Структура и свойства комплексов порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами и магнитными частицами

Кульвелис, Юрий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура и свойства комплексов порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами и магнитными частицами
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структура и свойства комплексов порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами и магнитными частицами"

На права^тЫЬиси

Кульвелис Юрий Викторович

СТРУКТУРА И СВОЙСТВА КОМПЛЕКСОВ ПОРФИРИНОВ И ИХ АНАЛОГОВ С БИОСОВМЕСТИМЫМИ ПОЛИМЕРАМИ И МАГНИТНЫМИ ЧАСТИЦАМИ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Санкт-Петербург -

003473263

Работа выполнена в Отделении нейтронных исследований Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук Лебедев Василий Тимофеевич. Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Вахрушев Сергей Борисович, доктор физико-математических наук, профессор Кожевников Николай Михайлович.

Ведущая организация: Физический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится "22-" июня 2009 г. в / б часов на заседании Диссертационного совета Д 212.229.25 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет» по адресу: 194021, Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 5, факультет медицинской физики и биоинженерии, ауд. 305.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет».

Автореферат разослан" мая 2009 г,

Ученый секретарь диссертационного совета

Власова О.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Порфирины и их аналоги - макрогетероциклические соединения, содержащие в своей основе цикл порфина. Природные порфирины являются широко распространенными веществами и выполняют важнейшие биологические функции. Наиболее известные из них - это хлорофилл и гем крови, которые обеспечивают процессы фотосинтеза и дыхания. Порфирины также входят в состав гемоглобина, миоглобина, ферментов каталазы, пероксидазы и группы цитохромов.

Важной областью применения порфиринов и их аналогов является медицина. Интенсивно развиваются исследования порфиринов в качестве сенсибилизаторов для фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний, основанной на способности порфиринов к накоплению преимущественно в опухолевых клетках и к генерации цитотоксичного синглетного кислорода. Наиболее эффективным сенсибилизатором, разработанным и применяющимся в России, является фотодитазин (производное хлорина), однако он не всегда накапливается в опухолевых клетках с достаточным контрастом по сравнению с нормальными. Важной задачей является повышение контраста накопления сенсибилизатора, например, в комплексе с внешне управляемым магнитным носителем. Известны антивирусные свойства некоторых порфиринов. Так, сульфированные тетрафенилпорфины, помимо фотодинамической активности, проявляют активность против вируса иммунодефицита. Сульфированные дифталоцианины металлов активны протав вируса гриппа, саркомы Рауса.

Терапевтический эффект порфиринов напрямую связан со структурной организацией и взаимодействием порфиринов с молекулами и органеллами в живых клетках и организмах. Актуальной задачей является изучение механизмов взаимодействия порфиринов и их аналогов с различными биомолекулами (ДНК, белки, ферменты) и другими биосовместимыми полимерами в связи с необходимостью разработки новых эффективных антивирусных и терапевтических препаратов.

Цель работы заключалась в изучении механизмов взаимодействия порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами (поли-Ы-винилпирролидон и ДНК) и магнитными частицами для создания перспективных антивирусных и противоопухолевых препаратов, исследовании структуры комплексов порфирин-полимер и магнитных носителей с фотодитазином для магнитоуправляемого транспорта препарата к опухолевым клеткам, а также оценке эффективности магнитоуправляемого противоопухолевого препарата в доклинических испытаниях на животных.

Задачи исследования:

1. Исследование межмолекулярных взаимодействий и образования комплексов в водных растворах при взаимодействии сульфированного тетрафенилпорфина и поли-И-винилпирролидона, определение характера конформационных изменений полимера при комплексообразовании, анализ молекулярной структуры комплексов и количественных характеристик связывания в зависимости от температуры и соотношения концентраций компонентов.

2. Изучение механизмов образования комплексов сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с макромолекулами ДНК, исследование структуры комплексов и их гидродинамических свойств в водно-солевых растворах.

3. Разработка стабильного наноразмерного магнитоуправляемого носителя для фотодитазина на основе частиц магнитной жидкости для повышения эффективности препарата для фотодинамической терапии. Определение и сравнительный анализ структуры магнитных наносистем с фотодитазином и тройных комплексов с биосовместимым полимером (плюроником), стимулирующим активность

. фотодитазина в модельных системах.

4. Проверка эффективности разработанных магнитных комплексов с фотодитазином и плюроником в ходе биомедицинских тестов на животных.

Научная новизна работы.

1. Установлено образование комплексов сульфированного тетрафенилпорфина с поли-№ винилпирролидоном в водных растворах, определена молекулярная структура, гидродинамические и спектральные характеристики комплексов.

2. Установлено образование комплексов отрицательно заряженных сульфированных дифталоцианинов с ДНК в водно-солевых растворах, определены структурные и гидродинамические свойства комплексов.

3. Разработаны стабильные магнитоуправляемые комплексы на основе наночастиц магнетита, связанных с молекулами сенсибилизатора фотодитазина. Достигнута биосовместимость комплексов при сохранении функциональных свойств сенсибилизатора, в том числе с использованием плюроников, связывающих фотодитазин и повышающих его эффективность.

4. Показано торможение роста опухоли в ходе доклинических испытаний на мышах при применении магнитоуправляемого комплекса с фотодитазином и направленной доставке препарата с помощью внешнего магнитного поля. Использование плюроника в составе комплексов увеличивает терапевтическое воздействие на опухоль.

Практическая значимость работы. Синтезированные и исследованные в работе комплексы порфиринов и их аналогов с поли-И-винилпирролидоном и ДНК перспективны для создания новых эффективных антивирусных препаратов. Полученные магнитоуправляемые комплексы с фотодитазином представляют практический интерес в качестве эффективных сенсибилизаторов для фотодинамической терапии. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сульфированный тетрафенилпорфин образует комплексы с макромолекулами поли-Ы-винилпирролидона по данным спектрофотометрического титрования, рассеяния нейтронов, вискозиметрии и динамического рассеяния света. Связывание носит кооперативный характер и приводит к нарушению электронейтральности цепей полимера при низких ионных силах внешнего электролита.

2. Отрицательно заряженные сульфированные дифталоцианины лютеция и скандия образуют комплексы с ДНК в водно-солевых растворах, приводя к компактизации молекулы ДНК, что подтверждено данными рассеяния нейтронов, вискозиметрии, спектрофотометрического титрования.

3. Установленные по данным рассеяния нейтронов структура и характер корреляций между частицами в магнитных жидкостях регулируются способами стабилизации феррочастиц. В феррожидкостях, стабилизированных лимонной кислотой, частицы ассоциируют в цепные структуры по мере повышения концентрации синтезированной магнитной жидкости.

4. Введение макромолекул плюроника, играющего роль полимерного поверхностно-активного вещества, в феррожидкость блокирует образование цепных структур, вызывая формирование глобулярных кластеров из феррочастиц в оболочках плюроника.

5. Фотодитазин в составе синтезированных магнитных комплексов с плюроником не только сохраняет свои функциональные свойства, но и приобретает повышенную эффективность как магнитоуправляемый сенсибилизатор для фотодинамической терапии.

Личный вклад автора заключается непосредственно в постановке задач, планировании, подготовке и проведении экспериментов, обсуждении результатов и оформлении публикаций. Экспериментальная часть работы (опыты по рассеянию нейтронов и динамическому рассеянию света, вискозиметрии и спектрофотометрии, разработка структурных моделей исследованных систем, фурье-анализ данных нейтронного рассеяния) практически полностью выполнена автором. Публикации на 90% написаны и

подготовлены к печати лично автором.

Достоверность полученных результатов подтверждается высокой воспроизводимостью и взаимной согласованностью результатов, полученных независимыми методами.

Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены на следующих российских и международных научных конференциях: III и IV Всероссийские Каргинские конференции (Москва, 2004 и 2007); XII, XIII и XIV симпозиумы по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Пущино, 2004, Санкт-Петербург, 2006, Челябинск, 2008); I Всероссийская школа-конференция «Молодые ученые - новой России. Фундаментальные исследования в области химии и инновационная деятельность» (Иваново, 2005); XIX и XX Совещания по использованию рассеяния нейтронов в исследованиях конденсированного состояния (Обнинск, 2006, Гатчина, 2008); I и II Региональные конференции молодых ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем (Крестовские чтения)» (Иваново, 2006,2007); International Workshop on Nanobiotechnologies (Saint-Petersburg, 2006); VI Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва, 2007); V International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines (Moscow, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе статей в журналах из перечня ВАК - 3, препринтов и сообщений ПИЯФ - 3, тезисов докладов на отечественных и международных конференциях - 9.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, приложения, заключения и списка цитируемой литературы (196 наименований). Работа изложена на 168 страницах, включая 69 рисунков и 32 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи работы, основные положения, выносимые на защиту, научная новизна и практическая значимость.

Глава 1. Литературный обзор посвящен современным представлениям о структуре и физико-химических свойствах порфиринов и их аналогов, характеристикам их электронных спектров поглощения, комплексообразующим свойствам и перспективам их биомедицинского применения. Представлены обзоры по сенсибилизаторам для ФДТ на основе порфиринов и их аналогов, комплексообразующим свойствам поли-N-

виниламидов и ДНК, синтезу и применению магнитных жидкостей. Глава 2. Объекты и методы исследования. Объектами исследования настоящей работы являлись водорастворимые порфирины и их аналоги: сульфированные дифталоцианины лютеция и скандия (рис. 1), сульфированный тетрафенилпорфин дигидрохлорид (рис. 2) и фотодитазин (рис. 3).

Рис. 1. Анион сульфированного дифталоцианина металла (МРсгЗц'), М = Ьи или Бс

Рис. 2. Сульфированный тетрафенилпорфин дигидрохлорид (НгТРРЗДНС!^)

СООН

'СООНСтНиМОз

СООНС?Н1?ЫОз Рис. 3. Фотодитазин

Проанализированы возможности различных методов исследования структуры и физико-химических свойств растворов при изучении молекулярных комплексов и обоснован выбор гидродинамических, спектральных методов и метода малоуглового рассеяния нейтронов для решения поставленных задач.

Спектры поглощения порфиринов в видимой области чувствительны к комплексообразованию, поэтому анализ спектров поглощения (спектрофотометрическое титрование) использовали для установления образования комплексов порфирин-полимер и определения количественных характеристик связывания. Спектры поглощения служили также для проверки сохранения свойств фотодитазина в комплексе с феррочастицами. Использованы спектрофотометры СФ-26 и Hitachi U-3310 в области длин волн 250-1100 нм.

Гидродинамические методы (вискозиметрия, динамическое рассеяние света) использовались для оценки размеров и характеристики конформаций полимерных молекул. Для измерений вязкости использовали капиллярный вискозиметр Оствальда (при исследовании ПВП) и ротационный низкоградиентный вискозиметр Зимма (для ДНК). Динамическое рассеяние света проводили на длине волны 632.8 нм, используя анализатор Autosizer IIC (Malvern Instruments Ltd.) с углом рассеяния 90° и коррелятор PhotoCor-SP (углы рассеяния 30-110°).

Малоугловое рассеяние нейтронов является прямым методом, позволяющим расшифровать структуру образца на масштабах от единиц до сотен нанометров, определить размеры и форму составляющих его частиц (комплексов), установить пространственные корреляции между частицами. Нейтронные опыты проводились на двух дифрактометрах («Мембрана-2», реактор ВВР-М, ПИЯФ РАН, с диапазоном переданных импульсов q = 0.03-0.8 нм'1 при длине волны нейтронов X = 0.3 нм и «Yellow submarine», Нейтронный центр Будапешта, q = 0.1-4.3 нм"1, X = 0.4, 0.75 нм). Глава 3. Исследование взаимодействия сульфированных порфиринов и дифталоцианинов металлов с поли-Ы-винилпирролидоном и ДНК. Постановка задачи обусловлена антивирусными свойствами некоторых сульфированных порфиринов и их аналогов, в частности тетрафенилпорфина и дифталоцианинов лютеция и скандия. В связи с возможностью использования этих соединений в составе медицинских препаратов одной из важных задач является изучение взаимодействия их с различными биополимерами. В качестве такого полимера был выбран поли-Ы-винилпирролидон (ПВП), типичный полимер медицинского назначения, который входит в состав многих лекарственных препаратов и обладает выраженной способностью формировать молекулярные

комплексы, а также ДНК, с которой могут взаимодействовать порфирины в случае проникновения в живую клетку. Глава посвящена анализу взаимодействия сульфированного тетрафенилпорфина с ПВП и сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с ДНК и исследованию структуры полученных комплексов порфирин-полимер.

3.1. Комплексы сульфированного тетрафенилпорфина с поли-Ы-виниллирролидоном. Методами спектрофотометр!!» в видимой области, вискозиметрии, динамического рассеяния света и холодных нейтронов анализировались водные растворы ПВП с добавлением сульфированного тетрафенилпорфина НгТРРв^НСЦг (ТРРЭ). Образование комплексов показано спектрофотометрическим титрованием водных растворов ТРРБ растворами ПВП при 20-90°С. Пример спектрофотометрического титрования при 20°С демонстрирует рис. 4. На основании вида графиков Скэтчарда и кривых связывания был сделан вывод о кооперативном характере ассоциации.

Методом малоуглового рассеяния нейтронов в области переданных импульсов

д = 0.1-4.3 нм"1 исследованы тяжеловодные растворы ПВП, содержащие ТРР5. Данные рассеяния нейтронов

(зависимости сечений рассеяния ст от переданного импульса <?) наилучшим образом

аппроксимируются функцией

Рис. 4. Спектрофотометрическое титрование ТРРБ растворами ПВП в воде при 20°С. В ряду растворов 1-12 увеличивается концентрация ПВП (от 0 до 0.496 г/дл), концентрация ТРРБ фиксированная (4.920x10"6 М)

<т(д) =

°|(0)

г. О

1 + (^9)3 (1 + Ом)5)'

где первое слагаемое соответствует модели Зимма для гауссовой цепи с радиусом инерции Дг = -УЗЛС, а второе слагаемое характеризует

плотные образования на масштабах в пределах сегмента полимерной цепи, а 1(0) и а2(0) -составляющие сечения, экстраполированного к малым значениям импульса д, пропорциональные концентрации и сухому объему рассеивающих объектов. В растворах комплексов в диапазоне температур 20-90°С наблюдались явления ассоциации цепей

ПВП за счет невалентных взаимодействий с молекулами порфиринов, играющих роль внутри-и межцепных физических сшивок.

При измерениях вязкости (30°С) водных растворов ПВП с добавлением ТРР8 в пределе низких концентраций полимера обнаружен полиэлектролитный эффект - рост значений приведенной вязкости с понижением концентрации ПВП, означающий наличие в разбавленном растворе заряженных макромолекул ПВП за счет присоединения к ним молекул порфирина, несущих отрицательный заряд. Анализ результатов экспериментов и литературных данных (Кирш, 1998) о молекулярных взаимодействиях ПВП позволил заключить, что образование комплекса ТРРБ с ПВП в водных растворах происходит за счет водородных связей между поляризованными молекулами воды в гидратном слое полимера и отрицательно заряженными сульфогруппами порфирина, а также в некоторой степени ион-дипольных взаимодействий между компонентами.

Таким образом, появление заряда у полимерной цепи приводит к увеличению гидратного слоя вокруг нее и взаимному отталкиванию звеньев, что выражается в обнаруженном полиэлектролитном эффекте вязкости. Исследованные особенности конформации ПВП в составе комплекса представляются важными в связи с возможностью создания антивирусных препаратов на основе таких структур.

3.2. Исследование взаимодействия сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с ДНК. Молекула ДНК является полианионом в водно-солевых растворах за счет своих фосфатных групп, поэтому в первом приближении не должна образовывать комплексы с отрицательно заряженными порфиринами и их аналогами, на что указывает и отсутствие литературных данных в этой области. Однако известно, что анионы сульфированных дифталоцианинов металлов (МРсгБ*4") могут ассоциировать с биологическими и синтетическими объектами полимерной природы, поверхности которых несут отрицательный заряд (полистирольные латексы, модельные бислойные липидные мембраны, монослои искусственного липида глицеролмоноолеата). Поэтому, несмотря на то, что ДНК не является основной мишенью для анионных порфиринов и их аналогов в случае их проникновения в клетку, установленная антивирусная активность МРс2$4 может определяться их взаимодействием в том числе и с ДНК. В связи с этим была поставлена задача исследовать взаимодействия между ДНК и сульфированными дифтапоцианинами лютеция и скандия.

Спектрофотометры и вискозиметрия растворов комплексов

Спектрофотометрическое титрование водно-солевых растворов (1 мМ ЫН4С1) ЬиРс254 и 5сРс254 растворами ДНК в области длин волн 330-1100 нм показало небольшой

Рис. 5. Зависимость характеристической вязкости ДНК от г. 1 и 3 - с ЬиРсгЗ^ 2 и 4 - с 5сРс254, / и 2 - в 1 мМ 3 и - в 5 мМ

ЫН4С1

гипохромкый эффект в полосе поглощения дифталоцианинов около 910 нм и небольшой гиперхромный эффект в полосе около 680 нм, без сдвига максимумов полос. Эти эффекты стабильно наблюдались в нескольких сериях опытов в исследованных системах, что достоверно указывает на взаимодействие МРсгБд с ДНК.

По данным вискозиметрии в растворе (1 мМ МНЦС1) добавление 1д1Рс254 приводит к постепенному уменьшению характеристической вязкости ДНК [г/] от 130 до 80 дл/г. При введении ЗсРсг$4 величина [г}] падает до 80 дл/г уже при соотношении компонентов г = 0.01 (одна связанная молекула дифталоиианина на 100 пар оснований ДНК), и при дальнейшем увеличении г она не меняется (рис. 5).

В результате введения ЬиРс2Э4 и 5сРсг54 в раствор происходит компактизация молекулы ДНК в составе комплексов почти в два раза по объему. Вискозиметрия при большей ионной силе (5 мМ ЫН4С1) дает меньший эффект компактизации ДНК - 25% (от 80 до 60 дл/г) при добавлении дифталоцианинов.

Малоугловое рассеяние нейтронов в растворах комплексов

Рассеяние нейтронов в диапазоне переданных импульсов <? = 0.1-3.0 нм"1 измеряли на растворах ДНК при 20-40°С в тяжеловодной среде (020, 1 мМ ЫЩС!) с добавлением 8сРс2$4. Экспериментальная область значений обратных импульсов 2л/? = 2-60 нм была выбрана так, чтобы анализировать внутреннюю структуру макромолекулы на масштабах от поперечного диаметра нити ДНК до размера сегмента £ ~ 100 нм. В целом цепь ДНК (молекулярная масса 13 МДа, контурная длина ~ 7 мкм, N ~ 65 сегментов Куна) имеет радиус инерции Яеопл - (Л^/б)"2 - 300 нм. Данные рассеяния нейтронов при 20°С показали изменение конформации ДНК в результате взаимодействия с молекулами ЗсРсг^. При ц < 1 нм"1 интенсивность рассеяния 1{д) описывалась функцией Гинье

1(ч) = 10е 3 , (2)

где параметр 1о - /?->о пропорционален концентрации ДНК в растворе и сухому объему рассеивающего объекта - сегмента с радиусом инерции Установлено, что для комплекса ДНК + ЗсРсгЭ^ значение /?£«,„ = 14.4 ± 0.6 нм на 20% ниже, чем = 17.3 ± 0.8 нм для ДНК.

В области импульсов я > 1 нм'1 распределение интенсивности подчиняется зависимости

описывающей рассеяние на объектах типа жестких стержней. Фактор ЛЛ? характеризует рассеяние в пределе тонкого стержня с поперечным радиусом инерции сечения гс-Приближение данных этой моделью показывает, что эффективный радиус ДНК при взаимодействии с $сРс2$4 увеличился в ~ 2 раза, от гсоыл - 0.70 ± 0.09 нм для ДНК (диаметр нити йот ~ 2 72 гсохл ~ 2 нм) до г&от = 1.3 ± 0.1 нм для комплекса ДИК + БсРсгБ^

Увеличение поперечного размера нити ДНК может объясняться посадкой молекул 5сРс284 на ее поверхность, что возмущает также ее конформационные свойства. Об этом свидетельствует обнаруженное уменьшение длины сегмента ДНК. В составе комплекса молекула ДНК становится менее жесткой, скручиваясь в более компактный клубок, что согласуется с данными для характеристической вязкости. Выводы, сделанные из данных, полученных при 20°С, справедливы и при более высоких температурах. Нагревание растворов до 40°С не возмущает существенно конформации ДНК и комплекса. Динамическое рассеяние света

В тяжеловодных растворах (1 мМ ЫШО, 20°С) ДНК и комплексов ДНК + БсРсгЭ« методом динамического рассеяния света были найдены коэффициенты диффузии и гидродинамические радиусы молекул по Стоксу: £>г= (5.0 ± 0.6)х10"9 см2/с, Л/, = 430 ± 50 нм для ДНК; 0,= (9.1 ± 1.0)х10"9 см2/с, Л» = 240 ± 30 нм для комплекса. Введение 5сРс284 вызвало уменьшение размеров молекулы ДНК почти в два раза, что находится в согласии с данными вискозиметрии в легкой воде и данными рассеяния нейтронов.

Таким образом, совокупность данных доказывает образование комплекса 5сРсг84 с ДНК. В составе комплекса, стабильного в водно-солевом растворе при 20-40°С, молекула ДНК является более компактной относительно свободного состояния. Установлено, что ЬиРс2$4, взаимодействуя с ДНК, также образует комплексы, но более слабые, чем БсРсА-

Анализ причин образования комплексов приводит к выводу, что наиболее вероятно

они формируются путем внешнего связывания молекул МРс2§4 с поверхностью ДНК, возможно, посредством гидрофобных взаимодействий между компонентами и водородных связей с участием молекул растворителя. При этом важную роль должны выполнять электростатические взаимодействия, на что указывает уменьшение эффекта компакт изации при увеличении внешней ионной силы, при котором происходит экранировка фосфатных групп ДНК противоионами. Интеркаляция молекул дифталоцианинов между парами оснований ДНК маловероятна из-за сравнительно крупных размеров молекул дифталоцианинов. Уменьшение жесткости ДНК может быть вызвано частичным связыванием МРсгЭд с основаниями ДНК в ее бороздках, а также связыванием далеких по цепи, но сблизившихся в пространстве участков ДНК в местах нахождения МРсгЭд. Следует отметить также возможное влияние анионного эффекта, связанного с влиянием анионов на дальние взаимодействия в цепи ДНК.

Для ПВП и ДНК эффекты воздействия порфиринов и их аналогов на конформацию противоположные: для ПВП - распрямление цепи из-за присоединения зарядов и возникновения их отталкивания, в случае же заряженной нити ДНК дополнительная посадка зарядов того же знака в некоторых точках цепи, наоборот, уменьшает размеры молекулы. Дополнительные заряды могут вызывать ток противоионов внутрь клубка и частичную нейтрализацию, что ведет к сжатию клубка. Вокруг длинной заряженной нити ДНК образуется логарифмически спадающий электростатический потенциал, а посадка молекул дифталоцианинов может создавать дополнительные точечные центры поля с высоким градиентом потенциала (Иг), что может усиливать ток противоионов внутрь клубка.

Глава 4. Синтез, структура и свойства магнитных наноразмерных комплексов фотодитазина. Глава посвящена решению задач получения, исследования структуры и свойств феррожидкостей на основе наночастиц магнетита в качестве магнитоуправляемых носителей сенсибилизаторов для ФДТ, в частности фотодитазина.

В первой серии опытов были синтезированы и исследованы комплексы магнитной жидкости с другим порфирином - сульфированным тетрафенилпорфином дигидрохлоридом (ТРРБ), обладающим, помимо фотодинамической активности, антивирусными свойствами, что может быть использовано в дальнейшем при создании антивирусных препаратов с возможностью направленной доставки.

В ходе приготовления феррожидкостей частицы магнетита, полученные методом Массара (химическая конденсация солей Ре2+ и Ре3+), стабилизировали одним из двух способов.

В первом случае активирование магнетита производили добавлением 2 М соляной кислоты при нагревании до 100°С. Полученный ферроколлоид хорошо связывает и TPPS, и фотодитазин, но ухудшает фототоксические свойства фотодитазина. В опытах на культурах клеток наблюдали отсутствие флуоресценции фотодитазина в комплексе с магнитной жидкостью этого типа и воздействия на клетки, что свидетельствовало о потере фотодитазином способности генерировать синглетный кислород, хотя избирательность накопления препарата в опухолевых клетках сохранялась.

Было установлено, что для использования в биомедицинских целях оптимальным является другой метод стабилизации магнетита - смесью растворов лимонной кислоты и гидрофосфата натрия. Комплексы полученной таким способом феррожидкости с фотодитазином в водной среде (90% D20 и 10% НгО по объему) исследовали методом малоуглового рассеяния нейтронов (дифрактометры «Мембрана-2» и «Yellow Submarine»). Для повышения эффективности и биологической совместимости препарата в состав комплексов вводили плюроник (тройной блок-сополимер этиленоксида и пропиленоксида), способный связывать фотодитазин и увеличивать его фототоксичностъ в модельных системах. Были изучены 4 образца магнитных коллоидов различного состава: 1 - ферроколлоид, 2 - ферроколлоид с плюроником, 3 - ферроколлоид с плюроником и фотодитазином, 4 - ферроколлоид с фотодитазином. Зависимости сечения рассеяния нейтронов ст от переданного импульса q (рис. 6) на образцах 1 и 4 (без плюроника) удовлетворительно описываются функцией, характеризующей кластерные структуры феррочастиц,

магнетита с радиусом корреляции Rc, связанным с ее геометрическим радиусом

описывающий парные пространственные корреляции частиц на пяти различных характерных расстояниях Я,. А/ - среднее количество частиц, коррелирующих с любой выбранной частицей на расстоянии Я,.

(4)

где а(0) - сечение рассеяния в нулевой угол,

' (1 + (?Лс)2)2

- формфактор частицы

Данные рассеяния на образцах 2 и 3, содержащих плюроник, подчиняются качественно другой структурной модели, которой отвечает закон рассеяния

сг(д) = 5,

3(б 1П <7Г, - дг, соя д^ ) 3(а1п дг2 - дгг со; дг2)

К-

дЯт

(5)

(яг,)' ' (дг2)' Л дК )

Здесь формфактор характеризует сферические образования (кластеры) в виде

центральной частицы магнетита (радиуса п) с оболочкой (радиуса г{), внутри которой находятся другие магнитные частицы, окруженные плюроником. Структурный фактор описывает корреляции кластеров на характерном расстоянии Я„. Состав образцов и параметры аппроксимации данных рассеяния функциями (4, 5) приведены в табл. 1 и 2.

Рис. 6. Сечения рассеяния на образцах 1-4 в зависимости от переданного импульса д

Состав и структурные параметры образцов 1 и 4 (без плюроника)

Таблица 1

Образец Смоги, Г/ДЛ с„„р, г/дл Сфот, Г/ДЛ с(0), СМ"1 Яс, НМ А\ НМ

1 2.49 0 0 0.18±0.03 2.0±0.2 2.1±0.3 8.0±0.4

4 2.49 0 0.049 0.29±0.09 2.5±0.3 1.5±0.4 7.9±0.7

Образец А2 НМ А3 Дз, НМ ¿4 й4, НМ Аь /?5, НМ

1 2.0±0.4 14.2±0.7 2.3±0.5 20.6±0.6 2.4±0.6 28.3± 0.6 1.3±0.4 36.7±1.0

4 Д.4±0.6 14.1±1.2 1.9±0.7 20.2±0.8 2.0±0.6 28.2±0.7 0.9±0.4 37.5±1.3

В образцах I и 4 (без плюроника) частицы магнетита диаметром 2КР = 6-7 нм = ЗДС формируют кластеры с характерными расстояниями между центрами частиц 8, 14, 20,28, 37 нм (Д| - /?5), приближенно кратными их диаметрам. Значения параметров А\.ь ~ 2 показывают, что в системе каждая феррочастица в среднем имеет на каждом из характерных расстояний Лм примерно две соседние частицы, что реализуется в цепных кластерах. Параметр А} < 2 показывает, что пространственная корреляция, присущая цепному кластеру, нарушается на расстоянии ~ Я5, составляющем около 5 диаметров частицы. Следовательно, кластеры представляют собой цепные структуры, включающие до 10 частиц. Введение фотодитазина в систему (образец 4) слабо возмущает структурные параметры образца, ослабляя тенденцию к ассоциации частиц.

Таблица 2

Состав и структурные параметры образцов 2 и 3 (с плюроником)

Образец Смагн* г/дл с пяюр1 г/дл г/дл Л,см-Ш г/, нм ¡1, см""2 Г1, нм А К,, нм

2 2.49 0.54 0 0.53±0.09 3.1±0.4 1.02±0.07 7.3±0.4 1.77±0.12 9.08±0.11

3 2.50 0.51 0.049 0.74±0.06 3.57±0.19 1.02±0.05 8.0±0.4 0.96±0.12 9.7±0.3

Образцы 2 и 3 (с плюроником) содержат феррочастицы тех же размеров 2г\ ~ 2ИР ~ 6-7 нм, покрытые оболочкой плюроника. Взаимодействие полимерных оболочек приводит к образованию глобулярных кластеров, строение которых описывается сферически симметричной моделью в виде центральной частицы с оболочкой, имеющей внешний диаметр ~ 15—16 нм (2г2). Расчеты с учетом вкладов центральной частицы и

оболочки в рассеяние, ^ и $2, и плотностей длин ядерного рассеяния для компонентов системы показали, что в оболочке кроме плюроника содержится около 6 частиц магнетита, ассоциированных с центральной частицей. Таким образом, основным структурным элементом системы является сборка из примерно 7 частиц магнетита, окруженных оболочкой из плюроника. В феррожидкостях 2 и 3 существуют корреляции между сборками на расстоянии Ят ~ 10 нм, следовательно, в растворе преобладают малые группы из (Л+1) ~ 2-3 сборок. Как видно из данных табл. 2, фотодитазин ослабляет взаимодействия частиц (образец 3), как и в случае образцов без плюроника.

Восстановленные из данных рассеяния корреляционные функции феррожидкостей (рис. 7) подтверждают наличие цепных корреляций в системах без плюроника. Введение плюроника радикально меняет структуру ферроколлоида: вместо протяженных цепных кластеров доминируют компактные глобулярные структуры. Об этом свидетельствует исчезновение множества максимумов, отвечающих радиусам корреляции Ли, и появление единственного максимума, соответствующего радиусу глобулярного кластера.

/«. *> А,

Рис. 7. Корреляционные функции образцов 1-4 в зависимости от расстояния К

Функциональные свойства

полученных феррожидкостей были тестированы в ходе доклинических испытаний на мышах с перевитой опухолью Эрлиха в лапках. Сравнительная динамика размеров опухоли после ФДТ при использовании образцов без плюроника показана на рис. 8. Установлено, что хотя магнетит несколько снижает эффективность фотодитазина (на него, вероятно, приходится часть синглетного кислорода), эффективность такого препарата при его направленной доставке магнитным полем становится выше по сравнению с исходным фотодитазином. Использование плюроника в составе комплексов увеличивает терапевтическое воздействие, наблюдались случаи полного исчезновения опухоли (вместе с лапкой, из-за ее небольших размеров, некротическая ампутация) уже на третьи сутки после облучения. На седьмые сутки после облучения в группе животных с применением плюроника опухоль на лапке оставалась только у 3 из 10 животных. Отмечено воздействие препарата на область, не подвергавшуюся ФДТ (другая лапка) с перевитой опухолью (системный эффект).

. Использование фотодитазина в составе препарата, содержащего магнетит, открывает перспективу совместного применения методов ФДТ и гипертермии для воздействия на опухоль, когда происходит также термическая гибель клеток, вызванная нагреванием частиц магнетита лазерным облучением или приложенным внешним магнитным полем. Комплексное применение двух методов способно дать еще больший эффект при лечении онкологических заболеваний.

В приложении приведен расчет состава оболочки магнитных частиц с плюроником и фотодитазином по данным рассеяния нейтронов.

Заключение

1. Установлено образование комплексов сульфированного тетрафенилпорфина с [юли-Ы-винилпирролидоном с использованием методов рассеяния нейтронов, спектрофотометрии и - молекулярной гидродинамики. Определен характер

Сутки после облучения

Рис. 8. Динамика размеров опухолей после ФДТ. 1 - контрольная группа, 2 -использование фотодитазина, 3 - магнетит + фотодитазин, 4 - магнетит + фотодитазин + магнитное поле

конформационных изменений полимера, установлен кооперативный характер и найдены количественные характеристики связывания. Показано, что в разбавленных водных растворах макромолекулы полимера являются полиэлектролитными вследствие присоединения к ним молекул тетрафенилпорфина посредством водородных связей сульфогрупп порфирина с поляризованными молекулами воды из гидратной оболочки полимера.

2. Впервые получены и исследованы комплексы анионных сульфированных дифталоцианинов металлов (МРсгвл) с ДНК. Методом малоуглового рассеяния нейтронов установлена ассоциация молекул ЬиРс2$4 и 5сРс2$4 с ДНК, что ведет к увеличению наблюдаемого поперечного диаметра, к уменьшению жесткости и к компактизации Цепи ДНК в водно-солевом растворе, подтвержденной данными вискозиметрии и динамического рассеяния света. Предложены гипотезы, которые объясняют наблюдаемые эффекты ассоциации.

3. Разработаны биосовместимые магнитные жидкости на основе магнетита, стабильные в диапазоне температур 20-70°С и сохраняющие функциональные свойства фотодитазина как фотосенсибилизатора.

4. Установлены структурные особенности магнитных коллоидов методом рассеяния нейтронов в зависимости от состава и условий синтеза. Определены размеры и строение кластерных структур магнетита. Из анализа данных рассеяния нейтронов в импульсном и реальном пространстве найдены корреляционные функции и построены структурные модели наноразмерных ассоциатов феррочастиц.

5. Впервые создан магнитоуправляемый сенсибилизатор, содержащий фотодитазин и плюроник, , адаптированный для применения в фотодинамической терапии. Определено строение комплекса, размеры составляющих комплекс частиц и комплекса в целом.

6. В серии доклинических испытаний фотодитазина в комплексах с магнитным носителем и плюроником установлено его повышенное терапевтическое действие на опухолевые клеточные культуры, показано торможение роста размеров опухолей у мышей по сравнению с результатами традиционной терапии с использованием чистого фотодитазина, что свидетельствует об увеличении эффективности препарата в составе комплекса. Отмечено повышение эффективности комплекса фотодитазина с магнетитом с применением внешнего магнитного поля для доставки препарата к опухоли.

Публикации по теме диссертации

1. Сибилева М. А., Кульвелис Ю. В., Сибилев А. И., Москалев П. Н., Пешехонов В. Т. Конформация молекулы ДНК в водно-солевом растворе в присутствии сульфированного дифталоцианина скандия. III Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры-2004». 27 января - 1 февраля 2004 г. Москва. Сборник материалов конференции. Т. 1. С. 303.

2. Sibileva М. A., Kul'velis Yu. V., Sibilev A. I., Moskalev P. N. Complexes of sulfonated lutecium and scandium diphthalocyanines with poly(N-vinylcaprolactam) and DNA // Russ. J. Phys. Chem. — 2005. — V. 79. Suppl. 1. — P. S60—S6S.

3. Кульвелис Ю. В., Лебедев В. Т., Török Gy., Москалев П. Н., Сибилев А. И. Исследования взаимодействия ДНК с сульфированными дифталоцианинами лютеция и скандия методами слеирофогометрии, вискозиметрии и рассеяния нейтронов. I Всероссийская школа-конференция «Молодые ученые - новой России. Фундаментальные исследования в области химии и инновационная деятельность». 2629 сентября 2005. Иваново. Материалы конференции. С. 131.

4. Кульвелис Ю. В., Лебедев В. Т., Török Gy., Сибилев А. И., Москалев П. Н., Мельников А. Б. Механизмы взаимодействия ДНК и биополимеров с порфиринами: данные нейтронного рассеяния и физико-химических методов. XIX Совещание по использованию рассеяния нейтронов в исследованиях конденсированного состояния. 12-15 сентября 2006. Обнинск. Сборник материалов совещания. С. 73.

5. Кульвелис Ю. В., Лебедев В. Т., Сибилев А. И., Москалев П. Н., Торок Д., Мельников А. Б. Исследование структуры водно-солевых растворов ДНК с сульфированным дифталоцианином скандия. Препринт ПИЯФ-2669. Гатчина, 2006.20 с.

6. Kulvelis Yu. V., Lebedev V. Т., Sibilev A. I., Moskalev P. N., Török Gy., Klyubin V. V. PoIy-N-vinilpirrolidone complexes with sulfonated tetraphenylporphines. Saint-Petersburg International Workshop on Nanobiotechnologies, 27-29 November 2006. St-Petersburg. Abstracts. P. 82.

7. Кульвелис Ю. В., Лебедев В. Т., Торок Д., Мельников А. Б. Образование комплексов ДНК и поли-Ы-виниламидов с водорастворимыми порфиринами и фтапоцианинами. Четвертая Всероссийская Каргинская конференция «Наука о полимерах 21-му веку», 29 января - 2 февраля 2007. Москва. Сборник материалов конференции. Т. 2. С. 396.

8. Кульвелис Ю. В., Лебедев В. Т., Торок Д., Мельников А. Б. Исследование структуры водно-солевых растворов ДНК с сульфированным дифталоцианином скандия // Журн. структ. химии. 2007. — Т. 48. № 4. — с. 789—795.

9. Кульвелис Ю. В., Лебедев В. Т., Торок Д., Клюбин В. В. Комплексы поли-N-винилпирролидона с сульфированными тетрафенилорфинами // Кристаллография. —

2007. — Т. 52. № 3. — С. 515—518.

10. Кульвелис Ю. В., Трунов В. А., Лебедев В. Т., Орлова Д. Н., Гельфонд М. Л., Мелик-Нубаров Н. С., Жиентаев Т. М. Исследование мезоструктуры феррожидкостей с порфиринами и их возможное применение в фотодинамической терапии онкологических заболеваний. VI Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов. 12-17 ноября 2007. Москва. Материалы конференции. С. 294.

11. Кульвелис Ю. В., Трунов В. А., Лебедев В. Т., Орлова Д. Н., Гельфонд М. Л., Мелик-Нубаров Н. С., Жиентаев Т. М. Синтез и исследование мезоструктуры феррожидкостей с порфиринами и их возможное применение в фотодинамической терапии онкологических заболеваний. Препринт ПИЯФ-2736. Гатчина, 2007.21 с.

12. Кульвелис Ю. В., Трунов В. А., Лебедев В. Т., Орлова Д. Н., Торок Д., Гельфонд М. Л., Мелик-Нубаров Н. С., Жиентаев Т. М. Синтез и исследование структуры комплексов феррожидкостей с фотодитазином и перспективы их применения в фотодинамической терапии. XIV Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформапиям молекул. 15-21 июня 2008. Челябинск. Материалы конференции. С. 144.

13. Kulvelis Yu. V., Trunov V.A., Lebedev V.T., Orlova D.N., TOrOk Gy., Gelfond M.L., Melik-Nubarov N. S., Zhiyentayev Т. M. Synthesis and structural study of ferrofluid complexes with photodithazine and their future application in photodynamic therapy. V International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines. 6-11 July 2008. Moscow. Abstracts. P. 438.

14. Кульвелис Ю. В., Трунов В. А., Лебедев В. Т., Орлова Д. Н., Торок Д., Гельфонд М. Л., Мелик-Нубаров Н. С., Жиентаев Т. М. Разработка препаратов для повышения эффективности фотодинамической терапии (ФДТ). XX совещание по использованию рассеяния нейтронов в исследованиях конденсированного состояния. 3-19 октября

2008. Гатчина. Сборник материалов совещания. С. 72.

15. Кульвелис Ю. В., Лебедев В. Т., Трунов В. А., Гельфонд М. Л. Синтез и исследование структуры и свойств магнитных нанокомплексов фотодитазина. Сообщение ПИЯФ-2799. Гатчина, 2009.29 с.

16. Кульвелис Ю. В., Трунов В. А., Лебедев В. Т., Орлова Д. Н., Гельфонд М. Л. Синтез и исследование структуры феррожидкостей с порфиринами и перспективы их применения в фотодинамической терапии // Поверхность. Рентген., синхр. и нейтр. иссл. — 2009. — № 5. — С. 55—62.

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 167, тир. 100, ут.-изд. л. 1; 14.05.2009 г.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Кульвелис, Юрий Викторович

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Строение порфина и его производных.

1.2. Природные металлопорфирины и их свойства.

1.3. Металлопроизводные фталоцианина.

1.4. Водорастворимые порфирины.

1.5. Электронные спектры поглощения порфиринов.

1.6. Порфирины как сенсибилизаторы в фотодинамической терапии.

1.7. Взаимодействие порфиринов с ДНК.

1.8. Поли-М-виниламиды и их свойства в водных растворах.

1.9. Магнитные жидкости — синтез, свойства и области применения.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Спектры поглощения и спектрофотометрическое титрование.

2.2.2. Капиллярная и низкоградиентная вискозиметрия.

2.2.3. Малоугловое рассеяние нейтронов.

2.2.3.1. Метод малоуглового рассеяния нейтронов и его применение к исследованию крупномасштабных неоднородностей

2.2.3.2. Когерентное и некогерентное рассеяние нейтронов на ядрах.

2.2.3.3. Метод дейтериевого контрастирования и исследование строения макромолекул.

2.2.3.4. Методы структурной интерпретации данных малоуглового рассеяния.

2.2.3.5. Анализ с помощью корреляционных функций в прямом пространстве.

2.2.3.6. Использованные приборы.

2.2.4. Динамическое рассеяние света.

Глава 3. Исследование взаимодействия сульфированных порфиринов и дифталоцианинов металлов с поли-Ы-винипирролидоном и ДНК.

3.1. Комплексы сульфированного тетрафенилпорфина с поли-Nвинилпирролидоном.

3.1.1. Определение связывания TPPS с ПВП методом спектрофотометрического титрования.

3.1.2. Капиллярная вискозиметрия растворов комплексов TPPS с ПВП

3.1.3. Исследование строения комплексов TPPS с ПВП методом малоуглового рассеяния нейтронов.

3.1.4. Динамическое рассеяние света на растворах комплексов TPPS с ПВП.

3.1.5. Анализ результатов.

3.2. Исследование взаимодействия сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с ДНК.

3.2.1. Спектрофотометрическое титрование L11PC2S4 и SCPC2S4 растворами ДНК.

3.2.2. Исследование комплексов l11pc2s4 и SCPC2S4 с ДНК методом низкоградиентной вискозиметрии.

3.2.3. Малоугловое рассеяние нейтронов на растворах комплексов ДНК с ScPc2S4.

3.2.4. Динамическое рассеяние света на растворах комплексов ДНК с ScPc2S4.

3.2.5. Анализ результатов, выводы.

Глава 4. Синтез, структура и свойства магнитных наноразмерных комплексов фотодитазина.

4.1. Синтез и стабилизация магнитных жидкостей.

4.2. Нейтронные исследования образцов.

4.3. Доклинические испытания препаратов на культурах опухолевых клеток и на мышах.

4.4. Обобщение результатов, выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура и свойства комплексов порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами и магнитными частицами"

Порфирины и их аналоги — макрогетероциклические соединения, содержащие в своей основе цикл порфина, состоящий из четырех колец пиррола. Природные порфирины являются широко распространенными веществами и выполняют важнейшие биологические функции. Они входят в состав гемоглобина, миоглобина, ферментов каталазы, пероксидазы и многочисленной группы цитохромов. В форме железосодержащих комплексов гемопротеиды участвуют в транспорте кислорода, обеспечивая процесс дыхания. Фотосинтез и родственные ему процессы выполняются хлорофиллами и бактериохлорофиллами, содержащими магний.

Большое разнообразие свойств порфиринов и их распространенность обуславливают их применение в промышленности красящих пигментов, полупроводников и катализаторов, а также широкое использование в научных исследованиях физико-химического и биологического характера.

Фундаментальный и прикладной интерес к природным порфиринам и их синтетическим аналогам связан с широкими возможностями синтеза молекулярных структур, обладающих выраженными фотолюминесцентными свойствами, а также высокой устойчивостью к температурным и химическим воздействиям. Благодаря наличию 7Г-электронного сопряжения по макрокольцу и особенностям электронных спектров поглощения (ЭСП) порфирины служат основой для получения множества перспективных материалов (пигменты, полупроводники, сенсоры, катализаторы), функциональные свойства которых базируются на чрезвычайно высокой чувствительности ЭСП порфиринов к молекулярному окружению вблизи центра и периферии молекулы. Наблюдаемые изменения ЭСП порфиринов позволяют детектировать процессы кислотной ионизации, протонирования, комплексообразования и молекулярной агрегации с участием молекул порфиринов.

Важной областью применения порфиринов и их аналогов является медицина. Интенсивно развиваются исследования порфиринов в качестве сенсибилизаторов для фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний, основанной на способности порфиринов к накоплению преимущественно в опухолевых клетках и к фотолюминесценции с генерацией цитотоксичного синглетного кислорода. Поглощая свет, сенсибилизатор переходит из основного в возбужденное состояние. Возбуждение передается на содержащийся в тканях организма кислород, который переходит в синглетную форму и разрушает главным образом опухолевые клетки, поскольку сенсибилизаторы обладают сродством и накапливаются преимущественно в опухолевых клетках.

Наиболее эффективным сенсибилизатором, разработанным и применяющимся в России, является фотодитазин (производное хлорина), однако, он не всегда накапливается в опухолевых клетках с достаточным контрастом по отношению к нормальным. Важной и актуальной задачей является повышение контраста накопления сенсибилизатора, например, в комплексе с внешне управляемым магнитным носителем. Известны антивирусные свойства некоторых порфиринов. Так, сульфированные тетрафенилпорфины, помимо фотодинамической активности, проявляют активность против вируса иммунодефицита. Сульфированные дифталоцианины редкоземельных элементов (впервые синтезированные П.Н. Москалевым и сотр. в ЛИЯФ АН СССР в 1960-х годах [1, 2]) и некоторых других металлов обладают антивирусной активностью против вируса гриппа, саркомы Рауса [3]. Наибольшим индексом антивирусной защиты в ряду сульфированных дифталоцианинов металлов обладают соединения лютеция и скандия.

Цель работы заключалась в изучении механизмов взаимодействия порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами (поли-]М-винилпирролидон и ДНК) и магнитными частицами для создания перспективных антивирусных и противоопухолевых препаратов, исследовании структуры комплексов порфирин-полимер и магнитных носителей с фотодитазином для магнитоуправляемого транспорта препарата к опухолевым клеткам, а также оценке эффективности магнитоуправляемого противоопухолевого препарата в доклинических испытаниях на животных.

Задачи исследования:

1. Исследование межмолекулярных взаимодействий и образования комплексов в водных растворах при взаимодействии сульфированного тетрафенилпорфина и 5 поли-Ы-винилпирролидона, определение характера конформационных изменений полимера при комплексообразовании, анализ молекулярной структуры комплексов и количественных характеристик связывания в зависимости от температуры и соотношения концентраций компонентов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сульфированный тетрафенилпорфин образует комплексы с макромолекулами поли-N-винилпирролидона по данным спектрофотометрического титрования, рассеяния нейтронов, вискозиметрии и динамического рассеяния света. Связывание носит кооперативный характер и приводит к нарушению электронейтральности цепей полимера при низких ионных силах внешнего электролита.

Научная новизна работы:

1. Установлено образование комплексов сульфированного тетрафенилпорфина с поли-N-винилпирролидоном в водных растворах, определена молекулярная структура, гидродинамические и спектральные характеристики комплексов.

3. Разработаны стабильные магнитоуправляемые комплексы на основе наночастиц магнетита, связанных с молекулами сенсибилизатора фотодитазина. Достигнута биосовместимость комплексов при сохранении функциональных свойств сенсибилизатора, в том числе, с использованием плюроников, связывающих фотодитазин и повышающих его эффективность.

Практическая значимость работы. Синтезированные и исследованные в работе комплексы порфиринов и их аналогов с поли-Ы-винилпирролидоном и ДНК перспективны для создания новых эффективных антивирусных препаратов. Полученные магнитоуправляемые комплексы с фотодитазином представляют практический интерес в качестве эффективных сенсибилизаторов для фото динамической терапии.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Кульвелис, Юрий Викторович

Выводы о компактизации ДНК в составе комплексов в тяжеловодных растворах, сделанные на основе экспериментов по рассеянию нейтронов и света, подтвердили результаты, полученные для аналогичных растворов в легкой воде методами вискозиметрии и спектрофотометрии в видимой области при 20°С.

3.2.5. Анализ результатов, выводы

Результаты, полученные методами вискозиметрии, рассеяния нейтронов и света свидетельствуют о формировании комплексов сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с молекулой ДНК, стабильных в области температур 20—40°С в водно-солевых растворах, и компактизации ДНК под действием дифталоцианинов.

Анализ причин образования комплексов приводит к выводу, что наиболее вероятным является внешнее связывание молекул дифталоцианинов с поверхностью ДНК посредством водородных связей с участием молекул растворителя и гидрофобных взаимодействий между компонентами. Важную роль должны играть электростатические взаимодействия, что подтверждено ослаблением эффекта компактизации ДНК с увеличением внешней ионной силы (экранировка фосфатных групп ДНК противоионами). Интеркаляция молекул дифталоцианинов между парами оснований ДНК маловероятна в виду достаточно крупных размеров молекул дифталоцианинов.

Заряженная нить ДНК окружена электростатическим потенциалом, медленно спадающим по логарифмическому закону. Дополнительная посадка зарядов того же знака на цепь ДНК в некоторых точках создает точечные центры поля с потенциалом ~ Mr, имеющим высокий градиент на малых расстояниях от нити. Это может вызвать усиление тока противоионов внутрь клубка и частичную нейтрализацию зарядов, приводящую к сжатию клубка.

При анализе явлений ассоциации ДНК с дифталоцианинами следует учитывать особенности строения молекул дифталоцианинов. Структура дифталоцианина лютеция (LuPc2) приведена в работе [178] (рис. 51а). Атом Lu находится между двумя лигандами фталоцианина. Лиганды не плоские, а блюдцеобразные. Основание каждого блюдца направлено к атому металла, что показано для UPc2 [17] и справедливо для LuPc2 и дифталоцианинов других металлов. Отклонение от плоскости одного лиганда больше, чем другого. Лиганды повернуты друг относительно друга на 45° (рис. 516). Изоиндоловые атомы азота каждого из лигандов лежат в параллельных плоскостях, расстояние между которыми - 2.69 А. Расстояние между усредненными плоскостями двух лигандов (phthalocyanine ring mean planes) - 3.1-3.2 А, что примерно совпадает с известным расстоянием 3.208 А для YPc2, изоморфного LuPc2 [179]. пространственное строение, б - поворот лигандов друг относительно друга на 45° [ 178]

Что касается структуры сульфированных дифталоцианинов, то работ, посвященных их определению, не известно. Следует отметить, что сульфирование может изменять общее строение дифталоцианинов. Взаимодействие отрицательно заряженных сульфогрупп способно возмущать угол поворота лигандов относительно друг друга, усиливать степень отклонения их от плоскости, увеличивать расстояние между лигандами, что может влиять на взаимодействие дифталоцианинов с ДНК.

При синтезе П.Н. Москалевым сульфированных дифталоцианинов металлов [1, 2] состав продуктов синтеза был охарактеризован только по элементному анализу (спектры поглощения в растворах), что позволило предположить анион с зарядом 4— и сэндвичевую структуру, а распределение зарядов на периферии сэндвича не определялось. По-видимому, синтез не был специфичен по положению сульфогрупп на периферии. Четыре сульфогруппы (в среднем на молекулу) могли располагаться на бензольных кольцах периферии несколькими способами, и продукт мог представлять собой смесь изомеров. Таким образом, считая, что каждое бензольное кольцо может связывать не больше одной сульфогруппы, без учета положения атома С, к которому присоединяется сульфогруппа, возможны несколько структурных изомеров по положению сульфогрупп в молекуле дифталоцианина. При возможном анализе вероятности появления каждого изомера при синтезе следует учитывать расстояние между двумя лигандами. Если учитывать также и разное отклонение формы лигандов от плоскости (один искривлен больше другого), то количество изомеров увеличится еще в несколько раз. Кроме того, конформация сэндвичей может изменяться при растворении твердой фазы из-за влияния растворителя. Определение положения сульфогрупп в сэндвичах возможно с помощью ЯМР высокого разрешения в твердой фазе и растворах, но подобные исследования не известны. Каждый из изомеров за счет особенностей структуры (угол поворота между фталоцианинами, расстояние между периферией лигандов, отличающихся от параметров несульфированной формы из-за наличия зарядов) способен по-разному взаимодействовать с ДНК. Описание такого взаимодействия является весьма непростой задачей, даже если знать состав изомеров в продукте и структуру каждого изомера.

Полученные результаты в определенной степени можно сравнивать с данными для комплексов поли-М-виниламидов (ПВКЛ и ПВП) с отрицательно заряженными порфиринами. Не являясь полиэлектролитами, поли-М-виниламиды имеют сходство с ДНК. Цепи поли-Ы-виниламидов содержат карбонильные группы - диполи С=0", в которых кислород несет отрицательный заряд, образуя водородные связи с молекулами

102 воды и формируя гидратиый слой из поляризованных молекул воды [103]. Несмотря на отрицательные заряды боковых групп цепи, поли-Ы-виниламиды ассоциируют преимущественно с анионами, а не с катионами. Образование комплекса ПВП + анионный краситель обеспечивают водородные связи между поляризованными молекулами воды в гидратном слое вокруг полимерной цепи и сульфоанионами красителя и в некоторой степени электростатические взаимодействия. Установлено, что молекулы ПВП, связывая красители, превращаются в отрицательно заряженный полиэлектролит, при введении красителя возрастает относительная вязкость раствора полимера, а добавление соли уменьшает вязкость, нейтрализуя отрицательные заряды на цепи и снимая электростатические эффекты отталкивания [103, с. 162-164]. Аналогичные эффекты наблюдались в системах ПВКЛ с сульфированными дифталоцианинами [106] и ПВП с TPPS, что позволяют считать механизм образования комплексов с участием водородных связей и гидрофобных взаимодействий общим для исследованных систем. ДНК, как более сложная молекула, допускает несколько способов связывания дифталоцианинов.

Размер молекулы дифталоцианина ~ 10-12 А, толщина «сэндвича» не более 3.5 А, т.е. он может легко поместиться и в малую (12 А), и в большую (22 А) бороздку ДНК. Локализация в бороздках может быть стабилизирована за счет водородных связей между основаниями ДНК (донорами могут быть группы NH, акцепторами - атомы N и О) и молекулами дифталоцианинов (напрямую, через молекулы воды) и гидрофобных взаимодействий. У дифталоцианинов акцепторами водородных связей могут быть атомы О сульфогрупп и атомы N в макрокольце). Дифталоцианины могут также конкурировать с основаниями ДНК за их собственные водородные связи (А=Т и Г=Ц), которые могут разрываться с «раскрытием» пары оснований и образовываться вновь за счет конформационной подвижности ДНК по данным тритиевого обмена [123, с. 293— 305]. В момент раскрытия пар освобождаются дополнительные доноры и акцепторы, способные участвовать в образовании водородных связей с дифталоцианинами. При локальном разъединении нитей цепь ДНК может стать менее жесткой, что ведет к уменьшению размера клубка ДНК. Именно это и наблюдалось при измерениях вязкости и подтверждено методом рассеяния нейтронов.

Возможно внешнее связывание (как с поли-Ы-виниламидами) через гидратный слой ДНК посредством водородных связей. При этом молекула дифталоцианина должна стремиться расположиться так, чтобы ее сульфогруппы на периферии были разнесены в разные стороны от поверхности двойной спирали (чтобы свести к

103 минимуму электростатическое отталкивание). Такие комплексы могут быть стабилизированы и гидрофобными взаимодействиями.

Увеличение наблюдаемого диаметра ДНК в ~ 2 раза при посадке на нее дифталоцианина (нейтронные данные для SCPC2S4) можно объяснить способностью фталоцианинов ассоциировать между собой (димеры, агрегаты), когда они присоединяются не непосредственно к ДНК, а к молекулам дифталоцианина, уже связанным с ДНК. Однако это требует дополнительного обоснования, так как существуют данные, что в водных растворах сульфированные дифталоцианины, в отличие от сульфированных фталоцианинов, не димеризуются, а находятся в форме мономеров [176].

Экспериментальный факт уменьшения эффекта (по вязкости) при увеличении внешней ионной силы (растворителя) легко объясняется при внешнем связывании -отрицательные заряды фосфатных групп в большей степени нейтрализуются противоионами и становятся менее доступными для связывания.

Также возможно «связывание» далеких по цепи и случайно сблизившихся в пространстве фосфатных групп ДНК в местах нахождения молекул дифталоцианинов через сетку водородных связей. Предположение о возможности подобного связывания было высказано для систем ДНК с гистонами HI и НЗ и синтетическими пептидными фрагментами гистона Н2В в которых также наблюдается двукратное уменьшение удельного объема ([7]) [180, 181].

Для понимания специфики связывания сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с ДНК (SCPC2S4 связывается сильнее) необходимо знать различия в их структуре, однако структурные данные по дифталоцианину скандия неизвестны. В нем расстояние между лигандами может быть меньше, чем в LuPc2 (атом скандия меньше атома лютеция), а угол поворота между лигандами может отличаться. Для сравнения, у SnPc2 угол поворота составляет 42°, у UPC2 — 37° [16]. Поэтому необходимо знать структуру именно сульфированных соединений.

Сульфированные дифталоцианины могут рассматриваться как составляющая внешнего электролита по отношению к ДНК. Известно, что на конформацию ДНК более сильное влияние оказывает анионный, а не катионный состав внешнего электролита [182]. Анионный эффект для однозарядных анионов из одного или нескольких атомов проявляется во влиянии анионов на размеры молекулы ДНК, определяемые по характеристической вязкости, что объясняется авторами [182] воздействием анионов и их гидратации только на дальние взаимодействия в цепи ДНК.

104

Обнаружено, что размеры молекул ДНК экстремальны (максимальны, минимальны) в водно-солевых растворах ряда солей, когда анионы мало влияют на структуру воды (анионы слабо гидратируются, подвижность молекул воды вблизи аниона близка к подвижности в чистой воде). Анионный эффект может иметь место и в системе ДНК + сульфированные дифталоцианины. Разница в действии дифталоцианинов лютеция и скандия может быть вызвана центральным атомом металла, который может опосредованно воздействовать на способность анионов MPC2S44" к гидратации, что проявляется во влиянии их на размеры ДНК.

Таким образом, комплекс может представлять ДНК, окруженную молекулами дифталоцианина, связанными с ней в основном внешне - через гидратную оболочку на поверхности спирали. Уменьшение жесткости ДНК может быть вызвано тем, что часть молекул дифталоцианина может связываться в бороздках, а также влиянием анионов на дальние взаимодействия в цепи ДНК (анионным эффектом).

Глава 4. Синтез, структура и свойства магнитных наноразмерных комплексов фотодитазина

В работе впервые синтезированы и исследованы методами малоуглового рассеяния нейтронов и спектрофотометрии комплексы наночастиц магнетита в водной среде с порфиринами - сульфированным тетрафенилпорфином дигидрохлоридом (H2TPPS4(HC1)2 или TPPS) и препаратом «фотодитазин», использующимся в фотодинамической терапии (ФДТ) при лечении онкологических заболеваний. Также исследовано влияние плюроников на функциональные свойства синтезированных комплексов. Полученные комплексы феррожидкости с фотодитазином и плюроником показали высокую эффективность при воздействии на культуры опухолевых клеток. Результаты могут быть использованы при создании магнитоуправляемого препарата для ФДТ.

Одним из наиболее эффективных отечественных препаратов в ФДТ является фотодитазин (рис. 8), разработанный в 1998 году на основе глюкаминовой соли хлорина еб в качестве фотосенсибилизатора для лечения целого ряда опухолей (рак кожи, рак щитовидной железы, злокачественные опухоли головного мозга и др.) [77]. Терапия основана на селективной способности фотодитазина накапливаться в онкологическом образовании с существенно более высокой концентрацией по сравнению со здоровой тканью и кровью, а также способностью фотодитазина под действием оптического облучения генерировать биологически активный синглетный кислород, вызывающий гибель клеток. Поскольку концентрация фотодитазина существенно выше в злокачественных клетках, то преимущественно погибают злокачественные клетки. Однако на практике остаются нерешенные проблемы, в основном связанные с недостаточным контрастом накопления рабочего препарата в клетках злокачественного онкологического новообразования. Актуальным является вопрос повышения контраста «злокачественное образование / здоровая ткань» для лечебного препарата.

Для этих целей в данной работе впервые исследовалась возможность управляемой (внешним магнитным полем) транспортировки и локализации фотодитазина, связанного с частичками ферромагнитной жидкости (ФМЖ), в злокачественном образовании. В связи с этим разработаны магнитные жидкости на водной основе с использованием фотодитазина.

До последнего времени разрабатывались в основном феррожидкости на основе наночастиц ферритов, концентрирование которых в опухолях при внешнем воздействии (инфракрасным облучением или магнитным полем) создавало эффект гипертермии [183, 184] — локального нагревания до 42—44°С, которое приводит к гибели только опухолевых клеток, поскольку они более восприимчивы к нагреванию, чем здоровые. Однако во многих случаях после гипертермии опухоль восстанавливается [84], а сам сеанс гипертермии является длительным процессом (до 60-120 минут) и часто болезненным для пациента. С точки зрения избирательного действия наиболее эффективными представляются феррожидкости — носители лекарственных препаратов за счет наличия комплекса препарата с магнитной частицей и последующей управляемой полем локализации препарата в нужном месте организма. Указанная область исследований еще только формируется [83, 84].

Использован препарат «фотодитазин» производства ООО «Вета-Гранд» в виде раствора в водно-солевой среде с физиологической ионной силой с исходной концентрацией препарата 0.5 г/дл ~ 0.0507 М. Рис. 52 демонстрирует спектры поглощения препарата, разбавленного в 0.15 М NaCl.

Рис. 52. Электронные спектры поглощения: 1 — раствора фотодитазина С = 0.0013 г/дл в 0.15 М NaCl; 2 - раствора фотодитазина С = 0.0050 г/дл в 0.15 М NaCl. Т = 20°С

Сульфированный тетрафенилпорфин дигидрохлорид H2TPPS4(HC1)2 (рис. 7), использовавшийся в качестве модели фотодитазина на начальном этапе работы, получен от Porphyrin Products (Logan, USA).

Методом малоуглового рассеяния нейтронов исследовались различные способы локализации фотодитазина на частицах феррожидкости, его спектральные свойства и способы их модификации. Для повышения эффективности и биологической совместимости препарата (фотодитазина) в феррожидкости вводили третий компонент

- плюроник F-108 или F-127 (тройной блок-сополимер этиленоксида и пропиленоксида, фирма BASF, молекулярные массы F-108 - 14600, F-127 - 12300), широко используемый в фармацевтике и медицине и способный солюбилизировать фотодитазин [86]. Буква «F» в названии плюроника указывает на его исходное агрегатное состояние (твердое, firm); последующие две цифры в названии указывают длину гидрофобного блока пропиленоксидного полимера, деленную на 5; третья цифра

- процентное (по массе) содержание этиленоксида в молекуле, деленное на 10 [185]. Плюроники облегчают проникновение лекарств через биологические барьеры, увеличивают накопление лекарств в опухолевых клетках. Обнаружено, что в системах, моделирующих процесс ФДТ, фотокаталитическую активность можно модулировать при использовании ряда плюроников [86]. Также был предложен способ увеличения фотоиндуцируемой токсичности фотодитазина в сеансах фототерапии in vitro, который заключается в одновременном добавлении фотодитазина в заведомо нетоксичных концентрациях к опухолевым клеткам [86].

Эффективность приготовленных препаратов проверялась на онкологических клеточных культурах и на мышах.

4.1. Синтез и стабилизация магнитных жидкостей

Синтез магнетита производили стандартным методом — химической конденсацией солей Fe2+ и Fe3+ в концентрированном растворе аммиака, на основе модифицированной реакции Элмора [114].

Использовали два метода стабилизации синтезированных частиц магнетита (табл.

11).

ФМЖ-1. Активирование магнетита производили по Массару [84] добавлением 2 М соляной кислоты и нагреванием до 100°С. При 100°С в присутствии НС1 в поверхностные слои кристаллов магнетита внедряются ионы С1", что обуславливает образование дислокаций. В результате этого на поверхности и в глубине кристаллической решетки феррита происходит накопление различных дефектов, и образуется активированный феррит [109]. Для очистки и выделения полученного золя его центрифугировали и пептизировали в дистиллированной воде.

ФМЖ-2. Магнетит стабилизировали добавлением лимонной кислоты и фосфата натрия, в соответствии с методом, предложенным в работе [186]: 2 г магнетита заливали смесью 150 мл 0.1 М лимонной кислоты СзН4(0Н)(С02Н)зхН20 и 50 мл 0.2 М гидрофосфата натрия Na2HJJ04>< 12Н20. В результате адсорбции ионов лимонной кислоты на поверхности магнетита образовался устойчивый золь черного цвета, имеющий рН 5.3-5.7. Добавлением гидрофосфата натрия получали стабильные золи с рН 6.0-6.5, пригодные для биоприменения [186]. Полученные растворы имели слабые магнитные свойства и низкую интенсивность рассеяния нейтронов вследствие низкой концентрации магнетита (0.5-1.0 г/дл). Для повышения концентрации магнитной жидкости образец, доведенный до рН 6.5 добавлением 0.2 М Na2lIP04x 12Н20, был упарен досуха при нагревании до 70°С и растворен в воде объемом, в несколько раз меньше исходного образца. Полученная жидкость (ФМЖ-2.1) имела высокую концентрацию магнетита (4 г/дл) и сохраняла стабильность (отсутствие заметного осаждения магнитной фазы) в течение длительного времени наблюдения (более года).

Также провели синтез ФМЖ-2 с большей концентрацией, добавляя к магнетиту те же количества лимонной кислоты и гидрофосфата натрия, растворенные в два раза меньшем объеме воды (75 мл 0.2 М лимонной кислоты СзН4(0Н)(С02Н)3хН20 и 25 мл 0.4 М гидрофосфата натрия Na2HP04><12H20) и частично выпаривая воду из полученного образца при нагревании до 30-40°С. Полученная жидкость имела значение рН 5.7, которое доводили до 6.1 добавлением кристаллов соли Na2HP04x12H20. Концентрация магнетита в полученной жидкости (ФМЖ-2.2) составляла около 6 г/дл. Подобным же образом, но без нагревания, была приготовлена ФМЖ на тяжелой воде (D2O) для проведения нейтронных экспериментов с использованием водородно-дейтериевого контрастирования растворителя по отношению к полимерной оболочке частиц ФМЖ, поскольку оболочка состояла из протонированного плюроника, имеющего слабый контраст по отношению к легкой воде. Величину pD феррожидкости, приготовленной на тяжелой воде, определенную из измеренного значения рНизм по формуле pD = рНшм + 0.4 [187, с. 45] и имевшую значение 5.75, доводили до 6.1 добавлением кристаллов Na2HPC>4x 12Н20. Полученная жидкость имела концентрацию магнетита около 3 г/дл.

Образец Условия стабилизации магнетита Концентрация магнетита, г/дл рН

ФМЖ-1 в Н20 25 г магнетита + 37 мл 2 М НС1, 100°С. 25.5 1.7

ФМЖ-2.1 в Н20 2 г магнетита + 150 мл 0.1 М лимонной кислоты С3Н4(0Н)(С02Н)3хН20 и 50 мл 0.2 М гидрофосфата натрия Na2HP04><12H20. 1.0 5.3-6.5

ФМЖ-2.2 в Н20 2 г магнетита + 75 мл 0.2 М лимонной кислоты С3Н4(0Н)(С02Н)3хН20 и 25 мл 0.4 М гидрофосфата натрия Na2HP04><12H20, частичное выпаривание воды при 30-40°С для увеличения концентрации магнетита. 5.9 5.7-6.1

ФМЖ-2.2 в D20 2 г магнетита + 75 мл 0.2 М лимонной кислоты С3Н4(0Н)(С02Н)3хН20 и 25 мл 0.4 М гидрофосфата натрия Na2HP04><12H20. 3.1 pD 5.7-6.1

Концентрации магнетита в исходных образцах определяли по массе сухого остатка, получавшегося в результате прокаливания раствора известного объема.

Приготовление комплексов для исследований методом малоуглового рассеяния нейтронов производили смешиванием раствора TPPS или фотодитазина с ФМЖ. Для ФМЖ-1 проводили нагревание смеси до 50-70°С и обработку ее ультразвуком для растворения образовавшегося осадка. В случае ФМЖ-2 нагревания и ультразвуковой обработки не требовалось. Образцы, с содержанием плюроника, готовили добавлением к ФМЖ сначала плюроника, а затем, если требовалось, фотодитазина. Концентрация тяжелой воды в ФМЖ-2.2 при добавлении легководного раствора фотодитазина составляла 90%, поэтому и остальные образцы ФМЖ-2.2 на тяжелой воде для нейтронного рассеяния доводили до 90% D20 (и 10% Н20) добавлением легкой воды. Состав исследованных растворов приводится в табл. 12—16.

4.2. Нейтронные исследования образцов

Методом малоуглового рассеяния нейтронов на дифрактометре «Мембрана-2» (ПИЯФ PAII) исследованы растворы ФМЖ-1 и ФМЖ-1 + TPPS. Кривые рассеяния I(q) (зависимости интенсивности рассеяния I от переданного импульса q) показаны на рис. 53.

Рис. 53. SANS ФМЖ-1 + TPPS в воде, Т= 20°С: 1,3 - ФМЖ-1 без TPPS; 2, 4 ~ ФМЖ-1 + H2TPPS4(HC1)2. Концентрации см. в табл. 12

Наилучшим образом кривые рассеяния приближаются формулой

1(g) =-/(Q) ? (1 +--—тт)у (1)

1 + (ЯС1д)2)гК (1 +(RC2q)2)2 К * соответствующей модели плотных сферических частиц, образующих кластеры, где /(0) = Iq^ - интенсивность рассеяния в нулевой угол при отсутствии интерференции

1 , волн, рассеянных от разных частиц, —--=-у = F (q) - квадрат формфактора + (ЛС[?) ) рассеивающих частиц в виде квадрированного лоренциана, хорошо описывающий Л рассеяние нейтронов на феррожидкостях [188]. 1 +-----= ^W) структурный

RC2q) ) фактор, обусловленный взаимной пространственной корреляцией частиц, образующих кластеры, а А = а(п -1), где а ~ вероятность образования кластера, и п - число частиц в кластере. Rci и Rc2 — радиусы корреляции отдельных частиц магнетита и кластеров, соответственно. Состав и параметры исследованных образцов приведены в табл. 12.

Заключение

1. Установлено образование комплексов сульфированного тетрафенилпорфина с поли-N-винилпирролидоном с использованием методов рассеяния нейтронов, спектрофотометрии и молекулярной гидродинамики. Определен характер конформационных изменений полимера, установлен кооперативный характер и найдены количественные характеристики связывания. Показано, что в разбавленных водных растворах макромолекулы полимера являются полиэлектролитными вследствие присоединения к ним молекул тетрафенилпорфина посредством водородных связей сульфогрупп порфирина с поляризованными молекулами воды из гидратной оболочки полимера.

2. Впервые получены и исследованы комплексы анионных сульфированных дифталоцианинов металлов (mpc2s4) с ДНК. Методом малоуглового рассеяния нейтронов установлена ассоциация молекул LUPC2S4 и SCPC2S4 с ДНК, что ведет к увеличению наблюдаемого поперечного диаметра, к уменьшению жесткости и к компактизации цепи ДНК в водно-солевом растворе, подтвержденной данными вискозиметрии и динамического рассеяния света. Предложены гипотезы, которые объясняют наблюдаемые эффекты ассоциации.

5. Впервые создан магнитоуправляемый сенсибилизатор, содержащий фотодитазин и плюроник, адаптированный для применения в фотодинамической терапии. Определено строение комплекса, размеры составляющих комплекс частиц и комплекса в целом.

Благодарю в первую очередь моего научного руководителя Лебедева Василия Тимофеевича за постоянное внимание и поддержку в процессе работы, Д.Н. Орлову за помощь в синтезе магнитных жидкостей, JI. Рошту и Д. Торока за помощь в организации проведения нейтронных экспериментов в Будапеште, M.JI. Гельфонда и А.Н. Стукова за помощь в проведении испытаний на мышах и предоставленный образец фотодитазина, Н.С. Мелик-Нубарова и Т.М. Жиентаева за предоставленные образцы плюроника, М.В. Филатова за помощь в оценке токсичности магнитных жидкостей, В.В. Клюбина и А.Б. Мельникова за возможность исследований образцов методом динамического светорассеяния, А.И. Сибилева и П.Н. Москалева за предоставленные образцы дифталоцианинов и обсуждения, В.А. Трунова, В.М. Лебедева, И.Н. Иванову, И.В. Голосовского, В.В. Исаева-Иванова и Г.В. Пономарева за полезные обсуждения и ценные замечания, а также сотрудников кафедры молекулярной биофизики СПбГУ за подготовку и необходимые знания, полученные в процессе обучения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Кульвелис, Юрий Викторович, Санкт-Петербург

1. Кирин И. С., Москалев П. Н., Макашев Ю. А. Образование необычных фталоцианинов редкоземельных элементов // Журн. Неорг. Химии. — 1965. — Т. 10. № 8. — С. 1951—1953.

2. Москалев П. Н. Способ получения комплексов дифталоцианинов редкоземельных элементов с йодом и бромом. Авт. свид. № 196216, зарег. 15.03.1967 // Бюлл. Изобр. 1967. —Т. 11. —С. 10.

3. Москалев П. Н., Комаров Е. В., Шнейдер М. А., Рачковская JI. А., Штильбанс Е. Б. Сульфированный дифталоцианин скандия, обладающий противовирусной активностью // Авт. свид. 1153536, зарег. 03.01.1985 // Бюлл. Изобр. — 1985. Т. 37.1. С. 257.

4. Гуринович Г. П., Севченко А. Н., Соловьев К. Н. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. Минск: Наука и техника, 1968. 520 с.

5. Березин Б. Д. Координационные соединения порфиринов и фталоцианина. М.: Наука, 1978. 280 с.

6. Linstead R. P. Phthalocyanines. Part I. A new type of synthetic colouring matters // J. Chem Soc. — 1934. — P. 1016—1017.

7. Barrett P. A., Dent С. E., Linstead R. P. Phthalocyanines. Part VII. Phthalocyanine as a co-ordinating group. A general investigation of the metallic derivatives // J. Chem. Soc.1936. —P. 1719—1736.

8. Robertson J. M. An X-ray study of the structure of the phthalocyanines. Part I. The metal-free, nickel, copper, and platinum compounds // J. Chem. Soc. — 1935. — P. 615—621.

9. Robertson J. M. An X-ray study of the phthalocyanines. Part II. Quantitative structure determination of the metal-free compound // J. Chem. Soc. — 1936. — P. 1195—1209.

10. Лебедева H. Ш. Термодинамика образования и физико-химические свойства молекулярных комплексов металлопорфиринов и металлофталоцианинов. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук. Иваново: 2007. 39 с.

11. Ломова Т. Н., Соколова Т. Н. Строение и реакционная способность металлофталоцианинов в процессах диссоциации / Успехи химии порфиринов, т. 2; под. Ред. О. А. Голубчикова. СПб: НИИ Химии СПбГУ, 1999. Гл. 8. С. 167—189.

12. Кирин И. С., Москалев П. Н., Макашев Ю. А. О новых комплексных соединениях фталоцианина с редкоземельными элементами // Журн. Неорган. Химии. — 1967. — Т. 12. №3, —С. 707—712.

13. Москалев П. Н., Шапкин Г. Н., Даровских А. Н. Синтез и свойства электрохимически окисленных дифталоцианинов РЗЭ и америция // Журн. Неорган. Химии. — 1979. — Т. 24. № 2. — С. 340—346.

14. Москалев П. Н., Кирин И. С. Способ получения сульфированных дифталоцианинов металлов. Авт. свид. № 298579, зарег. 04.01.1971 // Бюлл. Изобр. — 1971. Т. 11. — С. 84.

15. Bennet W. Е., Broberg D. Е., Baenziger N. С. Crystal structure of stannic phthalocyanine, an eight-coordinated tin complex // Inorg. Chem. — 1973. — V.12. No. 4. — P. 930—936.

16. Москалев П. H. Сэндвичевые координационные соединения металлов с фталоцианином и порфиринами // Коорд. Химия. — 1990. — Т. 16. № 2. — С. 147—158.

17. Tomilova L. G., Dyumaev К. М. The First Synthesis of Sandwich-type Titanium Bisphthalocyanines // Mendeleev Commun. — 1995. — V. 5. No. 3. — P. 109—110.

18. Бреусова M. О. Синтез и исследование новых симметрично замещенных фталоцианинов различного строения и их аналогов. Поиск новых областей их применения. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. М.: 2007. 26 с.

19. Толбин А. Ю., Томилова Л. Г., Зефиров Н. С. Би- и полиядерные фталоцианины: синтез и исследование физико-химических свойств // Успехи химии. — 2008. — Т. 77. № 5. — С. 460—475.

20. Галанин Н. Е., Якубов JI. А., Шапошников Г. П. Синтез и спектральные свойства комплексов «сэндвичевого» типа мезотетраметилтетрабензопорфирин-фталоцианин с лютецием, эрбием, иттрием и лантаном. // Журн. Орг. Химии. — 2008. — Т. 44. № 6. — С. 928—933.

21. Andersson-Engels S., Klintenberg C., Svanberg K., Svanberg S. In vivo fluorescence imaging for tissue diagnostics // Phys. Med. Biol. 1997. — V. 42. No. 5. — p. 815—824.

22. Pandey R. K., Zheng G. Porphyrins as photosensitizers in photodynamic therapy / The porphyrin handbook. Ed. Kadish К. M., Smith К. M., Guilard R. 2000 V. 6. P. 157—230.

23. Augulis R., Snitka V., Rotomskis R. Self-assembled tpps4 nanostructures revealed by atomic force microscopy // Solid State Phenomena. — 2004. — V. 97—98. P. 191—194.

24. Valanciunaite J., Bagdonas S., Streckyte G. and Rotomskis R. Spectroscopic study of tpps4 nanostructures in the presence of bovine serum albumin // Photochem. Photobiol. Sci. — 2006. — V. 5. — P. 381—388.

25. Ohno O., Kaizu Y., Kobayashi H. ./-aggregate formation of a water-soluble porphyrin in acidic aqueous media // J. Chem. Phys. — 1993. — V. 99. — P. 4128—4139.

26. Chen I. Molecular orbitals of phthalocyanine // J. Mol. Spectrosc. — 1967. — V. 23. No. 2.—P. 131—143.

27. Красновский А. А., Быстрова M. И. Перестройка агрегированных форм хлорофилла и бактериохлорофилла // Докл. АН СССР. — 1967. — Т. 174. № 2. — С. 480—483.

28. Быстрова М. И., Красновский А. А. Сравнительное изучение агрегированных форм хлорофилла и его аналогов в связи со структурными особенностями молекул пигментов // Молек. биол. — 1967. — Т. 1. № 3. — С. 362—372.

29. Быстрова М. И., Красновский А. А. Сравнительное исследование люминесценции агрегированных форм хлорофилла и его аналогов в твердых пленках // Молек. биол. — 1968. — Т. 2. № 6. — С. 847—858.

30. Быстрова М. И., Красновский А. А. Фотохимические свойства разных типов агрегированных форм хлорофилла а и бактериовиридина // Молек. биол. — 1971. — Т. 5. № 2. — С. 291—301.

31. Теренин А. Н. Фотоника молекул красителей и родственных соединений. JL: Наука, 1967.616 с.

32. Степанов Б. И. Введение в химию и технологию органических красителей. М.: Химия, 1984. 592 с.

33. Henderson В. W., Dougherty Т. J. How does photodynamic therapy work? // Photochem. Photobiol. — 1992. — V. 55. No. 1. — P. 145—157.

34. Henderson B. W., Dougherty T. J. Photodynamic therapy: basic principles and clinical application. New York: Marcel Dekker, 1992.

35. Черноносов А. А., Кнорре Д. Г., Федорова О. С. Конъюгаты олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами — реагенты для направленной окислительной модификации нуклеиновых кислот // Рос. Хим. Журн. — 2004. — Т. 48. № 4. — С. 83—99.

36. Pass Н. I. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use // J. Nat. Canser Inst. — 1993. — V. 85. No. 6. — P. 443—456. Перевод: Пасс X. И. Фотодинамическая терапия в онкологии // Физическая медицина. — 1993. — Т. 3. №3—4. —С. 5—21.

37. Riccelli F. Photophysical properties of porphyrins in biological membranes // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1995. — V. 29. No. 2—3. P. 109—118.

38. Moan J. On the diffusion length of singlet oxygen in cells and tissues // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1990. — V. 6. No. 3. — P. 343—344.

39. Ochsner M. Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of tumours // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1997. — V. 39. — P. 1—18.

40. Moore J. V., West С. M. L., Whitehurst C. The biology of photodynamic therapy // Phys. Med. Biol. — 1997. — V. 42. No. 5. — P. 913—935.

41. Zamzami N., Susin S. A., Marchetti P., Hirsch Т., Gomez-Monterrey I., Castedo M., Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis // J. Exp. Med. — 1996. — V. 183. No. 4.— P. 1533—1544.

42. Gomer C. J., Luna M., Ferrario A., Wong S., Fisher A. M. R., Rucker N. Cellular targets and molecular responses associated with photodynamic therapy // J. Clinical Laser Med. Surgery. — 1996. — V. 14. No. 5. — P. 315—321.

43. Geze M., Morliere P., Maziere J. C., Smith К. M., Santus R. Lysosomes, a key target of hydrophobic photosensitizers proposed for photochemotherapeutic applications // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1993. — V. 20. No. 1. — P. 23—25.

44. Hamblin M. R., Newman E. L. New trends in photobiology: On the mechanism of the tumour-localising effect in photodynamic therapy // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1994. — V. 23. No. 1. — P. 3—8.

45. Kessel D. Sites of photosensitization by derivatives of hematoporphyrin // Photochem. Photobiol. — 1986. — V. 44. No. 4. — P. 489—493.

46. Moan J., Boye E. Photodynamic effect on DNA and cell survival of human cells sensitized by hematoporphyrin // Photobiochem. Photobiophys. — 1981. — V. 2. — P. 301—307.

47. Crute J. J., Wahl A. F., Bambara R. A., Murant R. S., Gibson S. L., Hilf R. Inhibition of mammalian DNA polymerases by hematoporphyrin derivative and photoradiation // Cancer Res. — 1986.— V. 46. No. 1. —P. 153—159.

48. Sterry Ashby B. pH studies in human malignant tumours // The lancet. — 1966. — V. 288. No. 7458. — P. 312—315.

49. Thistlethwaite A. J., Alexander G. A., Moylan D. J., Leeper D. B. Modification of human tumor pH by elevation of blood glucose // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. — 1987. — V. 13. No. 4.— P. 603—610.

50. Thomas J. P., Girotti A. W. Glucose administration augments in vivo uptake nd phototoxicity of the tumor-localizing fraction of hematoporphyrin derivative // Photochem. Photobiol. — 1989. — V. 49. No. 3. — P. 241—247.

51. Nelson J. S., Kimel S., Brown L., Bems M. W. Glucose administration combined with photodynamic therapy of cancer improves therapeutic efficacy // Lasers Surg. Med. — 1992. — V. 12. No. 2. — P. 153—158.

52. Feldman G. В., Knapp R. C., Order S. E., Hellman S. The role of lymphatic obstruction in the formation of ascites in a murine ovarian carcinoma // Cancer Res. — 1972. — V. 32. No. 8. —P. 1663—1666.

53. Folkman J. How is blood vessel growth regulated in normal and neoplastic tissue? — G. H. A. Clowes Memorial Award Lecture // Cancer Res. — 1986. — V. 46. No. 2. — P. 467—473.

54. Underwood J. С. E., Carr I. The ultrastructure and permeability characteristics of the blood vessels of a transplantable rat sarcoma // J. Pathol. — 1972. — V. 107. No. 3. — P. 157—166.

55. Muller-Eberhard U., Morgan W. T. Porphyrin-binding proteins in serum // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1975. — V. 244. — P. 624—650.

56. Grossweiner L. I., Goyal G. C. Binding of hematoporphyrin derivative to human serum albumin // Photochem. Photobiol. — 1984. — V. 40. No. 1. — P. 1—4.

57. Jori G., Beltramini M., Reddi E., Salvato В., Pagnan A., Ziron L., Tomio L., Tsanov T. Evidence for a major role of plasma lipoproteins as hematoporphyrin carriers in vivo // Cancer Lett. — 1984. — V. 24. No. 3. — P. 291—297.

58. Гельфонд МЛ. Фотодинамическая терапия в онкологии // Практическая онкология. — 2007. — Т. 8. № 4. — С. 204—210.

59. Barth R. F., Soloway А. Н., Brugger R. М. Boron neutron capture therapy of brain tumors: past history, current status, and future potential // Cancer Invest. — 1996. — V. 14. No. 6. —P. 534—550.

60. Winkelman J., Slater G., Grossman J. The concentration in tumor and other tissues of parenterally administered tritium- and 14C-labeled tetraphenylporphinesulfonate // Cancer Res. — 1967. — V. 27. No. 11(1). — P. 2060—2064.

61. Evensen J. F., Moan J. A test of different photosensitizers for photodynamic treatment of cancer in a murine tumor model // Photochem. Photobiol. — 1987. — V. 46. No. 5. — P. 859—865.

62. Kessel D., Thompson P., Saatio K., Nantwi K. D. Tumor localization and photosensitization by sulfonated derivatives of tetraphenylporphine // Photochem. Photobiol. — 1987. — V. 45. No. SI. — P. 787—790.

63. Berg K., Western A., Bommer J. C., Moan J. Intracellular localization of sulfonated meso-tetraphenylporphines in a human carcinoma cell line // Photochem. Photobiol. — 1990. — V. 52. No. 3. — P. 481—487.

64. Nelson J. S., Roberts W. G., Berns M. W. In vivo studies on the utilization of mono-L-aspartyl chlorin (NPe6) for photodynamic therapy // Cancer Res. — 1987. — V. 47. No. 17.— P. 4681—4685.

65. Wong Kee Song L.-M., Wang К. K., Zinsmeister A. R. Mono-L-aspartyl chlorin e6 (NPe6) and hematoporphyrin derivative (HpD) in photodynamic therapy administered to a human cholangiocarcinoma model // Cancer. — 1998. — V. 82. No. 2. — P. 421—427.

66. Гельфонд M. JI. Возможности фотодинамической терапии в онкологической практике // Физическая медицина. — 2005. — Т. 15. № 2. — С. 31—34.

67. Rosenthal I. Phthalocyanines as photodynamic sensitizers // Photochem. Photobiol. — 1991. — V. 53. — P. 859—870.

68. Тахчиди X. П., Белый Ю. А., Терещенко А. В., Семенов А. Д., Каплан М. А., Володин П. Л., Румянцев Д. С., Пономарев Г. В., Баум Р. Ф. Фотодинамическая терапия в офтальмологии (обзор) // Офтальмохирургия. — 2005. — №1. — С. 45—51.

69. Brusentsov N. A., Baryshnikov A. Yu., Bayburtskiy F. S., Goncharov L. A. Evaluation of ferrofluids containing photosensitizer Электронный ресурс. // URL: http://maanetic1iquid.narod.rii/autoritv/066.htm (дата обращения: 15.04.2009).

70. Idowu M., Nyokong Т. Photophysical and photochemical properties of zinc and aluminum phthalocyanines in the presence of magnetic fluid // J. Photochem. Photobiol. A: Chem.2007. — V. 188. No. 2—3. — P. 200—206.

71. Мелик-Нубаров H. С. Взаимодействие водорастворимых полимеров с липидными мембранами. Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук. М.: 2007. 350 с.

72. Сибилева М. А., Морошкина Е. Б. Руководство к лабораторному практикуму по молекулярной биофизике. СПб. 1998. 122 с.

73. Fiel R. J., Howard J. С., Mark E. H., Datta-Gupta N. Interaction of DNA with a porphyrin ligand: evidence for intercalation // Nucleic Acids Res. — 1979. — V. 6. No. 9. — P. 3093—3118.

74. Решетников А. В., Швец В. И., Пономарев Г. В. Водорастворимые тетрапиррольные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака / Успехи химиипорфиринов, т. 2; под ред. О. А. Голубчикова. СПб: НИИ Химии СПбГУ, 1999. Гл. 4. С. 70—114.

75. Fiel R. J., Datta-Gupta N., Mark E. H., Howard J. C. Induction of DNA damage by porphyrin photosensitizers // Cancer Res. — 1981. — V. 41. No. 9(1). — P. 3543—3545.

76. Le Doan Т., Perrouault L., Rougee M., Bensasson R., Helene C. Singlet oxygen formation and cleavage of DNA photosensitized by porphyrins / Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases. Libreria Progetto. Ed., 1985. 423 p. P. 56—58.

77. Praseuth D., Gaudemer A., Verlhac J.-B., Kraljic I., Sissoeff I., Guille E. Photocleavage of DNA in the presence of synthetic water-soluble porphyrins // Photochem. Photobiol. — 1986. — V. 44. No. 6. — P. 717—724.

78. Croke D. Т., Perrouault L., Sari M. A., Battioni J.-P., Mansuy D., Helene C., Le Doan T. Structure—activity relationships for DNA photocleavage by cationic porphyrins // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1993. — V. 18. No. 1. — P. 41—50.

79. Merchat M., Spikes J. D., Bertoloni G., Jori G. Studies on the mechanism of bacteria photosensitization by meso-substituted cationic porphyrins // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1996. — V. 35. No. 3. — P. 149—157.

80. Moan J., Berg K. Photochemotherapy of cancer: experimental research // Photochem. Photobiol. — 1992. — V. 55. No. 6. — P. 931—948.

81. Groves J. Т., Matsunaga A. Designed double-strand DNA cleavage with chelate-appended porphyrins // Bioorg. Med. Chem. Lett. — 1996. — V. 6. No. 13. — P. 1595—1600.

82. Shneider H.-J., Wang M. DNA Interactions with Porphyrins Bearing Ammonium Side Chains // J. Org. Chem. — 1994. — V. 59. No. 24. — P. 7473—7478.

83. Villanueva A., Jori G. Pharmacokinetic and tumour-photosensitizing properties of the cationic porphyrin meso-tetra(4JV-methylpyridyl)porphine // Cancer Lett. — 1993. — V. 73. No. 1,—P. 59—64.

84. Boyle R. W., Dolphin D. Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers // Photochem. Photobiol. — 1996. — V. 64. No. 3. — P. 469—485.

85. Драбкин Г. M., Забиякин В. С., Иоффе А. И., Сибилев А. И., Марочкина И. К. Установка для исследования физико-химических и структурных свойств мономолекулярных пленок на границе раздела жидкость-газ. Препринт ЛИЯФ АН СССР № 1052. Л., 1985.26 с.

86. Юпобин В. В., Круглова Л. А., Сибилев А. И. Влияние добавок комплексообразующей соли на электрокинетические и гранулометрическиехарактеристики полистирольных латексов // Коллоид, журн. — 1991. — Т. 53. № 1. — С. 39-45.

87. Кирш Ю. Э. Поли-Ы-винилпирролидон и другие поли-Ы-виниламиды: синтез и физико-химические свойства. М.: Наука, 1998. 252 с.

88. Платэ Н. А., Васильев А. Е. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986. 294 с.

89. Sibileva M. A., Kul'velis Yu. V., Sibilev A. I., Moskalev P. N. Complexes of sulfonated lutecium and scandium diphthalocyanines with poly(N-vinylcaprolactam) and DNA // Russ. J. Phys. Chem. A. — 2005. — V. 79. Suppl. 1. — P. S60—S65.

90. Solomon O. F., Corciovei M., Cuita I., Boghina C. Properties of solutions of poly-N-vinylcaprolactam // J. Appl. Polym. Sci. — 1968. — V. 12. No. 8. — P. 1835—1842.

91. Lebedev V. Т., Torek Gy., Cser L., Kali Gy., Kirsch Yu. E., Sibilev A. I., Orlova D. N. NSE-study of poly(N-vinylcaprolactam) by coil-globule transition // Physica B: Condensed Matter. — 2001. — V. 297. — P. 50—54.

92. Байбуртский Ф. С. Магнитные жидкости: способы получения и области применения Электронный ресурс. // URL: http://maiineticliquid.narod.ru/ autoritv/008.htm (дата обращения: 15.04.2009).

93. Шлиомис М.И. Магнитные жидкости // Успехи физических наук. — 1974. — Т. 112. № 3. — С. 427—458.

94. Papell S. S. Low viscosity magnetic fluid obtained by the colloidal suspension of magnetic particles. Patent USA № 3215572, 1965.

95. Kaiser R., Miskolczy G. Magnetic Properties of Stable Dispersions of Subdomain Magnetite Particles // J. Appl. Phys. — 1970. — V. 41. No. 3. P. 1064—1072.

96. Kaiser R. Ferrofluid composition. Patent USA № 3700595, 1972.

97. Elmore W.C. Ferromagnetic colloid for studying magnetic structures // Phys. Rev., 1938. — V. 54. — P. 309—310.

98. Королев В. В., Рамазанова А. Г., Блинов А. В. Адсорбция поверхностно-активных веществ на высокодисперсном магнетите // Известия АН. Серия химическая. — 2002. — № 11. — С.1888—1893.

99. Королев В. В., Яшкова В. И., Рамазанова А. Г, Балмасова О. В. Адсорбция олеата натрия из водных растворов на поверхности магнетита. // Журн. Физ. Химии.2000. — Т. 74. № 11. — С. 2072—2075.

100. Бибик Е.Е. Приготовление феррожидкости // Коллоид. Журн. — 1973. — Т. 35. №6. —С. 1141—1142.

101. Massart R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media // IEEE Trans. Magn. — 1981. — V. 17. — P. 1247—1248.

102. BrusentsovN. A., Lukashevich M. V., Gogosov V. V. Magnetic and physicochemical aspects of the biomedical magnetic fluid technology // Magnetohydrodynamics. — 1994.

103. V. 30. No. 2. — P. 176—179.

104. BrusentsovN. A., Gogosov V. V., Lukashevich M.V. Physical and chemical criteria for the creation of ferrimagnetic composites for biomedical applications // Pharmac. Chem. J. 2006 — V. 30. No. 10. — P. 654—659.

105. Scatchard G. The attraction of protein for small molecules and ions // Ann. NY Acad. Sci. — 1949. — V. 51. — P. 660—672.

106. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия, т. 3, М.: Мир, 1985. 536 с.

107. Цветков В. Н., Эскин В. Е., Френкель С. Я. Структура макромолекул в растворе. М.: Наука, 1964.719 с.

108. Фрисман Э. В., Щагина Л. В., Воробьев В. И. Стеклянный ротационный вискозиметр //Коллоидный журнал. — 1965. — Т. 27. №1. — С. 130—133.

109. Будтов В. П. Физическая химия растворов полимеров. СПб: Химия, 1992. 384 с.

110. Eigner Y., Doty P. The native, denatured and renatured states of deoxyribonucleic acid // J. Mol. Biol. — 1965. — V. 12. No. 3. — P. 549—580.

111. Алексеев В. Л. Формирование структуры частиц полимерных коллоидов в процессе эмульсионной полимеризации. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Л., 1986. 116 с.

112. Gladkich I., Kunchenko А. В., Ostanevich Yu. М., Cser L. Spectrometer for investigation of small-angle neutron scattering using the time-of-flight method // J. Polym. Sci. — 1977. — V. 61. — P. 359—368.

113. Schmatz W., Springer Т., Schelten J., Ibel K. Neutron small-angle scattering: experimental techniques and applications // J. Appl. Cryst. — 1974. — V. 7. — P. 96—116.

114. Kadanoff L. P., Martin P. C. Hydrodynamic equations and correlation functions // Annals of Physics. — 1963. — V. 24. — P. 419—469.

115. Debye P., Bueche A. M. Scattering by an inhomogeneous solid // J. Appl. Phys. — 1949. — V. 20. No. 6. — P. 518—525.

116. Guinier A., Fournet G. Small-angle scattering of X-rays. New York: John Wiley and Sons, 1955.266 р.

117. Свергун Д. И., Фейгин J1. А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.: Наука, 1986. 280 с.

118. Jacrot В. The study of biological structures by neutron scattering from solution // Rep. Prog. Phys. — 1976. — V. 39. — P. 911—953.

119. Останевич Ю. M., Сердюк И. H. Нейтронографические исследования структуры биологических макромолекул // Успехи физических наук. — 1982. — Т. 131. — С. 85—116.

120. Асадчиков В. Е., Дембо А. Т., Львов Ю. М., Агамалян М. М., Крившич Т. И. Об исследовании радиусов инерции формиатдегидрогеназы методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и нейтронов // Кристаллография. — 1982. — Т. 27. — С. 189—190.

121. Li Z. Q., Jacrot В., Le Gaillard F., Loucheux-Lefebrve M. H. Transcortin: a neutron scattering study of a glycoprotein // FEBS Lett. — 1980. — V. 122. — P. 203—206.

122. Бояринцева А. К., Дембо А. Т., Рольбин Ю. А., Фейгин Л. А. Рентгеновское малоугловое рассеяние системой хаотически ориентированных правильных многогранников // Кристаллография. — 1975. — Т. 20. — С. 149—151.

123. Рольбин Ю. А., Свергун Д. И., Фейгин Л. А., Гаспар Ш., Ронто Д. Строение бактериофага Т7 по данным малоуглового рентгеновского рассеяния // Докл. АН СССР. — 1980. — Т. 255. — С. 1497—1500.

124. Дембо А. Т., Добров Е. Н, Леднев В. В., Тихоненко Г. И., Фейгин Л. А. Об упаковке ДНК внутри головок бактериофагов Д7, С2, Сд // Биофизика. — 1965. — Т. 10.— С. 404—407.

125. Фейгин Л. А. Рентгеновское малоугловое исследование структуры биополимеров в растворе. Автореферат дисс. на соискание ученой степени доктора физ.-мат. наук. М., 1975. 45 с.

126. Свергун Д. И., Фейгин JI. А., Щедрин Б. М. Прямой метод интерпретации данных малоуглового рассеяния системами идентичных частиц // Докл. АН СССР.1981. — Т. 261. — С. 878—882.

127. Ibel К. The neutron small-angle camera Dll at the High-flux Reactor, Grenoble // J. Appl. Cryst. — 1976. — V. 9. — P. 296—309.

128. Гуревич И. И., Тарасов JI. В. Физика нейтронов низких энергий. М.: Наука, 1965. 607 с.

129. Bacon G. Е. Neutron diffraction. Third edition. Oxford: Clarendon press, 1975. P. 38—41.

130. Sears V. F. Neutron scattering lengths and cross sections // Neutron News. — 1992.1. V. 3. No. 3. — P. 26—31.

131. Вайнштейн Б. К. Дифракция рентгеновских лучей на цепных молекулах. М.: изд-во АН СССР, 1963. 372 с.

132. Stuhrmann Н. В., Miller A. Small-angle scattering of biological structures // J. Appl. Cryst. — 1978. — V. 11. — P. 325—345.

133. Stuhrmann H. B. Neutron small-angle scattering of biological macromolecules in solution // J. Appl. Cryst. — 1974. — V. 7. — P. 173—178.

134. Ibel K., Stuhrmann H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions // J. Mol. Biol. — 1975. — V. 93. — P. 255—265.

135. Engelmann D. M., Moore P. B. A new method for the determination of biological quarternary structure by neutron scattering // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1972. — V. 69.— P. 1977—1999.

136. Harrison S. C. Structure of Tomato Bushy Stunt virus. I. The apherically averaged electron density // J. Mol. Biol. — 1969. — V. 42. — P. 457—483.

137. Mateu L., Tardieu A., Luzzati V., Aggerbeck L., Schanu M. On the structure of human serum low density lipoprotein // J. Mol. Biol. — 1972. — V. 70. — P. 105—116.

138. Engelmann D. M., Moore P. В., Schoenborn B. P. Neutron scattering measurements of separation and shape of proteins in 30s ribosomal subunit of Euscherichia coli // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1975. — V. 72. — P. 3888—3892.

139. Debye P. Molecular-weight Determination by Light Scattering // J. Phys. Colloid. Chem. — 1947. — V. 51. No. 1. — P. 18—32.

140. Kratky O., Porod G. X-ray Investigation of Dissolved Chain Molecules // Reel. Trav. Chim. Pays-Bas. — 1949. — V. 68. — P. 1106—1122.

141. Sharp P., Bloomfield V. A. Light scattering from wormlike chains with excluded volume effects // Biopolymers. — 1968. — V. 6. No. 8. — P. 1201—1211.

142. Schelten J., Wignall C. D., Ballard D. G., Schmatz W. Neutron small-angle scattering by mixtures of H- and D-tagged molecules of polystyrene and polyethylene // Colloid and Polymer Sci. — 1974. — V. 252. — P. 749—752.

143. Kirste R. G. Kruse W. A., Ibel K. Determination of the conformation of polymer in the amorphous solid state and in concentrated solution by neutron diffraction // Polymer.1975. — V. 16. — P. 120—124.

144. Lieser G., Fisher E. W., Ibel K. Conformation of polyethylene molecules in the melt as revealed by small-angle neutron scattering // J. Polym. Sci.: Polym. Lett. Ed. — 1975.1. V. 13. No. 1. —P. 39—43.

145. Glatter O., Kratky O. Small-angle X-ray scattering. London, New York: Acad. Press, 1982.515 р.

146. Фейгин JI. А. Абсолютная интенсивность малоуглового рассеяния рентгеновских лучей щелевыми системами и вычисление молекулярного веса макромолекул // Кристаллография. — 1967. — Т. 12. — С. 274—280.

147. Jacrot В., Zaccai G. Determination of molecular weight by neutron scattering // Biopolymers. — 1981. — V. 20. — P. 2413—2426.

148. Шоллер И. Приближение формы частиц однородным трехосным эллипсоидом на основе данных малоуглового рассеяния // Кристаллография. — 1975. — Т. 20. — С. 1175—1177.

149. Kratky О., Pils J. Recent advances and applications of diffuse X-ray small-angle scattering on biopolymers in dilute solutions // Quart. Rev. Biophys. — 1972. — V. 5. — P. 481—537.

150. Рольбин Ю. А., Фейгин JI. А., Щедрин Б. M. Расчет на ЭВМ интенсивности рентгеновского малоуглового рассеяния моделями произвольной формы с заданным распределением электронной плотности // Аппаратура и методы рентг. Анализа. — 1971. —Т. 9. —С. 46—50.

151. Fedorov В. A., Ptitsyn О. В., Voronin L. A. X-ray diffuse scattering by proteins in solution. Consideration of solvent influence // J. Appl. Cryst. — 1974. — V. 7. — P. 181—186.

152. Свергун Д. И. Разработка прямого метода определения структуры биологических макромолекул по данным малоуглового рассеяния. Дисс. На соискание ученой степени кандидата физ.-мат. Наук. М., 1982. 110 с.165

153. Stuhrmann H. В. Interpretation of small-angle scattering functions of dilute solutions and gases. A representation of the structures related to a one-particle scattering function // Acta Cryst. Sect. A. — 1970. — V. 26. No. 3. — P. 297—306.

154. Svergun D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria // J. Appl. Cryst. — 1992. — V. 25. — P. 495—503.

155. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. Под ред. Г. Камминса и Э. Пайка. М.: Мир, 1978. 583 с.

156. Vzorov A. N., Dixon D. W., Trommel J. S., Marzilli L. G., Compans R. W. Inactivation of human immunodeficiency virus type 1 by porphyrins // Antimicrob. Agents Chemother. — 2002. — V. 46. No. 12. — P. 3917—3925.

157. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. — 1958. — Т. 23. № 5. — С. 656—662.

158. Москалев П. Н., ЬСирин И. С. Спектрофотометрическое исследование свойств сульфированных дифталоцианинов иттрия, гадолиния и лютеция в водных растворах//Журн. неорган, химии. — 1971. —Т. 16. № 1.—С. 110—114.

159. Гросберг А. Ю., Хохлов А. Р. Статистическая физика макромолекул. М.: Наука, 1989. 344 с.

160. Сибилева М. А., Осипова Т. Н., Заленский А. О., Чебишян М. А., Голикова А. И., Воробьев В. И., Фрисман Э. В. Исследование комплексов ДНК с гистонами F3 и F3 + F2a2 // Молек. биол. — 1976. — Т. 10. № 3. — С. 514—520.

161. Сибилева М.А., Затяева А.А., Сабанеева Н.В., Матвеева Н.И. Конформация молекулы ДНК в водно-солевых растворах зависит от типа аниона соли // Биофизика. — 2002. — Т. 47. № 3. — С. 427—432.

162. Соловьева А. Б., Мелик-Нубаров H. С., Аксенова H. А., Глаголев H. H., Встовский Г. В., Бугрин В. С., Лузгина В. Н.,. Ольшевская В. А, Белкова Г. В. // Журн. физ. Химии. — 2006. — Т. 80. № 1. — С. 137—143.

163. Байбуртский Ф. С., Гончаров Л. А., Брусенцов Н. А. Получение магнитоуправляемых носителей для биомедицинских исследований Электронный ресурс. // http://magneticliquid.nafod.rii/medicine/012.htm (дата обращения: 15.04.2009).

164. Лобышев В. И., Калиниченко Л. П. Изотопные эффекты D20 в биологических системах. М.: Наука, 1978. 216 с.

165. Lebedev V. Т., Gordeev G. P., Panasiuk Е. A., Kiss L., Cser L., Rosta L., Torok Gy., Farago В. Ferrofluid dynamics: Spin-echo experiment // J. Magn. Magn. Mater. — 1993. — V. 122. —P. 83—89.

166. Лебедев В. Т., Гордеев Г. П., Панасюк Э. А., Дудаков А. Д., Орлова Д. Н., Сибилев А. И., Клюбин В. В., Качурин А. Л., Рошта Л., Чер Л., Торок Д., Киш Л., Фараго Б. Структура и динамика феррожидкости. Препринт ПИЯФ № 1839. Санкт-Петербург, 1992. 46 с.

167. Балашою М., Авдеев М.В., Аксенов В.Л. Исследование кластеров в водных магнитных жидкостях методом малоуглового рассеяния нейтронов. Обзор // Кристаллография. — 2007. — Т. 52. № 3. — С. 528—535.

168. Аксельрод JI. А., Гордеев Г. П., Драбкин Г. М., Лазебник И. М., Лебедев В. Т. Анализ малоуглового рассеяния поляризованных нейтронов в ненамагниченных феррожидкостях // ЖЭТФ. — 1986. — Т. 91. № 2(8). — С. 531—541.

169. Torok Gy., Lebedev V. Т., Orlova D. N. Structure of colloidal particles in aqueous ferrofluid // Magnetohydrodynamics. — 2002. — V. 38. No. 3. — P. 277—280.

170. Wiedenmann A., Hoell A., Kammel M. Small-angle scattering investigations of cobalt-ferrofluids using polarised neutrons // J. Magn. Magn. Mater. — 2002. — V. 252. — P. 83—85.

171. Gazeau F., Boue F., Dubois E., Perzynski R. Static and quasi-elastic small angle neutron scattering on biocompatible ionic ferrofluids: magnetic and hydrodynamic interactions // J. Phys.: Condens. Matter. — 2003. — V. 15. — P. S1305—S1334.

Информация о работе

Кульвелис, Юрий Викторович
кандидата физико-математических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Структура и свойства комплексов порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами и магнитными частицами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы