Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Узнавание внутренних повторов (TTAGGG)n теломерным белком TRF1 и его роль в поддержании стабильности хромосом в клетках китайского хомячка

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крутилина, Раиса Ивановна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Распределение (ТТАССС)п повторов в хромосомах разных видов позвоночных.

2.2 Теломеры млекопитающих: структура и функции.

2.3. Внутрихромосомная локализация (ТТАССС)п повторов.

2.4. Классификация внутрихромосомных (ТТАССС)п сайтов и внутрихромосомных (ТТАС(КЗ)п повторов.

2.5. Структура и нестабильность внутрихромосомных (ТТАС(Ю)п последовательностей в клетках китайского хомячка.

2.6. Гипотезы происхождения внутрихромосомных (ТТАСОС)п повторов.

2.7. Нестабильность внутрихромосомных (ТТАООО)п повторов.

2.8. Строение теломерных белков ТКП и ТКР2.

2.9. Функции теломерных белков ТИП и ТКР2.

2.10. Строение и функция белка танкираза 1, участвующего в регулировании функции теломер.

2.11. Белок Ки и его роль в защите теломер от слияния хромосомных концов.

2.12. Теломеро-связывающий комплекс, выделенный из спермы человека.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Линии клеток, использованные в работе.

3.2. Ревертазно-транскрипционная полимеразная цепная реакция (РТ-ПЦР) и клонирование ПЦР-фрагмента в плазмидные вектора.

3.3. Трансформация бактериальных штаммов.

3.4. Выделение плазмидной ДНК, определение ориентации встроенного гена ТЯП.

3.5. Трансфекция клеток.

3.6. Вестерн - блот - анализ.

3.7. Иммунофлуоресцентный анализ.

3.8. Приготовление метафазных пластинок хромосом.

3.9. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH).

3.10. Перераспределение флуоресценции после выжигания лазером (FRAP).

3.11. Обработка клеток вортманнином (WM).

3.12. Микроскопия и анализ изображений.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Клонирование человеческого гена TRF1.

4.2. Визуализация белка TRF1-V5 в клетках линий CV-1 и белка GFP-TRF1 в клетках линии А549.

4.3. Визуализация белка GFP-TRF1 в интерфазных ядрах КХ клеточных линий СНО-К1 и V79.

4.4. Локализация белка GFP-TRF1 в интерфазных ядрах и метафазных хромосомах клеток китайского хомячка.

4.5. Одновременная визуализация белка GFP-TRF1 и двунитевых разрывов в облученных клетках китайского хомячка.

4.6. Диффузионная подвижность белка GFP-TRF1 в живых клетках V79 и ее изменение воздействием вортманнина.

4.7. Обработка клеток V79 вортманнином повышает частоту спонтанных и индуцированных блеомицином хромосомных аберраций.

4.8. Совместная визуализация белка GFP-TRF1 и белка танкиразы 1 в клетках китайского хомячка.

4.9. Экспрессия танкиразы 1 приводит к возрастанию частоты спонтанных хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Узнавание внутренних повторов (TTAGGG)n теломерным белком TRF1 и его роль в поддержании стабильности хромосом в клетках китайского хомячка"

Геномы высших эукариот содержат большое количество рассеянных и тандемных повторов ДНК. Многие из этих повторов локализованы около центромер или теломер, значительно реже - во внутрихромосомных областях, или как целое хромосомное плечо. Некоторые эволюционно консервативные семейства повторяющихся последовательностей являются существенными для функционирования клеток, например, высококонсервативные последовательности ДНК, состоящие из тандемно -повторяющихся областей (TTAGGG)n. Эта последовательность ДНК была детектирована в теломерах всех позвоночных (Moyzis et al., 1988; Meyne et al., 1989).

Теломеры — это сложные нуклеопротеиновые комплексы на концах хромосом, отличающиеся по своей структуре от большей части хроматина. Теломерная ДНК млекопитающих состоит из G-богатых тандемных (TTAGGG)n повторов (у человека их длина составляет 10-15 т.п.н. на каждом конце хромосомы). Наличие в клетках высших эукариот большого числа t повторов может представлять опасность для стабильности генома. При репарации нескольких двунитевых разрывов (ДР), возникающих одновременно по гомологичным повторам, например при воздействии ИР, возможны «неправильные» гомологические взаимодействия, приводящие к хромосомным перестройкам (ХП) за счет неравной гомологической рекомбинации (НГР). Однако хромосомы относительно стабильны, что указывает на существование эффективных механизмов, которые позволяют ей избегать рекомбинации между повторами. Недавно был открыт один из специальных механизмов защиты теломер млекопитающих. Ключевую роль в этой защите играют теломерные белки TRF1 и TRF2, которые связываются с терминальными (TTAGGG)n повторами и формируют двунитевую петлю ДНК (называемую Т-петлей), размером 2-25 п.н. (Griffith et al., 1999). Эта петля защищает ДНК от негомологического воссоединения концов (НВК) и от слияния теломер (обзор de Lange, 2002).

Белок TRF1 был изначально идентифицирован как теломерный белок, связывающийся с повторами (TTAGGG)n (Zhong et al., 1992; Chong et al., 1995). Другой, почти идентичный ему белок, был выделен как регуляторный фактор клеточного цикла Pin2 (Chen et al., 1997). Pin2 отличается от TRF1 делецией последовательности длиной в 20 аминокислот, и он в 5-10 раз более распространен в клетке, чем TRF1 (Chen et al., 1997). Оба эти белка, по всей видимости, представляют собой продукты альтернативного сплайсинга одного и того же гена (Kishi and Lu, 2002). Значимость обнаруженной инсерции в 20 аминокислот в TRF1 не установлена, так два эти белка неразличимы по локализации и способам функционирования (Chen et al., 1997; Kishi et al., 2001). У человека TRF1/Pin2 непосредственно фосфорилируется АТМ-киназой по серину в положении 219, in vitro и in vivo (Kishi et al., 2001; Kishi and Lu, 2002). TRF1 активизирует слияния теломер, обычно наблюдаемые в клетках пациентов с Ataxia telangiectasia (Pandita et al., 1995). Это позволяет предположить, что ATM-зависимое фосфорилирование TRF1 может подавлять слияние теломер. TRF1 покрывает основную двунитевую часть теломер и является негативным регулятором их длины (van Steensel and de Lange, 1997). Функция TRF1 регулируется белком TIN2 (Kim et al., 1999), а также двумя высоко-гомологичными друг к другу белками: танкиразой 1 (TANK1) (Smith et al., 1998) и танкиразой 2 (TANK2) (Kaminker et al, 2001). TIN2 увеличивает TRF1-зависимое спаривание теломерных повторов. Кроме того, TIN2 является негативным регулятором длины теломер (Kim et al, 1999). TANK1 инактивирует TRF1 с помощью рибозилирования этого белка (Smith et al, 1998). Сверхэкспрессия TANK1 вызывает элонгацию теломер (Smith and de Lange, 2000). Белок TRF1 способен индуцировать латеральное спаривание повторов (TTAGGG)n in vitro (Griffith et al., 1998).

Другим белком, связывающимся с повторами (TTAGGG)n, является белок TRF2 (Bilaud et al., 1997; Broccoli et al., 1997). Подобно TRF1 и TIN2, он также является негативным регулятором длины теломер (Smogorzewska et al., 2000). Кроме того, TRF2 выполняет уникальную функцию — стабилизирует У - выступающий однонитевой конец ДНК и предотвращает тем самым слияние концов теломер (van Steensel et al., 1998). Белок TRF2 непосредственно связывается с тандемной областью удвоенных повторов (TTAGGG)n. Помимо этого, он связывается с ДНК в основании Т- петли в том сайте, где G-нить внедряется в двунитевую спираль ДНК, и тем самым поддерживает образование и стабилизацию Т-петли (обзор Greider, 1999). Было показано, что TRF2 привлекает в теломеры человека белок hRAPl. Этот белок гомологичен дрожжевому белку RAP1 и его сверхэкспрессия приводит к удлинению теломер (Li et al., 2000). TRF2 также привлекает комплекс MRE11 в теломеры человека (Zhu et al., 2000). Этот комплекс, образованный белками RAD50, MRE11 и NBS1, является ключевым компонентом как процесса гомологической рекомбинации (ГР), так и негомологического воссоединения концов. Известно, что у дрожжей удаление этого комплекса приводит к укорачиванию теломер (Nugent et al.,

1998), а мыши, дефицитные по этому комплексу белков, погибают на стадии эмбрионов (Zhu et al., 2001; Luo et al., 1999; Xiao and Weaver, 1997).

Два белка: Ku70 и Ku86, совместно с ДНК-протеинкиназой, образуют фермент, называемый ДНК-зависимая протеинкиназа (ДНК-ПК), который вовлечен в репарацию двунитевых разрывов ДНК (обзор Smith and Jackson,

1999). Ku-белки также взаимодействуют с теломерными белками TRF1 и TRF2 (Hsu et al., 2000; Song et al., 2000). Изучение мышей, дефицитных по белку Ku86 и ДНК-протеинкиназе показало, что эти белки также играют существенную роль в функционировании теломер млекопитающих (Bailey et al., 1999; Samper et al., 2000; Hsu et al., 2000; Goytisolo et al., 2001).

Суммируя вышесказанное, можно сказать, что стабильность теломер обеспечивается большим и сложным комплексом белков и что два из них: TRF1 и TRF2, являются основными факторами сиквенс-специфического контроля теломер в соматических клетках млекопитающих.

Другие сиквенс-специфические белковые комплексы, связывающиеся с повторами (TTAGGG)n, были выявлены в сперме млекопитающих (Zalensky et al., 1997; Gineitis et al., 2000), но их возможная роль в функционировании теломер нуждается в выяснении.

Помимо теломерной локализации, была показана и внутрихромосомная локализация последовательностей (TTAGGG)n, большие блоки которых в перицентромерных и внутрихромосомных областях хромосом были обнаружены у 40% изученных видов позвоночных (Meyne et al., 1990). Эти внутрихромосомные (TTAGGG)n последовательности у китайского хомячка, например, составляют около 5% всего генома (Day et al., 1998), и занимают 250-500 т.п.н. на каждой хромосоме (Faravelli et al., 1998). Недавно сообщалось, что кроме обширных и протяженных участков (TTAGGG)n повторов у китайского хомячка (КХ) существуют также короткие внутрихромосомные (TTAGGG)n последовательности (B ill), вкрапленные в АТ-богатые участки ДНК и ретропозоны (Faravelli et al., 2002). Поскольку, как известно, АТ-богатые последовательности ДНК нестабильны и характеризуют некоторые, так называемые «фрагильные сайты» у млекопитающих, было высказано предположение, что ВТП были вставлены в эти сайты в процессе репарации двунитевых разрывов (Faravelli et al., 2002).

Хромосомные области, содержащие (TTAGGG)n последовательности, как известно, являются «горячими точками» хромосомных перестроек, как индуцированных облучением, так и спонтанных, в культивируемых клетках (Alvarez et al., 1993; Fernandez et al., 1995; Bertoni et al., 1996; Slijepcevic et al., 1996; Day et al., 1998). Известно также, что внедрение повторов (TTAGGG)n в гены млекопитающих ведет к частым хромосомным перестройкам, включающим эти повторы (Kilburn et al., 2001). Причины повышенной нестабильности в последовательностях (TTAGGG)n неясны, но китайский хомячок и другие виды содержат ВТП в своих хромосомах на протяжении миллионов лет, что свидетельствует о наличие защиты этих блоков от хромосомных перестроек в норме. Механизм этой защиты должен быть, по всей видимости, отличен от механизма образования Т-петли в теломерах, но он может включать сиквенс-специфическое распознавание повторов (TTAGGG)n белками TRF1 и TRF2.

Возникает вопрос, с помощью какого механизма осуществляется защита таких внутрихромосомных тандемных повторов (TTAGGG)n. Если белок TRF1, специфически связывающийся с (ТТАСОС)п-последовательностью, играет роль в поддержании стабильности ВТП, то он должен взаимодействовать с ними, а ингибирование взаимодействия белка TRF1 с ВТП должно приводить к повышению спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций. В свете всего сказанного, представляется весьма актуальным изучение способности белка TRF1 связываться с ВТП в клетках китайского хомячка in vivo и его возможной роли в поддержании стабильности хромосом за счет такого связывания. Такое изучение помогает прояснению существующих в клетке эффективных, но пока малоизученных механизмов, контролирующих гомологическую рекомбинацию между повторами, которые играют важную роль в поддержании стабильности хромосом. В данной работе мы исследовали способность человеческого белка TRF1 взаимодействовать с ВТП двух линий КХ: СНО К1 и V79 и изучали, как такое взаимодействие влияет на стабильность этих клеток.

Основная цель работы состояла в изучении способности человеческого белка TRF1 связываться с внутрихромосомными (TTAGGG)n последовательностями в клетках китайского хомячка линий СНО-К1 и V79, его возможной роли в защите этих последовательностей от спонтанных и индуцированных повреждений. Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Клонировать человеческий ген ТЯР1 в вектор pcDNAЗЛ/V5-His-ТОРО и вектор рсОЫАЗ. 1 /ЫТ-ОРР-ТОРО. Методом временной трансфекции различных клеточных линий проверить экспрессию белка TRF1 и его локализацию в интерфазных ядрах клеток.

2. Используя методику флуоресцентной in situ гибридизации (Fluorescence in situ Hybridization - FISH), исследовать способность белка TRF1 взаимодействовать с ВТТТ в интерфазных ядрах клеток КХ линий СНО-К1 и V79.

3. Проанализировать подвижность белка TRF1 в живых клетках КХ, используя методику перераспределение флуоресценции после выжигания лазером (Fluorescence Redistribution After Photobleaching - FRAP)

4. Исследовать, как будет меняться подвижность белка TRF1 после обработки клеток вортманнином, который ингибирует АТМ-киназу, участвующую в фосфорилировании белка TRF1. Выяснить, будет ли такая обработка влиять на частоту хромосомных аберраций (ХА), как спонтанных, так и индуцированных.

5. Проанализировать способность белка TRF1 связываться со случайными сайтами двунитевых разрывов, появляющимися после обработки клеток ионизирующей радиацией, используя для этого специфичные антитела против у-Н2АХ, который является маркером двунитевых разрывов.

6. Трансфецировать клетки КХ плазмидой, кодирующей танкиразу 1 (TANK1), которая, взаимодействуя с белком TRF1, ингибирует его способность связываться с ДНК, и исследовать к каким последствиям приведет уменьшение количества связанного с ВТП эндогенного белка TRF1, а именно: будет ли влиять такое ингибирование на изменение частоты ХА, как спонтанных, так и индуцированных.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Ф

2.1. Распределение (TTAGGG)n повторов в хромосомах разных видов позвоночных.

Геномы большинства эукариот содержат много семейств повторяющихся ДНК последовательностей. Многие из этих последовательностей встречаются в форме тандемных повторов, локализованных около центромер или теломер и гораздо реже во внутрихромосомных областях, или как целое хромосомное плечо. Вероятно, некоторые из этих повторяющихся ДНК последовательностей влияют на структуру и функции генома. Эволюционно консервативные особые семейства повторяющихся последовательностей могут являться и основой в функции клеток, например, высоко-консервативные ДНК-последовательности, состоящие из тандемных (TTAGGG)n повторов. Эта ДНК-последовательность была детектирована в концевых участках хромосом всех позвоночных (Moyzis et al., 1988; Meyne et al., 1989; Meyne et al., 1990), в том числе, в концевых участках всех хромосом человека (Moyzis et al., 1988). В работе (Meyne et al., 1989) проанализированы хромосомные концы более чем 90 видов из разных отрядов и классов позвоночных. Были представлены отряды: рыбы, рептилии, птицы и млекопитающие. Использовался метод гибридизации in situ биотионилированных дезоксинуклеотидов (GGGTTA)7 и (ТААССС)7 с последующей флуоресцентной детекцией гибридизованной ДНК на метафазных пластинках - FISH. Флуоресцентные сигналы были детектированы в концевых участках всех хромосом всех видов, включая В хромосомы и микрохромосомы.

Хромосомы эукариот представляют собой линейные молекулы ДНК,

Ш} ограниченные специфическими повторяющимися последовательностями, составленными из большого числа тандемных GT-богатых повторов: (TTGGGG)n -Tetrahimena, (TTTTGGGG)n -Oxytricha, (TTAGGG)n- человек и мышь (обзор Greider, 1999). У позвоночных животных длина таких тандемных повторов на каждом конце хромосомы очень вариативна и может быть равна от 1 до 30 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) (Moyzis et al., 1988).

Эволюционная консервативность (TTAGGG)n повторов (111), концевая локализация у различных высших эукариот независимо от числа хромосом и длины хромосом, аналогичность функциональным теломерам, изолированным из низших эукариот - все это позволило предположить, что ТП на концах хромосом являются функциональными теломерами высших эукариот. Теломеры - это определенные функциональные области ДНК в концах линеаризованных хромосом, которые необходимы для репликации и стабилизации хромосом (Blackburn et al., 1984). Оканчиваются все теломеры выступающим З1 G-богатым однонитевым концом. Размер этого конца очень вариативен и имеет длину от 16 нуклеотидов у Oxytricha до 50-100 нуклеотидов у мыши и человека. (Greider, 1999).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Крутилина, Раиса Ивановна

6. ВЫВОДЫ

1. В интерфазных ядрах клеток китайского хомячка двух линий: СНО-К1 и У79 - белок ТМЛ связывается с внутрихромосомными (ТТА(ХЮ)п последовательностями (ВТП).

2. Взаимодействие белка ТКР1 с внутрихромосомными (ТТАООО)п последовательностями является динамичным: основная фракция этого белка (60-80 %) непрерывно обменивается со свободными молекулами белка ТМЧ в ядре.

3. Динамичное связывание белка ТИП с внутрихромосомными (ТТАООО)п повторами является функционально важным, т. к. уменьшение мобильной фракции белка ТИП, вызванное вортманнином, приводит к увеличению частоты спонтанных хромосомных аберраций, которые, как известно, концентрируются во внутрихромосомных сайтах, обогащенных (ТТАООО)п повторами.

4. Белок ТЮЛ остается связанным с внутрихромосомными (ТТАООО)п последовательностями после воздействия на клетки ионизирующей радиации и не перемещается в участки, содержащие двойные разрывы ДНК.

5. Взаимодействие белка ТИП с внутрихромосомными (ТТАОКЮ)п последовательностями необходимо для поддержания стабильности хромосом, так как ингибирование связывания белка ТИР1 с ВТП, индуцированное сверхэкспрессией ТАМС1, приводит к значительному возрастанию частоты спонтанных хромосомных аберраций.

Я выражаю благодарность С. Смит за предоставленные плазмиды pTetFLNLS и pUHR 15-1; профессору П.М. Яу за предоставленные антитела к фосфорилированному гистону ШАХ.

Особую признательность и благодарность я хочу выразить своему руководителю чл.- корр. РАН, д.б.н. Н.В. Томилину за внимательное руководство работой, постоянную поддержку и помощь в получении результатов.

Я хочу поблагодарить также Н.М. Плескач за квалифицированную консультацию и всестороннюю помощь при работе с культурами клеток и при анализе метафазных пластинок.

Кроме того, я хочу поблагодарить всех сотрудников Лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии за проявленное внимание к теме данной работе, полезное обсуждение результатов, а особенно А.Н. Смирнову за содействие при выполнении экспериментов. Также я хочу поблагодарить М.П. Светлову и Л.В. Соловьеву за содействие при работе на микроскопе и анализе изображений, полученных с помощью микроскопа. Я приношу свою благодарность В.О. Чагину и A.A. Никифорову за большой интерес к работе и техническую помощь при оформлении результатов.

Я приношу благодарность нашим заграничным коллегам Е.М. Бредбери (Е.М. Bradbury), А.О. Заленскому (O.A. Zalensky), Ш.Л. Оеи (S.L. Oei) за высокий интерес к теме данной работы, полезное обсуждение результатов и содействие в подготовке публикаций.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда для Фундаментальных исследований, гранты: 01-04-49486 и 02-04-49145; Отделения науки американского министерства энергетики грант DE-FG03-01ER63070; Национального института здоровья США грант 5R01-HD39830-02; Немецкого исследовательского общества грант 436RUS113/126/0.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клетки позвоночных животных имеют уникальные видоспецифические наборы хромосом, и каждая хромосома содержит одну линейную молекулу ДНК, ограниченную специфическими повторяющимися последовательностями, называющимися теломерами. Теломеры млекопитающих составлены из большого числа тандемных (ТТА(ЮО)п повторов. Теломеры являются единственными «легально дозволенными» концами ДНК в клетке, потому что нарушение непрерывности этой молекулы, то есть появление в ней двунитевого разрыва, почти всегда приводит к образованию ацентрического хромосомного фрагмента, который теряется при митозе. Основным следствием нерепарированных ДР является клеточная гибель. В частности, гибель клеток после воздействия ионизирующей радиации преимущественно связана с нерепарированными ДР, а также с хромосомными перестройками, возникающими при их неправильной репарации.

В клетках, однако, имеются эффективные системы распознавания и репарации внутренних ДР, а также системы поддержания стабильности теломерных концов ДНК. У позвоночных животных идентифицировано два основных механизма репарации ДР: путем прямого негомологического воссоединения концов ДНК и путем гомологической рекомбинации. Для репарации путем ГР необходима вторая неповрежденная копия двунитевой ДНК, содержащая участок с нуклеотидной последовательностью гомологичной к поврежденному участку. Главная опасность такой репарации ДР в клетках позвоночных состоит в том, что их геномы содержат большое число повторов, по которым возможны «неправильные» гомологические взаимодействия, приводящие к ХП за счет неравной гомологической рекомбинации (НГР). Если учесть наличие в клетках высших эукариот большого числа повторов, то довольно высока вероятность одномоментного образования нескольких разрывов по гомологичным повторам, например при воздействии ИР, и как следствие — возможность НГР между повторами, локализованными на разных хромосомах, что ведет к ХП. Однако клетка, по-видимому, имеет специальные механизмы, которые позволяют ей избегать рекомбинации между повторами. Существует ряд гипотез о возможном механизме подавления рекомбинации между повторами, в частности за счет дивергенции нуклеотидных последовательностей, предложенной М. Радманом (Radman, 1991), или гипотезы о функции ПАРП-1, приводящей к подавлению НГР (Lindahl et al, 1995). Для подавления ГР между повторами может быть достаточно создания особой локальной структуры хроматина, обеспечивающей надежную изоляцию концов ДНК при образовании ДР.

В свете всего изложенного особый интерес привлекают теломеры и их способность защищать длинные тандемные (TTAGGG)n повторы от НГР. Осуществляется это благодаря сборке на таких повторах сложных белковых комплексов, контролирующих теломеразу и препятствующих слиянию теломер за счет ГР (Blackburn Е.Н., 2001).

Основными белками теломерных комплексов у млекопитающих являются белки TRF1 и TRF2 (Broccoli et al., 1997). Оба эти белка участвуют в образовании Т-петли: TRF1 способен индуцировать изгиб удвоенных (TTAGGG)n повторов в составе двунитевой ДНК (Bianchi et al., 1997), что облегчает складывание теломеры, а также способен индуцировать латеральное спаривание теломерных последовательностей in vitro (Griffith et al., 1998), что позволяет белку TRF2 способствовать инвазии однонитевого теломерного конца в двунитевой участок теломеры и спаривание его с гомологичными последовательностями, благодаря чему этот участок оказывается спрятанным внутрь теломерного комплекса (Griffith et al., 1999) и поэтому не может атаковывать гомологичные мишени на других хромосомах.

Взаимодействие белков TRF1 и TRF2 с ВТП КХ (Smogorzevska et al., 2000; Krutilina et al., 2001; Krutilina et al., 2003) открывает вопрос о возможном функционировании этих белков помимо контроля над теломерами. С точки зрения недавних открытий, что соматические клетки млекопитающих имеют мощные механизмы подавления гомологической рекомбинации, кажется вероятным, что белки, связывающиеся с последовательностями (TTAGGG)n, могут действовать как супрессоры незаконной гомологичной рекомбинации между ВТП. Это возможно, например, путем опосредованного TRF1 изменения структуры хроматина или связывания антирекомбинационных факторов.

Белок TRF1 специфически взаимодействует с одной из субъединиц (р80) белка Ku (Hsu et al., 2000) и в мышиных клетках с мутацией по Ки80 частота слияния теломер повышается (Samper et al., 2000; Bailey et al., 1999). Таким образом, на теломерах антирекомбинационная активность белка Ки направляется на определенные последовательности ДНК сиквенс-специфическим белком TRF1, распознающим (TTAGGG)n повторы.

В настоящей работе мы показали, что в иммортализованных клетках КХ, имеющих длинные внутрихромосомные (TTAGGG)n повторы и очень короткие теломеры, белок TRF1 преимущественно связывается с указанными повторами (Krutilina et al., 2001; Krutilina et al., 2003). Возможно, с помощью белка Ku и других антирекомбинационных факторов белок TRF1 может препятствовать гомологической инвазии теломерной ДНК, при образовании ДР. Такая возможная защита (TTAGGG)n повторов с помощью белка TRF1 является сиквенс-специфической, поскольку не приводит к перемещению белка TRF1 в ядерные домены содержащие ДР (Крутилина и др., 2003). Сам по себе гетеродимер Ku70-Ku80 не может латерально связываться с двунитевой ДНК (Hsu et al., 2000), но очень эффективно распознает любые внутренние ДР (Walker et al., 2001) и после этого может инициировать процесс НВК, подавляя при этом возможность инициации ГР. Непосредственно связываясь с концами внутреннего ДР, белок Ки изолирует его от рекомбинационных белков. Каким образом белок Ки подавляет рекомбинацию при латеральном связывании с теломерной ДНК пока остается неясным. Возможно, это происходит через взаимодействующую с ним ДНК-зависимую протеинкиназу, мутация, которой, также стимулирует незаконные слияния теломер (Bailey et al., 1999; Goytisolo et al., 2001).

Второй теломерный белок TRF2 также связывается с ВТП в клетках КХ (Smogorzevska et al., 2000). Было показано, что белок TRF2 привлекает в человеческие теломеры белок hRAPl. Этот белок гомологичен дрожжевому RAP1 белку. Сверхэкспрессия TRF2 приводит к удлинению теломер (Li et al., 2000). Белок TRF2 привлекает также MRE11 комплекс в теломеры человека (Zhu et al., 2000). Этот комплекс образован белками RAD50, MRE11, NBS1 и является ключевым компонентом ГР и НВК. У дрожжей удаление этого комплекса приводит к укорачиванию теломер. Мыши, дефицитные по этому комплексу белков, погибают на стадии эмбрионов (Zhu et al., 2001; Luo et al., 1999; Xiao and Weaver, 1997).

TRF1 и TRF2 могут также прямо воздействовать на процессинг двунитевых разрывов ДНК, локализованных в ВТП, либо путем зависимого от белка Ки механизма негомологического воссоединения концов, либо путем однонитевого отжига (Karran Р., 2000), опосредованного белками Rad50/Mrel 1/NBS у млекопитающих, что, таким образом, подавляет репарацию путем НГР. Человеческие белки NBS1 и Mrell взаимодействуют с TRF1 и TRF2, колокализуясь с ними в неповрежденных интерфазных ядрах человека. (Zhu et al., 2000; Wu G. et al., 2000). Мутации белков, контролирующих НВК, ведут к повышению частоты слияний теломер (Bailey et al., 1999). Можно предположить, что оба белка TRF1 и TRF2 выполняют сиквенс-специфическую защиту внутрихромосомных (TTAGGG)n повторов, привлекая в эти последовательности антирекомбинационные факторы, или образуя специфическую структуру хроматина в данных областях.

Обработка клеток млекопитающих WM приводит к повышению радиочувствительности и подавлению репарации ДР, индуцированных радиацией, потому что ингибируются ДНК-протеинкиназы (Chernikova et al., 1999). Иингибирование АТМ-киназы, которая является важной в подавлении

СХА, также приводит к подавлению репарации. Этот эффект может быть связан со способностью АТМ-киназы фосфорилировать ДНК-репарирующие белки (Cortez et al., 1999; Zhao et al., 2000), а также гистон H2AX (Burma et al., 2001) и белок TRF1 (Kishi et al., 2001).

В настоящей работе мы показали, что в клетках, обработанных WM, значительно возрастает частота ХА как спонтанных, так и индуцированных. (Крутилина и др., 2003). Поскольку известно, что у гомозиготных ATM мутантов ATM (-/-) возрастает частота, как спонтанных, так и индуцированных ХА (Pandita et al., 1995; Sekiguchi et al., 2001), то, вероятно, такое воздействие WM, объясняется тем, что он ингибирует АТМ-киназу. Точки разрывов СХА в большинстве клеток китайского хомячка (больше 90%) возникают в сайтах, содержащих ВТП (Bertoni et al., 1996; Slijepcevic et al., 1996; Simi et al., 1998), с которыми, как нами показано взаимодействует белок TRF1 (Krutilina et al., 2001; Krutilina et al., 2003). Наблюдаемое возрастание ХА как спонтанных, так и, индуцированных при обработке клеток WM, вероятно, является следствием подавления ATM — зависимого фосфорилирования белка TRF1.

В настоящей работе мы показали, что в клетках V79 китайского хомячка взаимодействие белка GFP-TRF1 с внутрихромосомными последовательностями (TTAGGG)n является динамичным: основная фракция этого белка (60-80%) непрерывно обменивается со свободными молекулами белка GFP-TRF1 и связывается снова с теми же или другими блоками ВТП. Обработка клеток вортманнином приводит к сильному уменьшению подвижности белка TRF1 (Krutilina et al., 2003). Хотя мы не можем исключить влияния на подвижность белка TRF1 и других протеинкиназ, чувствительных к WM.

Возможно, ингибирование подвижности белка TRF1 приводит к возрастанию ХА как спонтанных, так и, индуцированных. Можно предположить, что уменьшение диффузионной подвижности белка TRF1, а также подавление ATM-зависимого фосфорилирования белка TRF1, вызванное вортманнином приводит к возрастанию ХА.

Мы показали, что ингибирование связывания белка TRF1 с ВТП, индуцируемое сверхэкспрессией танкиразы 1, также приводило к возрастанию спонтанных хромосомных разрывов (Крутилина и др., 2003). Эти результаты в совокупности позволяют утверждать, что динамичное сиквенс-специфическое взаимодействие белка TRF1 с ВТП защищает хромосомы от спонтанных хромосомных аберраций во внутренних участках хромосом, обогащенных последовательностями (TTAGGG)n.

Возможный механизм частых хромосомных повреждений в участках, содержащих внутрихромосомные (TTAGGG)n последовательности, пока неясен (Bertoni et al., 1996; Slijepcevie et al., 1996). Показано, что сайт-специфическая вставка (TTAGGG)n последовательности размером в 800 п.н. в интрон гена китайского хомячка индуцирует 30-ти кратное усиление генных перестроек и во все перестройки вовлечены указанные повторы (Kilburn et al., 2001). Внутренняя нестабильность (TTAGGG)n повторов также очевидна из работы, в которой эти повторы были обнаружены в экстра-хромосомном состоянии (Handle et al., 2001). Такие образования были показаны в человеческих Ataxia telangiectasia и мышиных ATM (-/-) клетках (Handle et al., 2001).Предположительно разрывы и вырезания (TTAGGG)n последовательностей возможны в отсутствии белка TRF1, фосфорилированного АТМ-киназой.

Помимо протяженных блоков ВТП в перицентромерных областях большинства хромосом у КХ обнаружены и короткие области, локализованные в некоторых внутрихромосомных сайтах (Faravelli et al., 2002). Специфической особенностью этих областей локализации ВТП являлось наличие AT - богатых фланкирующих последовательностей. Важно отметить, что аналогичное окружение характеризует некоторые ВТП, ранее выделенные из генома человека (Azzalin et al., 2001).

Можно предположить, что данные последовательности были встроены в процессе репарации двунитевых разрывов, так как негомологическая интеграция эписомных теломерных повторов в АТ-богатые участки ДНК была показана в работах (Azzalin et al., 2001; Faravelli et al., 2002). АТ-богатые участки ДНК могут расщепляться эндонуклеазой, кодируемой ретропазонами L1 семейства (Jurka, 1997). Мы проанализировали известные сайты расщепления для L1 эндонуклеазы (Jurka, 1997; Cost and Boeke, 1998) в трех связанных с ВТП сайтах КХ, присутствующих в Банке Генов, и нашли, что частота их значительно выше, чем в случайно выбранном геноме КХ (Krutilina et al., 2003). Частота L1 сайтов в геномной последовательности КХ также повышена в участках хромосомной нестабильности, в так называемых «фрагильных сайтах». Возможно, что часть хромосомных разрывов в ВТП КХ обусловлена эндонуклеазой L1. Однако встает вопрос — как белок TRF1, который связывается только с двунитевыми (TTAGGG)n повторами, может защищать внутрихромосомные последовательности, которые расщепляет L1 эндонуклеаза, так как она распознает совсем другие гексамерные последовательности. Возможно, TRF1 взаимодействует с ВТП и защищает при этом компактную структуру хроматина, образующуюся в этих сайтах, изолируя тем самым их от L1 эндонуклеазы. В опытах in vitro хроматинизация ДНК подавляет образование однонитевых разрывов L1 эндонуклеазой в большинстве сайтов (Cost et al., 2001). Дальнейшее изучение структуры хроматина в сайтах ВТП, связанных с белком TRF1 могут прояснить роль белка TRF1 в защите этих сайтов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крутилина, Раиса Ивановна, Санкт-Петербург

1. Alvarez L., Evans J.W., Wilks R., Lucas J.N., Brown J.M., Giaccia A J. 1993. Chromosomal radiosensitivity at intrachromosomal telomeric sites. Genes Chromosomes Cancer. 8: 8-14.

2. Azzalin C.M., Mucciolo E., Bertoni L., Giulotto E. 1997. Fluorescence in situ hybridization with a synthetic (T2AG3)n polynucleotide detects several intrachromosomal telomere-like repeats on human chromosomes. Cytogenet. Cell Genet. 78:112-115.

3. Azzalin C.M., Negradze S.G., Giolotto E. 2001. Human intrachromosomal telomeric-like repeats: sequence organization and mechanisms of origin. Chromosoma. 110:75-82.

4. Bailey S.M., Meyne J., Chen D.J., Kurimasa A., Li G.C., Lehnert B.E., Goodwin E.H. 1999. DNA double-strand break repair proteins are required to cap the ends of mammalian chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 14899-14904.

5. Balajee A.S., Dominguez I., Natarajan A.T. 1995. Construction of Chinese hamster chromosome specific libraries and theiruse in the analysis of spontaneous chromosome rearrangements in different cell line. Cytogenet. Cell Genet. 70: 95-101.

6. Banin S., Moyal L., Shieh S., Taya Y., Anderson C.W., Chessa L., Smorodinsky N.I., Prives C., Reiss Y., Shiloh Y., Ziv Y. 1998. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281: 1674-1677.

7. Baumann P. and Cech T. R., 2001. Potl, the putative telomere end-binding protein in fission yeast and humans. Science. 292: 1171-1175.

8. Bennet V. Ankyrins. 1992. J.Biol.Cem. 267: 8703-8706.

9. Bertoni L., Attolini C., Tessera L., Mucciolo E., Giulotto E. 1994. Telomeric and nontelomeric (TTAGGG)n sequences in gene amplification and chromosome stability. Genomics. 24: 53-62.

10. Bertoni L., Attolini C., Faravelli M., Simi S., Giulotto E. 1996. Intrachromosomal telomere-like DNA sequences in Chinese hamster. Mamm. Genome. 7: 853 855.

11. Bianchi A, Smith S, Chong L, Elias P, de Lange T. 1997.TRF1 is a dimer and bends telomeric DNA EMBO J. 16: 1785-1794.

12. Bianchi A., de Lange T. 1999. Ku binds telomeric DNA in vitro. J. Biol. Chem. 274:21223-21227.

13. Bilaud T., Brun C., Ancelin K., Koering C.E., Laroche T., Gilson E. 1997. Telomeric localization of TRF2, a novel human telobox protein. Nat. Genet. 17: 236239.

14. Blackburn E.H., Szostak J.W. 1984. The molecular structure of centromeres and telomeres. Ann. Rev. Biochem. 53: 163-194.

15. Blackburn E.H. 1995. Developmentally programmed healing of chromosomes. In "Telomeres". Editors: Greider C. and Blackburn E. Cold Spring Harbor Laboratory Press. P. 193-218.

16. Blackburn E.H. 2000. Telomere states and cell fates. Nature 408: 53-56.

17. Blackburn E.H. 2001.Switching and signaling at the telomere. Cell. 106: 661-673.

18. Bouffier S.D. 1998. Involvement of telomeric sequences in chromosomal aberrations. Mutat. Res. 404: 199-204.

19. Bougrain F.M., Katinka M.D. 1991. Telomeres inhibit end to end fusion and enhance maintenance of linear DNA molecules injected into the Paramecium primaurelia macronucleus. Nucleic Acids Res. 19: 1541-1547.

20. Boutouil M., Fetni R., Qu J., Dallaire L., Richer C.L., Lemieux N. 1996. Fragile site and interstitial telomere repeat sequences at the fusion point of a de novo (Y; 13) translocation. Hum.Genet. 98: 323-327.

21. Broccoli D., Smogorzewska A., Chong L., de Lange T. 1997. Human telomeres contain two distinct Myb-related proteins, TRF1 and TRF2. Nat. Genet. 17: 231-235.

22. Bryan T.M., Marusic L., Bacchetti S., Namba M., Reddel R.R. 1997. The telomere lengthening mechanism in telomerase-negative immortal human cells does not involve the telomerase RNA subunit. Hum Mol Genet. 6: 921-926.

23. Bryan T.M., Cech T.R. 1999. Telomerase and the maintenance of chromosome ends. Curr.Opin. Cell Biol. 11:318-324.

24. Burma S., Chen B.P., Murphy M., Kurimasa A., Chen D.J. 2001. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. J. Biol. Chem. 276:42462-42467.

25. Callen E., Samper E., Ramirez M.J., Creus A., Marcos R., Ortega J.J., Olive T., Badell I., Blasco MA., Surralles J. 2002. Breaks at telomeres and TRF2-independent end fusions in Fanconi anemia. Hum. Mol. Genet. 11:439-444.

26. Chen M., Haggblom C.,Vogt M., Hunter T., Lu K.P. 1997. Characterization and cell cycle regulation of the related telomeric proteins PIN2 and TRF1 suggest a role in mitosis. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94: 13618-13623

27. Cherry J.M., Blackburn E.H. 1985.The internally located telomeric sequences in the germ-line chromosomes of Tetrahimena are at the ends of transposon-like elements. Cell. 43: 747-758.

28. Chernikova S.B., Wells R.L., Elkind M.M. 1999. Wortmannin sensitizes mammalian cells to radiation by inhibiting the DNA-dependent protein kinase-mediated rejoining of double-strand breaks. Radiat. Res. 151: 159-166.

29. Chong L., van Steensel B., Broccoli D., Erdjument-Bromage H., Hanish J., Tempst P., de Lange T. 1995. A human telomeric protein. Science. 270: 1663-1667.

30. Conrad M.N., Dominguez A.M., Dresser M.E. 1997. Ndjlp, a meiotic telomere protein required for normal chromosome synapsis and segregation in yeast. Sciense. 276: 1252-1255.

31. Cooper J.P., Watanabe Y., Nurse P. 1998. Fission yeast Tazl protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392: 828-831.

32. Cortez D., Wang Y., Qin J., Elledge S.J. 1999. Requirement of ATM-dependent phosphorylation of brcal in the DNA damage response to double-strand breaks. Science. 286: 1162-1166.

33. Cost G.J., Boeke J.D. 1998. Targeting of human retrotransposon integration is directed by the specificity of the LI endonuclease for regions of unusual DNA structure. Biochemistry. 37: 18082-18093.

34. Cost G.J., Golding A., Schlissel M.S., Boeke J.D. 2001. Target DNA chromatinization modulates nicking by LI endonuclease. Nucleic. Acid. Res. 29: 573577.

35. Counter C.M., Avilion A.A., LeFeuvre C.E., Stewart N.G., Greider C.W., Harley C.B. and Baccehetti S. 1992. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. EMBO J. 11: 1921-1929.

36. Counter C.M., Botelho F.M., Wang P., Harley C.B., Bacchetti S. 1994. Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lymphocytes. J Virol. 68:3410-3414.

37. Day J.P., Limoli C.L., Morgan W.F. 1998. Recombination involving interstitial telomere repeat-like sequences promotes chromosomal instability in Chinese hamster cells. Carcinogenesis. 19: 259-265.

38. Delmas V., Stoker D.G., Perry R.P. 1993. A mammalian DNA-binding protein that contains a chromodomain and an SNF2/SWI2-like helicase domain. Proc Natl Acad Sci USA. 90: 2414-2418.

39. Devriendt K., Petit P., Matthijis G. 1997.Trisomy 15 rescue with jumping translocation of distal 15q in Prader-Willi syndrome.J. Med. Genet. 34: 395-399.

40. Farr C., Fantes J., Goodfelow P., Cooke H. 1991. Functional reintroduction of ^ human telomeres into mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7006-7010.

41. Faravelli M., Azzalin C.M., Bertoni L., Chernova O., Attolini C., Mondello C., Giulotto E. 2002. Molecular organization of internal telomeric sequences in Chinese hamster chromosomes. Gene. 283: 11-16.

42. Fernandez J.L., Gosalvez J., Goyanes V. 1995. High frequency of mutagen-induced chromatid exchanges at interstitial telomere-like DNA sequence blocks of Chinese hamster cells. Chromosome Res. 3:281-284.

43. A., Wood W.G., Ayyub H., Higgs D.R. 1994. Healing of broken human chromosomes by the addition of telomeric repeats. Am J Hum Genet. 55: 505-512

44. Galande S., Kohiwi-Shigemastu. 1999. Poly(ADP-ribose)polymerase and Ku autoantigen form a complex and synergistically bind to matrix attachment sequences. J.Biol. Chem. 274:20521-20528.

45. Gineitis A.A., Zalenskaya I.A., Yau P.M., Bradbury E.M., Zalensky A.O. 2000. Human sperm telomere-binding complex involves histone H2B and secures telomere membrane attachment. J. Cell. Biol. 151: 1591-1598.

46. Goytisolo F.A., Blasco A. 2002. Many ways to telomere dysfunction: in vivo studies using mouse models. Oncogene. 21: 584-591.

47. Gravel S., Larrivee M., Labrecque P., Wellinger R.J. 1998. Yeast Ku as a regulator of chromosomal DNA end structure. Science. 280: 741-744.

48. Greider C.W. 1999. Telomeres do D-Loop-T-Loop. Cell. 97:419-422.

49. Greider C.W., Blackburn E.H. 1985. Identification of specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43:405-413.

50. Griffith J., Bianchi A., de Lange T. 1998. TRF1 promotes parallel pairing of telomeric tracts in Vitro. J. Mol. Biol. 278: 79-88.

51. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stensel R.M., Bianchi A., Moss H., and de Lange T. 1999. Mammalian telomeres end in large duplex loop. Cell. 97: 503-514.

52. Grunstein M. 1997. Molecular model for telomeric heterochromatin in yeast. Curr. Opin. Cell. Biol. 9: 383-387.

53. Guiducci C., Cerone M.A., Bacchetti S. 2001. Expression of mutant telomerase in immortal telomerase-negative human cells results in cell cycle deregulation, nuclear and chromosomal abnormalities and rapid loss of viability. Oncogene. 20: 714-725.

54. Haber J.E. 2000. Partners and pathways repairing a double-strand break. Trends Genet. 16:259-264.

55. Hahn S., 1993. Structure(?) and function of acidic transcription activators. Cell, 72: 481-483.

56. Hande M.P., Balajee A.S., Natarajan A.T. 1997. Induction of telomerase activity by UV-irradiation in Chinese hamster cells. Oncogene. 15: 1747-1752.

57. Harley C.B., Futcher A.B., Greider C.W. 1990. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345:458-460.

58. Harley, C.B. 1991. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? Mutat. Res. 256:271-282.

59. Harley C.B. 1995. Telomeres and aging. In Blackburn E. H., and Greider C.W. (ed).1995. Telomeres. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. P. 247-263.

60. Hastie N.D., Allshire R.C. 1989. Human telomeres: fusionand interstitial sites. Trends Genet. 5: 326-331.

61. Horvath M.P., Schweiker V.L., Bevilacqua J.M., Ruggles J.A., Schultz S.C. 1998. Crystal structure of the Oxytricha nova telomere end binding protein complexed with single strand DNA. Cell. 95:963-74.

62. Jeggo P.A. 1998. DNA repair, PARP another guardian angel? Curr. Biol. 8:49-51.

63. Jurka J. 1997. Sequence patterns indicate an enzymatic involvement in integration of mammalian retroposons. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94: 1872-1877.

64. Kaminker P.G., Kim S.H., Taylor R.D., Zebaijadian Y., Funk W.D., Morin G.B., Yaswen P., Campisi J. 2001. TANK2, a new TRF1-associated poly(ADP-ribose) polymerase, causes rapid induction of cell death upon overexpression. J. Biol. Chem. 276: 35891-35899.

65. Karlseder J., Broccoli D., Day Y., Hardy S. and de Lange T. 1999. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science. 283: 1321-1325.

66. Karlseder J., Kachatrian L., Takai H., Mercer K., Hingorani S., Jacks T., de Lange T. 2003. Targeted deletion reveals an essential function for the telomere length regulator ^ TRF1. Mol. Cell Biol. 18: 6533-6541.

67. Kishi S., Zhou X.Z., Ziv Y., Khoo C., Hill D.E., Shiloh Y., Lu K.P. 2001. Telomeric protein Pin2/TRF1 as an important ATM target in response to double strand DNA breaks. J. Biol. Chem. 276:29282-20991.

68. Kilburn A.E., Shea M. J., Sargent R.G., Wilson J.H. 2001. Insertion of telomere repeat sequence into a mammalian gene causes chromosomal instability. Mol. Cell. Biol. 21: 126-135.

69. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.I.C., Coviello G.M., Wright W.E. Weinrich S.L. Shay J.W. 1994. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266: 2011-2015.

70. Kim S.H., Kaminker P. and Campisi J. 1999. TIN2, a new regulator of telomere length in human cells. Nat. Genet. 23:405 412.

71. Kim M.M., Rivera M.A., Botchkina I.L., Shalaby R., Thor A.D., Blackburn EH. 2001 A low threshold level of expression of mutant-template telomerase RNA inhibits human tumor cell proliferation. Proc Natl Acad Sci USA. 98: 7982-7987.

72. Marcand S., Gilson E., Shore D. 1997. A protein-counting mechanism for telomere length regulation in yeast. Science. 275:986-990.

73. Martin S.G., Laroche T., Suka N., Grunstein M., Gasser S.M. 1999. Relocalization of telomeric Ku and SIR proteins in response to DNA starnd breaks in yeast. Cell. 97: 621-633.

74. McElligott R., Wellinger R.J. 1997. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16: 3705-3714.

75. Meyne J., Ratliff R.L., Moyzis R.K. 1989. Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 7049-7053.

76. Meyne J., Baker R.J., Hobart H.H., Hsu T.C., Ryder O.A., Ward O.G., Wiley J.E., Wurster-Hill D.H., Yates T.L., Moyzis R.K. 1990. Distribution of non-telomeric sites of the (TTAGGG)n telomeric sequence in vertebrate chromosomes. Chromosoma. 99: 3-10.

77. Mills K.D., Sinclair D.A., Guarente L. 1999. MECl-dependend redistribution of the Sir3 silencing protein from telomeres to DNA double-strand breaks. Cell. 97: 609-620.

78. Mondello C., Pirzio L., Azzalin C.M., Giulotto E. 2000. Instability of interstitial telomeric sequences in human genom. Genomics. 68: 111-117.

79. Moore J. K., Haber J. E. 1996. Capture of retrotransposon DNA at the sites of chromosomal double-sytand breaks. Nature. 383: 644-646.

80. Mignon-Ravix C., Depetris D., Delobel B., Croquette M.F., Mattei M.G. 2002. A human interstitial telomere associates in vivo with specific TRF2 and TIN2 proteins. Eur. J. Hum. Genet. 10: 107-112

81. Musio A., Rainaldi G., Sbrana I. 1996. Spontaneous and aphidicolin-sensitive ^ fragile site 3 cen co-localizes with the (TTAGGG)n telomeric sequence in Chinesehamster cells. Cytogenet. Cell Genet. 75: 159-163.

82. Nugent C.I., Bosco G., Ross L.O., Evans S.K., Salinger A.P., Moore J.K., Haber J.E., Lundblad V. 1998. Telomere maintenance is dependent on activities required for end repair of double-strand breaks. Curr Biol. 8: 657-660.

83. Ogata K., Morikawa S., Nakamura H., Sekikawa A., Inoue T., Kanai H., Sarai A., Ishii S., Nishimura Y. 1994. Solution structure of a specific DNA complex of the Myb DNA-binding domain with cooperative recognition helices. Cell. 79: 639-648.

84. Pandita T.K., Pathak S., Geard C.R. 1995. Chromosome end associations, telomeres and telomerase activity in ataxia telangiectasia cells. Cytogenet. Cell. Genet. 71: 86-93.

85. Park V.M., Gustashaw T.M., Wathen T.M. 1992. The presence of interstitial telomeric sequences in constitutional chromosome abnormalities. Am. J. Hum. Genet. 50: 914-923.

86. Pluta A.F., Zakian V.A. 1989. Recombination occurs during telomere formation in yeast. Nature. 337:429-433.

87. Radman M. 1991. Avoidance of inter-repeat recombination by sequence divergence and a mechanism of neutral evolution. Biochimie. 73:357-361.

88. Rogakou E.P., Boon C., Redon C., Bonner W.M. 1999. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell. Biol. 146: 905-916.

89. Ruis Herrera A., Ponsa M., Garcia F., Egozcue J., Garcia M. 2002b. Fragile sites in human and Macaca fascicularis chromosomes are breakpoints in chromosome evolution. Cromosome Res. 10:33-44.

90. Saikumar P., Murali R., Reddy E.P. 1990. Role of tryptophan repeats and flanking amino acids in Myb-DNA interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 8452-8456.

91. Samper E., Goytisolo F.A., Slijepcevic P., van Buul P.P., Blasco M.A. 2000. Mammalian Ku86 protein prevents telomeric fusions independently of the length of TTAGGG repeats and the G-strand overhang. EMBO. 1:244-252.

92. Sarkaria J.N., Tibbetts R.S., Busby E.C., Kennedy A.P., Hill D.E., Abraham R.T. 1998. Inhibition of phosphoinositide 3-kinase related kinases by the radiosensitizing agent wortmannin. Cancer Res. 58: 4375-4382.

93. Sprung C.N., Afshar G., Chavez E.A., Lansdorp P., Sabatier L., Murnane J.P. 1999. Telomere instability in a human cancer cell line. Mutat Res. 429: 209-223.

94. Shay J.W., Bacchetti S., Shay J.W., Bacchetti S.A. 1997. Survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer. 33: 787-791.

95. Sherr C.J., DePinho R.A. 2000. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock? Cell. 102: 407-410.

96. Shiloh Y. 1995. Ataxia-telangiectasia: closer to unraveling the mystery Eur J Hum Genet. 3: 116-138.

97. Shore D. 1997. Telomere length regulation: getting the measure of chromosome ends. Biol Chem. 378: 591-597.

98. Siede W., Friedl A.A., Dianova I., Eskardt-Schupp F., Friedberg E. C. 1996. The Saccharomyces cerevusiae Ku autoantigen homologue affects radiosensitivity only in the absence ofhomologous recombination. Genetics. 142: 91-102.

99. Simi S., Attolini C., Giulotto E. 1998. Intrachromosomal telomeric repeats and stabilization of truncated chromosomes in V79 Chinese hamster cells. Mutat. Res. 397: 229-233.

100. Slijepcevic P., Bryant P.E. 1995. Absence of terminal telomeric FISH signals in chromosomes from immortal Chinese hamster cells. Cytogenet. Cell. Genet. 69: 87-89.

101. Slijepcevic P., Xiao Y., Domínguez I., Natarajan A.T. 1996. Spontaneous and radiation-induced chromosomal breakage at interstitial telomeric sites. Chromosoma. 104:596-604.

102. Slijepcevic P., Xiao Y., Natarajan A.T., Bryant P.E. 1997. Instability of CHO chromosomes carrying interstitial telomere sequences originating from Chinese hamster chromosome 10. Cytogenet. Cell Genet. 76: 58-60.

103. Slijepcevic P., Natarajan A.T., Bryant P.E. 1998. Telomeres and radiation-induced chromosome breakage. Mutagenesis. 13:45-55.

104. Slijepcevic P., Hande M. P. 1999. Chinese hamster telomeres are comparable in size to mouse telomeres. Cytogenet. Cell. Genet. 85:196-199.

105. Smith S., Giriat I., Schmitt A., de Lange T. 1998. Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase at human telomeres. Science. 282: 1484-1487.

106. Smith S., de Lange T., 1999. Cell cycle dependent localization of telomeric PARP, tankyrase, to nuclear pore complexes and centrosomesJ. Cell Sei. 112:3649-3656

107. Smith S., de Lange T. 2000. Tankyrase promotes telomere elongation in human cells. Curr. Biol. 10:1299-1302.

108. Smith G.C., Jackson S.P. 1999. The DNA-dependent protein kinase. Genes. Dev. 13: 916-964.

109. Smogorzewska A., van Steensel B., Bianchi A., Oelmann S., Schaefer M.R., Schnapp G., de Lange T. 2000. Control of human telomere length by TRF1 and TRF2. Mol. Cell. Biol. 20: 165 1668.

110. Teng S.C., Kim B., Gabriel A. 1996. Retrotransposon reverse-transcriptase-mediated repair of chromosomal breaks. Nature. 383:641-664.

111. Tomilin N.V., Solovjeva L.V., Svetlova M.P., Pleskach N.M., Zalenskaya I.A., Yau P.M., Bradbury E.M. 2001. Visualization of focal nuclear sites of DNA repair synthesis induced by bleomycin in human cells. Radiat. Res. 156: 347-354.

112. Vermeesh J.R., Petit P., Speleman F., Deuriendt K.F., Ryns J.P., Marynen P. 1997. Interstitial sequences at the junction site of a jumping translocation. Hum. Genet. 99: 735-737.

113. Walker J.R., Corpina R.A., Goldberg J. 2001. Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its implications for double-strand break repair. Nature. 412: 607-614.

114. Wright W.E., Piatyszek M.A., Rainey W.E., Byrd W., Shay J.W. 1996. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev.Genet. 18: 173-179.

115. Wu G., Lee W.H., Chen P.L. 2000. NBS1 and TRF1 colocalize at promyelocytic leukemia bodies during late S/G2 phases in immortalized telomerase-negative cells. Implication of NBS1 in alternative lengthening of telomeres. J Biol Chem. 275: 3061830622.

116. Wells R.A., Germino G.G., Krishna S., Buckle V.J., Reeders S.T. 1990. Telomere-related sequences at interstitial sites in the human genome. Genomics. 8: 699-704.

117. Wiley J.E., Meyne J., Little M.L., Stout J.C. 1992. Interstitial hybridization sites of the (TTAGGG)n telomeric sequence on the chromosomes of some North American hylid frogs. Cytogenet. Cell Genet. 61: 55-57.

118. Yu L.C., Zhang A.Y., Draper P., Kassab C., Miles T. 1997. Cultural correlates of self perceived health status among Chinese elderly. J Cross Cult Gerontol. 12: 73-89.

119. Xiao Y., Weaver D.T. 1997. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mrel 1 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acid. Res. 25: 2985-2991.

120. Zalensky O.A., Allen M.J., Kobayashi A., Zalenskaya I.A., Bradbury E.M. 1995. Well-defined genom architecture in the human sperm nucleus. Chromosoma. 103: 577590.

121. Zalensky A.O., Tomilin N.V., Zalenskaya I.A., Teplitz R.L., Bradbury E.M. 1997. Telomere-telomere interactions and candidate telomere binding protein(s) in mammalian sperm cells. Exp. Cell. Res. 232: 29-41.

122. Zhong Z., Shiue L., Kaplan S., de Lange T. 1992. A mammalian factor that binds telomeric TTAGGG repeats in vitro. Mol Cell Biol. 12:4834-4843.

123. Zhu X.D., Kuster B., Mann M., Petrini J.H., de Lange T. 2000. Cell-cycle-regulated association of RAD50/MRE11/NBS1 with TRF2 and human telomeres. Nat. Genet. 25: 347-352.

124. Zhu X.F., Xie B.F., Li Z.M., Feng G.K., Zeng Y.X., Liu Z.C. 2001. Mechanism of apoptosis induced by squamocin in leukemia cells. Yao. Xue. Xue. Bao. 36:498-501.