Клеточные механизмы коррекции цитотоксических полиорганных повреждений тритерпеноидами класса лупана - бетулоновой кислотой и ее производными

Сорокина, Ирина Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточные механизмы коррекции цитотоксических полиорганных повреждений тритерпеноидами класса лупана - бетулоновой кислотой и ее производными
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные механизмы коррекции цитотоксических полиорганных повреждений тритерпеноидами класса лупана - бетулоновой кислотой и ее производными"

/О-СЛ^Д/ А"-."

На правах рукописи

Сорокина Ирина Васильевна

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ КОРРЕКЦИИ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ПОЛИОРГАННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ТРИТЕРПЕНОИДАМИ КЛАССА ЛУПАНА -БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТОЙ И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫМИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2010

1» - О

652

Работа выполнена в Новосибирском институте органической химии им. Н.Н.Ворожцова СО РАН и Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск)

Научные консультанты:

доктор биологических наук,

профессор ТолстиковаТатьянаГенриховна

доктор биологических наук,

профессор Лушникова Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор биологических наук,

профессор Ляхович Вячеслав Валентинович

доктор биологических наук,

профессор Айдагулова Светлана Владимировна

доктор биологических наук,

профессор Плотников Марк Борисович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава

Защита диссертации состоится «_»_2010 г. в

_час. на заседании диссертационного совета Д 001.03 7.01 в НИИ

региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

Автореферат диссертации разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.037.01

доктор биологических наук Молодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Совершенствование схем полихимиотерапии злокачественных опухолей является одной из актуальных проблем практической онкологии. Наряду с разработкой препаратов, обладающих высокой цитостатической активностью, в последнее время также развивается направление, связанное с поиском агентов — модификаторов биологических реакций, повышающих переносимость традиционной противоопухолевой терапии (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Трещалина Е.М., 2005 ; Pucheault M., 2008). Основными требованиями к агенту-кандидату являются низкая токсичность, отсутствие стимулирующего влияние на опухоль и ее метастазы, усиление противоопухолевого иммунитета, повышение морфофункционального статуса здоровых клеток и тканей.

Большинство применяемых в клинической практике препаратов-модификаторов является иммуномодуляторами белковой природы: БСЖ, препараты тимуса (Т-активин, тималин), полипептиды (бестатин, циклоспорин А), цитокины и факторы роста, стимуляторы гемопоэза (колониестимулирующие факторы) и др. Побочными эффектами данных биогенных стимуляторов являются нежелательные иммунологические реакции (выработка нейтрализующих антител, сенсибилизация), а также способность стимулировать в определенных условиях рост первичного узла или метастазов опухоли (Трещалина Е.М., 2005; Корман Д.Б., 2006). Этих недостатков лишены препараты растительного происхождения, обладающие противоопухолевыми и антиметастатическими свойствами. В лечении злокачественных новообразований показана высокая эффективность экстрактов шлемника байкальского, элеутерококка, подорожника, побегов и листьев облепихи и др. (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Амосова Е.Н. и др., 2003). Поскольку растительные соединения обычно обладают комплексной активностью (гепатопротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и иммуномодулирующей) и лучше переносятся организмом, то они остаются в фокусе внимания при отборе корректоров химиотерапии.

соединений является сочетание цитотоксического действия на опухолевые клетки и низкой токсичности в отношении нетрансформированных клеток (Eiznhamer D.А., Ze-Qi Hu, 2004; Chaturvedy P.K. et al., 2008). В настоящее время бетулиновая кислота проходит клинические испытания за рубежом в качестве препарата для профилактики и лечения меланомы и дисплас-тического невуса (Fulda S. et al., 2009). Синтетические трансформации тритерпеноидов лупанового ряда рассматриваются как современный и перспективный подход к получению нового поколения препаратов с противоопухолевыми и химиопревентивными свойствами (Baglin I. et al., 2003; Cichewicz R.H., Kouzi S.A., 2004).

Другой многообещающей лупановой платформой можно считать бе-тулоновую кислоту (БК), получаемую путем одностадийного окисления бетулина. Несмотря на то, что БК является близким структурным аналогом бетулиновой, ее синтетические превращения и фармакологические свойства, в отличие от последней, до сих пор широко не изучены. По имеющимся данным, полученным на культурах опухолевых клеток человека (миеломы, лимфомы, карциномы молочной железы и яичника и др.), цитотоксическая активность БК в 2 -19 раз выше, чем у бетулиновой (Jle Банг Шон и др., 2004; Шинтяпина Ф.Б. и др., 2008).

Результаты исследований, проведенных за последние 10 лет, выявили молекулярные мишени тритерпеноидных соединений в клетке, что позволило обосновать политаргетный механизм их действия. Показано, что взаимодействуя с белком КЕАР1, тритерпеноиды активируют гены сигнального пути Nrf2, кодирующие семейство цитопротекторных белков, включая ферменты синтеза глутатиона, хинонредуктазу, катал азу, супероксиддисмутазу, гемоксигеназу, тиоредоксин, а также подавляют индукцию ЦОГ2 и NO-синтазы (Liby К.Т. et al., 2007; Chaturvedy P.K. et al., 2008). Противовоспалительная активность агентов также связана с ингибированием белков сигнального путиОТкВ, регулирующего процессы воспаления, апоптоза и дифференцировки (Shishodia S. et al., 2006; Fulda S. et al., 2009).

Противоопухолевое действие тритерпеноидов может реализовываться через индукцию ими внутреннего митохондриального пути апоптоза, не зависящего от внешнего, связанного с экспрессией р53 и CD95/FasL, что характерно для большинства противоопухолевых препаратов (Zarec J. et al., 2003; Eiznhamer D.A., Ze-Qi Hu, 2004). Последнее обстоятельство повышает интерес к тритерпеноидам, как агентам, способным преодолевать лекарственную устойчивость к традиционной химиотерапии. В доказательство этой способности в экспериментах на культурах опухолевых клеток был установлен синергический эффект бетулиновой кислоты с различными химиопрепаратами (доксорубицином, этопозидом, цисплатином, таксолом, актиномицином D), направленный на повышение апоптоза и подавление клоногенного окружения клеток опухоли (Fulda S. et al., 2005). Бетулиновая кислота также усиливает цитотоксический эф-

фект винкристина на клетки меланомы (SawadaN. et al., 2005), повышает апоптотическую активность индуктора внешнего пути апоптоза TRAIL (Fulda S. et al., 2004).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что лупановые соединения могут потенциально являться эффективными средствами дополнительной противоопухолевой терапии. Однако до настоящего времени интересы исследователей фокусировались в основном на изучении противоопухолевой активности тритерпеноидов, в то время как их свойства как модификаторов биологических эффектов цитостатической химиотерапии оставались за рамками внимания. В частности, практически не исследовано протекторное действие лупанов в тканях животных на фоне цито-токсических полиорганных эффектов традиционных противоопухолевых препаратов. Отчасти это связано с тем, что основные результаты были получены в экспериментах на культурах клеток, в то время как системных исследований in vivo не проводилось.

Таким образом, актуальность изучения лупановых тритерпеноидов в качестве потенциальных модификаторов цитостатической химиотерапии не вызывает сомнений. Решение данной проблемы связано, прежде всего, с исследованием не изученных ранее клеточных механизмов протекторного действия тритерпеноидов в условиях полиорганных цитотоксических эффектов как индивидуальных противоопухолевых препаратов, так и комбинированных схем полихимиотерапии.

Цель исследования - выявить среди тритерпеноидов ряда лупана соединения с комплексной протекторной и противоопухолевой активностью и изучить клеточные механизмы коррекции цитотоксических повреждений разных тканей при комбинированном и изолированном введении противоопухолевых препаратов, исследовать влияние лупановых тритерпеноидов на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитоста-тический полихимиотерапии.

Задачи исследования:

1. Провести широкий скрининг фармакологических свойств соединений ряда лупана и выявить среди них агенты с гепатопротекторной, кардиопротекторной, нефропротекторной, антиоксидантной и противовоспалительной активностью. Изучить противоопухолевую активность и антиметастатический эффект лупановых тритерпеноидов.

2. Изучить особенности морфологических изменений печени и миокарда при изолированном применении бетулоновой кислоты и ее производных и при их сочетаниях с цитостатиками (циклофосфамидом и доксорубицином).

3. Изучить особенности внутриклеточной реорганизации гепатоцитов и кардиомиоцитов при изолированном применении бетулоновой кислоты и ее производных и при их сочетаниях с цитостатиками (циклофосфамидом и доксорубицином) с оценкой цитопротекгорных и цитотоксических свойств исследуемых агентов.

4. Изучить особенности коррекции бетулоновой кислотой и ее производными токсических эффектов полихимиотерапии CHOP у интактных животных.

5. Изучить влияние отобранных соединений на морфологию и лейкоцитарный профиль периферической крови, клеточный состав костного мозга, уровень перекисного окисления липидов в условиях полихимиотерапии у животных с перевиваемыми опухолями.

6. Установить характер морфологических изменений печени и почек в условиях комбинированного воздействия цитостатической полихимиотерапии и лу Пановых тритерпеноидов.

7. Оценить влияние различных лупановых тритерпеноидов на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатической полихимиотерапии CHOP у мышей с перевиваемыми опухолями - карциномой легких Льюис и злокачественной лимфомой RLS, резистентной к циклофосфамиду.

Научная новизна. Впервые в результате комплексного морфологического исследования изучен характер модифицирующего влияния бетулоновой кислоты и ее производных на действие цитостатических препаратов в различных тканях интактных животных и у животных с перевиваемыми опухолями. Впервые выявлены политаргетные свойства лупановых соединений - цитотоксические (противоопухолевые) и ци-топротекторные. Впервые проведено комплексное исследование in vivo широкого спектра фармакологической активности тритерпеноидов лупано-вого типа (антиоксидантной, противовоспалительной, цитопротекгорной, противоопухолевой).

Впервые установлены особенности ремоделирования печени, сердца и почек, отражающие коррекцию тритерпеноидами повреждений, вызванных противоопухолевыми препаратами. Показано, что применение тритерпеноидов после моделирования противоопухолевой химиотерапии способствует снижению выраженности дистрофических и некробиоти-ческих изменений паренхиматозных клеток без значимого влияния на цитостатические свойства противоопухолевых препаратов.

Впервые выявлены особенности ультраструктурной перестройки основных внутриклеточных компартментов гепатоцитов и кардиомиоцитов под действием цитостатиков и тритерпеноидов. Показано, что бетуло-новая кислота и ее ß-аланиламид при изолированном введении интакт-ным животным оказывают одновременно умеренное цитотоксическое и стимулирующее действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусоидов, клетки Купфера) и миокарда (кардиомиоциты, эндотелиоциты). Впервые исследованы общецитологические особенности цитопротекторных и цитотоксических эффектов бетулоновой кислоты и ее ß-аланиламида, представлены их ультраструктурные эквиваленты.

Впервые показано, что бетулоновая кислота и ее ß-аланиламид, вводимые на фоне цитостатиков (циклофосфамида и доксорубицина), проявляют

политаргетное действие на клеточные популяции печени и миокарда, потенцируя цитотоксическое действие цитостатиков в отношении одних клеток и стимулируя регенераторные реакции - в других. Восстановление ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов при комбинированном применении цитостатиков и тритерпеноидов происходит быстрее. Установлено, что оба тритерпеноида не ингибируют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов.

Впервые показано, что бетулоновая кислота и ее производные снижают интенсивность перекисного окисления и повышают противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии и животных с перевитыми опухолями. Установлено, что (3-аланиламид бетулоновой кислоты и его метиловый эфир повышают антиметастатическую эффективность полихимиотерапии.

Получены доказательства иммуномодулирующей и противовоспалительной активности аланиламидов бетулоновой кислоты, лежащей в основе их системных эффектов и клеточных механизмов коррекции цито-токсического воздействия. В результате широкого скрининга соединений лупанового типа выявлены новые перспективные агенты с антиоксидант-ной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.

Теоретическая и практическая значимость. Впервые получены фундаментальные знания о фармакологической активности нового класса корректоров токсических эффектов цитостатической химиотерапии. Выявлены закономерности тканевой и внутриклеточной реорганизации печени, почек, сердца и тимуса в условиях комбинированного и изолированного действия цитостатических противоопухолевых препаратов и тритерпеноидов лупанового типа.

Показана высокая перспективность бетулоновой кислоты как новой тритерпеноидной платформы для получения агентов с широким спектром фармакологической активности. На основании результатов исследования 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота рекомендована для доклинических испытаний в качестве препарата-модификатора цитостатической полихимиотерапии. Результаты исследования и методические подходы, разработанные в диссертации, могут быть использованы при подготовке материалов доклинических испытаний и в клинической практике при обосновании схем полихимиотерапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Тритерпеноиды лупанового ряда - новый класс модификаторов биологических реакций, оказывающих антиоксидантное, противовоспалительное и цитопротекторное действие при токсическом и лекарственном поражении. Аланиламидные производные бетулоновой кислоты в условиях цитостатической гемодепрессии модулируют содержание нейтрофилов и мононуклеаров в периферической крови.

2. К общецитологическим цитопротекторным свойствам бетулоновой кислоты и ее (3-аланиламида как при изолированном, так и комби-

нированным с цитостатиками применении относится их способность усиливать эндоцитозную (пиноцитозную) активность клеток и стимулировать в них процессы внутриклеточной регенерации. Оба агента не подавляют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов.

3. К общецитологическим цитотоксическим свойствам обоих три-терпеноидов относится их способность вызывать умеренные литические изменения цитоплазматического матрикса, деструктивные изменения органелл и усиление аутофагических процессов. При комбинированном применении с цитостатиками бетулоновая кислота и ее производные способствуют более быстрому восстановлению ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов, уменьшают степень выраженности дистрофических изменений эпителиоцитов почечных канальцев.

4. Введение БК и ее производных мьпнам-опухоленосителям понижает интенсивность перекисного окисления липидов и не снижает противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии CHOP. В то же время бетулоновая кислота и ее ß-аланиламид уменьшают выраженность дистрофических и некробиотических изменений гепатоцитов, обусловленных неопластическим процессом и полихимиотерапией.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на 2-м съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), XII Международной конференции «Медицина XXI века» (Словакия, Низкие Татры, 2004), Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов, 2004), Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 2004), Научно-практической конференции с международным участием «Медицина и образование в XXI веке» (Новосибирск, 2004), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально значимых заболеваниях» (Новосибирск, 2004), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), Научной конференции «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005), III Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), III International Conference «Basic Science for Medicine» (Novosibirsk, 2007), III Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), II Международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Казахстан, Алматы, 2007), EHRLICH II, 2nd World Conference on Magic Bullets (Nürnberg, Germany, 2008), 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current issue of natural products chemistry and biotechnology» (Novosibirsk, 2010), ученом совете в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 64 работы, из них

19 - в рецензируемых журналах по списку ВАК, получены 7 патентов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 232 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4 глав с результатами и обсуждением собственных исследований, выводов; иллюстрирована 35 таблицами, 56 микрофотографиями. Список использованной литературы включает 348 работ отечественных и иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследуемыми соединениями были впервые синтезированные 44 тритерпеноида ряда лупана, в том числе 4 - производные бетулина, 2 - лупеола и 38 - бетулоновой кислоты (БК). Соединения были получены из нескольких научно-исследовательских институтов Сибирского и Уральского отделений РАН. Все агенты вводили животным в виде взвеси в воде с Твином-80, готовившейся непосредственно перед экспериментом.

Эксперименты проводили на беспородных мышах (1844 особей) и крысах линии Вистар обоего пола (360 особей), а также мышах-самцах CBA/Lac (300 особей) и самках С57В1/6 (460 особей) (табл. 1), полученных из лаборатории разведения лабораторных животных Института цитологии и генетики СО РАН.

Во время опытов животных содержали в условиях естественного освещения, они получали гранулированный корм ПК 120-1 (Лабораторснаб, Москва) и воду ad libitum. Все манипуляции выполняли в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Животных выводили из опыта декапитацией под легким эфирным наркозом.

Экспериментальные модели и скрининг гепатопротекторных, антиоксидантных, противовоспалительных и противоопухолевых свойств. При скрининге синтезированных соединений использовали модели и схемы введения, рекомендованные для проведения доклинических исследований (Хабриев Р.У., 2005).

Модель СС14-индуиированного поражения печени. Беспородным мышам однократно вводили в желудок 25% раствор СС14 в подсолнечном масле. Испытуемые соединения вводили однократно внутрижелу-дочно в виде водно-твиновой взвеси в дозах 20, 50 или 100 мг/кг за 1 ч до токсического воздействия. В качестве референсного соединения использовали известный антиоксидант дигидрокверцетин [(2R,3R)-3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон] (99% чистоты), который вводили в желудок в эффективной дозе 100 мг/кг. Контрольные животные получали водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме. Гепатопротектор-ные свойства оценивали через сутки по снижению в сыворотке крови

Этапы и цели исследования Вид животных Количество животных

Скрининг антиоксидантной, гепатопротекторной, противовоспалительной и противоопухолевой активности лупановых соединений Мыши: беспородные CBA/Lac C57BL/6 1844 140 220

Исследование клеточных механизмов действия производных бетулоновой кислоты в различных тканях на фоне изолированного и комбинированного введения противоопухолевых препаратов интактным животным Крысы Вистар 360

Оценка корректорного действия тритерпеноидов и их влияния на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемыми опухолями Мыши: CBA/Lac C57BL/6 160 240

активности трансаминаз (AJIT и ACT) и щелочной фосфатазы (ЩФ) с использованием стандартных наборов реактивов («Biocon», «Olvex Diagnosticum»). Антиоксидантный эффект определяли у этих же животных по уменьшению в крови концентрации ТБК-акгивных соединений (ТБКАС), согласно общепринятой методике (Камышников B.C., 2000).

Модели индуцированного воспаления. Воспалительный отек вызывали у мышей введением в апоневроз задней лапы водного раствора флогогена (1,5% каррагенина или 0,1% гистамина) в объеме 0,05 мл. Тестируемые соединения вводили внутрижелудочно в виде водно-твиновой взвеси за 1 ч до введения флогогена. Референсным препаратом была субстанция индометацина («Fluka») в дозе 20 мг/кг. Контрольным животным вводили эквивалентное количество воды с твином. Через 5 ч после введения флогогена животных умерщвляли путем кранио-цервикальной дислокации и определяли массу обеих задних лап ниже голеностопного сустава с отеком и без него. Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению индекса отека у животных опытных групп по сравнению с контролем. Индексы воспаления рассчитывали как отношение разности здоровой и воспаленной лапы к массе здоровой, выраженной в процентах.

Модель экспериментальной полихимиотерапии. Применяли классическую схему CHOP, адаптированную для лабораторных животных (Каледин В.И. и др., 2000; Грек O.P. и др., 2002). Однократно парентерально вводили комплекс цитостатических препаратов в дозах, составляющих 1/5 от ЛД50 соответственно для мышей и крыс: циклофосфан (ЦФ) («Биохимик», Саранск) - 50 и 21 мг/кг; доксорубицин (ДОК) - (« ЛЭНС-Фарм», Москва) - 4,0 и 2,1 мг/кг; винкристин («Гидеон Рихтер», Венгрия) - 0,1 и 0,04 мг/кг;

преднизолон («Гидеон Рихтер», Венгрия) - 5,0 и 2,1 мг/кг. Контрольным животным вводили эквивалентное количество физиологического раствора.

Методы перевивки и характеристика опухолевых штаммов. Для перевивки использовали штаммы опухолей с разной степенью злокачественности и чувствительности к ЦФ. Весь перевивочный материал был получен из банка опухолей лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН. Использовали следующие штаммы опухолей:

- карциному легких Льюис (LLC), возникающую спонтанно у мышей линии С57В1/6, растущую в виде солидного узла и метастазирующую гематогенно в легкие практически в 100% случаев (Софьина З.П., 1980). Перевивали внутримышечно в бедро задней лапы по 1 - 6х 106 опухолевых клеток в ОД мл физиологического раствора;

- лимфому LS - первично индуцированную у мышей CBA/Lac нитро-зометилмочевиной, растущую в виде солидного узла, склонную к спонтанной регрессии (Каледин И.И., 2002). Перевивали внутримышечно в бедро задней лапы по 1х 106 опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора;

- лимфому RLS - субштамм лимфомы LS, возникший у мышей СВА/ Lac в результате многочисленных пассажей на фоне введения повышающихся доз ЦФ. Характеризуется агрессивным течением и устойчивостью к циклофосфану, спонтанной регрессии не подвергается, метастазирует гематогенно в печень и почки. Перевивали внутримышечно в бедро задней лапы по 1х105 опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора;

- асцитную опухоль Эрлиха перевивали беспородным мышам внут-рибрюшинно по 0,2 мл асцита в разведении 1:10.

Лупановые тритерпеноиды вводили на разных стадиях развития опухоли: на фоне сформированного первичного узла или через 48 ч после перевивки. В первом случае применяли режимы однократного введения (внутрижелудочно - 500 мг/кг, внутрибрюшинно - 250 мг/кг) либо курсового (ежедневно по 50 мг/кг в течение 8 дней). Во втором случае использовали курсовой режим введения и референсный препарат циклофосфан в дозах 100 и 40 мг/кг внутрибрюшинно. Критерием противоопухолевого эффекта было уменьшение объемов опухоли по отношению к контролю, которые измеряли в период от начала ее визуализации до наступления массовой гибели животных в группе.

Исследование особенностей и механизмов политаргетного действия трнтерпенондов в условиях изолированного и комбинированного введения противоопухолевых препаратов интактным животным. Эксперименты проводили в трех независимых сериях. Цитотоксическое воздействие моделировали: 1) однократным парентеральным введением интактным крысам комбинации ЦФ, ДОК, винкристина и преднизолона по схеме CHOP; 2) однократным внутрибрюшинным введением ЦФ в дозе 125 мг/кг; 3) однократным внутрибрюшинным введением ДОК в

дозе 7 мг/кг. Дозы препаратов в двух последних сериях выбирали с учетом оптимальной выраженности основного побочного действия для каждого цитостатика (Гольдберг Е.Д. и др., 1999, 2000).

Тритерпеноидные соединения вводили внутрь через сутки после ци-тотоксического воздействия в дозе 50 мг/кг в течение 13 дней. Состояние животных исследовали по следующим показателям: динамике массы тела, картине периферической крови, лейкоцитарной формуле, , клеточному составу костного мозга, массе основных паренхиматозных органов. В каждой серии экспериментов с помощью светооптических методов проводили морфологическое исследование органов-мишеней, преимущественно поражаемых цитостатиками: для CHOP - печени, почек, тимуса; для ЦФ - печени, сердца; для ДОК - сердца, печени. Обследование животных проводили дважды: в период максимальной выраженности токсического эффекта цитостатиков (4 - 5-й дни после введения) и после окончания введения тритерпеноидов (14 — 15-й дни).

Оценка действия тритерпеноидов и их влияния на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатической полихимиотерапии животных с перевиваемымыми опухолями. Полихимиотерапию CHOP проводили у мышей с перевиваемыми опухолями LLC и RLS соответственно на 10-й и 5-й дни после перевивки. Изучаемые соединения вводили через сутки после цитостатиков внутрижелудочно в курсовом режиме в дозе 50 мг/кг в течение 8 дней. Референсной группе мышей проводили только полихимиотерпию. Контролем была группа животных с опухолью, которые получали внутрь водно-твиновую взвесь. В период введения агентов оценивали их влияние на рост опухоли путем измерения объема опухолевых узлов штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях. Противоопухолевый эффект определяли по величине индекса торможения роста опухоли (ТРО), который рассчитывали как отношение разности средних объемов опухолей в контрольной и опытной группах к ее среднему объему в контроле.

По окончании введения соединений у животных исследовали периферическую кровь с использованием проточного гемоанализатора («Медоник Оден», Швеция). В мазках крови, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали лейкоцитарную формулу. В сыворотке крови определяли активности трансаминаз (AJTT, ACT) и вторичные продукты окисления (ТБКАС). Для цитологического исследования брали костный мозг, для морфологического анализа и определения степени метастатического поражения брали образцы легких, печени и почек.

Методы морфологического исследования. Для светооптического исследования органы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, а затем подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе Микром («Zeiss», Германия). Для заливки в блоки использовали гистоп-ласт. Срезы толщиной 4-5 мкм готовили на ротационном микротоме той

же фирмы. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону и по методу PAS - гематоксилин - оранжевый G. Препараты исследовали в световых микроскопах Axioscop 2 plus и «Leica DM 4000В» (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровых фотокамер «Leica DFC 320» (Германия) и обрабатывали с помощью компьютерных программ «Leica QWin V3» и AxioVision.

Для электронно-микроскопического исследования брали образцы миокарда и печени размерами не более 1 мм3, которые первоначально фиксировали в 4% растворе параформальдегида, постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. После обезвоживания в серии спиртов возрастающей концентрации образцы печени заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие ( 1 мкм) и ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-III. Полутонкие срезы окрашивали 1% раствором азура II и толу-идиновым синим. Полутонкие срезы использовали для морфологического описания, морфометрического и стереологического анализа. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Исследование проводили в электронном микроскопе JEM-1400 (фирмы «Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Veleta и программного обеспечения ÍTEM (фирма «Olympus», Япония, Германия).

Тканевый стереологический анализ проводили с помощью сетки из 289 точек (Автандилов Г.Г., 1990). В печени подсчитывали объемную плотность (Vv) зон с дистрофическими и некротическими изменениями гепатоцитов, объемную плотность синусоидов и клеток с двумя ядрами. В почках определяли объемную плотность нефроцитов с дистрофическими и некротическими поражениями, объемную плотность интерстициальной ткани и просветов канальцев. Объемную плотность каждого структурного компонента в тканях определяли по формуле: Vv = Х/п, где X - количество точек, приходящееся на каждый структурный компонент, п - общее количество подсчитанных точек. Изменение объемной плотности в опытных группах выражали в процентах относительно контроля.

Для количественной оценки общей популяции кардиомиоцитов в сердце применяли метод щелочной диссоциации фиксированных тканей (Семенова JI.A. и др., 1985). Образцы миокарда помещали в 50% раствор КОН на 24 ч. Затем образцы Промывали в 3 - 4 сменах дистиллированной воды и в последней порции оставляли на 1 сут. В полученную суспензию добавляли по каплям 1% раствор азура-эозина и доводили объем до 8 мл. Подсчет числа клеток производили в камере Фукса-Розенталя. Кроме общей численности кардиомиоцитов в сердце, определяли количественное соотношение одно-, дву- и многоядерных (3 и более ядер) клеток. Оценку проводили также в камере Фукса-Розенталя, в десяти повторах, просчитывали не менее 500 клеток для каждого животного.

Оценка клеточного состава костного мозга. Приготовление мазка костного мозга для подсчета миелограмм проводили согласно реко-

мендациям (Гольдберг Е.Д. и др., 1992) с некоторыми модификациями. Костномозговой канал левой бедренной кости вскрывали со стороны эпифиза и 0,05 мл плазмы крови крыс осторожно ресуспендировали непосредственно в канале, переносили на обезжиренное стекло и делали мазок шлифованным стеклом. Окраску препаратов производили по Па-пенгейму (Наджимитдинов С.Т., 1969), подсчитывали в каждом случае 500 миелокариоцитов.

Подсчет метастатических поражений проводили путем морфомет-рического анализа срезов обеих долей легких у мышей с перевиваемой LLC, печени и почек у животных с RLS. Объемную плотность (Vv, %) метастазов подсчитывали по методу Г.Г.Автандилова (1990) с использованием окулярной сетки из 289 точек с помощью программы «ВидеоТест». Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (4M) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ): (Ак х Вк) - (А х В)

(Ак х Вк) *100%'

где Ак — частота метастазирования в контрольной группе, А - частота метастазирования в опытной группе, Вк - плотность метастазов у животных контрольной группы, В - плотность метастазов у животных опытной группы.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ «STATISTIKA 6,0». При оценке значимости различий применяли критерий Стьюдента, различия считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Скрининг гепатопротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и противоопухолевой активности

На модели СС14-индуцированного поражения печени и индуцированного воспалительного отека лапы протестированы 44 тритерпеновых соединения лупанового типа, в том числе 4 производных бетулина, 2 - лупеола и 38 - бетулоновой кислоты (БК). Среди них выявлены агенты со значимыми гепатопротекторным, антиоксидантным и противовоспалительным свойствами. В ряду производных, синтезированных из БК, установлено, что наиболее высоким антицитолитическим эффектом, не уступающим дигидрокверцетину, обладают ее производные с аминокислотными фрагментами в положении С28 (ß-алаБК, Of-19, Me-ß-алаБК, Ме-а-алаБК) (табл. 2).

Достоверный эффект продемонстрировали также секо-производные (0f-30, Of-31) и бетулоны с метиловым (Ме-БК), диоксииминовым (Of-

Таблица 2. Влияние тритерпеноидов на концентрацию маркеров цитолиза (АЛТ, ACT), холестаза (ЩФ) и пе-рекисного окисления липидов (ТБКАС) в сыворотке крови мышей с СС14 -индуцированным поражением печени

Шифр агента Химическое название агента Доза, мг/кг Биохимические показатели сыворотки крови (в % от контроля)

АЛТ ACT ЩФ ТБКАС

1 2 3 4 5 6 7

БК Бетулоновая кислота 100 44,5" 41,6" 109,3 69,1"

50 51,3 69,1 96,0 -

Ме-БК Метиловый эфир бетулоновой кислоты 50 60,4 102,5 87,2 97,1

а-алаБК 2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота 50 66,2 97 103,7 44,1*

Ме-а-алаБК Метиловый эфир 2-[3-оксо-20(29)-лу-пен-28-оиламино]-пропио-новой кислоты 50 55,3* 71,6 85,6 71,0*

Р-алаБК 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота 50 40,4* 63,9 112,8 92,6

Ме-р-алаБК Метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лу-пен-28-оиламино]-пропио-новой кислоты 50 49,7* 72,9 67,9* 87,3

Of-19 3-оксо-28-(0'-метил-Ь-изолейцино)карбонил-28-луп-20(29)-ен 100 48,6* 50,1* 101,0 79,8

Of-8 Метиловый эфир 2-фурфурилиден-бетулоновой кислоты 100 61,6* 64,8** 65,7* 88,6

Of-2 3-оксим бетулоновой кислоты 100 55,6* 56,2* 118,9 71,2**

Of-15 Метиловый эфир 3,20-диоксимино-29-норлуп-28-овой кислоты 50 41** 30" 97

20 74,0 80,2* 70,9* 56,8

Of-18 3,28-ди-0-ацетил-29-норлуп-20-оксим 50 84 101 34**

A-75 Нитроксил бетулоновой кислоты 50 57,0*** 49,5" 103,8 119,2

1 2 3 4 5 6 7

ВГ-153 Ы-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-иоданилин 20 56,2м* 54,6* 59,1* 124,5

ВГ-157 Ы-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(ТЧ-пиперидинопропаргил-1)анилин 50 70,0* 61,1* 62,1* 65,0

ВГ-132 Ы-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(М-морфолинопропаргил-1)анилин 50 78,1 69,0 100,4 196,9*

ВГ 156 N-(3-oкco-20(29)-лyпeн-28-oил)-4-(2-этинилпиpидил)aнилин 50 114,3 90,5 126,6 58,3*

ВГ-182 К-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(Ы,К-диэтиламинопропаргил-1-ин)анилин 50 88,0 102,1 73,7* 69,1*

ВГ-211 Ы-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-( 1 -гексил-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)анилин 20 118,9 85,2 92,7 66,1*

ВГ-216 1Ч-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(1-бензил- 1Н-1,2,3-триазол-4-ил)анилин 20 124,6 75,9 81,4 58,4*

ВГ-263 Н-3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(1-(4-ацетилфенил)-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)анилин 20 141,9 111,1 108,2 39,9**

ВГ-264 М-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-( 1 -(4-метоксифенил)- 1Н-1,2,3-триазол-4-ил)анилин 20 195,2* 105,6 99,1 41,2***

ОМО 3,4-секо-3-нитрило-28-( Ы-карбонил-О' -метил-Ь-лейцин)-4(23),20(29)-лупандиен 100 50,4* 64,1* 120,8 89,1

0«1 3,4-секо-3-нитрило-28-( Ы-карбонил-О'-метил- р-аланин)-4(23),20(29)-лупандиен 100 39,8* 42,3** 79,0* 83,2

К Контроль - 100 100 100 100

ДКВ Референс(дигидрокверцетин) 100 56,2 56,1 110,0 78,1

15), оксимным (ОМ), нитроксильным (А75), фурфурилиденовым (ОР-8) и анилиновым (ВГ153, ВГ157, ВГ132,) заместителями (см. табл. 2). Среди этих соединений выделяются агенты, обладающие дополнительно антихолестазными свойствами: Ме-Р-алаБК, 0£-8, 0£15, ВГ153, ВГ157, ВГ182иО£31.

В ряду производных БК выявлены соединения с большей, чем у ре-ференсного соединения, антиоксидантной активностью, в том числе сама БК, ее оксимы (ОР-18,0^2), триазолы (ВГ263, ВГ264, ВГ216, ВГ211), производные анилина (ВГ156, ВГ182), аланиламиды (а-алаБК, Ме-а-алаБК) (см. табл. 2). У некоторых агентов (Ме-Р-алаБК, 0£15, ВГ157, 0£19) антиоксидантные свойства проявились лишь на уровне тенденции.

В результате скрининга производных БК на 2 моделях воспаления выявлены соединения с высокой противовоспалительной активностью (табл. 3). Эта группа агентов представлена в основном аланиламидными и анилиновыми производными БК и соединениями с метальным, деци-луреидным и метилпиперазиновым заместителями в тритерпеноидной структуре. Аланиламиды БК проявляли статистически достоверный эффект в диапазоне доз 50-100 мг/кг, при этом их активность носила доза-зависимый характер. При введении в дозе 100 мг/кг их активность убывала в ряду Р-алаБК—»Ме-Р-алаБК—»а-алаБК—»Ме-а-алаБК. Метиловый эфир БК был более активным, чем сама кислота. Аналогичная зависимость активности от структуры для производных с анилиновым фрагментом, вводимых в дозе 20 мг/кг, имела вид: ВГ174—»ВГ182—»ВГ112—»ВГ157. В целом лупановые тритерпеноиды уступали по выраженности противовоспалительного действия индометацину, однако три производных в аналогичных условиях проявили активность, не уступающую референсному препарату: ВГ174, ВГ182 и Ме-БК.

Скрининг противоопухолевых свойств тритерпеноидов лупанового ряда проводили выборочно для соединений разных структурных типов с использованием нескольких видов перевиваемых опухолей при разных режимах и способах введения. В табл. 4 приведены максимальные значения индекса торможения роста первичного узла опухоли.

Сравнение эффективности однократного и курсового режимов введения аланиламидных производных выявило преимущество курсового введения, которое в большинстве случаев позволяло снизить дозу без существенного ослабления эффекта. Не установлено повышения активности агентов при внутрибрюшинном способе введения по сравнению с внутрижелудочным, что, по-видимому, объясняется низкой растворимостью исследуемых соединений в водных и липидных средах.

Оценивая выраженность противоопухолевого эффекта лупановых агентов, вводившихся через 2 сут после перевивки опухоли и на фоне сформировавшегося узла, можно сделать вывод об их относительно невысокой противоопухолевой активности, которая не превышала 50% по критерию ТРО и существенно уступала эффекту ЦФ. Вместе с тем,

Таблица 3. Влияние однократного внутрижелудочного введения лупановых тритерпеноидов на воспалительный отек лапы мышей, индуцированный гистамином и каррагенином

Шифр агента Химическое название Доза, мг/кг Модель 'ИО, % относит. контроля 2ПВА, %

1 2 3 4 5 6

БК Бетулоновая кислота 100 50 20 гист карр гист 71,8* 80,9* 107,5 28,2 19, 1 0

Ме-БК Метиловый эфир бетулоновой кислоты 100 50 20 гист карр гист 95,0 68,9** 67,7* 5 31,1 32,3

а-алаБК 2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота 100 50 20 гист карр гист 72,8* 77,8** 95,7 27,2 22,2 4,3

Ме-6-алаБК Метиловый эфир 2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил-амино]-пропионовой кислоты 100 50 20 гист карр гист 73,7* 95,9 95,7 26,3 4,1 4,3

(3-алаБК 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота 100 50 20 гист карр гист 67,2** 92,6 97,3 32,8 7,4 2,7

Ме-Р-алаБК Метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил-амино]-пропионовой кислоты 100 50 20 гист карр гист 80,3 70,7** 112,9 19,7 29,3 0

1 2 3 4 5 6

омо 3 -оксо-28-(4,4' -диаминодифенилсульфон)-карбонил-луп-20(29)-ен 100 гист 75,5* 24,5

ОМ1 3 -оксо-17 Р-(К-децилуреидо)-28-норлуп-20(29)-ен 100 гист 51,3" 48,7

ВГ-157 К-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(К-пиперидинопропаргил-1)-анилин 20 карр 74,3" 25,7

ВГ-132 Ы-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(К-морфолинопропаргил-1 )-анилин 20 карр 87,2 12,8

ВГ-176 К-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(Ы-пирролидинопропаргил-1 -ин)анилин 20 гист 81,9 18,1

ВГ-156 К-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(2-этинилпиридил)анилин 20 гист 89,1 10,9

ВГ-182 Н-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(Ы,К-диэтиламинопропаргил-1-ин)анилин 20 гист 62,0* 38,0

ВГ-174 К-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4- {Ы-метил-"М-[( 18,28)-2-(мети-ламино)-1 -фенил-1 -гидроксипропил]пропаргин-1 -ил)} анилин 20 гист 53,4" 46,6

ВГ-112 К-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(2-гидрокси-5-метилгексадии-нил-1,3 -ил)анилин 20 гист 71,9* 28,1

К Контроль - 100 0

ин Референс(индометацин) 20 карр гист 54,9** 61,8" 45,1 38,2

Примечание. *-р<0,05; **-р<0,01 - при сравнении с контролем. 'ИО - индекс отека; 2ПВА - противовоспалительная активность.

Таблица 4. Индекс торможения роста опухоли лупановых тритерпеноидов в зависимости от режима и способа введения в организм

Шифр Химическое название агента Вид опухоли Способ введения Доза, мг/кг ТРО, %

1 2 3 4 5 6

Введение на фоне растущего опухолевого узла

БК Бетулоновая кислота LLC RLS RLS LS В/Ж В/Б В/Ж В/Б 50x8 дней 250 50x8 дней 250 2 15 22 31

а-алаБК 2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота LLC LLC LS В/Ж В/Ж В/Ж 500 50x8 дней 500 28 33 18

Ме-а-алаБК Метиловый эфир 2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионо-вой кислоты LLC LLC LS В/Ж В/Ж В/Ж 500 50x8 дней 500 25 23 0

Р-алаБК 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота LLC LLC RLS RLS RLS LS LS В/Ж В/Ж В/Б В/Ж В/Ж В/Б В/Ж 500 50x8 дней 250 500 50x8 дней 250 500 26 15 39 33 35 22 33

Ме-Р-алаБК Метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионо-вой кислоты LLC LLC В/Ж в/ж 500 50x8 дней 18 2

ОФ-1 Бетулиновая кислота RLS LS В/Б В/Б 250 250 12 17

ч©

1 2 3 4 5 6

омо 3-оксо-28-(4,4'-диаминодифенил-сульфон)-карбонил-луп-20(29)-ен ЬЬС В/Ж 50x8 дней 11

ОМ1 3-оксо-28-(Ы-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен ЬЬС В/Ж 50x8 дней 23

о^з ЗР,28-ди-0-никотинат бетулина ЬЬС ЯЬ8 В/Ж В/Ж 50x8 дней 18 31

ОЫ5 Метиловый эфир 3,20-диоксимино-29-норлуп-28-овой кислоты ЬЬС ЯЬБ в/ж в/ж 50x8 дней 50x8 дней 24 28

Введение через 48 ч после перевивки

ЬЬС в/ж 20x8 дней 44

Р-алаБК 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота ЬЬС в/ж 50x8 дней 43

ЬЬС в/ж 100х8дней 55

А75 Нитроксил бетулоновой кислоты ЬЬС в/ж 50х8дней 28

М-Ме М-[3-оксо-лупано-28-ил]-4'-метилпиперазин ЬЬС в/ж 20х8дней 25

М-© М- [3-оксо-лу пано-28-ил]-4'-этилпиперазин ЬЬС в/ж 20х8дней 26

М-ЕЫ К-[3-оксо-лупано-28-ил]-4'-метил-4'-этилпиперазоний йодид ЬЬС в/ж 20х8дней 0

0£15 Метиловый эфир 3,20-диоксимино-29-норлуп-28-овой кислоты А.Эрлиха В/Б 50x5дней 51

ОМ 7 Лупеол А.Эрлиха В/Б 50x5дней 0

0^18 3,28-ди-0-ацетил-29-норлуп-20-оксим А.Эрлиха В/Б 50x5дней 0

ОГ-19 3-оксо-28-(0'-метил-Ь-изолейцино)карбонил-28-луп-20(29)-ен А.Эрлиха В/Б 50x5дней 0

ЦФ Референс (циклофосфан) ЬЬС ЬЬС В/Б В/Б 100х2дней 10х2дней 770 40

Примечание. В/Ж - внутрижелудочное введение; В/Б - внутрибрюшинное введение.

необходимо отметить, что изучаемые соединения не оказывали стимулирующего действия на рост трансплантатов. Наиболее значимую противоопухолевую активность демонстрировали БК и ее аланиламидные производные, 3 -оксо-2 8-(К-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (0^15), 3-оксо-28-(Ъ1-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (о£41), 3(3,28-ди-0-никотинат бетулина (ОМ), нитроксил БК (А75), >1-[3-оксо-лупано-28-ил]-4'-метилпиперазин и 1Ч-[3-оксо-лупано-28-ил]-4'-этилпи-перазин (М-Ме и М-Е1:).

На основании результатов скрининга тритерпеноидов ряда лупана для дальнейшего исследования в качестве потенциальных корректоров цитостатиков были выбраны следующие соединения: БК, ее метиловый эфир (Ме-БК), 2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота (а-алаБК), ее метиловый эфир (Ме-а-алаБК), 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота ф-алаБК), ее метиловый эфир (Ме-(3-алаБК), 3-оксо-28-(К-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (01"-41), 3-оксо-28-(Ы-метилггаперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (01-15) и Зр,28-ди-О-никотинат бетулина (О^З).

Морфологический анализ и клеточные механизмы политаргетных эффектов лупановых тритерпеноидов в условиях изолированного и комбинированного введения с противоопухолевыми препаратами ■

Исследование клеточных механизмов коррекции бетулоновой кислотой и ее {{-аланиламидом цитотоксических эффектов цикло-фосфана у интактных животных. Ведущим осложнением при лечении ЦФ является угнетение иммунной системы и кроветворения. Введение экспериментальным животным этого алкилирующего препарата в токсических и субтоксических дозах вызывает глубокие и стойкие нарушения практически во всех ростках гемопоэза (Гольдберг Е.Д. и др., 2000). Для клинической картины ЦФ также характерно поражение печени, вызванное токсическими продуктами его метаболизма (Непомнящих Л.М. и др., 2010). Клинически данный тип поражения печени характеризуется ее увеличением, болезненностью и асцитом, развитием вено-окклюзионного синдрома и симптомами острого гепатита (Никитин И.Г., Сторжаков Г.И., 2002). Образующийся при метаболизме ЦФ акролеин вызывает поражение почек и тяжелый геморрагический цистит. ЦФ также обладает кардиоток-сическими свойствами (Лушникова Е.Л. и др., 2009).

Для оценки общей картины полиорганных повреждений, вызванных ЦФ, и их коррекции БК и ее Р-аланиламидом, использован интегральный показатель - коэффициенты массы внутренних органов. Анализ полученных данных выявил достоверный ингибирующий эффект ЦФ на лимфоидные органы - тимус и селезенку (табл. 5). В группе с изолированным введением ЦФ относительная масса тимуса на 4-й день опыта

Таблица 5. Изменение коэффициентов массы внутренних органов на 4-й и 14-й дни опыта под влиянием введения БК и р-алаБК на фоне циклофосфана (М±т)

Группа Печень Селезенка Почки Легкие Тимус

4 14 4 14 4 14 4 14 4 14

Контроль 4,93±0,28 4,74±0,25 0,76±0,12 0,61±0,02 0,73±0,03 0,70±0,02 0,73±0,07 0,62±0,03 0,20±0,0 0,17±0,02

ЦФ 4,87±0,12 5,83±0,03* 0,37±0,07* 1,53±0,22* 0,9±:0,04* • 0,86±0,04* 0,68±0,02 1,21±0,42* 0,04±0,00*** 0,12±0,04"

ЦФ+БК 5,32±0,25 5,79±0,66 0,43±0,02* 1,15±0,25 0,81±0,02 0,89±0,05* 0,74±0,07 1,14±0,19* 0,04±0,00"* 0,08±0,0Г*

ЦФ+ Р-алаБК 5,17±0,11 5,00±0,13 0,96±0,09#» 0,78±0,09# 0,73±0,03 0,72±0,03 0,69±0,05 0,67±0,06 0,23±0,02ш 0,23±0,0Г*#

БК 5,26±0,12 5,22±0,12 0,38±0,06<' 0,77±0,11 0,95±0,03** 0,90±0,07 0,75±0,05 0,80±0,05 0,07±0,0Г" 0,08±0,02*

р-алаБК 5,01±0,09 4,97±0,37 0,86±0,03 0,77±0,09 0,78±0,66 0,74±0,04 0,66±0,04 0,64±0,05 0,19±0,01 0,19±0,02

Примечание. * -р<0,05, ** -р<0,01, -р<0,001 относительно контроля;" -р<0,05, ##-р<0,01,т -р<0,001 относительно циклофосфана.

снизилась в 5 раз, а селезенки - в 2 раза относительно контроля. К 14-му дню в этой же группе мышей масса тимуса отставала в 1,4 раза, а масса селезенки превысила в 2,5 раза соответствующий показатель контрольной группы. Под действием ЦФ происходило достоверное повышение массы экскреторных органов, обусловленное их кровенаполнением вследствие нарушения гемодинамики. Масса почек на 4-й день увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контролем и оставалась повышенной до конца эксперимента, в конце опыта значимо повысились коэффициенты масс печени и легких.

Введение ß-алаБК на фоне ЦФ полностью купировало его депрессивный эффект на тимус и селезенку, а также нормализовало массу экскреторных органов. Введение БК в тех же условиях не купировало негативный эффект ЦФ на оба лимфоидных органа в течение всего наблюдаемого периода и не оказало регулирующего влияния на массу выделительных органов. В режиме изолированного введения ß-аланиламид не оказывал влияния на массу лимфоидных органов, в то время как БК, подобно ЦФ, вызвала такое же по продолжительности угнетение тимуса и временное угнетение селезенки.

По данным литературы, однократное введение ЦФ в максимально переносимой дозе приводит к длительно сохраняющейся (до 6 мес) дезорганизации клеточного состава тимуса и нарушению функционального состояния клеток иммунной системы (Гольдберг Е.Д. и др., 2000; Захаров A.A., 2008). Известно, что снижение численности Thy 1,2+ в костном мозге приводит к подавлению образования селезеночных колоний. Показано, что тимоциты необходимы для миграции КОЕ-С из костного мозга в селезенку, а также для активации колониеобразования в селезенке (Гольдберг Е.Д. и др., 1999,2008). Поэтому отмеченное нами снижение массы селезенки на 4-й день эксперимента в группах с изолированным введением ЦФ и его комбинированным введением с БК можно объяснить как значительным угнетением гемопоэза в костном мозге, так и выраженным угнетением тимуса в этот период.

В ряде работ показано, что восстановление массы селезенки сопровождается увеличением ее клеточности, связанной с активной миграцией костномозговых стволовых и некоммитированных кроветворных клеток в селезенку, что совпадает по времени с активным восстановлением гемопоэза в костном мозге. Восстановление массы селезенки происходит в большей степени за счет ее заселения клетками миелоидного ряда, тогда как численность лимфоцитарной колонии увеличивается позже (Si'efc L., 2003; Barcew К., 2008). Эти данные объясняют развитие спленомегалии в группах с изолированным введением ЦФ и с его сочетанным введением с БК к 14-му дню опыта и косвенно указывают на восстановление кроветворной функции костного мозга и селезенки.

Отмеченные выше изменения в состоянии органов кроветворения нашли отражение в картине периферической крови крыс (табл. 6). Под

Таблица 6. Изменения в картине периферической крови на 4-й и 14-й дни опыта после введения БК и р-алаБК на фоне циклофосфана (М±т)

Группа Гематологические показатели

ЯВС НСТ WBC НОВ РЬТ

4 14 4 14 4 14 4 14 4 14

Контроль 5,94±0,55 5,65±0,23 32,9±3,4 31,8±0,7 12,4±0,5 14,1±2,1 16,4±1,2 16,2±0,1 210±14 193±8

ЦФ 5,20±0,27 4,7±0,27* 28,0±1,4 23,6±0,8" 0,9±0,1* 51,2±6,2" 15,2±0,6 12,2±0,7** 101±9*" 371±23"

ЦФ+БК 5,11±0,17 4,74±0,25 27,0±1,0 27,2±1,4 1,3±0,2* 39,7±4,9" 14,6±0,5 13,9±0,5* 95±8*** 336±47

ЦФ+ Р-алаБК 4,96±0,31 4,69±0,46 28,5±1,7 25,1±2,7 1,3±0,2* 30,3±4,8* 15,7±0,9 15,3±0,6 138±16* 387±20*"

БК 5,09±0,10 4,88±0,18* 27,2±0,7 26,2±1,(Г 12,7±0,8 12,5±1,7 14,9±0,5 14,8±1,7 195±16 193±12

р-алаБК 5,07±0,19 5,83±0,31 26,3±0,8* 31,1±1,8 18,2±3,6 14,3±4,1 14,5±0,4 17,0±0,7 213±28 198±13

Примечание. ЛВС - число эритроцитов, НСТ - гематокрит, РЬТ - число тромбоцитов, \V4BC - число лейкоцитов, 1~ЮВ - концентрация гемоглобина. * - р<0,05, ** - р<0,01, *" - р<0,001 относительно контроля.

влиянием ЦФ в первые четыре дня у животных развилась тяжелая лейкопения (снижение числа лейкоцитов в 13 раз), которая к 14-му дню сменилась лейкоцитозом (увеличение числа лейкоцитов в 3,6 раза). В этих условиях БК и р-алаБК оказали модулирующий эффект, снижая выраженность как лейкопении (в 1,4 раза), так впоследствии и лейкоцитоза (в 1,3 - 1,7 раза относительно ЦФ). При изолированном введении оба тритерпеноидных агента не вызвали статистически значимых изменений в содержание лейкоцитов периферической крови.

Введение тритерпеноидов на фоне ЦФ не оказало значимого влияния на вызванные им сдвиги в количестве тромбоцитов и эритроцитов. Динамика изменений показателей гематокрита и гемоглобина в группе с ЦФ и тритерпеноидами была аналогична динамике изменения количества эритроцитов.

Анализ лейкоцитарной формулы показал, что лейкопения, выявленная у крыс через 4 дня после введения ЦФ, обеспечивалась в основном за счет значительного угнетения гранулоцитарного ростка крови, прежде всего сегментоядерных нейтрофилов, количество которых снизилось в 3,4 раза относительно контроля (табл. 7). БК и ее р-аланиламид, вводимые на фоне цитостатика, оказали в тот же период корригирующий эффект, достоверно снизив вызванную им нейтропению соответственно в 2,5 и 1,9 раз. К 14-му дню опыта во всех группах, которым вводили ЦФ, содержание грану-лоцитов в крови нормализовалось. Обращает на себя внимание появление палочкоядерных нейтрофилов в группах с сочетанным введением ЦФ и обоих тритерпеноидов, свидетельствующее о стимуляции гранулопоэза в костном мозге. Следует отметить, что сами по себе тритерпеноиды не вызвали достоверных изменений в гранулоцитарном профиле в течение всего периода наблюдений.

В условиях цитостатического воздействия были выявлены определенные сдвиги в количестве циркулирующих мононуклеаров. После введения ЦФ у крыс наблюдалось тенденциозное повышение моноцитов, а также небольшой лимфоцитоз, который компенсировался к 14-му дню опыта. На этом фоне р-аланиламид БК уже в ранние сроки нормализовал количество моноцитов (снижение в 1,6 раз), тогда как БК достигла такого же эффекта в конце эксперимента. Ведение тритерпеноидов в изолированном режиме не влияло на содержание моноцитов - оно было близко к норме в течение всего опыта. Содержание лимфоцитов в группах с введением БК и ее р-аланиламида достоверно не отличалось от контроля.

Выявленная динамика изменения клеточного состава крови подтверждается данными литературы, описывающими состояние костномозгового кроветворения после введения ЦФ (Гольдберг Е.Д. и др., 1999; Дыгай A.M. и др., 2009). Известно, что через сутки после введения ЦФ в максимально переносимой дозе происходит значительное угнетение гранулоцитарного ростка костного мозга, что сопровождается резким уменьшением количества гемопоэтических островков. К 5-м суткам количество нейтрофилов

Таблица 7. Изменения показателей лейкоцитарной формулы на 4-й и 14-й дни опыта после введения БК и алаБК на фоне циклофосфана (М±ш)

Группа Эозинофилы Нейтрофилы Моноциты Лимфоциты

палочкоядерные сегментоядерные

4 14 4 14 4 14 4 14 4 14

Контроль 2±1 1,5±0,5 - - 21,2±2,5 27±4,7 7,3±1,7 4,3±0,9 63±1,5 68±3,8

ЦФ 1±0 1±0 - - 6,3±0,9*" 30,3±7,1 12±1,4 10±1,5 82±2,Г" 59±6,1

ЦФ+БК 1,5±0,5 4,7±1,5 - 2±0,6 15,5±2,4## 27±3,7 11,3±1,2 6,4±0,7 73±1,9" 63±4,3

ЦФ+ Р-алаБК - 1±0 - 2±1 12,2±1,8*# 48,3±9,7 7,3±1,3 7,7±1,7 74±5,9 42±9,5

БК 1,8±0,5 1±0 1±0 - 19±2,2 23±2,0 8,5±1,1 6±0,7 72±3,1 71±1,5

р-алаБК 1,5±0,3 5±0 1,5±0,5 - 16,2±2,4 22±4,6 9,3±1,1 6,8±0,6 74±2,4 70±5,8

Примечание. * -р<0,05, ** -р<0,01, *** -р<0,001 относительно контроля; #-р<0,05, т-р<0,01 относительно циклофосфана.

возрастает, достигая максимума к 8 - 12-му дню (Гольдберг Е.Д. и др., 1999; Дыгай A.M. и др., 2009). Эти данные согласуются с наблюдавшимся нами увеличением количества лейкоцитов в крови через 14 дней после введения ЦФ, существенно превышавшим их число в контроле. В то же время в крови сохранялись признаки угнетения эритрона.

Выявленные сдвиги в состоянии периферической крови, а также в массе селезенки и тимуса, вызванные действием ЦФ, в целом соответствовали описанной в литературе картине морфофункдиональных изменений в системе кроветворения. Выраженность гематотоксического эффекта ЦФ в нашем опыте определялась введенной дозой препарата, которая составляла Уг от максимально переносимой. В этих условиях гемопротекгорное действие БК и ее р-аланиламида было направлено преимущественно на гранулоцито-моноцитарный росток и выражалась в модуляции патологических сдвигов, вызванных. ЦФ.

У аланиламида БК дополнительно было установлено протекторное действие в отношении тимуса и селезенки, которое выражалось в поддержании их нормальной массы в течение опыта. Это обстоятельство позволяет предположить сохранение под действием Р-алаБК клеточного пула Thy 1,2+ и сделать вывод о иммунопротекторном действии агента. Кроме того, сохранение функциональной активности тимуса могло способствовать активизации процессов дифференцировки предшественников в костном мозге, что не потребовало дополнительной стимуляции кроветворной функции селезенки. БК не оказала корригирующего влияния на депрессивный эффект ЦФ в отношении как тимуса, так и селезенки.

Морфологические изменения печени через 3 сут после введения ЦФ проявлялись в виде мелкоочаговых некрозов паренхимы, распространявшихся от портальных трактов. Отмечались нарушения гемодинамики - неравномерное полнокровие синусоидов, центральных и портальных вен. В расширенных просветах синусоидов находились многочисленные мононуклеарные клетки, преимущественно клетки Купфера. К гепатоток-сическим эффектам ЦФ следует отнести и выраженную субплазмалем-мапьную «вакуолизацию» цитоплазмы гепатоцитов. Регенераторные реакции гепатоцитов проявлялись в усилении их митотической активности, особенно в перипортальной зоне, где возрастало количество двуядерных гепатоцитов.

К 14-м суткам после введения ЦФ происходило нарастание воспали-тельноклеточной инфильтрации, развивался тромбоз и обтурирование (особенно клетками Купфера) просветов синусоидов, центральных и портальных вен. Регенераторные реакции гепатоцитов в этот срок проявлялись в усилении цитокинеза двуядерных клеток (уменьшении их числа) и увеличении популяции «мелких» одноядерных гепатоцитов, направленных на восстановление их общей численности. Некробиотические изменения гепатоцитов и стимуляция их регенераторных реакций были наиболее выраженными в перипортальных зонах. Портальный и перипортальный

склероз, выявляемый в более поздние сроки после введения ЦФ, свидетельствовал о наиболее выраженных повреждениях цитотоксическими агентами клеточных популяций портальных зон печени.

В печени животных после введения ЦФ и БК отмечалось уменьшение степени полнокровия как в крупных сосудах, так и в синусоидах. В ге-патоцитах как центролобулярных, так и перипортальных зон выявлялась очаговая дистрофия. Отмечались некрозы отдельных гепатоцитов. После введения ЦФ и амида БК сохранялось более выраженное, по сравнению с ЦФ и БК, полнокровие сосудов. По всей паренхиме выявлялись коагу-ляционные некрозы отдельных гепатоцитов. В то же время регистрировались гепатоциты, находившиеся на разных фазах митотического цикла, и двуядерные клетки. В группах животных получавших БК и амид БК в режиме изолированного введения гистологическое строение печени существенно не отличалось от контроля. Однако при введении амида БК отмечалась более значительная активация эндотелиоцитов синусоидов, чем при БК. К признакам корригирующего влияния амида БК на фоне ЦФ можно отнести усиление регенераторных процессов в печени в виде повышения митотической активности гепатоцитов и увеличения количества двуядерных клеток.

По данным ультраструктурного анализа, внутриклеточная реорганизация гепатоцитов после однократного введения ЦФ определялась выраженными изменениями тонкой структуры митохондрий, транзиторными изменениями гранулярной цитоплазматической сети (расширениями профилей и частичной дегрануляцией), значительной редукцией гладкой цитоплазматической сети, гиперплазией и гипертрофией структурных элементов комплекса Гольджи. Характерной особенностью внутриклеточной реорганизации гепатоцитов обеих зон через 3 сут после введения ЦФ были лизис и секвестрация гранул гликогена, которые регистрировались во всех клетках, но различались по интенсивности. В наибольшей степени эти процессы были выражены в гепатоцитах перипортальной зоны.

Значительным изменениям подвергалось микроциркуляторное русло печеночной дольки. Через 3 сут после введения ЦФ регистрировалась гетерогенность эндотелиоцитов синусоидных капилляров, которая была обусловлена преимущественно присутствием в эндотелиальной выстилке как активированных, так и йекробиотически измененных клеток.

Через 14 сут после введения ЦФ ультраструктурные изменения гепатоцитов усиливались. В первую очередь это касалось тонкого строения митохондрий и скоплений гранул гликогена. Тонкая структура митохондрий была значительно изменена, они содержали, как правило, электронно-плотный матрикс, но кристы в них практически не различались; отмечалась «осмиофильная» дегенерация митохондрий с образованием остаточных телец. Выстилка синусоидов была представлена как активированными, так и дегенеративными формами эндотелиоцитов. Важной особенностью поражения печени после введения ЦФ можно считать массивную обту-

рацию синусоидов клетками Купфера и лимфоцитами с образованием тромботических масс, носивших распространенный характер.

При изолированном введении БК и ее амида отмечались сходные изменения ультраструктуры гепатоцитов. Через 3 сут ультраструктура гепатоцитов в обоих случаях была близка к норме, но отмечалось нарушение тонкой структуры митохондрий. Митохондрии, как правило, были с электронно-плотным матриксом, в котором плохо различались кристы. При этом усиливалась эндоцитозная и трансцитозная функции гепатоцитов: на синусоидальном полюсе регистрировалось большое количество эндоцитозных (пиноцитозных) везикул, на билиарном полюсе - многочисленные везикулы гладкой цитоплазматической сети, гипертрофированный комплекс Гольджи. Желчные капилляры, как правило, были расширенными, в них присутствовали небольшие осмиофильные структуры. Вблизи желчных капилляров часто встречались остаточные тельца с мелкой осмиофильной зернистостью.

Повышенная эндоцитозная (пиноцитозная) активность также была характерна для активированных форм эндотелиоцитов и клеток Купфера. В синусоидах часто располагались переходные формы моноцитов - клетки с большим бобовидным ядром, электронно-прозрачной цитоплазмой, в которой присутствовали многочисленные укороченные трубочки гранулярной цитоплазматической сети, первичные лизосомы, комплекс Гольджи, небольшие митохондрии и вакуоли с гомогенным содержимым; плазмалем-ма формировала множественные эндоцитозные/пиноцитозные везикулы. Усиление эндоцитозной (пиноцитозной) активности гепатоцитов, эндотелиоцитов и клеток Купфера (моноцитов) было наиболее манифестным при действии амида БК. После введения БК практически во всех клетках Купфера содержалось большое количество фагосом с осмиофильной зернистостью, эти же мельчайшие частицы диффузно распределялись по цитоплазме клеток и представляли собой фагоцитированные частицы БК.

В то же время при действии обоих тритерпеноидов отмечался некроз и некробиоз отдельных гепатоцитов и эндотелиоцитов, преимущественно в перицентральной зоне, формирование пристеночных скоплений клеточного детрита.

Через 14 сут после введения БК и ее амида ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Хорошо была развита гладкая цитоплазма-тическая сеть, везикулы которой встречались как на билиарном, так и на синусоидальном полюсах. В гепатоцитах присутствовали небольшие поля гликогена, отмечалась его умеренная секвестрация. В некоторых клетках отмечалось неравномерное расширение профилей гранулярной цитоплазматической сети и межмембранного околоядерного пространства. Во всех гепатоцитах сохранялась выраженная эндоцитозная активность синусоидальной плазмолеммы. Для амида БК характерным было появление в некоторых гепатоцитах крупных митохондрий с просветленным матриксом. Эндотелий синусоидов был представлен в основном активи-

рованными формами, но после введения амида БК отмечалось также появление некротизированных эндотелиоцитов. В обоих случаях наблюдалась значительная обтурация просветов синусоидов мононуклерами.

Через 3 сут после введения ЦФ и БК ультраструктура гепатоцитов была сходна с таковой после введения только одного ЦФ. В гепатоцитах присутствовало большое количество гликогена, который был подвержен лизису и секвестрации, субплазмалеммально локализовались липидные включения и вакуоли с осмиофильным содержимым. Профили гранулярной цитоплазматической сети были неравномерно расширены, гладкая цитоплазматическая сеть сильно редуцирована. Изменения тонкой структуры митохондрий проявлялись в частичной редукции крист. На билиар-ном полюсе часто регистрировались вторичные лизосомы и остаточные тельца с мелкой осмиофильной зернистостью. В этот срок эксперимента в просветах синусоидов и перисинусоидально располагалось большое количество клеток Купфера с многочисленными фагосомами с мелкой осмиофильной зернистостью. В отличие от введения только одного ЦФ в данном случае отмечалась выраженная эндоцитозная активность синусоидальной плазмолеммы гепатоцитов.

Через 3 сут после введения ЦФ и амида БК ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Отмечался выраженный полиморфизм митохондрий, которые были представлены часто крупными формами с разрыхленным матриксом. В гепатоцитах часто выявлялись везикулы гладкой цитоплазматической сети, преимущественно на билиарном полюсе. Отмечались гиперплазия и гипертрофия структурных элементов комплекса Гольджи. Желчные капилляры, как правило, были расширенными и содержали осмиофильную субстанцию. Отмечалась высокая эндоцитозная активность гепатоцитов и клеток Купфера.

Через 14 сут после введения ЦФ и БК отмечалась нормализация ультраструктуры одних гепатоцитов и усиление повреждения - других. В первых при этом сохранялись изменения тонкой структуры митохондрий, но появлялись везикулы гладкой цитоплазматической сети. Во вторых отмечались субплазмалеммальные скопления вакуолеобразных остаточных телец и выраженная секвестрация гликогена. Наблюдался некроз отдельных гепатоцитов. В некоторых случаях регистрировалось нарушение плотных контактов между соседними гепатоцитами, формирование апоптотических телец, которые попадали в просветы синусоидов, где резорбировались макрофагами. Через 14 сут после введения ЦФ и амида БК ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Отличительной чертой ультраструкгурной организации гепатоцитов при действии амида БК было присутствие большого количества крупных митохондрий с неравномерно расширенными кристами. Биологические эффекты обоих тритерпеноидов проявлялись в усилении эндоцитозной активности как гепатоцитов, так и эндотелиоцитов и клеток Купфера. В обоих случаях сохранялся тромбоз части синусоидов мононуклеарами.

Морфологические изменения миокарда через 3 сут после введения ЦФ заключались в увеличении количества кардиомиоцитов с контрак-турными повреждениями. Наблюдались умеренный интерстициальный отек и диффузная инфильтрация стромы мононуклеарами. Через 14 сут в этой группе животных мозаичность повреждений сохранялась, нарастало количество кардиомиоцитов с литическими изменениями цитоплазмы. Усиливалась фенотипическая гетерогенность кардиомиоцитов - встречались как атрофированные, так и гипертрофированные клетки. Последнее обстоятельство способствовало восстановлению массы сердца. Сохранялись гемодинамические расстройства, в некоторых случаях происходило усиление интерстициального и периваскулярного отека. Абсолютная численность кардиомиоцитов в сердце через 3 сут после введения ЦФ существенно не изменялась, что свидетельствовало о сохранении клеточной формы регенерации кардиомиоцитов. В то же время следует отметить заметное уменьшение (на 31%) доли одноядерных кардиомиоцитов и увеличение (на 10%) доли двуядерных клеток. В этот срок эксперимента появлялись кардиомиоциты, в которых происходило митотическое деление ядер.

Через 14 сут после введения ЦФ нарушения гемодинамики сохранялись. Практически у всех животных кровеносные сосуды и капилляры кроме форменных элементов крови содержали плазму, наблюдались также явления плазморрагии. Количество кардиомиоцитов с литическими и вакуолеобразными изменениями цитоплазмы возрастало. В то же время общее количество кардиомиоцитов через 14 сут после введения ЦФ возрастало на 50%, при этом доля одноядерных клеток также возрастала, но оставалась уменьшенной (на 13%) по сравнению с контролем.

При введении ЦФ и БК в миокарде животных через 3 сут более выраженной была мозаичность повреждений кардиомиоцитов, чем при введении только ЦФ. Возрастало количество клеток с контракгурными повреждениями. Как и при введении ЦФ, отмечались выраженные нарушения гемодинамики. Через 14 сут сохранялась мозаичность повреждений миокарда. Возрастало количество кардиомиоцитов с литическими изменениями цитоплазмы (у некоторых животных до 3 0 - 40%). Количественные изменения популяции кардиомиоцитов через 3 сут после введения ЦФ и БК были такими же, как и после введения ЦФ, но соотношение одно- и двуядерных кардиомиоцитов не изменялось.

При введении ЦФ и амида БК через 3 сут эксперимента также манифестировали контрактурные и логические повреждения кардиомиоцитов. Одновременно присутствовали кардиомиоциты, в саркоплазме которых наблюдались многочисленные вакуолеобразные расширения. Через 14 сут усиливались проявления некробиоза и атрофии одних кардиомиоцитов и гипертрофия других; сохранялась мозаичность повреждения мышечных сегментов. Нарушения гемодинамики манифестировали, выраженность отека стромы варьировала. Наблюдалась диффузная инфильтрация стро-

мы мононуклеарами, количество которых возрастало также в адвентиции интрамуральных артерий. Выявлено уменьшение общей численности кардиомиоцитов в сердце (на 26%) через 3 сут эксперимента при сохранении соотношения одно- и двуядерных клеток. К 14-м суткам эксперимента происходило восстановление общей численности кардиомиоцитов в сердце, но при этом уменьшалась (на 35%) доля одноядерных клеток и возрастала (на 19%) доля двуядерных клеток.

В группе с изолированным введением БК и амида БК через 3 сут наблюдались сходные изменения кардиомиоцитов: сочетание контрактурных и литических повреждений. Через 14 сут в миокарде животных, получавших БК, отмечено увеличение количества атрофированных и некробио-тически измененных кардиомиоцитов при одновременном увеличении количества гипертрофированных клеток. Гемодинамические нарушения сопровождались умеренной диффузной инфильтрацией стромы миокарда мононуклеарами; у некоторых животных отмечался мелкоочаговый кардиосклероз. Через 14 сут после введения амида БК происходило усиление литических повреждений отдельных кардиомиоцитов. Отмечалось развитие диффузного и мелкоочагового кардиосклероза. Введение крысам БК и ее аланиламида не вызывало заметного изменения общей численности кардиомиоцитов в сердце во все сроки эксперимента. Однако через 3 сут после введения амида БК выявлено увеличение на 92% доли одноядерных кардиомиоцитов и уменьшение доли дву- и многоядерных клеток. Через 14 сут после введения БК и ее амида происходило достоверное уменьшение доли одноядерных кардиомиоцитов соответственно на 39 и 28%.

По данным электронно-микроскопического анализа, через 3 сут после введения ЦФ отмечались умеренно выраженный преимущественно очаговый лизис миофибриллярных пучков, расширение везикул гранулярной и агранулярной саркоплазматической сети и деструкцию митохондрий с образованием миелиноподобных остаточных телец. При действии ЦФ в кардиомиоцитах сохранялось большое количество гликогена, наблюдалась его секвестрация. Ультраструктурные изменения ядер кардиомиоцитов проявляются преимущественно в изменении их формы, значительных инвагинациях ядерной оболочки и транслокации в субсарколеммальную зону. Через 14 сут после введения ЦФ сохранялись литические изменения кардиомиоцитов.

БК и ее амид при изолированном введении вызывали сходные с ЦФ, но менее выраженные изменения ультраструктуры кардиомиоцитов. К наиболее значимым повреждениям относились лизис саркоплазматического матрикса, особенно в околоядерной зоне, умеренный лизис миофибриллярных пучков, расширения везикул агранулярной саркоплазматической сети. Литические изменения миофибриллярных пучков были незначительными, в этих участках всегда локализовались полисомы, наблюдалось новообразование миофиламентов. Важно отметить, что при действии БК отмечалось формирование сарколеммой эндоцитозных везикул и

кавеол. К особенностям амида БК относится его способность вызывать в некоторых клетках значительные повреждения тонкой структуры митохондрий (диффузный лизис митохондриального матрикса, редукцию крист и нарушение их упаковки), которые манифестировали на протяжении всего эксперимента. Следует отметить, что эти изменения были наиболее выраженными в первые 3 сут эксперимента, восстановление ультраструктуры кардиомиоцитов при использовании тритерпеноидов происходило быстрее, чем после воздействия ЦФ.

При последовательном применении ЦФ и тритерпеноидов в первые 3 сут воздействия проявлялся их синергизм в отношении основных видов ультраструктурных изменений кардиомиоцитов - литических повреждений миофибрилл, расширений везикул саркоплазматической сети и межмембранного околоядерного пространства (основных ультраструюур-ных маркеров регенераторно-пластической недостаточности кардиомиоцитов). Восстановление ультраструктуры кардиомиоцитов при комбинированном применении ЦФ и тритерпеноидов происходило быстрее. Во многих кардиомиоцитах в саркоплазме присутствовали многочисленные полисомы, в околоядерной зоне отмечалась гиперплазия структурных элементов комплекса Гольджи.

Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о том, что изучаемые соединения вызывают морфофункциональные изменения в миокарде, сходные с ЦФ. Литические и некробиотические повреждения кардиомиоцитов обусловлены цитотоксическим действием исследуемых агентов. Наиболее выраженными эти изменения были при сочетанном введении ЦФ и амида БК, что обусловило наиболее значительное уменьшение массы сердца на 3-й сутки эксперимента и снижение общей численности кардиомиоцитов. В то же время, при использовании только одного амида БК происходило увеличение массы органа к 14-м суткам эксперимента и наиболее значительное возрастание пула одноядерных кардиомиоцитов. Использование тритерпеноидов в то же время стимулировало процессы внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов. Эти данные свидетельствуют о том, что БК и ее амид могут потенцировать как цитотоксические эффекты ЦФ, так и выступать в качестве индукторов регенераторных реакций миокарда.

Исследование клеточных механизмов коррекции бетулоновой кислотой и ее р-аланиламидом цитотоксических эффектов доксору-бицина (ДОК) у интактных животных. Известно, что одним из основных проявлений токсичности антрациклиновых антибиотиков, наряду с кардиотропным эффектом, является развитие гипо- и апластических состояний кроветворения (Дыгай A.M. и др., 2009). В результате анализа коэффициентов массы внутренних органов установлено снижение под действием ДОК массы тимуса к 14-му дню опыта (табл. 8). Этот эффект частично компенсировался при совместном введении цитостатика и тритерпеноидов, что выразилось в отсутствии, по сравнению с контролем,

Таблица 8. Изменение коэффициентов массы внутренних органов на 4-й и 14-й дни опыта под влиянием введения БК и ß-алаБК на фоне доксорубицина (М±т)

Группа Печень Сердце Селезенка Почки Легкие Тимус

4 14 4 14 4 14 4 14 4 14 4 14

Контроль 4,33± 0,19 4,60± 0,14' 0,40± 0,01 0,32± 0,01 0,36± 0,05 0,24± 0,01 0,76± 0,02 0,70± 0,03 0,64± 0,04 0,49± 0,04 0,25± 0,05 0,21± 0,02

док 4,77± 0,24 4,21± 0,17 0,40± 0,03 0,3 7± 0,01 0,3 0± 0,05 0,42± 0,08 0,83± 0,04 0,75± 0,06 0,66± 0,06 0,71± 0,02* 0,18± 0,04 0,11± 0,03*

ДОК+БК 4,47± 0,17 4,51± 0,21 0,40± 0,01 0,36± 0,02 0,26± 0,04 0,39± 0,06 0,84± 0,05 0,74± 0,02 0,69± 0,05 0,64± 0,07 0,16± 0,02 0,14± 0,03

ДОК+ ß-алаБК 4,87± 0,11* 4,36± 0,23 0,37± 0,01 0,3 8± 0,01* 0,34± 0,04 0,33± 0,03 0,77± 0,02 0,74± 0,02 0,64± 0,04 0,59± 0,04" 0,19± 0,03 0,14± 0,04

БК 5,01± 0,19 4,16± 0,15 0,3 8± 0,01 0,35± 0,01 0,3 8± 0,02 0,32± 0,04 0,76± 0,02 0,70± 0,02 0,60± 0,03 0,61± 0,07 0,25± 0,01 0,20± 0,02"

ß-алаБК 4,75± 0,10 4,21± 0,09 0,3 9± 0,02 0,3 8± 0,02 0,37± 0,05 0,42± 0,07 0,76± 0,02 0,77± 0,06 0,64± 0,06 0,54± 0,02 0,26± 0,03 0,22± 0,02"

Примечание. * - р<0,05 относительно контроля ;" - р<0,05 относительно доксорубицина.

значимых изменений данного показателя в группах с введением БК и ала-ниламида БК на фоне ДОК. В то же время при изолированном введении БК и Р-алаБК не влияли на массу вилочковой железы.

Масса селезенки во всех группах значительно не отличалась от контроля, однако можно отметить тенденцию к ее увеличению на 14-й день в группах с изолированным введением ДОК и Р-аланиламида БК (в 1,8 раза). Что касается массы сердца, поражение которого стоит на первом месте среди побочных эффектов ДОК, то в данном опыте не отмечено достоверных изменений его массы ни в одной из групп.

В картине периферической крови (табл. 9) подопытных животных не выявлено статистически значимых сдвигов в содержании эритроцитов и тромбоцитов. К концу опыта отмечено снижение гематокрита во всех группах с введением ДОК, а также с изолированным введением Р-алаБК. Кроме того, в те же сроки понизилось содержание гемоглобина у крыс, получивших только один цитостатик.

Введение ДОК вызвало у животных лейкоцитоз в конце эксперимента (увеличение лейкоцитов в 1,4 раза относительно контроля). В группах с введением тритерпеноидов на фоне ДОК количество лейкоцитов достоверно не отличалось от контроля.

Показатели лейкоцитарной формулы крови во всех группах статистически значимо не отличались от контроля в течение всего опыта (табл. 10). Однако в группе с изолированным введением ДОК можно отметить как тенденцию увеличение к 14-му дню количества сегментоядерных нейтрофилов (в 1,8 раз) и моноцитов (в 1,4 раза). Введение тритерпеноидов на фоне ДОК оказывало небольшой корригирующий эффект, снижая нейтрофилез и моноцитоз соответственно в 1,3 и 1,2 раза (относительно группы с ДОК).

Полученные результаты показали, что введение цитостатика в дозе 7 мг/кг не оказывает существенного патологического влияния на картину периферической крови. Введение ДОК вызвало лишь изменение со стороны белой крови в виде достоверного лейкоцитоза к 14-м суткам наблюдения. При этом соотношение форменных элементов в лейкоцитарной формуле не отличалось от контроля. Тем не менее, БК и Р-алаБК на фоне ДОК проявили тенденцию к нормализации показателей белой крови, что коррелировало с результатами, полученными в опыте с ЦФ. Отмеченные выше сдвиги в белой крови под действием ДОК согласуются с литературными данными об абортивном увеличении зрелых форм нейтрофилов в костном мозге к 4 - 7-м суткам после введения препарата в максимально переносимой дозе (Гольдберг Е.Д. и др., 1999).

Описанные в литературе механизмы коррекции функций лимфоидных органов после воздействия ЦФ и ДОК в целом одинаковы и связаны с ролью Т-лимфоцитов в восстановлении костномозгового и селезеночного кроветворения. В представленной работе характер и степень выявленного гематотоксического эффекта ДОК определялись величиной введенной

Таблица 9. Изменения в картине периферической крови на 4-й и 14-й дни опыта после введения БК и р-алаБК на фоне доксорубицина (М±ш)

Группа Число эритроцитов Число лейкоцитов Концентрация гемоглобина Число тромбоцитов

4 14 4 14 4 14 4 14

Контроль 5,75±0,07 6,03± 0,26 10,4± 0,78 14,31±0,72 18,4±0,40 18,97±0,13 293±58 217±21

ДОК 5,45±0,35 5,52±0,12 9,84±1,35 20,45±1,41"* 18,6±0,77 17,38±0,22* 273±22 239±18

ДОК+БК 6,02±0,20 5,60±0,10 9,87±1,03 14,72±3,06 19,47±0,61 18,36±0,48 303±22 214±18

ДОК+ Р-алаБК 5,63±0,17 5,03±0,30 15,03±3,41 16,28±1,50 18,75±0,44 17,00±1,08 266±10 277±31

БК 5,48±0,16 6,14±0,55 12,6±0,65 14,98±2,50 17,78±0,42 18,4±0,39 239±11 241±26

Р-алаБК 5,62±0,34 5,25±0,45 15,76±1,79 17,13±0,64 17,96±0,73 18,24±0,30 216±15 243±7

Примечание. * - р<0,05, *** - р<0,001 относительно контроля.

Таблица 10. Изменения показателей лейкоцитарной формулы на 4-й и 14-й дни опыта после введения БК и ß-алаБК на фоне доксорубицина (М±т)

Группа Эозинофилы Палочкоядерные Сегментоядерные Моноциты Лимфоциты

4 14 4 14 4 14 4 14 4 14

Контроль 2±1,2 1,7±0,9 0±0 0±0 22,7±6,3 20±1,5 7,3±2,3 7±2 68±7,0 71,3±4,4

ДОК 1±0,5 1±1 0,4±0,2 0±0 35,2±7,4 35,6±9,2 8,0±2,1 9,6±1,7 55,4±8,66 53,8±8,7

ДОК+БК 0,7±0,5 0,6±0,2 0,2±0,2 0±0 32,2±8,4 26,8±6,12 8,8±1,3 7,8±1,б 58,3±7,87 64,8±7,3

ДОК+ ß-алаБК 0,3±0,2 0,5±0,3 0±0 0,2±0,2 28,7±4,1 28,2±7,3 11,6±0,7 8,5±1,б 58,8±3,61 56±8,5

БК 1±0,7 0,6±0,2 0±0 0±0 19±2,2 21,4±3,5 11,6±1,1 11±2,3 68,2±ЗД2 67±4,9

ß-алаБК 1,6±0,6 0,4±0,3 0±0 0±0 20±4,2 26,4±4,1 №0,7 12,2±1,Г 68,2±4,51 61±3,9

Примечание. * - р<0,05 относительно контроля.

дозы, которая составляла половину от максимально переносимой. В этих условиях не удалось достичь значимого токсического действия цитоста-тика на кроветворную систему и, соответственно, выявить корректорное действие лупановых агентов. Однако в данном случае, так же как и в опыте с ЦФ, наблюдалась тенденция к нормализации лейкоцитов крови и массы тимуса при сочетанном введении ДОК и тритерпеноидов, свидетельствующая о иммунопротекторном действии БК и ее аланиламида.

Морфологические изменения печени после введения ДОК проявлялись в виде умеренной жировой дистрофии гепатоцитов (преимущественно мелкокапельной) и значительных литических изменениях цитоплазмы («опустошении» цитоплазмы, как правило, это был лизис больших скоплений гликогена). Гемодинамические нарушения, проявлявшиеся в ранние сроки эксперимента полнокровием и окклюзией синусоидов (многие сосуды были заполнены плазмой), усиливались к 14-м суткам наблюдения. К концу эксперимента в печени развивался венозный застой, который был также следствием гемодинамических нарушений в большом круге кровообращения. На этом фоне регистрировались преимущественно перицентральные некрозы гепатоцитов и инфильтрация очагов некроза мононуклеарными клетками в основном лимфоидного ряда.

Наблюдалось также нарушение поглотительной, накопительной и экскреторной функции гепатоцитов, ультраструктурными маркерами этих изменений были снижение количества эндоцитозных/пиноцитозных везикул и числа микроворсинок, вплоть до сглаживания поверхности гепатоцитов на синусоидальном полюсе, и спавшиеся диктиососмы комплекса Гольджи. В то же время в других гепатоцитах отмечалось увеличение площади синусоидальной поверхности за счет сокращения латеральной поверхности и образования микроворсинок, отражающее усиление трансмембранного обмена.

Ультраструктурный анализ синусоидальной выстилки и пространства Диссе показал, что токсическое действие ДОК вызывало окклюзию микрососудов и синусоидных капилляров печени клетками крови. В пространство Диссе мигрировали многочисленные клетки лимфо- и моноцитарного ряда, плазмоциты разной функциональной активности. Наблюдалось значительное расширение синусоидов, заполненных гипертрофированными макрофагами (клетками Купфера). При этом свободный (полезный) просвет синусоидов сужался; во многих синусоидах наблюдался некроз эндотелиальных клеток.

Следует особо подчеркнуть, что в данной модели доксорубицинового повреждения печени не отмечалось развитие перицеллюлярного фиброза во все сроки эксперимента, звездчатые клетки встречались очень редко. Основной клеточной популяцией среди соединительнотканных клеток были клетки Купфера, которые часто содержали гетерогенные липидные включения. К 14-м суткам в синусоидах появлялись сегментоядерные нейтрофилы, активированные плазмоциты с хорошо развитой цитоплаз-

матической сетью и активные формы клеток Купфера с обилием лизосом, фагосом и остаточных телец. Миграция нейтрофилов в печень в эти сроки была связана с некрозами гепатоцитов.

Через 3 сут после введения ДОК с последующим введением БК или ее амида морфологические изменения печени были сходными. Отмечались умеренная субплазмалеммальная липидная инфильтрация гепатоцитов, некроз отдельных гепатоцитов, венозное и синусоидальное полнокровие, более выраженное при применении амида БК. В обоих случаях выявлена умеренная миграция моноцитов (в основном клеток Купфера) в пери-синусоидальные пространства. Через 14 сут после введения ДОК и БК сохранялась субплазмалеммальная липидная инфильтрация гепатоцитов, в которых при этом отмечались массивные накопления гликогена. После применения ДОК и амида БК липидная инфильтрация гепатоцитов была более выраженной (по характеру как мелко-, так и крупнокапельная), при этом отложения гликогена были менее значительными, чем после применения БК. При использовании обоих тритерпеноидов регистрировалось неравномерное полнокровие сосудов. В этот срок эксперимента усиливалась мононуклеарная инфильтрация печеночной долыси.

Ультраструктурные изменения гепатоцитов через 3 сут после введения ДОК и последующего введения БК и ее амида заключались также в усилении секвестрации гликогена, частичной деструкции митохондриаль-ных крист и усилении аутофагоцитоза. Через 14 сут подобные изменения регистрировались в отдельных гепатоцитах. Следует отметить, что при сочетанном применении ДОК и тритерпеноидов так же, как и в случае с ЦФ, усиливалась эндоцитозная активность гепатоцитов, отмечалась гипертрофия и гиперплазия структурных элементов комплекса Гольджи. Синусоидные капилляры во все сроки эксперимента были обтурированы мононуклеарами и клеточным детритом.

Морфологические изменения миокарда после введения ДОК были более значительными по сравнению с ЦФ. Через 3 сут после введения ДОК отмечались литические изменения саркоплазмы и ультраструктур карди-омиоцитов. Литические изменения миофибрилл при доксорубициновом повреждении чаще носили диффузный характер. В изменениях ядрышек чаще манифестировали явления сегрегации фибриллярного и гранулярного компонентов нуклеолонемы. Практически во всех кардиомиоцитах наблюдались расширения межмембранного околоядерного пространства и агранулярной саркоплазматической сети. В то же время изменения ми-тохондриального компартмента были незначительными и заключались в основном в неравномерном расширении крист. Важно отметить, что при доксорубициновых, как и при циклофосфановых повреждениях карди-омиоцитов, в очагах лизиса миофибрилл в этот срок эксперимента всегда регистрировались полисомы и наблюдались хаотично расположенные новообразованные миофиламенты, что свидетельствовало об активации процессов внутриклеточной регенерации.

Через 14 сут после введения ДОК литические и деструктивные изменения отдельных кардиомиоцитов усиливались (выявлялись очаговые и диффузные литические изменения миофибриллярных пучков и расширенные везикулы агранулярной саркоплазматической сети). В этот срок эксперимента манифестировали также расширения межмембранного околоядерного пространства, отмечались явления аутофагоцитоза (особенно в околоядерной зоне).

В группе крыс, получавших ДОК и в последующем БК или ее амид, ультраструктурные изменения кардиомиоцитов были более выраженными, чем в аналогичных группах с введением ЦФ. Через 3 сут после введения ДОК и последующего введения БК во многих кардиомиоцитах выявлялись значительные диффузные литические повреждения миофибриллярных пучков и саркоплазматического матрикса, в результате чего саркоплазма клеток выглядела разреженной. Манифестировали также расширения межмембранного околоядерного пространства и саркоплазматической сети. Во многих кардиомиоцитах эти изменения были даже более выраженными, чем при введении только ДОК. К 14-м суткам общий характер изменений кардиомиоцитов сохранялся, но значительно уменьшалась выраженность литических изменений миофибриллярных пучков. Одновременно в некоторых клетках наблюдались значительные вакуолеобразные расширения межмембранного околоядерного пространства, в которых часто регистрировались мембранозные образования. Следует также отметить, что в кардиомиоцитах часто встречались единичные митохондрии со значительным лизисом матрикса и выраженной редукцией крист.

В кардиомиоцитах крыс, получавших ДОК и в последующем амид БК, через 3 сут эксперимента также регистрировался весь спектр отмеченных выше ультраструктурных изменений: диффузные литические изменения миофибриллярных пучков и митохондриального компартмента, расширения межмембранного околоядерного пространства и агранулярной саркоплазматической сети. Отмечался выраженный полиморфизм ядер, в которых содержались сегрегированные ядрышки. В саркоплазме кардиомиоцитов наблюдалось большое количество равномерно распределенных полисом. Через 14 сут в кардиомиоцитах значительно снижалась выраженность литических изменений миофибрилл и митохондрий; реже встречались клетки с расширенным межмембранным околоядерным пространством. Регистрировался полиморфизм ядер кардиомиоцитов, в которых содержались ядрышки с преимущественно гранулярным компонентом.

В миокарде при введении ДОК и тритерпеноидов в первые 3 сут отмечен их синергизм с цитостатиком в отношении выраженности ультраструктурных изменений основных компартментов кардиомиоцитов, но без длительного подавления процессов внутриклеточной регенерации и более быстрым восстановлением тонкой структуры клеток. Участие амида БК в стимуляции регенераторных резервов клеток показано на примере восстановления ультраструктуры кардиомиоцитов после однократного

введения ЦФ (Лушникова Е.Л. и др., 2007, 2008). При этом для амида БК характерны более выраженные изменения ультраструктуры митохондрий, чем для БК. Выраженные изменения ультраструктуры митохондрий под действием амида БК косвенно свидетельствуют о возможной активации проапоптотических факторов, обеспечивающих внутренний митохонд-риальный механизм клеточной смерти, который является ведущим механизмом для тритерпеноидных соединений.

Полученные нами данные косвенно указывают на наличие у амида БК апоптоз-индуцирующей активности, что, вероятно, связано с его противоопухолевым действием. Важнейшей особенностью действия амида БК, выявленного нами в условиях цитостатического воздействии, является также активация им репаративных сигнальных путей, с которыми связана стимуляция пластических резервов клетки. Признаками такой стимуляции были повышение на фоне сочетанного введения амида и ЦФ регенераторного резерва печени и сердца в виде увеличения пула двуядерных гепатоцитов и одноядерных кардиомиоцитов, а также более быстрое восстановления ультраструктуры кардиомиоцитов на фоне ДОК. Протекторное действие БК в условиях цитотоксического воздействия ЦФ менее выражено, оно проявилось лишь в виде стимулирующего влияния на гранулоцитарный росток крови. БК в меньшей степени, чем ее амид, снижала некрозогенное действие ЦФ в печеночной паренхиме, а также демонстрировала большую выраженность литических повреждений ми-офибрилл кардиомиоцитов на фоне ДОК.

Исследование коррекции бетулоновой кислотой и ее производными цитотоксических эффектов комбинированного введения цитостатиков по схеме CHOP у интактных животных

В данной серии экспериментов изучали корректорные свойства БК и двух ее аланиламидных производных (Р-алаБК и Ме-Р-алаБК).

Исследование периферической крови после введение крысам комплекса химиотерапевтических препаратов (ПХТ) выявило угнетение эритроцитарного и лейкоцитарного ростка. К 5-м суткам после цитостатического воздействия количество лейкоцитов крови снизилось на 42% и удерживалось на этом уровне в течение 10 дней. Уменьшение числа циркулирующих эритроцитов было небольшим - б - 9%. Содержание тромбоцитов в циркулирующей крови достоверно не отличалось от контроля во всех группах с ПХТ.

Введение БК на фоне ПХТ не оказало заметного корригирующего влияния на численность клеток белой крови. Ее аланиламидные производные, напротив, задерживали развитие лейкопении и несколько снижали ее тяжесть. Так, в группе с введением Р-алаБК количество лейкоцитов в крови на 5-й день после ПХТ уменьшилось на 28%, а в группе с его эфирным аналогом на 10-й день опыта - на 15%. В конце постцитостатического

периода содержание эритроцитов и лейкоцитов в группах с введением аланиламидных производных оставалось ниже нормы; БК повышала лишь уровень красных кровяных клеток. Показатели гемоглобина во всех группах коррелировали с количеством эритроцитов. Уменьшение гематокрита в первые 10 дней после ПХТ было связано со снижением клеточности крови в этот период.

В результате анализа лейкоцитарной формулы установлено достоверное снижение количества лимфоцитов в ответ на ПХТ (на 14 - 22% относительно контроля), сохранявшееся на протяжении всего постцитоста-тического периода. Введение БК и ее производных не оказало заметного влияния на выраженность лимфопении, однако Ме-|3-алаБК в первые 5 дней после ПХТ частично купировал этот эффект, повысив уровень лимфоцитов на 6%. Кроме того, тритерпеноиды оказали корригирующий эффект в отношении моноцитоза, развившегося под влиянием ПХТ. В первые 5 дней после ПХТ в группах с введением БК и Ме-Р-алаБК количество моноцитов оставалось в норме, в то время как в группе с изолированным введением цитостатиков их уровень повысился в 1,6 раза. В конце постцитостати-ческого периода отмечена тенденция к более быстрому восстановлению содержания моноцитов в крови под действием всех тритерпеноидов.

На фоне вызванной цитостатиками лимфопении у крыс наблюдалось достоверное увеличение сегментоядерных нейтрофилов (максимально в 2 раза на 10-й день после ПХТ). В конце цитостатического периода данный показатель снижался, однако оставался в 1,5 раза выше по сравнению с контролем. Введение БК и ее аланиламидных производных не оказало заметного корригирующего влияния на выраженность нейтрофилеза, вызванного ПХТ. Тритерпеноиды также не влияли на уровень эозинофилов в крови, превысивший норму во всех группах с ПХТ в конце постцитоста-тического периода.

Следует отметить, что в конце постцитостатического периода во всех опытных группах и в референсной группе с ПХТ наблюдалось постепенное восстановление показателей периферической крови, различия между группами уменьшались. Так, на 14-й день после введения тритерпеноидов на фоне ПХТ их влияние выражалось в небольшом увеличении числа эозинофилов и уменьшении моноцитоза, в то время как количество нейтрофилов и лимфоцитов в основном соответствовало показателям референсной группы.

Таким образом, корректорный эффект тритерпеноидов в условиях ПХТ выражался в ослаблении ее угнетающего эффекта на лейкоцитарный росток крови в раннем постцитостатическом периоде. При этом регулирующее влияние агентов было направлено преимущественно на моноциты, а не на гранулоциты.

Анализ препаратов костного мозга через 15 дней после цитостатического воздействия показал, что во всех группах с ПХТ происходило восстановление костномозгового кроветворения. Содержание стромаль-

ных и миелоидных клеток у крыс не выходило за пределы аналогичных показателей в контроле. Соотношение предшественников и зрелых ми-елоцитов (индекс созревания) соответствовало норме. Вместе с тем, в костном мозге крыс с изолированным введением цитостатиков отмечалось увеличение количества эозинофильных и моноцитарных клеток (в 1,3 и 1,7 раз относительно контроля). В группах с введением БК и |3-алаБК происходила коррекция этих элементов до уровня контроля. Эфир амида подобным эффектом не обладал. Аланиламидные производные БК нормализовали также количество плазматических клеток, которое возрастало после введения цитостатиков. Состояние гемопоэтических предшественников эритроцитов и тромбоцитов свидетельствовало о завершении восстановительного периода эритро- и мегакариоцитопоэза через 15 дней после ПХТ. Достоверно не отличалось от контроля и количество костномозговых лимфоцитов у всех животных после ПХТ, хотя содержание эритроцитов и лимфоцитов в циркулирующей крови в эти сроки еще не достигало нормы.

Данные анализа костного мозга свидетельствуют о более ранней нормализации основных клеточных элементов под действием тритерпеноидов с преимущественным влиянием на клетки моноцитарного ряда.

Отмеченные ранее особенности корректорного действия тритерпеноидов в опытах с ЦФ и ДОК проявились также на фоне экспериментальной химиотерапии по схеме CHOP. В частности, выявленный тимус-протекторный эффект агентов подтвердился в результате морфологического исследования этого лимфоидного органа. Показано, что через 15 дней после цитостатического воздействия в тимусе наблюдалась мелкоочаговая гипоплазия лимфоидной ткани, которая проявлялась в виде относительного снижения плотности его лимфоклеточной популяции, сужения корковой части, увеличения числа телец Гассаля в мозговом веществе (табл. 11).

По данным литературы, в результате воздействия противоопухолевых препаратов наступает дезорганизация тимуса, которая характеризуется истончением коркового вещества, инверсией окраски коркового и мозгового слоев и сопровождается уменьшением массы тимуса. При этом количество Thy 1,2+ в костном мозге животных резко снижается (Гольдберг Е.Д. и др., 1999). В нашем эксперименте под влиянием CHOP корково-мозговой индекс снизился в 1,6 раз относительно контроля. Это указывает на уменьшение поступления из костного мозга в корковую зону тимуса низкодиф-ференцированных лимфоцитов, что может быть следствием как угнетения костномозгового кроветворения, так и гипоплазии самого тимуса.

Последнее предположение подтверждается данными морфологического анализа, выявившим увеличение числа телец Гассаля, которые являются продуктами дегенерации медулярных клеток тимуса и содержат в основном кератины. Введение тритерпеноидных агентов на фоне CHOP привело к повышению корково-мозгового индекса и снижению количества телец Гассаля в паренхиме тимуса. Наиболее выраженный тимус-протекгорный эффект

Группа Объемная плотность, Vv % Индекс КУМ Количество телец Гассаля

К М

Контроль 64,61± 1,02 35,56±1,03 1,97±0,10 3,37±0,23

ПХТ 55,62±1,03* 43,41±1,00 1,22±0,06* 7,16±0,26*

ПХТ+БК 60,32±1,03 39,68±1,03 1,55±0,06 5,05±0,18

ПХТ+р-алаБК 68,58±0,68# 31,42±0,68" 2,22±0,07" 3,28±0,12#

ПХТ+ Me-ß-алаБК 57,83±0,88* 43,24±1,04* 1,4±0,05 6,04±0,18*

Примечание. К - кора; М - мозговое вещество. * - р<0,05 в сравнении с контролем; # - р<0,05 в сравнении с ПХТ.

проявил р-алаБК, увеличивший тимический индекс в 1,8 и снизивший число телец Гассаля в 2,2 раза. Соответствующее корректорное действие его метилового эфира и самой БК проявилось слабее (см. табл. 11).

Морфологическое исследование почек, проведенное через 15 дней после введения комплекса цитостатиков, выявило развитие альтератив-ных процессов. Наблюдалось полнокровие сосудов, отек интерстиция, расширение мезангия, сужение просвета капсулы Шумлянского-Боумена, дистрофические и атрофические изменения эпителиоцитов канальцев. На всем протяжении канальцевой системы, в том числе и в собирательных трубочках, расширенный просвет был заполнен белково-клеточными массами, встречались гиалиновые цилиндры.

На 15-е сутки после ПХТ (CHOP) у животных референсной группы объемная плотность нефроцитов, находящихся в состоянии дистрофии, превышала соответствующие показатели в контроле в 37,5 раз, в состоянии некроза - в 3,2 раза. Сужение просвета капсулы составляло 27% от контроля (табл. 12).

Оценка влияния изучаемых соединений на альтеративные процессы в почках, вызванные CHOP, показала, что тритерпеноиды существенно ослабляли нефротоксическое действие цитостатических препаратов. Введение крысам БК и ее производных вызывало снижение объемной плотности нефроцитов в состоянии дистрофии по сравнению с изолированным введением цитостатиков. На фоне БК объемная плотность нефроцитов проксимальных канальцев в состоянии дистрофии уменьшилась на 72%, на фоне (3-алаБК - на 65%, Ме-р-алаБК- на 69%. Объемная плотность очагов некроза снижалась у животных, получавших р-алаБК - в 2,4 раза, Ме-Р-алаБК - в 2,5 раза, тогда как под влиянием БК существенного снижения не наблюдалось. Все тритерпеноиды, кроме Ме-Р-алаБК, способствовали нормализации строения капсулы (см. табл. 12).

Таким образом, курсовое введение БК, и особенно ее аланиламидных производных в постцитостатическом периоде, уменьшало признаки токсического нефроза, оказывая позитивное влияние на состояние нефрона.

Группа Паренхима Vv,% Дистрофия Vv,% Некрозы Vv,% Диаметр сосудистого клубочка Просвет капсулы

Контроль 96,87±0,28 0,35±0,10 0,18±0,07 2,97±0,04 0,32±0,01

ПХТ 92,16±0,21 13,14±0,38* 0,58±0,0 6* 2,92±0,04 0,09±0,0Г

ПХТ+БК 91,27±0,28 3,63±0,26# 0,51±0,07* 2,61±0,04 0,26±0,04#

ПХТ+ ß-алаБК 91,6±0,44 4,53±0,20*# 0,24±0,05*# 2,88±0,03 0,26±0,01#

ПХТ+ Ме-ß-алаБК 91,62±0,43 4,11±0Д8*# 0,23±0,05*# 2,85±0,05 0,14±0,01

Примечание. ' - р<0,05 в сравнении с контролем; # - р<0,05 в сравнении с

пхт.

Морфологическое исследование печени показало, что на 15-й день после введения комплекса цитостатических препаратов ее балочная структура в основном сохранялась, однако в ней наблюдались выраженные альтеративные изменения: отек интерстиция, полнокровие вен, значительное сужение просветов синусоидальных капилляров. Отмечены дистрофия гепатоцитов, фокальные микронекрозы, наиболее выраженные в центральных отделах долек.

Объемная плотность дистрофических и некротических изменений под влиянием цитостатиков достигала 64,8 и 11,4% объема паренхимы (табл. 13). У животных в группе с изолированным введением цитостатических препаратов наблюдалось снижение, относительно контроля, объемной плотности синусоидов на 46,4%, увеличение объемной плотности гепатоцитов на 15,3%, снижение ядерно-цитоплазматического отношения на 20%. Количество двуядерных гепатоцитов снизилось на 38,6%, что свидетельствовало о депрессии пролиферативных процессов.

Введение тритерпеноидов способствовало восстановлению структур печени. Наблюдалось уменьшение отека, увеличение просвета синусоидов, снижение количества очагов некроза, цитолитических повреждений гепатоцитов, количества клеток с пикнотическими ядрами: Отмечено умеренное неравномерное полнокровие сосудов (центральных вен) и си-нусоидных капилляров преимущественно в центре долек. Тритерпеноиды достоверно уменьшали степень выраженности альтеративных изменений гепатоцитов, вызванных введением цитостатических препаратов. Введение БК вызвало достоверное уменьшение в 11,5 раз объемной плотности гепатоцитов в состоянии дистрофии относительно референсной группы (ПХТ - 64,8%, БК - 5,6%).

В группах животных с введением р-алаБК и Ме-|3-алаБК также наблюдалось достоверное снижение объемной плотности дистрофически

Группа Дистрофия, Vv,% Некрозы, Vv,% Синусоиды, Vv,% Двуядер-ные гепа-тоциты Отношение Я/Ц

Контроль 2,78±0,42 1,19±0,31 25,63±0,83 7,74±0,51 0,25±0,009

ПХТ 64,82±1,15* 11,31±0,60* 13,74±1,40* 4,75±0,46 0,20±0,0Г

ПХТ+БК 5,63±0,б" 1,72±0,63# 31,51±1,08#" 6,46±0,5 0,28±0,02

ПХТ+ ß-алаБК 16,39±0,77*# 7,36±1,18 23,22±0,99 6,95±0,56 0,26±0,02

ПХТ+ Ме-ß-алаБК 16,47±1,17*# 6Д4±0,68 24,63±1,26 0,31±0,02 0,31±0,02

Примечание. Я/Ц - ядерно-цитоплазматическое отношение. * - р<0,05 в сравнении с контролем; " - р<0,05 в сравнении с ПХТ.

измененных гепатоцитов в 4 и 6,6 раза соответственно, однако по степени выраженности гепатопротекторного действия аланиламидные производные уступали БК. Введение БК на фоне ПХТ вызывало уменьшение в 6,6 раза объемной плотности очагов некрозов гепатоцитов (ПХТ -11,3%, БК -1,7%). Введение животным аланиламидных производных БК после ПХТ сопровождалось недостоверным снижением объемной плотности очагов некрозов. Согласно данным таблицы, все тритерпеноиды восстанавливали до нормы объемную плотность синусоидов.

Нормализация структуры печени под влиянием БК и ее производных сопровождалась увеличением объемной плотности ядер при сохранении объемной плотности цитоплазмы гепатоцитов, что приводило к достоверному повышению ядерно-цитоплазматического отношения в этих группах. Полученные результаты указывают на усиление синтетических процессов в клетках печени. В связи с этим обращает на себя внимание, что Ме-(3-алаБК в большей степени, чем остальные тритерпеноиды увеличивал ядерно-цитоплазматическое отношение и количество двуядерных гепатоцитов.

Данные морфологического анализа свидетельствуют о том, что коррекция лупановыми тритерпеноидами структурньгх повреждений тканей и клеточных компартментов в результате изолированного введения ци-тостатиков или их комбинации у здоровых животных обеспечивается в основном стимуляцией регенераторных реакций. Основываясь на данных различных исследователей, свидетельствующих об индукции тритерпеноидами цитопротекторных сигнальных путей в ответ на действие провоспа-лительных факторов, можно предположить, что производные БК на фоне введения цитостатиков активируют сигнальный путь №£2. Этот вывод подтверждается данными группы исследователей, которые обнаружили у ряда цианопроизводных БК способность подавлять индуцированную

макрофагами синтазу окиси азота и активировать NAD(P)H-xhhohok-сидоредуктазу и гемоксигеназу - ферменты второй фазы репаративного ответа, с помощью которых клетки подавляют развитие элекгрофильного или окислительного стресса (Liby К. et al., 2007).

Еще одним доказательством выдвинутого предположения являются результаты исследования, в котором изучалось влияние тритерпеноида олеананового типа ODDO-Im на развитие острого Т-клеточного воспаления в печени мышей, вызванного введением конковалина A (Osburn W.O. et al., 2008). В данной модели развитие иммуногенного воспалительного процесса сопровождается выделением активированными макрофагами провоспалительных цитокинов, что приводит к некрозам гепатоцитов. Используя различные линии нокаутных мышей, авторы показали, что ODDO-Im уменьшает воспалительное повреждение печени путем активации генов сигнального пути Nrf2, уменьшая при этом экспрессию провоспалительных генов и снижая секрецию эффекторных клеток на поздних стадиях воспаления. Эти результаты продемонстрировали, что усиление сигнализации Nrf2 обеспечивает мощную защиту печени от воспалительного и иммуногенного некроза гепатоцитов.

Другой возможной мишенью лупановых соединений могут быть белки-регуляторы сигнального пути NFkB, выступающего ключевым регулятором воспалительного процесса и контролирующего экспрессию различных цитокинов и факторов адгезии (Lu Н. et al., 2006). Лупановые тритерпеноиды - бетулин и бетулиновая кислота, как было показано на культуре стимулированных IFN-y макрофагов, подавляют активность выделяемых ими провоспалительных цитокинов IL-1, TNF-a, а также снижают активность индуцибельных синтазы окиси азота и циклоосигеназы-2 (Suh N. et al., 1998, 1999). Аналогичные результаты были получены на такой же модели для лупеола (Fernandes М.А. et al., 2001) и ряда олеона-новых и урсановых тритерпеноидов (Honda Т. et al., 1997). Приведенные данные могут являться доказательством кардиопротекторного действия олеаноловой и урсоловой кислот в модели оксидативного повреждения миокарда, вызванного введением некрозогенного агента изопротеренола (Senthil S. et al., 2007). В последнем случае тритерпеноиды существенно снижали количество некротизированных клеток и уровень ТБКАС в ише-мизированном миокарде.

Полученные нами данные свидетельствуют о вовлеченности иммунной системы в механизмы корригирующего влияния лупановых тритерпеноидов. На это указывают модулирующий эффект БК и ее производных на численность клеток гранулоцитарно-моноцитарного ряда, являющихся эффекторами иммунных и воспалительных реакций, а также выявленное тимус-протекторное действие этих агентов. Сообщалось, что иммунорегу-лирующая активность характерна также для других тритерпеноидов—олеаноловой и урсоловой кислот (Rafael T.J., Kuttan, 2003) и их производных (Hsu H.-J. et al., 1997), бетулиновой и бетулоновой кислот и их амидов

(Покровский А.Г. и др., 2001). На тесную связь противовоспалительных и иммунокорректорных свойств лупановых агентов указывают данные (Zdzisinska В. et al., 2003), полученные на культуре цельной крови человека. Они показывают, что БК не влияет на продукцию секретируемого стимулированными моноцитами TNF-a, но уменьшает соотношение IFN-y/ IL-10. Принимая во внимание, что провоспалительный IFN-y секретируется популяцией Th 1 клеток, а противовоспалительный IL-10 - популяцией ТЫ, то можно сделать заключение о сложном характере регуляторных взаимодействий тритерпеноидов с их молекулярными мишенями в клетке.

Таким образом, на основании приведенных данных можно предположить, что механизмы цитопротекторного действия лупановых тритерпеноидов могут обеспечиваться их регулирующим влиянием на внутриклеточную сигнальную трансдукцию, а также на клеточные и гуморальные факторы иммунной системы, контролирующие процессы воспаления, оксидативного стресса и регенерации.

Оценка политаргетного действия тритерпеноидов в условиях цитостатической полихимиотерапии CHOP у животных с перевиваемыми опухолями

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию печени мышей с перевитой карциномой легких Льюис (LLC) на фоне ПХТ. В печени животных с перевитой карциномой Льюис выявлены морфологические изменения, связанные с общим и местным влиянием опухоли, а также изменения, обусловленные проведением ПХТ и введением изучаемых химических соединений. У мышей всех групп наблюдались очаговые клеточные метастазы, часто в просвете синусоидов с активным делением в них опухолевых клеток.

У мышей с LLC (контрольная группа) отмечались в разной степени выраженности проявления регенераторно-пластической недостаточности гепатоцитов (дистрофия, атрофия некоторых клеток). Ведущим типом поражения гепатоцитов была очаговая «опустошенность» цитоплазмы, ассоциированная с лизисом и секвестрацией гранул гликогена. В то же время вблизи портальных трактов отмечалась пролиферация гепатоцитов, появление небольших двуядерных клеток с ацидофильной цитоплазмой и гиперхромными ядрами. Появление мелких двуядерных гепатоцитов в условиях метастазирования свидетельствует о сохранении их регенераторного потенциала. Нарушения гемодинамики проявлялись в виде неравномерного полнокровия и частичной окклюзии просвета синусоидов. Стенки сосудов были PAS-положительными, толуидиновый синий вызывал их метахроматическое окрашивание, а при окраске по методу ван Гизона соединительная ткань в этих структурах не выявлялась. На полутонких срезах в просветах синусоидов обнаруживались звездчатые клетки и полинуклеарные лейкоциты.

Группа Объемная плотность, Уу, %

дистрофические измененные гепатоциты некротически измененные гепатоциты синусоиды лейкоциты метастазы

Контроль (LLC) 0,64±0,22 0,09±0,13 0,21±0,22 0,020±0,06 0,050±0,009

LLC + ПХТ 0,62±0,03 0,15±0,09" 0,15±0,06* 0,028±0,07 0,046±0,010

LLC + ПХТ + БК 0,59±0,04 0,09±0,09 0,21±0,02 0,06±0,02 0,03±0,010*

LLC +ПХТ + МеБК 0,62±0,01 0,12±0,01 0,21±0,01 0,024±0,005 0,034±0,008*

LLC +ПХТ+ Ме-Р-алаБК 0,63±0,01 0,12±0,02 0,17±0,01 0,036±0,008 0,034±0,008*

LLC +ПХТ +Р-алаБК 0,61±0,03 0,07±0,01" 0,18±0,01 0,017±0,007 0,043±0,030

LLC +БК 0,64±0,04 0,11±0,05 0,19±0,03 0,023±0,005 0,038±0,030

LLC +МеБК 0,64±0,06 0,09±0,08 0,19±0,09 0,025±0,030 0,055±0,020

LLC +Ме-Р-алаБК 0,64±0,05 0,09±0,07 0,16±0,08 0,024±0,020 0,051±0,030

LLC +р-алаБК 0,63±0,08 0,04±0,05" 0,27±0,05* 0,024±0,020 0,022±0,020*

Примечание. ЬЬС — карцинома легких Льюис, ПХТ - полихимиотерапия; БК

- бетулоновая кислота; МеБК - метиловый эфир БК. * - р < 0,05, ** - р < 0,01

- по сравнению с контролем; # - р < 0,05 - по сравнению с ЫХ+ ПХТ.

ПХТ обусловливала массивную гибель гепатоцитов с формированием крупных очагов некроза. Во многих гепатоцитах отмечалась крупно- и мелкокапельная липидная инфильтрация цитоплазмы (размеры жировых капель иногда были сопоставимы или превышали размеры ядер). Гликоген в виде разной степени интенсивности РАБ-положительных скоплений выявлялся преимущественно в гепатоцитах перипортальных зон; во многих гепатоцитах наблюдалось истощение запасов гликогена с формированием в этих участках «оптически» пустых пространств. Отмеченные морфологические изменения гепатоцитов характерны и для действия других лекарственных препаратов и расцениваются некоторыми авторами как стереотипные (Непомнящих Г.И. и др., 2008; Молодых О.П. и др., 2010). При проведении ПХТ на 88% возрастала доля моноцеллюлярных некрозов гепатоцитов в центролобулярных зонах (табл. 14). Доля синусоидов со свободными просветами уменьшалась на 21%.

Введение тритерпеноидов на фоне ПХТ обусловливало изменения структуры гепатоцитов и синусоидов. При введении БК и Р-алаБК доля дистрофически измененных гепатоцитов существенно не изменялась по сравнению с контролем и ПХТ, но выраженность изменений была меньше:

б гепатоцитах практически отсутствовали зоны «опустошения» цитоплазмы и липидная инфильтрация, отмечалась незначительная субплазма-леммальная вакуолизация цитоплазмы. Доля моноцеллюлярных некрозов после введения БК и ß-алаБК уменьшилась соответственно на 42 и 53% при сравнении с ПХТ, но не с контролем. Введение мышам МеБК и Me ß-алаБК на фоне ПХТ не приводило к существенному снижению объемной плотности некротически измененных гепатоцитов по сравнению с ПХТ.

Сочетанное воздействие всех тестируемых соединений с ПХТ вызывало изменения синусоидального русла и перицеллюлярных пространств (пространств Диссе). В ряде случаев отмечалось склерозирование пространств Диссе с разрастанием пучков коллагеновых волокон вокруг гепатоцитов. Склеротические процессы сопровождались появлением в просветах синусоидов и перисинусоидально звездчатых клеток с липид-ными включениями в цитоплазме. Повреждение гепатоцитов и активация медиаторами воспаления звездчатых клеток, приводящая к усилению синтеза коллагена, являются основными факторами, вызывающими нарушение архитектоники и уменьшение (или прекращение) транссинусоидального обмена (Непомнящих Д.Л. и др., 2006; Жукова H.A. и др., 2008; Молодых О.П. и др., 2008).

Коллагенизацию пространств Диссе и «капилляризацию» синусоидов после проведения ПХТ и введения тритерпеноидов можно рассматривать в качестве компенсаторно-приспособительного ремоделирования печени в ответ на действие токсических соединений. Снижение транссинусоидального обмена в условиях повышенного содержания в крови цитопати-ческих агентов способствует уменьшению повреждения гепатоцитов, но одновременно замедляет приток пластических веществ и факторов роста, необходимых для внутриклеточной и клеточной регенерации.

ПХТ и ее сочетания с исследуемыми химическими агентами вызывали существенное уменьшение объемной плотности метастазов в просветах синусоидов. Наиболее значительно объемная плотность метастазов уменьшалась после сочетания ПХТ с тритерпеноидами: после сочетания с БК - на 50%, после сочетания с МеБК и Me ß-алаБК - на 43% по сравнению с LLC (р<0,05). Как следствие, введение БК, МеБК и Me ß-алаБК на фоне ПХТ способствовало увеличению объемной плотности синусоидов со свободными просветами как по сравнению с LLC (на 5 — 11 %), так и по сравнению только с ПХТ (на 33 - 40%).

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию печени мышей с перевитой лимфомой RLS. Лимфома RLS является злокачественной неходжкинской крупноклеточной лимфомой, относительной резистентной к ЦФ. В печени всех животных выявлялись множественные метастазы, расположенные преимущественно перипортально. В центре и по периферии метастатических очагов наблюдались мелко- и крупноочаговые фибриноидные некрозы гепатоцитов, инфильтрированные мононуклеарами. Гепатоциты находились в состоянии дистрофии раз-

Экспериментальная группа Дистрофически измененные гепатоциты Некротически измененные гепатоциты Синусоиды

RLS (контроль) 0,58± 0,017 0,29± 0,036 0,11± 0,010

RLS + ПХТ 0,42± 0,040* 0,3 7± 0,017 0,095± 0,020

RLS + ПХТ + БК 0,49± 0,017 0,31± 0,026 0,11± 0,004

RLS + ПХТ + р-алаБК 0,53± 0,010# 0,19± 0,014# 0,13± 0,011

RLS + БК 0,45± 0,016* 0,31± 0,017 0,14± 0,008

RLS + ß-алаБК 0,52± 0,024 0,26± 0,018 0,12± 0,009

Примечание. RLS - лимфома RLS, БК - бетулоновая кислота, АБК - амид бетулоновой кислоты, ПХТ-полихимиотерапия.4 -р < 0,05 относительно животных с RLS; " - р < 0,05 относительно ПХТ.

личной степени выраженности. Под влиянием комплекса цитостатиков в печени развивался гепатоз, сопровождавшийся усилением некротических повреждений гепатоцитов (на 28% по сравнению с контролем) (табл. 15). Объемная плотность синусоидов была снижена незначительно.

Введение тритерпеновых соединений на фоне ПХТ вызывало снижение, по сравнению только с ПХТ, количества гепатоцитов в состоянии некроза. При этом выраженность дистрофических изменений существенно уменьшалась. Указанные положительные сдвиги проявлялись наиболее ярко у мышей, которым вводили Р-алаБК. По данным морфометрического анализа (см. табл. 15), под действием аланиламидного производного БК достоверно снижалась объемная плотность очагов некрозов (на 63%) по сравнению с ПХТ. В группе с введением БК аналогичные сдвиги были незначительными. В обеих группах отмечена тенденция к росту объемной плотности синусоидов (на 28% для Р-алаБК, на 10% для БК).

В отсутствии ПХТ Р-алаБК не оказывал достоверного влияния на объемную плотность очагов некрозов и дистрофий гепатоцитов. По сравнению с ним БК достоверно снижала объемную плотность дистрофически измененных гепатоцитов (на 24%), но не влияла на некробиоз. БК способствовала также увеличению объемной плотности синусоидов.

Представленные данные свидетельствуют о том, что аланиламидное производное БК проявляет заметный гепатопротекторный эффект у мышей со злокачественной лимфомой, который выражается в уменьшении очагов некробиотически поврежденных гепатоцитов. БК на фоне ПХТ не оказывала заметного влияния на печень, хотя в отсутствии цитостатиков и вызывала сдвиги в отдельных показателях.

Результаты, полученные на животных с перевиваемыми опухолями, коррелируют с данными, полученными на модели экспериментальной ПХТ у интактных крыс, которые свидетельствуют о снижении объемной

плотности очагов некрозов и дистрофий гепатоцитов под действием БК и ее аланиламидных производных. Наблюдаемое в условиях ПХТ уменьшение метастатических поражений синусоидов свидетельствует об активации тритерпеноидами апоптоза опухолевых клеток. Обнаруженная у этих соединений способность усиливать повреждение сосудов коррелировала с повышенной инфильтрацией синусоидов полинуклеарами. Возможно ремоделирование выстилки синусоидов связано с воздействием на нее продуктов секреции моноцитарных клеток, таких как цитокины, матриксные металлопротеиназы, коллагеназы, катепсин В (Mantovani А. et al., 2008). Кроме того, нельзя исключить возможность активации под действием три-терпеноидов системы комплимента. Известно, что в результате повышения активности комплимента увеличивается продукция фактора С5а, который стимулирует нейтрофилы. Активированные нейтрофилы, накапливаясь в капиллярах, могут вызывать повреждение эндотелия путем выделения токсичных кислородных метаболитов (Козлов JI.B. и др., 2007).

Данные литературы свидетельствуют о том, что характер структурных и внутриклеточных изменений в тканях, наблюдаемых под действием лупа-новых тритерпеноидов, может быть непосредственно связан с их влиянием на продукцию реактивных кислородных соединений. На примере бетули-новой и некоторых производных олеаноловой кислот было показано, что в низких концентрациях тритерпеноиды оказывают цитопротекторное действие, уменьшая оксидативный стресс в клетках, а в высоких - способствуют накоплению реактивных продуктов окисления (Sporn M.B. et al., 2006; Liby К. et al., 2007). Последнее наблюдение непосредственно связано с механизмом их противоопухолевого действия. Известно, что тритерпеноиды могут стимулировать апоптоз опухолевых клеток через внутренний митохондриальный путь, для которого характерно нарушение проницаемости митохондриальной мембраны с последующим выходом апоптоз-стимулирующих факторов, которые, в свою очередь, сдвигают редокс-баланс в клетке в направлении оксидативного стресса.

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек мышей с перевитой LLC. В почках животных с LLC выявлены преимущественно морфологические изменения проксимальных канальцев в виде умеренно выраженных дегенеративно-некротических изменений эпителиоцитов. Изменения клубочков и интерстициальной ткани были минимальными. В отдельных клубочках выявлялись лишь незначительное расширение мезангиального матрикса и отложения фибрина в виде PAS-позитивной субстанции между петлями капилляров. Выявленные поражения почек у животных с перевитой опухолью (отсутствие метастазов, повреждение сосудов клубочков и интерстициальной ткани, минимальные патологические изменения в канальцах) позволяют сделать заключение о паранеопластическом характере нефропатии.

Введение комплекса цитостатиков по схеме CHOP привело к развитию у мышей тубулоинтерстициального нефрита в сочетании с мембранозной

Экспериментальная группа Эпителиоциты Интерс-тициаль-ная ткань Просвет канальцев

умеренная дистрофия выраженная дистрофия некрозы

LLC 0,54±0,01 0,19±0,02 0,015±0,003 0,14±0,004 0,11±0,01

LLC + ПХТ 0,18±0,015*" 0,49±0,023*** 0,07±0,011** 0,15±0,004 0,12±0,008

LLC + ПХТ + БК 0,50±0,007ш 0,23±0,016ш 0,012±0,005ж 0,12±0,008 0,13±0,009

LLC + ПХТ + МеБК 0,46±0,016### 0,27±0,014и# 0,009±0,004## 0,13±0,007 0,14±0,013

LLC+nXT+ Р-алаБК 0,46±0,009ш 0.19±0,011ш 0,0026±0,001й# 0,14±0,017 0,21±0,012ш

LLC+1TXT+ Ме-р-алаБК 0,42±0,004ш 0,26±0,008ш 0,017±0,003й 0,13±0,004 0,18±0,006s#

LLC+БК 0,46±0,0Г* 0,23±0,018 0,007±0,004 0,14±0,005 0,17±0,004**

LLC+МеБК 0,48±0,007" 0,19±0,018 0±0" 0,14±0,009 0,17±0,004**

LLC+ Р-алаБК 0,50±0,011" 0,22±0,017 0,0023±0,001* 0,11±0,01Г 0,17±0,009*

LLC+ Ме-р-алаБК 0,47±0,006" 0,21±0,011 0,0021±0,001* 0,15±0,011 0,18±0,005**

Примечание. LLC - карцинома легких Льюис (контрольная группа), ПХТ - полихимиотерапия, БК - бетулоновая кислота. *** -р < 0,001; ** -р < 0,01 относительно контроля; т - р < 0,001; т - р < 0,01 относительно ПХТ.

нефропатией. Основные патологические изменения выявлены в эпите-лиоцитах проксимальных канальцев: набухание клеток и фрагментация щеточной каймы, очаговая дистрофия и некрозы эпителиоцитов отдельных канальцев.

По данным морфометрического анализа, относительный объем эпителиоцитов с выраженными дистрофическими изменениями увеличился на 157%, на 77% уменьшилась доля эпителиоцитов со слабо выраженными дистрофическими процессами (табл. 16). На фоне ПХТ на 366% возрастала объемная плотность очагов некрозов эпителиоцитов. В просвете собирательных трубочек определялись гиалиновые цилиндры, в интерсти-циальной ткани развивались умеренное полнокровие и периваскулярный отек. Существенного изменения относительного объема интерстициальной ткани и просвета канальцев при проведении ПХТ не выявлено. ПХТ в данном эксперименте осложняла течение нефропатии и вызывала увеличение дегенеративно-некротических повреждений нефроцитов.

Введение БК, ее метилового эфира и двух Р-аланиламидных производных БК снизило степень альтерации проксимальных канальцев. Отмечено уменьшение объемной плотности эпителиоцитов в состоянии некроза (на

80 - 98%) и выраженной дистрофии (на 54 - 60%). Кроме того, увеличился объем эпителиоцитов с признаками слабо выраженной дегенерации на 170 - 180% (см. табл. 16). Под действием ß-аланиламида БК и его метилового эфира просвет проксимальных канальцев увеличился на 50 - 75% вследствие уменьшения отека эпителиоцитов и щеточной каймы. Наиболее выраженная положительная динамика репаративных процессов наблюдалась на фоне введения ß-аланиламида БК.

В отсутствии ПХТ лупановые тритерпеноиды снижали у мышей выраженность паранеопластической нефропатии. В проксимальных канальцах отмечалось уменьшение в среднем на 56% объемной плотности очагов некрозов эпителицитов (см. табл. 16). Доля эпителиоцитов с мелкокапельной липидной инфильтрацией и фрагментированной щеточной каймой уменьшилась в среднем на 8 - 13% по сравнению с контролем. Во всех группах после введения тритерпеновых соединений отмечалось уменьшение отека эпителиоцитов проксимальных канальцев и щеточной каймы, в результате чего просвет канальцев увеличился на 54%. Кроме того, ß-аланиламид БК несколько уменьшил (на 22%) отек интерстциальной ткани. Следует отметить, что БК и ее производные не оказали заметного влияния на состояние гломерулярного аппарата, где по-прежнему сохранялись утолщение базальной мембраны клубочков и увеличение объема мезангиального матрикса.

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек мышей с перевитой лимфомой RLS. После инокуляции клеток опухоли в почках подопытных животных выявлялись мелкоочаговые метастазы, располагавшиеся в петлях капилляров клубочков, по ходу кровеносных сосудов в корковом веществе, а также в интерстициальной ткани на границе коркового и мозгового вещества. Метастазы были четко отграничены от окружающих тканей. В нефроцитах, эпителиоцитах дистальных, проксимальных канальцев и собирательных трубочек наблюдалось развитие дегенеративных и некротических процессов. Просвет канальцев был расширен и заполнен спущенными клетками, детритом щеточной каймы, фибрином. В интерстициальной ткани отмечался выраженный отек, слабо выраженная инфильтрация мононуклеарами, полнокровие сосудов.

Введение цитостатиков приводило к развитию у мышей тяжелого некротического нефроза, сопровождавшегося увеличением некротических повреждений нефроцитов (на 35% по сравнению с контролем) (табл. 17). Клетки канальцевого эпителия отечные, просвет проксимальных канальцев полностью заполнен некротизированной щеточной каймой и клеточным детритом. Отмечалось незначительное (на 28% по сравнению с контролем) уменьшение объема интерстициальной ткани.

Под влиянием изучаемых соединений, вводимых на фоне ПХТ, снижалась выраженность повреждений почек за счет уменьшения очагов некроза и отека интерстициальной ткани. Отмеченные сдвиги наиболее ярко проявлялились при введении амида БК. В этой группе животных до-

Группа Дистрофические изменения канальцевого эпителия Некротические изменения канальцевого эпителия Просвет канальцев Интерсти-циальная ткань

RLS (контроль) 49,0± 1,08 17,0±3,5 14,0±0,7 10,0±1,0

RLS + ПХТ 49, 0±3,2 23,0±6,5 14,0±0,4 7,2±1,5

RLS + ПХТ + БК 56, 0±3,6 17,0±4,8 16,0±1,2 4,9±1,1

RLS + ПХТ + ß-алаБК 75,0±1,5*# 4,0±0,4*# 8,0±0,4* 6,8±0,5*#

RLS + БК 58,0±6,6 22,0±4,6 12,0±1,7 6,6±0,3

RLS + ß-алаБК 67,0± 4,2* 8,0±1,09* 10,0±0,7* 6,7±0,9

Примечание. БК - бетулоновая кислота, Р-алаБК - амид бетулоновой кислоты, ПХТ - полихимиотерапия.* - р < 0,05 относительно контроля; # - р < 0,05 относительно ПХТ.

стоверно снижалось (на 77%) количество некротизированных нефроцитов и возрастало (на 53%) количество клеток со слабо выраженной дистрофией по сравнению с ПХТ. Введение амида БК вызывало также уменьшение на 43% объемной плотности просвета канальцев.

В отсутствии ПХТ амид БК проявлял значимый, хотя и менее выраженный, чем в комбинации с цитостатйками, нефропротекторный эффект. У животных этой группы снижение объемной плотности очагов некрозов канальцевого эпителия составило 53%, а увеличение объемной плотности клеток со слабо выраженной гиалиново-капельной дистрофией - 37% по сравнению с контролем; объемная плотность просветов канальцев уменьшилась на 29%. Введение БК мышам с лимфомой в тех же условиях приводило к незначительным однонаправленным изменениям показателей объемной плотности зон дистрофических нарушений, просвета канальцев и интерстициальной ткани. Обращает на себя внимание увеличение количества некротических повреждений нефроцитов в этой группе животных.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что изучаемые тритерпе-ноиды снижают тяжесть повреждений почек мышей со злокачественной лимфомой, вызванных ПХТ, путем уменьшения дегенеративно-некротических изменений нефроцитов, отека интерстициальной ткани и просвета канальцев. (З-Аланиламид БК обладает выраженным нефропротективным действием, уменьшая степень некробиоза нефроцитов как на фоне ПХТ, так и без нее. БК в тех же условиях не оказывала значимого эффекта.

Влияние тритерпеноидов на показатели белой крови и костного мозга у мышей с перевиваемыми опухолями. Через 8 сут после ПХТ в лейкоцитарном профиле крови мышей с LLC выявлено достоверное увеличение общего количества лейкоцитов (в 1,5 раза), в том числе

палочкоядерных нейтрофилов (в 1,8 раза). Повышение числа юных по-лиморфноядерных лейкоцитов, а также появление их предшественников метамиелоцитов свидетельствует о сдвиге лейкоцитарной формулы влево и может быть связано с активацией воспаления, вызванного некротиза-цией опухолевого узла под действием цитостатиков. На фоне увеличения общей клеточности белой крови отмечено угнетение ее лимфоцитарного ростка (в 1,5 раза), что свидетельствует о серьезных нарушениях процессов дифференцировки и созревания предшественников лимфоцитов в костном мозге и тимусе.

Введение БК и ее производных на фоне ПХТ не оказало влияния на выраженность лимфопении и сдвиги в соотношении полиморфноядерных гранулоцитов. Однако БК, в отличие от остальных тритерпеноидов, достоверно усиливала (в 1,4 раза) лейкоцитоз крови по сравнению с ПХТ. Ее метиловый эфир и оба аланиламида, напротив, снижали общее количество лейкоцитов. При этом для всех производных БК было характерно увеличение количества моноцитов в крови более чем в 2 раза относительно контроля. Максимальная выраженность моноцитоза отмечена для р-алани-ламида БК, который значимо повышал данный показатель относительно ПХТ (в 1,9 раза).

Характер сдвигов в лейкоцитарном профиле крови мышей указывает на то, что р-аланиламид БК и в меньшей степени метиловые эфиры сохраняют модулирующее влияние на общую численность клеток белой крови, при этом у них отмечается стимулирующее влияние на моноциты крови. В условиях неопластического процесса и цитотоксического воздействия эти сдвиги могут быть направлены на снижение выраженности альтерагивных процессов в тканях за счет регуляции макрофагами синтеза секретируемых продуктов эффекгорными клетками, участвующими в иммунном ответе и воспалении. Лейкоцитоз, вызванный БК на фоне ПХТ, свидетельствует об усилении воспалительных процессов в тканях.

Изменения в лейкоцитарной формуле крови животных с лимфомой RLS через 8 сут после ПХТ отражали те же тенденции, которые были отмечены выше у мышей с LLC. Это выражалось в сдвиге формулы влево, развитии моноцитоза и небольшой лимфопении. Введение БК и ее р-аланиламида не вызвало достоверного изменения этих показателей по отношению к группе ПХТ, однако привело дополнительно к снижению количества эозинофилов по сравнению с контролем.

Анализ миелограммы животных с LLC свидетельствовал о продолжительном угнетении под действием ПХТ эритроидного и мегакариоцитар-ного ростков в костном мозге. Количество эритробластов по сравнению с контролем значимо снижалось (в 1,4 раза), прежде всего за счет менее зрелых негемоглобинизированных форм (в 1,5 раза против контроля). В этих условиях БК и ее производные усиливали негативное влияние цитостатиков на эритрон, вызывая значимое уменьшение количества эритробластов относительно ПХТ. Через 8 сут после проведения ПХТ

состояние гранулоцитарного звена костномозгового кроветворения у животных с LLC характеризовалось небольшим снижением низкодиффе-ренцированных форм и таким же повышением зрелых форм метамиело-цитов относительно соответствующих показателей в контроле. Ведение БК на фоне ПХТ не изменило показателей гранулоцитопоэза, тогда как ее производные вызвали значимое повышение количества зрелых лейкоцитов относительно группы ПХТ, а ß-аланиламид БК также увеличивал продукцию незрелых миелоцитов. Клеточность эозинофилов, лимфоцитов и моноцитов достоверно не отличалась от контроля. Следует отметить, что на фоне ПХТ лишь БК и ее ß-аланиламид достоверно увеличивали индексы созревания эритроцитов, а последний дополнительно повышал и индекс созревания гранулоцитов, что можно рассматривать как стимуляцию дифференцировки этих клеточных элементов гемопоэза.

Проведение ПХТ мышам с лимфмой RLS, так же как и у животных с LLC, привело к существенному снижению (почти в 1,5 раза) числа эритроб-ластов в костном мозге, особенно их более ранних форм. Введение обоих тритерпеноидов усиливало негативный эффект цитостатиков на красный росток крови, вызывая дальнейшее двукратное снижение клеточности эритрона относительно ПХТ. Аналогичный синергизм с цитостатиками проявлялся у БК и ее амида в отношении лейкоцитарного звена гемопоэза. Оба агента достоверно увеличивали продукцию предшественников гранулоцитов, а также несколько повышали общее количество лейкоцитов относительно ПХТ. Введение тритерпеноидов в постцитостатическом периоде животным с RLS не оказывало достоверного влияния на другие лейкоцитарные клетки, хотя следует отметить тенденцию к повышению количества плазматических клеток в 3 и 6,5 раз и снижению моноцитоза в 2,4 и 2 раза под влиянием соответственно БК и ее ß-аланиламида.

Данные индексов созревания клеток костного мозга у мышей с лимфо-мой RLS, подвергавшихся воздействию цитостатиков и тритерпеноидов, подтверждают стимулирующее влияние БК и ее ß-аланиламида в основном на гранулоцитарно-моноцитарный росток крови.

Стимулирующее влияние тритерпеноидов на дифференцировку гра-нулоцитарно-макрофагальных предшественников отмечают другие исследователи (Koschmieder S. et al., 2007). Показано, что обработка клеток костного мозга больных миелоидной лейкемией тритерпеноидом олеана-нового типа (CDDO) вызывала признаки повышения дифференцировки гранулоцитов и моноцитов: увеличение ядерно-цитоплазматического отношения, ядерной сегментации и уменьшение степени базофильности цитоплазмы. Эти же авторы сообщили о том, что повышение дифференцировки и фагоцитарной активности гранулоцитов и макрофагов достигается независимо от апоптозиндуцирующего действия CDDO и в дозах существенно меньших.

Антиоксидантное действие тритерпеноидов на фоне ПХТ. Развитие окислительного стресса является неспецифическим осложнением опухоле-

150

100

Карцинома легких Льюис

Лимфома RLS

.cv

X vV

«SV

Влияние тритерпеноидов на уровень вторичных продуктов перекисного окисления (ТБКАС) в сыворотке крови мышей с карциномой легких Льюис и лимфомой RLS в конце периода введения агентов.

вого процесса и цитостатической химиотерапии. Способность лупановых производных снижать его интенсивность определяли по концентрации в крови ТБК-активных соединений - маркера вторичных продуктов окисления. У мышей с LLC, получавших ПХТ, концентрация ТБКАС была повышена в 5 - 6 раз относительно интактных животных (рисунок).

Введение БК и ее ß-аланиламидных производных уменьшало данный показатель соответственно в 2,7 и 4 раза, под действием пиперазиновых производных 0f-40 и Of-41 концентрация ТБКАС снижалась в 1,8 и 2,5 раз. Агент Of-15 и производное бетулина Of-3 в тех же условиях не проявляли антиоксидантного эффекта у мышей с карциномой Льюис, однако у животных с лимфомой RLS они уменьшали выраженность окислительного стресса в постцитостатическом периоде в 3,5 и 1,5 раза соответственно. На фоне лимфомы ß-аланиламид БК вызвал более чем двукратное падение ТБКАС относительно группы ПХТ.

В то же время под действием изученных тритерпеноидов не наблюдалось достоверного снижения уровней АЛТ и ACT в крови животных-опухоленосителей, получавших ПХТ. Высокий уровень трансаминаз можно рассматривать как результат интенсивного цитолиза вследствие некротических процессов в опухоли и других тканях, а также нарушений в метаболическом статусе клеток в терминальной фазе развития опухоли.

Таким образом, у производных лупана выявлена способность снижать интенсивность перекисного окисления в условиях цитостатической ПХТ.

Влияние лупановых тритерпеноидов на противоопухолевый эффект ПХТ. Наблюдения за динамикой роста трансплантатов LLC во время введения лупановых производных показало, что они не стимулируют опухолевый рост на фоне ПХТ. У протестированных соединений - алани-ламидных и пиперазиновых производных БК, ее диоксиимино метилового эфира и диникотината бетулина - не зафиксировано случаев достоверного увеличения объема опухолевых узлов в период введения агентов вслед за ПХТ. Кроме того, у некоторых из этих агентов была выявлена способность потенцировать противоопухолевый эффект самой химиотерапии.

Введение а-аланиламида БК и его метилового эфира на фоне ПХТ привело к усилению цитостатического эффекта химиопрепаратов с сохранением высокой противоопухолевой активности в конце периода введения. Противоопухолевое действие ПХТ максимально потенцировалось к 6-м суткам введения амида, содержащего фрагмент а-аланина, при этом размеры опухолевых узлов уменьшались почти в 1,5 раза по сравнению с ПХТ. У его метилового эфира достоверный противоопухолевый эффект на фоне ПХТ проявлялся в конце опыта.

Р-Аланиламид и диникотинат бетулина уже через 2 сут достоверно повышали противоопухолевую эффективность ПХТ и сохраняли ее до конца введения. Индекс торможения роста опухоли в этих группах вырос соответственно в 1,3 и 1,5 раза. Диоксиимино метиловый эфир БК в первые 4 сут потенцировал эффект ПХТ в 1,6 раз, затем его вклад уменьшался. В то же время у мышей, которым в постцитостатическом периоде вводили БК и ее метиловый эфир, изменений в активности цитостатиков не обнаружено. Метиловые эфиры Р-аланиламида и пиперазинового производного БК также не оказывали влияния на активность противоопухолевой терапии, а сульфопроизводное БК достоверно уменьшало противоопухолевое действие ПХТ.

В условиях злокачественной лимфомы р-аланиламид и диоксиимино метиловый эфир БК, а также диникотинат бетулина подтвердили свою способность увеличивать противоопухолевый потенциал цитостатической химиотерапии. Торможение роста опухоли на 7-е сутки повышалось соответственно в 1,7,1,7 и 1,3 раз. БК в этом случае также проявляла потенцирующий эффект, повышая в 1,3 раза индекс торможения роста опухоли.

Влияние тритерпеноидов на антиметастатический эффект ПХТ. Анализ показателей метастазирования карциномы легких Льюис выявил высокую антиметастатическую активность самой цитостатической химиотерапии. Во всех группах с введением цитостатических препаратов наблюдалось существенное (в 3,8 - 7,5 раз) снижение объемной и поверхностной плотностей метастазов в легких относительно контроля.

Введение лупановых соединений на фоне ПХТ оказывало различное влияние на ее антиметастатический потенциал. р-Аланиламид и его метиловый эфир повышали эффективность химиотерапии LLC путем снижения объемной плотности метастатических поражений, а р-аланиламид еще и

частоты метастазирования в легких. В результате ИИМ в этих группах повышался в 1,4 и 1,2 раза относительно эффекта ПХТ.

Введение а-аланиламидных производных вызывало незначительное снижение антиметастатического потенциала ПХТ, выражавшееся в увеличении площади метастатических поражений и частоты метастазирования. Однако эти изменения не были статистически достоверными и не привели к существенному изменению ИИМ, который оставался высоким благодаря значительной разнице показателей объемной плотности метастазов в этих группах по сравнению с контрольной.

Влияние БК и ее сульфона- и метилпиперазинового производных на показатели метастазирования ПХТ выражалось в увеличении объемной плотности метастазов LLC соответственно в 3,4, 3,4 и 1,2 раза и частоты метастазирования в 1,6 - 1,7 раз по сравнению с ПХТ. В случае метилпиперазинового производного снижение ИИМ составило 1,1 раза, тогда как под действием сульфопроизводного БК величина ИММ уменьшилась в 2, а под влиянием БК - в 7 раз по отношению к ПХТ. Введение агента Of-41 на фоне ПХТ не приводило к существенным изменениям ее антиметастатического эффекта, в отличие от его аналога 0f-40 и БК, которые заметно снижали этот эффект.

ВЫВОДЫ

1. Бетулоновая кислота и ее производные с аланиламидными, диок-сидииминовым, метилпиперазиновым заместителями, а также никотинат бетулина являются перспективными агентами-модификаторами биологических реакций с политаргетным механизмом, в котором сочетаются цитопротекторное действие на неповрежденные клетки и цитотоксическое

- на неопластические. Цитопротекторные свойства реализуются через противовоспалительную и антиоксидантную активность, цитотоксические

- через стимуляцию сигнальных тгутей некроза и апоптоза.

2. При моделировании циклофосфановых поражений р-аланиламид в отличие от бетулоновой кислоты оказывает корригирующее влияние на массу тимуса, селезенки, печени, почек и легких. Оба тритерпеноида модулируют содержание нейтрофилов и мононуклеаров в периферической крови. При воспроизведении доксорубициновых повреждений Р-аланиламид и бетулоновая кислота вызывают коррекцию массы тимуса и содержания лейкоцитов в периферической крови.

процессов (субплазмалеммальной вакуолизации цитоплазмы), появлении некробиотически измененных гепатоцитов и эндотелиоцитов. Амид бетулоновой кислоты модифицирует тонкую структуру митохондрий (появление крупных органелл с разреженным матриксом и неравномерно расширенными кристами). Стимулирующее влияние бетулоновой кислоты и ее амида на гепатоциты, эндотелиоциты и клетки Купфера (моноциты) проявляется в виде усиления их эндоцитозной (пиноцитозной) активности. В синусоидальной выстилке доминируют функционально активные формы эндотелиоцитов и клеток Купфера.

4. При изолированном введении бетулоновая кислота и ее (З-аланила-мид вызывают сходные с цитостатиками (циклофосфаном и доксорубици-ном), но менее выраженные изменения ультраструктуры отдельных кар-диомиоцитов. К таким изменениям относятся лизис саркоплазматического матрикса, особенно в околоядерной зоне, умеренный лизис миофибрил-лярных пучков, умеренные расширения межмембранного околоядерного пространства и цистерн агранулярной саркоплазматической сети. Амид бетулоновой кислоты вызывает также значительные изменения тонкой структуры митохондрий (диффузный лизис митохондриального матрикса, редукцию крист и нарушение их упаковки).

5. Бетулоновая кислота и ее р-аланиламид, вводимые на фоне цитоста-тиков (циклофосфамида и доксорубицина), проявляют политаргетное действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты си-нусоидов, клетки Купфера) и миокарда (кардиомиоциты и эндотелиоциты), потенцируя цитотоксическое действие цитостатиков в отношении одних клеток и стимулируя регенераторные реакции-в других. Восстановление ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов при комбинированном применении цитостатиков и тритерпеноидов происходит быстрее. В ге-патоцитах последовательное применение цитостатиков и тритерпеноидов активизирует эндоцитозную и трансцитозную активность и способствует сохранению гладкой цитоплазматической сети. В кардиомиоцитах тритер-пеноиды также активизируют эндоцитозную активность и стимулируют процессы внутриклеточной регенерации (появление многочисленных полисом в участках лизиса миофибрилл).

6. К общецитологическим цитопротекторным свойствам бетулоновой кислоты и ее (3-аланиламида как при изолированном, так и комбинированным с цитостатиками применении относится их способность усиливать эндоцитозную (пиноцитозную) активность клеток и стимулировать в них процессы внутриклеточной регенерации. Оба агента не подавляют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов. К общецитологическим цитотоксическим свойствам обоих тритерпеноидов относится их способность вызывать умеренные литические изменения цитоплазматического матрикса, деструктивные изменения органелл и усиление аутофагических процессов. Амид бетулоновой кислоты вызывает однотипную модификацию ультраструктуры митохондрий в разных

клетках - увеличение размеров органелл, разрыхление их матрикса и расширение крист.

7. При моделировании полихимиотерапии CHOP на здоровых животных корректорный эффект тритерпеноидов выражается в ослаблении ее угнетающего эффекта на тимус и более раннем восстановлении костномозгового кроветворения. Регулирующее влияние агентов направлено преимущественно на клетки моноцитарного, а не гранулоцитарного ряда. Под действием тритерпеноидов происходит коррекция цитотоксических повреждений в печени и почках: снижение некробиотических повреждений гепатоцитов и эпителиоцитов извитых канальцев, улучшение микроциркуляции, повышение пластических резервов.

8. Курсовое внутрижелудочное введение мышам-опухоленосителям а-аланиламида бетулоновой кислоты, его метилового эфира, (3-аланила-мида, диоксииминометилового эфира бетулоновой кислоты и диникоти-ната бетулина повышает противоопухолевый эффект полихимиотерапии CHOP. Выраженность эффекта зависит от вида перевиваемой опухоли. Производные с а-аланиламидным и метилпиперазиновым заместителем не стимулируют диссеминацию опухоли на фоне полихимиотерапии; р-аланиламид и его метиловый эфир повышают антиметастатическую эффективность CHOP.

9. Введение Р-аланиламидных производных бетулоновой кислоты мышам с перевиваемыми опухолями на фоне полихимиотерапии уменьшает выраженность лейкоцитоза и стимулирует моноцитарное звено периферической крови.

10. Курсовое введение бетулоновой кислоты, ее метилового эфира и Р-аланиламидных производных на стадии прогрессии опухоли существенно подавляет ее диссеминацию в печени; бетулоновая кислота уменьшает выраженность дистрофических изменений гепатоцитов, а Р-аланиламид - усиливает дегенеративные изменения гепатоцитов. На фоне полихимиотерапии CHOP бетулоновая кислота и ее р-аланиламид снижают выраженность дистрофических изменений гепатоцитов и уменьшают объемную плотность очагов некроза гепатоцитов по сравнению с полихимиотерапией. Эфирные производные не обладают выраженным гепатопротекторным эффектом.

И. Бетулоновая, [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовая кислоты и их метиловые эфиры проявляют нефропротективные свойства как на фоне полихимиотерапии, так и без ее воздействия. Все исследуемые тритерпеноиды обладают способностью уменьшать на фоне полихимиотерапии степень деструктивно-некротических процессов только в канальцах почек.

12. Бетулоновая кислота, ее р-аланиламидные и пиперазиновые производные, а также диоксииминометиловый эфир бетулоновой кислоты и диникотинат бетулина понижают интенсивность перекисного окисления в условиях цитостатической полихимиотерапии.

13. Бетулоновая кислота является новой перспективной тритерпеноид-ной платформой для синтеза соединений с высокой гепатопротекторной, кардиопротекторной, нефропротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и противоопухолевой активностью. [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовая кислота предложена для доклинических испытаний в качестве корректора цитостатической химиотерапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г, Бубнова Е.Б., Петренко Н.И., Шульц Э.Э. Изучение антиоксидантных свойств производных бетулоновой кислоты на модели острого токсического гепатита // Научный вестник Тюменской медицинской академии. - 2003. - № 1. - С. 60 - 62.

2. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Бубнова Е.Б., Петренко Н.И., Шульц Э.Э. Антиоксидантные свойства амидов бетулоновой кислоты // Материалы 2-го съезда Рос. науч. общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии». -М., 2003. — Ч. 1.-С. 186.

3. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Узенкова Н.В., Грек O.P., Позднякова C.B., Толстиков Г. А. Бетулоновая кислота и ее производные — новая группа агентов, снижающих побочное действие цитостатиков // Доклады академии наук. - 2004. — Т. 399, № 2. — С. 274 - 277.

4. Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Zhtsukova N.A., Petrenko N.I., Shults E.E., UzenkovaN.V., Grek O.R., Poszdnjakova S.V., Tolstikov G.A. Betulonic acid and its derivatives - a new group of agents reducing side effects of cytostatic drugs // Doklady Biological Science. - 2004. - Vol. 399. - P. 434 - 437.

5. Августинович Д.Ф., Коваленко И.Л., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Толстиков А.Г. Этологическое исследование антидепрессивного эффекта флуоглизина в условиях хронического социального стресса у мышей // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2004. - Т. 137, № 1. - С. 99 - 103.

6. Коваленко И.Л., Августинович Д.Ф., Сорокина. И.В., Толстикова Т.Г., Толстиков А.Г. Влияние хронического введения флуоглизина на биохимические показатели крови у мышей, находящихся в условиях социального стресса // Вопр. биол. мед. фарм. химии. - 2004. — № 11. — С. 44 - 47.

7. Толстиков А.Г., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Долгих М.П., Толстиков Г.А., Федосеева Л.А. Лекарственное средство для лечения различных форм депрессий «флуоглизин». Патент РФ № 2232574, Бюл. №20 от 12.10.2004.

8. Сорокина И.В., Бубнова Е.Б., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Узенкова Н.В., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Позднякова C.B., Грек O.P. Коррекция побочных эффектов цитостатической полихимиотерапии аланиламидными производными бетулоновой кислоты // Материалы XII международн. конф. «Медицина XXI века». - Словакия, Низкие Татры, 2004. - С. 21 - 22.

9. Сорокина И.В., Жукова Н.А., Волкова Е.Б., Толстикова Т.Г., Шульц Э.Э., Позднякова С.В., Грек О.Р. Новые пептидные производные бетулоновой кислоты

- корректоры токсических эффектов цитостатиков // Материалы Всерос. конф. «Химия и технология растительных веществ». - Саратов, 2004. - С. 161 - 163.

10. Жукова Н.А., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Шульц Э.Э., Позднякова С.В., Грек О.Р., Николин В.П., Каледин В.И., Попова Н.А. [ 3-оксо-20(29)-лупен-28-ошт]-3-амино-пропионовая кислота - новое производное бетулоновой кислоты с противовопухолевой активностью // Материалы международ, конф. и дискуссионного науч. клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Украина, Ялта-Гурзуф, 2004. - С. 20.

11. Позднякова С.В., Грек О.Р., Сорокина И.В., Жукова Н.А., Волкова Е.Б., Толстикова Т.Г., Попова Н.А., Каледин В.И., Николин В.П. Бетулоновая кислота и ее аланиламидные производные - перспективные органопротекторы // Науч-но-практич. конф. с междунар. участием «Медицина и образование в XXI веке».

- Новосибирск: Сибмедиздат, 2004. - С. 385 - 386.

12. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Грек О.Р., Попова Н.А., Каледин В.И., Николин В.П. Разработка новых агентов на основе аминокислотных производных бетулоновой кислоты для лечения социально значимых заболеваний // Всероссийская научно-практ. конф. с международ участием «Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально значимых заболеваниях».' - Новосибирск, 2004. - С. 158 - 159.

13. VolkovaE.B., ZhukovaN.A., Sorokina I.V., TolstikovaT.G. etal. The influence of betulonic acid and its amides on blood and bone marrow values in postcytostatic period // ICNPAS. 3rd EAHM-2004, «Heterocycles in Organic and Combinatorial Chemistry». - Novosibirsk, 2004. - P. 122.

14. Sidorova O.S., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Zhogol R.A., Sharapov V.I. Study of antioxidantive properties of new phytocomplex, obtained from bark of larch // ICNPAS. 3rd EAHM-2004, «Heterocycles in Organic and Combinatorial Chemistry».

- Novosibirsk, 2004. - P. 110.

15. Жукова H.A., Семенов Д.Е., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Позднякова С.В., Грек О. Р. Влияние бетулоновой кислоты и ее производного [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовой кислоты на структуру печени мышей с лимфосаркомой RLS // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2005. - Т. 140, № 9. - С. 348 -351.

16. Грек О.Р., Позднякова С.В., Надеев А.П., Пронин B.C., Жукова Н.А., Сорокина И.В., Волкова Е.Б., Толстикова Т.Г. Эффективность бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных при восстановлении паренхимы печени крыс в постцитостатический период // Эксперим. клин, фармакол. - 2005. -Т. 68, № 6.-С. 49-51.

17. Брызгалов А.О., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Жукова Н.А., Волкова Е.Б., Долгих М.П. Антиаритмическая активность аллаглизина // Эксперим. клин, фармакол. - 2005. - Т. 68, № 4. - С. 24 - 28.

18. Позднякова С.В., Грек О.Р., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Попова Н.А, Каледин В.И., Николин В.П. Бетулоновая кислота и аланинамидное

производное - перспективные органопротекторы при химиотерапии опухоли // Журн. эксперим. клин. мед. - 2005. - № 4. - С. 53 - 59.

19. ТолстиковаТ.Г., Брызгалов А.О., Сорокина И.В., Морозова Е.А., Толстиков С.Е., Альфонсов A.B., Толстиков А.Г. Стевиозид - новый стимулятор эффекта клатрирования фармаконов гликозидами // Доклады академии наук. - 2005. — Т. 403, № 2. - С. 274 - 276.

20. TolstikovaT.G., Bryzgalov А.О., Sorokina I.V., Tolstikov S.E, Kovalenko I.L., Avgustinovich D.F. New approach to development of low-dose CNS-active drug // J. European Neuropsychopharmacology (Abstr. 8th ECNP Regional Meeting). - Moscow, 2005.-Vol. 15.-S. 125.

21. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Волкова Е.Б., Шульц Э.Э., Петренко Н.И., Позднякова C.B., Грек O.P. Поиск противовирусных и противоопухолевых агентов в ряду аминокислотных производных бетулоновой кислоты // Материалы международн. симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». - Тюмень, 2005. - С. 161 - 162.

22. Жоголь P.A., Шарапов В.И., Грек O.P., Позднякова C.B., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В. Влияние бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных на процессы перекисного окисления липидов в гомогенате и микросомах печени // Материалы международн. симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». — Тюмень, 2005. - С. 117-119.

23. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Жукова H.A., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Новые корректоры токсических эффектов цитостатической полихимиотерапии на основе бетулоновой кислоты // Материалы конф. «Перспективы развития биотехнологии в России», Медбиотек-2. - Пущино, 2005. - С. 40 - 43.

24. Zhukova N.A., Semenov D.E., Sorokinal.V., Tolstikova T.G., Pozdnyakova S.V., Grek O.R. Effect of betulonic acid and its derivative [3-Oxo-20(29)-lupene-28-0-yl]-3]amino-propionic acid on liver structure in mice with RLS lymphoma // Bull. Exper. Biol. Med. -2005. -Vol. 140, № 3. -P. 361 -364.

25. Бабкин В.А., Остроухова JI.А., Малков Ю. А., Иванова H.B., Иванова С.З., Бабкин Д.В., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Долгих М.П., Толстиков Г.А. Новый комплекс биологически активных соединений из коры лиственницы - Пикнолар. Патент РФ № 2252028, Бюл. №14 от 20.05.2005.

26. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Шульц Э.Э., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Попова H.A. Оценка противоопухолевой и антиметастатической активности амидов бетулоновой кислоты на мышах с перевиваемой карциномой Льюис // Бюл. экспер. биол. - 2006. - Т. 142, № 7. - С. 78 - 81.

27. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г. А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. Терпеноиды ряда лупана как перспективные для медицины биологически активные агенты. Часть 1. Нативные производные лупана. Обзор // Биоорганическая химия. - 2006. - Т. 32, № 1. - С. 42 - 55.

28. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. Терпеноиды ряда лупана как перспективные для медицины биологически активные агенты. Часть 2. Полусинтетические производные лупана. Обзор // Биоорганическая химия. - 2006. - № 3. - С. 291 - 307.

29. Сорокина И.В., Жукова H.A., Толстикова Т.Г., Позднякова C.B., Грек O.P., Попова H.A., Каледин В.И., Николин В.П. Изучение влияния бетулоновой кислоты и ее амидных производных на рост и метастазирование перевиваемых опухолей у мышей // Вопр. биол. мед. фарм. химии. -2006. -№ I. - С. 29-31.

30. Позднякова C.B., Грек О. Р., Жоголь P.A., Шарапов И.В., Шарапов В.И., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В. Активность монооксигеназ печени и биологические эффекты бетулоновой кислоты и ее амидных производных // Вестник НГУ. Серия: биология, клиническая медицина. - 2006. - Т. 4, вып. 3. - С. 66 - 70.

31. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Брызгалов А.О., Долгих М.П., Лифшиц Г.И., Хвостов М.В. Использование нового подхода комплексообразования известных лекарственных препаратов с растительными гликозидами в профилактике и купировании острых гипертензивных состояний (экспериментальное исследование) // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2006. - № 1. - С. 55-58.

32. Баев Д.С., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Рутман М.Ю., Лукина Е.С., Понеделькина И.Ю. Противовоспалительная активность модифицированных гликозаминогликанов // Биомедицина. - 2006. - № 4. - С. 74 - 76.

33. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Брызгалов А.О., Лифшиц Г.И., Хвостов М.В. Использование подхода комплексообразования с глицирризиновой кислотой для создания новых кардиотропных средств // Биомедицина. - 2006. - № 4.-С. 115-117.

34. Жукова H.A., Семенов Д.Е., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Позднякова C.B., Грек O.P. Влияние производных бетулина на структуру почки при лимфоме RLS // Сиб. науч. вестн. - 2006. - Вып. XI. - С.49 -51.

35. Позднякова C.B., Грек O.P., Жоголь P.A., Шарапов И.В., Шарапов В.И., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Аланинамидные производные бетулоновой кислоты в лечении органотоксического действия цитостатиков // Сибирский консилиум.

- 2006. - № 3 (50). - С. 90 - 93.

36. Грек O.P., Позднякова C.B., Жоголь P.A., Шарапов И.В., Шарапов В.И., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Аланинамидные производные бетулоновой кислоты - новые индукторы монооксигеназной системы печени // Бюл. сибирской медицины. Приложение 2. - 2006. - Т. 5. - С. 63 - 65.

37. Позднякова C.B., Грек О. Р., Фунтиков A.C., Жукова H.A., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Сравнительное изучение нефропротективной активности бетулоновой кислоты и её производных при экспериментальной полихимиотерапии //Журн. экспер. клин. мед. -2006. - № 1 -2. - С. 15 - 17.

38. Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Zhukova N.A., Petrenko N.I., Uzenkova N.V., Shul'ts E.E., Popova N.A. Antitumor and Antimetastatic Effects of Betulonic Acid Amides in Mice with Transplantable Lewis Carcinoma // Bull. Exper. Biol. Med.

- 2006. -Vol. 142, № 1. - P. 69 - 72.

39. Bryzgalov A.O., Dolgikh M.P., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Sedova V.F., Shkurko O.P. Antiarrhythymic activity of 4,6-di(het)aiyl-5-nitro-3,4-dihydropyrimidin-(lH)-2-ones and its effects on arterial pressure in rats // Bioorganic&Medicinal Chemisrty Letters. - 2006. - № 16.-P. 1418-1420.

40. Shishkina G.T., Dygalo N.N., Yudina A.M., Kalinina T.S., Tolstikova T.G., Sorokina I. V., Kovalenko I.L., Anikina L. V. The effects of fluoxetine and its complexes" with glycyrrhizic acid on behavior in rats and brain monoamine levels // Neuroscience and Behavioral Physiology. - 2006. - Vol. 36, N 4. - P. 329 - 333.

41. Лушникова Е.Л., Толстикова Т.Г., Непомнящих Л.М., Клинникова М.Г., Молодых О.П., Свиридов Е.А., Сорокина И.В., Жукова Н.А. Численность карди-омиоцитов в миокарде крыс при воздействии на организм агентов с противоопухолевой активностью - циклофосфана и тритерпеноидов // Бюл. экспер. биол.

- 2007. - Т. 144, № 9. - С. 331 - 337.

42. Позднякова С.В., Грек О. Р., Фунтиков А.С., Данильчева Т.В., Жукова Н.А., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Нефропротективный эффект производных бетулоновой кислоты при экспериментальном цитостатическом повреждении почек у крыс // Бюл. СО РАМН. - 2007. - Т. 127, № 5. - С. 117 - 121.

43. Толстикова Т.Г., Брызгалов А.А., Сорокина И.В., Долгих М.П., Шульц Э.Э., Осадчий С.А., Толстиков Г.А. Солеобразование с бромистоводородной кислотой как фактор, определяющий антиаритмическое действие производных лаппаконитина // Доклады академии наук. - 2007. - Т. 415, № 6. - С. 837 - 839.

44. Tolstikova T.G., Bryzgalov А.О., Sorokina I.V., Hvostov M.V., Ratushnyak A.S., Zapara T.A., Simonova O.G. Increase in Pharmacological activity of drugs in their clathrates with plant glycosides // Letters in Drug Design &Discovery. - 2007.

- N 4. — P. 168- 173.

45. Лушникова Е.Л., Толстикова Т.Г., Клинникова М.Г., Молодых О.П., Свиридов Е.А., Сорокина И.В. Морфологический анализ миокарда при воздействии на организм веществ с противоопухолевыми свойствами // Сиб. науч. вестник. -2007.-Вып. X.-С. 27-31.

46. Баев Д.С., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Веров Д.С., Флехтер О.Б. Новые производные бетулоновой кислоты с антиоксидантной и противоопухолевой активностью // Материалы III Всерос. науч. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». Книга 2.

- Барнаул, 2007. - С. 78 - 82.

47. Lushnikova E.L., Tolstikova T.G., Nepomnyashchikh L.M., Klinnikova M.G., Molodykh O.P., Sviridov E.A., Sorokina I.V., Zhukova N.A. Cardiomyocyte Count in Rat Myocardium under the Effect of Antitumor Agents Cyclophosphamide and Triterpenoids // Bull. Exp. Biol. Med. - 2007. - Vol. 144, № 3. - P. 355 - 361.

48. Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Baev D.C., Zhukova N.A., Shults E.E., Kharitonov Yu.V. A new antioxidant of labdantype with hepatoprotective and hemostimulative activity // III Inter. Conf. «Basic Science for Medicine». -Novosibirsk, 2007.-P. 175.

49. Позднякова C.B., Грек О.P., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Гематопро-текторные эффекты бетулоновой кислоты и её аланинамидных производных в условиях цитостатической гемодепрессии у крыс // Психофармакология и биологическая наркология: Материалы III съезда фармакологов России. - СПб, 2007. -Т. 7.-Ч. 2.-С. 1900- 1901.

50. Шарапов И.В., Позднякова С.В., Грек О.Р., Жоголь P.A., Шарапов В.И., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В. Влияние длительного введения бетулоновой кислоты и ее амидов на активность монооксигеназной системы печени крыс // Психофармакология и биологическая наркология. Материалы III съезда фармакологов России. - СПб, 2007. - Т. 7. - Ч. 2. - С. 2013.

51. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Баев Д.С., Петренко Н.И., Шульц Э.Э. Аланинамидные производные бетулоновой кислоты - перспективные корректоры цитостатической полихимиотерапии опухолей // Материалы II международн. конф. «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений». - Алматы, Казахстан, 2007. - С. 92.

52. Харитонов Ю.В., Шульц Э.Э., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Баев Д.С., Жукова H.A., Толстиков Г.А. Антиоксидант, обладающий гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью. Патент RU № 2364599 С2 от 23.08.2007.

53. Харитонов Ю.В., Сорокина И.В., Шульц Э.Э., Толстикова Т.Г., Баева Д.С., Жукова H.A., Толстиков Г.А. 16-{2-Бензоиламино-2-[3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)алкилкарбамоил]винил} -лабдатриены с антиоксидантными, гепатопротекгорными и гемостимулирующими свойствами. Патент RU № 2346940 С1 от 23.08.2007.

54. Харитонов Ю.В., Шульц Э.Э., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Баев Д.С., Жукова H.A., Толстиков Г.А. (2)-Метил-16-(5-оксо-2-фенилоксазол-4-илиденме-тил)-15,16-эпокси-8( 17), 13( 16), 14-лабдатриен-18-оат, обладающий антиоксидан-тной, гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью. Патент RU № 2353620 С1 от 23.08.2007.

55. Баев Д.С., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Казакова О.Б. Антиоксидантная и гепатопротекторная активность новых производных бетулоновой кислоты // Бюл. Волгоградского науч. центра РАМН. - 2008. - № 3. - С. 66 - 67.

56. Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Zhukova N.A., Baev D.C., Schults E. E. Betulonic acid and its alanine amide derivatives - a new multy-target agents for tumor chemotherapy // EHRLICH II - 2nd World Conference on Magic Bullets. - Nürnberg, Germany, 2008.-P. 305.

57. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Баев Д.С., Толстиков Г.А., Казакова О.Б. Корректор паранеопластических повреждений и токсических эффектов цитостатической .полихимиотерапии. Патент RU № 2385324 С1 от 07.07.2008.

58. Vasilevsky S.F., Govdi A.I., Shults Е.Е., Shakirov M.M., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Baev D.S., Tolstikov G. A., Alabugin I.V. Efficient synthesis of the first betulonic acid - acetylene hybrids and their hepatoprotective and anti-inflammatory activity // Bioorganic Medicinal &Chemisrty Letters. - 2009. - Vol. 17, № 14. - P. 5164-5169.

59. Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Сорокина И.В., Долгих М.П., Огородникова Т.В., Бородавкина М.В., Дугина Ю.Л., Сергеева С.А. Противоязвенная активность препаратов сверхмалых доз антител на модели хронической язвы у крыс // Бюл. экспер. биол. и мед. Приложение. —2009. -№ 8. - С. 181 — 183.

60. Tolstikova T.G., Bryzgalov A.O., Sorokina I.V., Osadchii S.A., Shults E.E., Dolgikh M.P., Khvostov M. V. Solufication with hydrobromic acid as a factor defining ~ the selectivity of antiarrhythmic effect of lappaconitine derivatives // Letters In Drug Design & Discovery. - 2009. - Vol. 6. - № 7. - P. 475 - 477.

61. Толстикова Т.Г., Толстяков Г.А., Сорокина И.В., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Салахутдинов Н.Ф. Корректор цитостатической полихимиотерапии. Патент RU № 2353623 Опубл. 27.04.2009. Бюл. № 12.

62. Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Baev D.C., Tolstikov G.A. Anew multifunctional agents synthesized on natural triterpenoid platforms // 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current issue of natural products chemistry and biotechnology». - Novosibirsk, 2010. - P. 34.

63. Сорокина И.В., Баев Д.С., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Казакова О.Б., Гиниятуллина Г.В. N-метилпиперазинамид бетулоновой кислоты - корректор противоопухолевой химиотерапии // 2-й Международный Конгресс-Партнеринг по биотехнологии и биоэнергетике: Сборник тезисов. - Москва, 2010. - С. 172

64. Жукова H.A., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л .М., Семенов Д.Е. Структура печени мышей с перевитой карциномой Льюис при полихимиотерапии и коррекции бетулоновой кислотой и ее производными // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2010. - Т. 150, № 7. - С. 108 -112.

-173.

Соискатель

И.В .Сорокина

Подписано в печать 25.06.2010. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 50.

Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 333-37-39

2009128807

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Сорокина, Ирина Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ

ТРИТЕРПЕНОИДОВ.

1.1. Органотоксические и системные побочные эффекты основных групп противоопухолевых препаратов.

1.2. Модификаторы биологических реакций как средства дополнительной противоопухолевой терапии.

1.3. Фармакологические свойства лупановых тритерпеноидов

1.4. Молекулярные и клеточные механизмы действия тритерпеноидов

1.5. Резюме.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Общая характеристика химических соединений, используемых моделей и экспериментальных групп.

2.2. Методы морфологического анализа.

Глава 3. СКРИНИНГ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЙ, АНТИОКСИДАНТ-НОЙ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЛУПАНОВЫХ ТРИТЕРПЕНОИДОВ

Глава 4. МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПОЛИТАРГЕНТНЫХ ЭФФЕКТОВ ТРИТЕРПЕНОИДОВ В УСЛОВИЯХ ИЗОЛИРОВАННОГО И КОМБИНИРОВАННОГО ВВЕДЕНИЯ С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ ПРЕПАРАТАМИ

4.1. Исследование клеточных механизмов коррекции бетулоновой кислотой и ее р-аланиламидом цитотоксических эффектов циклофосфана у интактных животных.

4.2. Морфологические изменения печени после введения животным циклофосфана и тритерпеноидов.

4.3. Морфологические изменения миокарда после введения животным циклофосфана и тритерпеноидов.

4.4. Исследование клеточных механизмов коррекции бетулоновой кислотой и ее ß-аланиламидом цитотоксических эффектов доксорубицина у интактных животных.

4.5. Морфологические изменения печени после введения животным доксорубицина и тритерпеноидов.

4.6. Морфологические изменения миокарда после введения животным доксорубицина и тритерпеноидов.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КОРРЕКЦИИ БЕТУЛОНОВОЙ

КИСЛОТОЙ И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫМИ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ КОМБИНИРОВАННОГО ВВЕДЕНИЯ ЦИТОСТА-ТИКОВ ПО СХЕМЕ CHOP У ИНТАКТНЫХ ЖИВОТНЫХ.

5.1. Модулирующее влияние тритерпеноидов на показатели периферической крови и костного мозга в постцитостатическом периоде.

5.2. Структурная организация почек в постцитостатическом периоде на фоне применения тритерпеноидов.

5.3. Структурная реорганизация печени в постцитостатическом периоде на фоне применения тритерпеноидов.

Глава 6. ОЦЕНКА ПОЛИТАРГЕТНОГО ДЕЙСТВИЯ ТРИТЕРПЕНОИДОВ В УСЛОВИЯХ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ CHOP У ЖИВОТНЫХ С ПЕРЕВИВАЕМЫМИ ОПУХОЛЯМИ.

6.1. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию печени мышей с перевитой карциномой легких Льюис на фоне полихимиотерапии

6.2. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию печени мышей с перевитой лимфомой RLS.

6.3. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек мышей с перевитой карциномой легких Льюис.

6.4. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек мышей с перевитой лимфомой RLS.

6.5. Влияние тритерпеноидов на показатели белой крови и костного мозга у мышей с перевиваемыми опухолями

6.6. Антиоксидантное действие тритерпеноидов на фоне полихимиотерапии.

6.7. Влияние лупановых тритерпеноидов на противоопухолевый эффект полихимиотерапии.

6.8. Влияние тритерпеноидов на антиметастатический эффект полихимиотерапии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточные механизмы коррекции цитотоксических полиорганных повреждений тритерпеноидами класса лупана - бетулоновой кислотой и ее производными"

Актуальность проблемы. Совершенствование методов лечения злокачественных опухолей является одним из главных приоритетов фундаментальной и практической медицины. Антибластомная химиотерапия, направленная на предотвращение малигнизации и диссеминации опухолевых клеток, остается одним из основных, а иногда и единственным способом воздействия на новообразования. Главные достижения в области химиотерапии за последние полвека связаны с открытием новых высокоэффективных цито-статиков (подофилотоксины, таксаны, и др.), разработкой таргетных препаратов (моноклональные антитела, индукторы дифференцировки), а также с совершенствованием схем лечения. В настоящее время усилия специалистов в области «R&D» («Research & Development») направлены на создание препаратов высокоспецифичных для определенных типов опухолей, разработку систем их доставки до клеточных мишеней, а также на поиск средств, снижающих осложнения медикаментозной терапии.

Повышение эффективности медикаментозного лечения, особенно у больных с диссеминированными опухолями, связано, прежде всего, с высо-кодозной и комбинированной химиотерапией [Переводчикова Н.И., 1996]. Применение комбинированной химиотерапии позволило снизить дозировки индивидуальных препаратов и получить аддитивное или синергическое возрастание эффекта за счет различных механизмов действия отдельных компонентов. Эффективность полихимиотерапии связана также с преодолением лекарственной устойчивости опухолевых клеток к традиционным лекарственным препаратам. В онкологической литературе описано более сотни различных схем лечения, которые иногда включают до 7 - 9 различных компонентов [Корман Д.Б., 2006]. Однако серьезной проблемой, ограничивающей применение высокодозной и комбинированной химиотерапии, остаются многочисленные токсические побочные эффекты антибластомных препаратов.

Традиционная противоопухолевая терапия, как правило, приводит к развитию цитостатической болезни, повреждая в первую очередь быстро обновляющиеся клеточные системы (эпителиальной ткани, репродуктивных органов, кроветворной ткани и т.д.) [Гершанович M.JT. и др., 1999]. Показано, что у онкологических больных страдают основные звенья гомеостаза, снижена сопротивляемость организма [Кадагидзе З.Г., 1997; Шабашова Н.В., 1998]. Специфическая противоопухолевая терапия усугубляет и без того нарушенный баланс иммунитета, приводя к развитию вторичного иммунодефицита, активирует перекисное окисление липидов, нарушает гемостаз [Балуда В.П. и др., 1980], обмен веществ, истощает стресс-лимитирующие системы. Гепа-тотоксичность цитостатиков, наиболее часто развивающаяся при длительном и интенсивном лечении, способствует усилению токсичности антибластом-ных препаратов [Богуш Т.А., 1983]. Кроме того, унифицированные схемы химиотерапевтического лечения не учитывают индивидуальных особенностей и характера заболеваний у различных категорий больных, а также наличие сопутствующих патологических процессов. Несмотря на то, что значительные усилия по-прежнему направлены на поиск новых более эффективных противоопухолевых агентов, растет понимание того, что дальнейший прогресс в развитии методов цитостатической химиотерапии ограничен в виду низкой селективности и высокой токсичности противоопухолевых препаратов.

В связи с тем, что проблема повышения переносимости цитостатической химиотерапии имеет особую актуальность для онкологической практики, большое внимание уделяется поиску агентов-модификаторов, которые бы снижали побочное действие химиопрепаратов и при этом не ослабляли их основной терапевтический эффект [Гольдберг Е.Г. и др.,-2000; Трещалина Е.М., 2005; РисЬеаик М., 2008]. Основными требованиями к агенту-кандидату являются низкая токсичность, отсутствие стимулирующего влияние на опухоль и ее метастазы, усиление противоопухолевого иммунитета, повышение морфофункционального статуса здоровых клеток и тканей.

Большинство применяемых в клинической практике препаратов-модификаторов является иммуномодуляторами белковой природы: БСЖ, препараты тимуса (Т-активин, тималин), полипептиды (бестатин, циклоспорин А), цитокины и факторы роста, стимуляторы гемопоэза (колониестиму-лирующие факторы) и др. Побочными эффектами данных биогенных стимуляторов являются нежелательные иммунологические реакции (выработка нейтрализующих антител, сенсибилизация), а также способность стимулировать в определенных условиях рост первичного узла или метастазов опухоли [Корман Д.Б., 2006; Трещалина Е.М., 2005]. Этих недостатков лишены препараты растительного происхождения, обладающие противоопухолевыми и антиметастатическими свойствами. В лечении злокачественных новообразований показана высокая эффективность экстрактов шлемника байкальского, элеутерококка, подорожника, побегов и листьев облепихи и др. [Гольдберг Е.Г. и др., 2000; Амосова E.H. и др., 2003]. Поскольку растительные соединения обычно обладают комплексной активностью (гепатопротекторной, анти-оксидантной, противовоспалительной и иммуномодулирующей) и лучше переносятся организмом, то они остаются в фокусе внимания при отборе корректоров химиотерапии.

В настоящее время поиск перспективных растительных корректоров цитостатиков ведется среди соединений различных классов: алкалоидов, сапонинов, флавоноидов, кумаринов, полисахаридов, терпеноидов и др. [С.Я. Жанаева и др., 2005; Разина Т.Г. и др., 2006]. В этом ряду особое значение имеют пентациклические тритерпеноиды лупанового типа - легкодоступные вторичные растительные метаболиты. В экспериментах in vitro установлено, что бетулин, лупеол, бетулиновая кислота и их производные проявляют противовоспалительную, противоопухолевую, противовирусную, антимикробную активность [Chartulvedula V.S.P. et al., 2003; Покровский А.Г. и др., 2001; Толстикова Т.Г. и др., 2006]. В опытах на животных было показано, что эти агенты могут использоваться для профилактики и лечения злокачественных опухолей. Уникальным свойством данных соединений является сочетание цитотоксического действия на опухолевые клетки и низкой токсичности в отношении ^трансформированных клеток [Eiznhamer D.A. et al., 2004; Cha-turvedy P.K. et al., 2008]. В настоящее время бетулиновая кислота проходит клинические испытания за рубежом в качестве препарата для профилактики и лечения меланомы и диспластического невуса [Fulda S., 2009]. Синтетические трансформации тритерпеноидов лупанового ряда рассматриваются как современный и перспективный подход к получению нового поколения препаратов с противоопухолевыми и химиопревентивными свойствами [Baglin I. et al., 2003; Cichewicz R.H. et al., 2004].

Другой многообещающей лупановой платформой можно считать бету-лоновую кислоту, получаемую путем одностадийного окисления бетулина. Несмотря на то, что бетулоновая кислота является, близким структурным аналогом бетулиновой, ее синтетические превращения и фармакологические свойства, в отличие от последней, до сих пор широко не изучены. По имеющимся-данным, полученным на культурах опухолевых клеток человека (мие-ломы, лимфомы, карциномы молочной железы и яичника и др.), цитотокси-ческая активность бетулоновой кислоты в 2 - 19 раз выше, чем у бетулино-вой [Jle Банг Шон и др., 2002; Шинтяпина А.Б. и др., 2008].

Результаты исследований, проведенных за последние десять лет, выявили молекулярные мишени тритерпеноидных соединений в клетке, что позволило обосновать политаргетный механизм их действия. Было показано, что взаимодействуя с белком КЕАР1, тритерпеноиды активируют гены сигнального пути Nrf2, кодирующие семейство цитопротекторных белков, включая фементы синтеза глутатиона, хинонредуктазу, каталазу, суперок-сиддисмутазу, гемоксигеназу, тиоредоксин, а также подавляют индукцию ЦОГ2 и NO-синтазы [Liby К.Т. et ah, 2007; Chaturvedy P.K. et ah, 2008]. Противовоспалительная! активность агентов также связана с ингибированием белков сигнального пути NFkB, регулирующего процессы воспаления, апоп-тоза и дифференцировки [Fulda S., 2009; Shishodia S. et al., 2006]. Противоопухолевое действие тритерпеноидов реализуется через индукцию ими внутреннего митохондриального пути апоптоза, не зависящего от внешнего, связанного с экспрессией р53 и CD95/FasL, что характерно для большинства противоопухолевых препаратов [Zarec J. et al., 2003; Eiznhamer D.A. et ah, 2004]. Последнее обстоятельство повышает интерес к тритерпеноидам, как агентам, способным преодолевать лекарственную устойчивость к традиционной химиотерапии. В доказательство этой способности в экспериментах на •культурах опухолевых клеток был установлен синергический эффект бету-линовой кислоты с различными химиопрепаратами (доксорубицином, этопо-зидом, цисплатином, таксолом, актиномицином D), направленный на повышение апоптоза и подавление клоногенного окружения клеток опухоли [Fulda S., 2005]. Бетулиновая кислота также усиливала цитотоксический эффект винкристина на клетки меланомы [Sawada N. et al., 2004], повышала апопто-' тическую активность индуктора внешнего пути апоптоза TRAIL [Fulda S. et al., 2004].

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что лупановые соединения могут потенциально являться эффективными средствами дополнительной противоопухолевой терапии. Однако до настоящего времени интересы исследователей фокусировались в основном на изучении противоопухолевой активности тритерпеноидов, в то время как их свойства как модификаторов биологических эффектов цитостатической химиотерапии оставались за рамками внимания. В частности, практически не исследовано протекторное действие лупанов в тканях животных на фоне цитотоксических полиорганных эффектов традиционных противоопухолевых препаратов. Отчасти это связано с тем, что основные результаты были получены в экспериментах на культурах клеток, в то время как системных исследований in vivo не проводилось.

Задачи исследования:

1. Провести широкий скрининг фармакологических свойств соединений ряда лупана и выявить среди них агенты с гепатопротекторной, кардио-протекторной, нефропротекторной, антиоксидантной и противовоспалительной активностью. Изучить противоопухолевую активность и антиметастатический эффект лупановых тритерпеноидов.

3. Изучить особенности внутриклеточной реорганизации гепатоцитов и кардиомиоцитов при изолированном применении бетулоновой кислоты и ее производных и при их сочетаниях с цитостатиками (циклофосфамидом и доксорубицином) с оценкой цитопротекторных и цитотоксических свойств исследуемых агентов.

5. Изучить характер влияния отобранных соединений на морфологию и лейкоцитарный профиль периферической крови, клеточный состав костного мозга, уровень перекисного окисления липидов в условиях полихимиотерапии CHOP у животных с перевиваемыми опухолями.

6. Установить характер морфологических изменений печени и почек в условиях комбинированного воздействия цитостатической полихимиотерапии CHOP и лупановых тритерпеноидов.

Научная новизна. Впервые в результате комплексного морфологического исследования изучен характер модифицирующего влияния бетулоновой кислоты и ее производных на действие цитостатических препаратов в различных тканях интактных животных и у животных с перевиваемыми опухолями. Впервые выявлены политаргетные свойства лупановых соединений -цитотоксические (противоопухолевые) и цитопротекторные. Впервые проведено комплексное исследование in vivo широкого спектра фармакологической активности тритерпеноидов лупанового типа (антиоксидантной, противовоспалительной, цитопротекторной, противоопухолевой).

Впервые установлены особенности ремоделирования печени, сердца и почек, отражающие коррекцию тритерпеноидами повреждений, вызванных противоопухолевыми препаратами. Показано, что применение тритерпеноидов после моделирования противоопухолевой химиотерапии способствует снижению выраженности дистрофических и некробиотических изменений паренхиматозных клеток без значимого влияния на цитостатические свойства противоопухолевых препаратов.

Впервые выявлены особенности ультраструктурной перестройки основных внутриклеточных компартментов гепатоцитов и кардиомиоцитов под действием цитостатиков и тритерпеноидов. Показано, что бетулоновая кислота и ее Р-аланиламид при изолированном введении интактным животным оказывают одновременно умеренное цитотоксическое и стимулирующее действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты сину-соидов, клетки Купфера) и миокарда (кардиомиоциты, эндотелиоциты). Впервые исследованы общецитологические особенности цитопротекторных и цитотоксических эффектов бетулоновой кислоты и ее [З-ала пил амида, представлены их ультраструктурные эквиваленты.

Впервые показано, что бетулоновая кислота и ее Р-аланиламид, вводимые на фоне цитостатиков (циклофосфамида и доксорубицина), проявляют политаргетное действие на клеточные популяции печени и миокарда, потенцируя цитотоксическое действие цитостатиков в отношении одних клеток и стимулируя регенераторные реакции - в других. Восстановление ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов при комбинированном применении цитостатиков и тритерпеноидов происходит быстрее. Установлено, что оба тритерпеноида не ингибируют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов.

Впервые показано, что бетулоновая кислота и ее производные снижают интенсивность перекисного окисления и повышают противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии и животных с перевитыми опухолями. Установлено, что Р-аланиламид бетулоновой кислоты и его метиловый эфир повышают антиметастатическую эффективность полихимиотерапии.

Получены доказательства иммуномодулирующей и противовоспалительной активности аланиламидов бетулоновой кислоты, лежащей в основе их системных эффектов и клеточных механизмов коррекции цитотоксиче-ского воздействия. В результате широкого скрининга соединений лупанового типа выявлены новые перспективные агенты с антиоксидантной, гепатопро-текторной и противовоспалительной активностью.

Показана высокая перспективность бетулоновой кислоты как новой тритерпеноидной платформы для получения агентов с широким спектром фармакологической активности. На основании результатов исследования 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота рекомендована для доклинических испытаний в качестве препарата-модификатора цитостатиче-ской полихимиотерапии. Результаты исследования и методические подходы, разработанные в диссертации, могут быть использованы при подготовке материалов доклинических испытаний и в клинической практике при обосновании схем полихимиотерапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Тритерпеноиды лупанового ряда - новый класс модификаторов биологических реакций, оказывающих антиоксидантное, противовоспалительное и цитопротекторное действие при токсическом и лекарственном поражении. Аланиламидные производные бетулоновой кислоты в условиях цитостатиче-ской гемодепрессии модулируют содержание нейтрофилов и мононуклеаров в периферической крови.

2. К общецитологическим цитопротекторным свойствам бетулоновой кислоты и ее Р-аланиламида как при изолированном, так и комбинированном с цитостатиками применении относится их способность усиливать эндоци-тозную (пиноцитозную) активность клеток и стимулировать в них процессы внутриклеточной регенерации. Оба агента не подавляют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов.

3. К общецитологическим цитотоксическим свойствам обоих тритерпеноидов относится их способность вызывать умеренные литические изменения цитоплазматического матрикса, деструктивные изменения органелл и усиление аутофагических процессов. При комбинированном применении с цитостатиками бетулоновая кислота и ее производные способствуют более быстрому восстановлению ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов, уменьшают степень выраженности дистрофических изменений эпителиоци-тов почечных канальцев.

4. Введение БК и ее производных мышам-опухоленосителям понижает интенсивность перекисного окисления липидов и не снижает противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии CHOP. В то же время бе-тулоновая кислота и ее ß-аланиламид уменьшают выраженность дистрофических и некробиотических изменений гепатоцитов, обусловленных неопластическим процессом и полихимиотерапией.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на 2-м съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), XII Международной конференции «Медицина XXI века» (Словакия, Низкие Татры, 2004), Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов, 2004), Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 2004), Научно-практической конференции с международным, участием «Медицина и образование в XXI веке» (Новосибирск, 2004), Всероссийской научно-. практической конференции с международным участием «Клинико-морфоло-гические аспекты общепатологических процессов при социально значимых заболеваниях» (Новосибирск, 2004), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень; 2005), Научной конференции «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005), III Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), III International Conference «Basic science for Medicine» (Novosibirsk, 2007), III Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), II Международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Казахстан, Алматы, 2007), EHRLICH II, 2nd World Conference on Magic Bullets (Nürnberg, Germany, 2008), 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current issue of natural products chemistry and biotechnology» (Novosibirsk, 2010), ученом совете в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 64 работы, из них 19 - в рецензируемых журналах по списку ВАК, получены 7 патентов.

Основные публикации:

1. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Узенкова Н.В., Грек O.P., Позднякова C.B., Толстяков Г.А. Бетулоновая кислота и ее производные - новая группа агентов, снижающих побочное действие цитостатиков// Доклады академии наук. - 2004. - Т. 399, № 2. - С. 274 - 277.

2. Августинович Д.Ф., Коваленко И.Л., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Толстиков А.Г. Этологическое исследование антидепрессивного эффекта флуоглизина в условиях хронического социального стресса у мышей // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2004. - Т. 137, № 1.-С. 99-103.

3. Коваленко И.Л., Августинович Д.Ф., Сорокина. И.В., Толстикова Т.Г., Толстиков А.Г. Влияние хронического введения флуоглизина на биохимические показатели крови у мышей, находящихся в условиях социального стресса // Вопр. биол. мед. фарм. химии.

2004. -№11. -С. 44 -47.

4. Толстиков А .Г., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Долгих М.П., Толстиков Г.А., Федосеева Л.А. Лекарственное средство для лечения различных форм депрессий «флуог-лизин». Патент РФ № 2232574, Бюл. №20 от 12.10.2004.

5. Жукова H.A., Семенов Д.Е., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Позднякова C.B., Грек О. Р. Влияние бетулоновой кислоты и ее производного [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовой кислоты на структуру печени мышей с лимфосаркомой RLS // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2005. - Т. 140, № 9. - С. 348 - 351.

6. Грек O.P., Позднякова C.B., Надеев А.П., Пронин B.C., Жукова H.A., Сорокина И.В., Волкова Е.Б., Толстикова Т.Г. Эффективность бетулоновой кислоты и ее аланина-мидных производных при восстановлении паренхимы печени крыс в постцитостатический период // Эксперим. клин, фармакол. - 2005. -Т. 68, № 6. - С. 49 - 51.

7. Брызгалов А.О., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Жукова H.A., Волкова Е.Б., Долгих М.П. Антиаритмическая активность аллаглизина // Эксперим. клин, фармакол.

2005. - Т. 68, № 4. - С. 24 - 28.

8. Толстикова Т.Г., Брызгалов А.О., Сорокина И.В., Морозова Е.А., Толстиков С.Е., Альфонсов A.B., Толстиков А.Г. Стевиозид - новый стимулятор эффекта клатриро-вания фармаконов гликозидами // Доклады академии наук. - 2005. - Т. 403, № 2. - С. 274 - 276. '

9. Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Малков Ю.А., Иванова Н.В., Иванова С.З., Бабкин Д.В., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Долгих М.П., Толстиков Г.А. Новый комплекс биологически активных соединений из коры лиственницы - Пикнолар. Патент РФ № 2252028, Бюл. №14 от 20.05.2005.

10. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Шульц Э.Э., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Попова H.A. Оценка противоопухолевой и антиметастатической активности амидов бетулоновой кислоты на мышах с перевиваемой карциномой Льюис // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2006. - Т. 142, № 7. - С. 78 - 81.

11. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. Терпеноиды ряда лупана как перспективные для медицины биологически активные агенты. Часть 1. Нативные производные лупана. Обзор // Биоорганическая химия. - 2006.

Т. 32, № l.-C. 42-55.

12. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. Терпеноиды ряда лупана как перспективные для медицины биологически активные агенты. Часть 2. Полусинтетические производные лупана. Обзор // Биоорганическая химия. -2006. -№3. С. 291 -307.

13. Сорокина И.В., Жукова Н.А., Толстикова Т.Г., Позднякова С.В., Грек О.Р., Попова Н.А., Каледин В.И., Николин В.П. Изучение влияния бетулоновой кислоты и ее амидных производных на рост и метастазирование перевиваемых опухолей у мышей // Вопр. биол. мед. фарм. химии. - 2006. - № 1. - С. 29 - 31.

14. Позднякова С.В., Грек О. Р., Жоголь Р.А., Шарапов И.В., Шарапов В.И., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В. Активность монооксигеназ печени и биологические эффекты бетулоновой кислоты и ее амидных производных // Вестник НГУ. Серия: биология, клиническая медицина. - 2006. - Т. 4, вып. 3. - С. 66 - 70.

15. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Брызгалов А.О., Долгих М.П., Лифшиц Г.И., Хвостов М.В. Использование нового подхода комплексообразования известных лекарственных препаратов с растительными гликозидами в профилактике и купировании острых гипертензивных состояний (экспериментальное исследование) // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2006. - № 1. - С. 55 - 58.

16. Баев Д.С., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Рутман М.Ю., Лукина Е.С., Поне-делькина И.Ю. Противовоспалительная активность модифицированных гликозаминогли-канов // Биомедицина. - 2006. - № 4. - С. 74 - 76.

17. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Брызгалов А.О., Лифшиц Г.И., Хвостов М.В. Использование подхода комплексообразования с глицирризиновон кислотой для создания новых кардиотропных средств // Биомедицина. - 2006. - № 4. - С. 115 -117.

18. Bryzgalov А.О., Dolgikh М.Р., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Sedova V.F., Shkurko

0.P. Antiarrhythymic activity of 4,6-di(het)aryl-5-nitro-3,4-dihydropyrimidin-(lH)-2-ones and its effects on arterial pressure in rats// Bioorganic&Medicinal Chemisrty Letters. - 2006. - № 16. -P. 1418- 1420.

19. Shishkina G.T., Dygalo N.N., Yudina A.M., Kalinina T.S., Tolstikova T.G., Sorokina

1.V., Kovalenko I.L., Anikina L.V. The effects of fluoxetine and its complexes with glycyrrhizic acid on behavior in rats and brain monoamine levels // Neuroscience and Behavioral Physiology. - 2006. -Vol. 36. - N 4. - P. 329 - 333.

20. Лушникова Е.Л., Толстикова Т.Г., Непомнящих Л.М., Клинникова М.Г., Молодых О.П., Свиридов Е.А., Сорокина И.В., Жукова Н.А. Численность кардиомиоцитов в миокарде крыс при воздействии на организм агентов с противоопухолевой активностью -циклофосфана и тритерпеноидов // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2007. - Т. 144, № 9. - С. 331 - 337.

21. Позднякова С.В., Грек О. Р., Фунтиков А.С., Данильчева Т.В., Жукова Н.А., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Нефропротективный эффект производных бетулоновой кислоты при экспериментальном цитостатическом повреждении почек у крыс // Бюл. СО РАМН. - 2007. - Т. 127, № 5. - С. 117 - 121.

22. Толстикова Т.Г., Брызгалов А.А., Сорокина И.В., Долгих М.П., Шульц Э.Э., Осадчий С.А., Толстиков Г.А. Солеобразование с бромистоводородной кислотой как фактор, определяющий антиаритмическое действие производных лаппаконитина // Доклады академии наук. - 2007. - Т. 415, № 6. - С. 837 - 839.

23. Tolstikova T.G., Bryzgalov А.О., Sorokina I.V., Hvostov M.V., Ratushnyak A.S., Zapara T.A., Simonova O.G. Increase in Pharmacological activity of drugs in their clathratcs with plant glycosides // Letters in Drug Design &Discovery. - 2007. - N 4. - P. 168 - 173.

24. Харитонов Ю.В., Шульц Э.Э., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Баев Д.С., Жукова Н.А., Толстиков Г.А. Ангиоксидант, обладающий гепатопротекторной и гемостиму-лирующей активностью. Патент RU № 2364599 С2 от 23.08.2007.

25. Харитонов Ю.В., Сорокина И.В., Шульц Э.Э., Толстикова Т.Г., Баева Д.С., Жукова Н.А., Толстиков Г.А. 16-{2-Бензоиламино-2-[3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)ал-килкарбамоил]-винил}-лабдатриены с антиоксидантными, гепатопротекторными и гемо-стимулирующими свойствами. Патент RU № 2346940 С1 от 23.08.2007.

26. Харитонов Ю.В., Шульц Э.Э., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Баев Д.С., Жукова Н.А., Толстиков Г.А. (г)-Метил-16-(5-оксо-2-фенилоксазол-4-илиденметил)-15,16-эпокси-8(17),13(16),14-лабдатриен-18-оат, обладающий антиоксидантной, гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью. Патент RU № 2353620 С1 от 23.08.2007.

27. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Баев Д.С., Толстиков Г.А., Казакова О.Б. Корректор паранеопластических повреждений и токсических эффектов цитоста-тической полихимиотерапии. Патент RU № 2385324 С1 от 07.07.2008.

28. Vasilevsky S.F., Govdi A.I., Shults Е.Е., Shakirov M.M., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Baev D.S., Tolstikov G.A., Alabugin I.V. Efficient synthesis of the first betulonic acid -acetylene hybrids and their hepatoprotective and anti-inflammatory activity // Bioorganic Medicinal &Chemisrty Letters. - 2009. - Vol. 17, № 14. - P. 5164 - 5169.

29. Tolstikova T.G., Bryzgalov A.O., Sorokina I.V., Osadchii S.A., Shults E.E., Dolgikh M.P., Khvostov M.V. Solufication with hydrobromic acid as a factor defining the selectivity of antiarrhythmic effect of lappaconitine derivatives // Letters In Drug Design&Discovery. - 2009. - Vol. 6. - № 7. - P. 475 - 477.

30. Толстикова Т.Г., Толстиков Г.А., Сорокина PI.В., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Салахутдинов Н.Ф., Корректор цитостатической полихимиотерапии. Патент RU № 2353623. Опубл. 27.04.2009. Бюл. № 12.

31. Жукова Н.А., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Лушникова E.JI., Непомнящих JI.M., Семенов Д.Е. Структура печени мышей с перевитой карциномой Лыоис при полихимиотерапии и коррекции бетулоновой кислотой и ее производными // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2010. - Т. 150, № 7. - С. 108 -112.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Сорокина, Ирина Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Бетулоновая кислота и ее производные с аланиламидными, диокси-дииминовым, метилпиперазиновым заместителями, а также никотинат бету-лина являются перспективными агентами-модификаторами биологических реакций с политаргетным механизмом, в котором сочетаются цитопротек-торное действие на неповрежденные клетки и цитотоксическое - на неопластические. Цитопротекторные свойства реализуются через противовоспалительную и антиоксидантную активность, цитотоксические - через стимуляцию сигнальных путей некроза и апоптоза.

2. При моделировании циклофосфановых поражений [3-аланиламид в отличие от бетулоновой кислоты оказывает корригирующее влияние на массу тимуса, селезенки, печени, почек и легких. Оба тритерпеноида модулируют содержание нейтрофилов и мононуклеаров в периферической крови. При воспроизведении доксорубициновых повреждений Р-аланиламид и бетулоновая кислота вызывают коррекцию массы тимуса и содержания лейкоцитов в периферической крови.

3. Бетулоновая кислота и ее Р-аланиламид при изолированном введении интактным животным оказывают одновременно умеренное цитотоксическое и стимулирующее действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусоидов, клетки Купфера). По данным ультраструктурного анализа, цитотоксическое действие бетулоновой кислоты и ее амида проявляется в изменении тонкой структуры митохондрий гепатоцитов, секвестрации гликогена и усилении аутофагических процессов (субплазмалеммаль-ной вакуолизации цитоплазмы), появлении некробиотически измененных гепатоцитов и эндотелиоцитов. Амид бетулоновой кислоты модифицирует тонкую структуру митохондрий (появление крупных органелл с разреженным матриксом и неравномерно расширенными кристами). Стимулирующее влияние бетулоновой кислоты и ее амида на гепатоциты, эндотелиоциты и клетки Купфера (моноциты) проявляется в виде усиления их эндоцитозной (пиноцитозной) активности. В синусоидальной выстилке доминируют функционально активные формы эндотелиоцитов и клеток Купфера.

4. При изолированном введении бетулоновая кислота и ее Р-аланиламид вызывают сходные с цитостатиками (циклофосфаном и доксорубицином), но менее выраженные изменения ультраструктуры отдельных кар-диомиоцитов. К таким изменениям относятся лизис саркоплазматического матрикса, особенно в околоядерной зоне, умеренный лизис миофибрилляр-ных пучков, умеренные расширения межмембранного околоядерного пространства и цистерн агранулярной саркоплазматической сети. Амид бетуло-новой кислоты вызывает также значительные изменения тонкой структуры митохондрий (диффузный лизис митохондриального матрикса, редукцию крист и нарушение их упаковки).

5. Бетулоновая кислота и ее Р-аланиламид, вводимые на фоне цитоста-тиков (циклофосфамида и доксорубицина), проявляют политаргетное действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусои-дов, клетки Купфера) и миокарда (кардиомиоциты и эндотелиоциты), потенцируя цитотоксическое действие цитостатиков в отношении одних клеток и стимулируя регенераторные реакции - в других. Восстановление ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов при комбинированном применении цитостатиков и тритерпеноидов происходит быстрее. В гепатоцитах последовательное применение цитостатиков и тритерпеноидов активизирует эндоцитозную и трансцитозную активность и способствует сохранению гладкой цитоплазматической сети. В кардиомиоцитах тритерпеноиды также активизируют эндоцитозную активность и стимулируют процессы внутриклеточной регенерации (появление многочисленных полисом в участках лизиса миофибрилл).

6. К общецитологическим цитопротекторным свойствам бетулоновой кислоты и ее Р-аланиламида как при изолированном, так и комбинированном с цитостатиками применении относится их способность усиливать эндоцитозную (пиноцитозную) активность клеток и стимулировать в них процессы внутриклеточной регенерации. Оба агента не подавляют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов. К общецитологическим цито-токсическим свойствам обоих тритерпеноидов относится их способность вызывать умеренные литические изменения цитоплазматического матрикса, деструктивные изменения органелл и усиление аутофагических процессов. Амид бетулоновой кислоты вызывает однотипную модификацию ультраструктуры митохондрий в разных клетках - увеличение размеров органелл, разрыхление их матрикса и расширение крист.

7. При моделировании полихимиотерапии CHOP на здоровых животных корректорный эффект тритерпеноидов выражается в ослаблении ее угнетающего эффекта на тимус и более раннем восстановлении костномозгового кроветворения. Регулирующее влияние агентов направлено преимущественно на клетки моноцитарного, а не гранулоцитарного ряда. Под действием тритерпеноидов происходит коррекция цитотоксических повреждений в печени и почках: снижение некробиотических повреждений гепатоцитов и эпи-телиоцитов извитых канальцев, улучшение микроциркуляции, повышение пластических резервов.

8. Курсовое внутрижелудочное введение мышам-опухоленосителям а-аланиламида бетулоновой кислоты, его метилового эфира, Р-аланиламида, диоксииминометилового эфира бетулоновой кислоты и диникотината бету-лина повышает противоопухолевый эффект полихимиотерапии CHOP. Выраженность эффекта зависит от вида перевиваемой опухоли. Производные с а-аланиламидным и метилпиперазиновым заместителем не стимулируют диссеминацию опухоли на фоне полихимиотерапии; Р-аланиламид и его метиловый эфир повышают антиметастатическую эффективность CHOP.

9. Введение р-аланиламидных производных бетулоновой кислоты мышам с перевиваемыми опухолями на фоне полихимиотерапии уменьшает выраженность лейкоцитоза и стимулирует моноцитарное звено периферической крови.

Ю.Курсовое введение бетулоновой кислоты, ее метилового эфира и Р-аланиламидных производных на стадии прогрессии опухоли существенно подавляет ее диссеминацию в печени; бетулоновая кислота уменьшает выраженность дистрофических изменений гепатоцитов, а р-аланиламид - усиливает дегенеративные изменения гепатоцитов. На фоне полихимиотерапии CHOP бетулоновая кислота и ее Р-аланиламид снижают выраженность дистрофических изменений гепатоцитов и уменьшают объемную плотность очагов некроза гепатоцитов по сравнению с полихимиотерапией. Эфирные производные не обладают выраженным гепатопротекторным эффектом.

11.Бетулоновая, [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовая кислоты и их метиловые эфиры проявляют нефропротективные свойства как на фоне полихимиотерапии, так и без ее воздействия. Все исследуемые тритер-пеноиды обладают способностью уменьшать на фоне полихимиотерапии степень деструктивно-некротических процессов только в канальцах почек.

12.Бетулоновая кислота, ее (3-аланиламидные и пиперазиновые производные, а также диоксииминометиловый эфир бетулоновой кислоты и дини-котинат бетулина понижают интенсивность перекисного окисления в условиях цитостатической полихимиотерапии.

13.Бетулоновая кислота является новой перспективной тритерпеноид-ной платформой для синтеза соединений с высокой гепатопротекторной, кардиопротекторной, нефропротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и противоопухолевой активностью. [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовая кислота предложена для доклинических испытаний в качестве корректора цитостатической химиотерапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате скрининга, проведенного на различных патологических моделях, среди соединений лупанового типа были обнаружены новые гепа-топротекторные агенты с высоким антицитолитическим эффектом, который не уступал по выраженности дигидрокверцетину. К ним относятся производные БК с аминокислотными фрагментами (|3-алаБК, Of-19, Ме-Р-алаБК, Ме-á-алаБК), секо-производные (0f-30, Of-31) и бетулоны с метиловым (Ме-БК), диоксииминовым (Of-15), оксимным (Of-2), нитроксильным (А75), фурфури-лиденовым (Of-8) и анилиновым (ВГ153, ВГ157, ВГ132) заместителями. Среди них антихолестазные свойства установлены у агентов: Ме-р-алаБК, Of-8, Of-15, ВГ153, ВГ157, ВГ182 и Of-31.

У ряда лупановых производных выявлена антиоксидантная активность, превосходящая таковую дигидрокверцетина. В эту группу соединений входят сама БК, ее оксимы (Of-18, Of-2), триазолы (ВГ263, ВГ264, ВГ216, ВГ211), производные анилина (ВГ156, ВГ182), аланиламиды (á-алаБК, Me-á-алаБК). Противовоспалительные свойства найдены у аланиламидных и анилиновых производных БК, а также у агентов с метильным, децилуреидным и метил-пиперазиновым заместителями в тритерпеноидной структуре. Среди них три соединения - ВГ174, ВГ182 и Ме-БК - проявили активность, не уступающую индометацину.

Полученные результаты подтверждаются данными работ других авторов, в которых сообщается об аналогичных эффектах у близких по строению тритерпеноидов [Флехтер О.Б. и др., 2000; Карачурина Л.Т. и др., 2004; Din-kova-Kostova А.Т. et al., 2005; Honda Т. et al., 2007]. Показано, что антиокси-дантное, гепатопротекторное и противовоспалительное действие агентов связано с активизацией внутриклеточных цитопротекторных сигнальных путей и индукцией антиоксидантных ферментов в ответ на действие неблагоприятных факторов, которыми в представленной работе являлись гепатотоксин CCU и флогогены гистамин и каррагенин.

Тестирование противоопухолевых свойств некоторых из производных лупанов на животных с перевиваемыми опухолями позволило выявить соединения со значимым эффектом. Это БК и ее аланиламидные производные, 3-оксо-28-(]Ч-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (of-15), 3-okco-28-(Nметилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (of-41), Зр,28-ди-0-никотинат бе-тулина (of-3), нитроксил БК (А75), М-[3-оксо-лупано-28-ил]-4'-метилпипера-зин и 1Ч-[3-оксо-лупано-28-ил]-4'-этилпиперазин (М-Ме и M-Et). Следует отметить, что изученные соединения проявили невысокую противоопухолевую активность, что коррелирует с данными о подобном же по выраженности эффекте in vivo у бетулиновой кислоты [Liby К. et al., 2007].

При моделировании циклофосфановых поражений у животных наблюдался выраженный депрессивный эффект на тимус и селезенку, масса которых значительно снижалась. Масса экскреторных органов (печень, почки, легкие), напротив, повышалась из-за нарушения гемодинамики. В крови животных отмечалась выраженная нейтропения, а в конце опыта лейкоцитоз и тенденционное повышение количества моноцитов. Введение БК и р-алаБК на фоне ЦФ модулировало лейкоцитарный профиль крови, снижая выраженность как лейкопении, так и лейкоцитоза. Оба тритерпеноида вызывали уменьшение количество моноцитов в крови, при этом Р-аланиламид БК корригировал моноцитоз в более ранние сроки. У аланиламида БК дополнительно было установлено протекторное действие в отношении тимуса и селезенки, которое выражалось в поддержании их нормальной массы в течение опыта. БК не вызвала коррекции данных показателей.

Аналогичные, но менее выраженные сдвиги в динамике нейтрофилов и моноцитов крови, а также массе тимуса, наблюдали при введении ДОК. В этих условиях БК и Р-алаБК проявили тенденцию к нормализации показателей белой крови, что коррелировало с результатами, полученными в опыте с ЦФ. Так же как и в опыте с ЦФ, наблюдалась тенденция к восстановлению массы тимуса при сочетанном введении ДОК и тритерпеноидов. При моделировании полихимиотерапии CHOP у интактных животных корректорный эффект тритерпеноидов, по данным анализа крови и костного мозга, проявлялся в виде уменьшения депрессивного влияния полихимиотерапии на клетки лейкоцитарного ряда. При этом регулирующее влияние агентов было направлено в основном на моноциты.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о гематопротек-торном действии БК и ее аланиламидных производных в условиях цитоста-тических воздействий. Обращает на себя внимание тот факт, что корректорное действие агентов направлено преимущественно на клетки гранулоцитарно-моноцитарного типа, которые являются эффекторными в воспалительных и иммунных реакциях. Влияние тритерпеноидов на гранулоциты и макрофаги отмечается в некоторых работах. В частности, показано, что олеаноловые производные и бетулиновая кислота в низких концентрациях подавляют индукцию iNOS и СОХ-2 в макрофагах, стимулированных различными про-воспалительными цитокинами (ФНОа и у, ИЛ-1 и липополисахаридом) [Hsu H-J. et al., 1997; Liby К. et al., 2007]. Бетулин, добавленный в культуру макрофагов, вызывает усиление продукции воспалительного цитокина ФНОа, но не интерферона у и ИЛ-10 [Zdzisinska В. et al., 2003]. Таким образом, очевидно, что участие тритерпеноидов в иммунных и воспалительных процессах в тканях опосредуется через их регулирующее влияние на макрофаги. Однако фагоциты являются не единственной мишенью тритерпеноидов.

Ряд принципиально новых результатов, представленных в диссертационной работе, касается активирующего влияния БК и ее аланиламида на различные клеточные популяции в тканях, что показано на примере печени и сердца. Характер этого влияния имеет свои особенности в зависимости от режима введения агентов: изолировано от цитостатических препаратов или на их фоне.

При изолированном введении БК и ее амида установлено, что они оказывают одновременно умеренное цитотоксическое и стимулирующее действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусои-дов, клетки Купфера) и сердца (кардиомиоциты и эндотелиоциты).

Стимулирующее действие тритерпеноидов в печени выражалось в повышении эндоцитозной (пиноцитозной) и трансцитозной активности гепато-цитов. При этом на синусоидальном полюсе регистрировалось большое количество эндоцитозных (пиноцитозных) везикул, на билиарном полюсе -многочисленные везикулы гладкой цитоплазматической сети, гипертрофированный комплекс Гольджи, окаймленные везикулы. Такая же активность была обнаружена в активированных формах эндотелиоцитов и клеток Купфера. В синусоидах регистрировались переходные формы моноцитов с множественными эндоцитозными/пиноцитозными везикулами и вакуолями с гомогенным содержимым. Амид БК обладал более выраженным стимулирующим влиянием на гепатоциты, эндотелиоциты и клетки Купфера (моноциты), чем сама бетулоновая кислота.

Цитотоксическая активность тритерпеноидов выражалась в изменениях тонкой структуры митохондрий (лизисе матрикса и разрежении крист), некрозе и некробиозе отдельных гепатоцитов и эндотелиоцитов с формированием пристеночных скоплений клеточного детрита. По окончанию 14-дневного курсового введения БК и ее амида неблагоприятные изменения отмечались в виде умеренной секвестрации гликогена и неравномерного расширения профилей гранулярной цитоплазматической сети и межмембранного околоядерного пространства. Для амида БК было характерно частое появление в некоторых гепатоцитах и макрофагах крупных митохондрий с просветленным матриксом и редуцированными кристами, а также появление некротизиро-ванных эндотелиоцитов.

В миокарде цитотоксические эффекты БК и ее амида при их использовании в качестве моноагентов прявлялись в виде лизиса саркоплазматическо-го матрикса, особенно в околоядерной зоне, умеренного лизиса миофибрил-лярных пучков, неравномерного расширения везикул агранулярной сарко-плазматической сети. Литические изменения миофибриллярных пучков были незначительными, в этих участках всегда локализовались полисомы, наблюдалось новообразование миофиламентов. Амид БК вызывал в некоторых клетках повреждения тонкой структуры митохондрий, выражавшихся в диффузном лизисе митохондриального матрикса, редукции крист и нарушении их упаковки. Следует отметить, что изменения тонкой структуры митохондрий в гепатоцитах, кардиомиоцитах и макрофагах при действии аланиламида БК были однотипными.

В то же время тритерпеноиды стимулировали процессы внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов. Так, под влиянием амида БК происходило увеличение массы сердца к 14-м суткам эксперимента и наиболее значительное возрастание пула одноядерных кардиомиоцитов. На фоне БК наблюдалось увеличение количества эндоцитозных (пиноцитозных) везикул, образовываемых сарколеммой кардиомиоцитов.

На фоне циклофосфамида и доксорубицина бетулоновая кислота и ее (3-аланиламид проявляли политаргетное действие на клеточные популяции печени и миокарда, потенцируя цитотоксическое действие цитостатиков в отношении одних клеток и стимулируя регенераторные реакции - в других. При введении с ЦФ оба тритерпеноида существенно повышали эндоцитозную активность синусоидальной плазмолеммы гепатоцитов, эндотелиоцитов синусоидов в печени и клеток Купфера. Наблюдались также признаки частичного восстановления ультраструктуры гепатоцитов в виде появления везикул гладкой цитоплазматической сети, которая после действия цитостати-ков (циклофосфамида и доксорубицина) была значительно редуцирована.

Амид БК в сочетании с ЦФ вызывал более раннее восстановление ультраструктуры гепатоцитов, при этом также наблюдалось появление большого количества крупных митохондрий с неравномерно расширенными кри-стами. Признаком усиления регенераторных процессов под действием БК и ее аланиламида на фоне ЦФ можно считать повышение митотической активности гепатоцитов и увеличения количества двуядерных клеток. Такие же изменения митотической активности гепатоцитов и кардиомиоцитов отмечались при комбинированном воздействии ДОК и тритерпеноидов. Следует отметить, что изученные лупановые тритерпеноиды не подавляли клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов при их как комбинированном использовании с цитостатиками, так и введении в качестве моноагентов.

В то же время БК и ее аланиламид вызывали усиление деструктивных изменений отдельных гепатоцитов при их применении после введения циклофосфамида. В гепатоцитах это выражалось в появлении субплазмалем-мальных скоплений вакуолеобразных остаточных телец и выраженной секвестрации гликогена - усилении процессов аутофагоцитоза. В печени также фиксировалась гибель отдельных гепатоцитов путем некроза и апоптоза.

После введения ДОК и тритерпеноидов нарушения в печени фиксировались в виде умеренной субплазмалеммальной липидной инфильтрации гепатоцитов, некроза отдельных гепатоцитов, венозного и синусоидального полнокровия. К ультраструктурным повреждениям относились усиление секвестрации гликогена, частичная деструкция митохондриальных крист и усиление аутофагоцитоза. К концу опыта отмеченные выше нарушения наблюдались в отдельных гепатоцитах.

К признакам усиления регенераторных процессов в печени под влиянием изученных лупановых тритерпеноидов - бетулоновой кислоты и ее аланиламида, также как и на фоне ЦФ, относятся усиление эндоцитозной (транци-тозной) активности гепатоцитов, гипертрофия и гиперплазия структурных элементов комплекса Гольджн. На фоне ДОК БК в большей степени, чем амид БК снижала выраженность субплазмалеммальной липидной инфильтрации гепатоцитов и венозное и синусоидальное полнокровие. Кроме того, она вызывала более значительное накопление гликогена. В то же время для амида БК было характерно более быстрое восстановление ультраструктуры клеток.

Результаты эксперимента с введением БК и ее амида на фоне ЦФ свидетельствуют о том, что в миокарде тритерпеноиды вызывают сходные с ци-тостатиком морфофункциональные изменения и первоначально вызывают их усиление. К цитотоксическим эффектам исследуемых агентов относятся ли-тические и некробиотические повреждения кардиомиоцитов в виде литиче-ских повреждений миофибрилл, расширений везикул саркоплазматической сети и межмембранного околоядерного пространства, усиление аутофагоци-тоза. Наиболее выраженными эти изменения были при сочетанном введении ЦФ и аланиламида БК, что обусловило наиболее значительное уменьшение массы сердца и снижение общей численности кардиомиоцитов в ранние сроки эксперимента.

Использование тритерпеноидов в то же время стимулировало процессы внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов. Во многих кардиомиоцитах в саркоплазме присутствовали многочисленные полисомы, в околоядерной зоне отмечалась гиперплазия структурных элементов комплекса Гольджи. Восстановление ультраструктуры кардиомиоцитов при комбинированном применении ЦФ и тритерпеноидов происходило быстрее.

В миокарде крыс при введении БК и ее амида на фоне ДОК также отмечен их синергизм с цитостатиком в отношении выраженности ультраструктурных изменений основных компартментов кардиомиоцитов. К признакам цитотоксического влияния тритерпеноидов, вводимых в сочетании с ДОК, можно отнести значительные диффузные литические повреждения миофибриллярных пучков, саркоплазматического матрикса и деструктивные изменения отдельных митохондрий, а также расширения межмембранного околоядерного пространства и саркоплазматической сети. Во многих кардиомиоцитах эти изменения были даже более выраженными, чем при введении только ДОК. К концу опыта выраженность этих нарушений снижалась. Появлялись признаки стимуляции регенераторных процессов в виде появления полисом в участках лизиса миофибрилл.

Эти данные свидетельствуют о том, что БК и ее амид могут потенцировать как цитотоксические эффекты ЦФ и ДОК, так и выступать в качестве индукторов регенераторных реакций в кардиомиоцитах и гепатоцитах. Такое двойственное действие можно объяснить структурно-функциональной гетерогенностью паренхиматозных клеток - присутствием в каждом органе субпопуляций клеток, находящихся на разных стадиях созревания и проявляющих разную функциональную активность. В силу предсуществующей дифференциальной экспресси в клетках молекул сигнальной трансдукции и ци-топротекции под действием одних и тех же агентов в клетках возможна активация различных сигнальных путей с усилением процессов либо цитопротек-ции, либо деструкции. В частности, процессы восстановления паренхиматозных клеток печени и сердца, повышение их регенераторного резерва могут быть связаны с активностью цитопротекторных путей, снижающих выраженность воспалительного и оксидативного стресса. Подобные случаи описаны в литературе в отношении других тритерпеноидных соединений. Так, предварительное введение олеаноловой и урсоловой кислот предупреждало оксидативное повреждение миокарда некрозогенным агентом изопротерено-лом [ЭепЛП 8. е1 а1., 2007]. Выявлена стимуляция репаративной регенерации печени под действием диникотината и бисгемифталата бетулина [Карачурина Л.Т., 2004].

В то же время характерное для БК и ее амида изменение ультраструктуры митохондрий может быть обусловлено действием апоптогенных факторов, вызывающих дезорганизацию этих внутриклеточных структур. Кроме того, нельзя исключить активирующее влияние тритерпеноидов на макрофаги, которые, в свою очередь, могут оказывать опосредованное (через секрецию цитокинов) воздействие на клетки. В связи с этим обращает на себя внимание высокое содержание мононуклеаров и активированных клеток Купфера в просвете и выстилке синусоидов, а также наличие в непосредственной близости от них гепатоцитов и эндотелиоцитов с высокой эндоцитоз-ной (пиноцитозной) активностью.

Считается, что повышение эндоцитозной активности клеток прямо связано с активизацией обмена секреторными молекулами между участниками клеточных взаимодействий, а также свидетельствует об увеличении активности рецепторов на поверхности мембраны [Пальцев М.А. и др., 2003].

Дополнительные доказательства стимуляции БК и ее аланиламидными производными репаративных процессов в тканях были получены при изучении их действия у интактных животных на фоне полихимиотерапии CHOP. Введение тритерпеноидных агентов привело к повышению корково-мозгово-го индекса и снижению количества телец Гассаля в паренхиме тимуса. Наиболее выраженный тимус-протекторный эффект проявила (З-алаБК. Морфологическое исследование почек, проведенное через 15 дней после CHOP, показало, что тритерпеноиды существенно ослабляли нефротоксическое действие цитостатических препаратов. Введение крысам БК и ее производных уменьшало признаки токсического нефроза путем снижения объемной плотности нефроцитов в состоянии дистрофии и некроза. Все тритерпеноиды,. кроме Ме-р-алаБК, способствовали восстановлению просвета капсулы.

В печеночной паренхиме под действием БК и ее аланиламидных производных наблюдалось купирование воспалительных проявлений, уменьшение отека, увеличение свободного просвета синусоидов, сокращение количества очагов некроза, цитолитических повреждений гепатоцитов, количества клеток с пикнотичными ядрами. В гепатоцитах отмечено увеличение объемной плотности ядер при сохранении нормальной плотности цитоплазмы, что привело к достоверному повышению ядерно-цитоплазматического отношения в этих группах. Полученные результаты указывают на усиление синтетических процессов в клетках печени, связанных с повышением их функциональной активности.

В результате исследований, проведенных на животных с перевиваемыми злокачественными опухолями в условиях полихимиотерапии CHOP, установлены особенности влияния БК и ее аланиламидных производных на структурно-функциональное состояние печени и почек. Показано, что в печени животных с карциномой легких Льюис после ПХТ, вызывающей массивную гибель гепатоцитов и выраженную липидную инфильтрацию цитоплазмы, БК и р-алаБК снижали выраженность дистрофических изменений в гепатоцитах: в них практически отсутствовали зоны «опустошения» цитоплазмы и липидная инфильтрация, отмечалась незначительная субплазма-леммальная вакуолизация цитоплазмы. Кроме того существенно уменьшалась доля некрозов. Одновременно отмечено усиление митотической активности гепатоцитов. Метилированные производные этих кислот не проявляли подобного эффекта.

В то же время отмечены случаи склерозирования пространств Диссе с разрастанием пучков коллагеновых волокон вокруг гепатоцитов. Коллагени-зацию пространств Диссе и «капилляр! 1зацию» синусоидов после проведения ПХТ и введения тритерпеноидов, по мнению ряда авторов, можно рассматривать в качестве компенсаторно-приспособительного ремоделирования печени в ответ на действие токсических соединений [Непомнящих Д.Л. и др., 2006; Молодых О.П. и др., 2008]. В этих условиях снижение транссинусоидального обмена способствует уменьшению повреждения гепатоцитов, но одновременно замедляет приток пластических веществ и факторов роста, необходимых для внутриклеточной и клеточной регенерации.

Введение БК и ß-алаБК на фоне ПХТ животных со злокачественной лимфомой RLS вызывало снижение количества гепатоцитов в состоянии некроза. В этом случае также отмечено уменьшение выраженности дистрофических изменений гепатоцитов. Наибольший положительный эффект проявил ß-алаБК. Под действием БК снижение некротических поражений было небольшим, однако она достоверно снижала объемную плотность дистрофически измененных гепатоцитов в отсутствии ПХТ. Обращает на себя внимание существенное снижение объемной плотности метастазов в синусоидах под действием тритерпеноидов. Данный эффект, отмечавшийся у животных с LLC и RLS, свидетельствует о возможной активации тритерпеноидами сигнальных путей апоптоза и клеточной дифференцировки опухолевых клеток.

Положительные сдвиги под действием БК и ее аланиламидных производных наблюдались в почках мышей с LLC и RLS, которым проводилась ПХТ CHOP. Введение БК, ее метилового эфира и двух ß-аланиламидных производных БК снижало степень альтерации в проксимальных канальцах мышей с LLC, уменьшало объемную плотность некротических и дистрофических поражений эпителиоцитов, увеличивало просвет проксимальных канальцев. Аналогичные положительные сдвиги выявлялись под действием БК и ее ß-аланиламида у мышей с RLS в условиях ПХТ. Следует отметить, что наиболее выраженная положительная динамика репаративных процессов в почках наблюдалась на фоне введения ß-аланиламида БК.

Известно, что на фоне прогрессирования неопластического роста усиливается воспалительная инфильтация тканей полинуклеарными и мононук-леарными фагоцитами, отмечаются связанные с этим сдвиги в лейкоцитарном профиле крови и в костном мозге. Анализ морфологической картины белой крови мышей-опухоленосителей показал, что ß-аланиламид БК и в меньшей степени метиловые эфиры БК сохраняли в условиях ПХТ модулирующее влияние на общую численность лейкоцитарных клеток, при этом у них отмечалось стимулирующее влияние на моноциты. Сама БК не снижала нейтрофилез в крови животных с LLC.

Ведение БК на фоне ПХТ также не изменяло количества клеток грану-лоцитарного ряда в костном мозге, тогда как ее производные вызвали значимое повышение количества зрелых лейкоцитов относительно группы ПХТ, а ß-аланиламид БК также увеличивал продукцию незрелых миелоцитов. Следует отметить, что у животных с LLC на фоне ПХТ ß-аланиламид БК достоверно увеличивал индексы созревания эритроцитов и гранулоцитов, что можно рассматривать как его стимулирующее влияние на дифференцировку этих клеточных элементов гемопоэза. Показатели индексов созревания клеток костного мозга у мышей с лимфомой RLS, подвергавшихся воздействию цитостатиков и тритерпеноидов, подтверждают стимулирующее влияние БК и ее ß-аланиламида в основном на гранулоцитарно-моноцитарный росток крови.

Стимулирующее влияние лупановых тритерпеноидов на дифференцировку гранулоцитарно-макрофагальных предшественников подтверждается данными Koschmieder S.et al. (2007), которые свидетельствуют о повышении дифференцировки гранулоцитов и моноцитов в костном мозге больных мие-лоидной лейкемией после воздействия тритерпеноида олеонанового типа (CDDO). Сообщалось, что повышение дифференцировки и фагоцитарной активности гранулоцитов и макрофагов достигается независимо от апоптоз-индуцирующего действия агента.

В результате исследования влияния лупановых тритерпеноидов на состояние окислительного стресса у мышей-опухоленосителей в условиях ПХТ у БК, ее аланиламидных, пиперазиновых, диоксииминового производных и диникотината бетулина выявлена способность эффективно снижать уровень маркера перекисного окисления липидов - ТБК-активных соединений. Этот результат воспроизводился на животных с LLC и RLS.

В опытах на мышах с перевиваемыми опухолями установлено, что лу-пановые тритерпеноиды не обладают стимулирующим влиянием на опухоль в условиях ПХТ. При курсовом введении аланиламидных и пиперазиновых производных БК, ее диоксииминометилового эфира и диникотината бетулина не зафиксировано случаев достоверного увеличения объема опухолевых узлов в постцитостатическом периоде. Выявлены агенты, потенцирующие про-тивоопхолевый эффект ПХТ: а-аланиламид БК и его метиловый эфир, Р~ аланиламид БК, диоксииминометиловый эфир БК и диникотинат бетулина. Установлено, что р-аланиламид БК и его метиловый эфир также повышают антиметастатическое действие ПХТ CHOP

Обнаруженная у изученных тритерпеноидов антиоксидантная и противоопухолевая активности, свидетельствуют о вовлеченности цитопротектор-ных и апоптотических сигнальных путей в механизмы действия этих соединений. Полученные в данной работе доказательства цитопротекторного и ци-тотоксического действия лупановых агентов позволяют говорить об их поли-таргетном механизме действия.

На основании результатов, представленных в работе, среди аланиламидных производных БК выбрано наиболее активное соединение - Р-аланиламид БК (3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота), которое рекомендовано для доклинических испытаний в качестве препарата-модификатора цитостатической полихимиотерапии.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Сорокина, Ирина Васильевна, Новосибирск

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М.: Медицина, 1990. - 384 с.

2. Амосова E.H., Зуева Е.П., Разина Т.Г. и др. Лекарственные растения как средства дополнительной терапии для лечения опухолей // Бюл. экспер. биол. 2003. - Прил. 2. - С. 24 - 34.

3. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Томск: ТГУ, 1980. - 313 с.

4. Богуш Т.А. Микросомальные оксидазы печени и действие противоопухолевых препаратов. М., 1983. - С. 26 - 32.

5. Фаучи Э., Браунвальда Ю., Иссельбахеа К. и др. (Ред.) Внутренние болезни по Тинсли Р. Харрисону. М.: Практика - Мак-Гроу-Хилл, 2005. - Т. 2. - С. 630 - 643.

6. Волкова М.А. Интерфероны // Клиническая онкогематология / Ред. М.А. Волкова. М.: Медицина, 2001. - С. 77 - 85.

7. Гершанович М.Л., Филов В. А., Акимов М.А., Акимов А. А. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей. СПб: Сатис, 1999. - С. 7 -137.

8. Гилман А.Г. (Ред.) Клиническая фармакология по Гудману и Гилману. -М.: Практика, 2006. 1648 с.

9. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. и др. Фармакологические аспекты регенеративной медицины // Бюл. экспер. биол. 2008. - Прил. 2. -С. 14-21.

10. Гольдберг Е.Г., Зуева Е.П. Препараты из растений в комплексной терапии злокачественных новообразований. Томск: Томский университет, 2000. - 128 с.

11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в регуляции кроветворения при цитостатических миело-супрессиях. Томск, 1999. - 115 с.

12. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992. - 264 с.

13. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шерстобоев Е.Ю. Механизмы локальной регуляции кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. Томск, 2000. - 120 с.

14. Грек O.P., Мишенина C.B., Пупышев А.Б. Протективное действие энте-росгеля на лизосомы печени крыс при введении комплекса цитостатиче-ских препаратов // Бюл. экспер. биол. 2002. - Т. 134, № 10. - С. 413 -417.

15. Грек O.P., Позднякова C.B., Жоголь P.A. и др. Аланинамидные производные бетулоновой кислоты новые индукторы монооксигеназной системы печени // Бюл. Сибирской медицины. - 2006. - Прил. 2. - С. 63 - 65.

16. Гришанова А.Ю., Каледин В.И., Зуева Е.П. и др.// Вопр. мед. химии. -2003. Т. 49. - Вып. 1. - С. 27 - 34.

17. Дыгай А.М., Жданов В.В., Удут Е.В. Фармакологическая регуляция эри-тропоэза. М.: Изд-во РАМН, 2009. - 176 с.

18. Ермолаева JI.A. Дубская Т.Ю., Фомина Т.И. и др. Токсическое действие противоопухолевого препарата паклитаксела на морфофункциональное состояние печени крыс // Бюл. экспер. биол. 2008. - Т. 145, № 2. - С. 225 -228.

19. Жанаева С .Я., Короленко Т. А., Хощенко О.М. Влияние ингибитора цис-теиновых протеаз ЕР-475 на ФНО-а независимый апоптоз клеток мышиной лимфосаркомы LS, индуцированной циклофосфаном // Бюл. экспер. биол. 2005. - Т. 139, № 2. - С. 153 - 156.

20. Жоголь P.A., Шарапов И.В., Грек O.P. и др. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на активность микросомального метаболизма при тепловой ишемии печени // Журн. эксперим. и клин. мед. 2006. - № 1 -2.-С. 25-28.

21. Захаров A.A. Морфологические изменения тимуса после иммуносупрес-сии в эксперименте 11 Клиническая анатомия и оперативная хирургия. -2008.-Т. 7, №4.-С. 14-16.

22. Ивашкин И.Т., Непомнящих Г.И., Айдагулова C.B. и др. Лекарственно-индуцированное поражение печени: универсальные структурные маркеры // Росс. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2009. -T. XIX, № 2. - С. 20 - 29.

23. Исеева Е.А., Быков В.Л. Морфофункциональные изменения эпителия пищевода при воздействии цитостатика // Морфология. 2006. - Т. 130, №6.-С. 62-67.

24. Кадагидзе З.Г. Цитокины и их использование в онкологии // Int. J. Immu-norehabil. 1997. - № 6. - С. 47 - 56.

25. Каледин В.И., Николин В.П., Агеева Т.А., Тимофеева O.A. Циклофосфа-мид-индуцирующий апоптоз клеток мышиной лимфосаркомы в условиях in vivo // Вопр. онкологии. 2000. - Т.46, № 5. - С. 588 - 590.

26. Камышников В.С.Справочник по лабораторно-клиническим методам анализа. Минск: Беларусь, 2000. - Т. 2. - С. 142.

27. Карачурина JI. Т. Биохимические механизмы гепатопротекторного действия тритерпеноидов лупанового ряда и их фармакологическая активность. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Уфа, 2004. - 25 с.

28. Карачурина Л.Т., Сапожникова Т.А., Зарудий Ф.С. и др. Исследование некоторых фармакологических свойств бисгемифталата бетулина // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2003. - Т. 66, № 4. - С. 56 -59.

29. Карачурина JI.T., Сапожникова Т.А., Зарудий Ф.С. и др. Противовоспалительные и противоязвенные свойства бисгемифталата бетулина // Хим.-фармацевт. ж. 2002. - Т. 36, № 8. - С. 32 - 33.

30. Козлов JI.B., Бурделев О.О., Буреева C.B., Каплун А.П. Исскуственное ингибирование системы комплимента // Биоорг. химия. 2007. - Т. 33, № 5.-С. 485-510.

31. Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. Москва: Практическая медицина, 2006. - 512 с.

32. Корулькин Д.Ю., Абилов Ж.А., Музычкина P.A., Толстиков Г.А. Природные флавоноиды. Новосибирск: Изд. «Гео», 2007. - 230 с.

33. Ле Банг Шон, Каплун А.П., Шпилевский A.A. и др. Синтез бетулиновой кислоты из бетулина и исследование ее солюбизации с помощью липосом // Биоорг. химия. 1998. - Т. 24, № Ю. - С. 787 - 793.

34. Ле Банг Шон, Посыпанова Г.А., Колибаба Л.Г. и др. Исследование цито-токсической активности бетулиновой кислоты, ее производных и липосо-мальной формы in vitro // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2002. - № 4. - С. 31 - 34.

35. Ли Дапэн. Прогресс в основных исследованиях и клиническом применении противоопухолевого препарата канглайт для инъекций // Российский биотерапевтический журнал. 2007. - Т. 1, № 3. - С. 63 - 70.

36. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Розенберг В.Д. Морфологические и молекулярно-генетические основы дилатационной каридомиопатии М.: Изд-во РАМН, 2004. - 192 с.

37. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Толстикова Т.Г. Патоморфология мышечных клеток сердца при действии циклофосфамида и тритерпенои-дов. М.: Изд-во РАМН, 2009. - 272 с.

38. Молодых О.П., Лушникова Е.Л., Клинникова М.Г., Непомнящих Л.М. Внутриклеточная реорганизация гепатоцитов при воздействии доксору-бицина // Бюл. экспер. биол. 2007. - Т. 144, № 10. - С. 464 - 472.

39. Молодых О.П., Лушникова ЕЛ., Бакулина A.A. и др. Ремоделирование печени крыс при гепатотоксическом воздействии доксорубицина // Бюл. СО РАМН. 2008. - Т. 134, № 6. - С. 104 - 112.

40. Молодых О.П., Лушникова Е.Л., Клиникова М.Г., Непомнящих Л.М. Структурная реорганизация печени крыс при цитотоксическом действии доксорубицина // Бюл. экспер. биол. 2006. - Т. 141, № 5. - С. 579 - 585.

41. Наджимитдинов С.Т. Основные лабораторные методы исследования морфологии клеток крови. Ташкент: Медицина, 1970. — 152 с.

42. Непомнящих Г.И., Дюбанова Г.И., Непомнящих Д.Л. и др. Универсальные структурные маркеры гепатотоксического воздействия лекарственных препаратов // Бюлл. СО РАМН. 2008. - № 6. - С. 86 - 92.

43. Нигматуллина Л.Н. Синтез новых физиологически активных веществ на основе тритерпеноидов лупанового ряда. Дис. канд. хим. наук. - Уфа: ИОХ УНЦ РАН, 2002.

44. Никитин И.Г., Сторжаков Г.И. Лекарственные поражения печени // Болезни печени и желчевыводящих путей: Руководство для врачей. Под ред. В.Т.Ивашкина. - М.: Издат. дом. М-Вести, 2002. - 254 с.

45. Переводчикова H.H. Противоопухолевая химиотерапия. М., 1996. - С. 66-70.

46. Пальцев М.А., Иванов A.A., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. М.: Медицина, 2003. - 288 с.

47. Петренко Н.И., Еланцева Н.В., Шульц Э.Э. и др. Синтез производных бе-тулоновой кислоты, содержащих аминокислотные фрагменты // Химия природ, соед. 2002. - № 2. - С. 276 - 253.

48. Погребняк A.B., Василенко Ю.К., Оганесян Э.Т. и др. Компьютерный прогноз и направленный синтез нового производного бетулина, обладающего противотуберкулезным действием // Хим.-фарм. журн. 2002. - Т. 36.-С. 18-21.

49. Подольцева Э.И. Колониестимулирующие факторы в онкологии // Практическая онкология. 2001. - № 1. - С. 21 - 24.

50. Позднякова C.B., Грек O.P., Фунтиков A.C. и др. Нефропротекторный эффект производных бетулоновой кислоты при экспериментальном цито-статическом повреждении почек у крыс // Бюл. СО РАМН. 2007. - № 5. -С. 117-121.

51. Покровский А.Г., Плясунова O.A., Ильичева Т.Н. и др. Синтез производных растительных тритерпеноидов и исследование их противовирусной и иммуностимулирующей активности // Химия в интересах устойчивого развития. 2001. - Т. 9. - С. 485 - 491.

52. Покровский А.Г., Шинтяпина А.Б., Пронкина Н.В. и др. Активация апоп-тоза производными бетулиновой кислоты в опухолеых клетках человека in vitro // Докл. акад. наук. 2006. - Т. 407. - С. 698 - 701.

53. Птушкин В.В., Волкова М.А. Гемопоэтические факторы роста: биологические основы функционирования и клиническое применение // Клиническая онкогематология / Ред. М.А.Волкова. Москва: Медицина, 2001. - С. 52-71.

54. Разина Т.Г., Зуева Е.П., Амосова E.H. и др. Препараты из лекарственных растений как среда дополнительной терапии в экспериментальной онкологии // Вопр. онкол. 2000. - Т. 63, № 5. - С. 554 - 556.

55. Разина Т.Г., Хотимченко Ю.С., Зуева Е.П. и др. Некрахмальные полисахариды как • корректоры цитостатической терапии экспериментальных опухолей // Экспер. и клин, фармакол. 2006. - Т. 142. - № 9. - С. 59 - 61.

56. Разина Т.Г., Амосова E.H., Боровская Т.Г. и др. О возможности использования сока подорожника при химиотерапии хлокачественных образований в эксперименте // Вопросы экспериментальной и клинической онкологии. Томск. - 1982. - Вып. 1. - С. 65 - 68.

57. Райхлин Н.Т., Горбунова В.А., Трещалина Е.М. и др. Механизм гемопро-текторного действия дикарбамина у больных раком яичников при проведении химиотерапии // Вопр. онкол. 2004. - Т. 50. - № 2. - С. 53 - 56.

58. Семенов A.A. Очерк химии природных соединений. Новосибирск: Наука, 2000.-664 с.

59. Семенова Е.А., Плясунова O.A., Петренко Н.И. и др. Ингибирование активности рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 производными высших тер-пеноидов // Докл. АН. 2003. - Т. 391, № 4. - С. 556 - 558.

60. Софьина З.П., Сыркин А.Б., Голдин А., Кляйн А. Экспериментальнаяоценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. М.: Медицина, 1980.-296 с.

61. Степанова Е.В. Антиангиогенная терапия: новые возможности лечения злокачественных заболеваний // Практич. онкол. 2002. - № 4. - С. 246 -252.

62. Стоник В.А. (Ред.). Успехи в изучении природных соединений. Владивосток: Изд-во Дальнаука, 1999. - 221 с.

63. Сторожок Н.М., Цымбал И.Н., Петренко Н.И. и др. Взаимосвязь структуры и ингибирующего действия аминоислотных производных бетулоновой кислоты // Науч. вестник Тюменской мед. акад. Биооксиданты. 2003. - № 1 (23).-С. 62-65.

64. Стрелкова Л.Б., Минеева М.Ф., Тополева Т.В. Исследование влияния «Бересты экстракта сухого» на ключевые ферменты биотрансформации (цитохром Р450) и микросомальные мембраны печени крыс // Хим.-фарм. журн. 2007. - Т. 41, № 5. - С.32 - 36.

65. Сымон A.B. Молекулярная модифиация бетулиновй кислоты как антиме-ланомного средства: Автореф. дис. .канд. хим. наук. Москва, 2004. -25 с.

66. Сымон A.B., Веселова H.H., Каплун А.П. и др. Синтез циклопропановых производных бетулиновой и бетулоновой кислот и их противоопухолевая активность // Биоорг. химия. 2005. - Т. 31. - С. 320 - 325.

67. Толстиков Г.А., Петренко H.H., Еланцева Н.В. и др. Пат. РФ 2211843. 2003.

68. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А. и др. Терпеноиды ряда лупана биологическая активность и фармакологические перспективы. II. Полусинтетические производные лупана // Биоорг. химия. - 2006. - № 3. -С. 291-307.

69. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А. и др. Терпеноиды ряда лупана биологическая активность и фармакологические перспективы. I. Нативные производные лупана // Биоорг. химия. - 2006. - Т. 32, № 1. - С. 42 - 55.

70. Трещалина Е.М. Противоопухолевая активность веществ природного происхождения. Москва: Практическая медицина, 2005. - 272 с.

71. Удинцев С.Н., Разина Т.Г., Яременко К.В. О противоопухолевом эффекте шлемника байкальского // Вопр. онкол. 1990. - Т. 36, № 5. - С. 602 - 607.

72. Флехтер О.Б., Ашавина О.Ю., Бореко Е.И. и др. Синтез З-О-ацетил-бетулинового и бетулонового альдегидов по Сверну и фармакологическая активность их оксимов // Хим.-фарм. журн. 2002. - Т. 36, № 6. - С. 21 -24.

73. Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматуллина Л.Р. и др Синтез и противовирусная активность гидразидов и замещенных бензальгидразидов бетули-новой кислоты и ее производных // Биоорг. хим. 2004. - Т. 29. - С. 326 -332.

74. Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматуллина Л.Р. и др. Синтез и противовирусная активность амидов и конъюгатов бетулоновой кислоты с аминокислотами // Биоорг. хим. 2004. - Т. 30. - С. 89 - 98.

75. Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматуллина Л.Р., Третьякова Е.В. и др. Синтез и противовирусная активность уреидов и карбаматов бетулиновой кислоты и ее производных // Биоорг. химия. 2003. - Т. 29, № 6. - С. 655 -661.

76. Флехтер О.Б., Карачурина Л.Г., Нигматуллина Л.Р. и др. Синтез и фармакологическая активность диникотината бетулина // Биоорг. химия. 2002. -Т. 28.-С. 543-550.

77. Флехтер О.Б., Карачурина Л.Т., Нигматуллина Л.Р. и др. Синтез и гепато-протекторная активность 2-арилиденовых производных метилбетулоната // Хим.-фарм. журн. 2000. - Т. 34, № 2. - С. 3 - 5.

78. Флехтер О.Б., Карачурина Л.Т., Плясунова O.A. и др. Патент РФ 2174982. 2001.

79. Флехтер О.Б., Карачурина Л.Т., Поройков В.В. и др. Синтез эфиров три-терпеноидов группы лупана и их гепатопротекторная активность // Биоорг. химия. 2000. - Т. 26, № 3. - С. 215 - 223.

80. Флехтер О.Б., Медведева H.H., Карачурина Л.Т. и др. Синтез и противовоспалительная активность новых ацилпроизводных бетулина И Хим.-фарм. журн. 2002. - Т. 36, № 9. - С. 29 - 32.

81. Хабриев Р.У. (Ред.). Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: ОАО Изд-во «Медицина», 2005. - 832 с.

82. Шабашова Н.В. Лекции по клинической иммунологии. СПб, 1998. - 114 с.

83. Шинтяпина А.Б., Борисов В.И., Кожевников B.C. и др. Исследование противоопухолевого механизма действия бетулиновой кислоты и ее производных in vitro // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. 2008. - Т. 6. - Вып. 3. - С. 12 - 18.

84. Шинтяпина А.Б., Шульц Э.Э., Петренко Н.И. и др. Влиние азотсодержащих производных растительных тритерпенов бетулина и глицирретовой кислоты на рост опухолевых клеток МТ-4, MOLT-4, СЕМ и HER G2 // Биоорг. химия. - 2007. - Т. 33. - С. 624 - 626.

85. Ямагути X., Сугимото М., Асано И. и др. // Jpn. Pat. 62-301580 РЖ Хим (1990) 1Ю202П.

86. Aapro M.S., Martin С., Hatty S. Gemcitabin a safety review // Anticancer Drugs. - 1998. - Vol. 9. - P. 191 - 201.

87. Ahmad R„ Raina D„ Meyer C. et al. Triterpenoid CDDO-Me blocks the NF-kappaB pathway by direct inhibition of IKKbeta on Cys-179 // J. Biol. Chemistry. 2006. - Vol. 281. - P. 35764 - 35769.

88. Aiken C., Chen C.H. Betulinic acid derivatives as HIV-1 antivirals // Trends Mol. Med. 2005. - Vol. 11. - P. 31 - 36.

89. Akihisa Т., Tokuda H., Ubiya M. et al. 3-Epicabraleahydoxylactone and Other Triterpenoids from Camellia Oil and their Inhibitory Effects on Epstein Ban-Vims Activation. // Chem. Pharm. Bull. 2004. - Vol. 52. - P. 153 - 156.

90. Akihisa Т., Takamine Y., Yoshizumi K. et al. Microbial transformations of two lupane-type triterpenes and anti-tumor-promoting effects of the transformation products // J. Nat. Prod. 2002. - Vol. 65. - P. 278 - 282.

91. Alakurtti S., Makela Т., Koskimies S. et al. Pharmacological properties of the ubiquitous natural product betulin // Eur. J. Pharm. Sci. 2006. - Vol. 29. - P. 1-13.

92. Albini A., Sporn M.B. The tumor microenvironment as a target for chemopre-vention // Nat. Rev. Cancer. 2007. - Vol. 7. - P. 139 - 147.

93. Albini A., Tosetti F., Benelli R. et al. Tumor inflammatory angiogenesis and its chemoprevention // Cancer Res. 2005. - Vol. 65. - P. 10637 - 10641.

94. Amato R.J., Loughran M.S., Flynn E. et al. Thalidomide as an inhibitor of angiogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 4082 - 4085.

95. Amato R.J., Wnend S. Immunomodulation by thalidomide: systemic review of the literature and of unpublished observations // J. Inlamm. 1995. - Vol. 46. -P. 177-221.

96. Amor E.C., Villasenor I.M., Vasin A., Choudhary M.I. Prolyl endopeptidase inhibitors from Syzygium samarangense (Blume) // Z. Naturforsch. (C). 2004.-Vol. 59.-P. 86-92.

97. Aratanechemuge Y., Hibasami H., Sanrin K.et al. Induction of apoptosis by lu-peol isolated from mokumen (Gossampinus malabarica L. Merr) in human promyelotic leukemia HL-60 cells // Oncol. Rep. 2004. - Vol. 11. - N 2. - P. 289 - 292.

98. Arndt C., Hawkins D., Anderson J.R. et al. Age is a risk factor for Chemotherapy-induced hepatopathy with vincristine, dactinomycin, and cyclophosphamide // J. Clin. Oncol. 2004. -Vol. 22. - P. 1894 - 1901.

99. Ayash L.J., Wright J.E., Tretyakov O. et al. Cyclophosphamide pharmacokinetics: Correlation with cardiac toxicity and tumor response // J. Clinic. Oncol. 1992. - Vol. 10. - P. 995 - 1000.

100. Baglin I., Mitaine-Offer A.-C., Nour M. et al. A Review of Natural and Modified Betulinic, Ursolic and Echinocystic Acid Derivatives as Potential Antitumor and Anti-HIV Agents // Mini Rev. Med. Chem. 2003. - Vol. 3. - P. 159 -165.

101. Baltina L.A., Flekhter O.B., Nigmatullina L.R. et al. Lupane triterpenes and derivatives with antiviral activity // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. - Vol. 13.-P. 3549-3552.

102. Bar S., Alison M. Role of the ectodomain of the gp41 transmembrane envelope protein of human immunodeficiency virus type 1 in late steps of the membrane fusion process // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - P. 811 - 820.

103. Baskar R., Malini M., Varalakshmi P. et al. Effect of lupeol isolated from Cra-taeva nuvala stem bark induced toxicity in experimental urolithiasis // Phyto-therapia. 1996. - Vol. 67. - P. 121 - 125.

104. Basser R.L., Abraham R., Bik T.L. et al. Cardiac effects of high-dose epirubi-cine and cyclophosphamide in women with poor prognosis breast cancer // Ann. Oncol. 1999. - Vol. 10. - P. 53 - 58.

105. Bernard P., Scior T., Didier B. et al. Ethnopharmacology and bioinformatic combination for leads discovery: Application to phospholipase A2 inhybitors // Phytochemistry. 2001. - Vol. 58. - P. 865 - 874.

106. Biema B., Willemse P.N.B., Mulder N.H. et al. II Blood. 1992. - Vol. 80. -P. 1141.

107. Boreko E.I., Pavlova N.I., Savinova O.V. et al. Inhibition of virus reproduction and proteinase activity by lupane and some other terpenes // Proc. Natl. Acad. Sci. Belarus. Ser. Med.-Biol. Sci. 2002. - N 3. - P. 86 - 91.

108. Bouralexis S., Findlay D., Evdokiou A. Death to the bad guys: Targeting cancer via Apo2L/TRAIL // Apoptosis. 2005. - Vol. 10. - P. 662 - 672.

109. Bronchud M.H., Scarffe J.H., Thathcher N. et al. Phase 1/11 study of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in patients receiving intensive therapy // Brit. J. Cancer. 1989. - Vol. 56. - P. 809.

110. Cancer Chemotherapy. Principles and Practice / Ed. by B.A. Chabner, J.M. Collins. Philadelphia: J.B. Lappincott Williams & Wilkins, 1990. - 545 p.

111. Chang C.W., Wang J.P., Wu P.P. et al. Terpenoids from Ocium basilicum // Chin. Pharm. J. 1999. - Vol. 51. - P. 181 - 189.

112. Channa S., Dar A., Yaqoob M. et al. Broncho-vasodilatory activity of fractions and pure constituents isolated from Bacopa monniera // J. Ethnopharma-col. 2003. - Vol. 66. - P. 27 - 33.

113. Chartulvedula V.S.P., Schilling J.K., Randall K.J., Kingston D.J.I. New Cytotoxic Lupan Triterpenoids from Twigs of Coussarea paniculata II J. Nat. Prod. 2003. - Vol. 66. - P. 419 - 422.

114. Chatterjee P., Kouzi S.A., Pezzuto J.M., Hamman M.T. Biotransformation of anti-melanoma agent betulinic acid by Bacillus megarerium ATCC 13368 // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66. - P. 3850 - 3855.

115. Chatterjee P., Pezzuto J.M., Kouzi S.A. Glucosidation of betulinic acid by Cunninghamella species II J. Nat. Prod. 1999. - Vol. 62. - P. 761 - 763.

116. Chaturvedy P.K., Bhui K., Shukla Y. Lupeol: Connotations for chemopreven-tion (mini-review) II Cancer Lett. 2008. - Vol. 263. - P. 1 - 13.

117. Cichewicz R.H., Kouzi S.A. Chemistry, Biological Activity, and Chemo-therapeutic Potential of Betulinic Acid for the Prevention and Treatment of Cancer and HIV Infection // Med. Res. Rev. 2004. - Vol. 24. - N 1. - P. 90 -114.

118. Couch R.D., Browning R.G., Honda T. et al. Studies on the reactivity of CDDO, a promising new chemopreventive and chemotherapeutic agent: Implications for a molecular mechanism of action // Bioorg. Med. Chem. Lett. -2005. Vol. 15. - P. 2215 - 2219.

119. De Clercq E. Current lead natural products for the chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) infection // Med. Res. Rev. 2000. - Vol. 20. -P. 323 - 349.

120. De Clercq E. New developments in anti-HIV chemotherapy // Curr. Med. Chem. 2001. - Vol. 8. - P. 1543 - 1572.

121. DeFronzo R.A., Braine H., Colvin M., Devis P.J. Water intoxication in man after cyclophosphamide therapy. Time course and relation to drug activation // Ann. Intern. Med. 1973. - Vol. 78. - P. 861 - 869.

122. DeLeve L.D. Cellular target of cyclophosphamide toxicity in the murine liver: Role of glutathione and site of metabolic activation // Hepatology. 1996. -Vol. 24.-P. 830-837.

123. Deng Y., Snyder J.K. Preparation of a 24-Nor-l,4-dien-3-one Triterpene Derivative from Betulin: A New Route to 24-Nortriterpene Analogues // J. Org. Chem. 2002. - Vol. 67. - P. 2864 - 2869.

124. Dinkova-Kostova A.T., Liby K.T., Stephenson K.K. et al. Extremely potent triterpenoid inducers of the phase 2 response: correlations of protection against oxidant and inflammatory stress // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - Vol. 102.-P. 4584-4589.

125. Dominguez-CarmonaD.B., Escalante-Erosa F., Garcia-Sosa K. et al. Antiprotozoal activity of brtulimic acid derivatives // Phytomed. 2010. - Vol. 17. - P. 379 - 382.

126. Duker-Eshun G., Jaroszewski J. W., Asomaning W.A. Antiplasmodial activity of labdanes from Aframomum latifolium and Aframomum sceptrum //

127. Planta Med. 2002. - Vol. 68. - P. 642 - 644.

128. Eggler A.L., Liu G., Pezzuto J.M. et al. Modifying specific cysteines of the electrophile-sensing human Keapl protein is insufficient to disrupt binding to the Nrf2 domain Neh2 // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2005. - Vol. 102. - P. 10070-10075.

129. Ehrhard H., Fulda S., Fuhrer M. et al. Betulinic acid-induced apoptosis in leukemia cells // Leukemia. 2004. - Vol. 18. - P. 1406 - 1412.

130. Eiznhamer D.A., Xu ZQ. Betulinic acid: A promising anticancer candidate // Drugs. 2004. - Vol. 7. - N 4. - P. 359 - 373.

131. Eck J., Langer M., Mockel B, et al. Cloning of the mistletoe lectin gene and characterization of the recombinant A chane // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 264. - P. 775 - 784.

132. Enweren N.M., Okogun J.T., Wambebe C.O., Okorie D.A. // Phytomedicine. -2001.-Vol. 8.-P. 112-114.

133. Evers M., Poujade C., Soler F. et al. Betulinic acid derivatives: a new class of specific inhibitors of human immunodeficiency type 1 virus entry // J. Med. Chem. 1996. - Vol. 39. - P. 1056 - 1068.

134. Ewer M.S., Benijamin R.S. Cardiotoxicity of chemotherapeutic drugs // The Chemotherapy Sourse Book / Ed. by M.C.Perry. 1997. - P. 649 - 663.

135. Farrar W.L., Cleavelend J.L., Beckner S.K. et al. Biochemical and molecular events associated with interleukin 2 regulation of lymphocyte proliferation // Immunol. Rev. 1986. - Vol. 92. - P. 49.

136. Fernandez M.A., de las Heras B., Garcia M.D. et al. New insights into the mechanism of action of the anti-inflammatory triterpene lupeol // J. Pharm. Pharmacol. 2001. - Vol. 53. - P. 1533 - 1539.

137. Folkman J. Fighting cancer by attacking its blood supply // Scient. Am. -1996. Vol. 275. - P. 116 - 119.

138. Fontana J., Richi A. Retinoids and other differentiating agents // Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice / Eds. Chabner B.A., Longo D.L. Phylidelphia: Lippincott Williams & Wilkins. - 2002. - Pt 23. - P. 678 -699.

139. Friesel R., Komoriya A., Maciag T.J. Inhibition of endothelial cell proliferation by gamma-interferon // Cell Biol. 1987. - Vol. 104. - P. 689 - 696.

140. Fujioka T., Kashiwada Y., Kilkuskie R.E., Cosentino L.M., Bailas L.M., Jiang J.M., Jansen W.P., Chen I.S., Lee K.H. // J. Nat. Prod. 1994. - Vol. 57.1. P. 243 247.

141. Fulda S. Betulinic Acid: A natural product with anticancer activity // Mol. Nutr. Food Res. 2009. - Vol. 53. - P. 140 - 146.

142. Fulda S., Debatin K.-M. Sensitization for anticancer drug-induced apoptosis by betulinic acid // Neoplasia. 2005. -Vol. 7. - P. 162 - 170.

143. Fulda S., Debatin K.-M. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy // Curr. Cancer Drug Targets. 2004. - Vol. 4. - P. 569 - 576.

144. Fulda S., Friesen C., Los M., Scaffidi C. et al. Betulinic acid triggers CD95 (APO-l/Fas)- and p53 independent apoptosis via activation of caspases in neuroectodermal tumors // Cancer Res. 1997. - Vol. 57. - P. 4956 - 4964.

145. Fulda S., Jeremias I., Debaltin K.-M. Cooperation of betulinic acid and TRAIL to induce apoptosis in tumor cells // Oncogene. 2004. - Vol. 23. - P. 7611-7620.

146. Fulda S., Jeremias I., Pietsch T., Debatin K.M. Betulinic acid: A new chemo-therapeutic agent in treatment of neuroectodermal tumors // Klin. Pediatr. -1999. Vol. 211. - P. 319 - 322.

147. Fulda S., Jeremias I., Steiner H.H., Pietsch T., Debaltin K.M. A new cytotoxic agent against malignant brain-tumor cells // Int. J. Cancer. 1999. - Vol. 82. -p. 435-441.

148. Fulda S., Scaffidi C., Santos S. A. et al. Activation of Mitochondria and Release of Mitochondrial Apoptogenic Factors by Betulinic Acid // J. Biol. Chemistry. 1998. - Vol. 273. - N 51. - P. 33942 - 33948.

149. Gao H., Wu L., Kuroyanagi M. et al. Antitumor promoting constituents from chaenomeles sinensis Koehne and their activities in JB6 Mouse epidermal Cells // Chem. Pharm. Bull. 2003. - Vol. 51. - P. 1318 - 1321.

150. Garcia-Pineres A.J., Castro V., Mora G. Cysteine 38 in p65/NF-KB Plays a Crucial Role in DNA Binding Inhibition by Sesquiterpene Lactones // J. Biol. Chemistry. 2001. - Vol. 276. - P. 39713 - 39720.

151. Gauthier C., Legault J., Lebrun M. et al. Glycosidation of lupan-type triterpe-noids as potent in vitro cytotoxic agents // Bioorg. Med. Chem. 2006. - Vol. 14.-P. 6713-6725.

152. Geetha T., Varalakshmi P. Anti-inflammatory activity of lupeol and lupeol li-noleate in adjuvant-induced arthritis // Fitoterapia. 1998. - Vol. 69. - P. 13 - 19.

153. Gordon M.Y. Cellular and molecular mechanism in chronic myeloid leukemia: Biology and treatment // Brit. J. Hematol. 1996. - Vol. 295. - P. 10 - 20.

154. Green D.R., Kroemer G. The pathophysiology of mitochondrial cell death // Science. 2004. - Vol. 305. - P. 626 - 629.

155. Greetha T., Varalakshmi P. Anti-inflammatory activity of lupeol linoleate in rats // J. Ethnopharmacol. 2001. - Vol. 76. - P. 77 - 80.

156. Groopman J.G., Mitsuyasu R.T., De Leo M.J. et al. Effect of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on myelopoiesis in the acquired immunodeficiency syndrome // N. Engl. J. Med. 1987. - Vol. 317. - P. 593.

157. Gu J.Q., Wang V., Franzblau S.G. et al. Antitubercular constituents of Valeriana laxiflora II Planta Med. 2004. - Vol. 70. - P. 509 - 514.

158. Ha J.Y., Min K.R., Kang S.H. et al. Suppressive effects of triterpenoids on CINC-1 induction in intrleukin-lß-stimulated rat fibroblast NRK-49F cells // Arch. Pharm. Res. 1997. - Vol. 20. - P. 234 - 238.

159. Hata K., Hori K., Ogasawara H. et al. Antileukemia activities of Lup-28-al-20(29)-en-3-on, a lupan triterpene // Toxicol. Lett. 2003. - Vol. 143. - P. 1 -7.

160. Hata K., Hori K., Takahashi S. Role of p38 MAPK in lupeol-induced B162F2 mouse melanoma cell differentiation // J. Biochem. 2003. - Vol. 134. - N 3.1. P. 44i445.

161. Hata K., Hory K. Takahashi S. Differentiation- and apoptosis-inducing activities by pentacyclic triterpenes on mouse melanoma cell line // J. Nat. Prod. — 2002. Vol. 65. - P. 645 - 648.

162. Hata K., Ishikawa K., Hori K., Konishi T. Differentiation-inducing activity of lupeol from Chinese dandelion root (hokoueikon) on mouse melanoma cell line // Biol. Pharm. Bull. 2000. - Vol. 23. - P. 962 - 967.

163. Heiss E., Herhaus C., Klimo K. et al. Nuclear Factor kB Is a Molecular Target for Sulforaphane-mediated Anti-inflammatory Mechanisms // J. Biol. Chemistry. 2001. - Vol. 276. - P. 32008 - 32015.

164. Herr I. and Debatin K.-M. Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy // Blood. 2001. - Vol. 98. - P. 2603 - 2614.

165. Higa M., Ogihara K., Yogi S. Bioactive naphtoquinone derivatives from Di-ospyros maritime Blume // Chem. Pharm. Bull. 1998. - Vol. 46. - P. 1189 -1193.

166. Holz-Smith S.L., Sun I.S., Jin L. et al. Role of human immunodeficiency virus type 1 envelope in the anti HIV activity of betulinic acid derivative IC9564 // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. - Vol. 45. - P. 60 - 66.

167. Honda T. et al. Design, synthesis and anti-inflammatory activity both in vitro and in vivo of new betulinic acid analogues having an enone functionality in ring A // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006. - Vol. 16. - P. 6306 - 6309.

168. Honda T. et al. A novel dicyanotriterpenoid, 2-cyano-3,12-dioxooleano-1,9(1 l)-dien-28-onitrile, active at picomolar concentration for inhibition of nitric oxide production // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002. - Vol. 12. - P. 1027 -1030.

169. Honda T. et al. Design and synthesis of 2-cyano-3,12-dioxoolean-l,9-dien-28-oic acid, a novel and highly active inhibitor of nitric oxide production in mouse macrophages // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. - Vol. 8. - P. 2711 - 2714.

170. Honda T., Rounds B.V., Bore L. et al. Synthetic oleanane and ursane triterpe-noids with modified rings A and C: a series of highly active inhibitors of nitric oxide production in mouse macrophages // J. Med. Chem. 2000. - Vol. 43. -P. 4233-4246.

171. Honda T., Sundararajan C., Yoshizawa H. et al. Novel tricyclic compounds having acetylene groups at C-8a and cyano enones in rings A and C: Highly potent anti-inflammatory and cytoprotective agents // J. Med. Chem. 2007. -Vol. 50.-P. 1731- 1734.

172. Hsu H-J, Yang J.-J., Lin Ch.-Ch. Effects of oleanolic and ursolic acids on inhibiting umor growth and enhancing the recovery of hematopoetic system postradiation in mice // Cancer Lett. 1997. - Vol. 111.- Iss. 1, 2. - P. 7 - 13.

173. Huang L., Yuan X., Aiken C., Chen C.H. Bifunctional anti-human immunodeficiency virus type 1 small molecules with two novel mechanisms of action // Antimicrob. Agents. Chemother. 2004. - Vol. 48. - P. 663 - 665.

174. Huguet A.-I., Recio M.C., Manez S. et al. Effect of triterpenoids on the inflammation induced by protein kinase C activators, neuronally acting irritants and other agents // Eur. J. Pharm.- 2000. Vol. 410. - P. 69 - 81.

175. Hwang B.Y., Chai H.-B., Kardono L.B.S. et al. Cytotoxic triterpenes form the twigs of Celtic philippinensis // Phytochemistry. 2003. - Vol. 62. - P. 197 -201.

176. Hyer M.L. et al. Synthetic triterpenoids cooperate with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand to induce apoptosis of brest cancer cells // Cancer Res. 2005. - Vol. 65. - P. 4799 - 4808.

177. Ikeda T. et al. Induction of redox imbalance and apoptosis in multiple myeloma cells by novel triterpenoid, 2-cyano-3,12-dioxoolean-l,9-dien-28-oic acid

178. Mol. Cancer Ther. 2004. - Vol. 3. - P. 39 - 45.

179. Ikeda T., Sporn M., Honda T. The novel triterpenoid CDDO and its derivatives induce apoptosis by disruption of intracellular redox balance // Cancer Res. 2003. - Vol. 63. - P. 5551 - 5559.

180. Ikuta A., Kamiya K.,Satake T., Saiki Y. Triterpenoids from callus tissue cul-turs of Peonia species // Phytochemistry. 1995. - Vol. 38. - P. 1203 - 1207.

181. Ito J. et al. The novel triterpenoid CDDO induces apoptosis and differentiation of human osteosarcoma cells by caspase-8 dependent mechanism // Mol. Pharmacol. 2001. - Vol. 59. - P. 1094 - 1099.

182. Janssen O., Scheffler A., Kabelitz D. In vitro effect of mistletoe extract and mistletoe lectins. Cytotoxicity towards tumor cells due to induction of programmed cell death (apoptosis) // Arzneimittelforschung. 1993. - Vol. 43. -P. 1221 -1224.

183. Jeong H.-J., Chai H.-B., Park S.-Y. Preparation of amino acid conjugates of betulinic acid with activity against human melanoma // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. - Vol. 9. - P. 1201 - 1206.

184. Kanamoto T., Kashiwada Y., Kanbara K. et al. Anti- human immunodeficiency virus activity of YK-FH312 (a betulinic acid derivative), a nowel compound blocking viral maturation // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. -Vol. 45.-P. 1225-1230.

185. Karin M., Greten F.R. NFkB: linking inflammation and immunity,to cancer development and progression // Nat. Rev. Immunol. 2005. - Vol. 5. - P. 749 -759.

186. Kashiwada Y., Chiyo J., Ikeshiro Y. et al. 3,28-Di-0-(dimethylsuccinyl)-betulin isomers as antiHIV agents // Bioorg. Med. Chem. Letter. 2001. - Vol. 11.-P. 183- 185.

187. Kashiwada Y., Chiyo J., Ikeshiro Y. et al. Synthesis and anti-HIV activity of 3-alkylamido-3deoxy- betulinic acid derivatives // Chem. & Pharmaceut. Bull. 2000. - Vol. 48. - P. 1387 - 1390.

188. Kasperczyk H., La Ferla-Briihl K., Westhoff M.A. Betulinic acid as new activator of NF-kappaB: molecular mechanisms and implications for cancer therapy // Oncogene. 2005. - Vol. 24. - P. 6945 - 6956.

189. Kerbel R.S. Tumor angiogenesis: Past, present and the near future // Carcinogenesis. 2000. - Vol. 21. - P. 505 - 515.

190. Kessler J.H., Mullauer F.B., de Roo G.M., Medema J.P. Novel semisyntheticanalogues of betulinic acid with diverse cytoprotective, antiproliferative, and proapoptotic activities // Mol. Cancer Ther. 2007. - Vol. 6. - P. 2113 - 2119.

191. Kim D.S.H.L., Chen Z., Nguyen V.T. et al. A concise semi-synthetic approach to betulinic acid from betulin // Synth. Commun. 1997. - Vol. 27. - P. 1607- 1612.

192. Kim D.S.H.L., Pezzuto J.M., Pisha E. Synthesis of betulinic acid derivatives with activity against human melanoma // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. -Vol. 8.-P. 1707-1712.

193. Kim J.Y., Koo H.M., Kim D.S. Development of C-20 modified betulinic acid derivatives as antitumor agents // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. - Vol. 11. - P. 2405 - 2408.

194. Kim K.J. Li B., Winer A. et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo // Nature. 1993. -Vol. 362. - P. 841 - 844.

195. Kobayashi M. and Yamamoto M. Nrf2-Keaplregulation of cellular defence mechanisms against electrophiles and reactive oxygen species // Edv. Enzyme Regul. 2006. - Vol.46. - P. 113 - 140.

196. Kohn E.C., Sarosy G., Bicher.A., Link C. et al. Dose-intense taxol: high response rate in patients with platinum resistant recurrent ovarian cancer // J. Natl. Cancer Inst. 1994. - Vol. 86. - 18 - 24.

197. Konopleva M. et al. A novel triterpenoid CDDO-Me is a potent inducer of apoptosis and differentiation in acute melanogenous leukemia // Blood. 2002. -Vol. 99.-P. 326-335.

198. Konopleva M. et al. The novel triterpenoid CDDO-Me suppresses MAPK pathway and promotes p38 activation in acute myeloid leukemia cells // Leukemia. 2005. - Vol. 19. - P. 1350 - 1354.

199. Koschmieder S., D'Alo F., Radomska H. et al. CDDO induces granulocytic differentiation of myeloid leukemic blasts through translational up-regulation of p42 CCAAT enhancer-binding protein alpha // Blood. 2007. - Vol. 110. - P. 3695 - 3705.

200. Kouzi S.A., Chatterjee P., Pezzuto J.M., Hamman M.T. Microbial transformation of the antimelanoma agent betulinic acid // J. Nat. Prod. 2000. - Vol. 63. -P. 1653- 1657.

201. Krasutsky P.A., Carlson R.M., Nesterenko V.V. et al. Birch bark processing and isolation of natural products from birch bark // U.S. Pat. 6,392,070. 2002.

202. Kraut E.H., Neff J.C., Bouroncle B.A., Gochnour D., Grever M.R. Immunosuppressive effects of pentostatin // J. Clin. Oncol. 1990. - Vol. 8. - P. 848 -855.

203. Krogh R., Kroth R., Berti C. et al. Isolation and identification of compounds with antinociceptive action from Ipomoea pescaprae (L.) R. Br // Pharmazie. -1999. Vol. 54. - P. 464 - 469.

204. Labrosse B., Pleskoff O., Sol N. et al. Resistance to a drug blocking human immunodeficiency virus type 1 entry (RPR 103611) is conferred by mutation in jp41 // J. Virol. 1997. - Vol. 71. - P. 8230 - 8236.

205. Lee I.M. Antioxidant vitamins in prevention of cancer // Proc. Assoc. Am. Physicians. 1999. - Vol. 111. - P. 10 - 15.

206. Lee J.S., Min B.S, Bae K.H. Cytotoxic constituents from the Forsythiae fruc-tus against L1210 and HL60 cells // Yakhak Hoeji. 1996. - Vol. 40. - P. 462 -467.

207. Lee S.M., Min B.S., Lee C.G. et al. Cytotoxic triterpenoids from the fruits of Zizyphus jujuba // Planta Med. 2003. - Vol. 69. - N. 11. - P. 1051 - 1054.

208. Levine E.G., Bloomfield C.D. Leukemias and myelodysplastic syndromes secondary to drug, radiation, and environmental exposure // Semin. Oncol. -1992.-Vol. 19.-P. 47-84.

209. Liby K., Honda T., Williams C.R. et al. Novel semisynthetic analogues of betulinic acid with diverse cytoprotective, antiproliferative, and proapoptotic activities // Mol. Cancer Ther. 2007. - Vol. 6. - N 7. - P. 2113 - 2119.

210. Liby K., Yore M.M., Roebuck B.D. et al. A novel acetylenic tricyclic biscyano enone) potently induces phase 2 cytoprotective pathways and blocks liver carcinogenesis induced by aflatoxin // Cancer Res. 2008. - Vol. 68. - P. 6727-6733.

211. Liby K.T., Yore M.M., Sporn M.B. The synthetic triterpenoids, CDDO and CDDO-imidazolide, are potent inducers of heme oxigenase-1 and Nrf2/ARE signaling // Cancer Res. 2005. - Vol. 65. - P. 4789 - 4798.

212. Liby K.T., Yore M.M., Sporn M.B. Triterpenoids and rexinoids as multifunctional agents for the prevention and treatment of cancer // Nature Rev. Cancer. 2007. - Vol. 7. - P. 357 - 369.

213. Liby K.T. et al. The synthetic triterpenoids CDDO-imidazolide suppresses STAT phosphorilation and induces apoptosis in myeloma and lung cancer cells // Clin. Cancer Res. 2006. - Vol. 12. - P. 4288 - 4293.

214. Lipschultz S.E., Colan S.D., Gelber R.D., Perez-Atayde A.R. et al. Late cardiac effects of doxorubicin therapy for acute lymphoblastic leukemia in childhood // N. Engl. J. Med. 1991. - Vol. 324. - P. 808 - 815.

215. Liu W., Ho J.C.K., Cheung F.W.K. et al. Apoptotic activity of betulinic acid derivatives on murine melanoma B16 cell line // Eur. J. Pharmacol. 2004. -Vol. 498.-P. 71-78.

216. Lu H., Ouyang W., Huang Ch. Inflammation, a Key Event in Cancer Development // Mol. Cancer Res. 2006. - Vol. 4. - P. 221 - 233.

217. Luo J., Hill B.G., Gu Y. et al. Mechanisms of acrolein-induced myocardial dysfunction: Implications for environmental and endogenous aldehyde exposure // Am. J. Physiol. Heart Cirk. Physiol. 2007. - Vol. 293. P. H3673 -H3674.

218. Luo J.L., Kamata H., Karin M. IKK/ NFkB signaling: balancing life and death a new approach to cancer therapy // J. Clin. Invest. 2005. - Vol. 115. - P. 2625-2632.

219. Ma J., Starck S.R., Hecht S.M. et al. DNA polymerase p inhibitors from Tet-racera boiviniana // J. Nat. Prod. 1999. - Vol. 62. - P. 1660 - 1663.

220. Madureira A.M., Ascenso J.R., Valdeira L. et al. Evaluation of the antiviral and antimicrobial activities of triterpenes isolated from euphorbia segetalis //

221. Nat. Prod. Res. 2003. - Vol. 17. - P. 375 - 380.

222. Malini M.M., Lenin M., Varalakshmi P. Protective effect of triterpenes on calcium oxalate crystal-induced peroxidative changes in experimental urolithiasis // Pharmacol. Res. 2000. - Vol. 41. - P. 413 - 418.

223. Malspies L., Grever M.R., Staubus A.E., Yong D. Pharmacokinetics of 2-F-araA(9-beta-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine) in cancer patients during the phase I clinical investigation of fludarabine phosphate // Semin. Oncol. 1990. -Vol. 17.-P. 18-32.

224. Manez S., Recio M.S., Giner R.M., Rios J.L. Effect of celected triterpenoids on chronic derma inflammation // Eur. J. Pharm. 1997. - Vol. 334. - P. 107 -105.

225. Mantovani A., Marchesi F., Porta Ch. et al. Linking Iinflmmtion Reaction to Cancer: Novel Targets for Therapeutic Strategies // Targeted Therapies of Cancer / Eds. F.Colotta, A.Mantovani. 2008.

226. Mayaux J.F., Bousseau A., Pauwels R. et al. Triterpene derivatives that block entry of human immunodeficiency virus type 1 into cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 3564 - 3568.

227. Mellott A., Gradishar W. Inhibitors of tumor angiogenesis // Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice/ Eds. Chabner B.A., Longo D.L. Phylidelphia: Lippincott Williams & Wilkins. - 2002. - Pt 35. - P. 988 -997.

228. Melzig M.F., Bormann H. Betulinic acid inhibits aminopeptidase N activity // Planta Med. 1998. - Vol. 64. - P. 655 - 657.

229. Min B., Lee G.I., Ha J.Y. et al. Inhybitory effects of triterpenoids on inter-leukin 8/CINC-l induction in LPS-stimulated rat peritoneal macrophages // Nat. Prod. Sci. 1996. - Vol. 2. - P. 48 - 55.

230. Miskiniene V., Dickancaite E., Nemeicaite A., Cenas N. Nitroaromatic betulin derivatives as redox cycling agents // Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. - Vol. 42.-P. 391-397.

231. Mosmann T.R., Bond M.W., Coffiman R.L. et al. Thl and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol. 83.-P. 5654.

232. Muggia F.M. Overview of carboplatin: replacing, complementing and extending the therapeutic horizons of cisplatin // Semin. Oncol. 1989. - Vol. 16. - P.7.13.

233. Mukherjee P.K., Saha K., Das J. et al. Dtudies on the anti-inflammatory activity of rhizomes of Nelumbo nucifera // Planta Med. 1997. - Vol. 63. - P. 367 -369.

234. Munger J.S., Huang X., Kawakatsu H., Griffiths M.J., Dalton S.L., Wu J. et al. The integrin alpha v beta 6 binds and activates latent TGFpi: A mechanism for regulating pulmonary inflammation and fibrosis // Cell. 1999. - Vol. 96. -319-328.

235. Mutai C., Abatis D., Vagias C. et al. Cytotoxic lupan-tipe triterpenoids from Acacia mellifera // Phytochemistry. 2004. - Vol. 65. - P. 1159 - 1164.

236. Neamaty N. A small molecule antagonist of viron assembly // Expert Opin. Invest. Drugs. 2001. - Vol. 10. - P. 1767 - 1770.

237. Neiman D.J., Cragg J.M., Snader K.M. Natural products as sources of new drugs over the period 1981-2002 // J. Nat. Prod. 2003. - Vol. 66. - P. 1022 -1037.

238. Nick A., Wright A.D., Rali T., Sticher O. Antibacterial triterpenoids from Dillenia papuana and their structure-acrivity relationship // Phytochemistry. -1995. Vol. 40. - P. 1691 - 1695.

239. Niederau C., Heifges T., Hensel F. et al. // Interferons. Biological activities and clinical efficacy. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, 1997. - P. 27 - 35.

240. Nikiema J.B., Vanhaelen-Fastre R., Vanhaelen M. et al. Effect of antiinflammatory triterpenes isolated from Leptadenia hastate latex on keratinocyte proliferation // Phytother. Res. 2001. - Vol. 15. - P. 131 - 134.

241. Noda Y., Kaiya T., Kohda K., Kawazoe Y. Enhanced cytotoxicity of some triterpenes toward leukemia LI210 cells cultured in low pH media: Possibly new mode of cell killing // Chem. Pharm. Bull. 1997. - Vol. 45. - P. 1665 - 1672.

242. O'Connell M.M., Bently M.D., Campbell C.D. et al. Betulin and lupeol in bark from four white-barked birches // Phytochemistry. 1988. - Vol. 27. - P. 2175-2176.

243. Osburn W.O., Yates M.S., Dolan P.D. et al. Genetic or Pharmacologic Amplification of Nrf2 Signaling Inhibits Acute Liver Injuty in Mice // Toxicol. Sci. -2008. Vol. 104. - P. 218 - 227.

244. Pavlova N.I., Savinova O.U., Nikolaeva S.N. et al. Antiviral activity of betu-lin, betulinic and betulonic acids against some enveloped and non-enveloped viruses // Fitoterapia. 2003. - Vol. 74. - P. 489 - 492.

245. Pezzuto J.M., Das Gupta.T.K., Schimidt M.L. et al. Method and composition using a betulinic acid or betulinic acid derivations for treating cancer U.S. Pat. 5,962,527. - 1999.

246. Pisha E., Chai H., Lee I.S. et al. Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction apoptosis // Nat. Med. -1995.-Vol. l.-P. 1046-1051.

247. Place A.E. et al. The novel synthetic triterpenoid, CDDO-imidazolide, inhibits inflammatory response and tumor growth in vivo // Clin. Cancer Res. 2003. -Vol. 9. - P. 2798 - 2806.

248. Prasad S., Kalra N., Shukla Y. Hepatoprotective effects of lupeol and mango pulp extract of carcinogen induced alteration in Swiss albino mice // Mol. Nutr. Food Res. 2007. - Vol. 51. - P. 352 - 359.

249. Pucheault M. Natural products: Chemical instruments to apprehend biological symphony // Organic & Biomol. Chem. 2008. - Vol. 6. - P.424 - 432.

250. Rafael T.J., Kuttan G. Effect of naturally occurring triterpenoids glycyrrhizic acid, ursolic acid, oleanolic acid and nomilin on the immune system // Phy-tomedicine. 2003. - Vol. 10. - P. 483 - 489.

251. Rajic A., Akihisa T., Ukia M. et al. Inhibition of trypsin and chymotrypsin by anti- inflammatory triterpenoids from Compositae flowers // Planta Med. -2001. Vol. 67. - P. 599 - 604.

252. Ramadoss S., Jaggi M., Siddiqui M.J.A., Khanna A.B. US Pat.6.214.814. (1998) IC.A. 134(20 l)280995p.

253. Recio M.C., Giner R.M., Manes S. et all. Investigations of the steroidal antiinflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas // Planta Med. 1995. - Vol. 61. - P. 9 - 12.

254. Rieber M., Strasberg-Rieber M. Induction of p53 without increase in p21 WAF1 in betulinic acid-mediated cell death is preferential for human metastatic melanoma // DNA Cell Biol. 1998. - Vol. 17. - P. 399 - 406.

255. Rirch P.S., Shiller J., Rivkin S. et al. // Blood. 1993. - (Suppl. 1). - P. 1453.

256. Rubin J., Lotze M. Acute gastric mucosal injury associated with the systemic administration of interleukin-4 // Surgery. 1992. - Vol. 111. - P. 274.

257. Ryu S.Y., Oak M.H.,Yoon S.K. Anti-alleric and anti- inflammatory triter-penes from herb of Prunella vulgaris // Planta Med. 2000. - Vol. 66. - P. 358 -360.

258. Safayhi H., Sailer E.-R. Anti-inflammatory actions of pentacyclic triterpenes // Planta Med. 1997. - Vol. 63. - P. 487 - 493.

259. Saleem M., Afaq F., Adhauri V.M., Mukhtar H. Lupeol modulates NF-kappaB and PI3K/Akt pathways and inhibits skin cancer in CD-I mice // Oncogene. 2004. - Vol. 23. - N 30. - P. 5203 - 5214.

260. Saleem M., Kaur S., Kweon M. et al. Lupeol, a fruit and vegetable based tri-terpene, induces apoptotic death of human pancreatic adenocarcinoma cells vi inhibition of Ras signaling pathway // Carcinogenesis. 2005. - Vol. 26. - P. 1956 -1964.

261. Salti G.I., Kichina J.V., Das Gupta T.K. et al. Betulinic acid reduces ultravio-let-C-induced DNA breakage in congenial melanocyte naeval cells: Evifance for a potential role as a chemoprevantive agent // Melanoma Res. 2001. -Vol. 11.-P. 99-104.

262. Samudio I. et al. 2-cyano-3,12-dioxoolean-l,9-dien-28- imidasolide (CDDO-Im) directly targets mitochondrial glutathione to induce apoptosis in pancreatic cancer // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 36273 - 36282.

263. Sarek J., Klinot J., Klinotova I., Seibal J. Double-bond cleavage in 18-lupene derivatives by ruthenium(VIII)oxide- Path to des-E-lupan compounds // Chem. Listy. 1997. - Vol. 11. - P. 1005 - 1006.

264. Sarek J., Kvasnica M., Urban M., Klinot J. et al. Correlation of cytotixic activity of betulines and their hydroxyl analogues // Bioorg. Med. Chem. Lett. -2005. Vol. 15. - P. 4196 - 2000.

265. Sawada N., Kataoka K., Kondo K. et al. // Betulinic acid augments the inhibitory effects of vincristine on growth and lung metastasis of B16F10 melanoma cells in mice // Br. J. Cancer. 2004. - Vol. 90. - P. 1672 - 1678.

266. Schimmel K.J.M., Richel D.J., van den Brink R.B.A., Guchelaar H.-J. Cardi-toxicity of cytotoxic drugs // Cancer Treat. Rev. 2004. - Vol. 30. - P. 181 -191.

267. Schmidt M.L., Kusmanoff K.L., Indeck L.L., Pezzuto J.M. Betulinic acid induces apoptosis in human neuroblastoma cell lines I I Eur. J. Cancer. 1997. -Vol. 33.-P. 2007-2010.

268. Seltzer U.N., Zeltzer M.C., Bates R.B., Jackes B.R. Biologically active triter-penoids of Syncarpia glomulifera bark extract from Paluma, north Queensland, Australia // Planta Med. 2000. - Vol. 66. - P. 176 - 180.

269. Selzer E., Pimentel E., Wacheck et al. Effect of betulinic acid alone and in combination with irradiation in human melanoma cells // J. Invest. Dermatol. -2000. Vol. 114. - P. 935 - 940.

270. Senthil S., Chandramahan G., Pugalendi K.V. Isomers (oleanolic and ursolic acids) differ in their effect against isoproterinol-induced myocardial ischemia in rats // Intern. J. Cardiol. 2007. - Vol. 119. - Iss. 1. - P. 131 - 133.

271. Setzer W.N., Setzer M.C. Plant-derived triterpenoids as potential antineoplastic agents // Mini Rev. Med. Chem. 2003. - Vol. 3. - N 6. - P. 540 - 556.

272. Shin Y.G., Cho K.H., Chung S.M. et al. Determination of betulinic acid in mouse blood, tumor and tissue homogenates by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 1999. -Vol. 732.-P. 331-336.

273. Shirwaikar A., Setti M., Bommu P. Effect of lupeol isolated from Crataeva nurvala buch Ham stem bark extract against free radical induced nephrotoxicity in rats // Indian J. Exp. Biol. 2004. - Vol. 42. - P. 686 - 690.

274. Shishodia S., Aggarwal B. Nuclear Factor kB: a friend or a foe in cancer? // Biochem. Pharmacol. 2004. - Vol. 68. - P. 1071 - 1080.

275. Si'efc L., Psi'enak O., Kora V. et al. Response of Hematopoiesis to Cyclophosphamide Follows Highly Specific Patterns in Bone Marrow and Spleen // J. Hematother. & Stem Cell Res. 2003. - N 12. - P. 47- 61.

276. Simonsen I.L., Ross W.C.J. The Terpenes. V.4. Cambridge: University Press, 1957. - P. 287 - 367.

277. Singh S., Bani S., Singh G.B. et al. Anti-inflammatory activity of lupeol // Ethnotherapy. 1997. - Vol. 68. - P. 9 - 16.

278. Sjostrom H., Noren O., Olsen J. Structure and function of aminopeptidase N //

279. Adv. Exp. Med. Biol. 2000. - Vol. 477. - P. 25 - 34.

280. Smith D.E. et al. 4 new members expend the interleukin-1 superfamily //J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 1169.

281. Smith J.W., Longo D.L., Alword W.G. et al. The effects of treatment with in-terleukin 1 on platelet recovery after high dose carboplatin // N. Engl. J. Med. -1993.-Vol. 328.-P. 756.

282. Smith M.A., Rubinstein L., Anderson J.R., Arthur D., Satalano RJ. et al. Secondary leukemia or myelodysplastic syndrome after treatment with epipodo-phyllotoxins // J. Clin. Oncol. 1999. - Vol. 17. - P. 569 - 577.

283. Soler F., Poujade C., Evers M. et al. Betulinic acid derivatives: A new class of specific inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 entry // J. Med. Chem. 1996. - Vol. 39. - P. 1069 - 1083.

284. Sporn M. B., Liby K., Yore M.M. et al. Platforms and Networks in Triterpe-noid Pharmacology // Drug Develop. Res. 2007. - Vol. 68. - P. 174 - 182.

285. Sporn. M. B., Liby K. Cancer Chemoprevention: scientific promise, clinical uncertainty // Oncology. 2005. - Vol. 2. - P. 518 - 523.

286. Sturm S., Gil R.R., Chai H.-B. et al. Lupane Derivatives from Lophopetalum wallichii with Farnesyl Protein Transferase Inhibitory Activity // J. Nat. Prod. -1996.-Vol. 59.-P. 658-663.

287. Su B.N., Cuendet M., Farnsworth N.R. et al. Activity-guided fractionation of the seeds of Ziziphus jujuba using a cyclooxygenase-2 inhibitory assay // Planta Med. 2002. - Vol. 68. - P. 1125 - 1128.

288. Sudhahar V., Kumar S.A., Varalakshmi P. Role of lupeol and lupeol linoleate on lipemic-oxidative stress in experimental hypercholesterolemia // Life Sci. -2006. Vol. 78. - P. 1329 -1335.

289. Sudharsan P.T., Mythili Y., Selvakumar E., Varalakshmi P. Cardioprotective effect of pentacyclic triterpene, lupeol and its ester on cyclophosamide-induced oxidative stress // Hum. Exp. Toxicol. 2005. - Vol. 24. - P. 313 - 318.

290. Sudharsan P.T., Mythili Y., Selvakumar E., Varalakshmi P. Lupeol and its ester exhibit protective role against cyclophosamide-induced cardiac mitochondrial toxicity // J. Cardiovasc. Pharmacol. 2006. - Vol. 47. - P. 205 - 210.

291. Suh N. et al. A novel synthetic oleanane triterpenoid, 2-cyano-3,12-dioxoolean-l,9-dien-28-oic acid, with potent differentiating, fntiproliferative, and anti-inflammatory activity // Cancer Res. 1999. - Vol. 59. - P. 336 - 341.

292. Suh N. et al. Novel triterpenoids suppress inducible nitric oxidesynthase (iN-OS) and inducible cyclooxygenase (COX-2) in mouse macrophages // Cancer Res. 1998. - Vol. 58. - P. 717 - 723.

293. Suh N., Roberts A.B., Birkey Reffey S. et al. Synthetic triterpenoids enhance transforming growth factor p/Smad signaling // Cancer. 2003. - Vol. 63. - P. 1371 - 1376.

294. Suh N., Wang Y., Honda T. et al A novel synthetic oleanan triterpenoid, 2-cyano-3,12-dioxooleano-l,9-dien-28-oic acid, with potent differentiating, antiproliferative and anti-inflammatory activity // Cancer. 1999. - Vol. 59. - P. 336-341.

295. Suh et al. Synthetic triterpenoids activate a pathway for apoptosis in AML cells involving downregulation of FLIP nd sensitisaton to TRAIL // Leukemia. 2003. - Vol. 17. - P. 2122 - 2129.

296. Suksamrarn A., Tanachatchairatana T., Kanokmedhakul S. Antiplasmodial triterpenes from twigs of Gardenia saxatilis II J. Ethnopharmacol. 2003. -Vol. 88.-P. 275-277.

297. Sultana S., Saleem M., Sharma S., Khan N. Lupeol, a triterpene, prevents free radical mediated macromolecular damage and alleviates benzoyl peroxide induced biochemical alterations in murine skin // Indian J. Exp. Biol. 2003. -Vol. 41.-P. 827-831.

298. Sun Ch., Kashiwada Y., Susan L. Plant-derived terpenoids and analoges as anti-HIV agents // Curr. Top. Med. Chem. 2003. - Vol. 3. - P. 155 - 169.

299. Sun I.C., Chen C.H., Kashiwada Y. et al. Anti-AIDS agents. 49. Synthesis, anti-HIV and anti-fusion activities of IC9564 analogs based on betulinic acid // J. Med. Chem. 2002. - Vol. 45. - P. 4271 - 4275.

300. Sun I-Ch., Kashiwada Y., Morris-Natschke S.L., Lee K.-Hs. Plant-derived terpenoids and analogues as anti-HIV agents // Curr. Top. Med. Chem. 2003. -Vol.3.-P. 155-169.

301. Sun S., Hail N., Lotan R. Apoptosis as a novel target for cancer chemopreven-tion // J. Natl. Cancer Inst. 2004. - Vol. 96. - P. 35 - 51.

302. Sunitha S., Nagaraj M., Varalakshmi P. Hepatoprotective effects of lupeol and lupeol linoleate on tissue antioxidant defence system in cadmium-induced hepatotoxicity in rats // Fitoterapia. 2001. - Vol. 72. - P. 516 - 523.

303. Talalay P., Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D. Importance of phase 2 gene regulation in protection against electrophile and reactive oxygen toxicity and carcinogenesis // Adv. Enzyme Regul. 2003. - Vol. 43. - P. 121 - 134.

304. Tan Y., Yu. R., Pezzuto J.M. Betulinic acid-induced programmed cell death in human melanoma cells involves mitogen-activated protein kinase activation // Clin. Cancer Res. 2003. - Vol. 9. - P. 2866 - 2875.

305. Tew K., Colvin M., Chabner B.A. Alkylating agents // Cancer Chemotherapyrdand Biotherapy: Principles and Practice, 3 ed. (Chabner B.A. and Longo D.L. eds.). Phylidelphia: Lippincott Williams & Wilkins. - 2001. - 485 p.

306. Thimmulappa R.K., Scollick C., Traore K. Nrf2-dependent protection from LPS induced inflammatory response and mortality by CDDO-Imidazolide // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - Vol. 351. - P. 883 - 889.

307. Thurnher D., Turhani D., Pelsman M. et al. Betulinic acid: A new cytotoxic compound against malignant head and neck cancer cell // Head Neck. 2003. -Vol. 25. - P. 732 - 740.

308. Travis L.B., Holowaty E.J., Bergfeldt K., Lynch C.F. et al. Risk of leukemia after platinum-based chemotherapy for ovarian cancer // N. Engl. J. Med. -1999. Vol. 340. - P. 351 - 357.

309. Udeani G.O., Zhao G.M., Geun Shin Y. et al. Pharmacokinetics and tissue distribution of betulinic acid in CD-I mice // Biopharm. Drag Dispos. 1999. -Vol. 20.-P. 379-383.

310. Urban M., Sarek J., Klinot J. et al. Synthesis of A-Seco Derivatives of Betulinic acid with Cytotoxic Activity // J. Nat. Prod. 2004. - Vol. 67. - P. 1100 -1105.

311. Valavaara R., Nordman E. Renal complications of mitomycin C therapy with special reference to the total dose // Cancer. 1985. - Vol. 55. - P. 47 - 50.

312. Van Barneveld P.W., Sleijfer D.T., van der Mark T.W., Mulder N.H. et al. Natural course of bleomycine-induced pneumonitis. A follow-up study // Am. Rev. Respir. Dis. 1987. - Vol. 135. - P. 48 - 51.

313. Van Loc T., van Sung T., Kamperdick C., Adam G. Synthesis of Amino Acid

314. Conjugates and Futher Derivatives of 3a-Hydroxylup-20(29)ene-23,28-dioic acid // J. Pract. Chem. 2000. - Vol. 342. - P. 63 - 68.

315. Wachsberger P.R., Burd R., Wahl M.L., Leeper D.B. Betulinic acid sensitization of low pH adapted human melanoma cells to hyperthermia // Int. J. Hyperthermia. 2002. - Vol. 18. - P. 153 - 164.

316. Wächter G.A., Valcic S., Flagg M.L., Timmermann B.N. Antitubercular activity of pentacyclic triterpenoids from plants of Argentina and Chile // Phy-tomedicine. 1999. - Vol. 6. - P. 314 - 345.

317. Wada S.I., Iida A., Tanaka R. Screening of Triterpenoids Isolated from Phyl-lanthus flexuosus for DNA Topoisomerase Inhibitory Activity // J. Nat. Prod. -2001.-Vol. 61.-P. 1545-1547.

318. Wang Y. et al. A synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxoolean-l,9-dien-28-oic acid (CDDO), is a ligand for the peroxisome proliferator-activated receptor y // Mol. Endocrinol. 2000. - Vol. 14. - P. 1550 - 1556.

319. Woldemichael G.M., Singh M.P., Maiese W.H., Timmerman B.N. Constituents of antibacterial extract of Caesalpinia paraguariensis Burk. // Z Naturforsch. 2003. - Vol. 58. - P. 70 - 75.

320. Ya-Ching Shen, Chaturvedula V.S. Prakash, Li-Tang Wang et al. New Vib-sane Diterpenes and Lupane Triterpens from Viburnum odoratissimum // J. Nat. Prod. 2002. - Vol. 65. - P. 1052 - 1055.

321. Yasukawa K., Yu S.Y., Yamanouchi S. et al. Some lupane-type triterpenes inhibit a tumor promotion by 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin // Phytomedicine. 1995. - Vol. 4. - P. 309 - 313.

322. Yates M.S. Pharmacodynamic characterization of chemopreventive triterpe-noids as exceptionally potent inducers of Nrf2-regulated genes // Mol. Cancer Ther. 2007. - Vol. 6. - P. 154 - 162.

323. Ye Y.Y., He D.W., Ye W.C. et al. Differentiation of B16 melanoma cells induced by 23 hydroxyl betulinic acid // Clin. J. Biochem. Pharm. 2001. - Vol. 22. - P. 163 - 166.

324. Ying Q.L., Rinerart A.R.,Simon S.R., Cheronis J.C. Inhibition of human leukocyte elastase by ursolic acid. Evidence for binding site for pentacyclic triter-penoids // Biochem. J. 1991. - Vol. 277. - P. 521 - 526.

325. Yogeeswari P., Siram D. Betulinic Acid and Its Derivatives: Review on their Biological Properties // Curr. Med. Chem. 2005. - Vol. 12. - P. 763 - 771

326. Yore M. M., Liby K. T., Honda T. et al. The synthetic triterpenoid l-2-cyano-3,12-dioxooleana-l,9(ll)-dien-28-oyl.imidazole blocks nuclear factor-B activation through direct inhibition of IB kinase B // Mol. Cancer Ther. 2006. -Vol. 5.-P. 3232-3239.

327. You J.J., Nam N.H., Kim Y., Bae K.H., Ahn B.Z. Antiangiogenic activity of lupeol from Bombax ceiba // Phytother. Res. 2003. - Vol. 17. - P. 341 - 344.

328. You Y.-J., Kim Y., Nam N.H., Ahn B.Z. Synthesis and cytotoxic activity of A-ring modified betulinic acid derivatives // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. -Vol. 13.-P. 3137-3140.

329. Yun Y., Han S., Park E. et al. Immunomodulatory activity of betulinic acid by producing pro-inflammatory cytokines and activation of macrophages // Arch. Pharm. Sci. 2003. - Vol. 26. - P. 1087 - 1095.

330. Zarec J., Kilnot J., Dzubak P. et al. New Lupane Derived Compounds with Pro-Apoptotic Activity in Cancer Cells: Synthesis and Structure Activity Relationships // J. Med. Chem. 2003. - Vol. 46. - P. 5402 - 5415.

331. Zdzisinska B., Rzeski W., Paduch R. et al. Differential effects of betulin and betulinic acid on cytokine production in human whole blood cell cultures // Polish J. Pharmacol. 2003. - Vol. 55. - P. 235 - 238.

332. Zhang D.D., Hannink M. Distinct cysteine residues in Keapl are required for Keapl-dependent ubiquitination of Nrf2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress // Mol. Cell Biol. 2003. - Vol. 23. -P. 8137-8151.

333. Zhang H.-J., Tan G.T., Hoang V.D. et al. Natural Anti-HIV agents. Part IV. Anti-HIV Constituents from Vatica cinerea // J. Nat. Prod. 2003. - Vol. 66.1. P. 263 268.

334. Zhu M., Phillipson J.D., Greengross P.M., Bowery N.G. Chemical and biological investigation of the root bark of Clerodendrum mandarinorum // Planta Med. 1996. - Vol. 62. - P. 393 - 398.

335. Zuco V., Supino R., Righetti S.C., Cleris L. et al. Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells // Cancer Lett. 2002. -Vol. 175.-P. 17-25.

336. Автор выражает благодарность:

337. Толстикову Г.А., академику РАН, советнику РАН за общее руководство и координацию исследований, методологическую помощь, ценные советы и внимание к автору.

338. Толстиковой Т.Г., проф., д.б.н., зав. лабораторией за организационную поддержку исследований по данной теме, активное содействие в подготовке диссертации, постоянное внимание и помощь в работе, доброжелательное отношение.

339. Лушниковой Е.Л., проф., д.б.н., зав. отделом за помощь в подготовке материалов диссертации и рукописи, плодотворное обсуждение результатов, доброжелательное отношение к автору.

340. Шульц Э.Э., д.х.н., зав. лабораторией за консультационную поддержку, предоставление соединений и помощь в работе.

341. Василевскому С.Ф., проф., д.х.н., зав. лабораториией за предоставление соединений и подготовку совместных публикаций.

342. Казаковой О.Б., д.х.н. за предоставление соединений и подготовку совместных публикаций.

343. Николину В.П., к.м.н., с.н.с. лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦиГ СО РАН за помощь в перевивке опухолей.

344. Поповой H.A., к.б.н., н.с. лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦиГ СО РАН за помощь в перевивке опухолей.

Информация о работе

Сорокина, Ирина Васильевна
доктора биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Клеточные механизмы коррекции цитотоксических полиорганных повреждений тритерпеноидами класса лупана - бетулоновой кислотой и ее производными - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы