Структурно-динамическое моделирование и нейтронная спектроскопия мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз

Швецов, Алексей Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-динамическое моделирование и нейтронная спектроскопия мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-динамическое моделирование и нейтронная спектроскопия мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз"

На правах рукописи

Швецов Алексей Валерьевич

Структурно-динамическое моделирование и нейтронная спектроскопия мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

5 ДЕК 2013

005542973

Санкт-Петербург - 2013

005542973

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Работа выполнена в лаборатории биофизики макромолекул Отделения молекулярной и радиационной биофизики Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» Федерального государственного бюджетного учреждения «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова» (г. Гатчина).

кандидат физико-математических наук Исаев-Иванов Владимир Васильевич. Сергей Борисович Вахрушев, доктор физико-математических наук, профессор, ФГБУН «Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе РАН»; Даринский Анатолий Анатольевич, доктор физико-математических наук, у ФГБУН «Институт высокомолекулярных соединений РАН».

Объединенный институт ядерных исследований, Дубна.

Ведущая организация:

Защита состоится 23 декабря 2013 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 212.229.25 при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет», по адресу: 195251,, Санкт-Петербург, ул. Политехническая, д. 29, корпус 2, ауд. 265. .

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет».

Автореферат разослан «22." ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор физико-математических наук Власова Ольга Леонардовна

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Современный арсенал методов, доступный для биологических исследований, позволяет ответить на многие вопросы, касающиеся функционирования белков и их комплексов. Однако далеко не все методы позволяют исследовать структуру и динамику белка в его нативном состоянии в растворе. Особенно это сложно сделать для крупных нуклеопротеидных комплексов, например, таких, которые образует семейство белков ЛесА на онДНК и днДНК.

Белок ЯесА, принадлежащий к классу ДНК-трансфераз, - это один из основных белков, ответственный за гомологичную рекомбинацию и репарацию ДНК у бактерий. ЯесА осуществляет реакцию гомологической рекомбинации: перенос гомологичных нитей ДНК, что позволяет исправлять двунитевые разрывы ДНК или другие повреждения, вызванные, например, воздействием ионизирующего излучения. Белки К ее А в растворе функционируют в виде гомофиламен-тов или же в виде филаментов, образованных на он- или днДНК. На протяжении последних 20 лет стали известны несколько десятков кристаллических структур филаментов белков семейства ЯесА [14]. Белок ЯесА состоит из трёх доменов: С-шнцевого, Ы-концевого и Р-домена. Образование филаментов происходит за счёт взаимодействия /3-листов Р- и доменов соседних мономеров. Недавно стала известна структура комплекса белка ЛесА с онДНК и с днДНК [15]. Но, несмотря на это, остаётся нераскрытым вопрос: какие именно (информационные изменения ответственны за перенос нитей ДНК в реакции гомологической рекомбинации ДНК.

Белки ЯесА, а также их нуклеопротеидные комплексы исследовались в растворе с помощью методов малоупгового рассеяние нейтронов (МУРН) и мапоупгового рассеяния рентгена (МУРР). Эти методы позволяют получать структурно-динамическую информацию о сложных нуклеопротеидных комплексах в нативном состоянии, и это их преимущество, но, с другой стороны, они являются методами низкого разрешения. В силу последнего обстоятельства решение обратной задачи - получение из экспериментальных спектров структурно-динамических параметров исследуемого комплекса при использовании этих методов - требует точного знания структуры и внутренней динамики исследуемого нуклеопротеидного комплекса. Так как исследуемый комплекс находится в растворе и имеет ненулевую конформационную подвижность, в большинстве случаев теоретические кривые МУРН, полученные с использованием только одной статической структуры, не в состоянии адекватно описать экспериментальные данные [1]. Таким образом, разработка методов структурно-динамического молекулярного моделирования сложных нуклеопротеидных комплексов, в том числе мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз, которые могут являться основой для расчёта спектров МУРН и МУРР с учетом

¡¡информационной подвижности нуклеопротеидных комплексов в растворе, является актуальной задачей.

С другой стороны, конформационная подвижность, или внутренняя динамика нуклеопротеидных комплексов в растворе может быть явно исследована с помощью метода нейтронного спин-эхо (НСЭ). В основе метода НСЭ лежит метод МУРН на пучке поляризованных нейтронов, в котором измеряется релаксация поляризации нейтронов за счёт квазиупругого рассеяния их на образце. Время релаксации поляризации напрямую связано с эффективной диффузией рассеивающего объекта, которая складывается из диффузии комплекса как целого и внутренней динамики нуклеопротеидного комплекса. В силу сказанного решение обратной задачи в данном методе зависит не только от точного знания структуры исследуемого комплекса, но и от точного знания динамики этой структуры на временах измерения релаксации поляризации (1-200 нсек).

Таким образом, разработка методов структурно-динамического молекулярного моделирования нуклеопротеидных комплексов, являющихся базой для расчёта спектров НСЭ также является актуальной задачей.

Цели н задачи исследования

Целью настоящей работы является разработка методов структурно-динамического молекулярного моделирования и методов верификации полноатомных моделей с помощью МУРН и НСЭ при исследовании мупьтимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз. Для достижения этой цепи были поставлены следующие задачи:

1. разработать метод построения полноатомных молекулярных моделей филаментной структуры мупьтимолекулярных комплексов ДНК трансфераз из Escherichia coli и Deinococcus radiodurans, а именно: гомополимер RecA, КесА::онДНК::АТФ, КесА::днДНК::АТФ, КесА::тнДНК::АТФ; и комплексов из Е. coli: ЯесХ::онДНК, RecA::RecX::oH,HHK::ATi>;

2. рассчитать методами молекулярной динамики (МД) зависимость от времени (МД траектории) построенных полноатомных филаментных структур мупьтимолекулярных комплексов ДНК трансфераз из Е. coli и D. radiodurans: гомополимер RecA, ЯесА::онДНК::АТФ, RecA::flHflHK::A^, RecA::xnflHK::ATO; и комплексов из Е. coli'. RecX-онДНК, RecA::RecX::oHflHK::ATO;

3. разработать метод расчёта спектров МУРН на основе структур мупьтимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз, полученных путём молекулярного моделирования, с возможностью усреднения спектра МУРН по МД траекториям;

4. разработать метод расчёта спектров НСЭ на основе структур мультимолекулярных ком-

плексов ДНК трансфераз, рассчитанных методами МД (по МД-траекториям);

5. провести регистрацию экспериментальных спектров МУРН нативных растворов мульти-молекулярных комплексов Е. coli : гомополимер RecA, RecA::oHflHK::AT<J>yS, RecX-онДНК и RecA::RecX::oHflHK::ATOyS;

6. провести сравнительный анализ теоретических спектров МУРН и НСЭ на структурах, полученных путем молекулярного моделирования, и экспериментальных спектров на предмет верификации разработанных методов моделирования мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз.

Научная новизна

1. Разработан новый метод решения прямой задачи - построение спектров МУРН на основании данных траекторий полноатомной МД филаментных структур мультимолекулярных нуклеопротеидных комплексов, позволяющий учитывать конформационную подвижность этих структур в растворах.

2. Разработан новый метод решения прямой задачи - построение спектров НСЭ на основании данных траекторий полноатомной МД филаментных структур мультимолекулярных нуклеопротеидных комплексов.

3. Впервые построена полноатомная структура комплекса белка RecX с онДНК.

4. Впервые построена полноатомная структура комплекса белка RecA в комплексе с белком RecX в присутствии онДНК, описывающая экспериментальные данные МУРН.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные в рамках траекторий полноатомной МД филаментные структуры мультимолекулярных нуклеопротеидных комплексов ДНК трансфераз могут быть использованы при решении прямой задачи в рамках других методов исследования, например в методе FRET (Forster Resonance Energy Transfer).

Разработанные методы расчёта спектров МУРН по полноатомным траекториям молекулярной динамики, позволяющие учитывать конформационную подвижность нуклеопротеидных комплексов в растворе, могут быть также использованы для расчёта спектров МУРН других молекулярных комплексов, таких как гликопротеины и другие сложные многокомпонентные молекулярные системы.

Разработанный метод расчёта спектров НСЭ по полноатомным траекториям молекулярной динамики позволяет использовать его для расчёта спектров НСЭ других сложных многокомпонентных молекулярных систем.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Новый метод решения прямой задачи - расчёт спектров МУРН по полноатомным траекториям МД, позволяющий учитывать конформационную подвижность нуклеопротеидных мультимолекулярных комплексов в растворе.

2. Новый метод решения прямой задачи - расчёт спектров НСЭ по полноатомным траекториям МД филаментных структур мультимолекулярных нуклеопротеидных комплексов в растворе.

3. Спектры МУРН, рассчитанные предлагаемым методом для гомополимера белка RecA и нуклеопротеидных комплексов ДНК-трансфераз из Е. coli и D. radiodurans, удовлетворительно описывают экспериментально наблюдаемые спектры МУРН.

4. Спектры НСЭ, рассчитанные предлагаемым методом для гомополимера белка RecA и нуклеопротеидных комплексов ДНК-трансфераз из D. radiodurans качественно согласуются с экспериментальными данными.

Апробация работы

Основные результаты диссертации докладывались на следующих конференциях: РНИКС (2010 [2] и 2012 [3]); РСНЭ-НБИК 2011 [4]; БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых [5]; Sweedish Neutron Scattering Society 14th Annual Meeting [6]; 5th European Conference on Neutron Scattering [7]; The Eleventh International Conference on Surface X-ray and Neutron Scattering SXNS-11 [8]; FEBS Congress [9, 10].

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работах, из них 4 статьи в рецензируемых журналах [1, 11-13], 9 тезисов докладов [2-10]. Личный вклад автора

Содержание диссертации и основные положения, выносимые на защиту, отражают персональный вклад автора в опубликованные работы. Подготовка к публикации полученных результатов проводилась совместно с соавторами, причем вклад диссертанта был определяющим. Все представленные в диссертации результаты, кроме экспериментальных данных МУРН и НСЭ, получены лично автором.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и включает введение, три главы (обзор литературы, методы, результаты и обсуждение) и выводы. Материал иллюстрирован 58 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель содержит 123 источника.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность диссертационной работы, сформулирована цель и аргументирована научная новизна исследования, показана практическая значимость полученных результатов, представлены выносимые на защиту научные положения.

1. Обзор литературы

Обобщены современные представления о структуре различных комплексов белков RecA из различных организмов. На основе анализа литературы был сделан вывод о том, что достаточно хорошо изучены только комплексы гомополимеров белков RecA, а также комплексы ЯесА::онДНК и ЯесА::днДНК. В то же время вопросы, касающиеся динамики таких комплексов, а также молекулярных механизмов взаимодействия RecA с его регуляторными белками, также как и молекулярного механизма поиска гомологии, остались не освещены. Описаны основные принципы МУРН и НСЭ, а также современные методы расчёта спектров по имеющимся структурным данным. Описан современный арсенал методов молекулярного моделирования.

2. Методы

2.1. Молекулярное моделирование

Рассмотрены подходы к построению макромолекулярных комплексов белков RecA и RecX на основании имеющихся данных рентгеновской кристаллографии, криоэлектронной микроскопии и литературных данных. На основании известных кристаллических структур мономеров белков RecA из Е. coli (PDB:2REB [14]) и D. radiodurans (PDB:1XP8 [16]) были построены модели гомополимеров белков RecA различной длины (тримеры и додекамеры). При этом недостающие фрагменты кристаллической структуры мономеров, а именно подвижные петли LI, L2 и LAL, были достроены с использованием методов молекулярного моделирования и программного пакета ICM [17, 18]. С использованием данных рентгеновской кристаллографии по

структуре комплексов химерного белка RecA из Е. coli с онДНК и днДНК были построены модели филаментов RecA на онДНК и днДНК для белка RecA из Е. coli. Для белка RecA из D. radiodurans модели комплексов с онДНК и днДНК были построены с использованием методов гомологического моделирования. Также были построены модели комплексов, имитирующие переходное состояние в реакции гомологической рекомбинации, а именно комплекс белков RecA с тнДНК. Для тнДНК использовался вариант хугстиновских [19] водородных связей между нук-леотидами в тнДНК. Исходя из структуры мономера белка RecX (PDB:3C1D [20]) из Е. coli были построены возможные варианты филаментов белка RecX как в варианте гомополимера, так и в двух различных вариантах на онДНК (рис. !). Также исхода из данных криоэлектронной микроскопии с помощью методов молекулярного докинга была построена серия моделей комплексов белка RecX с филаментом RecA, содержащего онДНК (рис. 2).

(б)

Рис. 1. Структуры возможных комплексов ЯесХ::онДНК из Е. coli. Возможна®! структура комплекса фи-ламента белка RecX, покрывающего онДНК с одной стороны (а) и структура сандвич-подобного типа (б)

2.2. Молекулярная динамика

Были произведены расчёты траекторий молекулярной динамики для всех моделей, построенных в предыдущем пункте. Для расчётов МД использован программный пакет GROMACS [21-25]. Для белков и ДНК использовано поле атЬег99зЫк!Ь [26], для явно заданной воды использовался набор параметров ЧрЗр [27]. Все системы были уравновешены в периодическом водном боксе (расстояние от стенок бокса до молекулярного комплекса составляло не менее 15 А) в течение 10 не при постоянной температуре 310 К и давлении 1 атм. Затем были получе-

Рис. 2. Структура комплекса Ree А: :ЯесХ::онДНК:: АТФ из Е. coli с соотношением RecA:RecX 12:5

ны траектории длиной от 50 не до 100 не при тех же условиях, что были заданы для уравновешивания системы для каждого комплекса, которые затем были подвергнуты анализу.

2.3. Моделирование спектров МУРН

Для расчета спектров МУРН использован метод расчета, основанный на методе Дебая:

s® = JgoV^, (1)

где G(f) является парной корреляционной функцией. Предполагая, что все ориентации биомакромолекулы равновероятны и будут равноценно представлены в растворе, с помощью формулы Дебая формулу (1) можно переписать следующим образом:

S(9) = JGWE^)dr. (2)

Для удобства расчёта спектра по фреймам молекулярной динамики парную корреляционную функцию можно записать в виде суммы по частицам (3), используя в качестве коэффициентов когерентные длины рассеяния bt и bj [28]:

G(r)= 2 b'bl- (3)

i.j r=m-fj\\

Тогда формулу (3) можно представить в виде гистограммы с заданной шириной бина dr, что будет предпочтительней для вычисления на компьютере. Для получения l(q) нам нужно использовать дискретный вариант формулы (3), который будет выглядеть следующим образом:

%) = £G(r)Ä>. (4)

г "

Метод был расширен для того, чтобы было возможно реализовать усреднение расчёта спектров по траектории МД. Для этого было произведено усреднение функции G(r) по всей траектории. Методы были реализованы в виде модуля g_sans для программного пакета GROMACS.

2.4. Моделирование спектров НСЭ

Для расчёта спектров НСЭ использован метод, сходный с методом расчёта спектров МУРН, с той лишь разницей, что для спектров НСЭ требуется также учитывать временные корреляции. Измеряемый сигнал является промежуточной функцией рассеяния 1($,т), которую можно записать следующим образом:

ОД, г) (5)

где <), соответствует усреднению по ансамблю, что эквивалентно усреднению по времени (. В случае если рассматриваемая нами частица находится в растворе и может свободно вращаться как целое, то, усредняя по ориентациям, выражение (5) можно переписать с использованием формулы Дебая:

(6)

где С(г,т) является пространственно-временной кросс-корреляционной функцией:

С(Г'Г)= Е ь,ь'- (7)

У т=||</-у|

где ¿>„ Ь) - длины рассеяния на частицах ! и у соответственно. При этом удобнее вместо функции в(г, т) использовать функцию Р(г, т), которая является нормированной версией С(г,т). Нормировку можно записать следующим образом:

Как следствие из нормировки (8) также получается нормировка функции /0?,т):

1пп/(5,т)=1. (9)

9-.0

Метод был реализован в виде модуля g_nse для программного пакета ОЕЮМАСЗ.

3. Результаты и обсуждения

3.1. Анализ траекторий комплексов белков RecA

Анализ средней информационной подвижности показал, что при взаимодействии белков RecA с ДНК происходит стабилизация комплексов. При этом во всех случаях средняя информационная подвижность белка RecA из D. radiodurans оказалась выше, чем у белков RecA их Е. coli. Дальнейший анализ выявил, что стабилизация в комплексах RecA с ДНК происходит

за счёт того, что петли L1 и L2 взаимодействуют с ДНК. Также с помощью метода анализа принципиальных компонент [29] движения была выявлена скоррелированность движений N- и С-концевых доменов как у белка RecA из Е. coli, так и у белка RecA из D. radiodurans. При этом С-концевой домен совершал повороты на угол до 80 ° у белка RecA из D. radiodurans и на угол до 50° у белка RecA из Е. coli.

3.2. Анализ траекторий комплексов белка RecX

Анализ конформационной подвижности комплексов белка RecX как в форме гомополимера, так и в форме комплексов с онДНК показал снижение конформационной подвижности комплексов в ряду гомополимер, комплекс на онДНК, сандвич-подобный комплекс на онДНК. Используя карты контактов (рис. 3), было выявлено также, что белок RecX взаимодействует с онДНК в основном за счет кулоновских взаимодействий (во взаимодействии преимущественно участвуют полярные аминокислоты R17 R20 R25 Н27 R33 К35 R91 R93 R150 и их окружение). Была обнаружена также способность сандвич-подобного комплекса белка RecX вытягивать онДНК до 5,5 А на основание (в случае В-формы - это 3,3 Á на основание, вытянутая же S-форма в комплексе RecA::oHflHK - это 5,0 Á на основание).

*42 х

а h

о.

<ц

£ О

1 1 ! 1

!>j ff.

ti1 я

» jJí ; '

Iii ' ; Si i I ■■ 1 1

50 100

Номер остатка, RecX

150

1.4 1.2 1 0.8 0.6

Рис. 3. Средняя карта контактов между белком RecX и онДНК для сандвич-подобного комплекса ЯесХ::онДНК из Е. coli

i et

а.

<и £ о

X .

ти п

1'I j р г i'ii^i 'Ч

Ни

.jfc

50 100

Номер остатка, RecX

"Л .

■ti lt

150

Рис. 4. Средняя карта контактов между белком RecX и онДНК для комплекса ЯесА::Р.есХ::онДНК Е. coli

300

S 250 c¿

Í 200

b 150

2 100 о X

50 1

- i 1 1

....... : £ JP ti^- ' ST- - - ■ .-¡„»niiiHi _ Jtfí"'

¡ ffä ' i --f

1 ! - ---

50 100

Номер остатка, RecX

150

1.4 1.2 1 0.8 0.6

Рис. 5. Средняя карта контактов между белками RecX и RecA для комплекса RecA::RecX::онДНК Е. coli

3.3. Анализ траекторий комплексов RccA::RecX::onAHK

Анализ траекторий комплексов RecA::RecX::oнДHK с различной стехиометрией позволил установить, что белок RecX имеет примерно те же наборы контактов с онДНК, что и в сандвич-подобном комплексе с онДНК (рис. 4). Также было выявлено, что с белком RecA белок RecX взаимодействует в основном в районе петель LI и L2 (аминокислотные остатки белка RecA 150-160 и 195-210 соответственно), взаимодействующих с онДНК. Интересным является также тот факт, что белок RecX имеет контакты в районе межмономерного интерфейса белка RecA (конец первой а-спирали - аминокислотные остатки 10-25, а-спираль 7 - аминокислотные остатки 122-135 и в районе петли LAL). Примечательно, что контакты между белком RecX и белком RecA возникают в подвижных областях белка RecA, таких как петли LI, L2 и LAL, за счет чего конформационная подвижность мономеров RecA снижается (рис. 5).

3.4. Анализ спектров МУРН комплексов белков RecA и RecX

0.01

0.001

RstA::онДНК »кспврикент н *»»„. RecA::oMflHK модель

Рис. 7. Сравнение модельного спектра МУРН для комплекса ЯесА::онДНК::АТФ из Е. coli с экспериментальным спектром МУРН

Применение метода расчёта спектров МУРН с учётом конформационной подвижности путём усреднения по траектории даёт лучшее согласование с экспериментом, чем для спектров МУРН, рассчитанных по единичному фрейму (рис. 6 и 7). Метод МУРН был также использован для экспериментальной верификации моделей комплексов белков RecA.■:RecX::oнДHK и комплексов RecX::oнДHK (рис. 8).

3.5. Анализ спектров НСЭ комплексов белков RecA

Для гомополимера и пресинаптического комплекса белка RecA из D. radiodurans были измерены экспериментальные спектры НСЭ и проведено сравнение спектров с модельными,

Рис. 6. Сравнение спектров, рассчитанных с помощью СЯУЭОЫ и g_sa!ls, с экспериментом для гомополимера белка КесА из й. гаЛШигаю

Я«сА::онДНК эксперимент >■■■» ■"

RecA: :онДНК модель --

RecA: :оиДНК + RecX акслеримент ■ •■•■■'*......

RecA: :онДНК + 3 RecX --

RecA: :онДНК + 5 RecX -

(а)

(б)

Рис. 8. Экспериментальные и модельные спектры МУРН для комплексов RecA::RecX::oHflHK::AT<t> из Е. coli с различным соотношением RecX:RecA (а) и для комплексов ЯесХ::онДНК из Е. coli (б)

0.8-

g 06 w

о" 0.4-W

ri 1 r^i

0.2-

— q»0.05 А 0.08 А'1

- 0.11 А1 ..... 0.14 А1

- 0.17 А"'

'"К

.....Й*

T-J О 0.4

-q-0.05 А

0.08 А'1

........ 0.11 А'1

-...... 0.14 А"'

0.17 А"'

—1—

20 30

t, ns

Рис. 9. Экспериментальные спектры НСЭ для гомополимера белка ЯесА (слева) и комплекса РесЛ::онДНК:: АТФуЗ (справа) из ¿3. гас1юс1игапз

полученными с МД-траекторий, длиной 100 не. Как видно из графиков спектров НСЭ для моделей (рис. 10) и экспериментальных данных, модельные спектры НСЭ качественно описывают эксперимент, они имеют те же характерные особенности, что и экспериментальные спектры.

Сравнение модели и экспериментальных данных показывает (рис. 11), что модель качественно согласуется с экспериментом. Модельная система, также как и экспериментальные данные, дают схожую зависимость диффузии от векторов рассеяния как для комплекса гомополимера белка RecA из П. га<Ио<1игап$, так и для пресинаптического комплекса RecA::oнДHK::ATФyS, однако абсолютные значения диффузии, которые дает модель, отличается от эксперимента, что может быть обусловлено тем, что реальные комплексы в растворе имеют гораздо большие размеры по сравнению с модельной системой.

а А"1

Рис. 11. Экспериментальный (слева) и модельный спектр МУРН и зависимость диффузии от вектора рассеяния для гомополимера белка ЛесА и комплекса 11есА::онДНК::АТФу8 из £>. гасИос1игап8

4. Основные результаты и выводы

1. Построены полноатомные структуры гомополимера белка ЯесА из Е. соИ и О. гайюйигапБ и его нуклеопротеидных комплексов с онДНК и днДНК в рамках траекторий молекуляр-

= 0-05 А"1 0.08 А-1 011 А"1

Рис. 10. Модельные спектры НСЭ для гомополимера белка ЯесА (слева) и комплекса ЛесА::онДНК: :АТФу8 (справа) из £>. ra.diodura.ns

■ Л-ее Шатеп! РесА • ргевупар^с сотр1ех

ной динамики, позволяющие учитывать (информационную подвижность нуклеопротеид-ных мультимолекулярных комплексов в растворе при решении прямой задачи - расчете спектров МУРН.

2. Разработан новый метод решения прямой задачи: расчет спектров МУРН по полноатомным траекториям молекулярной динамики, позволяющий учитывать ¡информационную подвижность нуклеопротеидных мультимолекулярных комплексов в растворе.

3. Разработан новый метод решения прямой задачи: расчет спектров НСЭ по полноатомным траекториям молекулярной динамики филаментных структур мультимолекулярных нуклеопротеидных комплексов в растворе.

4. Спектры МУРН, рассчитанные предлагаемым методом для гомополимера белка RecA и нуклеопротеидных комплексов ДНК-трансфераз из Е. coli и D. radiodurans, удовлетворительно описывают экспериментально наблюдаемые спектры МУРН.

5. Спектры НСЭ, рассчитанные предлагаемым методом для гомополимера белка RecA и нуклеопротеидных комплексов ДНК трансфераз из D. radiodurans, качественно согласуются с экспериментальными данными.

6. Впервые построена полноатомная структура комплекса белка RecX с онДНК, согласующаяся с данными МУРН, и предложена модель взаимодействия RecX с онДНК.

7. Впервые построена полноатомная структура комплекса белка RecA в комплексе с белком RecX в присутствии онДНК, описывающая экспериментальные данные МУРН.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Garmay Yu., Shvetsov A., Karelov D. el al. Correlated motion of protein subdomains and large-scale conformational flexibility of RecA protein filament // Journal of Physics: Conference Series. 2012. Vol. 340, no. 1. P. 012094.

2. Швецов A.B., Гармай Ю.П., Лебедев Д.В. el al. Расчет и анализ молекулярной динамики ДНК-связывающих белков для моделирования данных нейтронного рассеяния // XXI Совещание по использованию нейтронов в исследованиях конденсированного состояния (РНИКС-2010). РНЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия: 2010.

3. Швецов А.В., Лебедев Д.В., Исаев-Иванов В.В. Моделирование данных малоуглового нейтронного рассеяния и нейтронного спинового эха при исследовании биомакромолекул методами молекулярной динамики // XXIII Совещание по использованию нейтронов в исследованиях конденсированного состояния (РНИКС-2012). РНЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия: 2012.

4. Швецов А.В., Гармай Ю.П., Лебедев Д.В. et al. Моделирование данных малоугаового рассеяния нейтронов с помощью методов молекулярной динамики на примере ДНК-трансфераз // VIII Национальная конференция "Рентгеновское Синхротронное излучение, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии". РСНЭ-НБИК. РНЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия: 2011.

5. Швецов А.В., Гармай Ю.П., Лебедев Д.В. et al. Расчет и анализ молекулярной динамики ДНК-связывающих белков для моделирования данных нейтронного рассеяния // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, Россия: 2011.

6. Shvetsov A., Garmay Yu., Lebedev D. et al. Molecular dynamics and large-scale conformational flexibility of RecA proteins. // Sweedish Neutron Scattering Society 14th .Annual Meeting & Bioin-teTfaces - From molecular understanding to application. International Workshop. Lund, Sweeden: 2010.

7. Shvetsov A., Garmay Yu., Lebedev D. et al. Molecular dynamics and large-scale conformational flexibility of DNA-transferases // 5th European Conference on Neutron Scattering. Prague, Czech Republic: 2011.

8. Ilatovskiy A.V., Garmay Yu.P., Shvetsov A.V. et al. Molecular Dynamics and Large-Scale Conformational Flexibility of DNA-binding Proteins // The Eleventh International Conference on Surface X-ray and Neutron Scattering SXNS-11. Evanston, IL, USA: 2010.

9. Shvetsov Alexey, Lebedev Dmitry, Baitin Dmitry et al. Structure of RecX complex with the presynaptic RecA filament: molecular dynamics simulations and small angle neutron scattering // FEBS Congress, Main Symposia And Workshops. Saint-Petersburg, Russia: 2013.

10. Shvetsov Alexey, Lebedev Dmitry, Ivanova Oxana et al. Large-scale mobility of RecA protein filaments in solution by molecular dynamics simulation and neutron spin echo // FEBS Congress, Main Symposia And Workshops. Saint-Petersburg, Russia: 2013.

11. Shvetsov A., Lebedev D., Chervyakova D. et al. Structure of RecX protein complex with the presynaptic RecA filament: molecular dynamics simulations and small angle neutron scattering // FEBS Letters. 2013.

12. Швецов A.B., Шмидт A.E., Лебедев Д.В., Исаев-Иванов В.В. Метод расчета спектров малоуглового нейтронного рассеяния по полноатомным траекториям молекулярной динамики // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2013. Т. 12. С. 1-5.

13. Дуцкина А.В., Швецов А.В., Бахланова И.В., Байтин Д.М. Изменение динамики ф«ламентации белка RecA, вызванное аминокислотной заменой D112R либо замещением АТР на dATP, приводит к устойчивости филамента к действию белка RecX // Молекулярная биология. 2011. Т. 45. С. 546-553.

Цитированная литература

14. Story Randall М., Weber Irene Т., Steitz Thomas A. The structure of the К coli recA protein monomer and polymer // Nature. 1992. Vol. 355, no. 6358. P. 318-325.

15. Chen Zhucheng, Yang Haijuan, Pavletich Nikola P. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures //Nature. 2008. Vol. 453, no. 7194. P. 489-494.

16. Rajan Rakhi, Bell Charles E. Crystal Structure of RecA from Deinococcus radiodurans: Insights into the Structural Basis of Extreme Radioresistance // Journal of Molecular Biology. 2004. Vol. 344, no. 4. P. 951-963.

17. Abagyan Ruben, Totrov Maxim, Kuznetsov Dmitry. ICM: A new method for protein modeling and design: Applications to docking and structure prediction from the distorted native conformation // Journal of Computational Chemistry. 1994. Vol. 15, no. 5. P. 488-506.

18. Abagyan Ruben, Totrov Maxim. Biased Probability Monte Carlo Conformational Searches and Electrostatic Calculations for Peptides and Proteins // Journal of Molecular Biology. 1994. Vol. 235, no. 3. P. 983-1002.

19. Hoogsteen K. The crystal and molecular structure of a hydrogen-bonded complex between 1-methylthymine and 9-methyladenine//Acta Crystallographica. 1963. Vol. 16, no. 9. P. 907-916.

20. Ragone Stefania, Maman Joseph D., Furnham Nicholas, Pellegrini Luca. Structural basis for inhibition of homologous recombination by the RecX protein // EMBO J. 2008. Vol. 27, no. 16. P. 2259-2269.

21. Berendsen H.J.C., van der Spoel D., van Drunen R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation // Computer Physics Communications. 1995. Vol. 91, no. 1-3. P. 43-56.

22. Lindahl Erik, Hess Berk, van der Spoel David. GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis // Molecular modeling annual. 2001. Vol. 7, no. 8. P. 306-317.

23. Van Der Spoel David, Lindahl Erik, Hess Berk et al. GROMACS: Fast, flexible, and free // Journal of Computational Chemistry. 2005. Vol. 26, no. 16. P. 1701-1718.

24. Hess Berk, Kutzner Carsten, van der Spoel David, Lindahl Erik. GROMACS 4: Algorithms for Highly Efficient, Load-Balanced, and Scalable Molecular Simulation // Journal of Chemical Theory and Computation. 2008. Vol. 4, no. 3. P. 435^147.

25. Pronk Sander, Pall Szilard, Schulz Roland et al. GROMACS 4.5: a high-throughput and highly parallel open source molecular simulation toolkit // Bioinformatics. 2013. Vol. 29, no. 7. P. 845-854.

26. Lindorff-Larsen Kresten, Piana Stefano, Palmo Kim et al. Improved side-chain torsion potentials for the Amber S99SB protein force field // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2010. Vol. 78, no. 8.

27. Jorgensen William L., Chandrasekhar Jayaraman, Madura Jeffry D. et al. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water // The Journal of Chemical Physics. 1983. Vol. 79, no. 2. P. 926-935.

28. Sears Yarley F. Neutron scattering lengths and cross section // Neutron News. 1992. Vol. 3, no. 3. P. 26-37.

29. Amadei Andrea, Linssen Antonius B. M., Berendsen Herman J. C. Essential dynamics of proteins// Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 1993. Vol. 17, no. 4. P. 412-425.

Отпечатано в типографии ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ «Курчатовский институт») 188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 356, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 20.11.2013 г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Швецов, Алексей Валерьевич, Санкт-Петербург

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова»

На правах рукописи

и ч и 1 % 5 3 1 о 3

<Мь4

Швецов Алексей Валерьевич

03.01.02 - биофизика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель

кандидат физико-математических наук

Исаев-Иванов Владимир Васильевич

Санкт-Петербург - 2013

Содержание

Введение............................................................................6

Глава 1. Обзор литературы....................................................12

1.1. Структура и функции семейства белков гомологической рекомбинации Ree А............................................................12

1.2. Исследования структуры комплексов белков Ree А в растворе с помощью методов МУРН и НСЭ......................................18

1.3. Применение методов молекулярного моделирования к нук-леопротеидным комплексам ......................20

Глава 2. Методы ................................24

2.1. Молекулярное моделирование.....................24

2.1.1. Моделирование филаментов белка RecA..........24

2.1.1.1. Моделирование гомополимера белков RecA

из Е. coli и D. radiodurans............24

2.1.1.2. Моделирование комплекса RecA::онДНК::АТФ из Е. coli и D. radiodurans 26

2.1.1.3. Моделирование комплекса RecA::днДHK::ATФ из Е. coli и D. radiodurans 30

2.1.1.4. Моделирование комплекса RecA::THflHK::ATO из Е. coli и D. radiodurans 31

2.1.2. Моделирование комплексов белка RecX из Е. coli.....34

2.1.2.1. Моделирование гомополимера белка RecX из

Е. coli........................34

2.1.2.2. Моделирование комплекса RecX: юнДНК . ... 35

2.1.2.3. Моделирование комплекса RecA:^есХ::онДНК::АТФ из Е. coli......37

2.2. Молекулярная динамика........................38

2.3. Моделирование спектров МУРН...................42

2.3.1. Расчёт спектра МУРН по одному фрейму траектории ... 42

2.3.2. Усреднение спектра МУРН по всей траектории или её части..............................43

2.3.3. Реализация метода в виде модуля g_sans для GROMACS . 44

2.3.3.1. Реализация параллельного метода Дебая в модуле g sans для GROMACS...........45

2.3.3.2. Реализация параллельного метода Монте-Карло в модуле g_sans для GROMACS.....45

2.4. Моделирование спектров НСЭ ....................46

2.4.1. Реализация алгоритма расчета спкетра НСЭ в модуле

g_nse в GROMACS......................47

2.5. Экспериментальное измерение спектров МУРН нуклеопротеид-

ных комплексов.............................47

2.6. Экспериментальное измерение спектров НСЭ нуклеопротеидных комплексов ...............................48

Глава 3. Результаты и обсуждения......................49

3.1. Анализ МД траекторий комплексов тримеров белка RecA.....49

3.1.1. Анализ средней конформационной подвижности комплексов тримеров белков RecA ...............49

3.1.2. Анализ локальной конформационной подвижности комплексов тримеров белков RecA ...............51

3.1.3. Анализ принципиальных компонент движения комплексов тримеров белков RecA..................55

3.2. Анализ МД траекторий комплексов додекамеров белка RecA ... 57 3.2.1. Анализ средней конформационной подвижности комплексов додекамеров белков RecA..............58

3.2.2. Анализ локальной конформационной подвижности комплексов додекамеров белков ЫесА..............64

3.2.3. Анализ динамики изменения шага филамента додекамеров белков ЫесА........................69

3.3. Анализ МД траекторий комплексов белка ЯесХ...........71

3.3.1. Средняя конформационнная подвижность комплексов белка ЫесХ...........................71

3.3.2. Локальная конформационнная подвижность комплексов белка ЯесХ...........................74

3.3.3. Взаимодействия белка ЯесХ и онДНК в комплексах белков ЯесХ::онДНК из Е. соН..................76

3.4. Анализ МД траектории комплекса 11есА::11есХ::онДНК......78

3.4.1. Средняя конформационная подвижность комплексов

белков ЯесА: :ЯесХ: :онДНК .................78

3.4.2. Взаимодействия между белком RecX, белком RecA и

онДНК в комплексе 11есА::КесХ::онДНК из Е. coli .... 78

3.5. Анализ спектров МУРН комплексов гомополимеров белков RecA, КесХ::онДНК, RecA:: RecX:: онДНК: : ATOyS и RecA: :онДНК:: ATOyS.........................81

3.5.1. Анализ спектров МУРН комплексов гомополимеров белков RecA и RecA::онДНК:: ATOyS из Е. coli и

D. radiodurans.........................81

3.5.2. Анализ спектров МУРН комплексов RecX::oHflHK и RecA: :RecX: :онДНК::ATOyS из Е. coli...........83

3.6. Анализ спектров НСЭ комплексов гомополимеров белка RecA и RecA::онДНК::ATOyS из D. radiodurans...............85

Основные результаты и выводы........................89

Список сокращений и условных обозначений ...............91

Список работ опубликованных по теме диссертации...........92

Цитированная литература...........................95

Список иллюстраций..............................109

Введение

Актуальность исследования

Белок RecA, принадлежащий к классу ДНК-трансфераз, - это один из основных белков, ответственный за гомологичную рекомбинацию и репарацию ДНК у бактерий. RecA осуществляет реакцию гомологической рекомбинации: перенос гомологичных нитей ДНК, что позволяет исправлять двунитевые разрывы ДНК или другие повреждения, вызванные, например, воздействием ионизирующего излучения. Белки RecA в растворе функционируют в виде гомофи-ламентов или же в виде филаментов, образованных на он- или днДНК. На протяжении последних 20 лет стали известны несколько десятков кристаллических структур филаментов белков семейства RecA [14]. Белок RecA состоит из трёх доменов: С-концевого, N-концевого и Р-домена. Образование филаментов происходит за счёт взаимодействия jß-листов Р- и N- доменов соседних мономеров. Недавно стала известна структура комплекса белка RecA с онДНК и с днДНК [15]. Но, несмотря на это, остаётся нераскрытым вопрос: какие именно конфор-мационные изменения ответственны за перенос нитей ДНК в реакции гомологической рекомбинации ДНК.

Белки RecA, а также их нуклеопротеидные комплексы исследовались в растворе с помощью методов малоуглового рассеяние нейтронов (МУРН) и малоуглового рассеяния рентгена (МУРР). Эти методы позволяют получать структурно-динамическую информацию о сложных нуклеопротеидных комплексах в нативном состоянии, и это их преимущество, но, с другой стороны, они явля-

ются методами низкого разрешения. В силу последнего обстоятельства решение обратной задачи - получение из экспериментальных спектров структурно-динамических параметров исследуемого комплекса при использовании этих методов - требует точного знания структуры и внутренней динамики исследуемого нук-леопротеидного комплекса. Так как исследуемый комплекс находится в растворе и имеет ненулевую конформационную подвижность, в большинстве случаев теоретические кривые МУРН, полученные с использованием только одной статической структуры, не в состоянии адекватно описать экспериментальные данные [1]. Таким образом, разработка методов структурно-динамического молекулярного моделирования сложных нуклеопротеидных комплексов, в том числе муль-тимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз, которые могут являться основой для расчёта спектров МУРН и МУРР с учетом конформационной подвижности нуклеопротеидных комплексов в растворе, является актуальной задачей.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является разработка методов структурно-динами-

ческого молекулярного моделирования и методов верификации полноатомных моделей с помощью МУРН и НСЭ при исследовании мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. разработать метод построения полноатомных молекулярных моделей фи-ламентной структуры мультимолекулярных комплексов ДНК трансфе-раз из Escherichia coli и Deinococcus radiodurans, а именно: гомополи-мер RecA, RecA::oнДHK::ATФ, RecA::днДHK::ATФ, КесА::тнДНК::АТФ; и комплексов из Е. coli: КесХ::онДНК, RecA::RecX::oнДHK::ATФ;

2. рассчитать методами молекулярной динамики (МД) зависимость от времени (МД траектории) построенных полноатомных филамент-ных структур мультимолекулярных комплексов ДНК трансфераз из Е. coli и D. radiodurans: гомополимер RecA, RecA::oнДHK::ATФ, КесА::днДНК::АТФ, RecA::тнДHK::ATФ; и комплексов из Е. coli: RecX::онДНК, RecA::RecX::онДНК::АТФ;

3. разработать метод расчёта спектров МУРН на основе структур мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз, полученных путём молекулярного моделирования, с возможностью усреднения спектра МУРН по МД траекториям;

4. разработать метод расчёта спектров НСЭ на основе структур мультимолекулярных комплексов ДНК трансфераз, рассчитанных методами МД (по МД-траекториям);

5. провести регистрацию экспериментальных спектров МУРН нативных растворов мультимолекулярных комплексов Е. coli : гомополимер RecA, RecA::онДНК::АТФу8, RecX::oнДHK и КесА:^есХ::онДНК::АТФу8;

6. провести сравнительный анализ теоретических спектров МУРН и НСЭ на

структурах, полученных путем молекулярного моделирования, и экспериментальных спектров на предмет верификации разработанных методов моделирования мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз.

Научная новизна

3. Впервые построена полноатомная структура комплекса белка RecX с онДНК.

Теоретическая и практическая значимость

Апробация работы

Основные результаты диссертации докладывались на следующих конференциях: РНИКС (2010 [2] и 2012 [3]); РСНЭ-НБИК 2011 [4]; БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА: 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых [5]; Sweedish Neutron Scattering Society 14th Annual Meeting [6]; 5th European Conference on Neutron Scattering [7]; The Eleventh International Conference on Surface X-ray and Neutron Scattering SXNS-11 [8]; FEBS Congress [9, 10].

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работах, из них 4 статьи в рецензируемых журналах [1, 11-13], 9 тезисов докладов [2-10].

Личный вклад автора

Структура и объем диссертации

Глава 1

Обзор литературы

1.1. Структура и функции семейства белков гомологической рекомбинации RecA

Белок ReeA являясь центральным ферментом в реакции гомологической рекомбинации и рекомбинационной репарации ДНК в бактериях, также играет главную роль в репродуцировании и поддержания целостности генома [16-19]. В ходе нормального клеточного роста белок RecA необходим при вынужденной остановки репликации, что сопровождается коллапсом репликативной вилки вблизи повреждения на онДНК. RecA-подобные белки принадлежат к большому семейству белков, включая белки RecA в бактериях, белки Rad51 и Dmcl у эукариот, и белок RadA у архей. Белок RecA функционирует in vivo и in vitro в виде полимерного филамента. Активная форма филамента белка RecA способна связываться с однонитевой ДНК (онДНК) в присутствии АТФ и ионов Mg2+. Активированная форма филамента RecA (комплекс RecA: :онДНК::АТФ) способна взаимодействовать с двунитевой ДНК (днДНК), после чего происходит гомологичное спаривание онДНК и днДНК внутри филамента RecA (образование промежуточного комплекса содержащего трёхнитевую ДНК (тнДНК) RecA: :тнДНК::АТФ) и обмен нитями между днДНК и онДНК (образование комплекса RecA::днДНК::АТФ + онДНК), что составляет три основных этапа реакции гомологичной рекомбинации.

В живой клетке, при наличии большого количества повреждений ДНК, возрастает количество филаментов белка RecA на онДНК, что инициирует так называемую SOS-функцию белка [16, 18, 20-22]. В норме SOS-состояние клетки контролируется репрессорным белком LexA, который при взаимодействии с филаментом RecA начинает интенсивно саморасщепляться. По мере того, как

концентрация LexA в клетке уменьшается, промоторы генов SOS-ответа открываются. При этом изменяется экспрессия более 40 генов, в том числе, и самого гена гесА. Активность синтезированого в клетке RecA находится под строгим контролем белков, непосредственно взаимодействующих с филаментом RecA. В настоящее время известно более десятка вспомогательных белков, участвующих в регуляции активности филамента RecA. Это RecO, RecF, RecR, RecX, PsiB, DinI, DinD, SSB и некоторые другие [22-29]. Все они могут быть подразделены на группы позитивных и негативных регуляторов, хотя это деление достаточно условно, поскольку некоторые из них, подавляя одни функции филамента, активируют другие. Особый интерес представляет белок RecX [30-36]. Белок RecX является негативным регулятором белка RecA как in vivo, так и in vitro. Показано, что RecX, взаимодействуя непосредственно с RecA, препятствует элонгации филамента, способствуя его диссоциации от ДНК [31]. Существует несколько моделей угнетения филаментации белка RecA белком RecX. Согласно одной из них, RecX находит брешь между соседними кластерами мономеров RecA и, связываясь с ближайшим мономером, прерывает полимеризацию мономеров вдоль нити ДНК. При этом динамика диссоциации мономеров от 5'-конца филамента не нарушается, но прекращается процесс сборки, а именно - этапа достройки филамента с 3'-конца за счет присоединения новых мономеров [31]. Исходя из другой модели, RecX взаимодействует с мономерами RecA спонтанно вдоль всего филамента, провоцируя диссоциацию RecA прямо в местах их взаимодей�

Информация о работе

Швецов, Алексей Валерьевич
кандидата физико-математических наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 03.01.02

Диссертация

Структурно-динамическое моделирование и нейтронная спектроскопия мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы