Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Плазмиды, транспозоны и их производные варианты в молекулярно-генетических исследованиях ассоциативной азотфиксирующей бактерии Azospirillum brasilense

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Плазмиды, транспозоны и их производные варианты в молекулярно-генетических исследованиях ассоциативной азотфиксирующей бактерии Azospirillum brasilense"

ВСЕСОЮЗНАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В.И.ЛЕНИНА. ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ.

На правах рукописи

БОРОВОК Илья Анатольевич

ПЛАЗЩЦЫ. ТРАНСП030НЫ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ ВАРИАНТЫ . В МОШСУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ АССОЦИАТИВНОЙ АЗОТФИКСИРУПЦЕЙ БАКТЕРИИ АгОБРШШДЛ! ВКАБПВЮЕ

03.00.03. - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена в лаборатории молекулярной ■ генетт микроорганизмов 'ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Майсурян А.Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Каменева C.B.; кандидат биологических на] Кузьмин Е.В.

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорп низмов АН СССР (г. Пущино-на-Оке, Mockoj ской обл.).

Защита диссертации состоится " "..............1991 г. в ..

час. на заседании Специализированного Совета Д.020.40.01. ВН! сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ (г. Москва).

Адрес: 12Т253, Москва, ул. Псковская, д. 12, корпус 4, ВНИИС] Специализированный совет. •

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскох! зяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан " "................1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета Д.020.40.01.,

кандидат биологических наук Меликова С.

1 -

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.Биологическая фиксация атмосферного азота является одним из ведущих разделов таких направлений современной микробиологии как генетика, биохимия, экология и др. Наиболее детально, именно с позиций этих дисциплин, изучены особенности азотфиксирукяцих симбиозов,обусловленных взаимодействием клубеньковых бактерий сем. Rhlzoblaceae с представителями сем. Бобовых (Faba-ceaeJ.B последние годы пристальное внимание привлекают к себе сво-бодноживущие и ассоциативные диазотрофы, изолированные из ризосферы к ризопланы нвбобовых растений, в том числа таких культур как рис, сорго, кукуруза, пшеница и др. (Dóbereiner, 1983; Окоп, 1985). Таксономический спектр таких диазотрофов достаточно широк: в настоящее время он включает представителей нескольких бактериальных семейств Azotobacteriaceae, Splrillaceae, Enterobacteriaceae и др. (Pedrosa, 1988). Среди ризосферных диазотрофов наибольший интерес представляют спириплоподобныа бактерии, отнесенные к роду Azospírillum (Tarrand et al., 1978), который объединяет несколько видов, включая A. brasilense, A.lipoferum и др. Азоспириллы, часто и повсеместно встречающиеся в ризосфере многих сельскохозяйственных культур, оказывают положительные качественный и количественный эффекты на урожай (Okon et al., 1988)'. Обнаружено, что азоспириллы способны стимулировать развитие растений как за счет снабжения их продуктами фиксации молекулярного азота (Albrecht et al., 1981), так и за счет продукции некоторых фитогорионов (Tien et al, 1979). В силу того,' что интенсивное исследование бактерий Azospírillum началось сравнительно недавно*многие аспекты их генетики, остаются малоизученными (Elnerich, 1986; Dóbereiner, Pedrosa, 1987). Например, до сих пор остается открытым вопрос о наличии у азоспирилл собственных систем обмена генетической информацией (Elmerich et al., 1983)! не изучены свойства и функции эндогенных плазмид азоспирилл. Однако понимание • генетических особенностей азоспирилл крайне необходимо в связи с возможностью создания эффективных шт ммов, пригодных для использования в сельскохозяйственной практике.

Очевидно, что селекция хозяйственно полезных штаммов Azospírillum немыслима без применения таких основополагающих методов современного генетического анализа как конъюгация, транспо-зонный мутагенез, клонирование фрагментов генома и др.

- г -

цель и задачи исследования. Целью работы являлась разработка основ генетического анализа ассоциативной азотфиксирующей бактерии Azospiгillum ЬгавИепве, базирующихся на использовании плазмид широкого круга хозяев, их векторных производных и транспозонов. В связи с этим в работе решались следующие задачи:

1) исследование состава и особенностей собственных (эндогенных) плазмид географически разнородных штаммов А. ЬгавИепве;

2) разработка системы конъюгации у А. Ьгasi^ense. основанной на использовании Тга-функций плазхид широкого круга хозяев;

3) анализ экспрессии генетических маркеров и стабильности наследования й-плазиид в клетках А. ЬгавИепве-.

4) оценка пригодности неконыогативных мобилизуемых векторов для клонирования в клетках азоспирилл;

5) разработка методов транспозонного мутагенеза и получение коллекции кутантных клонов' Л.ЬгавИепве-,

6) исследование возможности прямого клонирования фрагментов.генома А. ЬгазИепБе, основанного на использовании синтетического транспозона ТпУ и некоторых суицидальных векторов;

7) анализ стабильности и экспрессии чужеродной генетической информации в клетках Я. ЬгазНепае. '

Научная новизна и практическая ценность работы. Установлено, что клетки всех исследованных (географически разнородных) штаммов А. ЬгаэИепзе содержат эндогенные плаз миды средних (40- 300 тпн).и больших (свыше 300 тпн) молекулярных размеров.• Выявлен ряд штаммов, имеющих сходные плазнидные составы.' Показано,' что такие факторы, как повышенная температура инкубации, акридин оранжевый, бромистый этидий в редких случаях вызывали элиминацию либо делегирование эндогенных плазмид А.ЬгаяИепяе. Обнаружено, что только плазмиды широкого круга хозяев из 1псР1-, 1псН- и 1пс(3/Р4- групп могут с высокой частотой самостоятельно передаваться (либо мобилиг зоваться) в клетки А. ЬгабПепэе и автономно в них наследоваться. Установлено, что такие плазнидные и тоанспозонные маркеры укк Ар /Св и СтЕ не экспрессирувтся в клетках испытанных штампов азоспирилл. а маркер ТсК является индуцибельным. /

Со1Е1-подобные реплкконы не способны к автономному наследованию в клетках Л. Ьгаз.Пеляе. Интеграция гибридной (Со1Е1-КР4) плазмиды рАЗе-121й в хромосому А. ЬгаяНепяе дает возможность осуществлять хромосомную мобилизацию с частотой достаточной для проведения геномного картирования. Штаммы Л.Ьгав Неляе, несущие в составе

СВ08Й хромосокы pAS8-121А, явпяютсй эффективным* "мобилизующими" штаммами для передачи неконъюгативных XncPl- и IncQ-плазмид в клетки других гран-отрицательных бактерий.

Для бактерий A. brasilense проведена оценка эффективности суицидальных Tn-векторов серии pSUP202. Показано, что они способны обеспечивать с высокой частотой вставки Tn-элементов в гоном азос-пирилл. С частотой до 257. происходит встраивание, и самих суицидальных векторов. Создана новая серия суицидальных векторов - рХВ на основе PSUP202, несущих в своем составе синтетический транспозон TnV(rnS-R0Pp^clol), встраивание которого в генск грак-отрицательных бактерий дает возможность проводить прямое клонирование фрагментов. ДНК. прилегающих к TnV-вставкв.

Показано, что коснидные векторные плазмиды на основе 1псР1-ре-пликона, такие как pLAFRl, стабильны в клетках A. brasilense и являются удобными для клонирования гетерологичной генетической информации. Показано, что фрагменты che-Mot-fia-кластера Rhizobiun melíloti способны частично конплементировать соответствующие мутации л. brasilense.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях Молодых ученых ВНИИ CS (ВНИИ ПМБиГ) в 1984-1981 гг. на III Всесоюзном рабочем совещании по вопросам молекулярной биологии и генетики азотфиксации (Пущино, 1984), на VIII, X и XI Всесоюзных совещаниях по программе "Плазмида" (Саратов, 1384; Пущино, 1985, 1986), на Всесоюзной конференции "Состояние и перспективы развития сельскохозяйственной биотехнологии (Москва, 1986), на III Всесоюзной и на Республиканской конференциях "Микроорганизмы в сельском хозяйстве"'(Москва, 1986; Кишинев, 1988), на VI и VII Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов (Москва, 1987, 1990), на VI Съезде ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Москва,

1987), на VII Международном конгрессе по азотфиксации (Кельн, ФРГ,

1988), на V. Международно* симпозиуме по нвсимбкотячвской азотфиксации (Флоренция, Италия, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов. В работе 17 таблиц. 31 рисунок. Список цитируемой литературы включает 358 наименований.

- л -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объектов исследования были использованы 12 штакков ассоциативной азотфиксирующей бактерии izospirtllum brasllense, включая типовой штамм Sp7(ATCC29145). Штаммы любезно предоставлены Я.Доберейнер (Бразилия), Т. Калининской (ИНКИ АН СССР), О. Шиляевой (НГУ, Новосибирск), дас. Миланом (США), К. Элмеря (Франция), К. Вейером (Австралия). Кроме исходных штаммов использовались их производные варианты, сконструированные нами в процессе исследований, в работе были также использованы штаммы E.coll: НВ101, C600,J53, S17-1 и ММ294А:плазМИДЫ: RT4, R751, R906, pAS8-121, pRK2013, pRK290, pS-a, R388, Rtsl, R40a, R6K, RSF1010, pSUP202, их производные варианты, любезно предоставленные А. Пюлврок(ФРГ), С.Лонгом, М. Инойе, К. Бергманом (США), М.Ханом (Швейцария) и коллекцией каф. генетики МГУ. В работе были использованы также варианты термоиндуцибельного коли-фага PltsClAj: :TnV, предоставленные М. Инойе(США). В составе ряда плазмид, а том числе PSUP202, находились транспозоны ТпА, -Тп7, Тп9, ТП5, Tn5-MOb_ И Tnv.

Культуры Л.brasllense выращивали при Э0-32°С в аэробных, либо микроаэрофильных условиях в питательной среде(ПС) IB(Миллер, 1976) либо в синтетической минимальной, среде (MC) Д2 (Баканчцкова и др. J 1985). Для выращивания Е. coli использовали LB и MC М9(Миллер,1976) . Агариэованные среды содержали 1,5Х агара,, прлужидкие агаризованные среды - от 0,3 до 0,6% агара, в опытах использовали антибиотики в следующих концентрациях . (мкг/мл): канамкцин (Кп)/ноониЦ1<н(Нш),. cnexTHHOMHUHH(Sp) - 50,стрептомицин (Str, в случае хромосомной мутации) - 150, стрептомицин^», в случае плазмиднов или транспозон-ной устойчивости) - 30, тетрацкклин(Тс) -15. гриметоприк(тр) - 75, рифампицин(Н1Г) - 150, норсульфазол (Su) - 300.

Выделение спонтанных мутантов Л. brasllense и Е. coli, устойчивых к str и Rif, проводили на агаризованных ПС с селективным агентом; при идентификации потребностей ауксотрофных мутантов применя-

ли метод Холлидея (Holliday,1956).

Введение в клетки азоспирилл трансконъюгатхвных и мобилизуемых ллазмид и векторов, транспозонов осуществлялось в соответствии со стандартными процедурами(Simon,1984» Sinon et al.,1986) с незначительными модификациями. /

Манипуляции с плазмидной ДНК(плДНК), гель-электрофорез плднк и линейных фрагментов ДНК, трансформацию компетентных клеток Е.coii проводили в соответствии с рекомендациями Маниатиса с соавт. (1984)

а также Walker et al.(1987) и Sambróok et al.(1989).

Определение азотфиксирующей (нитрогеназной) активности проводили по методу Hardy et al.(1968). Микровегетационные опыты и реи-золяцию бактерий A. brasilense осуществляли согласно (Plazinski, Rolfe, 1985) с незначительными изменениями. Подвижность клеток и хемотаксис A. brasilense анализировали с помощью "чашечного" метода Адлера (Adler, 1966).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Эндогенные плазииды в клетках A. brasilense.

Информация о плазмидных составах и молекулярных размерах (МР) эндогенных плазмид исследуеных штаммов A.brasilense была необходима нам в первую очередь для отбора потенциальных реципиентов для последующих экспериментов по передаче плазмид и векторов. Очевидно, что наиболее "выгодными" для анализа реципиентными штаммами азоспирилл были бы те, чьи клетки эффективно воспринимали бы плазмиды заведомо отличные по МР от эндогенных. Ранее было показано, что клетки практически всех штаммов азоспирилл содержат плазмиды (от 1 до 8) с МР от S тпн до более чем 1500 тпн (Franche, Elnerich,1981; Singh, Wenzel,1982; Wood et al.,1982; Plazinski et al.,1983).

1.1 Плазмидные составы географически разнородных штаммов

Л. brasilense.

Нами было обнаружено, что в клетках всех без исключения исследованных штаммов A. brasilense присутствуют эндогенные плазмиды (табл. 1). МР обнаруженных плазмид определяли по их электрофорети-ческой подвижности в 0,6-0, IV. агарозных гелях, которая сравнивалась с подвижностью "стандартных" плазнид с известными МР. Дополнительными стандартами служили также МР плазмид, ранее обнаруженных в штаммах Sp7/АТСС29145) и KR77 (Franche, Elmerich,1982) .

Как. видно из табл. 1, характерный класс составляли плазмиды с МР 135-175тпн, которые обнаружены -практически у всех штаммов A.brasilense независимо от места их выделения. Кроме того, в клетках многих штаммов присутствовали плазмиды, чьи МР превышали 300 тпн, а в ряпе случаев даже 600 тпн (например, штаммы ТС и 94-3). Следует отметить, что плазмиды указанных МР выделялись непостоянно. Это, вероятно, обусловлено тесной связью их с мембранными структурами, которые осаждались при осветлении лизатов во время выделения плДНК. В клетках исследованных штаммов не удалось обнаружить эндогенные плазмиды с малыми значениями МР (менее 40 тпн). Ранее такой класс плазмид был описан лишь для немногих природных штаммов .Azospiril-

- б - Таблица I

Плазмидные составы исследованных штакков A. brasilense

ШТАММЫ Обозначение Молекулярный разнер

плазхиды плазниды (тпн)

5р7/АТСС29145 pABSpl 135 ± 3

(Бразилия) pABSp2 180 1 S

pABSp3* >400

pA8Sp4 >450(2?)**

;)Н82А1 (Эквадор) pABjMl 165 ± 3

pABjM2* >450(2?)

94-3 (СССР, pAB941 135 ± 3

Европ. часть) PAB942 155 ± 5

pAB943* >800

6К (СССР. pABBKl 95 ± 3

Европ. часть) 1 PAB6K2 150 ± 5

pAB6K3 225 ± 15

pAB6K4* 2б5 * 15

СЗЦ2, СЗЦ(Н)2 pABSZCl 135 1 3

(СССР. Ср. АЗИЯ) PABSZC2 175 ± 5

ТС (СССР, Ср. Азия) • pABTCl 40 ± 3

РАВТС2 65 ± 3

рАВТСЗ 115 ± 3

PABTC4 >135 ± 3

pABTCS 165 ± 5

pABTCS* >600

КИ77 (Сенегал) pABKRl 40 ± 2

PABKR2 70 ± 3

рАВКНЗ 175 ± 5

VII-! (Индия) pABVl 150 ± 5

Ш796 (Австралия) pABUl 135 ± 3

БН404, БН406 (СССР, pABSHl 135 ± 3

Зап. Сибирь) pABSH2 150 ± Ь

* - непостоянно выделяющиеся плазхиды.

** - предположительно два репликона данного MP.

lum (Singh, Wenzel, 1982; Шиляева, Ёоровок, 1989).

Два штамма, • выделенных из такыровидных почв Средней Азии -СЗЦ2 и СЗЦ(М)2 обладали сходными плазмидными наборами; их идентичность была подтверждена с помощью рестринционного анализа суммарной плДНХ, выделенной из клеток этих двух штаммов. Расчеты числа копий обнаруженных плазмид на клетку показали, что оно не превышает 1-2 для каждой из плазмид. Показано, что многие факторы, традиционно используемые для элиминации плазмид (инкубация при повышенной температуре 40-41°С, бромистый этхдий, акридин оранжевый, нито-мицин "С" и некоторые др.), не давали.возможности эффективно "излечивать" от эндогенных плазмид клетки азоспирилл. Удалось получить всего несколько клонов с утраченной полностью либо делегированной той или иной плаз ни до й.

В наших исследованиях не удалось определенно связать известные свойства и характерные особенности (наприкер, устойчивость к Ар/Св или Тр) A. brasilense с той или иной конкретной эндогенной плазми-дой. В то же время, в ряде случаев (штаммы Sp7, 94-3, ТС) исчезновение (на электрофореграмме) плазмиды с MP 135 тпн сопровождалось изменением морфологии колоний (наблюдался т. н. R»S-переход). Восстановление исходного типа колоний (R) сопровождалось появлением невыявляемой ранее у S-клонов электрофоретическими методами плазмиды. Скорее всего этот феномен мог быть связан с процессом встраивания-исключения 135 тпн плазмиды в хромосому A. brasilense.

Таким образом, каши результаты также позволяют подтвердить ранее сделанный вывод (Dôbereiner, Pedrosa, 1987) о широком распространении плазмид в клетках Л; brasilense. Наличие одинаковых ппаз-кидных классов (типов) в различных по географическому происхождению штаммах, известная трудность элиминации обнаруженных плазмид предположительно могут свидетельствовать о их значительной роли в функционировании -азоспирилл.- Обнаружение мегаплазмид (с MP более 300 тпн) в клетках азоспирилл дополнительно подчеркивает сходство последних с такими почвенными бактериями как ризобии и агробакте-р- и, которые, активно взаимодействуют с растениями.

2. Природные я гибридные R-плазмиды в клетках бактерий A. brasilense.

В связи с тем, что у бактерий Л. brasilense до сих пор не обнаружены собственные системы передачи генетической информации (Elmerich, 1986), было решено оценить способность клеток азоспирилл воспринимать к наследовать природные и гибридные R-плазмиды из нес-

кольких Inc-групп. Предполагалось, что на основе наиболее эффективно передающихся репликонов ножно будет создать искуственную сис-тену конъюгации для этих бактерий.

Передача трансмиссивных плаз ни д в клетки Л. brasilen.se осуществлялась из нескольких донорных штаммов Е. coll (обычно из С600 и НВ101), используя скрещивания на агаризованной среде.

2. 1. Плазмиды широкого круга хозяев в клетках A. brasllense. Известно, что трансмиссивные плазмиды из IncPl-, IncW- и IncN-групп, объединенные общим названием "плазмиды широкого круга хозяев", с высокой частотой передаются в клетки многих грам-отрица-тельных почвенных бактерий и стабильно в них наследуются. В наших экспериментах lncPi-плазниды (RP4, PRP5.10, R751 и R306) передавались в клетки A.brasllense с частотами Ю-4-10 С еще большей

частотой те же плазмиды передавались между клетками различных шта--2 -1

ммов A. brasllense (10 -10 ). Частоты передач lncW-плазнид (ps-a.

—fi —э

к R388) были в целок ниже: из Е. coll в A. brasllense г 10 -1.0 ,

-4-1

между азоспирилламк - 10 -10 . Передача IncN-плазмиды R15 как из

E.coli в клетки A. brasllense. так и между штаммами аз о спирилл осу— о

ществлялась крайне неэффективно, с частотами от менее, чем 10 до — в

10 (в зависимости от реципиентного штамма). Возможно, .это

связано с нестабильностью IncN-плазмиды'в клетках нового хозяина

(Tardif, Grant, 1980). Среди 12 испытанных ..штаммов Л. brasllense,

только один (ТС) воспринимал нирокотрансмиссхвные плазмиды с час- 9 - 7

тотами около 10 -10 независимо от того, передавались ли они хз клеток Е. coli или азоспирилл. . s

Наиболее стабильно наследующимися в клетках A. brasllense были lncPl-плазмияы. (исключая pRP5. 10). которые сохранялись в клетках транскокьюгактов даже при выращивании в несепективных условиях в течение 20-30 генераций. Было отмечено, что инкубация транскокъю-гантов 94-3 (RP4) при повышенной температуре (40-41°С) приводила,к появлению "утяжеленных" вариантов RP4, которые, как показал pe<jT-рикционный анализ, могли быть следствием внедрения IS-подобных элементов A. brasllense в IncPl-плазииду. Из двух IncW-плазмид(pS-а и R388) в клетках Л.brasllense наиболее стабильно наследовалась .388. В ряде штаммов, таких как Sp7, jH82Al и 94-3, плазмида pS-a претерпевала структурные изменения (делеции и увеличение HP), но сохраняла способность к обратной передаче в Е. coli. Для штамма Sp7 была отмечена высокая частота интеграции ps-a с геномом трансконь-югантов, что сопровождалось четко выраженной морфологической гете-

рогенностью их колоний.

2. 2. Передачу плазнид из 1ncC-, InсТ- и Incx-групп (соответственно, R40a, Rtsl и R6K) в клетки Л. Jbrasiiense зарегистрировать не

- g

удалось (частота менее 10 ). В то же время можно предположить, что сама конъюгация осуществлялась, но отсутствовала автономная репликация переданных плазнид в A. brasilense также как, например, в случае с IncF- и IncI-плазмидами в клетках P.aeruginosa (Krishnapillai, 1983).

2. 3. Экспрессия маркеров знгябиогикоусгойчивосги в клетках Л. brasilense. В клетках A. brasilense экспрессировались практически

все маркеры R-плазмид, определяющие устойчивость к антибиотикам.

R R R

Исключениями являлись маркеры Ар /Св (ген Ыа) и Cm (ген cat). Отсутствие выражения этих фенотипических маркеров использованных плазмид, вероятно, связано с "несовместимостью" промоторных зон генов Ыа и cat с РНК-полимеразой A. brasilense (Fani et al., 1988). Следует отметить, что экспрессия такого "популярного" маркера, как ТсН(например, плазмиды RP4) в клетках A. brasilense невозможна без предварительной индукции. Эта процедура заключается в инкубации транскоиъюгантов азоспирилл в среде с небольшим количеством Тс (0,3-0,5 мкг/мл) в течение 2-3 ч.

2, 4. Гибридные (ColE 1-RP4) плазмиды в клетках A. brasilense. Известно, что ColEl и подобные ей плазмиды (pBR322 и др.) функционируют преимущественно только в клетках бактерий кишечной группы. К моменту на'чала наших исследований информация возможности или неспособности Со1Е1-подобных плазмид поддерживаться в клетках азоспирилл отсутствовала. Получение ее было связано с использованием двух гибридных (ColEl-НР4)-плазмид, являющихся Тп7-производ-ными вариантами pAS8 (Степанов и др., 1976): pAS8-101 и pAS8-l21 (Урлапова, 1980). В первой плазмиде оба репликона, ColEl и RP4,

являются интактныни. во второй функционирует лишь ColEl, так как

R R R

область repRp4 повреждена вставкой Tn7(Tp Sm /Sp ). Если частота передачи pAS8-101(kanRp4::Тп7) в клетки A.brasilense составляла 1г"3-ю~2 (табл.2) и была сравнима с частотой передачи RP4, то перенос pAS8-121 был крайне неэффективен. Анализ образцов плДНК транскоиъюгантов A.brasilense на основе штаммов Sp7, 94-3 и 6К, воспринявших все маркеры pAS8-121 (TcR, KmR, TpR, SmR), показал, что в них присутствуют только эндогенные плазмиды азоспирилл, значительно превосходящие по MP pAS8-121(около 80 тпн). Во всех транс-коньюгантах, содержавших pAS8-101, была обнаружена дополнительная

10 Таблица Z.

Передача кокъюгативкых (Тга+) и неконъюгатквных (Tra~, МоЬ+) природных и сконструированных плазмид в ^летки некоторых штаммов A. brasllense.

Донорный штанн Передаваемая Селек- Частота передачи или мобилиза

тивный цик плазкиды в клетки штамма:

Е. coll

плазмида

маркер

Sp7

6К

jM82Al

lncPi(Tra+):

С600 RP4 K»r 2,5xl0~2 2xlO-1 4X10~3

j53 R751;:Tn5 KmR 2xl0~3 8xl0-3 HO **

j53 R906 suRSmR 6xlO~3 HO 10"4

IncPl(Tra~)s

HB101(pRX2013) pIAFRl ■TCR ' ю"3 : t,5xlO~3 HO

ИВ101(pRK2013) pRmSL26 TcR 9Xlo"4 IQ"3 HO

S17-1 pRmSL26 TCR. HO. 9xlO~4 HO

R -4 -4 :

HM294(pRX2013) pRZl TC 5X10 4 7X10 * HO .

MM294(pRK2013) pRZ4 TCR l,5Xlo'4 HO

H- гибридные"(ColEl -RP4) •

j53 PAS8-101 TcRSmR 1,5X10"3 1,5x10~2 HO

HB101 PAS8-121 KaR 1.0-7 2xl0~7 HO

HB101 ßAS8—121Д16 KaR 2X10~6 1,5X10-6 HO

IncW(Tra+)

j53 pS-a KaRSnR 2xl0~4 HO 2X10-3

j53 R388 SuRTpR 3xlO~3 3xlO-2 HO

IncN(Tra+): 3xlO~8

C600 R15 SaRSuR 2xl0~7 8X10"9

IncQ(Tra')

C600(pRK2013) RSF1010 SaRSuR 5xl0~3 8xl0-2 HO /

S17-1 RSF1010 SmRSuR l,5xl0~3 2X10-2 но/

HB101(pRK20X3 ) PKT210 1 SmR 2xlO~3 .4,4xl0_3 HO

HB101(pKR2013) PKT214 SmRTcR IG'3 2xl0-3 ?»

S17-1 РКГ214 SJBRTCR 4X10~3 3xl0-3 но

* - штаммы С600, j53 и KK294-RecA+, HB101 il S17-l-RecA~; плаз МИДа pRK2013 использовалась как "помощница" в трехродитольских скрещиваниях; "мобилизующий" штамм S17-1 содержал интегрированную с хромосомой плазмкду RP4-2(tet::Mu, kanj:Tn7);

** - НО, не определяли '

-Ileo гпн плазкида. Таким образом, низкая частота передачи pAS8-i21 в клетки Л. brasileiise, а также отсутствие ее во фракции плДНК транс-коньюгантов, свидетельствовали как о неспособности ColEi-репликона автономно функционировать в A.brasilense. так и о возможной коин-теградии гибридной плазмиды с геномом нового "хозяина" за счет IS8 или Тп7-эленентов, входящих в ее состав (Дубейковский, Каменева, 1984).

Наряду с pAS8-121 в клетки A.brasilense передавался и ее делегированный вариант рАв8-121Д16 (Муронец с соавт., 1985); эта плаз-£

мида, утратившая Тс -маркер и Тл7 встраивалась в геном азоспирилл с

частотами до 5хю"6(штанм 94-3). "Обратная" передача pAS8-121A16, а

также PAS8-121, из клеток A.brasilense в Е.coli проходила с часто--3 -2

тами 10 -10 . Показано, что и обмен интегрированными плазмидами

типа pAS8—121Д16 между штаммами A.brasilense также возножен(10~6-— 5

Ю ). Более того, отдельные донорные штаммы(например, sp7::pAS8-121Л16) способны обеспечивать мобилизацию хромосомных маркеров с частотой до 10 6, что создает предпосылки для проведения экспериментов по картированию хромосомы A.brasilense. Вставки pAS8-l21 и ее производных вариантов, как правило, очень стабильны в геноме азоспирилл и сохраняются при длительных пассажах трансконьюгантов на неселективных средах. Плазниды типа pAS8-121Al6 инеют очевидное преимущество по сравнению с RS8. 45, которая также может быть использована для картирования генома A.brasilense (Franche et al., 1981). оно заключается в том,что они обусловливают передачу хромосомных маркеров с заведомо "фиксированного" локуса(Каменева и др., 1986).

2. 5. Мобилизация неконьюгативных природных и векторных плаЬмид в клетки A. brasilense.

Одним из традиционных подходов в генетике почвенных диазотроф-ов(например, Rhisobium или Azptobacter) является клонирование в их клетках Собственной или чужвродиой генетической информации на векторных плазмидах. В настоящее время широко используются две системы клонирования, одна из которых базируется на малокопийных IncPl-репликонах (векторы pRK290, pLAFRl и их производные), вторая - на неконъюгативных мультикопийных плазмидах из группы IncQ/P4(RSF1010 R300B, R1162b

. 2.5.1. Мобилизация плазмид pRK290 и pLAFRl и их производных в . клетки азоспирилл осуществлялось как с помощью трехродительских скрещиваний (Ditta et al., 1980), в которых роль плазмиды-помощни-

цы играла. pRK2013, так и из "мобилизующего" штамма E.coli S17-1 (Simon et al., 1983). И pRK290 и космида 'на его основе - pLAFRl (Long et al., 1982) передавались в клетки A.brasilense с относительно высокой частотой(табл. 2) и стабильно наследовались в клетках трансконъюгантов (после 30 генераций обнаруживалось всего несколько процентов бесплазнидных клеток). Обязательное условие для достижения высокой частоты передачи плазмид pRK290, pLAFRl и их дериватов в клетки A.brasllense заключалось в предварительной индукции экспрессии единственного селективного маркера этой серии вер

кторных плазмид - Тс (см. выше). В противном случае частота передачи плазмид, регистрируемая на селективной среде с Tclg без индукции, отличалась от реальной на 3-4 порядка. Стабильное наследование векторных IncPl-плазмид в клетках Д.brasilense позволило в дальнейшем оценить в них экспрессию некоторых генов R.melilotl, клонированных в составе pLAFRl(см. ниже).

2. 5. 2. Мобилизация плазмиды RSF1010 и ее производных рКТ210 к

рКТ214.

1псО/Р4-плазмида RSF1010(Grinther, Barth, 1976) является "базовой" для большого семейства мультикопийных векторных плазмид широкого круга хозяев pKT(Bagdasarian et al., 1979; 1981). Помимо использования для клонирования, они с успехом применяются также для оценки эффекта нультикопийности клонируемого., генетического матери-ana(Knight et al., 1986). Мобилизация IncQ-плазнид в клетки Д.brasllense осуществлялась с приблизительно равной эффективностью(табл 2)как с помощью трехродительского скрещивания, так х из "мобилизующего" штамма É.coli S17-1. Как следует из табл.2, частота мобилизации не зависела от RecA-фвнотипа донорных штаммов и составляла

-3 -2

10 -10 .В клетках A.brasilense IncQ-плазмиды были также мульти-копийкы, как ив£Г. coli : RSFIOIO - до 25 копий на клетку, рКТ-ве-кторы - до 20. Мультикопийное состояние IncQ-плазмид в азоспирил-лах совершенно определенно зависело от селективных условий выращивания трансконъюгантов. В отсутствии селективного давления транс-коньюганты достаточно быстро утрачивали IncQ-плазмиды (в первую очередь. рКТ): за 20 генераций накапливалось до 85% бесплазнидных клеток. Ранее подобное явление было описано и для некоторых других почвенных бактерий, включая R.melilotl (David et al., 1983).

Мобилизацию IncQ-плазмид можно было наблюдать и между штаммами

» о

A. brasilense (с частотой до 10 ). Как правило, использовался следующий тип скрещиваний: донор A.brasilense : : pAS8-121A16(RSFIOIO

или рКТ-вектор) х реципиент Л.brasilense Rif . В том случае, если донор и реципиент являлись производными вариантами одного штамма,

то мобилизация, например RSF1010 в присутствии RP4, происходила с

-2 -1 частотами 10 -10

Ранее было показано, что мобилизующими свойствами в отношении RSF1010 могут обладать и трансмиссивные плазмиды некоторых почвенных бактерий(Sato, 1984). Наши попытки мобилизовать RSF1010 из А. brasilense (штаммы 6К, Sp7, KR77 и ТС) в А. brasilense или E.coli "силами" эндогенных плазмид, "подозревавшихся" на трансмиссивность, оказались безуспешными.

3. Влияние R-плазиид на физиологию и морфологию азоспирилл.

Все использованные, включая векторные, как правило, но оказывали какого-либо влияния на основные (легко тестируемые) фенотипи-ческие признаки Л. brasilense; азотфиксирующая активность, морфология и цвет колоний, двигательная функция и хемотаксис и др. В то же время, для штамма Sp7 была отмечена высокая частота встраивания плазмиды pS-a(IncW) в бактериальную хромосому, что сопровождалось четко выраженной морфологической (по размерам) гетерогенностью колоний трансконыогантов. В ряде случаев R-плазмиды вызывали некоторое снижение у- трансконыогантов продукции гетероауксина (ЛУК), что в какой-то мере напоминало эффект, вызываемый XncW-плазнидами в клетках агробактерий (Чернин и др., 1983). Нами было показано, что введение плазмиды RSFlÖlO(IncQ) в S-клоны штамма Sp7, часто приводило к тому, что трансконьюгантные клетки утрачивали способность к движению, становясь фенокопиями Mot~/Fla~-MyTaHTOB. После элиминации RSF1010 из клеток Л.brasilense двигательные функции "бывших" трансконыогантов восстанавливались. Этот эффект требует , дополнителдьного исследования.

4. Инсерционный мутагенез А. brasilense.

Тот факт, что Со1Е1-подобные репликоны не способны реплицироваться в клетках А.brasilense (см. выше), позволил использовать сконструированные на их основе плазмиды в качестве векторов для передачи Tn-элемэнтов в А.brasilense.

4. 1. Транспозон Тп7 в клетках Л. brasilense.

Проводя селекцию трансконыогантов в скрещиваниях типа: E.coli (PAS8-121) х л.brasilense по маркерам транспозона Tn7(TpR SraR/SpR) удалось показать, что до 807. их не несут маркеров самой плазниды,

т.о. были KmsTcs. Это свидетельствовало о транспозиции Тп7 в геном

— 7 - R

азоспирилл, которая осуществлялась с частотами 5x10 -2x10 в за-

висимости от штамма-реципиента. Среди более, чем 2000 анализированных Тп7-клонов ¿таймов Sp7 и 6К отсутствовали ауксотрофные и какие, -либо другие мутанты, что могло быть, связано со специфичностью встраивания Tn7(Rogers et al., 1986). в то же время, вставки самой плазмиды pAS8-l21 и ее варианта pAS8-l21A16(CM. выше) в геном А. brasílense (штаммы Sp7,94-3 и 6К), осуществлявшиеся чаще всего за счет IS8(Муронец и др., 1985), давали возможность отбирать, по крайней мере, ауксотрофные мутанты (до 1, 2% от всех KmR-KnoH0B, образовавшихся в результате плазмидных вставок), которые отличались достаточной стабильностью (частота реверсий менее Ю-5).

4. 2. Тп5 и его производные варианты в клетках Л.brasílense.

"Неспособность" Тп7 производить фенотипически выявляемые мутации побудило нас использовать транспозон Tn5(Berg, 1976) и созданные на его основе дериваты (Berg, Berg, 1988). Их введение в геном бактерий Л. brasílense осуществлялось из мобилизующего штамма E.coli S17—1 (см. выше), несущего векторную плазмиду pSUP202 (Simon et al., 1983) с тем или иным транспозоном. Плазмида pSUP202, созданная на основе ColEl-подобной pBR325(Маниатис и др.,1984), также не способна автономно реплицироваться в Л. brasílense■и потоку является своеобразным вектором-"самоубийцей"(суицидальным вектором).

4.2. 1. Создание суицидальных рвЦР202-векторов, несущих синтетический транспозон ТпУ.

В отличие от Тп5 и TnS-Mob, находившихся на .pSUP-векторах (Simon et al., 1983), имевшийся в нашем распоряжении синтетический транспозон TnVíTnS-RePpgpj^) (Furuichi et al., 1985) был исходно клонирован в ДНК теркоиндуцибельного бактериофага PltsCmR (Rosner, 1972), который не способен эффективно инфицировать A.brasílense и, таким образок, обеспечивать передачу TnV. In vivo была осуществлена селекция плазмид pSUP2Q2::TnV в системе скрещиваний типа: S17-1 (PltsCmR::TnV, pSUP202) х C600RifR при 40°С. С помощью трансформации вновь созданные векторы с индексом pIB: pIB7(tet::TnV), pIB9 я pIB50(cats:TnV),pIB19 и pIB53(bla::Тп5) были переданы в клетки мобилизующего штамма E.coli S17-I, из которого они эффективно передавали синтетический транспозон TnV в такие бактерии как P.putida, R.melilotí, A.tumefaciens и A.brasilense.

4.2.2. Встраивание Tn5, Тп5-ИоЬ в геном азоспирилл.

Основные характеристики процесса интеграции Тп5-подобных тран-спозонов в геном A.brasilense представлены в табл.3.

R

Селективным маркером для отбора транспозантов служил Km г час-

Частоты встраивания транспозонов Тп5, Тп5-МоЬ и ТпУ в геномы некоторых штаммов А.ЬгазИепБе(отбор Тл-клонов производился на среде, содержавшей ¡Сю).

Штамм-реципиент : :Тп5 ::Tn5-Mob : :TnV

Sp7(АТСС29145) 10"7(10)* -7 ** 2X10 (НО). 8Х10~8(8)

6К 6Х10~6(25) 7Х10-6(НО) 10~7(18)

94-3 10_б(15) ЗхЮ~6(Н0) . Зх10~7(11)

jM82Al 10~9(Н0) 10~9(НО) Ю-9 (НО) ,

* - в скобках приведены частоты (в У.У.) одновременного наследо р

вакия маркера Тс вектора рБиР202; ** - НО, не определяли.

р

тота спонтанного образования Km -клонов среди использованных штам-

- 9

мов-реципиентов A.brasilense была менее 5x10 . Вставки интактного Тп5 в геном A.brasilense приводили к появлению у транспозантов дополнительной устойчивости к Sm(AO 50 ккг/кл), что ранее было отмечено для других грам-отрицательных микроорганизмов, не относящихся к энтеробактериям(O'Neill et al., 1984). В клетках A.brasilense тракспозоны Тп5-МоЬ и TnV не обеспечивали устойчивость к Sm в свя-31 с тем, что при их конструировании произошло нарушение Sm -области Tn5(Simon et al., 1983; Furuichi et al., 1985; Mazodier et al. 1983).

D

Используя маркер Тс векторов pSUP202::Tn5-17 (Regensburger et .al., 1986) ир1В9, р1В53 (настоящая работа), удалось установить, что они могут интегрировать с геномом A.brasilense с частотой до 25%(табл.3). Ранее это было показано для таких бактерий как Rhizo-bium (Donald et al., 1986) и R.meliloti (Новикова и др., 1986) и установлено, что интеграция Тп-содержащих pSUP-векторов происходит за счет активно функционирующих ISSO-элементов, фланкирующих Тп5. Вставки суицидальных векторов, Тп5 и его дериватов в геном А.Ьга-sîlense приводили- к формированию стойких ауксотрофных мутаций (с частотой до 1,3%), мутаций, затрагивающих морфологию(8- и Н-формы) и цвет колоний (crt, каротинокдные мутации), аз ^фиксирующую активность (nif), а также подвижность(aot/fla) я хемотаксис (che). Мутанты последних двух классов формировались с частотой 3-6%, что. вероятно, связано с бог яим количеством соответствующих детерминант в геноме бактерий (Parkinson, Haselbauer, 1983).

4.2.3. Вставки Tn5-Mob в эндогенные плаз ни ды A brasilense..

Из-за больших МР эндогенных плазкид Л.brasilense не представлялось возможный с помощью электрофореза плДНК напрямую обнаружить клоны транспозантов, содержавших плазкидные вставки Тп5 и его дериватов. Наличие в составе Tn5-Mob mob-фрагмента RP4 (Simon et al., 1983) позволило отчасти разрешить эту проблему. Для этого в клетки 120 независимых (Tn5-Mob)-транспозантов штамма Л.brasilense 6К передали плазмиду RP4Akan,которая должна была сыграть роль "помощницы" в скрещиваниях типа:6К(крипт, пл. ::Tn5-Mob,RP4Akan) х Ul796RlfR Штамм U17S6 был использован в качестве реципиента, так как в его клетках содержится только одна криптическая плазмида, отличная от эндогенных плазкид штамма 6К (табл.1). Неожиданно оказалось, что из всех 120 донорных клонов 6К::Tn5-Mob(RP4Akan) происходила передача

КгоК-маркера. т.е. Tn5-Mob в клетки реципиента U1796 с частотами

- 9 - 7 R

10 -10 . Как правило, в Km -клонах U1796 обнаруживалась плазмида

RP4Akan::Tn5-Mob. Лишь из 8 клонов 6К::Tn5-Mob(RP4ükan) произошла

передача сразу двух репликонов: плазмида RP4ûkan и плазмиды, чей

МР соответствовал рАВ6К2(150 тпн)(табл. 1). Из всех восьми клонов

передача КшК-маркера осуществлялась с частотами 2х10~7- 8х10-7.

Обратный перенос плазмиды рАВ6К2::Tn5-Mob из U1796 в клетки 6К был

— 9 — 8

более, чем порядок ниже: 10 -10 , что, вероятно, объяснялось эффектом несовместимости двух "родственных" плазмид. Достаточно часто при обратном переносе рАВбК::Tn5-Mob возникали делегированные варианты этой плазмиды. Такой же низкой(около 10~8) была передача рАВбК::Tn5—Mob в присутствии RP4ükan в некоторые другие штаммы A. brasilense : Sp7,- KR77 и 94-3.

5. Прямое клонирование фрагментов генома А.brasilense.

Встраивание синтетического транспозона TnV и вектора pSUP202:: Тп5—17 в геном А.brasilense позволило провести ряд предварительных экспериментов по прямому клонированию его фрагментов, прилегающих к сайту интеграции.

5. 1. Использование вставок вектора pSUP202::Тп5-17.

Показано, что суицидальный вектор pSUP202::Тп5-17 с частотой до 25% был способен встраиваться в геном A. brasilense (см. раздел 4.2.2.). В нуклеотидной последовательности этой плазмиды имеются уникальные сайты для целого ряда "популярных" рестриктаз (EcoRI, EcoRV, Sinai и др.), что создает предпосылки для проведения прямого клонирования (Donald et al.,1985) фрагментов ДНК трансконьюгантов, граничащих с интегрированным вектором (рис.1). С помощью вставок вектора pSUP202::Тп5-17 нами была получена небольшая коллекция

- 17 -

V&

U II

Km

Ъ. , orlV' orlT Cm*- AP*-

Рис. 1. Интеграция вектора pSUP202-17, обусловленная IS50R(a) либо' XS50t(6), и экспериментальная схема ■прямого клонирования генома А.brasilense. Римскими цифрами обозначены: X - конъюгация, II - транспо з иция вбктора, III-VI: рестрикция ДНК мутантного клана, „лигирование, трансформация Е. coli, селекция Ар (Km )-трансформантов. Е - сайт рестриктазы EcoRI; волнистой чертой обозначена ДНК реципиента.

Mot~/FIa -мутантов. Тотальная(сумкарная) ДНК, выделенная из клеток двух клонов, р1В49 и р1883, была обработана в соответствии со схемой, приведенной на рис. 1. Конечным итогом такой процедуры явились две плазмиды,р1В49 и р1В83, в составе которых было клонировано 1,2 тпн и О, 7 тпн из генома штамма 6К, соответственно. Блот-гибридиза-цкя ник-транслированных плазмид р1В49 и р1В83 с клеточной суммарной ДНК штамма БК, обработанного рестриктазой EcoRI, дала положительный ответ.

5.2. Использование вставок транспозона ТпУ.

В составе синтетического транспозона TnV(Tn5-Reppgcl01) клонирован фрагмент плазмиды pSCIOl, содержащий район oriy-Rep(Furuichi et al.,1985). В составе нуклеотидной последовательности TnV отсутствуют сайты для некоторых рестриктаз, включая BamHI, EcoRI,Kpnl к

mv

»М^КгЛ f[S8QR

®rtv>>8Cl01

щениян, как на рис. 1 ( В, К, S - рестриктазы BamHl, Kpnl и Sali).

некоторые др., что позволяет использовать этот транспозон для прямого клонирования фрагментов генома.прилегающих к сайту транспозиции (рис. 2). С помощью TnV были получены также Mot~/Fla~- a Che"-мутанты. Используя две рестриктазы, Ваших и EcoRI, а также полное или частичное "переваривание" образцов суммарной клеточной ДНК TnV-клонов: ХВ103 и-IB154 (Mot~/Fla~), IB2H, IB312(Che"), были получены плазкиды, которые в сваек составе несли фрагменты ДНК A. brasi-letise 6К. Интересно, что плазкиды р1В103-1 и р1В154-1 содержали фрагненты генома БК, которые гибридизовались с ДНК плазмиды pRZl, несущей часть генов R. niel 1 loti Su47, контролирующих функции Mot"/ Fla" (Ziegler et al., 1986).

Таким образом,' транспозон TnV к некоторые плазкиды из серии pSUP202::Tn5 могут расширить использование продуктов инсерционного мутагенеза, которые станут одновременно являться как объектом клас-' сического генетического анализа, так я экспериментов по клонированию, гибридизации, и т.п.

В. Анализ экспрессии фрагментов генома клубеньковых бактерий в клетках A. brasílense.

Ранее была показана биохикико-таксономическая близость бактерий рода Azospirillum и группы RhizobiumfDe Ley, 1980). Установле- • но, что в составе генома азоспирилл присутствуют нуклеотидные пос-

ледовательностк гомологичные генам "хозяйской специфичности"(hsn и nod) R.melilotl (Vielle et al., 1988); гены exo A.brasilense способны конплементировать соответствующие мутации клубеньковых бактерий (Michiels et al., 1988). В наших экспериментах удалось выявить возможную гомологию нуклеотидных последовательностей mot/fla-областн R.melilotl Su47 и аналогичных фрагментов генома A.brasilense (см. раздел 5.2.). Вопрос о том, может ли генетическая информация R.melilotl конплементировать мутации A.brasilense остается дискуссионным, так как неясно, способны ли гены R.melilotl экспрес-сироваться в клетках. A. brasilense.

6.1. Хромосомные mot-fla-che-гены клубеньковых бактерий в A. brasilense.

В результате Tn-мутагенеза был получен целый спектр мутантов

A.brasilense .. нарушениями двигательных функций(mot), флагелярно-

го annapaTa(fla) и хемотаксиса(che). Наиболее стабильные мутации

*■ S

(с частотой реверсий не менее 10 ) были использованы для экспериментов по комплементации их фенотипов фрагментами mot-fla-che кластера клубеньковых бактерий люцерны, клонированными в составе плаз-мид pRZ, созданных Зпглером с соавт. (Ziegler et al., 1986) на основе коскидного вектора pIAFRl. Было показан- что гены R.meiiloti Su47 способны частично- восстанавливать лишь некоторые из полученных мутаций mot/fia, но не che. Используя метод Адлера, установлено, что клетки M0t~/Fla~-Kn0H0B (IB17, IB33, IB103 и IB154), содержавшие pRZl или pRZ4, приобретали способность к движению, хотя и менее активному по сравнению с клетками 6К. Способность mot/fla-генов R.melilotl Su47 комплементировать отдельные мутации A.brasilense может дополнительно свидетельствовать не только о гомологии соответствующих нуклеотидных последовательностей, но и о сходной регуляции их транскрипции.

6. 2. "Скмбиоткческив" гены R. meliloti в клетках Л. brasilense.

В составе космиды широкого круга хозяев pRmSL26, переданной в клетки A.brasilense "дикого типа" (табл.2), клонирована часть nod-генов из состава pSyji-плазмиды R.melilotl -nodDIABCI j f Long et al., 1983). Нами были получены трансконыоганты А.Ьгаь+lense на основе штаммов Sp7 к 6К, содержащие pRraSL26. Они были использованы для инокуляции стерильных проростков люцерны (около ю7 кл/проросток). Образование клубеньков нэ корнях люцерны наблюдать не удалось дажв после 6 недель инкубации обработанных растений. Трансконыоганты азоспирилл, несущие pRmSL26, вызывали лишь измен мие морфологии

- г° -

корневых волосков:их утолщение, ветвление и др. Невозможность формирования клуббньков на люцерне культурами Л.brasilense, содержащими pRmSL26, вероятно, связана с тем, что в составе переданной плазмиды отсутствуют необходимые гены хозяйской специфичности. - hsn; их нехватка не может быть компенсирована hsn-подобными локусами, обнаруженными у 'A.brasilense (Vielle et al., 1989).

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в клетках 12 географически разнородных штаммов A.brasilense присутствуют эндогенные плазмиды (от одной до шести), молекулярные размеры которых колеблются от 40 тпн до более чем 800 тпн. Характерным классом среди обнаруженных плазкид являются плазмиды с молекулярными размерами 135-175 тпн.

2. Широкотрансмиссивные плазмиды из IncPl- и IncW-rpynn с достато-

- 2

чно высокой частотой (до 10 ) могут быть переданы из E.coll в Л.brasilense; IncPl-плазниды стабильно наследуются в клетках азоспирилл, тогда как IncW-плазмида ps-a (но не R388) претерпевает структурные изменения даже в селективных услрвиях. Установ-

R R R

лено, чт маркеры R-плазмид - Ар /СЬ * Си не экспрессируются

р

в клетках Л. brasilense, а маркер Тс является индуцибельным.

3. Неконъюгативные векторные плазмиды из .IncPl-группы (производные RP4) и 1псО/Р4-группы (RSF1010, рКТ210 и рКТ214) эффективно мобилизуются как из E.coll в A. brasilense, так и между штам'мами А. brasilense с помощью Тга-функции XncPl-плазмид; в клетках А. brasilense 1пс<2/Р4-плазмиды поликопийны и стабильно наследуются (в отличие от IncPl-плазмид) только в селективных условиях.

4. Плазмиды на основе ColEl-подобных репликонов не способны автономно реплицироваться в Л.brasilense.Гибридные плазмиды, состоящие из ColEl и дефектной по репликации RP4 (плазмида pAS8-121 и ее производные),, встраиваясь в геном реципиентных штаммов A. brasilense, превращают их в потенциальные Hfr-штаммы необходимые для экспериментов по картированию генома.

5. Векторы pSUP (производные плазмиды pBR325), содержащие mobRp4-сайт, являются эффективным инструментом для введения транспозо-нов в геном A. brasilense; встраивание Тп5 и его дериватов (Тп5-Mob и TnV) в геном A.brasilense обеспечивает широкий спектр стабильных мутационных изменений.

- 218. На основе вектора pSUP202 создана in vivo новая серия суицидальных плазмяд (pIB), содержащих транспозон TnV (Tn5-ReppSC101), вставки которого в геном реципиентной бактерии позволяют проводить так называеноь "пряное" клонирование фрагментов ДНК, прилегающих к сайту транспозиции. 7. Продемонстрировано, что некоторые из mot-fla-мутаций A.brasile-nse могут быть комплементярованы с помощью фрагментов генного кластера mot-fla-che клубеньковых бактерий R.meliloti, клонированных в составе иеконъюгативной (мобилизуемой) космиды pLAFRl.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Баканчикова Т.К., Климачева В. А. , Боровок И. А. , Иайсурян А. Н. Плазниды Azos-irillum brasilense.//Молекулярная генетика, микроби-ол., вярусол. - 1S85.-N1.-С. 12-17.

2. майсурян А.Н., Баканчикова Т. И., Логосов В. 3., Климачева В. А. , Боровок Я. А. Генетические свойства Azospirillum brasilense.//Bionn. ВНИИ сельскохоз. Кикробиол. - 1.983. -N42. -С. 51-54.

3. Баканчикова Т.К., Лобанок Е. В. , .Боровок И. А. , Фомичева В. В. Влияние R плазмид íncP я IncW групп несовместимости на ауксинпродуци-руюдую способность втаммов Azospirillum brasilense.//B сб. ^Проблемы переноса генетической информации ( X всесоюз. совещ. "Плазми-да") .-М,-1985.-С. 27-28. '

4.. Боровок И. А. , Баканчикова Т.Н., Майсурян А.Н. Наследование и миграция R-плазмид в клетках ассоциативной аэотфиксирующей бактерии Azospirillum brasileña«.//Там же -С. 37-39.

5. Боровок И.А.. Майсурян А.Н. Мобилизация плазмид RSF1010 я pSA30 в клетка ассоциативной азотфиксирующей бактерия Azospirillum brasileñas. //Тан же -С. 39-40.

6. Боровок И. А., Майсурян А.Н. Транспоэонны! я векторный мутагенез в генетических исследованиях азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense.//В сб. : "Молекулярная биология я генетика плазмид" (XI Всесоюз. совещ. "Плаз ми да"). -М. -1986. -С. 61.

7.. Шиляева о. Н., Боровок И. А. Характер кет яка as т фиксирующих бак-теряй рода Azospirillum, выделенных яэ почв Западной Сябяри.//В сб. : "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" ( III Всесоюз. конф. ).-М. : ИГУ.-1988.-С. 72.

8. Боровок И. А., Найсурян А. Н. Использование транспозо'нов в генетических исследованиях азотфиксирующих ассоциативных бактерий Azo-spirillum brasilense.//B сб. :"Молекулярные механизмы генетических процессов" (VI Всесоюз. симпоз. ).-М. : Наука. -1987.-С. 156-157.

9. Боровок И. А., Майсурян А. Н. Разработка методов переноса генетической информации для азотфиксирующих ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense.//B сб. : »VI Съезд ВОГиС им. Н. И. Вавилова", -и. : Наука.-1987.-С. 15.

10. Боровок И.А. Генетический контроль азотфиксации у ассоциативных и свободноживущих диазотрофов (обзор). //С. —х. биология. -1987. -N10.-С. 76-85.

11. Боровок И.А., Погосов В. 3. Генетика ассоциативных и свабанно-живущих диазотрофов.//Молекулярная генетика микроорганизмов. Под ред. Г. И. Наумова.-М. : Наука. -1988.-Т. 24.-N7.-С. 96-107.

12. Боровок Н. В. , Майсурян А. Н. Наследование и функционирование природных и гибридных R-плазнид в клетках азотфиксирующей бактерии Azospirillum brasilense.//Генетика. -1988.-Т. 24.-N7.-C. 1166-1177.

13. Borovok I., Bakanchikova Т., Kortunova Е., Maisurian A. Trans-poson and vector mutagenesis of the nitrogen-fixing bacterium Azospirillum .rasilense.//Nitrogen Fixations Hundred Years After. Eds. H.Bothe et al. -New Kork: Gustav Fischer Verlag.-1988.-P.333.

14. Боровок И. а! Использование плазмид и. транспозонов в генетических исследованиях азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum. //Микроорганизмы в сельском хозяйстве (Республик, конфер. ). -Кишинев. -1988.-С. 36-48. ' ; '

15. Боровок И. А., Мякиньков А. Г. Инсерцяонный мутагенез азотфиксирующей бактерии Azospirillum brasilense.//Генетика.-1989.-Т. 25. -N1. -С. 36-48.

16. Шиляева О. Н. , Боровок И. А. К характеристике штаммов рода Azospirillum, выделенных из почв Западной Сибири. //Микробиологические исследования в Западной Сибири, под. ред. И. II. Клевенской. -Новоси-. бирСК: Наука.-1989.-С. 125-129.

17. Боровок И.А. Формирование ковалентнозамкнутых кольцевых структур транспозона TnV(Tn5-ReppScl01) в процессе транспозиции. //Докл. АН СССР.-1989.-Т. 309.-N3.-с. 724-728.

18. Боровок И.А. Использование мобилизуемых неконъюгативных плазмид широкого круга хозяев в качестве инструментов генетического анализа ассоциативных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasi-lenseV/reHeTHKa. -1990. -Т. 26.-N8.-С. 1380-1390.

IS. Боровок И.А. Транспозон Тп5 и его производные варианты эффективно транспозируются в широком диапозоне температур. //Генетика. -1990.-Т. 26.-N9.-С. 1690-1693.

20. Боровок И. А. Транслозиция составного синтетического транспозо-на TnV(Tn5-ReppSC101).сопровождается формированием миниплазмид pTnV, содержащих дефектные ISSO-элементы: //Молекулярная биология. -1990.-Т. 24. -NS.-С. 267-276.

21. Borovok I.A. Mutagenesis and direct cloning of mot/fla and che genes of Azospirillum brasilense by use of the synthetic transpo-son TnV(Tn5-ReppSC101) // Abstr. 5th Intern. Symp. Nitrogen Fixation with Non-legumes. - Florence, Italy, 10-14.09.1990 - P. 100.