Исследование цитотоксической активности и механизмов действия производных бетулина и глицирризиновой кислоты в опухолевых клетках в культуре

Шинтяпина, Александра Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование цитотоксической активности и механизмов действия производных бетулина и глицирризиновой кислоты в опухолевых клетках в культуре
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование цитотоксической активности и механизмов действия производных бетулина и глицирризиновой кислоты в опухолевых клетках в культуре"

На правах рукописи

ООЗ172597 Шинтяпина Александра Борисовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БЕТУЛИНА И ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ В КУЛЬТУРЕ

03 00 03 -молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2008

003172597

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор

Андрей Георгиевич Покровский

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Валерий Борисович Локтев

кандидат биологических наук

Владимир Олегович Пустыльняк

Ведущая организация •

Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН, Москва

Защита состоится мая 2008 года в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: п. Кольцово Новосибирской области, 630559, тел: (383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан « /<? » апреля 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Л И Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Рост онкологической заболеваемости в XX веке происходил такими быстрыми темпами, что это дало основание для его сравнения с эпидемией Ежегодно во всем мире от злокачественных опухолей умирает около 7 млн человек По данным Всемирной организации здравоохранения в 2006 году в мире от рака умерло свыше 7 млн человек и диагностировано 10 млн новых случаев онкологических заболеваний. В большинстве развитых стран они занимают второе место среди причин смерти. По оценкам Всемирной организации здравоохранения онкологические заболевания к 2020 году выйдут на первое место в мире по смертности в структуре всех заболеваний, обогнав при этом «традиционного лидера» -сердечно-сосудистые заболевания

Национальный институт рака (National Cancer Institute) осуществляет программу по разработке противоопухолевых препаратов В рамках этой программы ежегодно проводится тестирование т vitro более 10000 соединений как природного, так и синтетического происхождения NCI Drug Information System располагает информацией о 400000 соединениях, протестированных на сегодняшний день Важное место в таких исследованиях занимает поиск возможных молекулярных мишеней для этих препаратов Число таких мишеней составляет уже более 100, и их число постоянно растет (Dai Z et al, 2007).

Особенный интерес вызывают те соединения, о противоопухолевой активности которых уже есть данные Давно известно, что глицирризиновая кислота (ГК), которая является активным компонентом корня солодки (Glycyrrhiza sps), обладает антиканцерогенным и антимутагенным действием (Tanaka М and Mano N , 1987) Позднее было показано, что глицирризиновая кислота и некоторые ее производные способны избирательно ингибировать рост опухолевых клеток в культуре (Rossi Т et al, 2003)

Бетулиновая кислота (БК) - растительный пентациклический тригерпеноид, выделенный из коры березы (Кислицын А Н, 1994), обладает избирательным цитотоксическим действием в отношении различных опухолевых клеток, противовирусными свойствами, такими как анти-ВИЧ активность, а также противомалярийным, антибактериальным и системным противовоспалительным действием (Kashiwada Y et al, 1996) Противоопухолевая активность БК была показана на клеточной линии меланомы (Liu W et al, 2004), а также на модели in \ivo, на бестимусных мышах, несущих человеческую меланому (Pisha Е et al, 1995) Противоопухолевое действие БК и некоторых ее аналогов связывают с избирательной индукцией апоптоза в опухолевых клетках (Eiznhamer D et al, 2004) В настоящее время препарат на основе бетулиновой кислоты проходит клинические исследования в США в качестве средства для лечения злокачественной меланомы (http //clinicaltrials gov/show/NCT00346502).

Данные последних исследований свидетельствуют о том, что БК, ГК и другие природные тритерпены ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, индуцируют их апоптоз (Urech К et al, 2005, Essaady D et al, 1996, Rossi T et

al, 2003) Однако, несмотря на значительное количество данных о противоопухолевой активности растительных тритерпенов, на настоящий момент не до конца понятны механизмы их действия в клетке Показано, что основной противоопухолевый механизм действия тритерпенов связан с индукцией апоптоза в опухолевых клетках, запуск которого под действием ГК, БК в раковых клетках осуществляется независимо от «рецепторов смерти» (CD-95/Fas) и белка р53. С другой стороны, из литературных данных известно, что при действии бетулиновой кислоты на опухолевые клетки происходит активация каспазы 9, но не каспазы 8, что может говорить о Вс1-2-зависимом пути индукции апоптоза (Fulda S et al, 1997,1999, Zuco V. et al, 2002).

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение противоопухолевой активности производных тритерпенов in vitro, исследование особенностей молекулярных механизмов их противоопухолевого действия в опухолевых клетках человека т vitro.

Для достижения цели решались следующие задачи*

1) Исследовать цитотоксическую активность высших терпеноидов амиранового и лупанового рядов (глицирризиновой кислоты, глицирретовой кислоты, бетулина, бетулиновой кислоты и их производных) в культурах опухолевых клеток, выявить наиболее активные

2) Изучить с помощью метода проточной цитометрии способность наиболее активных производных тритерпеновых соединений индуцировать апоптоз в опухолевых клетках человека (линии МТ-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2, HeLa).

3) Исследовать влияние наиболее активных производных тритерпенов на изменение экспрессии гена апоптоза Вс1-2 и клеточного цикла Cyclm Dl в опухолевых клетках человека в культуре.

4) Исследовать с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ с последующим анализом на проточном цитометре возможное влияние производных наиболее активных тритерпенов на изменение экспрессии гена каталитической единицы теломеразы (hTERT) в опухолевых клетках m vitro.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено тестирование на противоопухолевую активность 25 соединений тригерпенового ряда на 5 опухолевых клеточных линиях человека. Определены 50% ингибирующие дозы для этих клеток (ИД50) Выявлены наиболее активные С помощью метода проточной цитометрии получены новые данные, характеризующие способность природных тритерпенов лупанового ряда и их производных индуцировать апоптоз в опухолевых клетках in vitro Исследованы молекулярные механизмы действия тритерпенов лупанового ряда в клетке Впервые показано, что механизм действия от vitro производных бетулиновой кислоты связан со снижением экспрессии гена апоптоза Вс1-2, клеточного цикла Cyclin Dl, каталитической субъединицы теломеразы hTERT

направленного создания производных с повышенной специфичностью воздействия на молекулярные мишени опухолевых клеток Приведенные исследования также являются стимулом для дальнейшего доклинического исследования производных бетулиновой кислоты в системах in vivo их противоопухолевой активности и создания на их основе перспективных препаратов со специфической противоопухолевой активностью

Положения, выносимые на защиту:

1 Бетулин, бетулиновая, глицирретовая кислоты и их химически модифицированные в С-28 положении производные ингибируют рост опухолевых клеток человека в культуре Амиды, содержащие 7, 8, 10 метиленовых остатков и СОО" концевую группу, и дипептид бетулоновой кислоты являются наиболее активными ингибиторами роста опухолевых клеток in vitro

2 Азотсодержащие производные бетулиновой кислоты являются эффективными индукторами апоптоза в опухолевых клетках человека in vitro. Наиболее эффективными индукторами апоптоза т vitro являются амиды и дипептид бетулоновой кислоты.

3 Индукция апоптоза под действием бетулиновой кислоты, амидов бетулоновой кислоты, содержащих 7, 8,10 метиленовых остатков и СОО" концевую группу, и дипептида в опухолевых клетках человека in vitro сопровождается снижением экспрессии гена апоптоза Bcl-2, клеточного цикла Cyclin DI, экспрессия гена каталитической субъединицы теломеразы hTERT снижается под действием амидов, содержащих 8 и 10 метиленовых остатков и СОО" концевую группу и дипептида бетулоновой кислоты

Апробация работы и публикации Результаты исследования были представлены на 10-ой международной школе-конференции для молодых ученых «Биология - наука XXI века», (Пущино, 2006), на 14-й, 15-ой, 16-ой международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье» (Санкт-Петербург, 2005, 2006, 2007), на международном симпозиуме «Biology of Disease - A Molecular Battlefield» (Германия, 2006), на 10-ом симпозиуме европейского общества медицинской химии и американского общества органической химии «International Symposium on Advances in Synthetic and Medicinal Chemistry ASMC 07» (Санкг-Петрбург, 2007). По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Личный вклад автора Все эксперименты были выполнены и проанализированы автором, часть измерений на проточном цитометре была проведена сотрудниками Института клинической иммунологии СО РАМН Борисовым В. И. и Пронкиной Н В

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 16 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а также списка литературы (234 источника)

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные соединения Использовавшиеся в работе соединения (глицирризиновая кислота, глицирретовая кислота и ее производные, бетулиновая кислота, бетулоновая кислота и ее производные (всего 25 соединений) были получены в лаборатории медицинской химии Института органической химии СО РАН, г Новосибирск (зав лаб дхн Щульц Э Э) Соединения растворяли в ДМСО, хранили при температуре -20°С

Клетки В работе использовали 5 опухолевых клеточных линий человека (МТ-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2, HeLa) Клетки МТ-4, MOLT-4, СЕМ культивировали в среде RPMI-1640, клетки Hep G2, HeLa в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота, 2 ммоль/л L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина, 30 мкг/мл линкомицина при температуре 37°С в С02 инкубаторе

МП-тест Для определения ИД50 (дозы, на 50% ингибирующей рост клеток) использовали 3-(4,5-диметилтаазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ) (Mosmann Т. et al, 1983; Wilson J, et al, 1990) Клетки MT-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2, HeLa высевали на 96-луночный планшет, исследуемые вещества добавляли к клеткам до конечных концентраций 0,01-1000 мкМ Клетки, инкубируемые в тех же условиях без добавления препаратов, являлись контрольными Клетки культивировали 48 ч Водный раствор МТТ (5 мг/мл) добавляли в культуру, инкубировали 4 ч при температуре 37°С в С02 инкубаторе Далее добавляли по 200 мкл смеси (50% пропанола-2, 10% додецилсульфата натрия, 0,01 Н НС1), 30 мин инкубировали Оптическую плотность (OD) измеряли при длине волны 540 нм. 50% ингибирующую дозу (ИД50), стандартную ошибку (SE) ИД50 определяли с помощью программы GraphPad Prism 5 0 (GraphPad Inc, США)

Анализ апоптоза Клетки после инкубации с экспериментальными препаратами в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 48, 72 ч ФСБ (xl) фиксировали в 70% этаноле 12 ч при -20°С, отмывали ФСБ (xl), в течение 12 ч Инкубировали при температуре 4°С в растворе пропидия йодида (50 мкг/мл), содержащем 0,1% натрия цитрата, 0,1% тритона Х-100 и РНКазу (150 ед акт /мл) Клетки, инкубируемые без экспериментальных соединений, использовали в качестве контроля. Измерения проводили на проточном цитометре FACSCalibur («Becton Dickinson», США) Рассчитывали апоптотический индекс (АИ, %) с использованием программы CellQuest («Becton Dickinson», США).

ОТ-ПЦР Суммарную РНК выделяли из клеток с помощью набора RNeasy Mini Kit («Qiagen», США) согласно протоколу фирмы-производителя Реакцию ОТ проводили в конечном объеме 25 мкл при следующих условиях. 1 мкг РНК, буфер (50 мМ трис-HCl, рН 8,3, 3 мМ MgCl2, 75 мМ КС1, 10 мМ DTT), 0,5 мМ dNTPs, 0,4 мкМ oligo(dT)i5, 200 ед. акт. обратной транскриптазы M-MLV («Сибэнзим», Россия) Смесь инкубировали 60 мин при 37°С, затем 10 мин при 70°С. Мультиплексную ПЦР (Wong Н. et al, 1994) проводили в конечном

объеме 30 мкл на амплификаторе Gradient Palm-Cycler («Corbett Research», Австралия) В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводили нормализацию продуктов амплификации исследуемых генов, был выбран ген «домашнего хозяйства» ß-actin В ПЦР использовали специфические праймеры к последовательностям исследуемых генов Bcl-2 (прямой 5'-TTCCCATCGCTGTCCTTCG-3', обратный 5'-CTGTGCCTGTAAA CATAGATTCGC-3' (340 п н ), Cychn Dl (прямой 5-TATTTGCATAACCCTG AGCG-3', обратный 5'-GTGACTACATG CATATGAGC-3' (350 п н ) и ß-actin (прямой 5'-ACGTTATGGATGATGATATCGC-3', обратный 5'-CTTAATGTC ACGCACGATTTCC-3' (644 п н ) ПЦР предварительно оптимизировали по числу циклов, количеству праймеров Каждая реакционная смесь содержала 1 мкл кДНК, буфер для ПЦР (xl), 50 мкМ dNTPs, 20 пкМ каждого праймера к ß-acitn и 2 ед акт Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим», Россия) Равные количества (20 пкМ) праймеров для амплификации гена Bcl-2 или Cychn Dl были добавлены через несколько циклов В наших условиях наиболее подходящее число циклов было для ß-acitn - 30, для Bcl-2, Cyclin Dl - 22 Каждую пробу амплифицировали трижды Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 2% агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромистого этидия Денситометрию продуктов амплификации проводили с помощью программы TotalLab 3 0 («Phoretix», США) Относительное содержание мРНК рассчитывали как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы исследуемых генов к интенсивности полосы гена ß-actin

Флуоресцентная гибридизация m situ с последующим анализом на проточном цитометре (flow FISH) Для анализа содержания мРНК гена hTERT использовали метод flow-FISH (flow fluorescence m situ hybridization) (Larsen R D et al, 2003) После инкубации с экспериментальными препаратами или без (контроль), клетки отмывали ФСБ (xl), фиксировали 1% парафармальдегидом 15 мин Далее клетки отмывали и инкубировали с 0,1% Tween-20 15 мин После этого, клетки снова отмывали ФСБ (xl) Зонд пептидной нуклеиновой кислоты (GripNA-зонд), меченный флюоресцеином (FITC) («Active Motif», США), комплементарный мРНК hTERT с нуклеотидной последовательностью 5'-CGTGCGCAGCAGGACGCA-3', добавляли в конечной концентрации 0,3 мкг/мл, инкубировали в течение 12 ч Добавляли 0,5 мл 1% параформальдегида Анализ проводили на проточном цитометре FACS Calibur («Becton Dickinson», США) с помощью программы Cell Quest («Becton Dickinson», США) Сигнал флуоресценции мРНК hTERT определяли как средний уровень флуоресценции клеток, прошедших гибридизацию в присутствии GnPN-зонда, вычитанием аутофлуоресценции клеток, прошедших FISH в отсутствии GripNA-зонда

Статистическая обработка данных Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Excel-2000 и STATISTICA 6 0 Результаты представлены как среднее значение ± отклонение от среднего Для оценки достоверности различий (р) использовали t-критерий Стьюдента Достоверными считали различия при р<0,05 Результаты всех экспериментов представлены в виде среднего значения данных, полученных из 3-х независимых повторов экспериментов

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование цитотоксической активности производных бетулина in vitro

Было проведено тестирование на ингибирующую активность экспериментальных препаратов, с помощью МТТ-теста, представленных на рис 1 (производных бетулина (1а,б, III, IV, IVa-л) на опухолевые клетки человека (линии МТ-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2 и HeLa)

la,б, III, IV, IVa-л

I R'=OH, R2 = H, R3 = CH2OH,

la R1=0C(0)(CH2)2C02H, R2 = H,R3 =

CH20C(0)(CH2)2C02H,

16 R1=OAc, R2= H, R3 = CH20C(0)(CH2)2C02H, III R'=OH, R2 = H, R3 = C02H, IVR1+R2=O,R3=CO2H,

IVa R'+R2 =0, R3 = C02NH(CH2)7C02H, IV6 R'+R2 =0, R3= C02NH(CH2)8C02H,

IVb R'+R2 =0, R3 = CO2NH(CH2)10CO2H, IVr R'+R2 =0, R3 = C02NH(CH2)8C0NHCH(Ph)CH2C02H IVfl R'+ R2=0, R3=C(0)NHCH(CH3)C2H5, IVe R'+ R2=0, R3=C(0)N(H)C4H9, IV® R'+ R2=0, R3=C(0)N(H)-Q, IV3 R'+ R2=0, R3=C(0)N(H)-{}, IVh R'+ R2=0, R3=C(0>-nQ , IVk R'+ R2=0, R3=C(0) -NQ-CH2Ph,

1Ул R'+ R2=0, R3=C(0)N(H)C(I1)2-<Qn

Рис. 1. Структура соединений, производные бетулина (I)

Количественная характеристика ингибирования (50% ингибирующие дозы, ИД50) растительных тритерпенов и их модифицированных производных приведена в табл 1

Из результатов табл 1 видно, что клеточные линии оказались в разной степени чувствительны к действию тритерпенов данного ряда Гетерогенность ответа между разными популяциями опухолевых клеток in vitro является одним из критериев, говорящим в пользу специфической противоопухолевой активности, нежели о неспецифической токсичности, где в разных популяциях клеток ответы сходны (Freshney R 1,1989)

Таблица 1. Ингибирование жизнеспособности опухолевых клеток производными бетулина, ИД50 (мкМ) ± SE

Соединение ИД50 (мкМ), MT-4 ИД50 (мкМ), MOLT-4 ВД50 (мкМ), СЕМ ВД50 (мкМ), Hep G2 ИД50 (мкМ), HeLa

I 90,3 ± 2,3 74,6 ± 2,7 147,9 ±2,2 141,2 ±2,5 151,5± 1,4

1а 62,5 ± 1,2 56,8 ± 1,2 90,6 ±2,5 109,3 ± 1 3 96,5 ± 2,5

16 20,14 ±0,9 35,9 ±1,0 54,7 ±1,3 85,4 ±1,2 82,8 ± 2,4

III 62,5 ±1,4 50,8 ± 0,8 11,6 ± 1,7 118,4 ±2,5 120,5 ± 1,4

IV 65,2 ±1,3 40,4 ±1,4 21,8 ±1,5 108,3 ±3,5 101,0 ±2,4

IVa 41,2 ± 1,2 17,1 ±0,8 14,5 ±0,8 53,3 ± 1,4 80,0 ±1,9

IV6 32,8 ± 0,9 26,2 ± 0,6 20,5 ± 0,7 52,5 ± 1,7 89,4 ±2,1

IVb 50,4 ±0,4 15,6 ± 1,5 12,5 ±0,2 50,2 ± 1,3 47,9 ±1,1

IVr 5,5 ±0,5 6,4 ± 0,3 9,1 ±1,2 33,1 ±0,8 24,5 ±1,2

IVA 200,7 ± 2,5 250,4 ± 2,5 225,5 ± 2,6 100,4 ±0,9 290,0 ±3,4

IVe 390,5 ± 2,2 390,0 ± 4,2 276,5 ± 3,35 350,0 ± 1,3 260,0 ±6,4

1Уж 200 ± 1,2 251,5 ±3,1 256,0 ±2,7 298,0 ± 4,27 300,0 ± 5,77

IV3 380 ±3,4 320,5 ± 4,2 230,5 ± 3,3 287,0 ±2,4 275,0 ± 2,4

IVu 245,3 ± 3,8 287,0 ± 2,4 180,0 ±2,4 198,5 ± 2,3 187,5 ±2,5

IVk 287,0 ± 4,3 250,0 ± 4,0 220,0 ±3,5 320,0 ± 2,4 250,0 ±3,4

IVл 230,5 ± 2,4 267,0 ± 4,3 210,0 ±4,5 120,0 ± 2,4 200,0 ±2,4

Показатель ИД50 исследованных соединений находился в интервале между 5,5 ± 0,5 и 390,5 ± 2,2 мкМ С28-Моносукцинат ацетата бетулина (16) обладал более выраженной ингибирующей активностью на рост клеток, чем бетулин (I) Необходимо отметить, что в других исследованиях, в частности на клетках меланомы (линия В16), также показана слабая активность бетулина, для этого соединения показатель ИД50 на этих клетках составлял 100,0 мкг/мл (277 мкМ) (Liu W К et al, 2004) Из литературных данных известны примеры высокоактивных цитотоксичных ацетоксилупанов, также содержащих С28-карбоксильную группу (Sarec J et al, 2003) Высокой ингибирующей активностью по отношению к росту опухолевых клеток обладали амиды и дипептид бетулоновой кислоты (IVa-r) Эти соединения (IVa-r) явились более активными ингибиторами роста опухолевых клеток МТ-4, MOLT-4, Hep G2, HeLa, они ингибировапи рост клеток в меньших концентрациях (ИД50 составила 5,5 ± 0,5 - 89,4 ± 2,1 мкМ), чем БК (III) (ИД50 составила 11,6 ± 1,7 -120,5 ± 1,4 мкМ) или бетулоновая кислота (ИД50 составила 21,8 ± 1,5 - 108,3 ± 3,5 мкМ), хотя в клетках СЕМ БК (III) оказалась более активной, чем амиды (IVa-в) Наиболее активным соединением оказался дипептид бетулоновой кислоты (IVr) Таким образом, длина метиленового звена (СН2)П (п=7,8,10) в

амидном остатке незначительно изменяет цитотоксическую активность, однако введение второго амидного остатка приводило к увеличению ингибирования роста опухолевых клеток (соединение IVr) Слабую противоопухолевую активность in vitro проявили соединения (1Уд-л), показатель ИД50 составил 100,4 ± 1,9 мкМ и более Можно предположить, что это связано с наличием неполярных заместителей в С-28 положении этих соединений, отсутствием концевой карбоксильной группы в этом положении

Таким образом, существует определенная связь между химической структурой и противоопухолевой активностью исследованных тритерпеновых гликозидов in vitro Ранее показано, что противоопухолевая активность тритерпеновых гликозидов в малой степени зависит от химической структуры агликона, а в основном определяется количеством и местом присоединения к агликону боковых радикалов (Baglin I et al, 2003) Замечено, что модификации БК по положению С-20 не приводят, по данным МТТ-теста, к усилению ее цитотоксической активности in vitro (Kim J Y et al, 2001) Кроме того, модификации в С-3 положении тритерпенового остова приводят к снижению активности БК (Darrik S Н et al, 1998). С другой стороны, в литературе есть данные о том, что простые химические трансформации в С-28 положении влияют на способность ингибировать рост опухолевых клеток в культуре (You Y J et al, 2003) С этими данными согласуются и дополняют их результаты проведенных нами экспериментов (табл 2), говорящие о том, что превалирующим фактором для производных бетулоновой кислоты является длина спейсер-метиленового звена радикала в 17-положении тритерпенового остова, а также концевая группа радикала в 17-положении Из чего можно предположить, что радикал в 17-положении тритерпенового остова каким-либо образом влияет на противоопухолевую активность производных бетулиновой кислоты т vitro

Исследование цитотоксической активности производных глицирризиновой кислоты in vitro

Для исследования были взяты ГК и ее производные (II, IIa-ж) (рис 2) COR2 II R' = H,R2 = OH,

Ila R = H,R2 = NH(CH2)4C02H, Пб R'= Н, R2 = NH(CH2)5C02H, Пв R'=H, R2 = NH(CH2)6C02H, Пг R'=H, R2 =NH(CH2)7C02H, Пд R1=Ac, R2=NH(CH2)8C02H, II, Па-ж Пе R'=H, R2=NH(CH2)10CO2H,

Пж R1 =H, R2 = NH(CH2)8C0NHCH(Ph)CH2C02H ГК R'= 2'-0-(Р-В-глюкуронопиранозил)- p-D-глюкуронопиранозид, R2=OH

Рис. 2. Структура исследуемых соединений. Производные глицирризиной кислоты (ГК)

В табл 2 приведены ИД50 (50% ингибирующие дозы) для этих соединений на пяти опухолевых клеточных линиях человека (МТ-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2, HeLa)

Таблица 2. Ингибирование жизнеспособности опухолевых клеток производными ГК, ИД5о(мкМ) ±SE

Соединение ЩЫмкМ), МТ-4 ИД5о(МКМ), MOLT-4 ВД50(МКМ), СЕМ ИД» (мкМ), Hep G2 ИД50 (мкМ), IleLa

ГК не достиг не достиг не достиг не достиг не достиг

II 334,8 ± 1,5 411,9 ±1,7 363,4 ±1,4 418,5 ±3,4 440,5 ±2,4

На 158,5 ± 1,2 152,3 ±1,9 132,7 ± 1,5 289,8 ± 3,4 168,0 ±1,2

Пб 132,2 ± 1,5 169,3 ± 1,5 107,5 ± 1,8 352,7 ± 4,6 211,0 ± 3,0

Пв 214,7 ±2,1 134 ± 2,5 138,3 ± 1,4 300,7 ± 1,5 214,7 ±1,5

Пг 160,2 ±2,3 87,6 ±1,0 121,4 ±1,7 146,7 ± 2,1 146,0 ±3,5

Ид 77,6 ±1,3 81,0 ±1,4 57,2 ±2,5 98,1 ± 1,4 83,5 ±2,5

Не 196,5 ± 1,4 235,8 ± 1,4 141,5 ±0,9 314,4 ±3,6 173,5 ± 2,4

Нж 112,8 ± 1,5 162,2 ± 1,6 109,3 ±1,6 141,0 ±3,6 113,5 ± 1,2

Как видно из табл 2, на исследуемых клеточных линиях ГК оказалась неактивна, 50% ингибирующая доза (ИД50) не была достигнута, жизнеспособность опухолевых клеток была аналогична жизнеспособности клеток необработанных экспериментальными соединениями Глицирретовая кислота (II) обнаруживала способность ингибировать рост опухолевых клеток, хотя, и самую слабую в этом ряду исследованных соединений (ИД50 составила 334,8 ± 1,5- 440,5 ± 2,4 мкМ)

Следует отметить, что производные глицирретовой кислоты, содержащие фрагмент аминооктановой или аминононановой кислоты (Нг, д), а также ее дипептид (Нж) оказались более активными ингибиторами роста опухолевых клеток, чем соответствующие амиды (Иа-в, е), содержащие остатки аминомасляной, аминопецтановой, аминогексановой или аминоундекановой кислот В целом, наибольший эффект на исследованные клетки оказал амид глицирретовой кислоты (11д), ИД50 составила 77,6 ± 1,3 - 98,1 ± 1,4 мкМ Можно предположить, что это связано с наличием ацетогруппы в С-3 положении тритерпенового остова этого соединения, которая отсутствует у других исследованных амидов глицирретовой кислоты (На-г, е, ж). Из полученных экспериментальных данных также можно сделать вывод о том, что введение химических модификаций, также как и в случае производных

бетулоновой кислоты, в структуру глицирретовой кислоты вызывает усиление ее ингибирующих свойств в культуре опухолевых клеток

Таким образом, впервые показано, что азотсодержащие производные глицирретовой кислоты (IIa-ж), модифицированные по С-28 положению, могут оказывать ингибирующее действие на рост опухолевых клеток человека МТ-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2, HeLa в культуре, эти результаты оказались достаточно интересными Если сравнивать результаты табл 1 и 2, где приведены величины ИД50 для производных тритерпенов, то становится видно, что амидные производные глицирретовой кислоты в целом менее активны, чем производные бетулина и бетулиновой кислоты

Таким образом, из полученных экспериментальных данных также можно сделать вывод о том, что введение химических модификаций (пептидных остатков) в структуру тритерпенов вызывает усиление их ингибирующих свойств на рост опухолевых клеток в культуре

Исследование способности тритерпенов вызывать апоптоз в опухолевых клетках in vitro

При первичном скрининге соединений обнаружено, что производные бетулина эффективно ингибируют рост опухолевых клеток в культуре Ранее было показано, что БК обладает апоптозиндуцирующей активностью в культурах опухолевых клетках (Schimdt М L et al, 1997; Fulda S et al, 1999, Eiznhamer D A et al, 2004, Ehrhardt H et al., 2004) Поэтому, с учетом полученных результатов МТТ-теста для тритерпеновых соединений, проявивших наибольшую ингибирующую активность, с помощью проточной цитофлуориметрии была определена способность вызывать апоптоз в исследованных клетках Для этого были выбраны наиболее активные ингибиторы лупанового типа - бетулин (I), сукцинаты бетулина (1а,б), БК (III), бетулоновая кислота (IV) и ее производные (IVa-r) Метод проточной цитометрии является методом выбора для количественного анализа апоптоза клеток (Nicoletti 1. et al ,1991, Afanasyev V et al, 1993, Riccardi С et al, 2006)

Одно из апоптотических событий реализуется в ядре клетки и заключается во фрагментации ДНК. Метод проточной цитометрии позволяет регистрировать клетки, содержащие фрагментированную ДНК, которые оцениваются на гистограммах как субдиплоидный пик (npe-Gl) и соответствует доли клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК

Интенсивность флуоресценции

Рис. 3. ДНК гистограммы проточной цитометрии клеток линий МТ-4 (Л), MOLT-4 (Б), СЕМ (В), Hep G2 (Г), HeLa (Д) до (контроль) и после обработки бетулиновой кислотой (III) или ее амидами (IVa-в) На гистограммах приведена зависимость числа клеток (ордината) от величины флуоресценции по второму каналу FL2 (абсцисса) Субдиплоидный (нре-Gl) пик представлен регионом Ml, соответствующим клеткам в стадии апоптоза

На рис 3 представлены ДНК-гистограммы, характеризующие распределение клеток по фазам клеточного цикла (регион М! соответствует апоптозу, М2- G0/G1, М3 - S+G2+M фазам клеточного цикла) Как видно из ДНК гистограмм рис 3, количество клеток в контрольных линиях МТ-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2, HeLa с гиподиплоидным содержанием ДНК (регион Ml) незначительно, в то время как в опыте (после обработки клеток этих линий экспериментальными соединениями) наблюдается увеличение содержания клеток в стадии апоптоза. Далее из ДНК гистограмм с помощью программы CellQuest («Becton Dickinson», США) рассчитывали апоптотический индекс (АИ, %). Значения АИ для соединений I, 1а, 16, III, IV, IVa-r в различных опухолевых клетках в культуре представлены на рис 4-5

«40

'S 30

х ф

¡20

1 10

-- 1

1 1 г

F I ; Ii

ж * . If

___i^er^eflreri б

I Ia Ii Ш IV IV» IVS IV. IVr Исследуемые соединения

I I» И Ш IV IV» IVS IV» IVr Исследуемые соединения

j- 48 ч I- 72 ч

I I» и Ш IV IV» IV« IV« IVr Исследуемые соединения

Рис. 4. Влияние тритерпеновых производных на уровень апоптоза лейкозных клеток . К - контроль (клетки, необработанные соединениями). Индукция апоптоза в клетках МТ-4 (А), (Б), (В). Приведены средние значения ± отклонение от среднего, * - достоверность различий относительно контроля (р<0,05), # - достоверность различий относительно БК (III) (р<0,05).

Ii IS Ш IV IV« 1У6 IV> IVr Исследуемые соединения

i« и ш IV re. m iv« ivi Исследуемые соединения

Рис. 5. Влияние тритерпеновых производных на уровень апоптоза клеток Hep G2 и HeLa. К - контроль (клетки, необработанные соединениями). А. Индукция апоптоза в клетках Hep G2. Б. - В клетках HeLa. Приведены средние значения ± отклонение от среднего, * - достоверность различий относительно контроля (р<0,05), # - достоверность различий относительно БК (III) (р<0,05).

Как видно из данных рис. 4 и 5, действие бетулиновой кислоты, производных бетулина и бетулоновой кислоты на клетки приводило к развитию апоптоза, эффективность индукции которого зависела от структуры

соединения, продолжительности инкубации и типа клеток Апоптозиндуцирующая способность сукцинатов бетулина (1а,б) (АИ составил не более 12%) была на уровне активности бетулиновой кислоты (на клетках МТ-4, MOLT-4 и HeLa) Апоптозиндуцирующая активность амидов и пептида бетулоновой кислоты (IVa-r) оказалась выше активности бетулиновой кислоты (III) (АИ был в диапазоне 10-55%), а также бетулоновой кислоты (IV) на клетках МТ-4, MOLT-4, СЕМ и HeLa Хотя, в клетках СЕМ АИ достигал 25 ± 2% на 72 ч инкубации, что сопоставимо с апоптозиндуцирующей активностью амидов (IVa, IVb) и дипептида (IVr) бетулоновой кислоты на этих клетках, где АИ составлял 30 ± 4,3% (рис 4В) В клетках HeLa максимальный уровень апоптоза был на 72 ч инкубации с соединением (IVa), АИ составил 23 ± 1,8% (рис 5А) Низкий уровень апоптоза (АИ не более 10%) во всех случаях обработки экспериментальными соединениями наблюдался в клетках Hep G2 (рис 5Б) Таким образом, введение амидной функции в положение С-28 лупановых тритерпеноидов приводит к получению эффективных индукторов апоптоза Варьирование длины п (СН2)п - звена амидного заместителя в положении С-28 незначительно влияет на изменении апоптозиндуцирующих свойств соединений, что хорошо видно на примере производных (IVa-в) и дипептида (IVr)

Также полученные данные свидетельствуют о том, что на исследованных клеточных линиях апоптозиндуцирующая активность тритерпенов зависела от продолжительности инкубации Процентное содержание клеток в фазе апоптоза после 72 часов инкубации клеток с экспериментальными препаратами было выше, чем при 48 часовой инкубации, что может быть связано с внутриклеточным механизмом индукции апоптоза данными соединениями Это может свидетельствовать о том, что исследуемые соединения действуют в определенной фазе клеточного цикла и требуют более длительного воздействия в течение нескольких клеточных циклов

Впервые апоптозиндуцирующая активность представителей высших терпеноидов выделенных из растений, с использованием культур клеток, была продемонстрирована в 1995 году (Pisha Е et al, 1995, Qian L et al, 1995) В дальнейшем были синтезированы и исследованы модифицированные производные природных тритерпенов лупанового ряда, которые оказались более активными индукторами апоптоза в опухолевых клетках (Sarec J et al, 2003) Работы свидетельствуют, что модификации по 17-положению тритерпенового остова приводят к усилению апоптозиндуцирующих свойств пентациклических тритерпенов, как это было показано на клетках мышиной меланомы (линия В16 2F2) (Hata К et al, 2002)

Таким образом, представленные данные позволяют считать, что противоопухолевое действие тритерпенов выражается в снижении клеточного роста и увеличении числа клеток, гибнущих в форме апоптоза В связи с этим, конечно, важно выяснить, как цитотоксические эффекты реализуются в опухолевых клетках, и какие внутриклеточные механизмы вовлечены в противоопухолевые эффекты производных тритерпенов

Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена Bcl-2 в лейкозных клетках

Ранее показано, что апоптоз, индуцированный тритерпеновыми соединениями, в частности БК, в раковых клетках осуществляется независимо от «рецепторов смерти» (CD-95/Fas) и белка р53.

Одним из ведущих генов, определяющим механизм клеточной гибели, является Bcl-2. Этот ген кодирует образование антиапоптотического белка, накапливающегося в митохондриях, и проявляет онкогенный эффект, так как снижает апоптоз. В связи с этим, мы исследовали возможное влияние БК (III), бетулоновой кислоты (IV), ее амидов (IVa-в) и дипептида (IVr) на экспрессию гена апоптоза Bcl-2 в наиболее чувствительных к их апоптозиндуцирующему действию опухолевых клетках MOLT-4 и СЕМ. Для этой цели был применен метод мультиплексной ОТ-ПЦР. Ген ß-actin был использован как эндогенный внутренний стандарт, относительно которого проводилась нормализация количества продуктов амплификации мРНК Bcl-2. На рис. 6 представлены результаты мультиплексной ОТ-ПЦР гена Bcl-2 в лейкозных клетках. Видно (рис. 6А), что обработка клеток СЕМ экспериментальными соединениями (III, IV, IVa-r) приводит к уменьшению содержания мРНК Bcl-2 в этих клетках в 1,8 -2,3 раза по сравнению с контрольными клетками СЕМ (р<0,05).

Б м

—> 4- ß-actin mm mm м и«« тщ шш тт |||—боол.н. . 4— Bcl-2 * •"-•*» шш тт Ыш ШШ ........' — 400 П.Н.

^ ййй*—-апптти

400 П. Н,— ***** 300П.Н— ......

Рис. 6. Данные мультиплексного ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена Bcl-2 в лейкозных клетках СЕМ (А) и MOLT-4 (Б) в контроле (К) и опыте (в клетках, обработанных соединениями III, IV, IVa-r). М - маркер молекулярного веса ДНК. На диаграмме приведены средние значения ± отклонение от среднего (п=3), * - достоверность различий относительно контроля (р<0,05).

Обработка экспериментальными соединениями (III, IV, IVa-r) клеток MOLT-4 также приводит к уменьшению содержания мРНК Bcl-2 в этих клетках в 1,6 - 2,2 раза по сравнению с контрольными клетками M0LT-4 (р<0,05).

Приведенные выше результаты показывают принципиальное вовлечение Bcl-2 зависимого пути в механизмы индукции апоптоза тритерпеновыми

соединениями (III, IV, IVa-r), под действие которых происходит снижение экспрессии гена Bcl-2. Эти данные согласуется с данными других исследований, которые показывают, что, в частности БК, индуцирует апоптоз в опухолевых клетках, сопровождающийся активацией каспазы 9 (Fulda S. et al., 1997; Grunewald S. et al., 2005), которая реализуется путем инициации митохондриального (Bcl-2 зависимого) пути, но не каспазы 8, активируемой в результате осуществления каскада реакций, запускаемых взаимодействием CD95/Fas рецептора с лигандом и, таким образом, независимо от этого пути апоптоза (Jin Z. et al., 2005).

Исследование влияния производиых тритерпенов на экспрессию гена Cyclin Dl в опухолевых клетках

Также было определено с помощью мультиплексного ОТ-ПЦР анализа изменение экспрессии гена Cyclin Dl в клетках СЕМ, MOLT-4 контрольных линий и клеток, подвергнутых действию тритерпенов. Для исследования были выбраны наиболее активные производные тритерпенового ряда. Результаты мультиплексной ОТ-ПЦР представлены на рис. 7.

ß-üctin -Cyclin Dl

Ш-боопн. ß-асйп-

— 400 П.Н —ЗООП.Н.

а и s ш

1 г

Ii.п.

IIIIII

К Ш IV [Vi IVB IVj IVr Исследуемые соединения

К Ш IV IVa IV5 №> IVr Исследуемые соединения

Рис. 7. Данные мультиплексного ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена СусИп £>/ в лейкозных клетках СЕМ (А) и МОЬТ-4 (Б) в контроле (К) и в клетках, обработанных препаратами (III, IV, 1Уа-г). М - маркер молекулярного веса. На диаграмме приведены средние значения ± отклонение от среднего (п=3), * - достоверность различий относительно контроля (р<0,05).

Как видно из рис. 7А, инкубирование клеток СЕМ в течение 48 ч с соединениями (1Уа-г) в концентрации 10 мкг/мл приводит к уменьшению экспрессии гена СусИп £>/ в 1,6-2 раза по сравнению с контролем (р<0,05). Как оказалось, БК (III) и бетулоновая кислота (IV) не влияли на уровень мРНК СусИп О! в исследуемых клетках. Подобные результаты были получены при

анализе содержания мРНК Cyclin D1 клетках MOLT-4. Рис. 7Б показывает, что обработка клеток MOLT-4 соединениями (IVa-r), приводит к снижению содержания мРНК Cyclin D1 в 1,9 - 2,1 раза (р<0,05) в этих клетках.

Повышенная продукция Cyclin D1 способствует инициации клеточного деления. Избыток комплексов Cyclin Dl/Cdk6(4) позволяет реализоваться транскрипционным факторам пролиферации, стимулирует переход клетки из состояния GO в фазу G1 клеточного деления и затем клетка переходит в S-фазу клеточного цикла (Williams M. Е. et al., 2005). Безусловно, этот белок в высоких количествах обладает онкогенными свойствами, поскольку влияет на контроль клеточного роста, темп клеточного цикла и экспрессию генов (Sutherland R. L. et al., 2002). С другой стороны отмечено, что ингибирование экспрессии Cyclin D1 приводит к остановке клеточного деления и выходу клетки в фазу апоптоза.

Таким образом, проведенные эксперименты наглядно свидетельствуют о том, что один из механизмов противоопухолевого действия амидов и дипептида бетулоновой кислоты в клетках лейкозов человека (СЕМ, MOLT-4) связан со снижением экспрессии гена Cyclin D1 в этих клетках, что также может обуславливать остановку деления клеток и выход их в фазу апоптоза.

Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена hTERTв опухолевых клетках

Следующим шагом в изучении возможных механизмов противоопухолевого действия тритерпенов стало исследование влияния соединений на уровень мРНК hTERT (каталитической единицы теломеразы) в лейкозных клетках MOLT-4.

Изменение содержания мРНК hTERT Ъыпо определено с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ с последующим анализом на проточном цитометре (flow-FISH). Рис. 8 показывает осуществление автоматического анализа клеток MOLT-4 в потоке.

А Б

Интенсивность флуоресценции Рис. 8. А. Точечная диаграмма клеток МОЬТ-4, визуализация клеток по их плотности (боковое светорассеивание, ББС) и размеру клетки (прямое светорассеивание, РЭС). Б. Гистограмма проточной цитометрии, показывающая флуоресценцию клеток региона ИЛ по каналу ИЛ. Регион М1 - интенсивность флуоресценции клеток без зонда (собственная флуоресценция или аутофлуоресценция). Регион М2 - флуоресценция клеток с зондом (ОпрЫАЛЧТС) к мРНК ИТЕЯТ.

Типичная точечная диаграмма отображения клеток (регион R1) показана на рис 8А. Автоматическая количественная обработка сигналов позволила строить функции распределения клеток из исследуемой популяции регион R1 в зависимости от сигнала интенсивности флуоресценции по первому каналу FL1 (рис 8Б) Рис 9 характеризует сравнительный анализ данных, полученных с помощью метода flow FISH, относительное содержания мРНК hTERT в контрольных клетках MOLT-4 (клетки необработанные соединениями) (100%) и обработанных соединениями (III, IVa-r), процентное содержание относительно контроля

Исследуемые соединения Рис. 9. Данные flow FISH анализа содержания мРНК hTERT в лейкозных клетках MOLT-4 в контрольной линии и в клетках, обработанных соединениями (III, IVa-r) Уровень мРНК hTERT представлен в % от уровня в контроле (100%) * -достоверность различии относительно контроля (р<0,05)

Видно (рис 9), что инкубирование лейкозных клеток MOLT-4 m vitro с экспериментальными препаратами (IV6-r) в концентрации 10 мкг/мл в течение 48 ч приводило к снижению содержания мРНК hTERT на 23,5, 33 и 55% соответственно относительно контроля (р<0,05). Однако, в случае действия БК (III) и амида бетулоновой кислоты (IVa) на клетки MOLT-4 не происходило снижения содержания мРНК hTERT в выбранных условиях эксперимента

Примерно в 90% опухолевых клеток человека обнаружена активность фермента теломеразы, тогда как нормальные соматические клетки (за исключением тканей, содержащих стволовые клетки) такую активность не проявляют (Shay J et al., 1997, Kim N et al, 1997) Теломераза - это РНК-зависимая ДНК-полимераза или обратная транскриптаза Ферменты этого класса, синтезирующие ДНК на РНК-матрицах, хорошо известны Они закодированы и содержатся в ретровирусах (например, в вирусе иммунодефицита человека) и служат для синтеза ДНК-копий их геномов, который в ретровирусе представлен РНК В клеточном геноме обратные транскриптазы закодированы в ретротранспозонах Существует ряд гипотез, предлагающих модель эволюционной связи от мобильных элементов к теломерным последовательностям и наоборот. Эти гипотезы основаны на

высокой степени гомологии между каталитической субъединицей теломеразы (hTERT) и обратной транскриптазой ретротранспозонов (Eickbush Т. et al, 1997). Интересен тот факт, что ангиретровирусное действие некоторых тритерпенов, в частности анти-ВИЧ активность, связана со способностью ингибировать обратную транскриптазу вируса (Pengsuparp Т. et al, 1995, Mizushma Y et al, 2000; Ильина T В. и др, 2002) Ранее было установлено, что в клеггках HL-60 при длительном культивировании в присутствии некоторых тритерпеновых соединений происходит снижение активности теломеразы, что также сопровождается ингибированием их пролиферации и апоптозом (Ji Z N. et al, 2004) Приведенные данные может подтверждать тот факт, что некоторые антиретровирусные препараты, например, зидовудин, механизм действия которого связан с ингибированием обратной транскриптазы вируса, могут являться эффективными ингибиторами теломеразы в опухолевых клетках (Мо Y. et al, 2003, Brown Т et al, 2003)

Таким образом, согласно полученным нами результатам, одним из механизмов противоопухолевого действия исследуемых производных растительных тритерпенов является ингибирование экспрессии гена hTERT в лейкозных клетках in vitro Доказано, что ингибирование экспрессии этого гена ведет к потере активности теломеразы, что, скорее всего, приведет к потере теломеров и хромосомной нестабильности - а это также может индуцировать апоптоз (Herbert В et al, 1999)

Представленные нами данные показывают перспективность дальнейшего изучения многофункциональности противоопухолевого действия высших терпеноидов с целью направленного синтеза производных с повышенной специфичностью воздействия на молекулярные мишени опухолевых клеток, влияющих одновременно на различные этапы онкогенеза

Выводы

1 Впервые исследована цитотоксическая активность азотсодержащих производных тритерпеновых кислот - глицирретовой и бетулоновой, а также ацетооксипроизводных бетулина т vitro Определены 50% ингибирующие дозы (ИД50) на опухолевых клетках человека МТ-4,

. MOLT-4, СЕМ, Hep G2, HeLa (5,5 - 440 мкМ) Показано, что химические трансформации бетулина, бетулиновой, глицирретовой кислоты в С-28 положении увеличивают их способность в 2-10 раз ингибировать рост опухолевых клеток в культуре

2 Обнаружено апоптозиндуцирующее действие производных бетулина в опухолевых клетках в культуре. Показано, что азотсодержащие производные бетулиновой кислоты, замещенные в 17-положении тритерпенового остова, являются 2-5 раза более активными индукторами апоптоза в лейкозных клетках МТ-4, MOLT-4, СЕМ, в 1,5 раза в клетках гепатокарциномы Hep G2 и 1,5-2,5 раза в клетках аденокарциномы шейки матки HeLa, чем бетулиновая кислота (р<0,05)

3 Установлено, что под действием тритерпеновых соединений лупанового ряда (бетулиновой кислоты, бетулоновой кислоты, амидов бетулоновой кислоты, содержащих 7, 8, 10 метиленовых остатков и СОО" концевую группу, и ее дипептида) происходит снижение содержания мРНК гена Вс1-2 в клетках MOLT-4 и СЕМ в 1,6-2,3 раза (р<0,05).

4 Показано снижение содержания мРНК Cyclm D1 в клетках MOLT-4 и СЕМ в 1,6-2,1 раза (р<0,05) под действием амидов бетулоновой кислоты, содержащих 7,8,10 метиленовых остатков и СОО" концевую группу, и ее дипептида.

5. Впервые с помощью flow-FISH анализа установлено, что одним из механизмов противоопухолевого действия производных бетулоновой кислоты, модифицированных по 17-положению тритерпенового остова группой, содержащей 8 и 10 метиленовых остатков и СОО" концевую группу, и дипептида, является ингибирование экспрессии гена hTERT на 23,5,33 и 55% соответственно (р< 0,05)

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях

1 Шинтяпина А.Б., Шульц Э Э, Петренко Н И, Узенкова Н В, Толстиков Г А., Пронкина Н В, Кожевников В С., Покровский А Г. Влияние азотсодержащих производных растительных тритерпенов - бетулина и глицирретовой кислоты на рост опухолевых клеток МТ-4, MOLT-4, СЕМ и HepG2 //Биоорг.химия 2007 -Т.З3 -№6 - С.624-628

2. Shintyapina А.В., Pokrovsky AG, Schults EE, Tolstikov GA. In vitro antitumor effect and mechanism of action of new tnterpene derivatives // Abstract book of «International Symposium on Advances m Synthetic and Medicinal Chemistry ASMC 07» 2007. P. 54

3 Шинтяпина А.Б., Покровский А Г, Борисов В И, Пронкина Н В., Кожевников В С , Шульц Э Э , Толстиков Г А Исследование механизмов противоопухолевого действия производных бетулиновой кислоты т vitro II Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье. 2005 Т. 9 № 2 С 87 / Тезисы XVI международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, 2007.

4 Покровский А Г, Шинтяпина А.Б., Пронкина Н В, Кожевников В С, Плясунова О.А, Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Индукция апоптоза производными бетулиновой кислоты в опухолевых клетках человека т vitro II ДАН Раздел биофизика, биохимия, молекулярная биология. 2006 - Т 407 - № 5. — С. 698-701

5 Shintyapina А.В. Induction of apoptosis by new derivatives of betulimc acid in human tumor cells MT-4, MOLT-4, СЕМ and Hep G2 // Abstract book of VIII International Symposium «Biology of Disease - A Molecular Battlefield» 2006 P. 75 / VIII International EMBL Symposium «Biology of Disease - A Molecular Battlefield», Heidelberg, Germany, 2006

6 Шинтяпина А.Б., Покровский А Г, Пронкина H В., Петренко Н И, Узенкова НВ, Шульц ЭЭ Цитотоксическое и апоптозиндуцирующее

действие новых производных бетулиновой кислоты в лейкозных клетках человека in vitro // Материалы международной школы-конференции для молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2006, С 176-177

7 Шинтяпина А.Б., Кожевников С В , Шульц Э Э, Петренко Н И , Узенкова Н В , Толстиков Г А, Покровский А Г. Апоптозиндуцирующий эффект производных бетулиновой кислоты на клетки Hep G2 // Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье 2006 Т 10 №2 С. 45 / Тезисы XV-ой международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, 2006

8 Шинтяпина А.Б., Покровский А Г, Шульц Э Э, Толстиков Г А. Индукция апоптоза бетулоновой кислотой в опухолевой линии человека // Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье 2005 Т 9 № 2 С 90 / Тезисы XIV международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, 2005

Список сокращений

ДМСО - диметилсульфоксид

ГК - глицирризиновая кислота

БК - бетулиновая кислота

ОТ - обратная транскрипция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

FISH - (fluorescence in situ hybridization) флуоресцентная гибридизация in situ

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид

ИД50 - доза, ингибирующая жизнеспособность опухолевых клеток на 50%

АИ - апоптотический индекс, %

Hep G2 - клетки карциномы печени человека

СЕМ - клетки Т-клеточной лейкемии человека

МТ-4 - клетки Т-клеточной лейкемии человека

MOLT-4 - клетки Т-лимфобластной лейкемии человека

HeLa - клетки эпителиоидной карциномы шейки матки человека

Благодарности

Автор благодарит ближайших коллег, оказавшим помощь к подготовке данной работы, и, персонально, выражает благодарность Н С. Пронкиной, В И Борисову (НИИКИ СО РАМН, Новосибирск) за помощь в освоении метода проточной цитометрии, к.б н. О. А Плясуновой (ГНЦ ВБ «Вектор») за моральную поддержку и дружеское участие при работе над диссертацией, заведующей лаборатории медицинской химии, д х н Э. Э Шульц (НИИОХ СО РАН, Новосибирск) за синтез соединений и ценные советы при обсуждении результатов, профессора, доктора медицинских наук, Покровского А Г за научное руководство работой.

Шинтяпина Александра Борисовна

Автореф дисс на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 15 04 2008 Заказ № 26 Формат60x90/16 Уел печ л 1 Тираж!00экз Типография Института катализа им Г К Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шинтяпина, Александра Борисовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клеточные культуры как модель экспериментальной онкологии

1.2. Разработка адресованных противоопухолевых препаратов.

1.2.1. Создание новых противоопухолевых препаратов, влияющих на передачу митогенных сигналов.

1.2.2. Молекулярные мишени для антиангиогенной терапии.

1.2.3. Теломераза - потенциальная мишень противоопухолевой терапии.

1.2.4. Противоопухолевые препараты - индукторы апоптоза

1.3. Тритерпеновые соединения.

1.3.1. Глицирризиновая кислота.

Противоопухолевая активность.

1.3.2. Бетулин, бетулиновая кислота.

Противоопухолевая активность.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы, используемые в работе.

2.1.2. Исследуемые соединения.

2.1.3. Клеточные линии.

2.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды.

2.1.5. Буферные растворы.

2.2. Методы.

2.2.1. Исследование цитотоксической активности соединений в . опухолевых клетках в культуре (МТТ-тест).

2.2.2. Анализ апоптоза методом проточной цитометрии.

2.2.3. Выделение суммарной клеточной РНК.

2.2.4. Определение концентрации РНК в образце.

2.2.5. Реакция обратной транскрипции.

2.2.6. Полимеразная цепная реакция.

2.2.7. Анализ продуктов ПЦР.

2.2.8. Флуоресцентная гибридизация in situ с последующим анализом на проточном цитометре (flow-FISH).

2.2.9. Статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование цитотоксической активности производных высших тритерпенов in vitro.

3.1.1. Исследование цитотоксической активности производных бетулина in vitro.

3.1.2. Исследование цитотоксической активности производных глицирризиновой кислоты in vitro.

3.2. Исследование способности тритерпенов вызывать апоптоз в опухолевых клетках in vitro.

3.3. Изучение молекулярных механизмов противоопухолевого действия производных тритерпеновых соединений.

3.3.1. Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена Bcl-2 в опухолевых клетках.

3.3.2. Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена Cyclin D1 в опухолевых клетках.

3.3.3. Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена hTERT в опухолевых клетках.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование цитотоксической активности и механизмов действия производных бетулина и глицирризиновой кислоты в опухолевых клетках в культуре"

Рост онкологической заболеваемости в XX веке происходил такими быстрыми темпами, что это дало основание для его сравнения с эпидемией. Ежегодно во всём мире от злокачественных опухолей умирает около 7 млн человек. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2006 году в мире от рака умерло свыше 7 млн человек и диагностировано 10 млн новых случаев онкологических заболеваний. В большинстве развитых стран они занимают второе место среди причин смерти. По оценкам Всемирной организации здравоохранения онкологические заболевания к 2020 году выйдут на первое место в мире по смертности в структуре всех заболеваний, обогнав при этом «традиционного лидера» — сердечно-сосудистые заболевания. К 2030 году число новых диагнозов может возрасти до 27 млн, а число живущих с раком пациентов достигнет 75 млн.

Таким образом, поиск и создание эффективных лекарственных противоопухолевых препаратов является актуальной задачей в современной науке.

Национальный институт рака (National Cancer Institute) осуществляет программу по разработке противоопухолевых препаратов. В рамках этой программы ежегодно проводится тестирование in vitro более 10000 соединений как природного, так и синтетического происхождения. NCI Drug Information System располагает информацией о 400000 соединениях, протестированных на сегодняшний день. Важное место в таких исследованиях занимает поиск возможных молекулярных мишеней или модуляторов для этих лекарств. Число таких мишеней составляет уже более 100, и их число постоянно растет (Dai Z. et al., 2007).

Особенный интерес вызывают те соединения, о противоопухолевой активности которых уже есть данные. Давно известно, что глицирризиновая кислота (ГК), глицирризин, активные компоненты корня солодки (Glycyrrhiza sps.) обладают антиканцерогенным и антимутагенным действием (Tanaka М. and Mano N., 1987). Позднее было показано, что глицирризин, глицирризиновая кислота и некоторые ее производные способны избирательно ингибировать рост опухолевых клеток в культуре (Rossi Т. et al., 2003).

Бетулиновая кислота (БК) - растительный пентациклический тритерпеноид, выделенный из коры березы (Кислицын А. Н., 1994), обладает избирательным цитотоксическим действием в отношении различных опухолевых клеток, противовирусными свойствами, такими как анти-ВИЧ активность, противомалярийным, антибактериальным, а также системным противовоспалительным действием (Kashiwada Y. et al., 1996). Противоопухолевая активность была показана на клеточной линии меланомы (Liu W. et al., 2004), а таюке на модели in vivo, на бестимусных мышах, несущих человеческую меланому (Pisha Е. et al., 1995). Противоопухолевое действие БК и некоторых ее аналогов связывают с избирательной индукцией апоптоза в опухолевых клетках (Eiznhamer D. et al., 2004). В 2000 году БК была включена в программу RAID (Rapid Access to Intervention Development) Национального института рака, как потенциальный противоопухолевый агент (http://dtp.nci.nih.gov/docs/smallmol/statussmallmol.html). В настоящее время препарат на основе бетулиновой кислоты проходит клинические исследования в США в качестве средства для лечения злокачественной меланомы (http://clinicaltrials.gov/show/NCT00346502).

Данные последних исследований свидетельствуют о том, что БК, ГК и другие природные тритерпены ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, индуцируют их апоптоз (Urech К. et al., 2005; Essaady D. et al., 1996; Rossi T. et al., 2003), либо усиливают его индукцию при действии лучевой или химиотерапии (Sawada N. et al., 2004; Wick W. et al., 1999; Fulda S. et al.,

1997), подавляют процессы ангиогенеза и метастазирования (Melzig М. et al.,

1998). Однако, несмотря на значительное количество данных о противоопухолевой активности растительных тритерпенов, на настоящий момент не до конца понятны механизмы их действия в клетке. Показано, что основной противоопухолевый механизм действия тритерпенов связан с индукцией апоптоза в опухолевых клетках, запуск которого под действием ГК, БК в раковых клетках осуществляется независимо от «рецепторов смерти» (CD-95/Fas) и белка р53. С другой стороны, из литературных данных известно, что при действии бетулиновой кислоты на опухолевые клетки происходит активация каспазы 9, но не каспазы 8, что может говорить о Bcl-2-зависимом пути индукции апоптоза (Fulda S. et al., 1997; 1999; Zuco V. et al., 2002).

Изложенное выше определило цель настоящей работы: изучение противоопухолевой активности производных тритерпенов in vitro и исследование возможных молекулярных механизмов их противоопухолевого действия в опухолевых клетках человека in vitro.

Для достижения цели решались следующие задачи:

3) Исследовать влияние наиболее активных производных тритерпенов на экспрессию гена апоптоза Bcl-2 и клеточного цикла Cyclin D1 в опухолевых клетках человека в культуре.

4) Исследовать с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ с последующим анализом на проточном цитометре возможное влияние производных наиболее активных тритерпенов на экспрессию гена каталитической единицы теломеразы (hTERT) в опухолевых клетках in vitro.

Апробация работы и публикации. Результаты исследования были представлены на 10-ой международной школе-конференции для молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), на 14-й, 15-ой, 16-ой международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье» (Санкт-Петербург, 2005, 2006, 2007), на 8-ом международном симпозиуме «Biology of Disease - A Molecular Battlefield» (Гейдельберг, Германия, 2006), на 10-ом международном симпозиуме европейского общества медицинской химии (EFMC) и американского химического общества (ACS) «International Symposium on Advances in Synthetic and Medicinal Chemistry ASMC 07» (Санкт-Петербург, 2007). По результатам работы опубликовано 8 печатных работ, из них 2 статьи и 6 тезисов докладов.

Личный вклад автора. Все эксперименты были выполнены и проанализированы автором, часть измерений на проточном цитометре была проведена сотрудниками Института клинической иммунологии СО РАМН Борисовым В. И. и Пронкиной Н. В.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено тестирование на противоопухолевую активность 25 соединений тритерпенового ряда на 5 опухолевых клеточных линиях человека. Определены

50% ингибирующие дозы для этих клеток (ИД50). Выявлены наиболее активные. С помощью метода проточной цитометрии получены новые данные, характеризующие способность природных тритерпенов лупанового ряда и их производных индуцировать апоптоз в опухолевых клетках in vitro. Исследованы молекулярные механизмы действия тритерпенов лупанового ряда в клетке. Впервые показано, что механизм действия производных бетулиновой кислоты связан со снижением экспрессии гена апоптоза Bcl-2, клеточного цикла Cyclin D1, каталитической субъединицы теломеразы hTERT.

Оригинальный фактический материал, полученный в процессе экспериментальных исследований, представляет собой ценную информацию для дальнейшего изучения противоопухолевого действия тритерпенов с целью направленного создания производных с повышенной специфичностью воздействия на молекулярные мишени опухолевых клеток. Приведенные исследования также являются стимулом для дальнейшего доклинического исследования производных бетулиновой кислоты в системах in vivo их противоопухолевой активности и создания на их основе перспективных препаратов со специфической противоопухолевой активностью.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шинтяпина, Александра Борисовна

выводы

Впервые исследована цитотоксическая активность азотсодержащих производных тритерпеновых кислот - глицирретовой и бетулоновой, а также ацетооксипроизводных бетулина in vitro. Определены 50% ингибирующие дозы (ИД50) на опухолевых клетках человека МТ-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2, HeLa (5,5 - 440 мкМ). Показано, что химические трансформации бетулина, бетулиновой, глицирретовой кислоты в С-28 положении увеличивают их способность в 2-10 раз ингибировать рост опухолевых клеток в культуре. Обнаружено апоптозиндуцирующее действие производных бетулина в опухолевых клетках в культуре. Показано, что азотсодержащие производные бетулиновой кислоты, замещенные в 17-положении тритерпенового остова, являются в 2-5 раза более активными индукторами апоптоза в лейкозных клетках МТ-4, MOLT-4, СЕМ, в 1,5 раза в клетках гепатокарциномы Hep G2 и 1,5-2,5 раза в клетках аденокарциномы шейки матки HeLa, чем бетулиновая кислота (р<0,05).

Установлено, что под действием тритерпеновых соединений лупанового ряда (бетулиновой кислоты, бетулоновой кислоты, амидов бетулоновой кислоты, содержащих 7, 8, 10 метиленовых остатков и СОО" концевую группу, и ее дипептида) происходит снижение содержания мРНК гена Bcl-2 в клетках MOLT-4 и СЕМ в 1,6-2,3 раза (р<0,05).

Показано снижение содержания мРНК Cyclin D1 в клетках MOLT-4 и СЕМ в 1,6-2,1 раза (р<0,05) под действием амидов бетулоновой кислоты, содержащих 7, 8, 10 метиленовых остатков и СОО" концевую группу, и ее дипептида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы возрастает интерес к изучению противоопухолевой активности растительных тритерпеноидов. Согласно (Setzer W. N. et al., 2003), в этом ряду выявлено более 100 соединений перспективных в качестве антинеопластических агентов. Ранее было показано цитотоксическое действие тритерпенов на опухолевые клетки (Fulda S. et al., 1997; Fulda S. et al., 1999). С тех пор это свойство тритерпенов изучалось по разным направлениям: в отношении различных линий опухолевых клеток, в отношении способности индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, что особенно важно, в отношении клеточных механизмов реализации цитотоксичности (Braca A. et al., 2004; Einbond L. et al., 2007).

Объектами тритерпенового ряда, привлекающими последнее время особое внимание, являются гликозид солодки - глицирризиновая кислота (ГК) и метаболит березы - бетулиновая кислота (Толстиков Г. А. и др.,

2002), проявляющие противоопухолевую активность in vitro и in vivo (Liu W. et al., 2004; Urech K. et al., 2005; Essaady D. et al., 1996; Rossi T. et al.,

2003). Показано, что механизм действия производных тритерпенов связан со способностью индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, который реализуется независимо от «рецепторов смерти» (Pisha Е. et al., 1995; Ehrhardt Н. et al., 2004; Fulda S. et al., 1999). Тем не менее, механизм противоопухолевого действия указанными тритерпенами остается до конца не изучен.

В данной работе исследована цитотоксическая активность на рост опухолевых клеток в культуре (линии МТ-4, СЕМ, MOLT-4, HeLa, HepG2) (МТТ-тест) соединений тритерпеновой химической природы глицирризиновой кислоты, глицирретовой, бетулина, бетулиновой кислоты и их производных). Определены для этих соединений 50% ингибирующие дозы (ИД50).

Из первичного скрининга (МТТ-теста) нами выявлено, что амиды (IVa-в) и дипептид (IVr) бетулоновой кислоты в целом являются наиболее активными цитотоксическими соединениями на линиях МТ-4, СЕМ, MOLT-4, Hep G2, HeLa, чем немодифицированные бетулин или БК. ГК оказалась неактивна на исследуемых клеточных линиях. Производные глицирризиновой кислоты в целом оказались менее активными ингибиторами роста опухолевых клеток в культуре, чем производные бетулина и БК. Используя сопоставление химических структур производных бетулоновой кислоты и данных МТТ-теста, было сделано предположение о важности структуры радикала в С-17-ом положении тритерпенового остова производных, что согласуются с литературными данными (Sarec J. et al., 2003; You Y. J. et al., 2003).

Далее, с учетом полученных результатов МТТ-теста для тритерпеновых соединений, проявивших наибольшую ингибирующую активность на рост опухолевых клеток в культуре, с помощью проточной цитофлуориметрии была определена способность вызывать апоптоз в этих клетках. Наиболее эффективными индукторами апоптоза в опухолевых клетках (линии МТ-4, СЕМ, MOLT-4, HeLa) оказались амиды и дипептид бетулоновой кислоты (соединения IVa-r), у которых АИ был выше, чем у немодифицированных растительных тритерпенов (I, III, IV). В клетках карциномы печени человека (Hep G2) апоптозиндуцирующая активность тритерпенов оказалась незначительной (АИ не превышал 10%). Также в ходе анализа данных было замечено, что варьирование длины спейсер-метиленового звена амидного заместителя в положении С-28 незначительно влияет на изменении апоптозиндуцирующих свойств соединений.

Следующим этапом в изучении противоопухолевого действия растительных тритерпенов и их модифицированных производных было изучение молекулярных механизмов в клетке. Поэтому далее на основании данных МТТ-теста и апоптозиндуцирующего анализа для этих целей были выбраны наиболее активные соединения в опухолевых клетках (MOLT-4, СЕМ). Поскольку уже имелся ряд литературных данных о действии тритерпенов в клетке, мы смогли опираться на эти факты при выборе потенциальных мишеней.

Литературные данные указываю на то, что апоптоз в опухолевых клетках под действием тритерпенов связан с инициацией Вс1-2-зависимого пути (Fulda S. et al., 1997; Zuco V. et al., 2002). В связи с этим, было проведено исследование возможного влияния тритерпеновых производных на экспрессию гена антиапоптотического белка Bcl-2 в наиболее чувствительных к их апоптозиндуцирующему действию опухолевых клетках (MOLT-4, СЕМ). Для этого были выбраны БК (III), бетулоновая кислота (IV), ее амиды (IVa-в) и дипептид (IVr). Как показали эксперименты, обработка этими соединениями клеток MOLT-4, СЕМ приводит к уменьшению содержания мРНК гена Bcl-2 в этих клетках в 1,6 -2,3 раза по сравнению с контрольными клетками (р<0,05).

Также было определено с помощью мультиплексного ОТ-ПЦР анализа изменение экспрессии гена Cyclin D1 в клетках СЕМ, MOLT-4 контрольных линий и клеток, подвергнутых действию тритерпенов (III, IV, IVa-r). Существуют и сведения о том, что гиперэкспрессия Cyclin D1 является одним из факторов злокачественной трансформации лимфоцитов ретровирусом HTLV-I, который, в свою очередь, рассматривается в качестве маркера лимфоидных опухолей (Taniguchi Т. et al., 1998; Neuveut С. et al.,

2000). С другой стороны отмечено, что ингибирование экспрессии гена Cyclin D1 приводит к остановке клеточного деления и выходу клетки в фазу апоптоза (Aggarwal В. et al., 2004). Согласно полученным нами результатам соединения (IV, IVa-r) снижают экспрессию гена Cyclin D1 в 1,6-2,1 раза (р<0,05). Однако, растительный тритерпен БК не влияет на изменение содержание мРНК гена Cyclin D1 в лейкозных клетках in vitro.

Следующим шагом в изучении возможных механизмов противоопухолевого действия тритерпенов стало исследование влияния тритерпеновых соединений на экспрессию гена hTERT (каталитической единицы теломеразы) в опухолевых клетках. Показано, что механизм противовирусного действия тритерпенов связан со способностью ингибировать обратную транскриптазу ретровируса (Ильина Т. В. и др., 2002). Существуют сведения о высокой степени гомологии между каталитической субъединицей теломеразы (hTERT) и обратной транскриптазой ретровирусов (Eickbush Т. et al., 1997). С другой стороны известно, что ингибирование экспрессии гена hTERT ведет к снижению активности теломеразы, что приводит к потере теломер и хромосомной нестабильности - это также может индуцировать апоптоз (Herbert В. et al., 1999). Поэтому, применив метод флуоресцентной гибридизации in situ с последующим анализом на проточном цитометре, мы исследовали влияние тритерпенов (III, IVa-r) на экспрессию гена hTERT в лейкозных клетках MOLT-4. Как показали эксперименты, в обработанных клетках не наблюдалось снижения содержания мРНК hTERT под действием БК и амида бетулоновой кислоты (IVa) в выбранных условиях эксперимента, однако, при обработке клеток производными (IV6-r) происходило снижение мРНК hTERT на 23,5, 33 и 55% соответственно, относительно контроля (р<0,05).

Таким образом, впервые было показано, что одним из молекулярного механизмов противоопухолевого действия исследуемых производных растительных тритерпенов является ингибирование экспрессии онкогенов hTERT, Bcl-2, Cyclin Dl, блокирующих противоопухолевую защиту клеток, что в конечном итоге приводит к остановке клеточного роста и выходу клеток в фазу апоптоза.

Представленные нами данные показывают перспективность дальнейшего изучения противоопухолевого действия высших терпеноидов и их модификаций с целью направленного синтеза производных с повышенной специфичностью воздействия на молекулярные мишени опухолевых клеток. Кроме того, полученные результаты о противоопухолевой активности in vitro производных тритерпеноидов являются стимулом для дальнейшего доклинического исследования в системах in vivo их противоопухолевой активности.

Таким образом, исследованные нами производные тритерпенов могут рассматриваться как перспективные химические соединения, на основе которых возможно создание препаратов со специфической противоопухолевой активностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шинтяпина, Александра Борисовна, Кольцово

1. Кислицын А. Н. Экстрактивные вещества бересты: выделение, состав, применение // Химия древесины. 1994. - №3. - С. 3-28.

2. Копнин Б. П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. -2000. Т. 65. - №. 1. - С. 5-33.

3. Петренко Н. И., Еланцева Н. В., Шулъц Э. Э., Шакиров М. М., Толстиков Г. А. Синтез производных бетулоновой кислоты, содержащих аминокислотные фрагменты // Химия природных соединений. 2002. - №. 4. - С. 276-283.

4. Плясунова О. А., Егоричева И. Н., Федюк Н. В. Изучение анти-ВИЧ активности |3-глицирризиновой кислоты // Вопросы вирусологии. -1992. Т. 37(5-6). - С. 235-238.

5. Сорокина И. В., Толстикова Т. Г., Жукова Н. А., Петренко Н. И., Шулъц Э. Э„ Узенкова Н. В. Бетулоновая кислота и ее производные новая группа агентов, снижающих побочное действие цитостатиков // ДАН. -2004. - Т. 399(2). - С. 274-277.

6. Толстиков Г. А., Болтина Л. А., Шулъц Э. Э., Покровский А. Г. Глицирризиновая кислота// Биоорг. химия. 1997. - Т. 23. - С. 691-709.

7. Толстиков Г. А., Болтина Л. А., Толстикова Т. Г., Шулъц Э.Э. Синтетические трансформации высших терпеноидов и алкалоидов // Химия и компьютерное моделирование. 2002. - № 7. - С. 9-20.

8. Толстиков Г. А., Флехтер О. Б., Шулъц Э. Э., Болтина Л. А., Толстиков А. Г. Бетулип и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого разв. 2005. Т. 13. - №. 1. - С. 1-30.

9. Флетчер О. Б., Карачурина Л. Т., Нигматуллина Л. Р. Синтез и фармакологическая активность диникотината бетулина // Биоорг. химия. 2002. - Т. 28. - № 6. - С. 543 - 550.

10. Abe N., Ebina Т., Ishida N. Interferon induction by glycyrizzin and glycyrrhetinic acid in mice // Microbiol. Immunol. 1982. - V. 26. - P. 535539.

11. Abe H., Ohya N., Yamamoto K., Shibuya Т., Arichi S., Odashima S. Effects of glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid on growth and melanogenesis in cultured В16 melanoma cells // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1997. - V. 23(10).-P. 1549-1555.

12. Abe S., Kubota Т., Otani Y„ Furukawa Т., et al. UCN-01 (7-Hydoxystaurosporine) inhibits in vivo growth of human cancer cells through selective perturbation of G1 phase checkpoint machinery // Jpn. J. Cancer Res. 2001. - V. 92. - P. 537-545.

13. Acharya S., Dasarathy S., Tandon A. A preliminary open trial on interferon stimulator (SNMC) derived from Glycyrrhiza glabra in the treatment of subacute hepatic failure // Indian J. Med. Res. 1993. - V. 98. - P. 69-74.

14. Ahmad M., Shi Y. TRAIL-induced apoptosis of thyroid cancer cells: potential for therapeutic intervention // Oncogene. 2000. - V. 19(30). - P. 33633371.

15. Aggarwal В. В., Shishodia S. Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer // Biochem. Pharmacol. 2006. - V. 71(10).-P. 1397-1421.

16. Aggarwal В. В., Takada Y., Oommen О. V. From chemoprevention to chemotherapy: common targets and common goals // Expert. Opin. Investig. Drugs.-2004.-V. 13(10).-P. 1327-1338.

17. Afanasyev V. N., Korol B. A., Matylevich N. P., Pechatnikov V. A., Umansky S. R. The use of flow cytometry for the investigation of cell death // Cytometry. 1993. - V. 14(6). - P. 603-609.

18. Aktas O., Schulze-Topphoff U., Zipp F. The role of TRAIL/TRAIL receptors in central nervous system pathology // Front. Biosci. 2007. - V. 12. - P. 2912-2921.

19. Aly A., Al-Alousi L., Salem H. Licorice: a possible anti-inflammatory and anti-ulcerdrug // AAPS Pharm. Sci. Tech. 2005. - V. 6(1). - P. 74-82.

20. Amioka Т., Kitadai Y., Hiyama Т., Tanaka S., Yoshihara M. Expression of human telomerase reverse transcriptase mRNA in esophageal cancers and precancerous lesions // Oncol. Reports. -2004. V.ll. - P.51-55.

21. Andre N., Rome A., Carre M. Antimitochondrial agents: a new class of anticancer agents // Arch. Pediatr. 2006. - V. 13(1). - P. 69-75.

22. Appels N., Beijnen J. H., Schellens J. Development of farnesyl transferase inhibitors: a review // Oncologist. 2005. - V. 10(8). - P. 565-578.

23. Ashkenazi A., Dixit V. Death receptors: signaling and modulation I I Science. 1998. - V. 281. - P. 1305-1308.

24. Bazzoni F., Beulier B. Tumor necrosis factor ligand and receptor families // N. Engl. J. Med. 1996. -V. 334. - P. 1717-1725.

25. Barnett J. M., McCollum G. W., Fowler J. A., DuanJ. J. Pharmacologic andgenetic manipulation of MMP-2 and -9 affects retinal neovascularization in rodent models of OIR // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. - V. 48(2). -P. 907-915.

26. Baglin I., Mitaine-Offer A. C., Nour M., Tan K, Cave C. A review of natural and modified betulinic, ursolic and echinocystic acid derivatives as potential antitumor and anti-HIV agents // Mini Rev. Med. Chem. 2003. - V. 3(6). -P. 525-539.

27. Bernardi M., D'Intino P., Trevisani F, Cantelli-Forti G., Raggi M., Turchetto E., Gasbarrini G. Effects of prolonged ingestion of graded doses of licorice by healthy volunteers // Life Sci. 1994. - V. 55(11). - P. 863872.

28. Blagosklonny M., Bishop P., Robey R. Loss of cell cycle control allows selective microtubule-active drug-induced Bcl-2 phosphorylation and cytotoxicity in autonomous cancer cells // Cancer Res. 2000. - V. 60. - P. 3425-3428.

29. Blajeski A. L., Kottke T. J., Kaufmann S. H. A multistep model for paclitaxel-induced apoptosis in human breast cancer cell lines // Exp. Cell Res. 2001. -V. 27.-P. 537-545.

30. Blower P. E., Yang C., Fligner M. A., Verducci J. S., Yu L., Richman S., Weinstein J. N. Pharmacogenomic analysis: correlating molecular substructure classes with microarray gene expression data // Pharmacogenomics J. 2002. - V. 2(4). - P. 259-271.

31. Braca A., Autore G., De Simome F., Marzocco S., Morelli I., Venturella F. Cytotoxic saponins from Shefflera rotundifolia // Planta Med. 2004. - V. 70(10).-P. 960-966.

32. Brandao M., Lacaille-Dubois M., Teixera M, Wagner H. Triterpene saponins from the roots of Ampelozizyphus amazonicus II Phytochem. -1992.-V. 31.-P. 352-354.

33. Brown Т., Sigurdson E., RogatkoA., Broccoli D. Telomerase inhibition using azidothymidine in the HT-29 colon cancer cell line // Ann. Surg. Oncol. -2003.-V. 10(8).-P. 910-915.

34. Builles N., Bechetoille N., Justin V., Andri V., Barbaro V., Di Iorio E., Auxenfans C., Hulmes D. Development of a hemicornea from human primary cell cultures for pharmacotoxicology testing // Cell Biol. Toxicol. 2007. -V. 23(4). - P. 279-292.

35. Burn F., Hwang P., Torrance C. Disruption of p53 in human cancer cells alters the responses to therapeutic agents // Clin. Invest. 1999. - V. 104. -P. 263-269.

36. Buolamwini J. K. Novel anticancer drug discovery // Currt. Opinion in Chem. Biol. 1999. - V. 3. - P. 500-509.

37. Canduri F, Uchoa H. В., de Azevedo W. F. Molecular models of cyclin-dependent kinase 1 complexed with inhibitors // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - V. 324(2). - P. 661-666.

38. Cichewicz R., Kouse S. Chemistry, biological activity, and chemotherapeutic potential of betulinic acid for the prevention and treatment of cancer and HIV infection // Med. Res. Rev. 2004. - V. 24. - P. 90-108.

39. Chappell J. The genetics and molecular genetics of terpene and sterol origami // Curr. Opin. Plant. Biol. 2002. - V. 5(2). - P. 151-157.

40. Chavali S., Francis Т., Campbell J. An in vitro study of immunomodulatory effects of some saponins // Int. J. Immunopharmacol. 1987. - V. 9(6). - P.675.683.

41. Chin L., Tarn A., Pomerantz J., Wong M., Holash J. Essential role for oncogenic Ras in tumour maintenance // Nature. 1999. - V. 400. - P. 468472.

42. Chistofalli M., Charnsangavej C., Hortobagyi G. N. Angiogenesis modulation in cancer research: novel clinical approaches // Nat. Rev. 2002. -V. 1.-P. 415-426.

43. Chodon D., Ramamurty N., Sakthisekaran D. Preliminary studies on induction of apoptosis by genistein on HepG2 cell line // Toxicol. In Vitro. 2007-V. 21(5). -P. 887-891.

44. Colvin О. M., Friedman H. S., Gamesik M. P., Fenselau C., Hilton J. Role of glutathione in cellular resistance to alkylating agents // Adv. Enzyme Regul. 1993.-V. 33.-P. 19-26.

45. Courtneidge S., Plowman G. D. The discovery and validation of new drug targets in cancer // Current Opinion in Biotech. 1998. - V. 9. - P. 632-636.

46. Crance J., Leveque F., Biziagos E. Studies on the mechanism of action of glycyrrizin against hepatitis A virus replication // Antiviral Res. 1994. - V. 23.-P. 63-76.

47. Cross M. J., Claesson-Welsh L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition // Trends Pharmacol. Sci. 2001. - V. 22. - P. 201-207.

48. Dai Z., Sadee W., Blower P. Chemogenomics of sensitivity and resistance to anticancer drugs // Current Pharmacogenomics. 2007. - V. 5(1). - P. 1119.

49. Dai G., Chan К. K., Liu S. Cellular uptake and intracellular levels of the Bcl-2 antisense G3139 in cultured cells and treated patients with acute myeloid leukemia // Clin. Cancer Res. 2005. - V. 11. - P. 2998-3008.

50. Dargan D., Aitken J., Subak-Sharpe J. The effect of triterpenoid compounds on uninfected and herpes simplex virus-infected cells in culture. III.

51. Ultrastructural study of virion maturation // J. Gen. Virol. 1998. - V. 69(2). -P. 439-444.

52. Darrick S., Pezzuto J. M., Pisha M. Synthesis of betulinie acid derivatives with activity against human melanoma // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. -V. 8.-P. 1707-1712.

53. Dash S., Haque S., Joshi V. et al. HCV-hepatocellular carcinoma: new findings and hope for effective treatment // Microsc. Res. Tech. 2005. - V. 68(3-4).-P. 130-148.

54. Davila J., Rodriguez R. J., Melchert R. В., Acosta D. Predictive value of in vitro model systems in toxicology // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1998. -V. 38.-P. 63-96.

55. Debatin К. M. Activation of apoptosis pathways by anticancer treatment // Toxicol. Lett. 2000. - V. 112. - P. 41-48.

56. Debatin К. M., Krammer P. H. Death receptors in chemotherapy and cancer // Oncogene. 2004. - V. 23. - P. 295-266.

57. Diomede L., Piovani В., Re F. et al. The induction of apoptosis is a common feature of cytotoxic action of ether-linked glycero-phospholipids in human leukemia cells // Int. J. Cancer. 1994. - V. 57. - P. 645-649.

58. Dhiman R. K., Chawla Y. K. Herbal medicines for liver diseases // Dig. Dis. Sci. -2005. V. 50(10). - P.1807-1812.

59. Dhiman H. K., Ray A. R., Panda A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen // Biomaterials. 2005. - V. 26(9). - P. 979-986.

60. Dredge К. AE-941 (AEterna) // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2004. - V. 5(6). - P. 668-677.

61. Duss S., Andre S., Nicoulaz A. L., Fiche M., Bonnefoi H., Brisken C., Iggo R. An estrogen-dependent model of breast cancer created by transformation of normal human mammary epithelial cells // Breast Cancer Res. 2007. - V. 9(3). - P. 38

62. Eickbush Т. H. Telomerase and retrotransposons: which came first? // Science. 1997. - V. 277(5328). - P. 955-959.

63. Einbond L,, Su T, Wu H., Friedman R., Wang X., Jiang B. Gene expression analysis of the mechanisms whereby black cohosh inhibits human breast cancer cell growth // Anticancer Res. 2007. - V. 27(2). P. 697-712.

64. Eiznhamer D. A, Xu Z. Q. Betulinic acid: a promising anticancer candidate // I. Drugs 2004. - V. 7(4). - P. 359-373.

65. Ehrhardt H., Fulda S., Fuhrer M., Debatin К. M., Jeremias I. Betulinic acid-induced apoptosis in leukemia cells // Leukemia. 2004. - V. 18(8). - P. 1406-1412.

66. Ellis L. M. Tumor angiogenesis // Horizons in Cancer Res. 2002. - V. 3. -P. 4-22.

67. Essaady D., Simon A., Oilier M., Maurizis J. C., Chulia A., Delage C. Inhibitory effect of ursolic acid on B16 proliferation through cell cycle arrest // Cancer Lett. 1996. - V. 106(2). - P. 193-197.

68. Fernandez M., Heras В., Garcia M., Saenz M., Villar A. New insights into the mechanism of action of the anti-inflammatory triterpene lupeol // J. Pharm. Pharmacol.-2001.-V. 53(11).-P. 1533-1539.

69. Floyd E., McShane T. Development and use of biomarkers in oncology drug development toxicologic //Toxicol. Pathol. 2004. - V. 1. - P. 106-115.

70. Freshney R. I. Culture of animal cells, a practical approach. Oxford. "IRL Press Limited". - 1989. - P. 277.

71. Fridman J. S., Lowe S. W. Control of apoptosis by p53 // Oncogene. 2003. -V. 22.-P. 9030-9040.

72. Fulda S., Debatin К. M. Betulinic acid induces apoptosis through a direct effect on mitochondria in neuroectodermal tumors // Med. Periatr. Oncol. -2000. V. 35(6). - P. 616-618.

73. Fulda S., Friesen C., Los M„ Scaffidi C. Betulinic acid triggers CD95 (APO-1/Fas) and p53-independent apoptosis via activation of caspases inneuroectodermal tumors // Cancer Res. 1997. - V. 57. - P. 4956-4964.

74. Fulda S., Jeremias I., Steiner H. H., Pietsch Т., Debatin К. M. Betulinic acid: a new cytotoxic agent against malignant brain-tumor cells // Int. J. Cancer. -1999.-V. 82(3).-P. 435-441.

75. Furuhashi L, Iwata S., Shibata S., Sato Т., Inoue H. Inhibition by licochalcone A, a novel flavonoid isolated from liquorice root, of IL-1 beta-induced PGE2 production in human skin fibroblasts // J. Pharm. Pharmacol.- 2005. V. 57(12). - P. 1661-1666.

76. Gardner C. R. Anticancer drug development based on modulation of the Bcl-2 family core apoptosis mechanism // Expert. Rev. Anticancer Ther. 2004.- V. 4(6).-P. 1157-1177.

77. Gilardini Montani M.S., Tuosto L., Giliberti R. Dexamethasone induces apoptosis in human T cell clones expressing low levels of Bcl-2 avoid an excess of immune response. // Cell Death and Differentiation. 1999. - V. 6. -P. 79-86.

78. GranaX., Reddy E. P. Cell cycle control in mammalian cells: role of cyclins, cyclin dependent kinases (CDKs), growth suppressor genes and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs) // Oncogene. 1999. - V. 11. - P. 211219.

79. Gus C., Sautos В., Ror A., Lit G., Rusal M. Current therapeutic progress in oncology: the development of targeted therapies // Rev. Med. Liege. 2007. -V. 62.-P. 391-398.

80. Gutierrez F., Estevez-Braun A., Ravelo A.G., Astudillo L., Zarate R. Terpenoids from the medicinal plant Maytenus ilicifolia // J. Nat. Prod. -2007. V. 70(6). - P. 1049-1052.

81. Hakem R., Накет A., Duncan G. S., Henderson J. 71, Woo M., Soengas M. S. Differential requirement for caspase 9 in apoptotic pathways in vivo // Cell. -1998.-V. 94.-P. 339-352.

82. Hanahan D., Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis // Cell. 1996. - V. 86. - P. 353364.

83. Нао X., Du M., Bishop A. Talbot I. C. Imbalance between proliferation and apoptosis in the development of colorectal carcinoma // Virchows Arch. -1998.-V. 433.-P. 523-527.

84. Hata H., Kuramoto H., Immunocytochemical determination of estrogen and progesterone receptors in human endometrial adenocarcinoma cells // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1992. - V. 42(2). - P. 201-210.

85. Hata K., Hori K., Takahashi S. Differentiation- and apoptosis-inducing activities by pentacyclic triterpenes on a mouse melanoma cell line // J. Nat. Prod. 2002. - V. 65(5). - P. 645-648.

86. Helder M. N., Jong S., Vries E. G., Zee A. G. Telomerase targeting in cancer treatment: new developments // Drug Resist. Update. 1999. - V. 2. - P. 104-115.

87. Herbert В., Pitts A., Baker S. I., Hamilton S. E„ Wright W. E. Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - V. 96. - P. 14276-14281.

88. Herold A., Cremer L., Calugaru A., Tamas V., Ionescu F., Manea S., Szegli G. Hydroalcoholic plant extracts with anti-inflammatory activity // Roum.

89. Arch. Microbiol. Immunol. 2003. - V. 62(1-2). - P. 117-129.

90. Hibasami H., Iwase H., Yoshikota K. Glycyrrhizin induces apoptosis in human stomach cancer KATO III and human promyelotic leukemia HL-60 cells // Int. J. Mol. Med. 2005. - V. 16(2). - P. 233-236.

91. Hibasami K, Komiya Т., Achiwa Y. Induction of apoptosis in human stomach cancer cells by green tea catechins // Oncol. Rep. 1998. - V. 5. -P. 527-529.

92. Ho Y. S., Tsai P. W, Yu C. F., Liu H. L„ Chen R. J., Lin, J.K. Ketoconazole-induced apoptosis through p53-dependent pathway in human colorectal and hepatocellular carcinoma cell lines // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1998. - V. 153.-P. 39-47.

93. Holbeck S. L. Update on NCI in vitro drug screen utilities // Eur. J. Cancer. -2004. V. 40(6). - P. 785-793.

94. Hugh J. M., Gabriel G. A. Molecules in focus Bax. The pro-apoptotic Bcl-2 family member, Bax // Int. J. Biochem. Cell Biology. 1998. - V. 30. - P. 647-650.

95. Яш С. H, ShenL. R., Zhao Y. Y, Liang H. Chemical constituents of plants from the genus Symplocos // Chem. Biodivers. 2007. - V. 4(1). - P. 1-11.

96. Ishiwata S., Nakashita K., Ozawa Y, Niizeki H., Nozaki S. Fas-mediated apoptosis is enhaneced by glycyrrhizin without alteration of caspase-3-like activity // Biol. Pharm. Bull. 1995. - V. 22(11). - P. 1163-1166.

97. Ji Z. N. Ye W. C„ Liu G. G., Hsiao W. L. 23-Hydroxybetulinic acid-mediated apoptosis is accompanied by decreases in bcl-2 expression and telomerase activity in HL-60 cells // Life Science. 2002. - V. 72(1). - P. 19.

98. Jin Z., El-Deiry W. S. Overview of cell death signaling pathways // Cancer Biol. Ther. -2005. V. 4. - P. 139-163.

99. Jung G. D., Yang J. Y., Song E. S., Par J. W. Stimulation of melanogenesis by glycyrrhizin in B16 melanoma cells // Exp. Mol. Med. 2001. - V. 33(3).- P.131-135.

100. Kawamoto K. Flow cytometric analysis, mechanism of action and evaluation of viability by antineoplastic agents // Nippon. Rinsho. 1992. - V. 50(10).- P. 2360-2367.

101. Kent L. L., Hull-Campbell N. E., Lau Т., WuJ. C., Thompson S. A., Nori M. Characterization of novel inhibitors of cyclin-dependent kinases I I Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - V. 260(3). - P. 768-774.

102. Kersten G., Crommelin D. Liposomes and ISCOMS as vaccine formulations //Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V. 1241(2).-P. 117-138.

103. Kim J. В., Stein R., O'Hare M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer a review // Breast Cancer Res. Treat. - 2004. - V.85.-P. 281-291.

104. WA.Kim J. Y., Koo H. M., Kim D. S. Development of C-20 modified betulinic acid derivatives as antitumor agents I I Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. - V. 11(17).-P. 2405-2408.

105. Kitagawa K., Nishino H., Iwashima A. Inhibition of the specific binding of 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate to mouse epidermal membrane fractions by glycyrrhetic acid // Oncology. 1986. - V. 43(2). - P.127-130.

106. Khajuria A., Gupta A., Garai S., Wakhloo B. P. Immunomodulatory effects of two sapogenins 1 and 2 isolated from Luffa cylindrica in Balb/C mice // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007. - V. 17(6). - P. 1608-12.

107. Klastersky J. Adverse effects of the humanized antibodies used as cancer therapeutics I I Curr. Opin. Oncol. 2006. - V. 18(4). - P. 316-320.

108. Known J. K., Shim J. S., Kim J. Я, Cho H. Y., Yum Y. N. Betulinic acid inhibits growth factor-induced in vitro angiogenesis via the modulation of mitochondrial function in endothelial cells // Jap. J. Cancer Res. 2002. - V. 93.-P. 417-425.

109. YlX.Konoshima Т., Takasaki M., Kozuka M. Studies on ihibitors of skin-tumor promotion // J. Nat. Prod. 1987. - V. 50(6). - P. 1167-1170.

110. Lanzi C., Cassinelli G., Cuccuru G., Supino R., Zuco V., Ferlini C., Scambia G., Zunino F. Cell cycle checkpoint efficiency and cellular response to paclitaxel in prostate cancer cells // Prostate. 2001. - V. 48(4). - P.254-264.

111. Larsen R. D., Schonau A., Thisted M., Petersen К. H. Detection of gamma-globin mRNA in fetal nucleated red blood cells by PNA fluorescence in situ hybridization // Prenat. Diagn. 2003. - V. 23. - P.52-59.

112. Lee G. Y., Kenny P. A., Lee E. H., Bissell M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells // Nat. Methods. -2007. V. 4(4). - P. 359-365.

113. Lehrman S. Virus treatment questioned after gene therapy death // Nature. -1999.-V. 401(6753).-P. 517-518.

114. Li Z. L„ YangB. Z, LiX., WangS. J., Li N., Wang Y. Triterpenoids from the husks of Xanthoceras sorbifolia Bunge // J. Asian Nat. Prod. Res. 2006. -V. 8(4).-P. 361-366.

115. Liu W. К., Ho J. C., Cheung F. W., Liu B. P., Ye W. C., Che C. N. Apoptotic activity of betulinic acid derivatives on murine melanoma B16 cell line // Eur. J. Pharmacol. 2004. - V. 498(1-3). - P. 71-78.

116. Luo R. J., Chen J. W, Quan Z. L., Li C., Liang J. K. Effects of Ilexonin A on circulatory neuroregulation // Adv. Exp. Med. Biol. 1995. - V. 363. - P. 143-154.

117. Masson V. Roles of serine proteases and matrix metalloproteinases in tumor invasion and angiogenesis // Bull. Mem. Acad. R. Med. Belg. 2006. - V. 161(5).-P. 320-326.

118. Matysiak M., Jurewicz A., Jaskolski D., Selmaj K. TRAIL induces death of human oligodendrocytes isolated from adult brain // Brain. 2002. - V. 125(11)-P. 2469-2480.

119. Mehta J. P., O'Driscoll L., Barron N., Clynes M, Doolan P. A microarray approach to translational medicine in breast cancer: how representative are cell line models of clinical conditions? // Anticancer Res. 2007. - V. 27(3A).-P. 1295-1300.

120. Melzig M. F„ Bormann H. Betulinic acid inhibits aminopeptidase N activity // Planta Med. 1998. - V. 64. - P. 655-657.

121. Mis aw a M., Tauchi Т., Sashida G., Nakajima A., Abe K., Ohyashiki J. H., Ohyashiki K. Inhibition of human telomerase enhances the effect of chemotherapeutic agents in lung cancer cells // Int. J. Oncol. 2002. - V. 21(5).-P. 1087-1092.

122. Mizushina Y., Iida A., Ohta K., Sugawara F., Sakaguchi K. Novel triterpenoids inhibit both DNA polymerase and DNA topoisomerase //

123. Biochem. J. 2000. - V. 350(3). - P. 757-763.

124. Mukherjee R., Kumar V., Srivastava S. K., Agarwal S. K., Burman A. Betulinic acid derivatives as anticancer agents: structure activity relationship // Anticancer Agents Med. Chem. 2006. - V. 6. - P. 271-279.

125. Mateyak M. K., Obaya A. J., Sedivy J. M. c-Myc regulates cyclin D-Cdk4 and -Cdk6 activity but affects cell cycle progression at multiple independent points // Mol. Cell Biol. 1999. - V. 19(7). - P. 4672-4683.

126. Mo Y., Gan Y., Song S., Johnston J., Xiao X., Wientjes M. G. Simultaneous targeting of telomeres and telomerase as a cancer therapeutic approach // Cancer Res. 2003. - V. 63(3). - P. 579-585.

127. Mo Y., Gan Y., Song S., Johnston J., Xiao X, Wientjes M. G., Au J. L. Simultaneous targeting of telomeres and telomerase as a cancer therapeutic approach // Cancer Res. 2005. - V. 65(4). - P. 1489-1496.

128. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods. -1983.-V. 16(65).-P. 55-63.

129. Nagarajan S., Mohan Rao L. Triterpenoids from swallow roots a convenient HPLC method for separation // J. Chromatogr. Sci. - 2007. - V. 45(4).-P. 189-194.

130. Neuveut C„ Jeang К. T. HTLV-I Tax and cell cycle progression. // Prog. Cell Cycle Res. -2000. V. 4.-P. 157-162.

131. Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C., Grignani F. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J. Immunol. Methods. 1991. - V. 139(2). - P. 271-279.

132. Panvichian R., Orth K., Pilat M. J., Day M. L, Day К. С., Yee C. Signaling network of paclitaxel-induced apoptosis in the LNCaP prostate cancer cell line // Urology. 1999. - V. 54(4). - P. 746-752.

133. Pendino F., Tarkanyi I., Dudognon C., Hillion J., Lanotte M., Aradi J., Segal-Bendirdjian E. Telomeres and telomerase: Pharmacological targets for new anticancer strategies // Curr. Cancer Drug Targets. 2006. - V. 6(2). -P. 147-180.

134. Pengsuparp Т., Cai L., Constant H., Fong H. H., Lin L. Z., Kinghorn A. D., Pezzuto J. M. Mechanistic evaluation of new plant-derived compounds that inhibit HIV-1 reverse transcriptase // J. Nat. Prod. 1995. - V. 58(7). - P. 1024-1031.

135. Pines J., Rieder C. L. Re-staging mitosis: a contemporary view of mitotic progression // Nat. Cell Biol. 2001. - V. 3(1). - P. 3-6.

136. Pis ha E., Chai H., Lee I. S., Chagwedera Т. E. Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis//Nat. Med.- 1995.-V. l.-P. 1046-1051.

137. PoonK., Zhang J., Wang C, Tse A. K., Wan С. K., Fong W. F. Betulinic acid enhances 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3-induced differentiation in human HL-60 promyelocyte leukemia cells // Anticancer Drugs. 2004. - V. 15(6). -P. 619-624.

138. Qian L., Murakami Т., Kimura Y., Takahashi M., Okita K. Saikosaponin Ainduced cell death of a human hepatoma cell line (HuH-7): the significance of the 'sub-Gl peak' in a DNA histogram // Pathol. Int. 1995. - V. 45(3). -P. 207-214.

139. Reed J. C., Pellecchia M. Apoptosis-based therapies for hematologic malignancies // Blood. 2005. - V. 106. - P. 408-418.

140. O'Reilly M., Teichmann S., Rhodes D. Telomerases // Curr. Opin. Struct. Biology. 1999. - V. 9. P. 56-65.

141. Rege T. A., Fears C. Y., Gladson C. L. Endogenous inhibitors of angiogenesis in malignant gliomas: nature's antiangiogenic therapy // Neuro. Oncol.-2005.-V. 7(2).-P. 106-121.

142. Ribrag V, Massade L, Faussat AM, Dreyfus F, Bayle C, Gouyette A, Marie JP. Drug resistance mechanisms in chronic lymphocytic leukemia // Leukemia. 1996. - V. 10(12). - P. 1944-1949.

143. Riccardi C., Nicoletti I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // Nat. Protoc. 2006. - V. 1(3). - P. 1458-1461.

144. Richter M, Zhang H. Receptor-targeted cancer therapy // DNA Cell Biol. -2005. V. 24(5). - P. 271-282.

145. Ross D. Т., Perou С. M. A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines // Dis. Markers. 2001. -V. 17.-P. 99-109.

146. Rossi Т., Benassi L., Magnoni C., Ruberto A.I., Coppi A., Baggio G. Effects of glycyrrhizin on UVB-irradiated melanoma cells // In Vivo. 2005. - V. 19(1).-P. 319-322.

147. Human Gene Ther. 1996. - V. 7. - P. 861-874.

148. Row insky E. K., Donehower R. C., Jones R. J., Tucker R. W. Microtubule changes and cytotoxicity in leukemic cell lines treated with taxol // Cancer Res. 1988. - V. 48(14). - P. 4093-4100.

149. Sarkar F. H., Adsule S., Padhye S., Kulkarni S., Li Y. The role of genistein and synthetic derivatives of isoflavone in cancer prevention and therapy // Mini Rev. Med. Chem. 2006. - V. 6(4)! - P. 401-407.

150. Salomon D. S., Brandt R„ Ciardiello F., Normanno N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1995. - V. 19. - P. 183-232.

151. Satyamoorthy K., DeJesus E., Linnenbach A. J., Kraj В., Kornreich D. L.,

152. Sawada N., Kataoka K., Kondo K., Arimochi H, Fujino H Betulinic acid augments the inhibitory effects of vincristine on growth and lung metastasis of B16F10 melanoma cells in mice // Br. J. Cancer. 2004. - V. 90(8). - P. 1672-1678.

153. Schulze W. X., Deng L., Mann M. Phosphotyrosine interactome of the ErbB-receptor kinase family // Mol. Syst. Biol. 2005. - V. 1. - P. 205-208.

154. Schulze-Bergkamen H., Krammer P. H. Apoptosis in cancer implications for therapy // Semin. Oncol. - 2004. - V. 31. - P. 90-119.

155. Schwartz G. K., Shah M. A. Targeting the cell cycle: a new approach to cancer therapy // J. Clin. Oncol. 2005. - V. 23(36). - P. 9408-9421.

156. Segal E., Friedman N., Kaminski N., Regev A., Koller D. From signatures to models: understanding cancer using microarrays // Nat. Genet. 2005. - V. 10.-P. 38-45.

157. Selzer E., Pimentel E., Wacheck V., Schlegel W., Pehamberger H., Jansen B. Effects of betulinic acid alone and in combination with irradiation in human melanoma cells // J. Invest. Dermatol. 2000. - V. 114(5). - P. 935-940.

158. Selzer E., Thallinger C., Hoeller C., Oberkleiner P., Wacheck V., Pehamberger H, Jansen B. Betulinic acid-induced Mcl-1 expression in human melanoma-mode of action and functional significance // Mol. Med. -2002. V. 8(12). - P. 877-884.

159. Setzer W. N., Setzer M. C. Plant-derived triterpenoids as potential antineoplastic agents // Mini Rev. Med. Chem. 2003. - V. 3. - P. 540-558.

160. Shay J. W., Bacchetti S. A. Survey of telomerase activity inhuman cancer //

161. Eur. J. Cancer. 1997. - V. 33. - P. 787-791.

162. Shapiro G. I., Harper J. W. Anticancer drug targets: cell cycle and checkpoint control // J. Clin. Invest. 1999. - V. 104. - P. 1645-1653.

163. Shibata S. A drug over the millennia: pharmacognosy, chemistry, and pharmacology of licorice // Yakugaku Zasshi. 2000. - V. 120(10). - P. 849-862.

164. Schimdt M. L., Kuzmanoff K. L., Ling-Indeck L., Pezzuto J. M. Betulinic acid induces apoptosis in human neuroblastoma call lines // Eur. J. Cancer. -1997.-V. 33.-P. 2007-2010.

165. Shiota G., Harada K., Ishida M., Tomie Y., Okubo M., Katayama S. Inhibotion of hepatocellular carcinoma by glycyrrhizin in diethylnitrosamin-treated mice // Carcinogenesis. 1999. - V. 20(1). - P. 59-63.

166. Sklar L. A., Carter M. В., Edwards B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening // Curr. Opin. Pharmacol. 2007. V. 7(4). - P. 395-403.

167. Sutherland R. L., Musgrove E. A. Cyclin D1 and mammary carcinoma: New insights from transgenic mouse models // Breast Cancer Res. 2002. - V. 4. -P. 14-17.

168. Suzuki F., Schmitt D. A., Utsunomiya Т., Pollard R. B. Stimulation of host resistance against tumors by glycyrrhizin, an active component of licorice roots // In Vivo. 1992. - V. 6(6). - P. 589-596.

169. Sweet L. I., Passino-Reader D. R., Metier P. G., Omann G. M. Xenobiotic-induced apoptosis: significance and potential application as a general biomarker of response // Biomarkers. 1999. - V. 4. - P. 237-253.

170. Taga Т., Suzuki A., Gonzalez-Gomez I., Gilles F. H., Stins M., Shimada H, alpha v-Integrin antagonist EMD 121974 induces apoptosis in brain tumor cells growing on vitronectin and tenascin // Int. J. Cancer. 2002. - V. 98(5). - P. 690-697.

171. Takara K., Obata Y., Yoshikawa E., Kitada N., Sakaeda T. Molecular changes to IleLa cells on continuous exposure to cisplatin or paclitaxel // Cancer Chemother. Pharmacol. 2006. - V. 58(6). - P. 785-793.

172. Takeda K., Stagg J., Yagita H., Okumura K., Smyth M. J. Targeting death-inducing receptors in cancer therapy // Oncogene. 2007. - V. 26(25). - P. 3745-3757.

173. Tan Y, Yu R., Pezzuto J. M. Betulinic acid-induced programmed cell death in human melanoma cells involves mitogen-activated protein kinase activation // Clin. Cancer Res. 2003. V. 9(7). - P. 2866-2875.

174. Tanaka M., Mano N. Inhibition of mutagenicity by glycyrrhiza extract and glycyrrhizin // J. Pharmacobiodyn. 1987. - V. 10(12). - P. 685-688.

175. Tohda С., Tamura Т., Matsuyama S„ Komatsu K. Promotion of axonal maturation and prevention of memory loss in mice by extracts of Astragalus mongholicus //Br. J. Pharmacol. -2006. V. 149(5). P. 532-541.

176. Urech K., Scher J., Hostanska K., Becker H. Apoptosis inducing activity of viscin, a lipophilic extract from Viscum album L // J. Pharm. Pharmacol. -2005.-V. 57(1).-P. 101-109.

177. Vinyals A., Peinado M., Gonzalez-Garrigues M. Failure of wild-type p53gene therapy in human cancer cells expressing a mutant p53 protein // Gene Therapy. 1999. - V. 6. - P. 22-33.

178. Vries E. G., Timmer Т., Mulder N. H., Geelen С. M., Graaf W Т., Spierings D. C. Modulation of death receptor pathways in oncology // Drugs Today (Bare). 2003. -V. 39. - P. 95-109.

179. Wajant H., Gerspach J., Pfizenmaier K. Tumor therapeutics by design: targeting and activation of death receptors // Cytokine Growth Factor Rev. -2005.-V. 16.-P. 55-76.

180. Wan X., Takahashi S., Niwa K. The 5'-end of hTERT mRNA is a good target for hammerhead ribozyme to suppress telomerase activity // Biochem. Biophys. Res.-2001.-V. 61. P. 3053-3061.

181. Wanibuchi H., Wei M., Salim E. I., Kinoshita A., Morimura K. Inhibition of rat urinary bladder carcinogenesis by the antiangiogenic drug TNP-470 // Рас. J. Cancer Prev. 2006. - V. 7(1). - P. 101-107.

182. Wang Z. Y., Nixon D. W. Licorice and cancer // Nutr. Cancer. 2001. - V. 39(1).-P. 1-11.

183. Wang J. L., Zhang Z. J., Choksi S., Shan S., Lu Z., Croce С. M. Cell permeable Bcl-2 binding peptides: a chemical approach to apoptosis induction in tumor cells // Cancer Res. 2000. - V. 60(6). - P. 1498-502.

184. Walczak Я, Miller R. E., Ariail K., Gliniak В., Griffith T. S., Kubin M., Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo // Nat. Med. 1999. - V. 5(2). - P. 146-147.

185. Walter-Yohrling J., Morgenbesser S., Rouleau C., Bagley R., Callahan M., Weber W., Teicher B. A. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells // Clin. Cancer Res. 2004. - V. 10(6). - P. 2179-2189.

186. Watson M. В., bind M. J., Cawbvell L. Establishment of in vitro models of chemotherapy resistance // Anticancer Drugs. 2007. - V. 18. - P. 749-754.

187. Williams M. E., Densmore J. J. Biology and therapy of mantle cell lymphoma // Curr. Opin. Oncol. 2005. - V. 17. - P. 425-431.

188. Wilson J. K., Sargent J. M., Elgie A. W., Hill J. G., Taylor C. G. A feasibility study of the MTT assay for chemosensitivity testing in ovarian malignancy I I Br. J. Cancer. 1990. -V. 62(2). - P. 189-194.

189. Wong H., Anderson W. D., Cheng Т., Riabowol К. T. Monitoring mRNA expression by polymerase chain reaction: the "primer-dropping" method // Anal. Biochem. 1994. - V. 223(2). - P. 251-258.

190. XiangH., Schevzov G., Gunning P., Williams H. M., SilinkM. A comparative study of growth-inhibitory effects of isoflavones and their metabolites on human breast and prostate cancer cell lines // Nutr. Cancer. 2002. - V. 42(2). - P. 224-232.

191. Yamori T. Panel of human cancer cell lines provides valuable database for drug discovery and bioinformatics // Cancer Chem. Pharmacol. 2003. - V. 52. - P. 74-79.

192. Yanagihara K., Ito A., Tuge Т., Numoto M. Antiproliferative effects of isoflavones on human cancer cell lines established from gastrointestinal tract // Cancer Res. 1993. - V. 53. - P. 5815-5821.

193. Yang Y., Chen Y., Zhang C., Huang H., Weissman S. M. Nuclear localization of hTERT protein is associated with telomerase function // Exp. Cell Res. -2002.-V. 277.-P. 201-209.

194. Yasunari Т., Baharat B. A. Betulinic acid suppress carcinogen-induced NF-kB Activation through inhibition of 1кВа kinase and p65 phosphorylation: abrogation of cyclooxygenase-2 and matrix metallopotease-9 // J. Immunol. -2003. V. 171.-P. 3278-3286.

195. Yip M. Т., Chen I. S. Modes of transformation by the human T-cell leukemia viruses // Mol. Biol. Med. 1990. - V. 7(1). - P. 33-44.

196. Yogeeswari P., Sriram D. Betulinic acid and its derivatives: a review on their biological properties // Curr. Med. Chem. 2005. - V. 12(6). - P. 657-666.

197. Yoshikawa M., Matsuda H. Antidiabetogenic activity of oleanolic acid glycosides medicinal foodstuffs // Biofactors. 2000. - V. 13(1). - P. 31-37.

198. Yoshikawa M., Toyhara M., Ueda S., Shiroi A., Takeuchi H., Nishiyama T. Glycyrrhizin inhibits TNF-induced, but not Fas-mediated, apoptosis in human hepatoblastoma line HepG2 I I Biol. Pharm. Bull. 1999. - V. 22(11). -P. 1163-1166.

199. Yoshiki Y., Kudou S., Okubo K. Relationship between chemical structures and biological activities of triterpenoid saponins from soybean // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. - V. 62(12). - P. 2291-2299.

200. You Y J., Kim Y, Nam N. H., Ahn B. Z. Synthesis and cytotoxic activity of A-ring modified betulinic acid devatives // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. - V.13. - P.3137-3140.

201. Yun Y., Han S., Park E., Yim D., Lee С. K. Immunomodulatory activity of betulinic acid by producing proinflammatory cytokines and activation of macrophages // Arch. Pharm. Res. 2003. - V. 26(12). - P. 1087-1095.

202. Zuco V., Supino R., Righetti S. C., Cleris L., Marchesi E., Gambacorti-Passerini C. Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells // Cancer Lett. 2002. - V. 175(1). - P.17-25.1. ОТ АВТОРА

Информация о работе

Шинтяпина, Александра Борисовна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Исследование цитотоксической активности и механизмов действия производных бетулина и глицирризиновой кислоты в опухолевых клетках в культуре - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы