Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание наноструктурных систем для транспорта лекарственных препаратов на основе смеси тритерпеноидов бересты

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Создание наноструктурных систем для транспорта лекарственных препаратов на основе смеси тритерпеноидов бересты"

На правах рукописи

Нгуен Хонг Куанг

СОЗДАНИЕ НАНОСТРУКТУРНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ТРАНСПОРТА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ СМЕСИ ТРИТЕРПЕНОИДОВ БЕРЕСТЫ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

13 МАЙ 2015

005568772

Москва-2015

005568772

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова».

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор,

заведующий кафедрой биофизики - ФГОУ ВПО «Московский физико-технический институт (государственный университет)» Чуппн Владимир Викторович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, зав.

лабораторией инженерии ферментов (ФГБУН Центр «Биоинженерия» РАН) Варламов Валерий Петрович

кандидат физико-математических наук, начальник группы малоуглового рассеяния нейтронов Лаборатории нейтронной физики им. И.М. Франка (Объединенный институт ядерных исследований) Куклнн Александр Иванович

Ведущая организация: ФГБНУ «Научно-исследовательский

институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Защита диссертации состоится «22» июня 2015 г. в 13 ч 00 мин на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» по адресу 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86, аудитория М-119.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» и на интернет-сайте МИТХТ им. М. В. Ломоносова http:/Av\vw.mitht.ru.

С авторефератом можно ознакомиться на интернет-сайгах ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru и МИТХТ им. М.В. Ломоносова http://\vww.mitht.ru.

Автореферат разослан «Д&» апреля 2015 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.120.01 кандидат химических наук, старший научный сотрудник

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

Актуальность проблемы. В последние годы наблюдается стремительный рост научных исследований и их практических приложений в области нанонауки. Значительные успехи, достигнутые в развитии нанотехнологий, позволяют использовать данные технологии в медицине для эффективной диагностики и лечения социально значимых заболеваний. Ожидаемые области применения нанотехнологий в медицине включают доставку лекарственных препаратов, диагностику in vitro и in vivo, производство биологически активных добавок и биосовместимых материалов. В настоящее время изучение наноструктур для медицинского использования направлено на создание систем адресной доставки лекарственных средств, в частности наночастицы (НЧ) являются важными инструментами для реализации этих задач. Причины, почему НЧ являются привлекательными объектами для медицинских целей, основываются на их важных и уникальных свойствах. НЧ имеют относительно большую функциональную поверхность, на которой могут связываться, адсорбироваться и транспортироваться различные соединения, такие как лекарства, зонды и белки, включая адреса доставки. Небольшой размер НЧ обеспечивает возможность их транспорта к различным органам и тканям. Кроме того, водонерастворимые гидрофобные соединения могут включаться в состав НЧ.

Использование наночастиц в качестве средств доставки уже продемонстрировало возможность увеличения терапевтической эффективности некоторых лекарственных препаратов, а также снижение их токсичности и побочных эффектов. В связи с этим актуальной задачей нанотехнологии является создание новых наноструктур лекарственных препаратов, обладающих низкой токсичностью, которые могут быть использованы в медицине в качестве направленных средств доставки.

В рамках данной работы нами была поставлена цель создать новые наноструктуры для направленной доставки лекарственных средств. Ранее на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М. В. Ломоносова был создан ряд нанопрепаратов на основе сферических аморфных наночастиц (САНЧ) из смеси тритерпеноидов бересты (СТБ) для доставки некоторых лекарственных средств из различных фармакологических групп для лечения социально-значимых заболеваний. Данные наночастицы обладают рядом преимуществ, такими, как: маленький размер частиц, нетоксичность, отрицательное значение дзета-потенциала, высокая стабильность. Таким образом, исходя из вышеперечисленных свойств, САНЧ представляют собой перспективные наноструктуры для доставки лекарств.

В данной работе были разработаны методы получения и получены новые препараты САНЧ, включающие гидрофобные лекарственные препараты.

Цели работы: Создание и изучение свойств ряда нанодисперсий на основе САНЧ из СТБ для солюбилизацни и доставки гидрофобных биологически активных соединений:

В руководстве работой и подготовке диссертации к защите принимал участие зав. кафедрой биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В.Ломоносова акад. РАН Швец В.И.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Изучение влияния холестерил гемисукцината (CHS) в качестве добавки на стабильность САНЧ.

2. Создание и изучение физико-химических характеристик нанодисперсий САНЧ, загруженных мезо-арилпорфиринами в качестве моделей потенциальных агентов для фотодинамической терапии рака (ФДТ).

3. Создание и изучение физико-химических характеристик и биологической активности нанопрепарата САНЧ, содержащего радиозащитное вещество - генистеин.

4. Создание и изучение физико-химических характеристик нанодисперсии САНЧ, загруженной субстанцией противоэпилептического препарата - карбамазепина.

Научная новизна работы

1. Впервые была проведена оценка влияния CHS на агрегационую стабильность САНЧ и его возможность использования в качестве стабилизирующей добавки.

2. Впервые были получены нанодисперсии на основе САНЧ и мезо-арилпорфиринов для ФДТ. Были изучены физико-химические характеристики и возможность загрузки нанодисперсий САНЧ порфиринами.

3. Впервые был получен нанопрепарат на основе САНЧ с радиозащитным веществом генистеином. Были изучены физико-химические характеристики и биологическая активность в испытаниях in vivo для данного нанопрепарата.

4. Впервые была получена нанодисперсия на основе САНЧ и субстанции противоэпилептического препарата карбамазепина. Были изучены физико-химические характеристики и возможность загрузки нанодисперсии САНЧ данным препаратом.

Практическая значимость работы

В работе были получены наночастицы на основе САНЧ и некоторых биологически активных соединений, а также оценена эффективность загрузки полученных нанодисперсий. Исследование позволило создать новые нанопрепарата с высокой биологической активностью, стабильностью и низкой токсичностью для организма. Исследование свойств и биологических эффектов нанодисперсий, полученных в ходе выполнения данной работы, также позволит расширить область применений САНЧ в качестве средств для доставки лекарственных препаратов. Данное направление является стратегическим в области фармацевтики в частности, и современной медицины в общем.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Влияние использования CHS в качестве стабилизирующей добавки на агрегационую стабильность САНЧ.

2. Получение новых нанодисиерсий на основе комбинации САНЧ с различными гидрофобными лекарствеными препаратами: .i/езо-арилпорфиринами для потенциального применения в ФДТ, радиозащитньш веществом генистеином и субстанцией противоэпилептического препарата карбамазепииа.

3. Изучение физико-химических характеристик и возмозности загузки нанодисперсий САНЧ, загруженных л/езо-арилпорфиринами для ФДТ.

4. Изучение физико-химических характеристик и биологической активности нанопрепарата САНЧ с радиозащитным веществом генистеином.

5. Изучение физико-химических характеристик нанодисперсии САНЧ, загруженной субстанцией противоэпилептического препарата карбамазепина.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 1 принята в печать и 4 тезиса докладов на международных конференциях.

Результаты диссертации были доложены и представлены на международных научных конференциях: VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и переспективны развития» (Москва, 19-22 марта 2013); V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии; нанотехнологий и медицины» (Ростов, 3-5 октября 2013); VI Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (ТМКФ-6) (Г. Троицк, г. Москва. 2-6 июня 2014 г); VII Съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 21-24 октября 2014 г).

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, заключений и списка литературы, включающего 246 источников. Работа проиллюстрирована 88 рисунками и содержит 1 схему и 16 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для получения САНЧ была использована СТБ, состоящая из следующих компонентов: бетулин (60±5%), лупеол (30±4%) и кофеат бетулина (9±3%) (рис. 1).

>

//' н3с—-.,

н I \

ГСй

НуСГ СН:,

г-г-;.4

Рис. 1. Основные компоненты смеси тритерпеноидов бересты: а - бетулин, б - лупеол, в - кофеат

бетулина.

Ранее на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова было показано, что смесь тритерпеноидов, выделенная экстракцией органическими растворителями из бересты (продукт компании ООО «Березовый мир») при растворении в смеси воды и органического растворителя, смешивающегося с водой, и последующего удаления органического растворителя образуют САНЧ. Получающиеся при этом сферические наночастицы имеют довольно узкое распределение по размерам (рис. 2) и обладают относительно высокой стабильностью.

Рнс. 2. Электронная микрофотография САНЧ из тритерпеноидов бересты (а) и средний размер САНЧ (б).

Благодаря своим свойствам САНЧ. состоящие из смеси тритерпеноидов бересты, были исследованы в отношении возможности загрузки ряда субстанций. Оказалось, что многие вещества (доксорубицин, рифампицин и рифабутин, синтетический аналог эстрогена диэтилстильбэстрол, диклофенак, ацетилсалициловая кислота, гепатопротектор силибинин) включаются в САНЧ с концентрацией от 5 до 20 % по отношению к содержанию СТБ (Каплун А.П и др., 2011). Обычно вплоть до 5 % вещество полностью включается в САНЧ. Учитывая гидрофобный характер ядра САНЧ, данные наночастицы были выбраны нами для создания водорастворимых форм ряда гидрофобных препаратов.

1. Влияние использования холестерил гемисукцината в качестве стабилизирующей добавки на стабильность САНЧ

Одной из ключевых проблем в создании нанопрепаратов лекарственных препаратов является их стабильность как при хранении, так и при терапевтическом использовании.

Для повышения стабильности САНЧ нами был выбран CHS (рис. 3). В нескольких исследованиях [Ycinyun X. el cd., 2015; Cherezov V. el а/, 2013] было показано, что CHS увеличивает стабильность некоторых наночастиц, в частности мицелл. К достоинствам CHS следует отнести его биодергадируемость (молекула CHS состоит из янтарной кислоты и холестерина, соединенных сложноэфирной связью), структурную близость к тритерпеноидам, наличие ионогенной группы, позволяющей увеличивать поверхностный дзета-потенциал САНЧ. Для проверки стабилизирующего эффекта CHS, САНЧ получали в присутствии разных количеств CHS по отношению к СТБ.

Put. 3. Структура холестерина гемисуксината (CHS).

Включение CHS в состав САНЧ контролировалось с помощью УФ-спектроскопии, по поглощению при длине волны 210 нм. Результаты, представленные на рис. 4, указывают на присутствие CHS в нанодисперсии, и при этом наблюдается увеличение степени поглощения CHS при добавлении различных концентраций вплоть до 5%т.

Длина волны, нм

Рис. 4. УФ - спектры поглощения CHS с различными концентрациями в нанодисперсиях САНЧ.

Содержание CHS, а также включаемых препаратов в состав САНЧ указано в весовых процентах по отношению к СТБ.

Полученные образцы хранились в течение недель при комнатной температуре. После центрифугирования содержание САНЧ контролировалась с помощью УФ-спектроскопии. Было показано, что образцы, содержащие от 1 % до 5% CHS ( по отношению к содержанию СТБ), оставались стабильными в течение 4-8 недель. В отсутствии CHS наблюдалось образование осадка СТБ.

С целью оценки эффекта использования CHS на свойства САНЧ было проверено влияние CHS на изменение размера частиц и значение дзета-потенциала поверхности САНЧ. Полученные результаты, представленные в табл. 1 и рис. 5 показывают, что увеличение концентрации CHS до 5% по отношению к содержанию СТБ приводило к уменьшению размера и увеличению значения дзета-потенциала поверхности частиц по сравнению с обычными САНЧ (без добавления CHS). Частицы САНЧ с наименьшим размером образовывались при содержании 2% CHS. При дальнейшем увеличении содержания CHS размер САНЧ увеличивался, что. по-видимому, обусловлено относительно высокой гидрофобностью CHS.

Таблица 1. Изменение размера САНЧ с использованием (CHS) в качестве стабилизатора в различных концентрациях.

Нанодисперсии Размер частиц, нм

САНЧ без CHS 193

САНЧ + 1%CHS 172

САНЧ + 2 % CHS 143

САНЧ + 5% CHS 166

САНЧ + 10%CHS 223

ррв ? СЛНЧ < 2% CHS

И s 1 -34.58 1 ! 1

I -зи

САНЧ беи CHS

Л 1.Я

Рис. 5. Увеличение величины дзета потенциала на поверхности САНЧ при добавлении CHS.

Таким образом, исходя из полученных данных, видно, что CHS может быть использован в качестве добавки для повышения стабильности САНЧ. Эффект использования CHS на способность доставки САНЧ с определёнными лекарственными субстанциями будет рассмотрен в следующих частях работы.

2. Сферические аморфные наночастицы (САНЧ), загруженные сенсибилизаторами мезо-арплпорфнрннами для фотодннамическоп терапии (ФДТ)

Использование порфиринов и их синтетических производных в качестве фотосенсибилизаторов (ФС) для ФДТ при лечении рака описано в многочисленных публикациях [Ballut S. el al„ 2011; Nishiyama N. el a/., 2003]. Синтетические производные порфиринов представляют собой типичные ФС, способные генерировать синглетный кислород '02 под воздействием света и оказывать эффективное лечение. Однако, использование порфиринов и их производных имеет ряд ограничений. Это низкая

растворимость в воде, недостаточная специфичность в доставке к опухолевым тканям, быстрое выведение из организма. Для преодоления этих недостатков одним из возможных вариантов является включение препаратов в наноструктуры. Цель данного раздела заключалась в изучении включения модельных синтетических и/езо-арилпорфиринов (рис. 6) в состав САНЧ и исследование характеристик таких наночастиц в качестве потенциальных агентов для ФДТ.

Получение САНЧ с сенсибилизаторами мезо-арилпорфиринами

Afejci-арилпорфирины I-V были синтезированы на кафедре химии и технологии биологически активных соединений имени H.A. Преображенского (Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова). Нанодисперсии САНЧ с синтетическими л<езо-арилпорфиринами были получены из смесей путем смешения соответствущих растворов .«езо-арилпорфиринов, СТБ и CHS в тетрагидрофуране и фосфатного буфера (ЮмМ, pH 7,5). Тетрагидрофуран удалялся упариванием в вакууме. Свойства и стабильность полученных САНЧ были исследованы методами динамического светорассеяния, УФ-ВИД спектрофотометрии, флуоресцентной спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии.

Для создания САНЧ с включенными порфиринами было проверено влияние соотношения СТБ/СНБ/порфирин на размер частиц, поверхностный дзета-потенциал, морфологию и стабильность. Были приготовлены и исследованы 2 серии нанодисперсий САНЧ, модифицированных порфиринами: 1) при фиксировании концентрации порфиринов 2% и изменении концентрации CHS 0%, 1% и 5% или 2) при фиксировании концентрации CHS 2% и изменении концентрации порфиринов 0%, 5% и 10%. Концентрации порфиринов и CHS в нанодисперсиях рассчитаны по отношению к содержанию СТБ.

R,

R1 - ОН: R = OICHjhjCHj (III) R' -= 0(СН,)пСН,; Ii = OH (IVj R1 - 0(CH;CH,0),; R - OH (V)

Рис. 6. Структура исследуемых порфиринов.

Определение размера наночастнн

Размер САНЧ с включенными порфнринамн определяли с помощью метода динамического светорассеяния. Полученные данные представлены в табл. 2. Размеры частиц для большинства образцов оказались в диапазоне 100-200 нм, что отвечает требованиям при разработке эффективных нанопрепаратов. При фиксировании концентрации порфиринов размеры частиц САНЧ уменьшаются постепенно с увеличением концентрации CHS. При самой высокой концентрации CHS 5% и концентрации порфиринов II-V, равной 2%, наночастицы имели наименьшие размеры. Во втором эксперименте при фиксировании концентрации CHS 2%, размеры частиц увеличиваются с увеличением концентрации загружаемых веществ и достигают наибольших размеров при концентрации порфиринов 10%.

Таблица 2 . Размеры полученных наночастиц.

2% Порфнрина + изменение кон. CHS 2% CHS + изменение кон. порфиринов

Соединение Доля порфиринов, % Доля (CHS), % Размер частиц, нм Доля порфиринов, % Доля (CHS), % Размер частиц, нм

0 0 193

(I) 2 0 216

2 1 407

2 5 408

0 0 193

in» 2 0 238 0 2 143

2 1 213 5 . 2 246

2 5 166 10 2 305

0 0 193

о») 2 0 327 0 2 143

2 1 286 5 2 277

2 5 217 10 2 280

(IV) 0 0 193

2 0 143 0 2 143

2 1 151 5 2 176

2 5 158 10 2 160

0 0 193

(V) 2 0 185 0 2 143

2 1 260 5 2 152

2 5 175 10 2 202

Определение дзетп-потенцшиа

Одним из важных факторов, обеспечивающих стабильность САНЧ, является поверхностный дзета-потенциал. Результаты определения дзета-потенциала представлены в табл. 3 и рис. 7. Значения дзета-потенциалов нанодисперсий находятся в диапазоне от - 33 до - 37 мВ. Кроме того, значения дзета-потенциала увеличиваются с увеличением гидрофобное™ порфиринов. загруженных в САНЧ (IV > II > САНЧ > V). Присутствие CHS в составе САНЧ увеличивает отрицательный поверхностный потенциал и, тем самым, препятствует агрегации наночастиц и увеличивает их стабильность.

Таблица 3. Дзета -потенциал исследуемых дисперсий САНЧ

Дзета-потенциал исследуемых дисперсий САНЧ (мВ)

САНЧ без порфиринов и CHS -31.8

САНЧ + 2% CHS и без порфиринов -34.58 (Контроль)

САНЧ +2% CHS + 10% порфирина (II) -35.09

САНЧ +2% CHS + 10% порфирина (IV) -36.29

САНЧ +2% CHS + 10% порфирина (V) -33.78

Исследование морфологии

Исследование морфологии наночастиц проводилось с помощью метода сканирующей электронной микроскопии. На рис. 8 представлены микрофотографии наночастиц на основе САНЧ, модифицированных порфиринами IV и V, а также контрольной дисперсии, не содержащей порфиринов. На всех микрофотографиях имеются видны сферические наночастицы. Наночастицы при этом имеют схожие размеры, обособлены между собой и не агрегируют. При содержании порфиринов 10% по отношению к СТБ наблюдается появление палочковидных структур (рис.8 а,б). По-видимому, это связано с кристаллизацией компонентов наночастиц.

-150 -100 -50 0 50 100 150 200 250

0 -200 Дзета-потенциал. мВ

Рис. 7. Величина дзета потенциала наночастиц САНЧ, загруженных 10% порфирина V и 2% CHS.

а 6 в

Рис. 8, Электронные микрофотографии нанодисперсий САНЧ: а - нанодисперсия САНЧ с 10 % порфирина V + 2% CHS; б - нанодисперсия САНЧ с 10 % порфирина IV + 2% CHS; в - контрольная нанодисперсия САНЧ (без порфиринов) + 2% CHS.

Опенки возможности ¡чгрузки СЛНЧ с порфиринами и стабильности дисперсии

На основании полученных данных о размерах частиц и их морфологии мы исследовали возможность загрузки САНЧ с порфиринами с помощью УФ-спектроскопии и флуориметрии. Согласно полученным экспериментальным данным, амфифильные мезо-арилпорфирины связываются с наночастицами САНЧ. С помощью УФ/ВИД-спектроскопии было показано, что при фиксировании концентрации загружаемых порфиринов 2% (вес. по отношению к СТБ), увеличение концентрации CHS до 5% вес. по отношению к СТБ) способствует увеличению эффективности загрузки порфиринов в частицы. На рис. 9 показано увеличение оптической плотности, соответствующей полосе Соре порфиринов I и II, в составе САНЧ при увеличении содержания CHS.

а б

Рис. 9. Увеличение содержания порфиринов I и II, загруженных в САНЧ в зависимости от концентраций CHS: а - для порфнрнна I; 6 - для порфирнна II. Концентрация порфиринов прямо пропорциональна интенсивности поглощения при полосе Соре.

Результаты флуориметрии порфиринов IV и V показывают, что при добавлении высокой концентрации CHS увеличивается интенсивность флуоресценции, достигая наивысшего значения при 5% CHS (рис. 106 и 116). При фиксированной начальной концентрации порфиринов 2% увеличение концентрации CHS также вызывает повышение их загрузки в частицы. И. наоборот, при фиксированной концентрации CHS 2% (рис. 10а и 11а), увеличение концентрации порфиринов до 10% приводит к снижению интенсивности флуоресценции по сравнению с более низкой концентрацией 5%. Подобное снижение интенсивности флуоресценции является результатом формирования агрегатов порфиринов.

Рис. 10. Спектры флуоресценции наночастиц САНЧ, загруженных! а — 2% CHS при изменении концентрации порфирина (V): 10% (1), 5% (2); 6-2% порфирина V при изменении концентрации CHS: 0% (1), 1% (2), 5% (3).

а.

s г

г

s'

11

! К"

I I

<\л

и . ^ \

550 600 6S0 ЯЮ Длина волаы, им

Р 1 -

а б

Рис. 11. Спектры флуоресценции наночастиц САНЧ, загруженных: а - 2% CHS при изменении концентрации порфирина (IV): 10% (7), 5% (2); б - 2% порфирина IV при изменении концентрации CHS: без CHS (1), 1% (2), 5 %(3).

Для подтверждения образования САНЧ с порфирином был проведен эксперимент по измерению флуоресценции исходного порфирина в органическом растворителе тетрагидрофуране (ТГФ) и сравнение этих данных со спектрами полученных наночастиц. При образовании САНЧ с порфирином происходит тушение флуоресценции по сравнению со свободным порфирином в ТГФ. Далее при разрушении наночастиц с помощью додецилсульфата натрия (SDS) наблюдали восстановление флуоресценции порфирина, что доказывает его включение в наночастицы. Этот эксперимент был проведен с нанодисперсией САНЧ, содержащей 0,01 мг/мл (2%) порфирина V и 2% CHS в качестве стабилизатора. Показано, что при концентрации 2% порфирина V, почти 100% содержания порфирина высвобождается в дисперсионную среду при разрушении частиц (рис. 12).

»О 650 700 750 тв Длена волны, ш|

ÍOO 550 «О 650 ?oa т Длина волны.вм

Рис. 12. Спектры флуоресценции порфирина V в различных растворах: 2% порфирина (0,01мг/мл буфера) в нанодисперсии САНЧ {/), порфирин в ТГФ (0,01мг/мл) (2), 2% порфирина (0,01мг/мл) в нанодисперсии САНЧ с добавлением 0.4М ЭЭБ

(3).

Для оценки стабильности исследуемой нанодисперсии сравнивали УФ-спектры поглощения порфирина V в нанодисперсии САНЧ: непосредственно сразу после приготовления, а также после б недель хранения. Результаты, представленные на рис. 13, показывают, что концентрация порфирина V в нанодисперсии практически не изменилась после 6 недель хранения. В нанодисперсии также не наблюдали возникновение агрегатов и выпадение осадка. Это указывает на то, что полученная нанодисперсия является стабильной во времени.

Рис. 13. Стабильность наночастиц САНЧ. загруженных 10% порфирина V + 2% CHS во времени: а - сразу после приготовления: б - после 6 недель хранения.

3. Сферические аморфные наночастицы (САНЧ), загруженные радиозащитном веществом геиисгеииом

Особое внимание в работах последних лет было уделено изучению радиозащитных свойств для веществ из группы изофлавоноидов. К одним из таких препаратов относится генистеин (рис. 14). По литературным данным, генистеин обладает радиозащитной эффективностью, которая, как полагают, в значительной степени определяется сильной антиоксидантной активностью этого соединения. Эффект от применения генистеина в значительной степени зависит от времени введения препарата и его дозы. Кроме того, использование генистеина также не вызывает токсичность и побочные эффекты в исследованиях ir¡ vivo.

До настоящего времени еще не существует коммерческого препарата на основе генистеина для радиозащитной цели и широкого использования в медицине, поскольку существует еще ряд неизученных вопросов, требующих отдельного рассмотрения, например, его фармакологическая активность и потенциальная токсичность при использовании в организме человека. Кроме того, генистеин является гидрофобным соединением и практически не растворяется в воде. Это также вызывает значительные сложности в разработке и получение препаратов на его основе. Следовательно, параллельно с изучением и оценкой радиозащитной эффективности генистеина в обычной форме, одним их перспективных исследовательских направлений, которое может привести к положительным результатам в плане оптимизации и повышения фармацевтической эффективности, химической устойчивости, растворимости и дисперсности генистеина, является его комбинированное использование в составе наноструктур. Таким образом, учитывая гидрофобные свойства генистеина и возможность доставки субстанции с помощью САНЧ. целью следующего раздела работы явилась получение и изучение свойств нового радиозащитного нанопрепарата на основе САНЧ с генистеином, а также оценка его биологической активности в опытах in vivo.

Получение САНЧ в комплексе с субстанцией радиозащитиого вещества генистеина

На основе полученных ранее результатов об эффективности загрузки САНЧ с мезо-арилпорфиринами (раздел 2) и оптимальной используемой концентрации CHS, а также необходимой концентрации субстанции для обеспечения дозы испытаний in vivo, был предложен способ получения и изучены свойства нанопрепарата САНЧ с генистеином с концентрацией субстанции 10% и 2% CHS в качестве стабилизирующей добавки. Концентрация генистеина и CHS в нанопрепарате рассчитана по отношению к содержанию СТБ. Нанопрепарат был получен при диспергировании смеси, состоящей из следующих растворов: генистеина в ТГФ, СТБ в ТГФ, CHS в 'ГГФ (в качестве стабилизатора), фосфатного буфера (10 мМ. рН 7,5). Дисперсию после перемешивания концентрировали до объема 10 мл. После частичного удаления растворителя, полученная нанодисперсия была использована для исследования физико-химических характеристик и оценки радиозащитной активности в испытаниях in vivo.

Физико-химические и морфологические характеристики САНЧ, содержащих субстанцию радиозащитиого вещества генистеина

С помощью методов динамического светорассеяния, сканирующей электронной микроскопии и УФ-спектрофогометрии определяли основные параметры наноформы

1S

Рис. 14. Структура генистеина.

генистеина на основе САНЧ. Исходя из полученных данных (рис. 15) видно, что наночастицы имеют сферическую форму и обособлены друг от друга с дзета потенциалом поверхности -34,74 мВ, средний размер САНЧ. содержащих 10% генистеина и 2% CHS, составляет 137 нм. Возможность загрузки САНЧ с генистеином была подтверждена, исходя из УФ-спектра поглощения вещества в нанодисперсии при длине волны 262 нм.

137 км

I,

-

1

САНЧ + 10% ГЕН + 2% CHS

САНЧ +• 0% ГЕН -г 294 CHS (Контроль)

Длина волны, пм

Рис. 15. Физико-химические характеристики САНЧ, содержащих 10% генистеина + 2% CHS: а - средний размер наночастиц по данным динамического светорассеяния; б- дзета-потенциал поверхности наночастиц; в -электронная микрофотография наночастиц; г-УФ спектр поглощения генистеина в нанодисперсии САНЧ.

Оценка у ад но защити ой эффективности нанопрепарата САНЧ с генистеином при профилактическом применении*

Полученную дисперсию САНЧ с генистеином разбавляли дистиллированной водой для создания необходимой концентрации генистеина. Для изучения радиозащитного действия в режиме профилактического применения, нанопрепарат САНЧ с генистеином в дозе 150 мг/кг и 500 мг/кг вводили внутрибрюшинно за 24 ч, 1 ч до радиационного воздействия, а также путем двух последовательных инъекций - первое введение за 24 ч,

* Биолигические испытания с нанопрепаратом САНЧ с генистеином выполнены на кафедре военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург на белых беспородных мышах разводки питомника РАМН «Рапполово».

второе - за 1 ч до острого облучения в дозе 7.5 Гр. Животным контрольной группы вводили в равном объеме физиологический раствор.

Таблица 4. Влияние использования нанопрепарата САНЧ с генистеином при профнлакпгческом применении в дозах 150 мг/кг п 500 мг/кг на выживаемость и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышеП.

Условия эксперимента Доза 1 50 мг/кг Доза 500 мг/кг

Выживаемость, % СПЖ, сут Выживаемость, % СПЖ, сут

Контроль 30 13 30 12

-24 ч 10 10 70 17

-24 ч; -1 ч 60 12 70 14

-1 ч 80 16 60 18

Данные в табл. 4 показали, что введение нанопрепарата в дозе 150 мг/кг за 24 ч до радиационного воздействия в дозе 7.5 Гр ощутимо не влияло на увеличение показателей выживаемости облученных животных, наоборот, эти показатели были даже хуже, чем у животных в группе контроля. Наблюдалась некоторая тенденция к увеличению выживаемости защищенных животных нанопрепаратом при его курсовом применении. Профилактическое введение нанопрепарата в дозе 150 мг/кг за 1 ч до лучевой нагрузки было наиболее эффективным, при этом выживаемость облученных животных на фоне введения им препарата способствовало значимому увеличению выживаемости на 50% по сравнению с контролями. В то время как в дозе 500 мг/кг, введение нанопрепарата по различным схемам было в равной степени эффективно. Профилактическое введение генистеина при курсовом приеме препарата, а также за 24 ч или 1 ч до радиационного воздействия в дозе 7,5 Гр способствовало увеличению выживаемости облученных животных на 40%, 40% и 30%, соответственно.

Кроме того, было изучено влияние профилактического применения препарата на среднюю продолжительность жизни (СПЖ) облученных животных. Данные, представленные в табл. 5, также показывают, что в дозе 150 мг/кг профилактическое курсовое применение препарата, а также его введение за 24 ч до острого рентгеновского облучения в дозе 7,5 Гр ощутимо не влияло на изменение СПЖ защищенных препаратом животных по сравнению с контролем. Однако, введение генистеина за 1 ч до облучения обеспечивало увеличение СПЖ животных почти на трое суток. В дозе 500 мг/кг введение нанопрепарата за 24 ч или за 1 ч до рентгеновского облучения в дозе 7,5 Гр привело значимому увеличению СПЖ мышей на 5 и 6 суток соответственно. При использовании генистеина в схеме курсового приема была отмечена только тенденция к увеличению исследуемого показателя, величина которого значимо не отличалась от контроля.

Опенка радиозащитной эффективности нанопрепарата САНЧ с генистеином при терапевтическом применении

Для изучения радиозащитной эффективности САНЧ с генистеином в режиме терапевтического применения препарата, нанопрепарат в дозе 150 мг/кг и 500 мг/кг вводили внутрибрюшинно через 1 ч или 4 ч после острого облучения в дозе 7,5 Гр. Срок введения препарата был обусловлен тем, что доврачебная помощь при радиационных поражениях должна оказываться в течение 1 ч, а первая врачебная помощь - в течение 4-6 ч. Кроме того, показано, что синтетические и природные антиоксиданты обладают наиболее выраженным радиозащитным эффектом при их применении не ранее чем через 4 ч после острого лучевого воздействия в поражающих дозах.

Таблица 5. Влияние использования нанопрепарата САНЧ с генистеином при терапевтическом применении в дозах 150 мг/кг и 500 мг/кг на выживаемость и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей.

Условия эксперимента Доза 150 мг/кг Доза 500 мг/кг

Выживаемость, % СПЖ, сут Выживаемость, % СПЖ, сут

Контроль 30 12 20 12

-1ч 40 12 30 12

-4ч 60 11 30 11

Полученные данные представленные в табл. 5, показали, что в дозе 150 мг/кг введение нанопрепарата через 1 ч или 4 ч после облучения в дозе 7,5 Гр способствовало повышению выживаемости облученных животных на 10% и 30%, соответственно, по сравнению с контролем. Однако, значимых отличий между исследуемыми показателями в опытной и контрольной группе обнаружено не было. В то время как в дозе 500 мг/кг показатели выживаемости защищенных препаратом облученных животных значимо не отличались от контроля. Значение СПЖ для облученных животных на фоне введения им нанопрепарата в обеих дозах (150 мг/кг и 500мг/кг) также не проявили отличие в сравнении с контрольной групой. Таким образом, в результате проведенного исследования по изучению радиозащитной эффективности нанопрепарата при терапевтическом применении было показано, что нанопрепарат в данной схеме применения обладает низкой радиозащитной активностью во всем диапазоне изученных доз.

Оценка радиозащитной эффективности нанопрепарата САНЧ с генистеином я отношении выживаемости животных при различных дозах радиационного воздействия

Для изучения радиозащитной эффективности нанопрепарата САНЧ с генистеином в отношении выживаемости животных при различных дозах радиационного воздействия, выбирали дозы облучения 6,5; 7.5 или 8,5 Гр. Нанорепарат вводили профилактически в дозе

150 мг/кг за 24 ч, 1 ч до радиационного воздействия, а также путем двух последовательных инъекций - первое введение за 24 ч, второе - за 1 ч до радиационного воздействия. Наблюдение за животными осуществлялось в течение 15 суток.

Таблица 6. Влияние профилактического применения нанопрепарата САНЧ, содержащих генистеин, в различные сроки до облучения на 15-сут выживаемость белых беспородных мышей-самцов, подвергнутых острому рентгеновскому облучению.

Условия Доза облучения, Количество выживших Выживаемость, СПЖ, сут

эксперимента Гр животных / общее количество животных в группе %

6,5 5/10 50 11

Контроль 7,5 4/12 30 10

8,5 3/15 20 II

6,5 6/10 60 12

-24 ч 7,5 4/12 20 10

8,5 3/15 20 11

6,5 6/10 60 11

-24 ч; -1 ч 7,5 5/12 42 10

8,5 6/15 40 10

6,5 7/10 70 12

-1 ч 7,5 7/12 58 13

8,5 5/15 33 11

Данные в табл. б указывают на то, что наибольшим радиозащитным эффектом по критерию выживаемости обладает генистеин. введенный за 1 ч до радиационного воздействия во всем диапазоне изученных доз. При этом выживаемость животных возрастала при облучении в дозе 6,5 Гр на 20 %, в дозе 7,5 Гр на 28%, а в дозе 8,5 Гр на 13%. Кроме того, показатели выживаемости животных на фоне введения генистеина по альтернативным схемам применения препарата в целом мало отличались от контроля. Показатели СПЖ также значимо не отличались от контроля во всех схемах введения препарата.

Оценки острой токсичности нанопрепарата САНЧ. загруженных генистеином

При оценке острой токсичности нанопрепарата использовали исходный раствор САНЧ с генистеином в концентрации 10%. Для получения необходимой дозы препарата данный раствор вводили в различных объемах, учитывая при этом вес каждого животного. Конечный сумарный объем введенных растворов САНЧ с генистеином не превышал 1 мл на особь. Нанопрепарат вводили в организм испытуемых животных, используя 4 пути введения: внутрибрюшинный, подкожный, пероральный и повторный внутрибрюшинный (вводили повторно в равных объемах с интервалом в 3 ч). Воздействие нанопрепарата на организм животных наблюдали в отсуствии радиационного воздействия в течение 14 сут. Заключение о токсическом воздействии нанопрепарата генистеина можно сделать по определению

показателей гибели, изменению массы и морфологическим характеристикам внутренних органов животных в экспериментальных группах.

Таблппа 7. Влияние внутрибрюшинного введения нанопрепарата на показатели гибели и массу тела лабораторных животных.

Доза САНЧ с генистеином, мг/кг Количество животных в группе, гол Число погибших животных через 14 сут, гол Летальность, % Изменение массы испытуемых особей во времени после введения нанопрепарата

После введения Через 7 сут. Через 14 сут.

Контроль 10 0 0 21,2 г± 0,2 21,7 г± 0,1 21,6 г± 0,3

200 10 0 0 21,5 г± 0,2 20,3 г ± 0,2 21,8 г ± 0,3

500 10 0 0 21,7 г ± 0,1 21,8 г ± 0,3 20,7 г ±0,3

1000 10 0 0 21,1 г ± 0,2 21,2 г ± 0,38 19,8 г ±0,4

3000 10 0 0 21,5 г ± 0,2 21,7 г ± 0,3 19,2 г ± 0,4

5000 10 0 0 21,8 г ± 0,3 21,3 г± 0,3 20,4 г ± 0,4

Данные в табл. 7 отражают влияние нанопрепарата на показатели гибели и изменение массы тела испытуемых животных при внутрибрюшинном пути введения. Из этих данных видно, что при внутрибрюшинном введении САНЧ, загруженных генистеином, гибели среди животных экспериментальных групп и значимых отличий их массы тела по сравнению с контрольной группой (без введения нанопрепарата) во всем диапазоне изученных доз обнаружено не было. Кроме того, проведенное макроскопическое исследование выживших животных на 14 сутки исследования не выявило достоверных различий по сравнению со здоровыми животными. Морфологические изменения или метаморфозы внутренних органов животных в экспериментальных группах после введения нанопрепарата не проявлены.

Проверка токсической способности нанопрепарата САНЧ с генистеином при других путях введения (подкожный, пероральный и повторный внутрибрюшинный) также показала аналогичные результаты, как и в случае с внутрибрюшинным введением. Таким образом, в результате проведенного исследования по оценке токсичности САНЧ, загруженных генистеином при различных путях введения препарата, было установлено, что введение нанопрепарата животным не вызывает их гибели и не изменяет поведения и массы тела в течение 14 суток периода наблюдения. Кроме того, не было обнаружено морфологических изменений внутренних органов у животных на фоне введения им нанопрепарата .

4. Получение н изучение характеристик наподпсперсии САНЧ, загруженных протнвоэпилептпческим препаратом карбамазепином

Карбамазепин (рис. 16) - противоэпилептическое лекарственное средство из группы производных карбоксамида. Данный препарат является гидрофобным веществом и практически не растворяет в воде. В основном используется в качестве противосудорожного

20

препарата при больших судорожных припадках (тонико-клонических эпилептических приступах) и при фокальной психомоторной эпилепсии. Большинство препаратов карбамазепина. используемых в лечении, представлены в таблетированнной форме и используются для перорального введения. Данные лекарственные формы препарата, наряду с фармацевтической эффективностью, также оказывают нежелательные побочные эффекты. Исследование и разработка новых лекарственных форм на основе карбамазепина являются актуальной задачей для окончательного преодоления неблагоприятных воздействий, уменьшения используемой дозы препарата, а также повышения фармакологической эффективности и растворимости. В настоящей работе предложен способ получения наноформы карбамазепина в комбинации с САНЧ, а также проведены предварительные исследования физико-химических характеристик данной нанодисперсии.

Нанодисперсии САНЧ с карбамазепином были получены стандартным способом при диспергировании растворов: карбамазепина в ТГФ, СТБ в ТГФ, CHS в ТГФ, фосфатного буфера (10 мМ, рН 7,5). Возможность загрузки САНЧ с карбамазепином была оценена при различных концентрациях действующего вещества в САНЧ.

Размер САНЧ, модифицированных карбамазепином, определяли методом динамического светорассеяния. Нанодисперсии САНЧ с карбамазепином были приготовлены с концентрациями лекарства 5%, 10%, 15% и 2% CHS в качестве добавки для стабилизации. Концентрации карбамазепина и CHS в нанодисперсиях рассчитаны по отношению к содержанию СТБ. Из результатов в табл. 8 видно, что размеры САНЧ, загруженных карбамазепином с содержанием субстанции от 5 до 10%, находятся в допустимом пределе, а САНЧ, загруженные карбамазепином с концентрацией 15%, имеют большой размер и не соответствуют целям исследования. Размер САНЧ, содержащих карбамазепин, увеличивался с увеличением концентрации загруженной субстанции. Кроме того, для оценки влияния использования добавки CHS на размер частиц, также сравнивали размер наночастиц САНЧ, содержащих 5 % карпамазепина в двух различных дисперсиях: с использованием 2% CHS и без его использования. Данные в табл. 8 также показали, что при одной и той же концентрации препарата, добавление CHS приводило к значительному уменьшению размера частиц (157нм ) по сравнению с образцом, не содержащим CHS (253нм).

Рис. 16. Структура карбамазепина

Таблица 8. Средний размер частиц САНЧ . загруженных карбамазеинном (КБЗ) с различными концентрациями лекарства.

Нанодисперсии Размер частиц, нм

САНЧ без КБЗ и CHS 193

САНЧ без КБЗ + 2% CHS 143

САНЧ+ 5% КБЗ и без CHS 253

САНЧ + 5% КБЗ + 2% CHS 157

САНЧ + 10% КБЗ + 2 % CHS 184

САНЧ + 15% КБЗ + 2% CHS 3281

Морфология наночастиц САНЧ с различными концентрациями карбамазепина представлена на электронных микрофотографий на рис.1 7.

а б в

Рис. 17. Электронные микрофотографии дисперсий наночастиц САНЧ с различными концентрацями карбамазепина: а - САНЧ без КБЗ + 2% CHS; б - САНЧ, загруженные 5% КБЗ + 2% CHS; в - САНЧ. загруженные 10% КБЗ + 2% CHS.

Оценка возможности загрузки САНЧ с карбамазепином была проведена с помощью УФ-спектроскопии, регистрируя карбамазепин в полученных дисперсиях САНЧ. Результат на рис. 18 подтверждается наличием карбамазепина с различными концентрациями в дисперсиях САНЧ. исходя из спектров поглощения вещества при длине волны 285 нм.

260 НО 500 т МО 360 530 -Ш

Длина волны,нм

Рис. 18. УФ спектры поглощения карбамазепнна в наноднсперспях САНЧ: нанодисперсия САНЧ, содержащая 5% КБЗ (/), нанодисперсия САНЧ, содержащая 10 % КБЗ (2), нанодисперсия САНЧ, содержащая 15 % КБЗ (3).

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и получены новые нанодиепереии на основе комбинации САНЧ и лекарственных препаратов: синтетических сенсибилизаторов л<гз»-арилпорфиринов, радиозащитного вещества генистеина и субстанции противоэпилептического карбамазепнна. Показано, что использование холестерил гемисукцината (CHS) в качестве стабилизирующей добавки приводит к уменьшению размера частиц и повышению их

i стабильности за счет увеличения дзета-потенциала.

2. САНЧ эффективно включают синтетические сенсибилизаторы .иези-арилпорфирины с концентрацией действующих веществ до 10%. Полученные наночастицы стабильны, водорастворимы, обладают размерами в диапазоне 100 - 300 нм. Добавление холестерил гемисукцината (CHS) повышает стабильность нанодисперсий и увеличивает загрузку порфиринов в наночастицы. Была показана эффективность включения серии порфиринов в САНЧ. Полученные результаты позволяют использовать данные наночастицы в качестве сред для солюбилизации производных порфиринов и создания препаратов для применения в фотодинамической терапии.

3. Показано, что САНЧ эффективно включают радиозащитное вещество генистеин с концентрацией до 10% (вес. по отношению к СТБ). Полученный нанопрепарат САНЧ с генистеином обладает радиозащитной эффективностью, проявляющейся в повышении выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей. Наиболее выраженный радиозащитный эффект регистрировался при профилактическом применении нанопрепарата за 1 ч до воздействия острого внешнего рентгеновского облучения. Нанопрепарат САНЧ с генистеином не проявляет токсичности. Выявленная в данном исследовании радиозащитная активность нанопрепарата САНЧ с генистеином позволяет рекомендовать данный препарат в качестве средства профилактики радиационных поражений и свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения генистеина для

разработки новых комбинированных схем профилактики и ранней патогенетической терапии острой лучевой болезни.

4. САНЧ обеспечивают эффективное включение противоэпилептического препарата карбамазепина с концентрацией до 10% (вес. по отношению к СТБ). Полученные наночастицы стабильны, обладают размерами в диапазоне 100 - 200 нм. Использование CHS в качестве стабилизатора также приводит к увеличению стабильности нанодисперсии и уменьшению размера частиц. Полученные данные по физико-химическим характеристикам САНЧ, сожержащих карбамазепин, являются основанием для проведения дальнейших биологических испытаний, а также оценки возможности использования нанодисперсии в качестве средства для лечения эпилепсии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах

1. Н.Х. Куанг (Нгусн Хонг Куанг), В.В. Чупин, Д.И. Прохоров, К.А. Жданова, В.И. Швец. Липосомальные системы доставки биологически активных соединений в лечении некоторых заболеваний // Вестник МИТХТ. 2014. Т. 9. № 6. С. 26-41.

2. X.K. Нгуеи, К.А Жданова, B.C. Уварова, H.A. Брагина, А.Ф. Миронов, В.В. Чупин, В.И. Швец. Создание и изучение наночастиц на основе смеси тритерпеноидов бересты и амфифильных мезо-арилпорфиринов // Биоограническая химия. 2015. Т. 41. № 2. С. 185194.

3. X.K. Нгуеи, В В. Чупин, Д.И. Прохоров, И.Е. Чикунов, В.Ю. Ковтун, P.A. Тарумов, А.Н. Гребенюк, В.И. Швец. Создание и изучение наночастиц на основе смеси тритерпеноидов бересты и радиозащитного вещества генистеина // Доклады Академии Наук (принята в печать).

Тезисы докладов международных конференции

1. Нгуен X.K, Жданова К.А. Наночастицы тритерпеноидов, сенсибилизированные амфифильными мезо-арилпорфиринами, как потенциальные агенты для ФДТ // Сборник материалов VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективны развития». Москва, 19-22 марта 2013. Т. 1. С. 104 - 105.

2. Д.И. Прохоров, Н.Х. Куанг (Нгуен Хонг Куанг), И.Г. Капица, Д.А. Абаимов, Т.А. Воронина, В.В. Чупин. Разработка и исследование фармакологических свойств водорастворимой лекарственной формы карбамазепина па основе третерпеноидов бересты // Сборник материалов V Международная начно практическая конференция «Актуальные проблемы биологии; нанотехнологий и медицины». Ростов. 3-5 октября 2013. С. 354-355.

3. К.А. Жданова, X.K. Нгуен, B.C. Уварова, H.A. Брагина, В.В. Чупин, В.И. Швец, А.Ф. Миронов. Изучение наночастиц тритерпеноидов бересты, сенсибилизированных амфифильными порфиринами // Сборник трудов VI Троицкой конференции «Медицинская

24

физика и инновации в медицине» (ТМКФ-6). Г. Троицк, г. Москва. 2-6 июня 2014 г. С. 276-277.

4. А.Н. Гребешок, В.А. Башарип, P.A. Тарумов, В.Ю. Ковтун, И.Е. Чикунов, Х.К. Нгуен, В.И. Швец, В.В. Чупин. Предварительные результаты экспериментальной оценки радпозащитной эффективности наноформы синтетического генистеина // VII Съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): тезисы докладов. Москва, 21-24 октября 2014 г.- Москва: РУДН, 2014. -456 с.

Подписано в печать 21.04.2015

Заказ № 270 Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. Типография ООО «Генезис» 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86 8(495)434-83-55