Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая рекомбинация в процессе конъюгации у Escherichia coli K-12

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая рекомбинация в процессе конъюгации у Escherichia coli K-12"

/ /

Главное Управление микробиологической промышленности при Совете Министров СССР

ВСЕСОШШЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

МНЦОВ Владислав Александрович

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ В ПРОЦЕССЕ КОНЪЮГАЦИИ У ESCHERICHIA COLI К-12

(03.00.15 - генетика)

Автореферат диссертации на соискание ученой стелем доктора биологических наук

ftocma 1981

| Оглел /яшертацк

'Работа выполнена в Ленинградском икстатуте ядерной физики гол .Б .П.Константинова АН СССР.

Официальные оппоненты: член-корреспондент АМН СССР, профессор А.Г.СМВРОНШЯ, доктор биологических наук, профессор А .А .ПРОЗОРСПЗ, доктор биологических наук, профессор В.Б.СЗОСОДОЖЦ.

Ведущее предприятие: Институт цитологии АН СССР, лаборатория радиационной цитологии.

Защита состоится 1982 г< в чао.

на заседании специализированного совета ДО 25.01.01. при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, Дорожная ул., д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан

1962 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В.К.Гордеев.

- 3 -

В В Е Д Е Н.И Б

Генетическая рекомбинация является одним из важнейших процессов в живой природе. Если еще 7-8 лет назад, говоря о рекомбинацииt мы ограничились бы указанием па ее главную и очевидную функцию -обмен донорного и реципиентного генетического материала и образование гибридного потомства, то теперь, благодаря применению методов генетической инженерии в генетике про- и эукариот, стали ясны те потенциальные возможности, которые заложены в рекомбинации для .реализации таких явлений, как хромосомные перестройки (дупликации, делеции, транслокации и инверсии), регуляция выражения'гена, неконтролируемый злокачественный рост и т.д. Иными словами, стала очевидна фундаментальная роль, которую процесс рекомбинации может играть в эволюции.

Новому взгляду на рекомбинацию мы во многом обязаны успехам, достигнутый в последние годы, в изучении так называемой незаконной рекомбинации (illegitimate reoombination) У прокариот, изучению IS -элементов и TpaHcno30HOB(starlinger, 1977; I960). Особенности этой рекомбинации является ее сайтспецифический характер, обусловленный энзимологической системой как самого is-элемента, или тран-спозона, так и бактериальной клетки. Можно предполагать, что на ранних этапах эволюции сайтспецифическая рекомбинация, обеспечивающая образование новых генов за счет рекомбинационных событий адди-тивно-эксцизионного типа, могла ш,;еть селективное преимущество. Дальнейшие этапы эволюции могли выдвинуть на первый план более тонкие механизмы, предусматривающие возможности рекомбинациошюго обмена между гомологическими структурами ДНК (см., например, Star-linger ,1980). В связи с этим интересен один'из основных результатов нашей работы - сайтспецифический характер общей гомологической рекомбинации у Е. coli . Доказательство этого факта не являлось самоцелью настоящей работы. Он выявился в результате систематических исследований процесса общей рекомбинации, которая проводится в нашей лаборатории на протяжении последних 15 лет.

В качестве экспериментальной системы мы избрали постконъюга-ционную рекомбинацию. Привлечение других систем рекомбинация, в том числе и адцитивно-эксцизионных (взаимодействие фактора У о хромосомой , распад плазмид), анализ которых представляет и самостоятель-'

нкй интерес, в основном преследовало цели понимания специфичности явления рекомбинации после конъюгации. Выбор конъгагационного cnoco-i ба направленной передачи ДНК не случаен, так как он позволяет nepe-i давать и вовлекать в последующую рекомбинацию сколь угодно большие фрагменты хромосомы е. coli . Это, в конечном итоге, дает возможность анализировать рекомбинационные свойства хромосомы в целом.

Актуальность проблемы. Хотя явление конъюгации и последующей рекомбинации достаточно интенсивно изучается последние 20 лет, тем не менее, многие важные вопросы продолжают оставаться предметом дискуссии, К числу их относятся прекде всего уровень рекомбинации (одно- или двунитевая ДНК) после конъюгации, судьба фрагмента до-норной ДНК в постконъшгациокннх мерозиготах, явление гетерогенности потомства экскоггъюгантов. Кларк с сотрудниками определили генетические детерминанты общей рекомбинации и ввели в литературу понятие о тале назш емых путях рекомбинации. Однако биологический смысл этих путей оставался загадкой. В настоящей работе ш попытались обобщит^ данные, имеющиеся в литературе, и собственные данные, чтобы дать единое представление о характере и способах прохоздения общей гомологической рекомбинации у Е. coli.

Исследование генетической рекомбинации у такого классического объекта молекулярной генетики, каким является Е. coli, следует отнести к числу фундаментальных вопросов молекулярной биологии прокариот. Результаты настоящей работы глогут найти применение во всех лабораториях, изучагацих проблемы рекомбинации, репарации и репликации как у про-, так и у эукариот, а также в лабораториях, решакщих прикладные задача и использующих методы рекомбинационного анализа в повседневной практике.

Основные задачи работы сводятся к следующему:

- доказательство одно- или двунитевого уровня рекомбинации молекул ДНК после конъюгации;

- анализ метаболических путей рекомбинации;

- судьба донорного фрагмента б конъюгациенной мерозиготе.

Научная новизна результатов. Впервые описано явление необычной конъюгации, названное "однонитевой конъюгацией", которое характеризуется протеканием рекомбинацаонного процесса на уровне однонитевой ДНК. Оно детально исследовано и сопоставлено с обычной двуни-тевой конъюгацией. Впервые показан сайтспецифический характер одно-

го из главных путей общей рекомбинации у б. coli • С использованием различных экспериментальных систем рекомбинации выяснена роль сайтов, названных вами fro , в реализации рекомбинации на разных путях рекомбинации у е. coll. Впервые выявлены необычные промежуточные продукты рекомбинации - замкнутые в кольца структуры донорной ДНК, обнаруживаемые в постконъюгациояных мерозиготах. Существование таких структур позволяет объяснить одно из самых загадочных явлений постконъпгациошюй рекомбинации - гетерогенность потомства экскоыь-югантов.

Экспершенталыше материалы, изложенные в диссертации, получены как самим автором, так и совместно с сотрудниками и аспирантами лаборатории молекулярной и радиационной биофизики ЛИЯФ им.Б.П.Константинова АН СССР, работавшими под его руководством.

Объем и структура работы. Диссертация содержит 227 страниц машинописного текста, 25 таблиц, 38 рисунков. Диссертация состоит из "Введения", главы обзорного характера, главы "Материалы и методы", трех экспериментальных глав и "Еыводов". Первые разделы 3 и 5-й глав представляют собой краткий обзор литературы, необходимый для постановки задач данной части исследования. Каждая экспериментальная глава заканчивается разделом "Заключение", который подыто-ливает данную часть исследования. Список литературы включает 233 наименований, в том числе 31 на русском языке.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены, на 15-й научной конференции Института высокомолекулярных соединений АН СССР, Л., 1968; теоретических семинарах по молекулярной генетике, Звенигород, 1968, 1981; Пущино-На-Оке, IS78; Луга, 197Э;Х1У Международном генетическом конгрессе, M., 1978; 17 Б се сока ном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", M., 1979; рабочем совещании "Генетика и молекулярная биология плазмид", Пущино-на-Оке, 1980.

Глава I

ГЕНШЧЕСЮШ И Э1ШШШП1ЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ РЕКОМБИНАЦИИ У в. coli £-13

В этой главе, написанной на основе данных литературы и результатов настоящей работы, изложены современные представления о механизме рекомбинации у е. coll • Отмечена роль экспериментального н

теоретического исследования пластических свойств ДНК - сверхскрученности, миграции перекреста и изомеризации структуры ДНК - в понимании процесса рекомбинации. Кратко рассмотрены разновидности рекомбинации и основные экспериментальные системы, используемые для ■ ее изучения. Описаны основные рексмбннационше гены и их продукты (гены геоА ' , гесВС и геоР ), метаболические пути рекомбинации ( RecBC , реализующийся в клетках гес-Р" , RecF (гесВС~вЪсВ~) й смешанный ЕесВСР (гес+ ) и сайтспецифический характер общей рекомбинации (сайты chi для геоВО -нуклеазы и сайты fre для гипотетической recP-зависимой эндонуклеазы).

Глава 2 M/iTBPIlAJH И МЕТОД!

В данной главе приведен перечень использованных штаммов Е. coli K-I2 (в работе использовали более 150 шташов, из которых более 100 было сконструировано в лаборатории, см.рис.1) и бактериофагов,содержится пропись сред для работы с бактериями и фагами, описаны методические подробности выполнения экспериментов.

Генетические методы включают методики конъюгации, генерализо- < ванной трансдукции, мутагенеза, а также рекомбинационный анализ, клональный анализ рекомбинантов и расчет коэффициента сцепленности маркеров.

Рекомбинационный анализ проводили на основе картирующей функции Холдеина w = 1/2(1 - которая связывает вероятность рекомбинации w •, физическую длину отрезка ДНК, на котором протекает рекомбинация, 1 , и масштаб генетической карты А - среднее статистическое расстояние между да угля соседними кросскнговерами. В эксперименте определяли коэффициент сцепленности маркеров у как вероятность наследования проксимального несёлектируемого маркера ореди рекомбинантов по дисталыюму селектируемому. Так как у = 1 - <7 , то, зная X , можно вычислить масштаб Я . Если анализируется несколько неселектируемых маркеров, зависимость 1п(1/2/> - 1 ) от 1 должна быть прямой, котангенс утла наклона которой будет равен ^/2 Получение такой прямой свидетельствует как о правильности картирова-г 1шя маркеров, так и о точности определяемого масштаба /\ в данной области карты.

Рис.I. Генетическая карта В. coli (по Bachmann, Low , 1980). Показаны маркеры, использованные в работе, и направления передачи хромосомы донорами. Показана локализация сайтов fre 11 , fre 12 и fre 111 в горячих областях рекомбинации fre I и fre II , соответственно.

Клоналыши анализ рекомбинантов. Рекомбинантше клоны первичного рассева анализировали методом перепечаток-на наличие про-тотрофного аллелл неселектируемого маркера. Если хотя бы о,дин из заданной Выборга клонов вторичного рассева показывал альтернативный генотип, первичный клон считали смешанным. Относительное число смешанных среда общего числа клонов первичного рассева считали долей гетерогенных клонов g]5 в %. Индексы 15 и I показывают, что данная величина найдена при выборке 15 клонов вторичного рассева, анализируемых по одному неселектируемому маркеру. Е работе будут встречаться и большие выборки.

Символ s - степень сложности гетерогенных .событий. Запись s = 4/15 означает обнаружение 4 тройных и более сложных наборов генотипов в клоне среди 15 гетерогенных клонов.

Коэффициент сцепленности маркеров. Запись .-í/tlir.+ _leu = 0,96 (300) означает величину сцепленности неселектируемого маркера leu с селектируемым thr , установленную при анализе 300 рекомбинантных клонов thr+ . Выборка 300 клонов в подобном анализе обеспечивает погрешность в определении величины /U +0,03 в 95$ доверительном интервале (1«1остеллер и др., 1969). Поэтому в зависимости от необходимой точности анализа выборку варьировали от 100 до 8С0 клонов.

Радиохимические методы включают радиоактивное самоубийство ре-, комбинантов (по методике Puerst, stent IS56), радиоактивную метку ДНК или ^С-тишном и методики ее измерения, радиоавтографию молекул ДНК (по методике Caima, 1963).

Биохимические метода включают определение активности ß -га-лактозадазы (по руководству Миллера, 1976), выделение ДНК плазмид и оценка их мол.веса (по методике Hansen, Oloan, 1978), обработка ДНК зццонуклеазоп рестрикции (по методике Alton, Vapnek, 1978).

Глава 3

СИНТЕЗ ДНК В ХОДЕ КОНЪЮГАЦИИ У Е. coli К-12.

ОДНОНИТЕВАЯ КОНЪЮГАЦИЯ

0 мехагошме бактериальной конъюгации. Основным стимулом к изучению механизма конъгагациошюй передали ДНК явилась сформулированная Ф.Жакобом и С.Бреннером теория решшкона и предложенная ими, в частности, решшконовая модель конъюгации (Jacob et al., 1963). Центральное положение этой модели предусматривало запуск специального конъюгационного синтеза ДНК, ответственного за передачу генетического материала донора в реципиент. Это экспериментальное предсказание модели вскоре.было подтверждено ноли методом радиоактивного самоубийства эксконъюгантов (Blinkova et al«, 1965) и друтаип авторами методом радаоавтографии эксконъюгантов (Gross, Caro, 1966).

Согласно репликоновой модели конъюгации все активные события,-' связанные с конъгагациокяым синтезом ДНК, развивается в доноре. Со- ' мнения в справедливости этого полсж&шш были впервые высказаны в

. - 9 -

работе Ф.Бонгеффера, которому удалось отобрать термочувствительную мутацию ВТ43 в гене dnaB / подавляющую как вегетативный синтез ДНК в реципиенте в непермиссивных условиях, так и выход рекомбинантов после конъюгации (Bonhoeffer, 1966). Эта работа стимулировала новые исследования, которые и завершились следующим выводом: -донор передает лишь одну нить своей ДНК с S -конца, передаче 1шти сопутствует специальный конъюгационный синтез ДНК, этот синтез имеет место в доноре, чтобы заполнить образовавшуюся брешь, связанную с изъятием одной нити, и вероятен в реципиенте (Bonhoeffer, Vielmet-ter, I968;0hki, Tomiaawa, 1968; Rupp, Ihler, 1968).

Возникли вопросы. Нужен ли коныогационный синтез ДНК в доноре для передачи ДНК? Нужен ли этот синтез в реципиенте, в чем загадка мутации ВТ43? Какова генетическая детерминированность конъюгацион-ного синтеза ДНК? В какой форме (одно- или двунитевой) ДНК донора приступает к рекомбинации в реципиенте? На каком уровне (одно- или двунлтевая ДНК) завершается рекомбинация? Эти вопросы отнвдь не исчерпывают всех деталей сложного многостадийного процесса конъюгации, но они подводят нас к главному вопросу о судьбе донорной ДНК в ходе рекомбинации.

Попытаемся ответить на эти вопросы.

Коныогационный синтез ДНК в доноре. Этот синтез оказалось возможным выявить радиометрически за счет подавления в доноре и реципиенте вегетативного синтеза ДНК с помощью термочувствительной по синтезу ДНК мутации dna ВТ43 (непермиссивные условия, 42°С).

На фоне остаточного внедрения радиоактивного тишша в неконъкь гирущие доноры и реципиенты наблвдается от 3 до 5 раз превосходящее внедрение за счет конъюгации. Данный конъюгационный синтез протекал только в доноре: он обнаруживался в присутствии налиднксовой кислоты (агента, неизбирательно подавлякщего синтез ДНК), когда донор был устойчив к яду, а реципиент нет, и не обнаруживался, когда донор был чувствителен к яду, а реципиент -нет.

Конъюгационный синтез ДНК в реципиенте. Термочувствительная мутация Т266 в гене dna В (КоМуаиа et al., 1966) по своим коныэ-" гационным свойствам отличается от мутации ВТ43. Хотя она так же,как и ВТ4.3, подавляет вегетативный синтез ДНК в неггермиссивных условиях, но не пнгибирует выход рекоглбипантов. Для селективной метки конъагациониого синтеза в доноре или реципиенте ш использовали ^ штаммы thy+ п thy" . Первые внедряют ^С-тимин на порядок менее

ю -

эффективно. Тогда комбинация thy+ и thy" доноров с thy+ и thy"-реципиентами может указать, через какого партнера протекало внедрение радиоактивности в непермиссивных условиях, т.е. какой партнер вел конъюгациошшн синтез ДНК.

В качестве доноров использовали thy+ или thy" штаммы Hfr H dna БТ4?.и У 0RF-2OC dna ЕГ43 (мутации BT42 и ВТ43 родственны) . Реципиентами служили thy+ или thy" штаммы CRT dna Т266 И CR 3443 dna ВТ43.

Анализ 16 возможных комбинаций убеждает нас в том/ что конькь гационный синтез ДНК как в доноре, так и в реципиенте обычно сопровождает конъпгационную передачу генетического материала донора (по данным с мутацией Т266). Мутация ВТ43 - случай исключительный, она селективно подавляет конъгагационный синтез в реципиенте, что и приводит к необычным последствиям, выражающимся в "рекомбинацион-ной дефектности" реципиента с этой мутацией.

Конъигационний синтез ДНК в реципиенте не требует рекомбинации. Итак, конъигационный синтез ДНК в реципиенте сопровождает конъюгацию, хотя и не нуген для собственно передачи донорной ДНК. Спрашивается, когда же он протекает, до рекомбинации или после. Чтобы от-' ветигь на этот вопрос проследим за поведением донорного фрагмента в реципиентах, не способных к рекомбинации из-за мутации гесА70 . Наблюдение за фрагментом мы вели по способности им производить -гаяактозидазу в реципиентах, лишенных этого свойства из-за мутации lac V z . Донор Hfr н передает нить ДНК, информационную для синтеза фермента, противонаправленный донор 'Hfr с - неинформационную (Kumar, Szyhalski, 1969). Только достройка комплементарной нити без участия рекомбинации может объяснять обнаруженную в опытах способность фрагмента ДНК донора Hfr С проводить такой не по мощности синтез фермента в мерозиготах гесА70 , какой дают мерозиготы от донора Hfr H . Это означает, что в норме однонитевой фрагмент донорной ДНК в реципиенте быстро достраивается до двунитевой формы.

Однокитевая конъюгация. Из данных, приведенных в предыдулдех разделах, ясно, что шкет .возникнуть необычная ситуация, когда только одна нить донорной ДНК окажется в реципиенте и должна будет ре-комбинировать с его ДНК. Этот необычный процесс направленной передачи ДНК, который по своим рекомбинационным последствиям должен скорее напоминать трансформацию, чем конъюгацию, мы назвали "одно-,

нитеиая конъюгация". Все дальнейшие эксперимент, описывакщие этот процесс, били виполнепы с двумя целями: проследить качественное отличие "однонитевой конъюгации" от обычной и доказать ожидаемый од-нонитевой уровень рекомбинации.

Ингибирущее действие пкзонтклеаз I и У. Условия, при которых удалось получить трансформацию у в." coli, заключались, прежде всего, в дефектности двух деградацконных экзонуклеаз акцепторной клетки I и У. Повреждение первой (мутация в гене пЪсВ ) повышало выход трансформантов в 4 раза, а дополнительное повреждение второй (мутация в генах гес ВО ) - еще в 5 раз (Oishi, Cosloy, 1972; 1974). Трансформация у разных микроорганизмов протекает на уровне однонитевой ДНК. Это, очевидно, справедливо и для е. coli (fox, 1978; Buitenwert, Venema, 1978). Если однокитевая конъюгация'напоминает трансформацию, то и для нее следует ожидать той же генетической детерминированности. И действительно, выход рекоыбинантов в контрольном штамме ECK 018: dna ВШ43 гес+ оказался подавленным на два порядка в непермиссивных условиях. У штамма ECK 016: dna ВТ-13 гесВс"аЬсВ" способность к образованию тех же рекомбикаятов при 42°С была в 15 раз выше.

Сравнение с генерализованной трансдукцией. Оценка масштаба генетической карты. При генерализованной трансдукции донорная Д1К в двунитевой форме интегрируется в хромосому реципиента (Sondri , Berger, 1980). Спрашивается, как изменятся, коэффициенты сцепленно-сти (котрансдукции) маркеров, если трансдукцию проводить в условиях, соответствующих или однонитевой, или обычной (двунитевой) конъюгации. Результаты анализа представлены в табл.1". Коэффициенты сцеп-ленности маркеров для однонитевой конъюгации оказатась меньшими, чем для двунитевой: ¿, ¿yj^. Отметим такяе, что сцеп-ленности для разных путей рекомбинации оказались равными yf, ,

ßz = jit с,. . Это показывает, что масштабы генетической карты в данной области хромосомы не только для обычной, но и для однонитевой конъюгации не зависят от пути рекомбинации.

Коэффициенты котрансдукции для RecF -пути рекомбинации Еыше, чем для НосВСР -пуги: U7 , . Величины же котранс-

дукции в реципиентах díía ВТ43 и dna+ при 42°С оказались одинаковыми : и,- - и г , U-, = Mg . Это показывает, что I ;етки toa ВТ43 не соде шаг каких-либо особенностей зглрещаящих прохождение дву-

_ i2 _ Таблица I

Коэффициента сцепленности маркеров ara и leu при однонитевой конъюгации и генерализованной трансдукции реципиентов dna ВТ43 И dna+ при 42°С. Донор - Hfг R4,

Реципиент Путь peKOi..-бина-ции Генотип Сцепленности при

конъюгащш трансдукции

(/ + / ara - leu leu+-ara

ЗСК 018 ЕСК 048 ЕСК 016 ЕСК 046 ЕосБОР ЕесР cLna ВТ43 dna+ dan. BW3 rscEC"abcI dna+ rec3C~ abcl (1) 0,7b (2) 0,95 (3) 0,76 (4) 0,96 (5) 0,68 (6) 0,69 (7) 0,88 (8) 0,88

БеличиШу^ определяли при анализе 500 клопов. Цифры е скобках используются в тексте как , м. ....

нитевых рокомбинационных процессов, и что в случае однонитевой конъюгация специфика процесса определяется лишь субстратом реком-бикационной реакции - однонитевой ДНК донора.

Теперь обратимся к сравнению масштабов генетических карт при однонитевой и обычной конъюгации. Для донора Hfr R4 в раосматри- ' ваемой области карты величина У- при обычной конъюгации составляет 24 ;шн. Зная коэффициент сцепленностц (^С = 0,76) и расстояние ыезду маркерами ara - leu по карте (0,3+0,4 мин) (Eachiian, Low, • 1980), мы, используя формулу Холдейна, ыояем вычислить параметр Д для однонитевой конъюгации. Он составил приблизительно I мин или 25 ЭД. Представленная оценгл - максимальна. 'Гакам образом, минимальное различие в масштабах карты для обычной и однонитевой конъюгации - 24 раза.

Особенности образования гетерогенного потомства. Рекомбинация при обычной конъюгации сопровогдеется образованней гетерогенного потомства, что выражается в способности отдельных мерозигот вы-щеплять более одного рекомбинаятного генотипа.

На рис.2 представлен возможный вариант образования смешанного потомства при однонитевой конъюгации. В данном слуае гетероген- 1

Рекомьинлц iq

деление

Рис.2. Схема образования гетерогенного потомства при одноните-. вой конъюгации. I -• ДНК донора во взаимодействии с дву-нптевой ДНК реципиента; 2 - гетеродуплексная структура рекомбинанта; 3 - коррекция реципиентного аллеля селектируемого маркера; 4 - смешанное потомствй.

ность рекомбинантного клона целиком зависит от наличия стадии коррекции реципиентного аллеля селектируемого маркера к донорпому аллели. Ясно видна одна особенность коррекционного типа гетерогенности: смешанное потомство может состоять только из двух рекомбинант-mix генотипов, т.е. степень сложности s должна стремиться к "О", тогда как при обычной'конъюгации она, как правило, 3/10.,

Клональный анализ эксконъюгантов на системе тесно сцепленных маркеров thr-ara-leu в скрещивании Hfr С х ECK 01 б dna ВТ43 геоВС" вЪоВ" (RecP-путь) показал следующие параметры гетерогенности

для клонов thr

'15

23$, S = 10/27 при 37°С и Of5 = 21%,

S s I/2I при 42°С. Изменение величины S от 1/2 (37°) до 0/14 (42°) зарегистрировано к для термочувствительных реципиентов EecBOF пути. Эти данные убедительно показывают, что однонитевая конъюгация на обоих путях рекомбинации характеризуется вшцеплением ожидаемого двойного набора генотипов в гетерогенном клоне. Это, очевидно, является результатом однонитевой интеграции донорной ДНК в хромосому реципиента.

Доказательство однонитевого уровня рекомбинации после однонитевой конъюгации. Попытки физико-химического анализа непосредственных продуктов рекомбинации, ст'оль успешно зарекомендовавшего себя при. изучении явления трансформации У Вас. subtilis (см.обзор Fox, 1978), генерализованной тран'сдукции у Salmoni lia ihyphinturiuri (Ebel-Tsipnia et al., 1972) И E.ccU (Sandrl, Berger, I960),

- 14 - '

при изучении конъюгации (Oppenheim, Rliejr, I96S;siddiqi, Fox, 1973) следует признать неудачными. И причины этого вполне объективны. Размзр ожидаемых фрагментов застройки донорной ДНК в хромосому реципиента при конъюгации слишком велик душ анализа с помощью ультрацентрифуги. Он составляет от 30 до 700 МД. Поэтому мы остановились на генетических методах сопоставления результатов однокитевой и обычной (двунитевой) конъюгаций.

Идею экспериментов иллюстрирует схема,-приведенная на рис.3. Мы уже упоминали, что противонаправленные доноры ( Hfr Н и Hfr С) . передают разные нити донорной ДНК либо информационную, либо неинформационную для прочтения РНК-полимеразсй и.поеледущей наработки продукта данного гена. Ген tax ответствен за синтез рецепторов к фагу Т6. Схема показывает, что только в случае однонитевой реком-• бинации при застройке неинформационной нити должна проявиться за- . держка г чинетике вьпцепления фенотипа tax3 . Именно такая ситуация и была выявлена в эксперименте.

РекОМБИНАция

рекомвинА-ция

* 21 рекомБинА-Х 1f имя

Tsx5

Tsx

Рис.3. Схемы фенотшшческого выражения дозорного маркера tax.

в транскоиыогонтах в случае: А - когда реципиент застраивает обе нити донорной ДНК, Б - когда реципиент застраивает одну информационную нить ДНК, С - застраивается ' только неинформационная нить. Доноршй аллель tsx8 показан черным крузкком, рециппентшш tsxr - полым кружком. Волнистая линия .отмечает информационную нить. Стрелка указывает I момент фенотипического выражения гена tsxc .

А

х

С

В принципе описанные эксперименты могут служить тестом для выяснения информативности нитей ДНК в пределах данного гена.

Возможности перехода от однонитевой конъюгации к обычной (дву-нитевой).

1. Конъюгация в условиях фенотипической супрессии мутации в гене dna в .

ВТ43 - термочувствительная мутация миссенс типа. Она способна к восстановлению функциональной активности продукта поврежденного гена при изменении ионной, силы среды. Увеличивая концентрацию НаС1 в среде при непермиссивных условиях, можно обнаружить восстановление активности продукта гена dna В (Ricard, Hirota, 1973). За этим можно проследить, анализируя способность клеток к образованию ре-комбинантов и к ведению синтеза ДНК, например, вегетативного синтеза. В подобном эксперименте нам удалось проследить не только восстановление двух указанных свойств, но и наблюдать изменение параметров рекомбинации у*/ и Л от величин, характерных дал однонитевой рекомбинации, до величин, ожидаемых при двунитевой рекомбинации.

2. Изменение гетерогенности потомства при температурном иог.е реципиентов dna ВТ43 в ходе конъюгации.

Идею экспериментов иллюстрируют схемы, представленные на рис.4..

Схем* А -±_

Ь

а 6

СхемдВ -±-±_

ИИГ

-â~—Г СхемлС

рекоиви-

нация

рекомеи-: нация

сегре-гацмя +

РеКОМБИ-ГГГ НАЦИЯ +

сегре- + i, гдция i.

Рис.4. Экспериментальные предсказания гетерогенном., потомства зксконъвгантов dna BTÍ3 при трех температурных режимах конъюгации, Схема А - при 42й. Схема В - при 37и. Схема 0 -передача проксимального неселектируемого маркера при 42°, а дистального

селектируемого при 37°С. ' '

а

Но это - идеализированные предсказания. В эксперименте, выполненном по схеме А, следует ожидать проявления коррекционяой гетерогенности, которую мы описнваш! выше. Б опыте по схеме В должна выявиться обычная гетерогенность. Наконец, 100$ гетерогенность, предсказываемая схемой 0 ,_может быть уменьшена 'за счет коррекционных явлений.

Результаты эксперимента, систематизированные в табл.2, согласуются с предсказаниями схеш С.

Таблица 2

Анализ гетерогенности клоноь dna+ по неселектируемому гчаркеру lac , отобранных е скрешиванш Hfr 0 х Еск 018 dne. ЕТ43 при разных температурных условиях конъюгация

Температура при конъюгация, Е °С H H1 у" dnaB+ - lac G Б %

37 1193 525 0,44 19

42 5317 ИЗ 0,02 21

42/3'/ 1430 256 0,18 46

4*

И - число проанализированных кленов ¿на : 1. - среди них рекой-бинантных по 1ас+ . а - доля секториальных клонов 1ао+/1ао~ среди рекомбипаитных (и») , выявляемая на ЭМС- 1ав-агаре.

Итак, варьируя температурный_режим.конъюгации, оказалось возможные: переключать однонитевую конъюгацию на двунитевую и наоборот.

Заключение. Мы начали с описания методического приема, позволяющего селективно выде.оягь коньигацпонкнй синтез ДНК. Использование это1'о приема позволило нам продемонстрировать наличие специального синтеза ДКК, сопутствующего конъюгации как в доноре, так и в реципиенте. Последний оказалось возможным запретить о помощью мутации ВТ43 в гене йпа Б . Это привело к необ1Гчной конъюгации, .названной нами "однонитевой", которая характеризовалась: I) резким увеличением частоты рекопбинационных обменов па единицу длины ДНК; 2) обедненностью гетерогенного потомства эксконъегештод. легко объясняемой однонктеЕЫм уровнем рекомбинации между еднонлтевым фрагментом ДНК"'Донора и хромосомой реципиента; 3) резким усилением вы-

хода рекомбикантов, ¡согда в ыерозигстах отсутствовали деградацион-ные экзонуклеазы клетки. Все это аналогично рекомбииациошшм событиям при трансформации у е. coli.

Затем привели генетические доказательства ожидаемого одно-нитевого уровня рекомбинации после однонитегой конъюгации.'Из экспериментов с генерализованной трансдукцией ясно следовало, что термочувствительные реципиенты dna ВТ43 способны проводить как одно-нитеЕые, так и двунитевые рекомбинационше застройки, т.е. они не являются рекомбинационпо дефектны!,ш. Все зависит о% субстрата ре-комбинационной реакции - одно- или двунитевой донорной ДНК. Логично заключить, что при обычной конъюгации, когда донорная ДНК еще до стадии рекомбинации достраивается до двунитевой формы, рекомбинация протекает на уровне двух нитей. В связи о обс£здаемым вопросом очень показательны эксперименты, демонстрирующие возможность переключения однонитевой конъюгации на обычную. Переход к условиям фенотилической супресспи мутации ВТ43 или переход от неперщссив-ных к пермиссивным условиям открывает возможности для конъюгацион-ного синтеза ДНК в реципиенте, образования двунитевого фрагмента ДНК донора, проведения рекомбинации на обычном двунитевом уровне с параметрами рекомбинационной реакции, характер1шми для обычной конъюгации.

Глава 4

• САЙТСПЕЦИ®ИЕСКИЙ ХАРАКТЕР ОБЩЕЙ РЕКОМБИНАЦИИ У Б. ooll

Сайты fyg . До недавнего • времени казалось очевидным, что . что гомологическая рекомбинация не может иметь на.хромосоме Б. colt областей, в которых процесс инициируется преимущественно, т.е. она не может тлеть горячих точек. Главным аргументом в пользу этого считалась возможность наблюдать виутригенные рекомбинационша обмены вплоть до единичных нуклеотидов. И действительно, такой строгой организации процесса, с какой мы сталкиваемся в случае сайтспецифи-ческой интегратнвной рекомбинации фага А (асишетрия сайтов узнавания, наличие узнащего белка и т.д.) в общей рекомбинации не обнаружено. Но, как во всяком процессе, основанном на белково-нукле-иновом взаимодействии, в рекомбинации отдельные нуиеотиднне naturell довательности могут обладать преиыу ютвом во взаимодействии с фер-

- IG - '

ментом либо из-за структурных элементов узнавания в них заключенных (палиндромы, шпилыш), либо из-за преимущественной деспирализа-ции и, следовательно, более быстрого связывания с инициирующим белком.

В последнее вреш накапливаются данные, свидетельствующие о существовании горячих точек рекомбинации на хромосоме е. coli . Это относится, прежде всего, к так называемым сайтам chi (обзор stahl, 19 73) для гесво -нуклеазы, выступающей в роли одной нз'эндонукле-аз рекомбинации. Это относится и к вариациям эффективности интеграции различных маркеров в хромосому Е. coll при генерализованной транедукшш (Shendel, 1977; Newman, liaaters, 1980).

В настоящей работе мы опишем сайты fre (от frequent recombination exchange) , обнаруживаемые после конъюгации на хромосоме Е. coli по их способности увеличивать частоту рекомбипационных обменов hp единицу длины ДНК в области локализации сайта или группы сайтов. Поэтому мы и начнем с анализа постконъюгацЕонной рекомбинации. Затем мы привлечем к рассмотрению явления, которые по сути своей являются сайтспендфическими,- это рекомбпнаииопные взаимодействия фактора Р и хромосомы клетки в ходе мобилизации хромосомы и интегративной супрессии. Наконец, рекомбинационшй распад плаз-мид поможет нам выявить локализацию некоторых сайтов fre .

Масштаб генетической-карты на разных путях рекомбинации. Если рекоглбинациошше обмены равновероятны в любой точке хромосомы Е. coli, то масштаб карты А , определяиций среднее расстояние между соседними обменами, должен быть величиной постоянной. Попытки измерить масштаб карты при постконъюгациошюй рекомбинации предпринимались неоднократно. Он оказывался Б мин (Жакоб, Вольман, 1962), 10 мин(Verhoef, DeHaan, 1966; Wu 1967),'20 глин (Wood, Y/almsly, 1969). 3 чем же причина непостоянства параметра X > в несовершенстве измерений или неравномерности распределения рекомбинационных обменов' вдоль рекомбшшрующих хромосом? Поиск ответа на этот вопрос и привел нас к обнаружении "горячих" областей рекомбинации на хромосоме s, coli . Однако, прежде всего, оценим масштаб в области карты, лишенной каких-либо аномалий. Такую возможность дает нам донор Ufr R4 (см.рис.1) в области карты ргоЛ - orgE . Параметр А оказался, большим (24 пин) и одинаковым для RecBCF и КесР -путей рекомбипапг.и.

Области хромосомы с повышенной частотой рекомбинмшонных нов. Локализация областей Гге I . и Гге II . Если для донора Н4 зависимость :оэффицнента сцепленностп селектируемого днстального маркера агвЕ+ с нееелектируемш.ш проксимальными (/О от расстояния между маркерами (1) носит ояащаешй экспоненциальный характер, то для донора нгг С ситуация совсем иная. Ее хорошо иллюстрирует рис.5, на котором зависимость " от 1 представлена для обоих доноров в форма удобной для графического определения масштаба Л

« I I 'S I 5<j I !

thr ¡fu proA (ос proC

Рис.5. Зависимость коэффициента сцепленности ^ селектируемого arg в с указанными неселектируемнмп маркерами от расстояния между маркерами по карте Е. coli. Скрещивание доноров Hfr R4 . Ufr С и Hfr CAB с реципиентом JC 7623 Reel" -пути рекомбинации.

Для донора Hfr с масштаб % перестает быть величиной постоянной (он оценен условно), частота рексмбпнациошшх обменов на едя-шшу длины ДНК возрастает, увеличиваясь по мере приближения к области In с - purB карта. В отличие от R4- этот донор передает некую генетичзскуга область, ответственную за увеличение частоты рекомби-нациошмх обменов. Назовем эту горячу») область fre I , а о Жакт изменения масштаба карты при рекомбинации в этой области Pre -яф-с^ектом.

Fre-эффгкт наиболее ярко выражен на RecF .-пути (клетки гесВС вЪсВ") рекомбинации, заметен, хотя и слабо, на RecBCF -пути (гео+) и подавлен на RecBC -пути (recF-) . Область fre I обнаруживается в посткоиыпгационяой рекомбинации и о донором нгг н . . Л с помощью доноров R 4 , F72 и Н 25 (см.рис.1) удается локализовать и другую область fre II около генов argE -ilv . Приблизительная локализа-' ция области fre III- между генами trp и his.

Масштаб Л в горячих областях fre I • и fre и составляет I мин для RecF -пути и 5 мин дая ПеоВСВ-пути. Отсюда яст причины различий величин масшФабов карты, полученных разными авторами.

О роли гена recF в рекомбинации. Если судить о роли данного гена в рекомбинации по изменению выхода рекомбинантов, то одиночная гдутация recF" никак себя не проявляет в постконъюгацион-. ной рекомбинации. По этому тесту она заметна только на RecP-пути. Однако, 'оли о рекомбинационной дефектности судить по частоте обменов на единицу длины ДНК, то мутация reo?" в реципиенте придает ему уникальше свойства. Такой реципиент ведет застройку фрагмента донорной ДНК целиком, производя рекомбинациокнне обмены по концам фрагмента. Сколько генетического материала передано донором при конъюгации - столько будет и застроено в хромосому рекомбинакта. Это следует из оценок коэффициентов сцеплепности далеко отстоящих маркеров, полученных в скрещиваниях доноров он 11 , К 4 и Mi с реципиентом ЕС;< 035 recF~

Этот результат является первым указанием на существование recF -зависимой эидонуклеазы рекомбинации.

Мобилизация хромосош фактором F . Сайты fre и элементы IS.

Ыы обратились к анализу явления хромосомной мобилизации в связи с изучением сайтспеплфпчеокого характера общей рекомбинации не случайно. Дело в том, что области fre in fre и содержат скопления точек начала передачи хромосомы донорами Н£г (см.рис.1), т.е. сайтов рекомбинационного взаимодействия медду фактором F , и . хромосомой е. coli . По современным представлениям такое взаимодействие происходит через элементы 1s 2 ели 13 3 , если оно гесА -'зависимое, или через элемент KT , если оно госА -независимое.

I. Генетическая детерминированность хромосомной мобилизации.

Эффективность мобилизации на Нес?-пути мы условно приняли за. 100$. Она оказалась столь высокой, что выход рекомбинантов, дава-

емый ею, сравнил с выходом рекомбинантов от доноров Hfr . Этот, уровень мобилизации не зависит от целостности гена recL , но прямо зависит от целостности гена гесР . Второй по эффективности -уровень мобилизации меток дикого типа. Он в 50 раз ниже первого. В известной мере он зависит от целостности генов .гесВС и reo? , так как повреждение в них образует третий уровень (в 4+6 раз ниже второго). Наконец, четвертый базовый уровень образуют штаммы гееА" Он на 4 порядка ниже первого. Итак, мы видим, что мобилизация и описанный выше Pre -эффект имеют,в принципе, одинаковую генетическую детерминированность: резкое усиление на Reel? -пути, ярко выраженную гесР -зависимость. Отметим, что речь вдет о мобилизации именно V -фактором, когда рекомбинация инициируется на IS -элементах. Мобилизация, фактором I" - lac, которая со всей очевидностью идет путем рекомбинации, между lac -фрагментом ДНК донора и гомологичным участком хромосомы реципиента, показывает совершенно иные результаты. '

2. Карта мобилизации хромосомы Е. coli .

Чтобы уловить корреляцию между местами преимущественной мобп-' лизации хромосомы фактором з? и областями fre , мы сняли так называемые карты мобилизации для доноров Р+ RecF- и RecBCF -путей рекомбинации метки . Они оказались одинаковыми для доноров различных путей рекомбинации. Единственное различие, как и ожидалось, было в абсолютном масштабе: на RecP -пути мобилизация на два порядка выше. Эффективности мобилизации изменялись более чем в 20 раз, принимая максимальное значение около маркера ilv и минимальное -около thyA . Карта демонстрирует по крайней мере две области по- • . вишенной мобилизации. Од^а совпадает с областями ire 1и fre 111 , а'другая - с областью fre II.

3. Модель мобилизации хромосомы фактором I1 .

Предлагаемая модель учитывает современные представления о механизмах коныогационной передачи донорнсй ДНК и последующей рекомбинации, а такг.е представлеш1е, развитое Кушевым (1974), о том, что частота полухиазгл должна быть значительно вероятнее частоты хиазм v. ■ Взаимодействие ?-фактора с хромосомой происходит через . IS -элвт» мепт. Оно начинается путем образования однонитевых . взрывов в ода;-' накошх сайтах р-фактора и хромоеош, обеспечиваемых reo? -зависимой эщю!,ухитеазэи. Переброска ДНК на уровне одно»- нити приводит

! к. сбралсвздиг.' полухиеиш перекрем торой может мигрировать?!

пределах is-элемента. В таком состоянии может начаться передача одной нити ДНК от сайта ori Т фактора F . Так как полухиазма нестабильна, в большнстве случаев она резертирует к первоначальному состоянию свободного Р -фактора и хромосомы. В редких случаях полухиазма переходит в полную хиазму с образованием стабильного Hfr .

riHTex'-paTimiia" с.упрессия ьа RecF-пути рекомбинации. Супрессия териочувствителыюсти репликации за счет интеграции фактора F в хромосому клетки (т.е. постановка репликации клетки под контроль F -ренликона) вместе с мобилизацией хромосомы фактором F , являются • примерами рекомбннациониого взаиыодспстшт г-фактора с-хромосомой. Достаточно очевидно, что оба явления дотам иметь одинаковую генетическую детермшшрОЕанностг.. Для подтвердив шш этого мы ограничились проверкой главного предс^занпя: патегративная супрессия должна резко усиливаться на Rec? -пути рекомбинации. И действительно, на этом п„ги супрессия возрастает з 20 раз-

Итак, во всех трех рассмотренных процессах (постконьвгационная рекомбинация, мобилизация, интегратпанал супрессия) достаточно слоя;-•мая и идентичная генетическая детерминированность. Сайт-специфичность общей рекомбинации проявляется в инициирования процесса гипотетической recF -зависимой пндонуклеазой на сайтах frs , которые могут обнаруживаться в составе xs-злементов клетки. Теперь мы опишем четвертую экспериментальную систему - распад плазмпды, которая, обладая той же генетической детермшшрованпостью, позволяет доказывать сайтспецифическую природу рекомбинации, в ней заключенной, и помогает локализовать сайты fre ■ в горячих областях рекомбинации. Рекомбипационная нестабильность плазмида, переносящей область fre L Нлазмида ORF-1 передает фрагмент хромосомы Е» со11, захватывающий всю область fra I или значительную часть ее в оле-дуздей последовательности маркеров:purE+ ~ t-чх3 - ргоС+ -1ас+. Эта плазшда ■происходит от донора OR 11 , образовавшегося при интеграции F-фактора б хромосому через элемент is 3 (см.рис.Г). Стабильность илазмкда в исходном стачме ORF -1/ f 517 обеспечивается за счет деления в хромосоме клетки всего фрагмента ДДС, захватеппого плазмидои в момент ее образования. Ясно, что при переносе плазглтды в клетки с кеделетирсвашюй хромосомой, ео структура долгша дестабилизироваться за счет рекомбинации, обеспечиваемой протяженной гомологией плазмпдной ДИК к хромосомой клетки.

1. Рекомбинацпоншй распад плазг.цуги на ПесВСР-путк.

Электрофоретический и гепетпческий анализ продуктов распада

плазшуш оир-1 после ее конъюгацлонной передачи в рсшшгснт лвп57 предполагает следущую схему распада: ОШ?-1 (ригЕ+ - 1,эх° - ргоС+ ~ 1ао+)—рСК-1(1;!ззс3 - ргоС+- 1ас+).Распад происходит сайтсие-цифпчески, т.е. по строго определенным местам, часть генетического материала исходно'! плазмиды с маркером ригЕ+ теряется, образуется новая плазиида рСК-1 с мол.весом 85 +2 ЦД. Предполагается, что в ее выцеллекяи принимает участие сайт £те 11 л элемент 13 3 фактора Р .

2. Рексмбинациоымй распад, плазшда на КесР-пут'.;.

Сочетание электройоретпческого и генетического отигз*РБ позг.о~

лило установить следущую схему сайтспецифпчос^ого реслягп иар«:.г.!-дк овр-1 после передачи в реципиент ¿с 7623 :

г 90Й, рСК-2 (ргоС+ - 1ас+) + НГг

СЯР-1 '

р(Ж-2 + Р+

В 90% случаев Р -Виктор оказывается интегрированным в хромосону кисти:, маркер *£нс3 теряется, появляется новая илрзицда рСп-2 (мол.вес 54 +2 Щ), которая является производной пдаам'ди рС'а-х. В 10£ случаев, наряду со свободным фактором р , выявляется тп ло плапипда рСК-2, а маркер оказывается интегрированным в хро-

мосому клетки. Для образования плазшгды рСК-2 необходим новый сайт Гге 12, локализованный глеэду генами ргсС и tвx .

3. Участие элемента 13 3 в сайтспевдфическом распаде плазшды.

Распад плазыкда ОИР-1 , как правило, сопровотдастся водепле-

нием Диктора Р . Последнее очевидно происходит по элементу 13 3, который, как мч указывали, использовался при образовании предшест-вешшпа плазмпды спг-1 , ктагма НГг оп 1-1 . Чтобы доказать точка! характер вм'цеплепгл фактора Р (л именно по сайту 13 з), мн сравнили рестрпкти Р-Тпктора дпкого тгпа к г-факторов, впделен-ш:с из 1';тат;овг+ /рСК-1/ЛВ 1157 и Р+ /рСК-2/ ЛО 7623 , после обработки ? -'-аптг.ров зцдо'^тлеазей Бвп НХ . Выбор этого (Рориси-та определялся о:.; ••цсиолот.ехзп сайтов рестрикции на Щ1К от-

носительно элемента 13 3 . Гпоктро'.ореграгЕИ» р>стрвктов оклэспко* здсиппшш.

Итак, Г го X 1, Гге 12 И садт в элементе 13 3 - са!:тн гесЛ п гос1 -зависимой рекомбинации, усиливающейся па -пути.

• Рекомбинационная нестабильность плазмиды. переносящей область frell. Область fre II частично перекрывается плазмидой Р'14 , структура которой тщательно исследована физическими метода!®. Плаз-мида- образовалась из штамма Hfr 313 , в котором ? -фактор застроен в хромосому клетки через элемент (outsubо et al., 1974). Как и в случае с он?-1, относительная стабильность Р'14 е исходном штамме GC 4 17 обеспечивается за счет делении в хромосоме клетки участка ДНК гомологичного бактериальной ДНК плазмиды.

Электрофореграммы плазмидной ДНК, выделенной нами из транс-конъюгантов F' 14 с генотипом reo+, recF~, reoP~sbc В" и reсВС eboB" , обнаруживают зону ДНК, соответствующую г -фактору, а в исходном штамме сс 4 17 дополнительно зону, соответствующею плаз-миде РЧ4 • Это указывает не только на reçA-независимость вы-щешгения фактора р , но и на независимость его-исключения от пути рекомбинации КесВС, КеоР или RecBCF . Принимая во внимание. результаты с orp-1 , можно заключить, что рекомбинационная нестабильность плазмиды РЧ4 не сопровождается внщеплением" дополнительных структур,способных к авторепликации.

Генетический анализ распада плазмиды I" 14 позволяет нам локализовать еще одну из горячих точек рекомбинации - сайт fre II 1 r, и указать на наличие горячей точки (или точек) на факторе F , что, как и в случае с плазмидой 0RF-1 , выражается в образовании стабильных Hfr . Горячие сайты абсолютно гесА и гесР зависимы и чрезвычайно активны именно на RecF -пути рекомбинации. Логично предположить, что горячими сайтами фактора г являются элементы 13 2 и IS 3 .

Возможности устранения горячих точек рекомбинации. Эффекты сайтспецифической рекомбинации резко усиливаются на RecP -пути, лишенном двух деградационных нуклеаз (I и У), хотя и заметны на ReoBCP пути. Отсюда ясно'; что эти нуклеазы (особенно гесВС -нуклеаза, об-ладащая среда прочих и однонитевой эндонуклеазной активностью) способны ингибировать Pre -эффект. Оказалось, что для выявления , плазмидного Pre -эффекта (утраты фрагмента ДНК о геном tax при конъюгационнои передаче плазмиды orp-1 ) достаточно инактиви-роиать гэоЬ- -нулеазу. Воздействие гесВС -нуклеазы на сайты fis ели •соседило о шы области ДНК^вероятно, лриводнт к инактивации этого cJi'-'a. î.'ii установили, что конъчгпдюшгое пролустслие всей хпсмо-

' сомы донора Hfr С через клетку-рецшшент RecBCF , но не RecF , пути рекомбинации существенно модифицирует хромосому донора, сникая ее потенции к гесА -зависимой гомологической рекомбинации. Это хорошо видно па рис.5, где масштаб карты Л для донора Hfr CAB ( Hfr с , пропущенный через AB 1157) существенно увеличен десне по сравнению с масштабом Л дая донора Hfr Я 4 , лишенного горячих точек рекомбинации в области ergE - pro А.

Попытаемся представить себе ситуацию устранения сайта fre с. помощью геоВС -нуклеазы. Гипотетическая схема содержит одно предположение: сайты fre должны содержать з своей структуре палиндромы. Тогда в момент вхождения одНонитевой доноркой ДНК в реципиент эти сайты, временно принимая шпилечную структуру, могут легко атаковаться однонитевой эндонуклеазой геоВС . Псследущак деградация ДНК модифицирует сайт, делая его неузнаваемым для гесР -зависимой эндонуклеазы.

Заключение. Отправной точкой каких исследований било измерение масштаба генетической карты при постконъюгационноЛ рекомбина- ■ ции. Проведя сравнение физической и генетической карт хромосомы Е. colt, мы установили еле,пущее: I) масштаб карты зависит от области ДНК, передаваемой донором при конъюгации; з зависимости от того, какая область хромосомы принимает участие в рекомбинации, масштаб мокет варьировать от 24 мин (при 100 мин карте Е. coli ) до I мин (горячая область хромосош); 2) масштаб карты зависит и от конкретного штагсга донора, тек как оказалось возможным искусственно создавать штаммы, инертные в инициировашш рукэ.мбинационкых обменов. Это же доказывает, что инициирование рекомбинации после конъюгации происходит на донорной ДНК; 3) масштаб карты зависит от реципиента, точнее генотипа реципиента, определяющего Ree -систему рекомбинации, в рамках которой протекает застройка донорной ДНЕС В ХРОМОСОМУ КЛеТКИ.

Далее ш привлекла к рассмотрению три экспериментальные системы адцитквно-эксцпз:!оп:юй j:ei<oi.tóiiHaiyiii: мобилизацию хромосомы (¡актором р , пнтегративнуг) супрессию, рекоглбинационный распад плаз-шд. Особенностью первых двух является то, что рекомбинация в них протекает за счст Ree -систе;.я донора. Прежде всего,мы показали, что процесс рекомбинации в этих необычных экспериментальных системах подчиняется закономерностям лос -системы общей рекомбинации.

Затем, используя особенности каждой систош, ш установили связь между горячими сайтами fre и IS-элементами (конкретнее IS 2 и IS 3 -элементами) и локализовали три сайта fre I 1, f reI2 и fre II 1 в горячих областях хромосош fre I и fre несоответственно.

Теперь обратился к генетической детерминированности сайтспеци-фических рекомбинациошшх событий. В постконъюгациокных мерозиготах геоР" практически не происходит рекомбинациошшх разрывов в дозорной ДНК.

Иная ситуация наблюдается в мерозиготах гесВСвЪоВ" . Здесь рекомбинация инициируется в середине хромосош в горячих областях, названных fre I, fre II и fre III . Масштаб Я в них в 20 раз меньше среднего, т.е. частота рекомбинациошшх обменов очень высокая. Поэтому генетический материал из этих областей часто выпадает при рекомбинации. Этот процесс особенно наглядно можно наблвдать на длинном I" , переносящем фрагмент хромосомы с горячей областью fre L Такой У оказывается чрезвычайно нестабильным, подверглась гесА -зависимому р е к о;. J и наци о нн ому распаду на фрагменты, в клетках recBO"sbcB~ , более стабилен в клетках гес+ .и абсолютно стабилен в клетках гесВС-еЪсВ~гесР~ или одиночных мутантах recF~

Отсвда ш заключаем, что продукт гена recF прямо участвует в сайтспецифической гесА -зависимой рекомбинации.

Что же происходит в клетках дикого типа? Очевидно первичные разрывы донорной ДНК инициируются той же reсР -зависимой эвдонукле-азой, но затем они интенсивно деградируют с концов под действием экзонуклеаз У и I. В результате в хромосому реципиента интегрируются самые разные фрагменты донорной ДНК, распределенные по закону случая (распределение длин по Пуассону), и эффекты горячих точек оказываются смазашшми.

Учитывая.вышеизложенное, на наи взгляд, правильнее говорить о реализации чистого НесВС -пути в клетках *ес1? и reci'~sbcB~ , чистого йаоР-пути, как и прежде, в клетках гесВС~вЪоВ" и комбинированного ReaBCP -пути в клетках дикого типа. Биологический смысл -«различных путей в различии деятельности эвдонуклеаз (гесВС -нуклеазы и гесР завис!шой эвдонуклеази), их определящих. RecUC -нуклеаза .инициирует рекомбинацию по сайтам chi , весьма гесно расположенным на хромосоме E.coli , recF-зависимая - по сайтам fre , разбросан: ш;;.; по хромосоме и группирующимся в отдельных областях ее. В отли-

чие от сайтов fre , сайга chi обнаруживаются только при анализе систеш тесно сцепленных маркеров и причем при рекомбинации ДНК фагов X за счет Rec-систеш хозяйской клетки. В постконъгагационной рекомбинации сайты chi пока не обнаружены. Можно предложить по крайней мере два объяснения этого факта. Первое состоит в том, что геевс -нуклеаза - концевая, поэтому хотя ее воздействие на ДШС и происходит через сайты chi , по место рекомбинационного обмена в конечном счете определяет положение конца фрагмента донорисй ДНК, Второе объяснение предполагает предусмотренную клеткой защиту бактериальной, в отличие от фаговой, ДНК белком от действия нуклеаз метки, в том числе и геевс -нуклеазы.

Глава 5

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ РЕКОЖИНЛЦИОННЫЕ СТРУКТУРЫ И ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОТОМСТВА ЭКСКОНЬЮГАНТШ

О гетерогенности потомства эксконъюгантов. Это явление заключается в способности эксконъгоганта_ Еыцедлять более одаого генотипа рекомбинантов. Оно имеет более чем 20-летгоога историю своего изу" -ния. Ile менее шести моделей было выдвинуто для его объяснения. Такой постоянный интерес к данному явлению связан с надеждами раскрыть механизм рекомбинации через генетический анализ гетерогешю-сти коныогационннх мерозигот, так как нет сомнений в том, что дичина гетерогенности заключена в характере самого рекомбинационного процесса.

Современные представления о механизмах реализации гетерогенных событий после конъюгации можно представить в виде следующей ниже схемы, из которой видно, что к числу небалалыих механизмов мы относил два: независимого репликона и таццемной застройки. Оба механизма едины в одном: требовании кольцевания фрагмента донорной ДНК, способного защитить ДНК от действия деградациошшх экзоиуклеаз. Кольцевание вошедшей в реципиент донорной ДНК должно протекать по законам обычной госл -зависимой рекомбинации, т.е. оно нуждается в областях гомологии, рассредоточенных по хромосоме к. ooli . Такшл1 областями могут быть сайты fro .

- 28 -Гетерогенность

Банальная

(только двойные наборы генотипов в клоне)

За счет рекомби- За счет одно-нации с реплика- штевой реком-тивной вилкой .бинацш

хромосомы реципиента

Небанальная

(двойные и более сложные наборы генотипов в клоне)

I

Г

Протекает через образование промежуточных продуктов рекомбинации - кольцевых структур ДНК

Кольцо образует самостоятельный решшкон

За счет репликона F -фактора

•Ч.

За счет включения в кольцо

:дного из ori

репликации клетки

Кольцо интегрируется в хромосому, образуя область таццемной дупликации материала, реплицируется вместе о ней и постепенно выщепля-ет разнообразное по генотипу потомство ,

Демонстрация явления гетерогенности на большом статистическом материале. Клональный анализ 400 клонов his+strr , отобранных в скрещивании Hfr н х РА 309, по двум не селектируемым маркерам trp и leu выявил существенную долю гетерогенных клонов (Q 60-100 в 31%) при значительной степени сложности событий гетерогенности ( S = 28/125).

Гетерогенность потомства зксконъиганта связана с поддержанием его меродиплоидного состояния. Интересующая нас небанальная гетерогенность 0) обеспечивается рядом независимых и разделенных во времени актов рекомбинации. Это доказывают следуицие эксперименты: I) гаплоидизаьдя одного из маркеров в ходе постконъпгационной рекомбинации не означает того же для других; 2) гетерогенность потомства обнаруживается и после начала деления эксконъпгантов; 3)"радиоактивное самоубийство" фрагмента донорной ДНК (аа счет распадов внедрившихся в ДНК атомов . Р) не препятствует образованию . гетерогенного потомства, если трансконъпгант совершил первые деления. Теперь естественно задаться вопросо.л, каково время жизни пост-конъкгпционных ыероэигот, обеспечивавших гетерогенность потомства , &кско1сьпгантов.

Закономерность распада меродпплоидного состояния эксконыоганта. Клональный анализ каждого гетерогенного клона позволяет определить соотношение между обоими аллелями неселектируемого маркера. Статистический анализ шожества гетерогенных клонов дает возможность построить функцию их распределения по соотношению обоих аллелей. Она представлена на рис.6 как результат анализа 363 смешанных клонов, отобранных из разных скрещиваний.

Рис.6. Функция распределения

соотношения двух аллелей в' смешанных клопах: н0 - число гетерогешшх клонов:

р - логарифм отношения гепо-типов в смешанном клоне.

1 - скрещивание Мг Н х РА 309;

2 - скрещивания доноров Иг Н

и нгг с с реципиентом АВ 712 и его производными.

По оси ординат на рис.6 отложено число смешанных клонов с данным соотношением аллелей, а по оси абсцисс - логарифм этого отношения. Кспользоваете логарифмического масштаба связано с тем, что именно логарифм этого отношения по основанию 2 дает число делений первого рекомбинанта к моменту выщзпления второго, т.е. показывает время существования мерозиготы. Описызаемое распределение симметрично. Это естественный результат равной вероятности интеграции в хромосому рекомбинанта донорного и роципиентнсго аллелей. Максимум распределения приходится на первое деление реко!.;бингптов, а затем функция Щипает окспокеяциально. Убывание функции в е раз соответствует ~ 3 периодам деления реяомбипантов.

- 30 - .

Роль доноров и реципиентов в ооразовании гетерогенного потомства. Чтобы ответить на эти вопросы, мы проанализировали гетерогенность потомства, образующегося при скрещивании 4 доноров (два из которых Hfr Н и И 99 передают ДНК по часовой стрелке, а два других - Hfr с и kl 19 - против) и 3 реципиентов (один из которых, AB 712, оказался штаммом обычным по свойствам гетерогенности, а два других - PC 0212 и ECK 022 - необычными). Выбранные для анализа маркеры были рассредоточены по всей хромосоме е. coli, так что данные доноры могли передать фрагментами почти всю хромосому б. coli (см.рис.1). Результаты клонального анализа суммированы в табл.3.

Таблица 3

Гетерогенность потомства эксконъюгантов

Скрещивание Донорные маркеры Гетерогенность«

№ селек- неселек- 2 S

Hfr X i1 *" тивный тивные . G10

I Hfr Н x PO 0212 gal+ thr pro . 29 2/22

2 Hfr Н x PC 0212 trp+ thr pro 36 0/9

3+4 Hfr С x PC 0212 ade+ pro thr 38 5/26 '

5+6+7 KL 16 x PC 0212 trp+ tyr his 66 17/51

8+9+10 KL 99 x PC 0212 tyr+ trp hie 24 3/19

II " Hfr С x AB 712 *yl+ thr pro 31 10/22

12+13 Hfr H x ECK 022 trp+ thr pro 10 2/16

14+16 Hfr С x ECK 022 ade+ pro thr 5 0/3

16 Hfr С x ECK 022 ilv+ pro thr 9 0/9'

17+18+19 KL 16 x ECK 022 trp+ tyr hie 46 6/37

20 KL 99 x ECK 022 tyr+ trp his 44 1/15

Донор нгг с в скрещивании с реципиентом АВ 712 показывает большую и разнообразную гетерогенность, не уступающую величинам Е И в- для донора Шг н в скрещиваниях с реципиентами РА 309 (см. выше). Тот ле Н:Гг С показывает большую, "но менее разнообразную гетерогенность для реципиента РС 0212 г слабую для штамма ЕСК 022.

, Интересно, что донор Н:Гг Н такие показывает подобные результаты. 11 с этими же реципиентами другие доноры КЬ 16 и К1 99 , пере-

дающие другие области хромосомы е. coli , показывают высокие величины а .

Итак, мы столкнулись о ситуацией, когда уровень гетерогенности эксконъюгантов определяется как донором, так и реципиентом. Пожко заключить, что для оценки гетерогенности чрезвычайно важна область ДНК е. coli, передаваемая донором в реципнент.

Реципиенты PC G2I2 и особенно производный от него ECK 022, отобранный как трансконыогант gal+ в скрещивании Hfr с х PC 0212, демонстрируют аномальные параметры гетерогенности. Мы не стали анализировать природу повреждений геномов штаммов PC 0212 л ECK 022, но мы поняли, что, во-первых, рекомбинационные мутации в геноме реципиента должны существенно влиять на уровень гетерогенности их потомства, и, во-вторых, следует отыскать фундаментальный параметр, характеризующий интенсивность рекоглбинацконного процесса в лябом случайном реципиенте. Такт,! параметром оказался коэффициент сцеп-ленности маркеров^," или вытекающий из него масштаб генетической карта /I , отрэжащие частоту рекомбинационпых обменов на единицу длишг ДНК.

Зависимость между долей гетерогенных клонов к коэффициентом сцепленкости маркеров. Эта зависимость обратно пропорциональна. Максимум функции с^« ) достигается при = 0,5 (абсолютная не-сцеплешюсть маркеров) и величина ^ —^ 0, при г'—^ I (полная сцепленность). Прямая построена на основе 15 скрещиваний с участием доноров типа Ufr н и Hfr с .и реципиентных штаммов KS а также производных штамма AB 712.

Во вссх до сих пор проведенных экспериментах нам ни разу не удалось наблюдать отклонения от найденной корреляции: чем выше частота рзкомбикационшх обменоЕ, тем выше уровень гетерогенных событий. Таким образом, измерив только параметр"^ , можно оценить ожидаемый уровзнь гетерогенности клонов в данном скрещивании.

Выбор модели рекомбинации, учитывавший возможность образования гетерогенного потомства эксконъюгантов. В этом разделе ана-' лизиругатся данные, позволяющие из четырех возможных моделей небанальной гетерогенности (модели "истощения фрагмента", "концевых избыточностей"(Hopwood,' 1967), "независимого репликона'', "тан-дешой застройкк" (рис.7)) отобрать для дальнейшего рассмотрения две последние.

Модель тандемной застройки содержит уникальное экспериментальное предсказание. В ней первый кроссинговер предопределяет ограниченное число возможностей второго или, другими словами, набор ре-комбинантных генотипов, выщеплящихся в данной мерозиготе, предоц-ределен местом синапсиса кольцевого фрагмента донора с хромосомой реципиента. Анализ событий гетерогенности на системе четырех тесно сцепленных маркеров, три из которых принадлежат профагу ¿80: с40--am32-h , а четвертый бактериям (trp) , показывает согласие экспериментальных данных с указанным предсказанием. Но это согласие носит лишь качественный характер. Далее на примере частичного ди-плоида у 137 Ех2-штамма, у которого в диплоидном состоянии постоянно находится до Ъ% генома в области ara - proAB карты Б. coli , доказана принципиальная возможность реализации модели тавдемной застройки. Этот дипловд был отобран Кертисом, который измерил и ве,личины его спонтанной и УФ-иццуцируемой галлоидизации (Curtisa, I9S8). Анализ этих данных и убедил нас в том, что дипловд сущеЬт- . вует и размножается как тандемно душшцированная структура.

Модель независимого репликона также имеет уникальное экспериментальное предсказание (lotaa et al., 1972; см.рис.8). Если первичную селекцию рекомбинантных клонов проводить по редкому событию, то вероятность образования гетерогенного клона будет мала, так как она определится произведением вероятностей двух независимых редких рекомбинационных событий. Авторы цитированной работы проверили это предсказание на одной системе маркеров (см.рис.8: а - lacZ , в -laoY . с - phoR ). Результаты оказались в хорошем согласии с моделью независимого репликона.

Убедительная простота данного доказательства заставила нас провести дополнительные исследования на пяти различных экспериментальных системах с участием доноров Bfr с и Hfr Н в другой об-' . ласти карты е» coil thr-carA-ara-leu-proA . Результат оказался обратным ожидаемому: уникальное предсказание для выбранных наш экспериментальных систем не выполнялось. Отсэда можно было заключить, что если модель независимого репликона и верна, то лишь в определенных областях хромосомы. Недавние результаты, полученные в нашей лаборатории, указывают на наличие в области 1ас-ргоС , с которой работали Дотан и др., нового orí репликации, активность 1 которого зависит от наличия фактора Р .

Рис.7. Схема рекомбинации медду хромосомой: реципиента (маркеры А, Б, В, Г, Д) и фрагментом ДЕК донора (маркеры а,-б, в, г, д) путем тандемнои застройки и выщепления избыточной ДНК. I - фрагмент замыкается в кольцо и взаимодействует с хромосомой в " области Б-В; 2 - первый нроссипговер-застройка; 3 - последовательность маркеров в тандеме I такая структура способна размножаться);

4 - второй кроссикгозет) - выпетливанке избытка ДНК в области В-Г;

5 - рекомбинантная хромосома и кольцо избыточной ДНК.

+Г

репли нация

РГПЛИКА' Ц.МЯ

+ +

Г"

а +

выщепле- + иие +

__ + С

а с

а+

г--- ч.

+6 я + с выщеп- ++ ление +

:гл. ++ с

с

+

А

а +

в

Рис.8. Варианты рекомбинациошшх событий (А и В)приводящих к гетерогенности по модели независимого репчикона.

Сплошная линия - двунитевея ДНК донора (со стрелкой) и реципиента; а/+, в/+, с/+ - аллельяне маркеры. Штриховая линия показывает путь рекомбанациошпсс обменов .

Генетическая детерминированность гетерогенности эксконъдган-тов. Роль сайтов fre . Гетерогенность значительно усиливается на RecP -пути по сравнению с Несвси-путем и отсутствует на RecBC -пути. Иными словами, гетерогенность усиливается на пути рекомбинации, в котором рекомбинация инициируется на сайтах fre , и подавлена, когда геоР -зависимая эндонуклеаза, воздействующая на эти сайты, не "активна. Напомним такие, что удаление сайтов fre из хромосомы донора Hfr с (штамм CÄB-5) существенно повышает коэффициенту для постконъюгационной рекомбинации с участием этого донора и, следовательно, понижает величину G

Кинетика рекомбинации на RecBCff и RecF -путях. Ллойд и Джонсон, используя мутант гесЛ гоо э , позволявдий обратимо инги-бировать рекомбинацию в непермиссивных условиях, показали, что на RecBCF-nyTH интеграция фрагмента донорной ДНК после конъюгации длится 90 мин при 35°С, кинетика его деградации в непермиссивных условиях (42°С) - быстрая (Lloyd, Johnson, 1979). Мы подтвердили эти данные на примере мутанта гесА 44 и показали, что на RecF -пути кинетика интеграции фрагмента при 35°С чрезвычайно замедленная (процесс заканчивается только к 14 ч постконъюгационного периода), и кинетика его деградации при 42°С также очень замедленна.

Промежуточные рекомбинантные структуры донорной ДНК в пост-конъюгациокнон мерозиготе. Результаты, описанные в предыдущем разделе,. легли в основу эксперимента, позволяюцего проследить за . кинетикой образования промежуточных рекомбинантных структур, нечувствительных к действию геевс -нуклеазы. В эксперименте создавали ситуацию перехода эксконъшгантов с Нес!1 на RecBCF -путь с помощью введения в них плазмида i"15 » содержащей гены активно действующей recBC-нуклеазы. Одновременно с введением плазмида на I ч повыпали температуру до 42°С, создавая условия активной деградации донорного фрагмента, не успевшего рзкомбинировать и стать устойчивым. По сути дела,мы зондировали состояние фрагмента в различные моменты времени после конъюгации. Результаты показывают, что уже к 30-й 1,51 нуте после конъюгации фрагмент ДНК становится не чувствителен к деградационному действию геовс -нуклеазы. Новое состояние фрагмента возникает гесА -зависимо.

Наиболее правдоподобное объяснение этих данных заключается в наличии стадии рекомбинации, преобразующей фрагмент донора в коль-цевзгл структуру.

Радиоавтография кольцевых промежуточных рекомбинантных струн-тур. Кольцевые структуры донорной ДЕК были выделены из мерозигот НесР-пути рекомбинации. Гистограмма, представленная на рис.9, показывает длины 98 найденных колец. Длины находятся в согласии с ожидаемыми по. генетическому анализу.

N

Л

4J

JL____._J__■ П 1TU-

50 100 150 200 250 L fl •

Рис.9. Распределение кольцевых структур ДНК по длинам L , II- число найденных образцов данной длины.

Шаг гистограммы - IOf-

Заключение. В основе явления гетерогенности лежит способность эксконъюгантов в течение ограниченного ряда поколений размножать свое меродиплоидное состояние. Установлено, что явление гетерогенности свойственно не одному исключительному донору, а постконыпга-ционному рекомбинационному процессу в целом. Оно зависит как от донора, так и от реципиента. Зависимость от донора выражается в конкретной области ДНК, которую он проксимально передает при конъюгации, а точнее, в наличии в передаваемой ДШС горячих точек рекомбинации -сайтов fre . Реципиент определяет собой рекомбиналцонные способности мерозиготы, и ото, в первую очередь, выражается в эффективности работы Reo-системы клетки (пути рекомбинации, гас-мутации). Найден параметр, характеризующий эти способности - коэффициент сцеп-

ленности маркеров, который прямо связан с величиной g .

Понимание закономерностей поддержания меродиплоидного состояния эксконъюганта привело нас к формулированию модели посткснъюга-дпоныой рекомбинации посредством тандемной застройки донорной ДНК в хромосому реципиента. Принципиальная возможность такой ситуации следует из существования тапдемно душицированных структур в стабильных ыеродиплоидных штаммах е. coli.

Модель тандемной застройки требует существования промежуточно! рекомбинантной структуры - кольца донорной ДНК. Замыкание фрагментг донорной ДНК в кольцо способно предохранить донорный материал от действия деградационных экзонуклеаз реципиентной клетки. Именно такие структуры были выявлены на ЕесР -пути рекомбинации, на котором рекомбинационный процесс протекает чрезвычайно замедленно. Для этого пути характерна и повышенная гетерогенность потомства эксконыо-гантов. t

Таким образом, генетическая рекомбинация после конъюгации, инициируясь на донорной ДНК (сайтах fre ) с помощью гесР -зависимой эндонуклеазы, протекает путем образования промежуточных реком-бинантных структур (колец донорной ДНК), взаимодействие которых с реципиентной хромосомой может приводить к созданию временных тан-демно дуплицированных областей ДНК в мерозиготе.

ВЫВОДЫ

1. Процесс передачи донорной ДНК в реципиентную клетку при конъюгации сопровоздается двумя синтезами ДНК, в доноре и реципиен те. Конъигационный синтез ДНК в реципиенте достраивает передаваему донором одно1Штевую ДНК до двунитевой формы. Этот синтез находится под контролем геца dnaB.

2. Мутация ВТ43 в гене toaB ингибпрует конъигационный синтез ДНК в реципиенте, что приводит к необычному процессу постконъю гациошюй рекомбинации на уровне одной нити ДНК. Этот процесс был

J назван однонитевой конъюгацией.

. По своим генетическим характеристикам он резко отличается от обычной конъюгации: а) сильным увеличением частоты рекомбинационны обменов на единицу длины ДНК, б) обедненностью гетерогенного потом ства эксконъктгантов.допускающей объяснение этого явления; за счет

коррекции неспаренных оснований, в) значительным увеличением выхода рекомбинантов, когда в конъюгациошшх мерозиготах отсутствуют деградационные экзонуклеазн клетки. Однонитевая конъюгация скорее схожа с трансформацией, чем с обычной конъюгацией.

3. Сравнение генетических параметров однснитевой и обычной конъюгации позволяет нагл утверждать, что рекомбинация после обычной конъюгации протекает на уровне двунитевой ДНК.

4. Ree -система общей рекомбинации со•свойственными ей особенностями так называемых путей рекомбинации, RecBC-пути (клетки recF-П гесР~вЪсВ~ ), RecF -пути (гесВС~вЪсВ~ ) и смешанного ПесВОР -пути (гео+) , успешно функционирует и в необычных рекомбипздионных процессах, приводящих к мобилизации хромосомы фактором т , интег-ративной супрессии и распаду плазшд.

5. Процесс общей рекомбинации в известной мере сайт-специфичен. Он инициируется преимущественно на Taie называемых сайтах £ге Сайты группируются в отдельных местах хромосомы Е. coli . Это создает обнаруживаемые при рекомбииацпонном анализе "горячие" области рекомбинации: f.га I (областЫае - purE карты Е. coli), i'го II (область argE - ilv карты). Сайты fra могут входить в состав элементов is г и is з хромосомы клетки.

6. Рекомбинация, инициирующаяся на сайтах fre , ярко проявля-etcH на ReсР-пути, заметна па RecBCP-пути и абсолютно подавлена на RecBC-пути. Последнее приводит к парадоксальной ситуации, когда рекомбинационные обмены реализуются только по краям фрагмента донор-ной ДНК, переданного в реципиент в ходе конъюгации. В этом случае обмены,очевидно, происходят за счет концевой гесВС -нуклеазы. Отсутствие "внутренних" обменов пюедполагает существование геср -зависимой эндонуклеазы рекомбинации.

7. Сайты ira не требуются для жизнеспособности клетки. Они могут быть удалепг из хромосомы донора. Это приводит к снижению частоты рекомбинацкошшх обменов и доказывает, что гасР-зависимая рекомбинация послс конъюгации инициируется именно на донорной ДНК. Если сайты fre имеют сходную структуру, то в рассматриваемой ситуации можно предсказать их взаимодействие друг с другом, что приведет к кольцеватпо фрагмента донорной ДНК.

8. Особенностью RecP-пути является замедленная кинетпка застройки фрагмента донорной ДНК. Это связано с существованием проме-

жуточных рекоыбинантных структур, выявляемых радиоавтографией как кольцевые фрагменты донорной ДНК.

9. Существование промежуточных кольцевых рекомбинантных струк-• тур позволяет объяснить одно из самых загадочных явлений рекомбинации после конъюгации - гетерогенность потомства эксконъюганта. Кольцо фрагмента донорной ДНК может в течение длительного времени неоднократно рекомбинировать или размножаться вместе с хромосомой в состоянии тандемной дупликации, завершая рекомбинацию выщеплением разнообразного по генотипам потомства.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ"ДИССЕРТАЦИИ

1.Bresler S.E., Lanzov V.A., Blinkova A.A. Mechanism of geneti recombination during bacterial conjugation of Escherichia coli K-12

I-. Heterogeneity of the progeny of conjugated cells. Genetics, 1967 v.56, p. 105 - 116. с

2.Bresler S.E,, Lanzov V.A. Mechanism of genetic recombination during bacterial conjugation of Escherichia coli K-12. II. Incorpor tion of the donor DHA fragment into recombinant chromosome. Genetic 1967, v.56, p. 117- 124.

3.Bresler S.В., Lanzov V.A., Lukjaniec-Blinkova A.A. On the.ma cism of conjugation in Escherichia coli K-12. Mol.Gon.Gonet., 1968, v.102, p.269 - 284.

4. Бреслер.С.Е., Ланцов В.А., Лукьянец-Блинкова A.A. О механизме конъюгации у Escherichia coli K-12 - Труды XI научной конференции ИБС АН СССР. Л.: Наука, 1970, с.247-250.

5. Бреслер С.Е., Ланцов В.А., Манукян Л.Р. Механизм генетической рекомбинации при конъюгации бактерий. Ш. Клон&льный анализ ' гетерогенного потомства эксконъюгантов на системе близко располо- • женных друг от друга маркеров. - Генетика, 1970, т.6, В 8, с.116-13

6. Бреслер С.Е., Ланцов В.А., Лукьянец-Блинкова А.А. Кинетика проявления генетической информации в метках бактерий при конъюгации. - Мол.биология, 1971, т.5, вып.6, с.803-808.

; 1 7. Бреслер С.Е., Ланцов В.А., Лукьянец-Блинкова А.А. О механизме конъюгации у Escherichia coli K-12 . П. Конъгагационныо свойства реципиентов, термочувствительных в отношении синтеза ДНК. -Генетика, IS73, т.9, Л 5, с,87- 96.

8. Bresler S.E., Lanzov V.A., Idkhachev V.T. On the mechanism oi conjugation in Escherichia coli K-12. III. Synthesis 3f DNA in the course of bacterial conjugation. Mol.Gen.Genet., 1973, v.120, p.125--".131.

Bresler S.E., Lanzov V.A., Manukian L.B. Mechanism of genetic recombination during bacterial conjugation of Escherichia coli K-12i IV. Heterogeneity of progeny of exconjugants. Hole of donor and recipient strains. Mol.Gen.Genet., 1973, v.123, pl347- 353.

10. Бреслер C.E., Вячеславов Л.Г., Калинин В.Л., Кренева P.A., {ушев В.В., Ланцов В.А., МосевиЦкий М.И., -Перунов Д.А., Рыбчин В.Н. Элементарные процессы генетики, 1973, Л.: Наука, II6-I70.

11. Бреслер С.Б., Ланцов В.А., Манукян Л.Р. Механизм генети-теской рекомбинации при конъюгации бактерий. У. Гетерогенность потомства эксконъюгантов, индуцированная рекомбиногенами. - Генетика, [974, т.10, № 2, с.145 - 150.

12. Ланцов В.А., Лихачев В.Т. О механизме конъюгации у Escherichia coli £-12 . iy. Конъюгация в условиях фенотипической су-]рессии мутации в гене dnaB . - Генетика, IS75, т.П, й 8, с. 104 -»107

13. Бреслер С.В., Ланцов В.А., Лихачев В.Т. Механизм генеТи-lecKoit рекомбинации при конъюгации бактерий. УТ. Однонитевая конъюгация. - Генетика, 1976, т.12, № 9, с.61-70.

14. Ланцов В.А. Рекомбинация у оактерий. - Генетика, 1977, г.13, № 4, с.710-734.

15. Бреслер O.E., Горышин И.Ю., Ланцов В.А. Механизм генетической рекомбинации при конъюгации бактерий. УЛ. О гетерогенности тотомства эксконъюгантов. - Генетика, 1977, т.13, № 5, с.862- 871.

16. Горышин И.Ю., Ланцов В.А. Однонитевай,конъюгация у Escherichia coli R-12 : особенности образования" ге№рсгенного потомст-" па. - Генетика, 1977, т.13, !Ь 7, с.1246 -1251.

17. Бреслер С.Е., Ланцов В.А. Индуцированная рекомбинация у Escherichia coli К-12; реког,;бпногешшй эффект мутации tif-1 . -Цокл.АН СССР, 1970, т.238, JS 3, с.715 - 717.

18. Вгев'1эг S.Ii., Krivonogov S.V., Lanzov V.A. Scalo of the genetic nap and genetic control of recombination after conjugation.in Escherichia coli K-12. Hot spots of recombination. Mol.Gen.Genet., 1978, V.16G, p.337-346.

19., Бреслер O.E., Кривоногов C.B., Ланцов В,А. Механизм генетической рекомбинации при конъюгации бактерий. УЩ, Масштаб генетической карты и генетический контроль рекомбинации. - Генетика, ' 1979, т.15, # 3 , 409 г 419.

20. Бреслер С.Б., Кривоногов C.B., Ланцов В.А. Механизм генетической рекомбинации при конъюгации бактерий. П. Дальнейшее изучение эффекта горячих точек рекомбинации. - Генетика, 1979, т.15, » 3, с.420« 425.

21. Brasier S .В., Krivonogov S.V., Ьалаот 7.А. Genetic détermination o£ the donor properties in Escherichia coli К-12. Phenomona of chromosome mobilization and integrafcive suppression. Mol.Gem. Genet., 1979, v.177, p.177- 184.

22. Bresler S.S., Goryshin I.Xu., Laj>zov_V.A. Çingle-stranded conjugation in Escherichia coli K-12. Uol.Gen.Genet., 1980, v.177,

P.519~ 525. • . *

23. Кривоногов C.B., Ланцов В.A. Рекомбинация при конъюгации и трансдукции у Escherichia coli К-12 : эффекты краев фрагмента донора на разных путях рекомбинации. - Мол.биология, 1980, вып.27, К.: Наукова дуыка, с.З- 5.

24. Ланцов В,А. Однонитевая конъюгация у Escherichia coli • К-12: сравнение с общей, трансдукцией. - Мол.биология, 1980, К.: Наукова думка, вып.27, с.5- 7.

25. Бреслер С.Е., Горншин И.Ю., Ланцов В.А. Промежуточные структуры ДНК, образующиеся в ходе рекомбинации при конъюгации у Escherichia coli К-12 . - Докл.АН СССР, 1980, т.251, Ä 3, 0.7X7 "721

РТП ЛИЯФ, 8ак.762,тир. 120, уч.-изд.л.Г,9; 25/K-I98Ir. .U-I8I

Бесплатно