменений свойств клеток и их популяций. В результате были обнаружены периодические процессы изменения выживаемости бактерий (см. раздел 4.1), их светорассеивающих свойств, проницаемости мембран (см. раздел 4.9.3), чувствительности к дезоксихолату (см. раздел 4.9.1), самосогласованные деления клеток в процессе выращивания культур и некоторые другие свидетельства кооперативного поведения бактерий. Колебательные режимы являются переходными между двумя относительно устойчивыми состояниями - состоянием с максимальной выживаемостью при оптимальной (критической) плотности популяции и процессом быстрой гибели бактерий при высокой плотности их популяции.

Многие свидетельства саморегуляции развития микробных популяций были обнаружены при ретроспективном анализе литературы, другие были получены в наших собственных исследованиях. К первым относится хорошо известная зависимость продолжительности лаг-фазы от плотности засева (см. раздел 1.1.1), ко вторым - снижение выживаемости при увеличении плотности популяции выше определенного предела [Вахитов и др, 1986; Вахитов, Петров, 1992, 2006].

О существовании механизма авторегуляции свидетельствует и S-образный вид кривой роста культуры, обративший на себя внимание исследователей еще в самом начале 20 века (см. раздел 1.1.3). Подобные закономерности широко известны в химической кинетике, электродинамике и многих других разделах естествознания и объясняются действием соответствующих положительных и отрицательных обратных связей.

Наличие лаг-фазы подразумевает наличие положительной обратной связи, или автокатализа. Классическим примером автокатализа из области химии может служить гидролиз сложных эфиров, ускоряемый образующейся в ходе реакции кислотой. Накопление продуктов приводит к постепенному уменьшению скорости реакции и, в конечном итоге, к ее остановке. Чтобы реакция дошла до конца необходимо постоянно удалять образующиеся в ее ходе соединения. При определенных условиях в химических системах с автокатализом могут возникать периодические колебания [Белоусов, 1959]. Предполагается, что именно колебательные реакции явились биохимической основой возникновения живого [Пригожин, Стенгерс, 1986; Николис, Пригожин, 1990; Баблоянц, 1990].

При аэробном росте основным конечным продуктом является СОг, удаляющийся из среды культивирования с током поступающего газа (воздуха, кислорода или искусственной смеси). Накопившись в среде до определенного предела, СОг стимулирует рост культуры [Walker, 1932], однако эту функцию углекислого газа до сих пор рассматривают не как регуляторную, а как трофическую. Однако образование других продуктов с этих позиций необъяснимо, поскольку в аэробных условиях все они являются субстратами для конструктивного или энергетического метаболизма. По этой причине их накопление в среде культивирования вплоть до настоящего времени объясняют «плохой» организацией роста, то есть несбалансированностью стадий биосинтетических и энергетических процессов. Результаты настоящей работы позволяют объяснить выделение экзометаболитов с экологических позиций. Согласно полученным данным, каждое (или большинство) из выделяемых соединений выполняет определенные коммуникативные функции: обеспечивает рост и развитие популяции, ее взаимодействие с другими популяциями или участвует в поддержании коммуникативных связей с организмом хозяина.

В процессе изучения механизмов саморегуляции рассматривалось два альтернативных варианта взаимодействия бактерий: передача регуляторно-го сигнала путем физических контактов (непосредственные межклеточные контакты [Конев, Мажуль, 1977], а также контакты путем генерирования электрических, электромагнитных, акустических и других сигналов [Коган, 1977; Николаев, 2000]) и химическое взаимодействие, опосредованное действием соответствующих сигнальных молекул.

Чтобы различить эти два типа взаимодействия была проведена серия экспериментов по хранению культур в условиях диализа. При высокой концентрации клеток частичное диализное удаление выделяемых низкомолекулярных метаболитов приводило к увеличению выживаемости культур. Если же выделяемые метаболиты удалялись практически полностью (высокая интенсивность диализа), то скорость гибели культуры вновь увеличивалась. Аналогичные результаты были получены, и при адсорбции метаболитов активированным углем. Регуляторные функции низкомолекулярных экзометаболитов подтвердились при их добавлении в среду голодания, а также при голодании разделенных диализной мембраной культур. Хромато-графическими методами были получены фракции веществ, понижающих выживаемость бактерий. Все эти данные не оставляли сомнений в том, что регуляторами выживаемости являются выделяемые бактериями низкомолекулярные соединения - УГ-факторы (глава 4, [Вахитов и др, 1986; Вахитов и др., 1989; Вахитов, Петров, 1992, 2006; Вахитов, 1993]).

Изучение биологической активности КЖ голодающих культур показало, что в ее составе имеются не только УГ-факторы, но и стимуляторы роста бактерий. При наличии колебаний численности концентрации тех и других соединений периодически изменялась, причем максимумы активности УГ-факторов соответствовали начальным этапам возрастания КОЕ и совпадали с падениями активности стимуляторов роста. Все это позволяло предполагать, что колебания численности связаны с попеременным действием УГ-факторов и стимуляторов роста.

Активность стимуляторов роста в среде голодания культур высокой плотности оказалась значительно выше, чем в среде культивирования бактерий, что позволило разработать соответствующий способ получения высокоактивных стимуляторов роста бактерий [Вахитов, Яшина, 1990в].

В процессе работ по стандартизации выращивания микроорганизмов подтвердилось, что начало и конец роста культур обычно сопровождаются их синхронным делением. Непосредственно перед синхронным делением концентрация стимуляторов роста увеличивалась, в процессе деления она падала, а затем вновь восстанавливалась до исходного уровня [Вахитов и др., 1987].

Оптимальным с позиций биотехнологии является остановка роста сразу после синхронного деления, поскольку в этом случае культура отличается минимальной гетерогенностью, повышенной устойчивостью к технологическим стрессам и содержит приблизительно в 2 раза больше жизнеспособных клеток (КОЕ). На практике, однако, рост обычно останавливают непосредственно перед синхронным делением, поскольку связанное с ним понижение оптической плотности ошибочно принимают за автолиз культуры. Для того чтобы отличить синхронное деление от автолиза, нами было предложено применять для контроля роста метод спектров мутности, позволяющий судить о размере клеток по величине характеристической функции светорассеяния - п [Вахитов и др., 1987]. Величина этого показателя изменяется антибатно размеру клеток и в процессе синхронного деления быстро увеличивается. Использование метода спектров мутности показало, что не всякое культивирование заканчивается синхронным делением культуры, однако при необходимости его можно спровоцировать дробным введением небольшого количества питательной добавки. Предложенные методы контроля роста и синхронизации культуры позволили значительно улучшить качество получаемой биомассы.

Стимуляторы роста играли важную роль на всех стадиях культивирования. Сравнительно высокий уровень этих соединений регистрировался в КЖ сразу после внесения посевной культуры. Часть стимуляторов переносилась в составе внеклеточной среды, а часть выделялась бактериями. Чем ниже была концентрация стимуляторов в среде, тем дольше культура не приступала к росту. Рост начинался только после того, как их концентрация достигала определенного порогового значения. В дальнейшем стимулирующая активность КЖ сначала увеличивалась, а затем, приблизительно с середины роста, начинала падать, что, в конечном итоге и приводило к остановке роста. Зависимость роста и гибели бактерий от активности метаболитов КЖ была подтверждена путем построения соответствующей математической модели (см. раздел 4.6.3).

Таким образом, при изучении культивирования и голодания были получены веские свидетельства существования низкомолекулярных эффекторов, влияющих на рост и выживаемость бактерий. Доказать наличие подобных соединений, однако, можно было только после их выделения и идентификации.

Наиболее перспективными в этом отношении представлялись стимуляторы роста, поскольку именно они (а не ингибиторы или УГ-факторы) играли ключевую роль в развитии популяции. Кроме того, эти вещества имели очевидную практическую ценность, а определение их биологической активности было значительно проще и не требовало таких затрат времени, как определение активности УГ-факторв.

В использовавшемся первоначально методе разделения на TSK-геле (см. раздел 6.1), стимуляторы и ингибиторы роста E.coli М-17 локализовались в двух соседних группах фракций: 23-26 и 27-30, а стимуляторы гибели в 22-23 (УЛ) и 29-31 (УГ2) фракциях. Близкое расположение фракций стимуляторов и ингибиторов свидетельствовало о сходстве их строения, но могло быть и следствием того, что в зависимости от концентраций и/или сопутствующих веществ одни и те же соединения оказывали стимулирующее или ингибирующее действие. Аналогичное замечание касается и близкого соседства УГр и УГ2-факторов со стимуляторами и ингибиторами роста соответственно [Стефаненко и др., 1989].

Важной особенностью разделения на TSK-геле являлось то, что фракции стимуляторов роста (23-26) проявляли более высокую активность, чем исходные препараты. Результаты последующей работы позволяют полагать, что причиной этого являлось отсутствие ингибиторов и уникальное сочетание стимуляторов роста и сопутствующих соединений. В дальнейшей работе в составе этих фракций было обнаружено как минимум два активных вещества, однако их суммарная активность была значительно ниже, чем активность фильтратов КЖ и фракций 23-26. По другим оценкам (см. раздел 6.4) таких веществ было не менее трех.

Результаты этих исследований (см. разделы 6.1-6.5) показали принципиальную возможность выделения и идентификации стимуляторов роста [Вахитов и др., 1989]. Для решения этой задачи, однако, требовалось разработать более эффективный способ фракционирования и концентрирования компонентов КЖ и по возможности исключить стадию ее лиофильного высушивания. Использование методов экстракции не привело к желаемому результату ввиду высокой гидрофильности искомых веществ. Неэффективными оказались и катионные сорбенты. Значительного прогресса удалось достигнуть только путем применения анионообменных смол, что свидетельствовало о кислотной природе стимуляторов роста. Результаты фронтальной хроматографии (см. раздел 6.6.2) подтвердили предположение о поликомпонентном составе стимулятора роста и показали, что в составе стимулирующего комплекса может быть не менее 5-6 соединений, то есть значительно больше, чем по более ранним оценкам.

Представление о поликомпонентном составе стимулятора роста легло в основу дальнейшей стратегии поиска его составляющих. На первом этапе все усилия были сосредоточены на выделении соединений с индивидуальной активностью. Затем предполагалось более подробно исследовать другие фракции и их влияние на активность уже идентифицированных компонентов.

Потеря активности в процессе фракционирования метаболитов КЖ привела к определенным осложнениям в работе. В конечном итоге, однако, удалось выделить два предположительно наиболее активных компонента -янтарную и глутаминовую кислоты. Как и предполагалось, эти соединения оказались исключительно гидрофильными и обладали сравнительно высокой кислотностью. Они заметно увеличивали скорость роста культуры, понижали приблизительно в 10 раз необходимую для его инициации плотность засева, но при этом не инициировали рост при концентрации бактерий ниже 104-105 кл/мл [Вахитов и др., 1999, 2003].

То, что основными компонентами стимулятора роста оказались не специализированные соединения (например, такие, как АГЛы или МОПы, см. раздел 1.5), а обычные метаболиты, позволило предположить, что и другие продукты метаболизма Е. coli могут проявлять стимулирующую активность [Момот, 2002; Вахитов и др., 2003]. Для проверки этого предположения был изучен состав низкомолекулярных метаболитов Е. coli М-17 и составлена композиция из всех идентифицированных соединений. Чтобы понизить окислительно-восстановительный потенциал композиции до уровня КЖ (препарата АРК-1) в ее состав было введено небольшое дополнительное количество цистеина. После этой модификации активность композиции оказалась не ниже, чем у прототипа. Это означало, что дальнейший поиск стимуляторов роста следует продолжать среди идентифицированных и включенных в состав композиции веществ.

В ходе последующей работы были выявлены другие стимуляторы роста - метионин, лизин и ацетат, а также ингибиторы роста - аланин, аспартат, гистидин, формиат и цистеин. Остальные соединения индивидуальной активности не проявляли. Подтвердилось, что сукцинат является основным компонентом стимулирующего комплекса, поскольку он обладал наивысшей активностью и (если не брать в расчет ацетат) присутствовал в среде в значительно больших концентрациях, чем другие стимуляторы. Вторым по значимости стимулятором являлась глутаминовая кислота. Ее активность в некоторых тестах уступала активности метионина и лизина, но концентрация в среде была приблизительно в 5 раз выше. Все эти результаты подтвердили правильность стратегии поиска и являлись гарантией того, что в конечном итоге были идентифицированы практически все значимые компоненты стимулирующего комплекса [Момот, 2002; Вахитов и др., 2003]. В связи с вопросом о механизмах межклеточных контактов следует, однако, отметить, что наличие низкомолекулярных эффекторов полностью не отрицает возможность взаимодействий клеток посредством физических полей или непосредственных контактов, которые могли выполнять определенные функции в регуляции синтеза и выделения эффекторов в окружающую среду.

Для изучения совместного действия метаболитов помимо их полной композиции (Комп-1) были составлены смеси, содержащие только стимуляторы роста (Еспм), ингибиторы роста (Хи„г), стимуляторы с нейтральными веществами и некоторые другие. Активность соответствующих композиций уменьшалась в следующем ряду: Комп-1> £стим+ нейтральные вещества> SCTHM> индивидуальные стимуляторы. Это подтвердило синергическое действие стимуляторов роста и выявило способность нейтральных веществ повышать их активность. Эти данные хорошо согласовались с выводами, сделанными на основе результатов фронтальной хроматографии (см. раздел 6.6.2).

Аналогичным образом 1инг подавляла рост сильнее, чем индивидуальные вещества. Наличие ацетата усугубляло действие других ингибиторов, но только в том случае, если его концентрация была высока. Низкие концентрации ацетата, напротив, уменьшали ингибирующее действие вплоть до его полного подавления или даже замены на слабое стимулирующее. Ацетат, таким образом, оказался способным модулировать активность среды: при низких концентрациях он усиливал действие стимуляторов и нивелировал влияние ингибиторов, а при высоких -проявлял собственную ингибирующую активность и усиливал эффект ингибирования других веществ.

Важная информация о регуляторном действии экзометаболитов была получена при изучении их динамики в ходе роста и голодания культур [Вахитов и др., 2005а]. В этих экспериментах подтвердилось, что выделение метаболитов в среду культивирования объясняется не патологическими отклонениями в регуляции процессов биосинтеза, а физиологической необходимостью поддержания их концентрации в среде на определенном уровне. Обмен метаболитами между клетками и средой начинался сразу после их суспендирования в свежей среде. При не слишком большом разбавлении культуры состав среды пополнялся за счет внутриклеточных стимуляторов роста. Если же разбавление было больше, то все имевшиеся в среде стимуляторы и некоторые другие метаболиты поглощались щетками, а продолжительность лаг-фазы значительно увеличивалась. Поскольку все соединения пополняли внутриклеточный пул бактерий, увеличение лаг-фазы являлось не результатом их недостатка, а следствием разрыва обеспечивавшихся ими коммуникативных связей.

Если после засева и перераспределения метаболитов концентрация стимуляторов роста (главным образом ацетата) в среде была недостаточна, то рост не начинался, пока она не достигала порогового значения. При слишком низкой посевной дозе концентрация стимуляторов не могла установиться на должном уровне даже в течение достаточно продолжительного времени. В этих условиях первоначальный рост обеспечивали те редкие клетки, рост которых по какой-то причине не ограничивался отсутствием стимуляторов (см. раздел 5.1). Возможно, что их размножение приводило в дальнейшем к инициации роста и других бактерий, однако концентрация стимуляторов роста в среде при этом оставалась заметно ниже, чем при засеве большего числа клеток. Все это позволяло предполагать существование двух альтернативных путей развития культуры: зависимого и независимого от стимуляторов роста.

Механизм перераспределения метаболитов между клетками и окружающей средой предполагает наличие у них способности оценивать степень разбавления среды по изменению концентрации ацетата и (или) других нм-метаболитов (см. раздел 7.5.1). Слишком быстрое уменьшение концентрации этих соединений свидетельствует о высокой степени разбавления и грозит потерей всего внеклеточного пула. Чтобы избежать этого, нм-метаболиты транспортируются внутрь клеток и сохраняются там до наступления лучших условий. Транспорт метаболитов сопровождался повышением физиологической активности бактерий, о чем свидетельствовали периодические изменения их светорассеивающих свойств (п). Приведенные в работе данные позволяют полагать, что процессы адаптации к новой среде являются важными для понимания механизмов коммуникативных связей и, безусловно, заслуживают более подробного изучения в дальнейшем.

При выращивании культуры общая стимулирующая активность среды изменялась в соответствии с изменениями концентрации экзометаболитов-стимуляторов. Ее увеличение наблюдалось при возрастании концентрации ацетата в начале роста и на завершающей стадии, одновременно с возрастанием концентраций ацетата и сукцината. Как уже отмечалось, оба возрастания предшествовали синхронным делениям культуры.

Данные по динамике стимуляторов роста позволили предположить, что их выделение и поглощение тесно связаны со стадией клеточного цикла: выделяют метаболиты крупные, готовящиеся к делению клетки, а поглощают молодые, только что разделившиеся. Механизм синхронизации деления может быть связан с уменьшением концентрации ацетата вследствие его поглощения небольшим количеством уже разделившихся клеток и регуляторным действием белков, реагирующих на это понижение. Одним из этих белков может быть АгоК, упоминавшийся в разделе 1.4.1. Этот белок, шикиматкиназа I, кроме основной, имеет дополнительную активность: при падении концентрации ацетата он оказывает позитивное влияние на скорость деления клеток. Через посредство этого белка, таким образом, локальное падение концентрации ацетата вокруг разделившихся бактерий может индуцировать деление остальных членов популяции. На фазе замедления роста дополнительный вклад очевидно вносит стимулирующее действие сукцината.

В последнее время в литературе появились предположения, что ацетат, лактат или/и некоторые другие аналогичные соединения могут служить в качестве регуляторов при переключении бактерий с аэробного на анаэробный метаболизм (см. раздел 1.2). Наши эксперименты, однако, показали, что сама по себе высокая концентрация этих веществ не обеспечивает переключения метаболизма. Синтез продуктов брожения в присутствии ацетата начинался только тогда, когда концентрация клеток достигала определенного предела. Весьма показательно, что выделялись при этом и вещества, традиционно не относящиеся к продуктам брожения, например аланин и валин. Динамика процесса позволяет полагать, что клетки реагируют на локальную концентрацию регуляторных метаболитов (ацетата или другого продукта) вокруг отдельных, инициирующих цепную реакцию, бактерий (см. раздел 7.5.3). Если концентрация клеток достаточно высока, эта реакция развивается и далее, в противном случае передающая сигнал цепочка быстро обрывается и массового выделения метаболитов не происходит. В целом, функционирование этой системы можно уподобить передаче импульса в сети нейронов. При выращивании смешанных культур цепная реакция может индуцироваться одним видом микроорганизмов, а пролонгироваться другим (см. раздел 5.6.1).

Влияние метаболитов на рост культуры может быть тесно связано с другими функциями этих соединений. Так, например, стимулирующая рост E.coli М-17 глутаминовая кислота совместно с белками GadA и GadB повышает устойчивость бактерий к кислотному стрессу [Lin et al., 1995]. По этой причине, ее выделение перед наступлением стационарной фазы можно расценивать не только как подготовку к последующему росту, но и как защиту от возможного закисления среды. Аналогичный механизм можно предположить и в случае лизина и белка CadA (см. разделы 1.4.1 и 1.4.2).

В разделе 1.2 приводятся данные, согласно которым при росте на глюкозе количество выделяемого ацетата снижается до нуля при понижении ц до 0,72. Не ясно, однако, что произойдет с накопленным в среде ацетатом, если скорость роста упадет ниже этого критического значения. Результаты наших экспериментов позволяют полагать, что в этом случае ацетат будет потребляться культурой одновременно с глюкозой. Это предотвратит дальнейшее падение скорости роста и приведет к более плавному ее изменению или поддержанию на одном и том же уровне. Переключение культуры с одного источника питания на другой может происходить с некоторым опозданием, в результате чего потребление ацетата начнется не сразу после падения р до 0,72, а несколько позже, то есть при более низких значениях р [Wolfe, 2005].

Использование ацетата в качестве питательного субстрата приводит к снижению его концентрации, уменьшению ингибирующего действия и, следовательно, к увеличению скорости роста культуры. В силу определенной инерционности обратное переключение на потребление глюкозы также может происходить с некоторым опозданием. В результате возникают колебания скорости роста культуры. При наличии питательного субстрата этот процесс может повторяться неоднократно и сопровождаться последовательным увеличением амплитуд колебаний р и концентрации ацетата в среде. Вполне возможно, что подобный механизм лежит в основе самосинхронизации культуры.

Ингибирующее. действие ацетата прежде всего должно быть направлено на те клетки, которые выделяют его больше других. Это могут быть наиболее крупные бактерии (см. раздел 7.5.3), поскольку они хуже снабжаются кислородом. Ингибируя рост наиболее крупных клеток, высокие концентрации ацетата должны способствовать уменьшению среднего размера бактерий. Подобная закономерность была обнаружена еще в начале прошлого века (см. раздел 1.1.5) и нашла подтверждение в наших собственных экспериментах.

Молекулярно-биологические исследования последних лет показали, что в процессе роста на среде с глюкозой активируются гены утилизации ацетата (асек, асеВ, gltk, icd и mdh) и ген сопряжения метаболизма глюкозы и ацетата (uspk) (см. раздел 1.3.2). Это означает, что избыточный синтез ацетата и его потребление одновременно с глюкозой являются генетически обусловленными и, следовательно, исключительно важными аспектами роста культуры.

Механизм переключения с глюкозы на ацетат на заключительной стадии роста культуры включает индукцию ферментов ЦТК, глиоксилатного цикла, белков RpoS-регулона, универсального стрессового белка UspA. Одновременно увеличивается транскрипция генов транспорта других источников углерода: галактозы (mg/BAC), рибозы (rbsD, rbsACB), N-ацетил-О-глюкозамина (nagЕ), аргинина (argT), С4-дикарбоновых кислот (idctk) и некоторых других. Понижают уровень экспрессии гены гликолиза (pfkA, fba, gapA, epd, pgk, eno, pykF, ppc), транспорта глюкозы (ptsG), фосфотрансферазного пути (оперон ptsYQ-crr), пентозофосфатного пути (zwf и gnd) и гены пируватдегидрогеназы (оперон асеEF) (см. раздел 1.3.3). Это означает, что причиной лаг-периода, наблюдаемого при пересеве таких клеток на среду с глюкозой, может быть пониженный уровень ответственных за ее утилизацию белков. В отличие от глюкозы, потребление ацетата не требует синтеза новых белков, чем, возможно, и объясняется его стимулирующее действие. Аналогичным образом можно объяснить стимулирующее действие янтарной и молочной кислот.

Начальным этапом метаболизма ацетата является его активация в ацетил-КоА. Для это существует 2 метаболических пути - Pta-AckA и Acs. Ферментами первого из них являются ацетаткиназа и фосфотрансацетилаза (Pta-AckA путь), а второго - ацетил-КоА-синтетаза (Acs). Предполагается, что Acs выполняет функции основного фермента поглощения и активации ацетата, а ферменты Pta-AckA метаболического пути при росте на глюкозе используются для удаления сверхпроизведенного ацетата. Внеклеточный ацетат индуцирует второй путь метаболизма, а вместе с тем - и дополнительный синтез необходимых для собсвенной утилизации ферментов глиоксилатного цикла.

Возможно, что удаление ацетата из клеток с использованием Pta-AckA пути и последующее его потребление с образованием ацетил-КоА является наиболее предпочтительным способом вовлечения ацетата в метаболические процессы, и потому именно этот путь используется на начальной стадии развития культуры. Выброс ацетата выгоден культуре и с чисто энергетических позиций, поскольку приводит к генерации мембранного потенциала. Вероятно, непосредственно перед делением бактерии обладают избыточным запасом ацетата, но испытывают недостаток кислорода и, следовательно, имеют пониженный мембранный потенциал. Для его увеличения клетки выделяют ацетат, а сразу после деления вновь потребляют его, поскольку молодые и быстрорастущие микроорганизмы нуждаются в избыточном количестве двухуглеродных фрагментов. Кроме того, образующийся из ацетата ацетилфосфат используется в качестве источника энергии для транспорта некоторых аминокислот и при фосфорилировании белков, а аце-тил-КоА может обеспечивать энергией транспорт органических кислот. Таким образом, обмен ацетатом между клетками, находящимися на разных стадиях клеточного цикла, возможно, является одной из причин ускорения роста популяции как единого целого.

В литературе выделение ацетата быстрорастущими культурами связывают с недостаточной активностью фосфоенолпируваткарбоксилазы, синтезирующей оксалоацетат из фосфоенолпирувата и СО2 и таким образом способствующей увеличению пропускной способности цикла Кребса. При увеличении концентрации этого фермента в специально сконструированном штамме количество выделяемого ацетата уменьшилось, однако при этом снизилась скорость роста и сократилось потребление глюкозы (см. раздел 1.2.1). Эта безуспешная попытка оптимизировать метаболизм путем минимизации пула «избыточного» ацетата, на наш взгляд, является дополнительным свидетельством важности его коммуникативных функций. Выделяющая ацетат популяция способна расти быстрее и, следовательно, обладает большей конкурентной способностью в процессе эволюции.

Высокая концентрация ацетата является показателем высокой плотности культуры. До недавнего времени считалось, что его ингибирующее действие, как и действие других короткоцепочечных жирных кислот

КЖК), связано с уменьшением мембранного потенциала и закислением цитоплазмы. Исследования последних лет, однако, показали, что высокие концентрации ацетата в среде, даже в тех случаях, когда он не потребляется культурой, индуцируют синтез белков стационарной фазы и репрессируют синтез белков конструктивного метаболизма (см. раздел 1.4.2). Большое число увеличивавших экспрессию генов относится к генам устойчивости к различным стрессовым воздействиям, в том числе и к генам rpoS-peiynoHa. Под действием ацетата индуцировался синтез белка LuxS (см. раздел 1.4.1, 1.4.2), что свидетельствует о влиянии метаболитов на функции систем классического «чувства кворума» (см. раздел 1.5). Поскольку собственный регулятор классического «чувства кворума» у E.coli отсутствует, можно допустить, что в этом случае рецепцию плотности популяции осуществляет некая гибридная система, роль внеклеточного регулятора в которой выполняют «обычные» продукты обмена, а внутриклеточные функции - те же белки, что и у других бактерий. Высокие концентрации ацетата и пониженные значения рН подавляют синтез шига токсина патогенными штаммами E.coli 0157:Н7 in vivo и in vitro, то есть ацетат выполняет те же функции, что и классические регуляторы чувства кворума [Asahara et al., 2004]. Определенные пробиотические штаммы увеличивают концентрацию ацетата в кишечнике, что позволяет сохранить жизнь лабораторным животным.

Известно также, что ацетат и некоторые другие КЖК способны индуцировать гены вирулентности независимо от классического «чувства кворума» и белков фо£-регулона [El-Gedaily et al., 1997]. Это позволяет предполагать, что продукты обмена способны выполнять регуляторные функции и у бактерий с полноценной сенсорной системой. Кроме того, ацетильный остаток участвует в биосинтезе ацильной части автоиндуктора АИ-1, что открывает дополнительную возможность регуляции синтеза автоиндуктора внеклеточным ацетатом. В случае монокультуры наличие ацетата является показателем ее плотности, во всех остальных случаях - свидетельствует об общей плотности производящих ацетат микроорганизмов. В этом контексте ацетат можно рассматривать как средство их межвидовой коммуникации.

В литературе имеются сведения о взаимном влиянии метаболитов. Так, например, с нашими собственными результатами хорошо согласуется факт уменьшения ингибирующего действия высоких концентраций ацетата при добавлении метионина [Roe et al., 2002]. Механизм синергического действия метаболитов, как уже отмечалось (см. раздел 7.5.3), может быть объяснен тем, что при наличии в среде двух и более соединений экспресси-руются преимущественно те белки, которые не подвержены разнонаправленной регуляции со стороны этих соединений. Кроме того, характер действия двух и более метаболитов в значительной степени будет зависеть не только от их абсолютных концентраций, но и от их соотношения в среде. Благодаря широким возможностям комбинирования различных веществ и их соотношений, система метаболической регуляции способна обеспечивать регуляцию значительно большего количества процессов, чем любая специиализированная система (см. раздел 1.5). Другим ее преимуществом является способность к плавной регуляции метаболизма, что позволяет достигать лучшего соответствия метаболических процессов физиологически важным характеристикам внешней среды. И, наконец, третий, весьма важный аспект заключается в том, что, выделяя метаболиты, клетки не только реагируют на изменения условий, но и сами формируют состав среды.

К сожалению, работы в области молекулярных аспектов действия метаболитов до сих пор никак не связаны с изучением регуляторных механизмов развития популяций бактерий. Первое направление движется по пути исследования физиологии роста, стрессовых и технологических воздействий (культивирование микроорганизмов до высоких плотностей и на различных субстратах, прохождение бактерий через желудочно-кишечный тракт, окислительный и кислотный стрессы и.т.д.), а второе - по пути изучения регуляторных функций ограниченного числа специализированных молекул. Концепция метаболической регуляции позволяет связать эти два направления воедино и поставить задачи, решение которых имело бы принципиальное значение для обоих направлений. К числу таких задач относится регуляция экспрессии генов на разных стадиях роста и голодания при наличии или отсутствии (удалении) всех выделяемых культурой метаболитов, одного из них или группы метаболитов. Значительный интерес представляет сопоставление экспрессии генов при различной степени разбавления засеваемой культуры (см. раздел 7.5.1), то есть в тех случаях, когда развитие контролируется стимуляторами роста или происходит без их участия, и ряд других вопросов.

Возвращаясь к функциям ацетата, следует отметить его важную регу-ляторную роль и при голодании культур: он способствует генерации колебаний численности и уменьшению выживаемости бактерий, что можно объяснить репрессией вовлеченных в голодание генов: cstA, 64353-64354, csiE, hcaR (см. раздел 1.4.2, [Polen et al., 2003]). Поглощение и выделение ацетата голодающими культурами (см. раздел 7.9.3) подтверждает наше предположение о том, что его стимулирующая активность может быть связана с дефицитом двухуглеродных фрагментов у только что разделившихся бактерий. Поскольку уменьшение концентрации стимуляторов роста обычно сопровождается увеличением концентрации УГ-факторов (см. раздел 4.6), можно ожидать, что падение концентрации ацетата будет приводить к возрастанию концентрации глицина. Проверка этого факта послужила бы подтверждением предварительного вывода об идентичности глицина и одного из УГ-факторов (см. раздел 7.9.2). Использование меченого ацетата позволило бы выяснить пути биосинтеза глицина и пролить свет на механизмы регуляторного действия того и другого соединения. Представляет интерес вопрос об изотопной идентичности потребленного и выделенного ацетата, причем не только на стадии голодания, но и в процессах роста и адаптации клеток при пересеве в свежую среду.

В среде голодающих культур аналогичным ацетату индикатором численности может служить сукцинат. На спектрах ЯМР он выявлялся при плотности культур выше 25D460, а при более высоких концентрациях клеток становился доминирующим продуктом, что свидетельствовало о соответствующем переключении метаболизма бактерий. Образование сукцината могло происходить в глиоксилатном цикле, либо в процессе фумаратного дыхания. При низких плотностях популяции произведенный сукцинат очевидно сразу утилизировался бактериями или синтезировался в меньших количествах и поэтому практически не выделялся. Возможно по этой причине бактерии жили дольше и даже могли размножаться (см. раздел 4.1). В культурах высокой и, особенно, сверхвысокой плотности пути утилизации сукцината вероятно были блокированы, он выделялся в окружающую среду, а сами бактерии погибали значительно быстрее. Выделение сукцината может быть выгодным с экологических позиций. Поскольку он является селективным стимулятором роста (см. раздел 7.10), при благоприятных условиях его наличие в среде гарантирует боле быстрый рост численности E.coli М-17 по сравнению с другими микроорганизмами.

Характер зависимости концентрации сукцината от плотности голодающей культуры позволил предположить, что он является одним из УГ-факторов. Его добавление в среду голодания действительно приводило к некоторому ускорению гибели бактерий, однако это ускорение было не больше, чем от многих других метаболитов. Следовательно, наличие сукцината является не причиной гибели бактерий, а следствием изменения их метаболизма под действием УГ-факторов. Дальнейшие поиски УГ-факторов осложняются высокой трудоемкостью соответствующих работ. Кроме того, в процессе голодания происходит естественная сукцессия метаболитов, каждый из которых выделяется на определенной стадии голодания и действует на культуру в соответствии с ее физиологическим состоянием.

Как уже отмечалось, наиболее достоверной в настоящее время представляется гипотеза о том, что одним из УГ-факторов является глицин. Для ее подтверждения необходимо изучить действия сверхнизких концентраций глицина на культуры низкой плотности (см. раздел 4.5), его динамику в процессах голодания и роста культуры и сопоставить ее с изменением соответствующей активности КЖ. Возможно, что вторым УГ-фактором является формиат, не имеющий выраженной индивидуальной активности, но проявлявший ее при совместном действии с другими веществами. Формиат относительно летуч, а это значит, что уменьшение УГ-активности препаратов при лиофильном высушивании можно связать с его частичной потерей. Весьма вероятно также, что полная УГ-активность, как и в случае со стимуляторами роста, является следствием синергического действия нескольких метаболитов, причем одни из них могут ускорять гибель на начальном этапе голодания, а другие - на более поздних стадиях (см. раздел 7.9). Дальнейшее изучение УГ-факторов представляется весьма перспективным и в свете концепции метаболической регуляции бактерий, и с общебиологических позиций, как явления, способного прояснить механизмы апоптоза.

При выращивании смешанных культур обнаружилось, что скорость роста E.coli М-17 возрастает в присутствии штамма конкурента и еще больше увеличивается при добавлении АРК. Возможно, что под действием метаболитов E.coli М-17 бактерии конкурирующего штамма начинали сами выделять вещества, стимулирующие рост E.coli М-17. Иными словами, штамм-конкурент являлся своего рода усилителем метаболического сигнала, подаваемого самими клетками E.coli М-17 или путем внесения ее метаболитов извне. Аналогичные эффекты наблюдались и при совместном голодании бактерий. Объяснить их можно на основе представления об автокаталитическом характере выделения метаболитов (см. раздел 7.5.3). Дальнейшее изучение подобных явлений представляется весьма важным для понимания природы симбиоза и антагонизма.

Высокие индексы стимуляции, полученные при изучении действия АРК на рост нормальных симбионтов человека L. acidophilus (Д-75 и Д-76) и В. adolescentis, свидетельствуют что именно метаболиты E.coli М-17 играют решающую роль в повышении приживляемости этих бактерий при их совместном применении с колибактерином [Алешкин и др. 2005]. Аналогичные данные по успешному применению самого колибактерина [Перетц, 1955; Лаврушко, 1968 Вилынанская, 1970] позволяют полагать, что состав экзометаболитов E.coli М-17 близок к нормальному составу низкомолекулярных метаболитов кишечника человека. Это, конечно, не означает, что именно этот или аналогичные штаммы E.coli вносят решающий вклад в формирование метаболитного пула микробиоценоза. В норме численность бактерий этих штаммов в кишечнике взрослого человека относительно невелика. Однако в процессе становления микробиоценоза метаболически активный штамм E.coli, обладающий большей устойчивостью, чем многие другие бактерии, способен обеспечить базальный уровень метаболитов, стимулирующих рост остальных представителей нормофлоры и подавляющих рост патогенных бактерий. После того, как микробиоценоз сформировался, становится возможным внедрение только тех штаммов, рост которых не подавляется совокупным действием метаболитов микрофлоры. В наших экспериментах было показано, что рост L. bulgaricus, в отличие от роста L. acidophilus Д-75 и Д-76, не стимулируется метаболитами E.coli М-17, чем может объясняться известная из литературы неспособность L. bulgaricus к длительной колонизации кишечника. С практической точки зрения это означает, что все микроорганизмы, терапевтическое действие которых предполагает внедрение в состав микробиоценоза, должны подвергаться исследованию на совместимость с его метаболическим пулом. Показателем такой совместимости может являться тест на стимуляцию роста метаболитами E.coli М-17.

Результаты, полученные при изучение действия индивидуальных метаболитов (см. раздел 7.10), являются прямым доказательством (в отличие от косвенных свидетельств, приводившихся в разделе 5.5) высокой специфичности метаболической регуляции. В этих опытах было показано, что наиболее активный стимулятор роста E.coli М-17 - янтарная кислота, очень слабо стимулирует рост Е. coli BL21 и подавляет рост S. enteritidis, а аспарагиновая кислота ингибирует рост E.coli М-17 и, в то же время, стимулирует рост других штаммов E.coli [Budrene & Berg, 1995].

Эксперименты на плотных питательных средах, помимо получения дополнительной информации о характере действия экзометаболитов, преследовали еще и цель изучения популяционных механизмов авторегуляции. В качестве альтернативных нами рассматривались два возможных варианта авторегуляции. Первый из них предполагал, что все клетки выделяют одни и теже стимуляторы, которые в одинаковой степени действуют на все клетки популяции. Второй вариант заключался в том, что выделяет те или иные метаболиты только часть популяции, а другая часть воспринимает их как сигнал для активации роста или использует в качестве дополнительного стимулирующего рост субстрата. Вторая схема, однако, имеет смысл только в том случае, когда первая часть популяции значительно меньше второй. В первом варианте осуществляется так называемая диффузная регуляция, в которой регулятор и объект регуляции практически идентичны. Второй, классический вариант, предполагает, что в составе саморегулируемой системы можно выделить две подсистемы: регулятор (он же сенсор) и объект регуляции (основная часть популяции).

В случае бактериальной популяции ни тот ни другой вариант не является вполне удовлетворительным, поскольку первый из них предполагает практически полную идентичность микроорганизмов, что противоречит основным биологическим представлениям и известным сведениям о гетерогенности микробных популяций, а второй подразумевает существование некоего «мозгового центра» популяции, полностью контролирующего все этапы ее развития.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Вахитов, Тимур Яшэрович, Санкт-Петербург

1. Абросов Н.С., Ковров Б.Г., Черепанов О. А. Экологические механизмы сосуществования в видовой регуляции Новосибирск: Наука, 1982.-301 с.

2. Акопян М., Поладян А., Баграмян К. Преобразование энергии, сопряженное с окислением формиата в условиях анаэробного брожения // Биофизика 2006 - Т.51.-Вып.З - С.466-471.

3. Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Поспелова В.В. и др. Становление пробиотикотерапии в России // Вестник РАМН 2005 - №12.- С.3-13.

4. Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин и др. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры // Росс. хим. ж.- 1994 Т.38.-№6- С.66-78.

5. Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В. и др. Новые подходы к разработке лекарственных средств // Росс. хим. ж- 1996- Т.40-№2-С. 125-130.

6. Баблоянц А. Молекулы, динамика и жизнь М.: Мир, 1990 - 373 с.

7. Бабусенко Е.С. Ауторегуляция роста и развития метанокисляющих бактерий: Автореф. дисс.канд. биол. наук.-М., 1992.-25 с.

8. Барбье М. Введение в химическую экологию М.: Мир, 1978 - 229 с.

9. Барихин С.Я., Ткаченко А.Г., Пшеничнов Р.А.и др. Стимулирующая добавка к синтетической питательной среде для культивирования микроорганизмов: А.с. СССР №49691, 1974 / Опубл. 1975. Бюл. №42.

10. Безбородов А. М. Биохимические основы микробиологического синтеза М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984 - 394 с.

11. Белоусов Б.П. Периодически действующая реакция и ее механизм // Сб. рефер. по радиационной мед.- М.: Медгиз, 1959.

12. Беляков В.Д., Голубев Д.Б., Каминский Г.Д., Тец В.В. Саморегуляция паразитарных систем Л.: Медицина, 1987 - 240 с.

13. Бери Д. Биология дрожжей М: Мир, 1985- 96 с.

14. Богданов Е.А., Несвижский Ю.В., Воробьев А.А. и др. Исследования пристеночной микрофлоры желудочно-кишечного тракта крыс при пероральном введении пробиотических препаратов // Вестник РАМН.- 2006.- №2.- С.6-10.

15. Богословская О.А., Бурлакова Е.Б., Глущенко Н.Н. и др. Взаимосвязь устойчивости микробных клеток с их фосфолипидным составом // Журн. микробиол.- 1987.-№1.-С.6-8.

16. Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г. Дисбактериозы- JL: Медицина, 1979.- 176 с.

17. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых М.: КМК, 2003 - 224 с.

18. Борен К., Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами. -М.: Мир, 1986 664 с.

19. Бузолева JI.C., Сидоренко M.JI. Влияние газообразных метаболитов почвенных бактерий на размножение Listeria monocytogenes и Yersinia pseudotuberculosis // Журн. микробиол 2005- №2 - С.7-11.

20. Бурштейн Э.А. Собственная флуоресценция белков (природа и применение). Итоги науки и техники. Биофизика- М.: ВИНИТИ, 1977.-Т.7.-243 с.

21. Бухарин О.В., Гинцбург A.JL, Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина, 2005 - 367 с.

22. Вахитов Т.Я. Ауторегуляция выживаемости в процессе голодания культур Escherichia coli М-17: Дисс.канд.биол.наук: 03.00.07 / СПбГУ.-С-Пб., 1993.-231 с.

23. Вахитов Т.Я. Колебания численности бактерий в процессе голодания // Биофизика- 1999 Т.44.- Вып.З- С.503-504.

24. Вахитов Т.Я, Алексин JI.M., Ососкова Л.И. Роль внутрипопуляционных факторов на стадии отмирания Escherichia coli

25. IV Всес. конф. "Управляемое культивирование микроорганизмов". Пущино, 1986.-С.55-56.

26. Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., Петров JI.H. и др. Сравнительное изучение действия препаратов аутостимуляторов роста Escherichia coli М-17 и фруктоолигосахаридов на рост и антагонистичекую активность лактобацилл // Журн. микробиол. 2001- №3.- С. 80-83.

27. Вахитов Т.Я., Куликов С.В., Яшина О.Ю. и др. Принцип Олли в популяциях микроорганизмов // Отечественный производственный опыт. Микробиологическая промышленность- М: ВНИИ СЭНТИ, 1988 Вып.4 - С. 9-12.

28. Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Петров JI.H. Стимулятор роста клеток бактерий Escherichia coli: Патент России № 2233875, 2004 / Опубл. 10.08.2004.-Бюл.№ 22.

29. Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Толпаров Ю.Н. Динамика и функции экзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichia coli М-17 // Журн. микробиол 2005а - № 1- С. 16-21.

30. Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Шалаева О.Н., Петров J1.H. Экзометаболиты пробиотиков как фактор восстановления микробиоценоза человека // Цитокины. Воспаление. Иммунитет: Материалы междунар. на-учно-практич. школы-конф СПб, 2002. - С.24.

31. Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Шалаева О.Н., Петров J1.H. Состав и биологическая активность экзометаболитов Escherichia coli М-17 // Журн. микробиол 2003-№6-С.20-25.

32. Вахитов Т.Я., Огородников О.Н., Алексин JI.M. Спектрофотометрический анализ развития бактериальных популяций // Биофизика микробных популяций: Тез.докл.Всесоюз.науч.конф-Красноярск, 1987.-С.101.

33. Вахитов Т.Я., Ососкова Л.И., Яшина О.Ю., Морозова Э.Н., Куликов С.В. Ауторегуляторы развития бактериальных популяций //

34. Актуальные проблемы биотехнологии: Материалы 1 Отраслевой конф. молодых ученых- Кольцово, 1988-М.: 1989.-С.27-28.

35. Вахитов Т.Я., Петров JI.H. Выживаемость клеток Escherichia coli при хранении в суспензиях различной концентрации // Микробиология-1992.-Т.61Вып.6- С. 1087-1095.

36. Вахитов Т.Я., Петров JI.H. Разработка новых пребиотиков на основе аутостимуляторов роста нормальной микрофлоры человека // Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы».- 2001 Т.5.- № 1-С.95.

37. Вахитов Т.Я., Петров JI.H. Перспективы создания антипатогенных лекарственных средств // Folia ORL et PR 2004 - Т. 10.- №3-4.-С.48-59.

38. Вахитов Т.Я., Петров JI.H. Регуляторные функции экзометаболитов бактерий // Микробиология,- 2006 Т.75.- №4 - С.483-488.

39. Вахитов Т.Я., Петров JI.H., Бондаренко В.М. Концепция пробиотиче-ского препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты // Журн. микробиол.- 20056.- № 5 С. 108-114.

40. Вахитов Т.Я., Петров JI.H., Борц М.С., Николаева Е.Г. Биоактивная добавка для косметических средств. Патент России № 2180576, 2002.

41. Вахитов Т.Я., Петров JI.H., Яшина О.Ю. Стимулятор роста бактериальной кулыуры: Патент России № 2090612, 1997 / Опубл. 20.09.97-Бюл. № 26 7с.

42. Вахитов Т.Я., Протасов Е.А, Виснольд Н.В, Толпаров Ю.Н., Петров JI.H. Выделение и идентификация аутостимуляторов роста Escherichia coli. II Журн. микробиол.- 2003- №2 С.7-12.

43. Вахитов Т.Я., Шалаева О.Н. Флуориметрическое определение содержания различных видов ДНК в клетках бацилл // Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение: Тез.докл.Всесоюз.науч.конф- Рига, 1985 С.52-53.

44. Вахитов Т.Я., Шалаева О.Н. Андреев О.А. Определение копийности плазмид в клетках // V Всес. конф. по спектроскопии биополимеров: Тез.докл- Харьков, 1984.-С.36-37.

45. Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю. Динамика хромосомной и внеклеточной ДНК в хранящихся культурах Escherichia coli // Актуальные проблемы биотехнологии: Материалы Второй отраслевой конф.-конкурса молодых ученых.- Кольцово, 1990а С. 18-20.

46. Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю. Способ получения аутоактиватора роста для культивирования Escherichia coli: А.с. СССР №1638156, 1990в / Опубл. 30.03.91.-Бюл. №12.- С.74.

47. Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю., Куликов С.В. Ауторегуляция численности в популяциях Escherichia coli // Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов: Тез.докл.Всесоюз.науч.конф.- Пущино, 1989.- С.14.

48. Вербицкая Н.Б. Изучение ответных реакций бактериальных клеток на слабое тепловое воздействие: Дисс.канд.биол.наук: 03.00.07 / ЛГУ-Ленинград, 1989.

49. Вилыпанская Ф.Л. Характеристика микрофлоры при дисбактериозе кишечника; патогенетическое значение дисбактериоза при кишечных расстройствах и эффективность применения с лечебной цельюколибактерина: Автореф. дис.докт. мед. наук.-М., 1970.-31 с.

50. Герхардт Ф. и др. Методы общей бактериологии М.: Мир, 1983-Т.1.-536 с.

51. Гершаиович В.Н. Биохимия и генетика транспорта ионов у бактерий-М.: Медицина, 1980,- 176 с.

52. Говорунов И.Г., Косарев Н.В., Евтодиенко Ю.В., Пучков Е.О. Исследование проницаемости мембран оболочки Escherichia coli для бромистого этидия // Микробиология 1982 - Т.51- Вып.5 - С.731-734.

53. Говорунов И.Г., Пучков Е.О. Исследование нефелометрических параметров плазмолитической реакции бактерий Escherichia coli К-12 // Прикл. биохимия и микробиология 1987 - Вып.2 - С.260-265.

54. Головлев E.JI. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы //Микробиология 1999 -Т.68-№5.-С.623-631.

55. Громов Б.В. Строение бактерий Д.: ЛГУ, 1985 - 192 с.

56. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий Л.: ЛГУ, 1989 - 248 с.

57. Дарвин Ч. Происхождение видов путем естественного отбора- М.: Просвещение, 1987 383 с.

58. Дебабов В.Г. Метаболическая инженерия микробной клетки // Микробиология.- 1999 Т.68 - Вып.6 - С.823-833.

59. Дмитриев М.Т., Малышева А.Г., Растянников Е.Г. Специфические органические соединения в продуктах жизнедеятельности //

60. Космическая биология и авиакосмическая медицина- 1987 Т.21-№4 - С.50-56.

61. Дмитриев М.Т., Растянников Е.Г., Волков С.А. и др. Прецизионное исследование микропримесей, выделяемых организмом человека // Вопросы медицинской химии 1982 - Т.25.- Вып.6- С.122-125.

62. Дьяконов В.П. Справочник по расчетам на микрокалькуляторах М.: Наука, 1989 - 464 с.

63. Егоров С.Ю., Куприянова Ф.С., Хайбуллина С.А., Колпаков А.И. Влияние ДНКазы 1 на рост бактерий в зависимости от условий культивирования и физиологических особенностей инокулята // Биологические науки 1991.-№ 4-С.109-116.

64. Ждан-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов- JL: ЛГУ.-1983.-187 с.

65. Задаура Е.Ю. Эффект аутостимуляции роста в популяциях бактерий рода Lactobacillus на примере промышленного штамма L. delbrueckii subsp. bulgaricus АТСС 21815: Дипломная работа / СПбХФА С-Пб., 1997.-56 с.

66. Земсков М.В. Биодинамические негенетические эффекты нуклеиновых кислот // Журн. микробиол 1982 - № 2 - С. 19-23.

67. Зефиров А.Л. Медиаторы, эволюция представлений // Вестник РАМН.-2005.-№1 .-С.49-52.

68. Иванов А.Ю., Фомченков В.М. Зависимость повреждающего действия поверхностноактивных веществ на клетки E.coli от фазы роста культуры // Микробиология. 1989.- Т.58 - Вып.6 - С.969-975.

69. Иванов В.Н. Экзо- и эндотрофия клетки- Киев: Наукова думка, 1990.- 104 с.

70. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов М.: АН СССР, 1963.-244 с.

71. Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки,- М.: Наука, 1978.-207 с.

72. Катон, Варрон, Колумелла, Плиний о сельском хозяйстве- М.: Сельхозгиз, 1957.-352 с.

73. Кешелава В.Б., Ерошина Н.В. Метаболическое лимитирование эффективности роста Escherichia coli К802 в хемостате // Доклады АН СССР.- 1986.-Т- 288.-ЖЗ.- С.737-740.

74. Кировская Т.А. Исследования популяционной организации и межклеточной коммуникации у микроорганизмов в Советском Союзе (России) второй половины XX века: историко-научный анализ: Дисс. канд. биол. наук: 07.00.10 / ИИЕТ РАН.- М., 2005.- 188 с.

75. Кленин В.И., Щеголев С.Ю., Лаврушин В.И. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем- Саратов: Изд-во Саратовского университета, 1977 176 с.

76. Коган А.Б. Биологическая кибернетика М.: Высшая школа, 1977408 с.

77. Кондракова О.А., Бабин В.Н., Вылегжанина Е.С. и др. Избирательность действия низкомолекулярных метаболитов нормальной микрофлоры человека // Эпидемиология и инфекционные болезни 1998-№3.-С.30-35.

78. Конев С.В., Мажуль В.М. Межклеточные контакты.- Минск: Наука и техника, 1977.

79. Коновалова Е.Ю. Ауторегуляция роста и развития дрожжей Rhodospiridium toruboidis факторами d: Автореф. дисс.канд. биол. наук.-Л., 1985.- 18 с.

80. Коровина В.П., Сазонова Л.А., Вайсман И.Ш. Изучение механизма регуляции численности популяций в экспериментах на культурах бактерий // Экология.-1974 № 6 - С.5-9.

81. Коротяев А.И., Кроличенко Т.П. Хромосомы и продолжительность клеточного деления у бактерий // Факторы развития бактериальных популяций.- Свердловск: УНЦ АН СССР, 1980.- С.44-49.

82. Круглов Д.А. Биологические и хроматографические свойства аутостимуляторов роста Escherichia coli М-17: Дипломная работа / СПбГУ, 1994.-57 с.

83. Куваева И.Б. Обмен веществ организма и кишечная микрофлора М.: Медицина, 1976.-248 с.

84. Кузнецов О.Ю. Бактериальная колония как сложно организованное сообщество клеток // Журн. микробиол.- 2005 № 2.- С.3-7.

85. Лабораторный регламент на производство комплекса биологически активных соединений бактериального происхождения «Актофлор»: ЛР 00479741-013-99 / ГНЦ ГосНИИ Особо Чистых Биопрепаратов. -СПб, 1999.-50с.

86. Лабораторный регламент на производство препарата «Актофлор капсулы»: ЛР 00479741-013-01 / ГНЦ Гос.НИИ Особо Чистых Биопрепаратов.-СПб, 2001- 59с.

87. Лаврушко B.C. Молочный колибактерин и его применение при дизентерии у детей: Автореф. дис. .канд. мед. наук.-Ростов-на Дону: Ростовский Гос. мед. ин-т, 1968 20 с.

88. Лауринавичене Т.В., Цыганков А.А. Участие гидрогеназы 1 и гидро-геназы 2 в водородзависимом нитратном дыхании у Escherichia coli // Микробиология 2003 -1.12- Вып.6 - С.740-745.

89. Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Осипов Г.А., Г.И. Эль-Регистан. Низкомолекулярные ауторегуляторы развития бактерий Thioalkalivibrio versu-tus // Микробиология.- 2002 Т.71- Вып.З - С.308-316.

90. Лукас С. Экологическая роль метаболитов, выделяемых во внешнюю среду // Механизмы биологической конкуренции М.: Мир, 1964,- С. 242-262.

91. Макфедьен Э. Экология животных М.: Мир, 1965 - 375 с.

92. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Молекулярное клонированиеМ.: Мир, 1984.-480 с.

93. Маслов Ю.Ф., Кузнецова Н.Н., Коробов В.П. Формирование аминокислотного фона среды при развитии популяции Escherichia coli М-17 на полноценной и синтетической питательных средах // Факторы развития бактериальных популяций- Свердловск, 1980-С.28-33.

94. Мейсель М.Н. Функциональная морфология дрожжевых организмов-М.: Изд-во АН СССР, 1950.- 368 с.

95. Мельникова И.А. Биологические и физико-химические свойства экзометаболитов лактобацилл: Выпускная квалификационная работа инженера / СПбГТЩТУ).- С-Пб., 2000.- 79 с.

96. Момот Е.Н. Метаболическая регуляция в процессе роста и голодания культуры Escherichia coli М-17: Дисс.канд.биол.наук: 03.00.23 / С-ПбГТИ(ТУ).- С-Пб, 2002.- 167 с.

97. Момот Е.Н., Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Метаболическая регуляция в развитии культур бактерий пробиотиков // Цитокины. Воспаление. Иммунитет: Материалы междунар. научно-практич. школы-конф-СПб, 2002.-С.28.

98. ЮО.Назаренко В.Г., Сельков Е.Е. Механизм контактного угнетения как возможный источник сверхнизкочастотных биологических ритмов // Колебательные процессы в биологических и химических системах-Пущино, 1971.-Т.2.-С.145-149.

99. Николаев Ю.А. Дистантные информационные взаимодействия у бактерий // Микробиология. 2000.- Т.69 - Вып.5 - С.597-605.

100. Николис Г., Пригожин И. Познание сложного М.: Мир, 1990 - 344 с.

101. Новикова И.Ю. Возможные механизмы образования структур в популяциях бактерий, состоящих из подвижных клеток // Микробиология.- 1987-Т.56.-Вып. 6.-С.1001-1005.

102. Овсова JI.M., Мазрухо А.Б., Ломов Ю.М. и др. Влияние различных аминокислот и солей аммония в составе синтетической питательной среды на продукцию холерного энтеротоксина // Журн. микробиол.-2003.- №3.- С. 16-21.

103. Одинцова Е.Н. Микробиологические методы определения витаминов,- М.: Изд-во АН СССР, 1959.- 379 с.

104. Одум Ю. Экология М.: Мир, 1986 - Т.2.- 376 с.

105. Ю7.0лескин А.В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях // Микробиология 1993.- Т. 62 - Вып.З.- С.З89-405.

106. Ю8.0лескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология.- 2000.-Т.69-Вып.З -С.309-327.

107. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А. и др. О химической природе ауторе1уляторного фактора dj Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология 1985.-Т.54-Вып. 2.-С.186-190.

108. Остроумов С.А. Введение в биохимическую экологию М.: МГУ, 1986.-176с.

109. Паников Н.С., Шаховцова Н.В., Дорофеев А.Г. и др. Количественное исследование динамики отмирания голодающих микроорганизмов // Микробиология- 1988-Т.57.-Вып. 6.-С.983-991.

110. Пастер Л. Избранные труды. В 2т.- Т.1 М.: АН СССР, I960.- С. 140141.

111. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека- М.: Медгиз, 1955 436 с.

112. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток-М.: Мир, 1978.-332 с.

113. И 6. Петров Л.Н., Бондаренко В.М., Вахитов Т.Я., Воробьев A.A. QS-системы у бактерий и перспективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов // Вестник Российской АМН- 2006.-№1.-С.38-45.

114. Петухов В.Г. О возможности применения теории Ми к светорассеянию суспензий шаровидных бактерий // Биофизика-1965 Т.Ю.- Вып.6 - С.993-999.

115. И8.Печуркин Н.С. Популяционная микробиология.- Новосибирск: Наука, 1978.-277 с.

116. И9.Печуркин Н.С., Брильков А.В. Влияние факторов среды на устойчивость микробных культур в открытых системах // Рост микроорганизмов Пущино, 1984 - С. 104-118.

117. Печуркин Н.С., Брильков А.В., Марченкова Т.В. Популяционные аспекты биотехнологии-Новосибирск: Наука, 1990 173 с.

118. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника-М.: Медицина, 1984 144 с.

119. Плакунов В.К. Координация регуляторных механизмов в процессе развития прокариотных клеток // Онтогенез микроорганизмов.- М.: Наука, 1979.- С.158-174.

120. Плакунов В.К. Мембранные механизмы экскреции бактериями физиологически активных веществ //Прикл. биох. и микробиология-1986.- Т.22.- № 6.- С.723-735.

121. Плакунов В.К. Основы энзимологии. -М.; Логос, 2001. 128с.

122. Плакунов В.К., Волкова И.М., Лебедева Ж.Д. и др. Регуляция внутриклеточной концентрации низкомолекулярных веществ у бактерий //Изв. АН СССР, сер. биол 1985.-№ 5.- С.715-721.

123. Плохинский П.А. Биометрия-М.: МГУ, 1970 -368 с.

124. Позмогова И.Н. Синхронные культуры // Итоги науки и техники. Микробиология.- М.: ВИНИТИ, 1981. Т. 11.- С. 118-151.

125. Позняк А.Л., Петров Л.Н., Вахитов Т.Я. Влияние препарата Актофлор на микрофлору кишечника у больных хроническими мочеполовыми хламидиозами // Цитокины. Воспаление. Иммунитет.: Материалы междунар. научно-практич. школы-конф. СПб, 2002 С.ЗО.

126. Пригожин И., Стенгерс И. Порядок из хаоса: Новый диалог человека с природой М.: Прогресс, 1986 - 432 с.

127. Прозоров А.А. Поглощение ДНК бактериальной клеткой: естественный процесс и лабораторные приемы // Генетика.- 1998.- Т.34- №5.-С.581-592.

128. Прозоров А.А. Феромоны компетентности у бактерий // Микробиология.- 2001.- Т.70.-ВЫП.1- С.5-14.

129. Пронин С.В. Влияние культуральной жидкости на реактивацию рефрактильных покоящихся форм и прорастание спор Bacillus cereus // Микробиология 1988.- Т.57 - Вып.З - С.503-506.

130. Пронин С.В. Образование специфических покоящихся форм бактерий под влиянием ауторегуляторных факторов: Автореф. дисс. канд. биол. наук.-М., 1982 16 с.

131. Пучков Е.О. Методы определения содержания и жизнеспособностимикроорганизмов // Биотехнология 1988 - Т.4.- Вып.1.- С.132-142.

132. Пучков Е.О., Говорунов И.Г., Евтодиенко Ю.В. и др. Действие шока, вызванного низкой температурой, и внеклеточного образования льда на внешнюю и цитоплазматическую мембрану клеток Escherichia coli // Микробиология 1983.- Т. 52 - Вып. 1.- С. 13 6-139.

133. Пшеничнов Р.А., Колотов В.М., Барихин СЛ. и др. Микробная популяция саморегулируемая система // Экология и популяционная генетика микроорганизмов.- УНЦ АН СССР, 19756 - С.3-13.

134. Пшеничнов Р.А., Ткаченко А.Г., Зеленин Е.Н. Влияние внеклеточныхаутометаболитов на экономический коэффициент популяции Е. coli различной плотности // Экология 1981-№ 1 - С.93-95.

135. Работнова И.Л. Об изучении физиологического состояния исследуемых микроорганизмов // Микробиология.- 1980 Т.49- Вып.- С.634-638.

136. Райе Э. Аллелопатия.- М.:Мир, 1978 392 с.

137. Ракитин В.Ю., Чугасова В.А., Финогенов Б.П. и др. Регулирование состава ферментационной среды как метод управляемого культивирования микроорганизмов-М.: ВНИИСЭНТИ, 1986.-36 с.

138. Рамазанов К.Р., Хлебцов Н.Г., Щеголев С.Ю. и др. Характеристические функции светорассеяния полидисперсных систем // Коллоидный журнал 1983 - Т.45.- № 3 - С.473-479.

139. Рашевский Н. Модели и математические принципы в биологии // Теоретическая и математическая биология-М.: Мир, 1968.-С.48-66.

140. Розен В.Б. Основы эндокринологии М.: Высшая школа, 1984.- 336 с.

141. Роус С., Роус Ф. Выделение головастиками веществ, задерживающих рост // Механизмы биологической конкуренции М.: Мир, 1964-С.263-276.

142. Рубан Е.Л., Вербина Н.М., Бутенко С.А. и др. Биосинтез аминокислот микроорганизмами М.: Наука, 1968 - 293 с.

143. Рудченко О.Н., Лихачева Н.А., Тимакова Н.В., Ильяшенко Б.Н. Фактор компетентности в культуральной жидкости Escherichia coli // ДАН СССР.- 1973.- Т.211.- № 1.- С.224-225.

144. Рыбкин А.И., Равин В.К. Гибель бактерий и судьба ДНК Escherichia coli при аминокислотном голодании //Микробиология 1986.-Т.55-Вып. 6 - С.949-952.

145. Рыбкин А.И., Равин В.К. Снижение синтетической активности как возможная причина гибели бактерий Escherichia coli во времяаминокислотного голодания // Микробиология- 1987- Т.56-Вып.2.-С.227-231.

146. Самсонов Г.В. Сорбция и хроматография белков M.-JL: АН СССР-1960.-175с.

147. Светличный В.А. Ауторегуляторы роста и развития водородной бактерии Pseudomonas carboxydoflava: Автореф. дисс.канд. биол. наук -М., 1982-19 с.

148. Светличный В.А., Романов А.К., Эль-Регистан Г.И. Изучение количественного содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология 1986.- Т.55 - Вып.1- С.55-59.

149. Северцов А.С. О причинах эволюционной стабильности популяций видов в природе // Журн.общ.биол 1986.- Т.47 - №6 - С.723-734.

150. Сельков Е.Е., Назаренко В.Г. Математическая модель угнетения роста популяции при повышении ее плотности // Регуляция в биологических системах Пущино, 1970 - С. 107.

151. Смирнова Г.В. Периодические культуры Escherichia coli с дробным добавлением субстрата при различных условиях культивирования: Автореф. дисс. канд. биол. наук.-Л- 1989 16 с.

152. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Октябрьский О.Н. Статус глутатиона и экспрессия антиоксидантных генов у Escherichia coli при действии цистина и перекиси водорода //Биохимия- 2005- Т.70- №4-С.1119-1129.

153. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Влияние активности первичных протонных помп на рост E.coli в присутствии ацетата // Микробиология- 1988.- Т.57 Вып.4 - С.554-559.

154. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Периодические культуры E.coli в аэробных и анаэробных условиях // Микробиология- 1985 Т.54-Вып.2.- С.252-256.

155. Страховская М.Г., Иванова Е.В., Фрайкин Г.Я. Стимулирующее влияние серотонина на рост дрожжей Candida guillermondii и бактерий Streptococcus faecalis // Микробиология 1993- Т.62 - Вып.1- С.46-49.

156. Сукачев В.Н. О внутривидовых и межвидовых взаимоотношениях среди растений // Избранные труды- Л.: Наука, 1975 Т.З.- С.389-424.

157. Тарков М.И. Микробиологические методы оценки искусственных питательных сред-Кишинев: Штиинца, 1972. 166с.

158. Тец В.В., Заславская Н.В. Эффективность действия антибиотиков на бактерии в биопленках//Журн. микробиол.-2005-№5-С.24-26.

159. Тец В.В., Каминский Г.Д. Фазовые изменения в периодических бактериальных культурах // Журн. микробиол.- 1984 № 8 - С.24-31.

160. Тирранен Л.С. Роль летучих метаболитов в межмикробном взаимодействии-Новосибирск: Наука, 1984 104 с.

161. Ткаченко А.Г. О соотношении селективного и аутометаболического типов регуляции численности и структуры бактериальных популяций // Факторы развития бактериальных популяций Свердловск: УНЦ АН СССР, 1980 - С.75-84.

162. Ткаченко А.Г., Октябрьский О.Н. Экономический коэффициент утилизации субстрата (глюкозы) в бактериальных популяциях разной плотности // Факторы развития бактериальных популяций-Свердловск: УНЦ АН СССР, 1980 С. 19-21.

163. Ткаченко А.Г., Чудинов А.А. Обмен полиаминами между клеткой и средой как один из факторов, определяющих развитие культур Escherichia coli с подпиткой // Микробиология 1989 - Т.58 - Вып.4-С.584-590.

164. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях-М.: Медицина, 1975.-295 с.

165. Фихман Б.А. Микробиологическая рефрактометрия М.: Медицина, 1967.-280 с.

166. Харборн Д. Введение в экологическую биохимию.- М.: Мир, 1985312 с.

167. Хлебцов Н.Г., Щеголев С.Ю. Характеристические функции светорассеяния систем несферических частиц с хаотической ориентацией в приближении Рэлея-Ганса // Оптика и спектроскопия-1977.-Т.42.-№ 5- С.956-962.

168. Хохлов А.С. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы М.: Наука, 1988.-272 с.

169. Цавкелова Е.А., Климова С.Ю., Чердынцева Т.А. и др. Гормоны и гормоноподобные соединения микроорганизмов // Прикл. биохимия и микробиология.- 2006.- Т.42.- №3- С 261-268.

170. Чалисова Н.И., Комашня А.В. Модулирующее действие аминокислот в органотипической культуре лимфоидной ткани // Биоорганическая химия 2006.- Т. 32 - №3 - С.284-290.

171. Чернощеков К. А., Лепехин А.В. О жизнедеятельности энтеробактерий в водной среде при отсутствии источников органического питания // Журн. микробиол 1992 - № 9-10 - С.21-24.

172. Шапошников В.Н. Основные физико-химические закономерности обмена веществ микроорганизмов М.: Наука, 1968.-122 с.

173. Шварц С.С. Метаболическая регуляция роста и развития животных на популяционном и организменном уровнях // Известия АН СССР. Сер.биологическая 1972.-№ 6 - С.822-835.

174. Шварц С.С., Пястолова О.А., Добринская JI.A., Рункова Г.Г. Эффект группы в популяции водных животных и химическая экология М.: Наука, 1976.- 154 с.

175. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: В 3 т.-М.: Грант, 1998, 2001-Т-3.

176. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология: некоторые итоги и перспективы исследований // Вестник РАМН 2005 - №12 - С. 13-17.

177. Шилин В.И., Печуркин Н.С., Брильков А.В., Белянкина Н.И., Терсков И.А. Положительный эффект кооперативности роста популяции бактерий (эффект Олли) в простой среде // ДАН СССР- 1983-Т.271.-№ 2.- С.505-508.

178. Эль-Регистан Г.И., Бабаян T.JI. Явление автолиза у микроорганизмов // Перспективные направления развития микробиологической промышленности. Обзор, информ- М.: ЦБНТИ Минмедбиопрома СССР.- 1987.- Вып.2-52 с.

179. Эль-Регистан Г.И., Хохлова Ю.М., Дужа М.В. и др. Выявление и характеристика специфических ауторегуляторных факторов, синтезируемых про- и эукариотными микроорганизмами // Изв. АН СССР. Сер. Биологическая.- 1979а.-№6.-С.869-877.

180. Эль-Регистан Г.И. Покой как форма адаптации микроорганизмов // В кн.: Бухарин О.В., Гинцбург A.JL, Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий М.: Медицина, 2005. - 367 с.

181. Alexeeva S., Hellingwerf К J., Teixeira de Mattos M. J. Requirement of ArcA for redox regulation in Escherichia coli under microaerobic but notanaerobic or aerobic conditions // J. Bacteriol 2003 - V. 185 - № 1.- P. 204-209.

182. Alexeeva, S., de Kort В., Sawers G., Hellingwerf K. J. et al. Effects of limited aeration and of the ArcAB system on intermediary pyruvate catabo-lism in Escherichia coli // J. Bacteriol.- 2000.-V.182.- №17.- P.4934-4940.

183. Alper Т., Stern M. The measurement of the opacity of bacterial cultures with a photo-electric cell // J. Hyg 1933.- V.33 - P.497-509.

184. Anderson E. В., Meanwell L. J. Studies in the bacteriology of low-temperature pasteurization. Part II. The heat resistance of a thermiduric streptococcus grown at different temperatures // J. Dairy Research 1936-V.7.- P.182-191.

185. Arnold C. N., McElhanon J., Lee A. et al. Global analysis of Escherichia coli gene expression during the acetate-induced acid tolerance response // J. Bacteriol.-2001.-V.183.-№7.-P.2178-2186.

186. Asahara Т., Shimizu K., Nomoto K. et al. Probiotic bifidobacteria protect mice from lethal infection with shiga toxin-producing Escherichia coli 0157:H7 // Infection and Immunity.- 2004.- V.72.- №4.- p.2240-2247.

187. Barak, R., Eisenbach M. Acetylation of the response regulator, CheY, is involved in bacterial chemotaxis // Mol. Microbiol 2001- V.40 - P.731-743.

188. Barber M. A. The rate of multiplication of Bacillus coli at different temperatures I I J. Infectious Diseases 1908.- V.6.- P.379-400.

189. Barlati S., Majerfeld J. Partial characterization of the factor responsible for tryptophanes death in Bacillus subtilis // J.Bacteriol.- 1970 V.101- № 2.-P.355-360.

190. Barrete W.C., Hennum D.M., Wheeler W.D. et al. Viability and metabolic capability are maintained by Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus lactis at very low adenylate energy charge // J.Bacteriol 1988.-V.170.-№ 8.-P.3655-3659.

191. Bassler B. L., Greenberg E. P., Stevens A. M. Cross-species induction of luminescence in the quorum-sensing bacterium Vibrio harveyi // J. Bacterid.- 1997. V.179.-№12.-P.4043-4045.

192. Bayne-Jones S., Adolph E. F. Growth in size of micro-organisms measured from motion pictures. III. Bacterium coli // J. Cellular Сотр. Physiol-1932.-№ 2-P. 329-348.

193. Bayne-Jones S., Rhees H.S. Bacterial calorimetry. II. Relationship of heat production to phases of growth of bacteria // J.Bacteriol. 1929 - V.17-P.123-140.

194. Bayne-Jones S., Sandholzer L. A. Changes in the shape and size of Bacterium coli and Bacillus megatherium under the influence of bacteriophage. A motion photomicrographic analysis of the mechanism of lysis // J. Exptl. Med.- 1933.-V.67.-P.279-304.

195. Ben-Jacob E., Schochet O, Tenenbaum A., Cohen I, Czirok A, Vicsek T. Generic modelling of cooperative growth patterns in bacterial colonies // Nature.- 1994.-V. 368.-P.46-48.

196. Bergter F., Knorre W.A., Muller P.J. Produktinduzierte Oscillationen von Wachstum und Stoffwechsel bei kontinuierlichen Kulturen von Microorganismen // Nova acta Leopold 1977 - V.46 - № 225 - P.643-653.

197. Blankenhorn, D., Phillips J., Slonczewski J. L. Acid- and base-induced proteins during aerobic and anaerobic growth of Escherichia coli revealed by two-dimensional gel electrophoresis // J. Bacterid- 1999- V.181-P.2209-2216.

198. Bock, A., Sawers G. Fermentation // Neidhardt F. C. (ed.), et al. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed-Washington, D.C.: ASM Press, 1996.- P. 262-282.

199. Braun W. Cell population dynamics and somatic change // J.Cell and Сотр. physiol.- 1958.- V.52 suppl.l.- P.337-369.

200. Braun W. Studies of population changes in bacteria and their relation to some general biological problems // The American Naturalists- 1952-V.86.-№831.-P.355-371.

201. Brdar В., Kos E., Drakulis M. Metabolism of nucleic acids and protein in starving bacteria // Nature.- 1965 V.208 - P.303-304.

202. Breznak J.A., Potrikus C.J., Pfennig N. et al. Viability and endogenous substrates used during starvation. Survival of Rhodospirillum rubrum // J.Bacteriol 1978.- V.134.-№2.- P.381-388.

203. Buchanan R.E. Life phases in a bacterial culture // J. Infection Diseases-1918-V.23.- P.109-125.

204. Buchner H., Longard K., Riedlin G. Uber die Vermehrungsgeschwindig-keit der Bacterien // Zentr. Bakt. Parasitenk 1887 - V.2.- P. 1-7.

205. Buckley D.E., Anagnostopoulos G.D. Growth of Escherichia coli B/r/1 in a semi-continuous system designed for the synchronization of cell division // Arch.Microbiol.- 1975.- V.105.- №2.- P.l 69-172.

206. Budrene E.O., Berg H.C. Complex patterns formed by motile cells of

207. Escherichia coli // Nature.- 1991.- V.349 P.630-633.

208. Budrene E.O., Berg H.C. Dynamics of formation of symmetrical patterns by chemotactic bacteria //Nature.- 1995.- V. 376 P.49-53.

209. Buggs C. W., Green, R. G. Electrophoretic phenomena of bacteria. III. The electrophoretic velocity of bacteria in relation to growth, senescence, and death // J.Bacteriol.- 1935.- V.30 P.453-463.

210. Bullough W.S. The evolution of differentiation- L.-N.Y.: Acad.Press, 1967.- 206p.

211. Bunch, P. K., Mat-Jan F., Lee N. et al. The IdhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli // Microbiology.-1997.-V. 143.-P. 187-195.

212. Burk D., Lineweaver H. The influence of fixed nitrogen on Azotobacter. J.Bacteriol.- 1930.-V.19.- P.389-414.

213. Byers B.R., Powell M.V., Lankford C.E. Iron-chelating hydroxamic acid (schizokinen) active in initiation of cell division in Bacillus megaterium // J.Bacteriol.- 1967.- V.93.- №1.- P.286-294.

214. Cashel M., Rudd K.E. The stringent response // Escherichia coli and Salmonella typhimurium- Washington, 1987 P.1410-1438.

215. Castanie-Cornet, M.-P., Penfound T. A., Smith D. et al. Control of acid resistance in Escherichia coli //J. Bacterid- 1999 V.181.-P.3525-3535.

216. Chen J., Morrison D.A. Modulation of competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae // J. Gen. Microbiol 1987.- V.133-№5- P. 1959-1967.

217. Chen H., Fujita M., Feng Q. et al. Tyrosol is a quorum-sensing molecule in Candida albicans // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2004.- V.101.- №14.-P.5048-5052.

218. Chen X., Schauder S., Potier N. et al. Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron // Nature.- 2002 V.415 - P.545-549.

219. Chesney A. M. The latent period in the growth of bacteria // J. Exptl. Med.- 1916-V.24- P.387-418.

220. Cheville, A. M., Arnold K. W., Buchrieser C. et al. rpoS regulation of acid, heat, and salt tolerance in Escherichia coli 0157:H7 // Appl. Environ. Microbiol.- 1996.-V.62.-P.1822-1824.

221. Chiaramello A.E., Zyskind J.W. Coupling of DNA replication to growth rate in Escherichia coli: a positive role for guanosine tetraphosphate // J.Bacteriol.- 1990.- V.172.- №4.- P.2013-2019.

222. Chou T.W., Greasham R., Tannenbaum S.R. et al. Prodaction of an autoinhibitor by a thermophilic bacillus // J.Bacteriol- 1972- V.lll-P.459-464.

223. Chun C.K., Ozer E.A., Welsh M.J. et al. Inactivation of a Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal by human airway epitelia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2004.-V.101.-P.3587-3590.

224. Clark P.F., Ruehl W.H. Morphological changes during the growth of bacteria // J.Bacteriol.- 1919.- V.4.-P.615-629.

225. Clark, D. P., Cronan J. E. Two-carbon compounds and fatty acids as carbon sources // Neidhardt F. C. (ed.), et al. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology 2nd ed - Washington, D.C.: ASM Press, 1996.-P. 343-357.

226. Clay don T. J. The influence of growth temperature and age on the thermal resistance of milk cultures of Streptococcus lactis // B. W. Hammer Panegyric-Collegiate Press, Ames, la., 1937-P. 177-183.

227. Coblentz J.M., Levine M. The effect of metabolites of Escherichia coli on the growth of coli-aerogenes bacteria // J. Bacteriol 1947 - V.53- №4-P.455-467.

228. Crabtree H. G. Observations on the carbohydrate metabolism of tumours //. Biochem. J. 1929.- V.23.- P.536-545.

229. Culter R.G., Evans J.E. Synchronization of bacteria by a stationary-phasemethod // J.Bacteriol.- 1966.- V.91- №2.- P. 469-476.

230. Cummings J.H., Pomare E.W., Branch W.J. et al. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood // Gut- 1987-V.28.-P.1221-1227.

231. Cutler D. W., Crump L. M. Carbon dioxide production in sands and soils in the presence and absence of amoebae // Ann. Applied Biol- 1929-V.16.-P.472-482.

232. Davis В., Luger S., Tai P. Role of ribosome degradation in the death of starved Escherichia coli cells // J.Bacteriol.- 1986 V.166.- № 2 - P.439-445.

233. Dawes E.A. Endogenous metabolism and the survival of starved prokaryotes // The survival of vegetative microbes: 26th Symp.Soc.Gen.Microbiol- London: Cambridge Univ. Press, 1976-V.26.-P.19-53.

234. Dawes E.A. Starvation and energy reserves // Bacteria in their natural environments. Ed. by Fletcher M., Floodgate G.D.- London etc: Academic Press, 1985.-P.43-79.

235. Dawes E.A. Stress of unbalanced growth and starvation in microorganisms // The revival of injured microbes. Ed. by M.N.E. Andrew and A.D. Russell-London etc: Academic Press, 1984-P. 19-43.

236. Dean A.C.R., Hinshelwood C.N. Growth, function and regulation in bacterial cells Oxford: Clarendon Press, 1966 - 439 p.

237. DeGraef M. R., Alexeeva S., Snoep J. L. et al. The steady-state internal redox state (NADH/NAD) reflects the external redox state and is correlated with catabolic adaptation in Escherichia coli // J. Bacteriol.- 1999-V.181.-№8.-P.2351-2357.

238. DeLisa M.P., Wu C.F., Wang L. et al. DNA microarray-based identification of genes controlled by autoinducer 2-stimulated quorum sensing in Escherichia coli // J. Bacteriol.- 2001V. 183.- №18.- P.5239-5247.

239. D'Mello A., Yotis N.W. The action of sodium deoxyholate on Escherichia coli //Appl. Env. Microbiol.- 1987.-V. 53.-№ 8.-P. 1944-1946.

240. Dong Y.H., Xu J.L., Li X.Z. et al. AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2000.- V.97-P.3526-3531.

241. Dubos R.J. Louis Pasteur, free lance of science // Boston, Little, Brown-1950 (цит. no Rose S.M.,1960.).

242. Duerre J. A., Miller С. H. Cleavage of S-ribosyl-L-homocysteine by extracts from Escherichia coli. // J Bacteriol.- 1966. V.91- P. 1210-1217.

243. Eaton M. D. A quantitative study of the respiration of staphylococcus cultures lysed by bacteriophage // J.Bacteriol.- 1931- V.21.- P. 143-156.

244. Eberhard A., Burlingame A.L., Eberhard C. A et al. Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase // Biochemistry.-1981.- V.20 P.2444-2449.

245. Eberl L., Winson M.K., Sternberg C. et al. Involvement of N-acyl-L-homoserine lactone autoinducers in control of multicellular behavior of Serratia liquefaciens // Mol. Microbiol.- 1996.-V.20.-P.127-136.

246. Egan A.F. Enumeration of stressed cells of Escherichia coli // Can.J.Microbiol- 1979.-V.25.-№ l.-P. 116-118.

247. El-Gedaily A, Paesold G., Chen C.-Y. et al. Plasmid virulence gene expression induced by short-chain fatty acid in Salmonella dublin: identification of /poS-dependent and /poS-independent mechanism // J. Bacteriol.- 1997.-V. 179.-№4.-P. 1409-1412.

248. Engelberg-Kulka H., Glaser. G. Addiction modules and programmed cell death and antideath in bacterial cultures // Annu. Rev. Microbiol 1999-V.53.- P.43-70.

249. Elliker P.R., Frazier W.C. Influence of time and temperature of incubation on heat resistance of Escherichia coli // J. Bacteriol. 1938 - V.36.- P.83

250. Ellis R.J., van der Vies S.M. Molecular chaperones // Ann.Rev.Biochemistry- 1991.- V.60.- P.321-347.

251. Federle M.J., Bassler B.L. Interspecies communication in bacteria // J. Clin. Invest.- 2003.- V.112- №9.- P.1291-1299.

252. Foster, J. W., Hall H. K. Adaptive acidification tolerance response of Salmonella typhimurium // J. Bacterid.- 1990 V.172 - P.771-778.

253. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. Bacterid.- 1994. V.176.-№2. -P.269-275.

254. Gaal Т., Bartlett M. S., Ross W. et al. Transcription regulation by initiating NTP concentration: rRNA synthesis in bacteria // Science- 1997.-V.278 P.2092-2097.

255. Gallant J. Stringent control in Escherichia coli // Annu.Rev.Genet 1979-V.13.-P.393-415.

256. Garre C. Uber Antagonisten unter den Bacterien // Correspond, f. schweizer Arzte.- 1887.- B.17 S.385-392. (цит. no Coblentz & Levine, 1947.)

257. Garvie E.I. The growth of Escherichia coli in buffer substrate and distilled water // J.Bacteriol.- 1955,- V.69.- № 4.- P.393-398.

258. Gates F. L. A study of the bactericidal action of ultra violet light. I. The reaction to monochromatic radiations // J. Gen. Physiol- 1930- V.13-P.231-248.

259. Gauthier M.J., Munro P.M., Breittmayer V.A. Influence of prior growth conditions on low nutrient response of Escherichia coli in seawater // CanJ.Microbiol 1989.- V.35 .-№ 3.- P.379-383.

260. Gerard R.W., Falk I.S. Observations on the metabolism of Sarcina lutea // J. Biol. Bull.- 1931.-V. 60.-P.213-226.

261. Gestwicki J. E., Kiessling L. L. Inter-receptor communication through arrays of bacterial chemoreceptors // Nature-2002 V.415.- P.81-84.

262. Gillespie L. J. The acid agglutination of pneumococci // J. Exptl. Med-1914 V. 19.- P.28-3 7.

263. Givskov M., de Nys R., Manefield M. et al. Eukaryotic interference with homoserine lactone-mediatedprokaryotic signalling// J. Bacterid 1996-V.l 78.- №22.- P.6618-6622.

264. Gladstone G. P., Fildes P., Richardson G. M. Carbon dioxide as an essential factor in the growth of bacteria // Brit. J. Exptl. Path 1935 - V.16-P.335-348.

265. Greenberg E. P. Bacterial communication and group behavior // J. Clin. Invest- 2003.-V.112.- № 9.- P. 1288-1290.

266. Groat R.G., Schultz J.E., Zychlinsky E. et al. Starvation proteins in Escherichia coli: kinetics of synthesis and role in starvation survival // J.Bacteriol- 1986.- V.168.- №2.- P.486-493.

267. Guilfoyle D. E., Hirshfield I. N. The survival benefit of short-chain organic acids and the inducible arginine and lysine decarboxylase genes for Escherichia coli // Lett. Appl. Microbiol.- 1996.- V.22.- P.393-396.

268. Harrison A.P. The response of Bacterium lactis aerogenes when held at growth temperature in the absence of nutriment: an analysis of survival curves //Proc.Roy.Soc.B I960.- V.l52.-P.418-428.

269. Harrison A.P., Lawrence F.R. Phenotypic, genotypic, and chemical changes in starving populations of Aerobacter aerogenes // J.Bacteriol-1963.- V.85.- №4.- P.742-750.

270. Harrison D. E., Pirt S. J. The influence of dissolved oxygen concentration on the respiration and glucose metabolism of Klebsiella aerogenes duringgrowth// J. Gen.Microbiol.- 1967.-V.46.-P. 193-211.

271. Hecker M., Schroeter A., Trader K., Mach F. Role of relA mutation in the survival of amino acid-starved Escherichia coli // Arch. Microbiol 1986-V.143.-P.400-402.

272. Hehewerth F. H. Die mikroskopische Zahlungsmethode der Bacterien von Alex. Klein und einige Anwendungen derselben // Arch. Hyg- 1901-B.39.-S.321-389.

273. Heiberg B. Die Thermoresistenz bei jungen und alten Bakterien und "jun-gen" and "alten" Bakteriophagen // Z. Hyg. Infektionskrankh- 1932-B.l 14.-S. 425-428.

274. Helinski D.R., Clewell D.B. Circular DNA // Ann.Rev. Biochem 1971.-V.40.- P.899-942.

275. Henricil A. T. Morphologic variation and the rate of growth of bacteriai.-Springfield: C.C. Thomas, 1928 194p.

276. Hentzer M., Givskov M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections // J. Clin. Invest 2003-V.112.-№ 9.-P.1300-1307.

277. Hentzer M., Wu H., Andersen J. B. et al. Attenuation of Pseudomonas aeruginosa virulence by quorum sensing inhibitors // EMBO J 2003-V.22 - P.3803-3815.

278. Hewitt L. F. Oxidation-reduction potentials in bacteriology and biochemistry. Fourth Ed.-London County Council, 1937.

279. Hirsch P., Berhard R.M., Cohen S.S. et al. Life under conditions of low nutrient concentration // Strategies of microbial life in extreme environments. Ed. by M.Shilo.-N.Y.: Verlag Chemie, 1979.-P. 357-372.

280. Hitchener B.J., Egan A.F. Outer membrane damage in sublethally heated Escherichia coli K-12 // Can J.Microbiol.- 1977.- V.23.- № 3.- р.зц. 318.

281. Holms H. Flux analysis and control of the central metabolic pathways in Escherichia coli // FEMS Microbiol. Rev.- 1996.- V. 19.- P.85-116.

282. Hooper L. V., Gordon J. I. Commensal host-bacterial relationships in the Gut // Science. 2001.- V.292.- P. 1115-1118.

283. Huntington E., Winslow C.-E. A. Cell size and metabolic activity at various phases of the bacterial culture cycle // J.Bacteriol- 1937 V.33-P.123-144.

284. Ingram L.O., Fisher W.D. Mechanism for the regulation cell division in Agmenellum // J.Bacteriol.- 1973b.- V. 113.- № 2.- P. 1006-1014.

285. Ingram L.O., Fisher W.D. Novel mutant impared in cell division: evidence for a positive regulating factor // J.Bacteriol- 1973a- V.113 № 2.-P.999-1005.

286. Jenkins D.E., Auger E.A., Matin A. Role of RpoH, a heat shock regulator protein, in Escherichia coli carbon starvation protein synthesis and survival //J.Bacteriol.- 1991.-V. 173.-№ 6.-P. 1992-1996.

287. Jenkins D.E., Schultz J.E., Matin A. Starvation-induced cross protection against heat or H202 challenge in Escherichia coli // J.Bacteriol 1988-V.170.-№ 9.-P.3910-3914.

288. Jensen K. A. Durch direkte mikroskopische Beobachtung ausgefuhrte Untersuchungen uber das Wachstum des Coli-Bazillus // Zentr. Bakt. Para-sitenk. I, Orig.- 1928.-В. 107.-S. 1-34.

289. Kahn M. C., Schwarzkopf H. Some biophysical properties of the tubercle bacillus // Am. Rev. Tuberc.- 1931.- V.23.-P.45-55.

290. Kalir S., McClure J., Pabbaraju K. et al. Ordering genes in a flagella pathway by analysis of expression kinetics from living bacteria // Science-2001 -V.292.-P.2080-2083.

291. Keener, J., Nomura M. Regulation of ribosome synthesis // Neidhardt F. C. (ed.), et al. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology.- 2nd ed.- Washington, D.C.: ASM Press, 1996.- P. 1417-1431,

292. Kihara M., Macnab R. M. Cytoplasmic pH mediates pH taxis and weak-acid repellent taxis of bacteria // J. Bacteriol.- 1981.- V.145 P. 12091221.

293. Kimball G.A. The growth of yeast in a magnetic field // J.Bacteriol. -1938-V.35- P.109-122.

294. Kirkpatrick C., Maurer L. M., Oyelakin N. E. et al. Acetate and formate stress: opposite responses in the proteome of Escherichia coli // J. Bacteriol.- 2001.- V. 183.- P.6466-6477.

295. KjelIeberg S., Hermansson M., Marden P. The trasient phase between growth and nongrowth of heterotrophic bacteria, with emphasis on the marine environment // Ann.Rev.Microbiol 1987 - V. 41.- P.25-49.

296. Koch A.L. Estimation of size of bacteria by low-angle lightscattering measurements theory // J.Microbiol.Methods 1986 - V.5.- P.221-235.

297. Koch A.L. Microbial growth in low concentrations of nutrients // Strategies of microbial life in extreme environments. Ed. by M.Shilo N.Y.: Verlag Chemie, 1979.-P.261-279.

298. Koch A.L. Same calculations on the turbidity of mitochondria and bacteria // BBA.- 1961.-V. 51-№ 3.-P.429-441.

299. Koch A.L. Theory of the angular dependence of light scattered by bacteria and similar-sized biological objects // J.Theor.Biol 1968 - V. 18 - № 1-P.133-156.

300. Kumari S., Tishel R., Eisenbach M. et al. Cloning, characterization, and functional expression of acs, the gene which encodes acetyl coenzyme A synthetase in Escherichia coli // J. Bacteriol- 1995- V.177- P.2878-2886.

301. Kuznetsov S.J., Dubinina G.A., Lapteva N.A. Biology of oligotrophicbacteria// Ann.Rev.Microbiol.- 1979.-V. 33.-P.377-387.

302. Lambert В., Le Pecq J.-B. Effect of mutation, Electric membrane Potential, and metabolic inhibitors on the accessibility of nucleic acids to ethidium bromide in Escherichia coli cells // Biochemistry 1984 - V. 23 - № 1-P. 166-176.

303. Landwall P., Holme T. Removal of inhibitors of bacterial growth by dialysis culture // J.Gen.Microbiol.- 1977.- V.103.- P.345-352.

304. Lane-Claypon J. E. Multiplication of bacteria and the influence of temperature and some other conditions thereon // J. Hyg- 1909 V.9. - P.239-248.

305. Lankford C.E., Kustoff T.Y., Sergeant T.P. Chelating agents in growth initiation of bacillus globigii // J.Bacteriol. 1957.- V.74 - №6.- P.737-748.

306. Lankford C.E., Walker J.R., Reevs J.B. et al. Inoculum-dependent division lag of Bacillus cultures and its relation to an endogenous factors ("schizokinen") // J.Bacteriol.- 1966.-V.91.- №3.- P.1070-1079.

307. Laris Ph.C., Pershadsingh H.A. Estimation of membrane potentials in Streptococcus faecalis by means of a fluorescent probe // Biochem.Biophys.Res.Comm 1974 - V. 57.- № 3.- P.620-626.

308. Leadbetter J.R., Greenberg E.P. Metabolism of acyl-homoserine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus // J. Bacteriol 2000-V.182-№24.-P.6921-6926.

309. Ledingham J. C. G., Penfold W. J. Mathematical analysis of the lag-phase in bacterial growth//J. Hyg.- 1914.-V.14.-P.242-260.

310. Legros M., Kepes A. One-step fluorometric microassay of DNA in procaryotes // Anal.Biochem 1985 - V. 147.- № 2 - P.497-502.

311. Lehnen D., Blumer C., Polen T. et al. LrhA as a new transcriptional key regulator of flagella, motility and chemotaxis genes in Escherichia coli // Mol. Microbiol.- 2002.- V.45.- P.521-532.

312. Levit M.N., Liu Y., Stock J.B. Stimulus response coupling in bacterialchemotaxis: receptor dimers in signalling arrays // Mol. Microbiol 1998-V.30.- P.459-466.

313. Lewenza S., Visser M.B., Sokol P.A. Interspecies communication between Burkholderia cepacia and Pseudomonas aeruginosa // Can.J.Microbiol-2002 V.48 - P.707-716.

314. Lilley B.N., Bassler B.L. Regulation of quorum sensing in Vibrio harveyi by LuxO and sigma-54 // Mol. Microbiol.- 2000 V.36.- P.940-954.

315. Lin J., Lee I.S., Frey J. et al. Comparative analysis of extreme acid survival in Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, and Escherichia coli // J. Bacteriol- 1995.- V.177 P.4097-4104.

316. Lin J., Smith M.P., Chapin K.C. et al. Mechanisms of acid resistance in en-terohemorrhagic Escherichia coli // Appl. Environ. Microbiol.- 1996-V.62 P.3094-3100.

317. Lipinska В., Zylicz M., Georgopoulos C. The HtrA (DegA) protein, essential for Escherichia coli survival at high temperatures, is an endopeptidase // J.Bacteriol.- 1990-V. 172.-№ 4 P.1791-1797.

318. MacGregor A. S. M. Immunity-phenomena in cerebro-spinal meningitis: opsonins and agglutinins in their relation to clinical features, prognosis, and therapy // J. Path. Bact 1910- V. 14 - P.503-521.

319. MacKelvie R.M., Campbell J.J.R., Gronlung A.F. Survival and intracellular changes of Pseudomonas aeruginosa during prolonged starvation // Can. J.Microbiol.- 1968.- V.14.- № 6.- P.639-645.

320. Magasanik В., Neinhardt F.C. Regulation of carbon and nitrogen utilization // Escherichia coli and Salmonella typhimurium Washington, 1987.-P.1318-1325.

321. Mager J., Kuczynski M., Schatzberg C., Avi-Dor Y. Turbidity changes in bacterial suspension in relation to osmotic pressure // J.Gen.Microbiol-1956.-V.14-№l.-P.69-75.

322. Majerfeld I., Barlati S., Ciferri O. Tryptophanless death in Bacillus subtilis

323. J.Bacteriol.- 1970 V.l 01 - №2 - P.350-354.

324. Major C.P., McDougal J.D., Harrison A.P. The effect of the initial cell concentration upon survival of bacteria at -22°C // J.Bacteriol 1955. - V. 69 - №3. - P.244-249.

325. Makinoshima H., Nishimura A., Ishihama A. Fractionation of Escherichia coli cell population at different stages during growth transition to stationary phase // Molecular Microbiology 2002 - V.43.- №2 - P.269-278.

326. Martin D.S. The oxygen consumption of Escherichia coli during the lag and logarithmic phases of growth // J. Gen. Physiol 1931-32. -V.15-P.691-708.

327. Massa E.M., Vinals A.L., Farials R.N. Influence of unsaturated fatty acid membrane component on sensitivity of Escherichia coli fatty acid auxotroph to conditions of nutrient depletion // Appl. Env. Microbiol-1988.- V.54.- № 8.- P.2107-2 111.

328. Matin A. Microbial regulatory mechanisms at low nutrient concentration as studied in chemostat // Strategies of microbial life in extreme environments. Ed. by M.Shilo.-N.Y.: Verlag Chemie, 1979.- P.323-339.

329. Matin A., Auger E.A., Blum P.H. et al. Genetic basis of starvation survival in nondifferentiating bacteria // Annu. Rev. Microbiol- 1989- V.43-P.293-316.

330. Matsui Т., Yokota H., Sato S. et al. Pressurized culture of Escherichia coli for a high concentration // Agric. Biol. Chem- 1989- V.53 №8-P.2115-2120.

331. McCann M.P., Kidwell J.P., Matin A. The putative factor Kat F has a central role in development of starvation mediated general resistance in Escherichia coli//J.Bacteriol.- 1991.-V.173.-№ 13.-P.4188-4194.

332. Meiklejohn J. The relation between the numbers of a soil bacterium and the ammonia produced by it in peptone solutions with some reference tothe effect on this process of the presence of amoebae // Ann. Applied Biol.- 1930.-V.17.-P.614-637.

333. Midgley M. The phosphonium ion efflux system of Escherichia coli: relationship to the ethidium efflux system and energetic studies // J.Gen.Microbiol- 1986.-V. 132, part II.-P.3187-3193.

334. Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria // Annu. Rev. Microbiol.- 2001 -V.55- P. 165-199.

335. Miller S.T. et al. Salmonella typhimurium recognizes a chemically distinct form of the bacterial quorum-sensing signal AI-2 // Mol. Cell 2004-V.15.-P.677-687.

336. Miller V. L., Taylor R. K., Mekalanos J. J. Cholera toxin transcriptional activator ToxR is a transmembrane DNA binding protein // Cell.- 1987-V.48- P.271-279.

337. Mink R.W., Patterson J.A., Hespell R.B. Changes in viability, cell composition and enzyme levels during starvation of continuously cultured (ammonia limited) Selenomonas ruminantium // Appl. Environ. Microbiol.- 1982.- V.44.- №4.- P.913-922.

338. Mobley H.L.T. Helicobacter pylori factors associated with disease development // Gastroenterology 1997.- V.l 13.- P.S21-S28.

339. Mooney G., Winslow C.-E. A. The metabolic activity of various colon-group organisms at different phases of the culture cycle // J.Bacteriol-1935 SO - P.427-440.

340. Morgan A.R., Lee J.S.? Pulleyblank D.E. et al. Etidium fluorescence assays. Part 1. Physicochemical studies //Nucleic Asids Research 1979-V.7.- №3. P.547-570.

341. Morita R.Y. Starvation and miniaturisation of heterotrophs, with special emphasis on maintenance of the starved viable state // Bacteria in their natural environments. Ed. by M. Fletcher, G.D. Floodgate. London etc: Academic Press, 1985.-P.81-109.

342. Moss C.W., Speck M.L. Release of biologically active peptides from Escherichia coli at subzero temperatures // J. Bacterid 1966. - V.91- №3-P.l 105-1 111.

343. Moyer L. .Changes in the electrokinetic potential of bacteria at various phases of the culture cycle // J. Bacteriol. 1936.- V.32 - P.433-464.

344. Mozharov A.D., Shchipakin V.N., Fishov I.L. et al. Changes in the composition of membrane phospholipids during the cell cycle of Escherichia coli//FEBS Letters.- 1985.-V.l86.-№1.-P. 103-106.

345. Muller M. Uber das Wachstum und die Lebenstatigkeit von Bakterien, sowie den Ablaut fermentativer Prozesse bei niederer Temperatur unter spezieller Beriicksichtigung des Fleisches als Nahrungsmittel // Arch. Hyg.- 1903-B.47.-S.127-193.

346. Muller M. Uber den Einfiuss von Fiebertemperaturen auf die Wachsthumsgescwindigkeit und die Virulenz des Typhus-bacillus // Z. Hyg. Ifektionskrankh 1895.-B.20.- S.245-280.

347. Nealson K.H., Piatt Т., Hastings J.W. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system // J. Bacteriol 1970- V.l 04-P.313-322.

348. Neidhardt F. C. (ed.), et al. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology 2nd ed - Washington, D.C.: ASM Press - 1996.

349. Neidhard F.C., VanBogelen R.A., Lau E.T. The genetics and regulation of heat-shock proteins // Annu. Rev. Genet 1984 - V.l8.- P.295-329.

350. Neijssel O.M. PQQ-linked enzymes in enteric bacteria // Microbiological Sciences.- 1987.- V.4.- №3.- P.87-90.

351. Neijssel O.M., DeMattos M.J.T., Tempest D.W. 1996. Growth yield andenergy distribution // Neidhardt F. C. (ed.), et al. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology.- 2nd ed., Washington, D.C.: ASM Press, 1996.- P. 1683-1692.

352. Neilandds J.B. Siderophores: biochemical ecology and mechanism of iron transport in enterobacteria // Advances in Chemistry. Series Bioinorganic Chemistry II.- 1977.- V.162.- P.3-32.

353. Pakula R., Walczak W. On the nature of competence of transformable streptococci//J. Gen. Microbiol- 1963.-V.31.-№1-P.125-133.

354. Parkinson J.S., Kofoid E.C. Communication modules in bacterial signalling proteins // Annu. Rev. Genet 1992 - V.26 - P.71-112.

355. Parsek M.R., Val D.L., Hanzelka B.L. et al. Acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal generation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA- 1999.-V.96 P.4360-4365.

356. Pearson J.P., van Delden C., Iglewski B.H. Active efflux and diffusion are involved in transport of Pseudomonas aeruginosa cell-to cell signals // J. Bacteriol.- 1999.-V.181 -№4.-P. 1203-1210.

357. Pechere J.C. Azithromycin reduces the production of virulence factors in Pseudomonas aeruginosa by inhibiting quorum sensing // Jpn. J. Antibiot-2001.- V.54.- P.87-89.

358. Pedlow J. Т., Lisse M. W. The effect of electrolytes present in the growth media upon the electrophoretic mobility of Escherichia coli // J.Bacteriol-1936 V.31 -P.235-244.

359. Penfold W.J. On the nature of bacterial lag // J. Hyg.- 1914.- V.141. Р.215-241.

360. Peschkov J. Die antibacterialle Activitat eines Stammes von Staphylococcus epidermidis // Zbl. Bakt., Hyg. 1 Abt. Orig. A.- 1973.- B.225.- S.459-463.

361. Peschkov J. The autoinhibition activity of some microbial species // Zbl. Bakt., Hyg. 1 Abt. Orig. A.- 1976.-V.235.-P.459-463.

362. Pesci E.C., Milbank J.B.J., Pearson J.P. et al. Quinolone signalling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1999.- V.96.-P.11229-11234.

363. Polen Т., Rittmann D., Wendisch V.F. et al. DNA microarray analyses of the long-term adaptive response of Escherichia coli to acetate and propionate // Appl. Environ. Microbiol.- 2003.- V.69.- P.1759-1774.

364. Poolman В., Smid E.J., Veldkamp H. et al. Bioenergetic consequences of lactose starvation for continuously cultured Streptococcus cremoris // J.Bacteriol.- 1987.- V. 169.- N4.- P. 1460-1968.

365. Postgate J.R. Death in macrobes and microbes // The survival of vegetative microbes: 26th Symp.Soc.Gen.Microbiol. London: Cambridge Univ. Press, 1976.-V.26.-P.1-19.

366. Postgate J.R., Hunter J.R. The survival of starved bacteria // J.Gen.Microbiol- 1962.-V.29.-№ 2.-P.233-263.

367. Rahn O. Uber den Einfluss der Stofiwechselprodukte auf das Wachstum der Bakterien // Zentr. Bakt. Parasitenk- 1906.- B.ll, 16 P.417-429; 609-617.

368. Rahn O., Hegarty C.P., Deuel R.E. Factors influencing the rate of fermentation of Streptococcus lactis // J. Bacteriol 1938 - V.35.- P.547-558.

369. Reading N. C. & Sperandio V. Quorum sensing: the many languages of bacteria // FEMS Microbiology Letters 2006 - V.254 - №1.- P. 1-11.

370. Reeve C.A., Amy P.S., Matin A. Role of protein synthesis in the survival of carbon-starved Escherichia coli K-12 // J.Bacteriol- 1984b V.1603.-P.l 041-1046.

371. Reeve С.A., Bockman A.T., Matin A. Role of protein degradation in the survival of carbon-starved Escherichia coli and Salmonella typhymurium // J.Bacteriol.- 1984a.- V. 157.- №3.- P.758-763.

372. Regnier P. Proteases of Escherichia coli // Ciencia Biologica (Portugal).-1986 V. 11P.33-40.

373. Reichenbach H. Die Absterboerdnung der Bakterien und ihre Bedeutung fur Theorie und Praxis der Desinfektion // Z. Hyg. Infektionskrankh-1911.-B.69.-S. 171-222.

374. Reitzer L., Schneider B. L. Metabolic context and possible physiological themes of o54-dependent genes in Escherichia coli // Microbiol, and Mol. Biol. Rev.- 2001.- V.65.- №3.- P.422-444.

375. Revenchon S., Bouillant M. L., Salmond G. et al. Integration of the quorum-sensing system in the regulatory networks controlling virulence factor synthesis in Erwinia chrysanthemii // Mol. Microbiol- 1998- V.29-P.1407-1418.

376. Ricciuti C.P. Synchronized division in Escherichia coli: an integral portion of culture growth//J.Bacteriol- 1972-V.l 12.-№l.-P.643-645.

377. Robertson Т. B. The chemical basis of growth and senescence. Lippin-cott, Philadelphia, 1923.-221 p.

378. Roe A. J., McLaggan D., Davidson I. et al. Perturbation of anion balance during inhibition of growth of Escherichia coli by weak acids // J. Bacterid.- 1998.- V.180.-P.767-772.

379. Roe A. J., O'Byrne C., McLaggan D. et al. Inhibition of Escherichia coli growth by acetic acid: a problem with methionine biosynthesis and homocysteine toxicity // Microbiology 2002 - V.148 - P.2215-2222.

380. Rose S.M. A feedback mechanism of growth control in tadpoles // Ecology.- I960.-V.41.-№ 1.-P.188-199.

381. Rossman R., Sawers G., Bock A. Mechanism of regulation of the formate-hydrogenlyase pathway by oxygen, nitrate, and pH: definition of the formate regulon // Mol. Microbiol.- 1991.- V.5.- P.2807-2814.

382. Roszak D.B., Colwell R.R. Survival strategies of bacteria in the natural environment//Microbiol. Rev.- 1987.-V.51.-№3.-P.365-379.

383. Russell J. В., Diez-Gonzalez F. The effects of fermentation acids on bacterial growth // Adv. Microb. Physiol.- 1998.- V.39.- P.205-234.

384. Ryan F.J. Bacterial mutation in a stationary phase and the question of cell turnover // J.Gen.Microbiol- 1959 V.21- №3 - P.530-549.

385. Schaechter E., Maaloe O., Kjeldgaard N.O. Dependence on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced growth of Salmonella typhimurium // J. Gen. Microbiol 1958.- V.19 - P.592-606.

386. Schauder S., Shokat K., Surette M. G. et al. The LuxS family of bacterial autoinducers: biosynthesis of a novel quorum sensing signal molecule // Mol. Microbiol.-2001.-V.41.-№2.-P.463-476.

387. Schellhorn H. E., Stones V. L. Regulation of katF and katE in Escherichia coli K-12 by weak acids // J. Bacterid.- 1992.- V.174.- P.4769-4776.

388. Schmalhausen I., Bordzilowskaja N. Studien uber Wachstum und Differ-enzierung. II. Die Individuelle Wachstumskurve der Bakterien // Arch. Entwicklungsmech. Organ 1926 - B.107 - S.627-678.

389. Schultz J.E., Latter G.J., Matin A. Differential regulation by cyclic AMP of starvation protein synthesis in Escherichia coli // J.Bacteriol- 1988-V.170.-№9.-P.3903-3909.

390. Schultz J.H., Ritz H. Die Thermoresistenz junger und alter Coli-Bacillen // Zentr. Bakt. Parasitenk., I, Orig.- 1910.- B.54 S.283-288.

391. Shapiro J.A. Organization of developing Escherichia coli colonies viewed by scanning electron microscopy // J.Bacteriol.- 1987- V.169 P.142-156.

392. Shapiro J.A. Pattern and control in bacterial colonies // Science Progress1994.-V.76.-P. 399-424.

393. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns // BioEssays1995.- V.l 7.- №7.- P.597-607.

394. Shapiro J.A., Hsu C. E.coli K-12 cell-cell interaction seen by time-lapse video // J.Bacteriol- 1989.- V.l 71.- P.5963-5974.

395. Sherman J.M., Albus W.R. Physiological youth in bacteria // J. Bacteriol-1923 V.8.- P.127-139.

396. Sherman J.M., Albus W.R. The function of lag in bacterial cultures // J. Bacteriol.- 1924.-V.9.-P.303-305.

397. Sinclair N.A., Stokes J.L. Factors, which control maximal growth of bacteria // J.Bacteriol.- 1962.- V.83.- №5.- P. 1147-1154.

398. Small P., Blankenhorn D., Welty D. et al. Acid and base resistance in Escherichia coli and Shigella flexneri: role of rpoS and growth pH // J. Bacteriol.- 1994 V. 176 - P. 1729-1737.

399. Sofer D., Gilboa-Garber N., Belz A. et al. 'Subinhibitory' erythromycin represses production of Pseudomonas aeruginosa lectins, autoinducer and virulence factors // Chemotherapy.- 1999 V.45 - P.335-341.

400. Spence J., Cegielska A., Georgopoulos C. Role of Escherichia coli heat shock proteins Dna К and Htp G (C 62,5) in responce to nutrient deprivation // J.Bacteriol.- 1990.- V. 172,- P.7157-7166.

401. Stancik L.M., Stancik D.M., Schmidt B. et al. pH-Dependent expression of periplasmic proteins and amino acid catabolism in Escherichia coli // J. Bacterid.- 2002.- V.184.- P.4246-4258.

402. Stark C. N., Stark, P. Physiological difference between young and old bacterial cells // J.Bacteriol. 1929.- V.17.- P.2-3.

403. Stim K.P., Bennett G.N. Nucleotide sequence of the adi gene, which encodes the biodegradative acid-induced arginine decarboxylase of Escherichia coli // J. Bacterid.- 1993.- V.175.- P.1221-1234.

404. Strange R.E., Dark F.A., Ness A.G. The survival of stationary phase Aerobacter aerogenes stored in aqueous suspension // J.Gen.Microbiol-1961-V.25.-№1. P.61-76.

405. Strange R.E., Wade H.E., Ness A.G. The catabolism of proteins and nucleic acids in starved Aerobacter aerogenes // Biochem.J- 1963-V.86-P. 197-203.

406. Strange R.E.,Dark F.A. "Substrate accelerated death" of Aerobacter aerogenes // J.Gen.Microbiol.- 1965.- V.39.- №2.- P.215-228.

407. Surette M.G., Bassler B.L. Regulation of autoinducer production in Salmonella typhimurium // Mol. Microbiol 1999 - V.31- P.585-595.

408. Surette M.G., Bassler. B.L. Quorum sensing in Escherichia coli and Salmonella typhimurium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998- V.95-P.7046-7050.

409. Surette M.G., Miller M.B., Bassler. B.L. Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi: a new family of genes responsible for autoinducer production // Proc. Natl. Acad. Sci. USA-1999-V.96.-P.1639-1644.

410. Tabor С.W., Tabor H. Polyamines in microorganisms // Microbiol. Rev-1985- V49 № 1.- P.81 -99.

411. Taga M.E., Bassler B.L. Chemical communication among bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.-V.l00, Suppl. 2.-P.14549-14554.

412. Tetz V.V. Colony-like communities of bacteria // Microbios- 1994-V.80.- P.63-65.

413. Tetz V.V., Rybalchenko O.V. Ultrastructura of colony-like communities of bacteria // ARMS.- 1997.- V. 105.- P.99-107.

414. Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Ultrastructura of the surface film of bacterial colonies // J. General Microbiol 1993 - V.139 - P.855-858.

415. Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Ultrastructural features of microbial colony organization // J.Basic Microbiol 1990.-V.30,- № 8-P.597-607.

416. Thomas T.D., Batt R.D. Survival of Streptococcus lactis in starvation conditions // J.Gen.Microbiol- 1968.- V.50, part 3.- P.367-382.

417. Thompson J., Curtis M.A., Miller S.P.F. N-(l-carboxyetyl)-ornitin, a new amino acid from intracellular pool of Streptococcus lactis // J.Bacteriol-1986.-V.l 67.-№2.-P.522-529.

418. Topley W.W.C., Wilson G.S. Principles of bacteriology and immunity. London: Arnold, 1934.-V.l.-P.73-88.

419. Tormo A., Almiron M., Kolter R. SurA, an Escherichia coli gene essential for survival in stationary phase // J.Bacteriol- 1990- V.l72- №8.-P.4339-4347.

420. Tso W.W., Adler J. Negative chemotaxis in Escherichia coli // J. Bacteriol 1974.-V.118.-P.560-576.

421. Tucker D.L., Tucker N., Conway T. Gene Expression Profiling of the pH Response in Escherichia coli // J. Bacteriol 2002 - V.184 - P.6551-6558.

422. Udenfriend S. Fluorescence assay in biology and medicine V.2.- N.-Y., L.: Academic Press, 1969.

423. Umbarger H. E. Biosynthesis of the branched-chain amino acids // Neid-hardt F. C. (ed.), et al. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology 2nd ed - Washington, D.C.: ASM Press, 1996 - P.442-457.

424. Vakhitov T.Ya., L.N. Petrov. Survival of Escherichia coli cells stored in suspension of different concentrations // Microbiology (Russia, Engl, trans.). 1992.- V.61.- Issue 6.- P.767-773.

425. Vakhitov T.Ya., Yu. V. Tyagotin and L.N.Petrov. The effect of the growth autostimulators of Escherichia coli on tumor cell activity //AIDS, Cancer and Related Problems: 3-rd International conference.- St.Petesburg, Russia, May 22-26 1995.- P.83.

426. Val D.L., Cronan J.E. In vivo evidence that S-adenosylmethionine and fatty acid intermediates are the substrates for the Luxl family of autoin-ducer synthases//J. Bacteriol- 1998-V.180.-№10.-P.2644-2651.

427. Walker H.H. Carbon dioxide as a factor affecting lag in bacterial growth // Science.- 1932.-V.76.-P.602-604.

428. Walker H.H., Winslow C.-E.A., Mooney M.G. Bacterial cell metabolism under anaerobic conditions // J. Gen. Physiol 1933-34, V.17 - P.349-357.

429. Walker H.H. Winslow C.-E.A. Metabolic activity of the bacterial cell at various phases of the population cycle // J. Bacteriol- 1932 №24-P.209-241.

430. Walker H.H., Winslow C.-E.A., Huntington E. et al. The physiological youth of a bacterial culture as evidenced by cell metabolism // J. Bacteriol.- 1934.-V.27.-P.303-324.

431. Wang Q., Kaguni J.M. A novel sigma factor is involved in expression of the rpoH gene of Escherichia coli // J.Bacteriol 1989a- V.171- №8-P.4248-4253.

432. Wang Q., Kaguni J.M. Dna A protein regulates transcription of the rpoH gene of Escherichia coli // J. Biol. Chem.- 1989b- V.264.- №13.-P.7338-7344.

433. Ward, H. M. On the biology of Bacillus ramosum (Fraenkel), a schizomy-cete of the River Thames // Proc. Roy. Soc- London.- 1895 V.58-P.265-468.

434. Waterman S.R., Small P.L. Acid-sensitive enteric pathogens are protected from killing under extremely acidic conditions of pH 2,5 when they are inoculated onto certain solid food sources // Appl. Environ. Microbiol-1998 V.64.- P.3882-3886.

435. Waterman S.R, Small P.L. Identification of sigma S-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri // Mol. Microbiol.- 1996.- V.21.- P.925-940.

436. Waters C., Bassler B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria // Annu. Rev. Cell Dev.Biol 2005.-V.21- P.319-346.

437. Wei Y., Lee J.M., Smulski D.R. et al. Global impact of sdiA amplification revealed by comprehensive gene expression profiling of Escherichia coli // J. Bacteriol.- 2001.- V. 183.- P.2265-2272.

438. Weichart D.H., Kell D.B. Characterization of an autostimulatory substance produced by Escherichia coli // Microbiology 2001- V.147 - P.1875-1885.

439. Wetzel N.C. On the motion of growth. VI. Energetics of bacterial growth and heat production // Proc. Soc. Exptl. Biol. Med 1932 - V.30.-P.360-365.

440. Whiple G. C. Changes that take place in the bacterial contents of water during transportation // Tech. Quart.- 1901 -V. 14,- P.21 -23.

441. Wildiers E. Nouvelle substance indispensable au developpement de la le-vure // La Cellule.- 1901.- V.18.- P.313-333.

442. Winkelmann G., Van der Helm D., Neilands J.B. Iron transport in microbes, plant, and animals. Weinheim, Fed. Repub. Germany: VHS, 1987.-533p.

443. Winslow C.-E.A., Walker H.H. The earlier phase of the bacterial culture cycle // Bacteriol. Rev.- 1939.- V.3.- №2.- P. 147-186.

444. Winzer K., Hardie K. R., Williams P. Bacterial cell-to-cell communication: sorry, can't talk now gone to lunch! // Cur. Opin. Microbiol - 2002b-V.5.-P.216-222.

445. Winzer K., Hardie K.R., Burgess N. et al. LuxS: its role in central metabolism and the in vitro synthesis of 4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone // Microbiology.- 2002a.- V. 148.- P.909-922.

446. Wolfe. A. J. The Acetate Switch // Microbiology and Molecular Biology Reviews.- 2005.- V. 69.-№l.- P. 12-50

447. Xavier K.B., Bassler B.L. Regulation of uptake and processing of the quorum-sensing autoinducer AI-2 in Escherichia coli // J. Bacteriol 2005a-V. 187-P.238-248.

448. Xavier K.B., Bassler B.L. Interference with AI-2-mediated bacterial cell-cell communication // Nature 2005b.- V.437.- P.750-753.

449. Yamamori Т., Yura T. Genetic control of heat-shock protein synthesis and its bearing on growth and thermal resistance in Escherichia coli K-12 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982.- V.79.- P.860-864.

450. Yamamoto K., Macnab R.M., Imae Y. Repellent response functions of the Trg and Tap chemoreceptors of Escherichia coli // J. Bacteriol 1990-V.172.-P.383-388.

451. Yoshida Т., Ueguchi C., Mizuno T. Physical map location of a set of Escherichia coli genes (hde) whose expression is affected by the nucleoid protein H-NS // J. Bacteriol.- 1993.- V. 175.- P.7747-7748.

452. Zeilstra-Ryalls J., Fayet O., Georgopoulos C. The universally conserved Gro E (Hsp 60) chaperonins // Ann. Rev. Microbiol- 1991.- V.45-P.301-325.

453. Zhang Y., Cronan J.E. Jr. Polar allele duplication for transcriptional analysis of consecutive essential genes: application to a cluster of Escherichia coli fatty acid biosynthetic genes // J. Bacteriol.-1996- V.178.- P.3614-3620.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Вахитов, Тимур Яшэрович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы