Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизмов АНТИ-ВИЧ активности производных высших тритерпенов и хинонов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов АНТИ-ВИЧ активности производных высших тритерпенов и хинонов"

На правахрукописи

Ильина Татьяна Валерьевна

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ АНТИ-ВИЧ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ВЫСШИХ ТРИТЕРПЕНОВ И ХИНОНОВ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Покровский А. Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Загребельный С.Н. кандидат биологических наук Евдокимов А А.

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Защита состоится 14 мая 2004 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздрава РФ по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559 (тел. 3832-367428).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Автореферат разослан апреля 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы появляется все больше публикаций, посвященных изучению противовирусной активности соединений природного происхождения. Особое место занимают исследования веществ тритерпеновой природы, обладающих широким спектром биологической активности. К ним относится глицирризиновая кислота (ПС), активный компонент корня солодки и бетулиновая кислота, выделяемая из коры платана и березы. ПС ингибирует репродукцию многих ДНК и РНК содержащих вирусов - осповакцины, герпеса, ВИЧ-Г и некоторых других. Бетулиновая кислота ингибирует ВИЧ-1 в культуре клеток.

Однако, несмотря на большое количество данных о противовирусной активности ПС и ее производных, на настоящий момент мы очень мало знаем о механизмах ее действия в клетке. Есть данные о ингибировании ПС различных киназ, в частности, казеин киназы 2 (участвует в фосфорилировании обратной транскриптазы ВИЧ-1, тем самым повышая ее активность) и протеин киназы С, которая фосфорюшрует рецептор CD4 на поверхности Т-лимфоцитов, необходимый для связывания вируса с клеткой. С другой стороны, есть данные, что некоторые природные тритерпены, выделенные из растений Shizandra sphaerandra, Maprounea africana и других, могут служить ингибиторами обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ-1, ключевого фермента жизненного цикла вируса, необходимого на ранних стадиях заражения клетки.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение молекулярных механизмов анти-ВИЧ активности глицирризиновой кислоты и ее производных, в том числе способность этих соединений ингибировать рекомбинантную ОТ ВИЧ-1. Также нашей целью являлось исследование ингибирующей активности в отношении ОТ ВИЧ-1 ряда производных бетулина, другого природного тритерпена, и новых

синтетических производных хинонов. Для определения возможных мишеней действия ГК в клетке мы воспользовались технологией фагового дисплея.

Таким образом, перед настоящим исследованием стояли следующие задачи:

1) проверить ингибирующую активность ГК и ее производных в отношении рекомбинантной ОТ ВИЧ-1 и ее мутантных форм, несущих аминокислотные замены, обусловливающие устойчивость к АЗТ;

2) выяснить характер взаимодействия ГК и ее производных с АЗТ и невирапином при совместном ингибировании;

3) проверить ингибирующую активность бетулина и его производных в отношении рекомбинантной ОТ ВИЧ-1 и АЗТ-устойчивых форм ОТ;

4) исследовать ингибирующую активность ряда производных хинонов в отношении ОТ В ИЧ -1;

5) применив метод фагового дисплея, описать возможные мишени противовирусного действия ПС

Научная новизна и практическая значимость. В данной работе была исследована ингибирующая активность соединений различной химической природы в отношении рекомбинантной ОТ ВИЧ-1. Было показано, что производные ГК эффективно ингибируют ОТ по неконкурентному типу. Сама ГК также ингибирует ОТ, хотя и в более высоких концентрациях; чем ее производные. При совместном ингибировании ОТ ГК и азидотимидин-трифосфатом наблюдается синергический эффект.

Наиболее эффективным ингибитором ОТ среди всех производных ГК оказался пента-0-никотинат ГК, который не только подавлял активность ОТ дикого типа в более низких концентрациях, чем другие производные ГК, но и эффективно ингибировал мутантные формы ОТ, несущие аминокислотные замены, обусловливающие устойчивость к АЗТ. Ингибирование ОТ пента-О-никотинатом ГК и невирапином выявило взаимонезависимый характер их совместного действия. Также было исследовано совместное действие пента-О-никотината ГК и-азидотимидин-трифосфата на ОТ ВИЧ-1. Полученные

результаты говорят о перспективности такой комбинации, так как действие двух этих ингибиторов на ОТ независимо и аддитивно. В*Ье эти данные полностью подтверждаются результатами, полученными на культуре инфицированных ВИЧ клеток.

Проведенные нами исследования арилзамещеных антра- и нафтохинонов показали, что эти производные являются ингибиторами обратной транскритазы ВИЧ-1, причем часть соединений подавляла активность как фермента дикого типа, так и его форм, содержащих мутации, определяющие устойчивость к азидотимидину. При совместном ингибировании ОТ исследованными производными и невирапином было показано, что данные соединения действуют независимо, вполне вероятно, что центр связывания хинонов с обратной транскриптазой отличается от описанного для невирапина.

Воспользовавшись технологией фагового дисплея, мы попытались изучить возможные сайты, связывания для глицирризиновой кислоты. Этот метод был впервые применен для поиска белков-мишеней для соединений тритерпенового ряда. Выявлено наличие гомологии отобранных пептидов с вирусными белками, в частности, с поверхностными гликопротеидами gpl20, gp41 и с ферментами ВИЧ-1 - обратной транскриптазой и интегразой.

Апробация работы и публикации. Материалы исследований по теме диссертации изложены на следующих российских и международных конференциях: FEBS Forum of Young Scientists, 2003, Brussels, Belgium; Xllth International Congress of Virology, The World of Microbes, 2002, Paris, France; «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 2002, Новосибирск, Россия; «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы», 2001, С-Петербург, Россия и др. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, оформлен 1 патент и тезисы 9 докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из семи разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа

изложена на 117 страницах машинописного текста и включает 33 рисунка, 19 таблиц и список литературы, состоящий из 197 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Характеризация использовавшихся в работе вариантов обратных транскриптаз. Работа проводилась с использованием четырех форм обратных транскриптаз - ОТ дикого типа, ОТ с заменой Asp67-*Asn, ОТ с заменой

и мутантной ОТ с тремя заменами Thr215—>Phe. Характеристики полученных форм ОТ представлены в таблицах 1. Большинство кинетических исследований ОТ проводится с использованием дуплекса поли (гА)-олиго (dT) в качестве матрицы-праймера, поэтому он были выбраны для данной работы. Такой подход позволяет быстро оценить, оказывают ли препараты ингибирующий эффект на обратную транскриптазу.

Таблица 1. Значения Км для ТТР, kc«, kcat/KM, и величины к^/К« относительно ОТ дикого тала.

ОТВИЧ-1 ... К„ (для ТТР), мкМ kcat 1 С bat Жщ мкЛГ^с1 кси/Км, отн. ед.

дг 1,24±0,11 2,81±0,15 2,26 1

М(215) 1,47±0,08 2,40±0,22 1,63 0,7

М(67) 8,03±0,22 1,95±0,15 0,24 0,1

М(67,70,215) 12,01±0,26 1,52±0,12 0,12 0,05

2. Исследование ингибирующей активности ПС и ее производных в отношении обратной транскриптазы ВИЧ-1.

Поскольку в литературе упоминается о тритерпенах, обладающих ингибирующей активностью в отношении ОТ, нам представлялось интересным проверить, может ли глицирризиновая кислота или ее производные также обладать такой активностью. Это позволило бы расширить знания о молекулярных механизмах анти-ВИЧ активности ПС.

Для этого исследования были выбраны: ГК (1а), ее аммонийная соль (глицерам) (16), пента-О-никотинат ГК (пента-О-никотинат ГК) (1в) и агликон ГК - глицирретовая кислота (1г), а также два ее аминокислотных производных (1д, 1е) (Схема). В таблице 2 приведены концентрации исследованных соединений, блокирующих обратную транскрипцию, катализируемую ОТ дикого типа на 50% (15о). Из данных, приведенных в таблице видно, что среди всех производных ГК наиболее эффективным ингибитором ОТ является пента-О-никотинат ГК (1в). Также высокую ингибирующую1 способность показали аминокислотные производные глицирретовой кислоты.

Таблица 2. Величины !ю исследуемых соединений для ОТ ДТ.

Глицирретовая кислота (1г) и глицирам (16) тоже довольно активные ингибиторы' хотя ингибируют ОТ в более высоких концентрациях. Как оказалось, ГК (1а) тоже оказывает действие на ОТ, хотя и самое слабое в этом ряду исследованных соединений; Тем не менее, т.к. ранее не было данных, что ПС может ингибировать ОТ ВИЧ-1, эти результаты оказались достаточно интересными.

Для дальнейшего исследования взаимодействия с ОТ были выбраны глицирретовая кислота и ее производные, а также пента-О-никотинат ГК. В таблице 3 приведены константы ингибирования данных соединений для различных форм ОТ. Полученные результаты показали, что глицирретовая кислота не ингибировала мутантные формы ОТ. Зато ее аминокислотные производные ингибировали все формы ОТ по неконкурентному типу.

Ингибитор 15о (мкМ)

1а 209,0±22,1

16 60,4±5,3

1в 5,3±0,6

1г 65,2±4,3

1д 21,3±2,4

1е 10,4±1,7

а К!- ОН, Л2=Н, Лз=СН,ОН бВ»Нз«0.1Ь-С00Н в ДОз^о.К- СОНН(ОЕЬ)»СООН гИ^з-О, Ла - СОМН(С1и,СОМНСЫ(РЬ)СН!СООН

К1-К2-Н 00, К,-ОН, К2-Н (е), К |-Н, ИуОСНз (ж)

Я ■ Н (»), ОООЕ1 (б)

ни

Схема. Структурные формулы исследованных соединений.

Таблица 3. Константы ингибирования ОТ и ее мугантных форм для исследованных соединений.

Ингибитор Константы ингибирования ОТ ВИЧ-1, мкМ' Тип ингибирования

дт М(б7) М(215) М(67,70,215)

1в 6,2±0,5 6,8±0,6 4,5±0,3 3,6±0,1 неконкурентаый

1г. 133,¡¿7,5 нет ингибир. нет ингибир. нет ингибир. неконкуревпгный

1д 27,5±3,4 45,1±4,9 47,5±5,1 33,6±3,8 неконкурентный

1е 22,3±2,9 28,5±3,1 32Д±2,9 17,2±2,1 неконкурентный

Таким образом, среди всех производных ПС, пента-О-никотинат ГК -самый активный ингибитор ОТ ВИЧ-1 и ее мугантных форм. Интерес к этому препарату обусловлен еще и тем, что пента-О-никотинат ГК является-эффективным индуктором интерферона-гамма, что может существенно усилить его терапевтический потенциал при лечении ВИЧ-инфекции.

Совместное ингибирование обратной транскриптазы ВИЧ-1 пента-О-никотинатом ГК и азидотимидином. По причине того, что пента-О-никотинат ГК проявил самые высокие ингибирующие свойства в отношении ОТ ВИЧ-1, интересно было изучить также его взаимодействие с азидотимидином и невирашшом при совместном ингибировании. Сначала мы оценили эффективность совместного ингибирования азидотимидин трифос-фатом и пента-0-никотинатом глицирризиновой кислоты. Эти результаты представлены на следующем рисунке, где в виде столбцов показаны данные эффекты ингибирования (Рис. 1).

Для иллюстрации процессов совместного ингибирования удобно воспользоваться изоболами, координатами которых служат равноэффективные концентрации двух реагирующих соединений. Обычно изоболы строят при фиксированном 50% подавлении активности фермента.

На рисунке 2 представлена изоболограмма совместного

ингибирования рекомбинантной обратной транскриптазы ВИЧ-1 дикого типа двумя соединениями - азидотимидин трифосфатом и пента-0-никотинатом ГК. Как показали результаты проведенного исследования, совместное ингибирование ОТ комбинациями пента-О-никотинатом ГК и азидотимидин-трифосфатом эффективно, хотя и не обладает синергическим эффектом. Можно сказать, что в данном случае наблюдается суммация, или аддитивный эффект, те. действие этих соединений на обратную транскриптазу независимо.

Совместное действие пента-О-никотината ГК и невирапина. АЗТ, как аналог нуклеозида, действует на субстрат- связывающий центр, а пента-О-никотинат ГК, как ненуклеозидный ингибитор ОТ, может реагировать с любым другим участком фермента. В связи с зтим? мы исследовали ,. совместное действие пента-О-никотината ГК и невирапина, наиболее известного ненуклеозидного ингибитора ОТ ВИЧ-1, для которого центр связывания в ОТ уже хорошо .изучен и является общим для большинства ненуклеозидных ингибиторов. Нам представлялось интересным выяснить, имеет ли пента-0-никотинат ГК тот же центр связывания, что и невирапин, или же он действует по другому механизму. Для этого мы воспользовались методом определения взаимозависимости действия двух ингибиторов.

Определенное нами значение коэффициента = 0,22 для совместного действия пента-О-никотината ГК и невирапина; указывает на реализацию взаимонезависимого механизма ингибирования этих соединений. Поскольку коэффициент а говорит лишь о взаимонезависимости действия двух ингибиторов, представлялось интересным сравнить ожидаемый эффект действия пента-О-никотината ГК и невирапина с полученным в эксперименте.

На рисунке 3 приведена гистограмма, показывающая; что эффект совместного действия выше в случае более высоких * концентраций невирапина. Это говорит о том, что действие этих двух соединений & случае более низких концентраций аддитивно, а при увеличении эффективной концентрации невирапина те же концентрации пента-О-никотината ПС вызывают синергический эффект.

Также мы воспользовались методом изобол, для подтверждения полученного результата. На рисунке 4 приведена изоболограмма совместного ингибирования данных соединений. Изобола также подтверждает присутствие синергического эффекта, так как кривая сильно вогнута вниз, больше, чем на рис. 2, иллюстрирующем совместное действие АЗТ и пента-О-никотината ГК.

Способность пента-О-никотината ГК эффективно ингибировать ОТ ВИЧ-1 не только с азидотимидином, но и с невирашшом открывает новые возможности его использования в комбинационной терапии ВИЧ-инфекции.

Совместное действие ГК и азидотимидина. Данные о совместном ингибировании, приведенные в предыдущем параграфе показали эффективность комбинации АЗТ и пента-О-никотината ГК. Нам представлялось интересным выяснить, будет ли совместное действие азидотимидина с нативным тритерпеном - глицирризиновой кислотой. По аналогии с методом, описанном выше, мы рассчитали ожидаемый эффект от совместного действия (рис. 5).

В случае использования низких концентраций соединений эффекты для ожидаемого и полученного ингибирования не отличаются, тогда как при более высоких концентрациях азидотимидина и ГК наблюдается усиление ингибирующего эффекта. Следовательно, уже достоверно можно сделать вывод о наличии синергизма в действии ГК и АЗТ. При этом, эффект синергического действия заключается в усилении- «активности» азидотимидина, т.к. ГК в выбранных концентрациях практически не влияет на обратную транскриптазу.

Также мы воспользовались методом изобол для подтверждения полученного результата. Как выяснилось, изобола (рис. 6) имеет еще более вогнутую форму, что говорит о синергическом характере взаимодействия.

Таким образом, характер синергического действия ПС и АЗТ в культуре клеток, описанный ранее, может заключаться в их совместном действии на обратную транскриптазу.

3. Исследование ингибирующей активности бетулина и- его производных.

Для исследования были взяты бетулин (Па), бетулоновая кислота (Пб) и два ее аминокислотных производных (Пв и г) (схема). В таблице 4 приведены константы ингибирования этих соединений для четырех форм ОТ.

Как видно из таблицы, исследованные нами соединения ингибируют обратную транскриптазу ВИЧ-1- и действуют, как неконкурентные ингибиторы. Из полученных экспериментальных данных так же - можно сделать вывод, что введение химических модификаций (пептидных остатков) в структуру тритерпена вызывает существенное усиление его ингибирующих свойств.

Таблица 4. Константы ингибирования для ОТ.

Ингибитор Константы ингибирования ОТ ВИЧ-1, мкМ Тип ингибирования

дт М(67) М(70) М(67,70,215)

На 29,1±4,4 55,2±7,2 40,2±3,8- 55,3±4,6 неконкурентный -

116 59,4±3,7 33,3±3,2 25,7±2,7 • 18,7± 1,9 неконкурентный -

Ив 34,7±2,2 16,1±1,4 8,5±0,7 23,3 ±2,5 неконкурентный

Иг 14,9±1,1 6,8±0,7 9,2±1,1 15,6±1,4 неконкурентный

Как и глицирретовая кислота, которая- ингибирует обратную транскриптазу в более высоких концентрациях, бетулоновая кислота ингибируют ОТ в более высоких концентрациях, чем ее аминокислотные

производные. Максимальную ингибирующую активность показало

соединениеIId.

4. Исследование ингибирующей активности антра- и нафтохинонов.

Целью данной работы являлось исследование ингибирующей активности ряда новых. 4-арилзамещенных антра- и нафтохинонов в отношении рекомбинантной ОТ ВИЧ-1 дикого типа и несущей амнокислотные замены, обусловливающие устойчивость к азидотимидину.

Как показали результаты определения ингибирующей активности исследуемых соединений, приведенные в таблице 5, соединения данной группы тормозят реакцию обратной транскрипции ВИЧ-1, значительно отличаясь между собой по величине констант ингибирования (К,). Из исследованных соединений наибольшую ингибирующую активность на всех формах фермента показали Шг, 111д и 111е. При этом соединения Ша, Шб и 111в не проявили ингибирующей активности в отношении мутантных форм ОТ.

Таблица 5. Константы ингибирования и тип ингибирования для антра- и нафтохинонов.

Ингибитор: Константы ингибирования ОТ ВИЧ-1, мкМ Тип ингибирования

ДГ- М(67) М(215) М(67,70,215)

Ша 46,5±1,9 52,9±3,7 нет ингибир. нет ингибир. ' смешанный

III6 234,5±2,1 нет ингибир. нет ингибир. нет ингибир. неконкурентный

Шв 194,3±9,1 нет ингибир. нет ингибир. нет ингибир. неконкурентный

Шг 45,6±5,3 . 46,9±5,3 42,5±6,3 • 55,6±4,2 . неконкурентный

Щд 75,6±5,8 93,3 ±6,7 104,6±6,4 98,4±5Д... неконкурентный

Ше 25,2±2,1 30,0±1,2 43,7±3,1 32,5±1,7 смешанный

Шж 127,8±4,3 213,4±9,4 234,9±8,4 211,6±7,8 неконкурентный

Часть соединений ингибировали мутантные формы фермента в более высоких концентрациях (111д и Шж), тогда как константы ингибирования для производных Шг и Ше практически не меняются и для АЗТ-устойчивых форм

ОТ. Все препараты, кроме соединений Ша и Ше, ингибнровали обратную транскриптазу по неконкурентному типу, что характерно для ненуклеозидных ингибиторов ОТ. Соединения Ша и Ше показали смешанный тип ингибирования.

С целью определения - возможных центров связывания исследуемых соединений проводился анализ совместного ингибирования ОТ производными хинонов и невирапином, аналогичный, описанному выше, с вычислением коэффициента а.. Определенное нами значение коэффициента а указывает на реализацию взаимонезависимого механизма ингибирования (табл.6). Таким образом, в экспериментах по одновременному ингибироваиию реакции полимеризации обратной транскриптазы дикого типа установлено, что для всех соединений (кроме Шб и Шв) реализуется взаимонезависимый механизм. Следовательно, производные 1,4-нафтохинона и диоксиантрохинона ингибируют обратную транскриптазу по механизму, отличному от действия невирапина.

Таблица 6. Данные по исследованию одновременного ингибирования ОТ ВИЧ-1 двумя ингибиторами (невирапин и исследуемые производные хинонов).

Ингибитор а

Ша 0,30±0,06

1П6 »

Шв *

Шг 0,04±0,008

Н1д 0,22±0,05

Ше 0,17±0,03

Шж 0,50±0,14

* - невозможно определить из-за высокой разности К] невирапина и исследуемого соединения.

5. Поиск сайтов связывания глицирризиновой кислоты методом фагового дисплея.

Для определения возможных сайтов связывания глициризинновой кислоты в клетке была проведена селекция бактериофагов, связывающихся с ПС, из фаговых пептидных библиотек fUse5-15mer и f88-4/15. Связывание фагов с ГК подтверждалось конкурентным вариантом ИФА. После этого проводилось определение первичных последовательностей отобранных пептидов и анализ возможных мишеней действия ГК путем сравнения аминокислотных последовательностей пептидов, аффинных к ГК, с различными белками, содержащимися в банках SWISS-PROT, TrEMBL и BLAST.

Для отобранных 27 пептидов затем была определена первичная последовательность. Проведенный анализ показал, что аминокислотные последовательности рандомизированных олигонуклеотидов,

экспонированных на поверхности фагов, не имеют между собой заметной гомологии.

При этом общей для всех закономерностью явилось повышенное содержание гидрофобных аминокислот (Phe, Бе, Leu, Met, Pro, Val, Туг, Trp, суммарная частота встречаемости гидрофобных аминокислот в белках составляет 37,0%, среди отобранных пептидов 49,2%) Содержание триптофана превысило среднее более чем в 3 раза. Кроме того, для многих последовательностей блоку гидрофобных аминокислот предшествовала положительно заряженная аминокислота (His, Lys или Arg). Иногда такие же аминокислоты замыкали блок гидрофобных.

Видимо, благодаря большим гидрофобным участкам в самой глицирризиновой кислоте, связывание с белками осуществляется именно за счет неспецифических гидрофобных взаимодействий, поэтому трудно ожидать какой-либо заметной гомологии в последовательностях отобранных аффинной,, селекцией фагов Однако, если провести выравнивание по положительно заряженным аминокислотам лизину и аргинину (К и R) или

гистидину (Н), не очень большой полярной аминокислоте,

считающейся относительно близкой к R и К, можно увидеть, что во многих последовательностях за одной из указанных аминокислот следует блок гидрофобных, за ним опять следуют К, R или Н.

По всей видимости, взаимодействие ГК с такого рода участками связано со строением самой кислоты: большой гидрофобный участок и гидрофильные группы Таким образом, мы можем предположить, что происходит неспецифическое связывание ГК с гидрофобными аминокислотами; которое уточняется кулоновскими взаимодействиями.

Поиск гомологии отобранных пептидов с белками вирусов-человека. Критерием отбора являлось совпадение не менее пяти аминокислотных остатков пептида и фрагмента белка. При анализе сходства. первичных структур отобранных пептидов с белковыми последовательностями из баз данных принимались во внимание только те случаи, когда не менее двух пептидов показывали сходство с одним и тем же или группой сходных по функциям белков, иначе считалось, что совпадение случайно. Сходство пептидов с трансмембранными сегментами белков и сигнальными пептидами не принимали во внимание (исключая случаи гомологии с трансмембранными каналами).

При помощи программы BLAST отобранные аминокислотные последовательности анализировались на предмет сходства с белками вирусов человека. Как показал проведенный анализ, отобранные пептиды показали гомологию со многими вирусными белками; В данной работе были проанализированы случаи сходства с белками таких известных вирусов человека, как ВИЧ-1, гепатиты В и С, разные представители семейства Герпесвирусов и некоторыми другими.

Гомология отобранных пептидов с белками ВИЧ-1. 25 пептидов (86% из имеющихся) показали наличие сходства с полипротеином Env, из которого образуются поверхностные гликопротеиды ВИЧ gpl20 и gp41, ответственные за связывание с Т-лимфоцитами. Во-вторых, 18 встроек имеют

гомологию с полипротеином Pol (62%), среди них 12 обнаружили сходство с обратной .транскриптазой ВИЧ-1 (т.е. 67% от всех гомологии с Pol и 41% от имеющихся пептидов). Около 30% встроек имеют гомологию с вирусным инфекционным фактором (белок- Vif) и фактором негативной регуляции транскрипции (белок Nef). Эти результаты согласуются с данными о блокировании ПС стадии адсорбции. Вполне объясним и большой разброс в участках гомологии, так как белок gpl20 имеет очень высокую изменчивость, максимальную среди белков ВИЧ.

Также примечательным оказался- факт наличия- гомологии с полипротеином., Pol, разными! его частями - обратной транскриптазой, интегразой'И протеазою (Табл. 7). Этот результат хорошог согласуется с данными» по ннгибированшо. обратной' транскриптазы производными тритерпенов.

Таблица 7. Результаты анализа гомологии отобранных пептидов с белками ВИЧ-1.

Белок ВИЧ-1, для которого показана гомология Район в белке Количество пептидов, показавших. гомологию '

Полипротеин Env gpl20 gp4I 23 4

Полипротеин Pol Образная транскриптаза Интеграза. Протеаза 12 6 2

Vif 7

Nef. 9

Полипротеин Gag р24 Р17 2 2

Как видно из рисунка 7, гомологии приходятся на область «пальцев» (а) и на область «ладони» ОТ (б). В этих областях нет каталитических центров. Интересно, что нет гомологии с областью гидрофобного «кармана» (174-190 АК), с которым связывается большинство ненуклеозидных ингибиторов ОТ.

Этот факт легко объяснить, если вспомнить структуру глицирризиновой кислоты - два сахарных остатка, присоединенных к тритерепену. По всей видимости, эти остатки значительно затрудняют взаимодействие с обратной транскриптазой. Это объясняет и более высокую ингибирующую активность глицирретовой кислоты (агликон ПС) и ее производных в отношении ОТ;

а) 80 100

ККТ0ОГетЕУ<ЗЬС1РНР8С1.К0ККЗУТУЬО

2 7 етнООЬСУЗЬРЭГАРУ

2 4 КНЕРБ0Ь81РЬУ00Р

22 . КНЦЕУРАЗвРРРУР

19 СПТОЬЬвКЕАРЬУ

б) 155 175 СЗРА1Р058МТрХЬЕРГ|К0ЫРО1У1

ю сссьрассНАЬЮУГ

и аШеустЦрбыссу!

14 .....Р АУА£5 Т Б Б Ь110 (3 Р Г

2 0 РАЬУ^увЫдЬЬЬСГУ

21 РАЬЬ|ЮКРЗТ0УУ5Ь

Рисунок 7. Сравнение аминокислотных последовательностей пептидов и обратной транскриптазы ВИЧ-1.

Поиск гомологии отобранных пептидов с белками человека. Для поиска возможных мишеней действия ГК в клетке проводили сравнение аминокислотных последовательностей пептидов, аффинных к ГК, с белками человека, содержащимися в банках данных.

Количество отобранных белков велико, так что может показаться, что ГК имеет сродство практически ко всем классам белков. Однако, при отсутствии заметной гомологии между аминокислотными последовательностями пептидов, аффинных к ПС, большинство отобранных

белков, гомологичных отобранным встройкам относятся к нескольким сходным по функциям белков. Больше всего гомологии с белками-ферментами человека обнаружено для класса трансфераз. 24 пептида показали сходство с ферментами подкласса трансфераз, переносящих фосфор (82%).

Также большое количество гомологии (22 вставки или 76%) с классом гидролаз, из них 16 - с подклассом гидролаз, воздействующих на фосфоэфирные связи. Среди отобранных белков есть оксидоредуктазы (15) и лиазы (16), но внутри этого класса большой разброс белков по подклассам -не более 6-8 вставок, показавших сходство с тем или иным подклассом. Наибольший интерес вызвало сходство отобранных пептидов с ферментами, относящимися к классу трансфераз, так как большинство совпадений приходится на группу фосфотрансфераз со спиртовыми группами в качестве акцептора.

В настоящее время имеется большое количество литературных данных об ингибировании глшшрризиновой кислотой активности ряда киназ из класса серин-треониновых протеинкиназ - протеинкиназы С (в том числе в ВИЧ-инфицированных клетках), СК-П и некоторых других. Гомологию с отобранными последовательностями показали казеин киназа 1 и протеинкиназа С. Казеин киназа 1 также является важным участником клеточного цикла, в частности известно, что она участвует в фосфорилировании белка р53 и фосфорилирует протеинкиназу С, в некоторых случаях она может подавлять активность казеин киназы 2.

В проанализированных клонах по сравнению со случайными последовательностями (результаты поиска лротеинкиназных сайтов в трех группах по 10 000 последовательностей длиной 15 а о.) также оказалась повышенной частота сайтов фосфорилирования казеинкиназы I (в случайных последовательностях 23,1%, в проанализированных пептидах 37,9%), глюкоген синтазы киназы 3 (в8К3, в случайных последовательностях 6,9%, в пептидах 17,2%). Это согласуется с имеющимися данными о том, что ПС препятствует фосфорилированию, связываясь с субстратом ряда киназ.

Таким образом, впервые применив технологию фагового дисплея для поиска белков-мишеней глицирризиновой кислоты, мы выявили большое количество возможных белков-мишеней ПС, что может объяснять широкий спектр ее биологической активности.

Выводы

1. Исследование ингибирующей активности ряда производных глицирризиновой кислоты показало, что пента-О-никотинат ПС, моноаммонийная соль ПС, - глицирретовая. кислота и ее дипептиды ингибируют рекомбинантную обратную транскриптазу ВИЧ-1. В этом ряду пента-О-никотинат ПС показал себя самым активным ингибитором ОТ с константой иягибирования 6,2 мкМ. Пента-О-никотинат ПС эффективно ингибирует активность мутантных форм-ОТ, несущих аминокислотные замены, обусловливающие устойчивость к азидотимидину.

2. Показано, что при совместном ингибировании ОТ .пента-О-никотинатом ПС и азидотимидин-трифосфатом наблюдается аддитивный эффект. Совместное ингибирование активности ОТ пента-О-никотинатом ПС и невирапином выявило взаимонезависимый и синергический эффект их совместного действия. Показано, что эффект совместного ингибирования ОТ азидотимидин-трифосфатом и глицирризиновой кислоты выше ожидаемого, что говорит о синергическом механизме их действия.

3. Установлено, что аминокислотные производные бетулина эффективно ингибируют рекомбинантную обратную транскриптазу ВИЧ-1 и ее АЗТ-устойчивые формы. Наиболее активным ингибитором ОТ является дипептид бетулоновой кислоты, константа ингибирования ОТ дикого типа для данного соединения составляет 14 мкМ.

4. Исследовние ингибирующей активности производных нафто- и антрахинонов показало, что данные соединения эффективно ингибируют рекомбинантную обратную транскриптазу ВИЧ-1 как дикого типа, так и ее мутантные формы, при этом они показывают разный тип ингибирования. Константы ингибирования для наиболее активных соединений - 25 и 45 мкМ.

5. Методом фагового дисплея были отобраны пептиды, специфически взаимодействующие с глицирризиновой кислотой. Была показана гомология отобранных пептидов с поверхностными белками ряда вирусов человека, в том числе ВИЧ-1 (85% пептидов имеют гомологию с гликопротеидом gpl20). Найдена гомология проанализированных пептидов с обратной транскриптазой (44 % пептидов).

6. Показана гомология отобранных пептидов с белками человека: тирозин киназами (55% пептидов среди отобранных показали гомологию), серин-треониновым киназам (37% пептидов) и некоторым другим белкам. Анализ аминокислотных последовательностей выявил общие закономерности - повышенное содержание гидрофобных аминокислот; повышенная частота сайтов фосфорилирования для некоторых киназ: казеинкиназы I (в случайных последовательностях 23%, в проанализированных пептидах 37%), глюкоген СИНТЕЗЫ киназы 3

. (GSK3, в случайных последовательностях 7%, в пептидах 17%).

Список публикаций.

Ильина Т.В.. Фелюк Н.В., Бачинский А.Г., Туманова О Ю., Кувшинов В.Н., Ильичев А.А., Покровский АХ. Определение участков связывания глицирризиновой кислоты в клетке методом фагового дисплея. Молекулярная биология. 2003. Т.37(5). С.861-867

Ильина Т.В. Семенова ЕА, Плясунова О.А., Федюк н.В., Петренко Н.И., Еланцева Н.В., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А., Покровский АХ. Производные природных тритерпенов - ингибиторы обратной транскршггазы вируса иммунодефицита человека. Бюллетень СО РАМН. 2002. №2 (104). С.' 20-24

Ильина Т.В.. Семенова ЕА, Проняева Т.Р., Покровский АХ., Нечепуренко И.В., Шульц Э.Э., Андреева О.И., Кочетков С.Н., Толстиков Г.А Ингибирование обратной транскршггазы ВИЧ-1 ариязамещеными нафто- и антрахинонами. Доклады Академии Наук. 2002. Т.382. №6. С. 829-832

Ильина Т В т Семенова Е.А., Ильичева Т.Н., Проняева Т.Р., Покровский А Г., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Ингибирование обратной транскриптазы ВИЧ-1 фенольными соединениями солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisch.). Химия в интересах устойчивого развития. 2001. Т.9. С.643-647

Патент. Шульц Э.Э., Нечепуренко И.В., Толстиков Г.А., Ильина Т.В., Семенова Е.А., Проняева ТР., Покровский А.Г. "Арилзамещеные нафго- и антрахиноны, обладающие анти-ВИЧ активностью". 2003. Патент РФ№ 15326-010

Тезисы.

1. Шла T.V. Feduk N.V., Tumanova O.U., Kuvshinov V.N., Dychev A.A., Pokrovsky A.G. Phage display application in the study of glycyrrhizic acid binding sites. FEBS Special Meeting on Signal Transduction. Brussels. 2003

2. Semenova E.A., Ilina Т.. Nechepurenko I., Shults E., Tolstikov G. , Pokrovsky A. The interaction of wild type and AZT-resistant mutant forms of HIV reverse transcriptase with 1,4-naphtoquinones and anthraquinones. FEBS Forum of Young Scientists. Brussels. 2003

3. Ilina T.% Semenova E., Pokrovsky A., Shults E., Tolstikov G. Inhibition of Human Immunodeficiency Virus's Reverse Transcriptase by natural triterpenes derivatives.XIIIth International Congress of Virology. The World of Microbes. Paris. 2002. P. 263

4. Ильина Т.В.. Семенова Е.А., Покровский АХ., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А /Ингибирование обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека производными природных тритерпенов. «Проблемы

инфекционной патологии в регионах Сибири. Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск. 2002. С.69

5. Ильина Т.В.. Семенова ЕА, Покровский А.Г., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А Ингибирование обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека производными природных тритерпенов. «Биология - наука XXI века», Пущино. 2002

6. Нечепуренко И.В., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А., Ильина Т.В. Семенова ЕА, Покровский А.Г. Синтез 1-арил-нафто- и антрахинонов -новой группы ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ. "Современные проблемы органической химии". Новосибирск. 2001. С.135

7. Ильина Т.Б.Г Семенова ЕА, Покровский А.Г., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А Производные природных тритерпенов - ингибиторы обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека. Русский журнал "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы". С.-Петербург. 2001. Т.5. С.88

8. Семенова ЕА, Ильина Т.Б.1 Покровский А.Г., Нечепуренко И.В., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Взаимодействие производных 1,4-нафтохинона и диоксиантрохинона с мутантными формами обратной транскриптазы

, вируса иммунодефицита человека. Русский журнал "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы". С.-Петербург. 2001. С.94

9. Ильина ТВ.. Покровский А.Г., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А., Андреева О.И., Кочетков С.Н. Русский журнал "ВИЧ/СПИД и родственные

' проблемы". С.-Петербург. 2000. С.73

Соискатель

Ильина Т.В

Подписано в печать 30.03.2004 Формат 60x84 1/16 Заказ № 44 Бумага офсетная, 80 гр/м2

Печл. 1 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа нм. ПК. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

»-72 6 2

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ильина, Татьяна Валерьевна

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы 10 1.1. Вирус иммунодефицита человека

1.1.1. Краткое описание генома ВИЧ

1.1.2. Обратная транскриптаза ВИЧ-1 16 1.1.3 .Схема обратной транскрипции 18 1.2 Анти-ВИЧ терапия

1.2.1. Блокирование стадии адсорбции

1.2.2. Ингибиторы обратной транскрипции 23 Аналоги субстратов 23 Ненуклеозидные ингибиторы ОТ 25 Связывание ненуклеозидных ингибиторов с обратной транскриптазой ВИЧ

1.2.3. Ингибиторы других этапов жизненного цикла ВИЧ-1 31 1.3. Глицирризиновая кислота

Противовирусная активность глицирризиновой кислоты

2. Материалы и методы

2.1. Реактивы, используемые в работе

2.2. Буферные растворы.

2.3. Трансформация клеток E.C.oli

2.4. Выделение обратной транскриптазы

2.5. ПААГ SDS-электрофорез

2.6. Определение скорости реакции, катализируемой ОТ

2.7. Определение кинетических параметров реакции

2.8. Исследование противовирусной активности соединений

2.9. Фаговый дисплей

3. Результаты и обсуждение

3.1.Характеристика использовавшихся в работе вариантов обратных транскриптаз

3.2.Исследование ингибирующей активности ГК и ее производных в отношении ОТ ВИЧ

Активность производных ГК на культуре клеток 57 Совместное ингибирование обратной транскриптазы ВИЧпента-О-никотинатом ГК и АЗТ

Совместное действие пента-О-никотината ГК и невиралина

Совместное ингибирование ГК и азидотимидином 65 Совместное действие АЗТ и пента-О-никотината ГК в культуре инфицированных клеток

3.3.Исследование ингибирующей активности бетулина и его производных 70 Активность производных бетулина в культуре клеток

3.4.Исследование ингибирующей активности антра- и нафтохинонов 73 Противовирусная активность производных хинонов

3.5.Поиск сайтов связывания глицирризиновой кислоты методом фагового дисплея 79 Характеристика отобранных фаговых клонов 80 Поиск гомологии отобранных пептидов с белками вирусов человека 82 Гомология отобранных пептидов с белками ВИЧ 84 Поиск гомологии отобранных пептидов с белками человека

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов АНТИ-ВИЧ активности производных высших тритерпенов и хинонов"

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - сегодня наиболее известный представитель семейства Ретровирусов. Действительно, синдром приобретенного иммунодефицита или СПИД - болезнь, вызываемая ВИЧ, за последние десятилетия широко распространился по всей планете. По последним данным, за 20 лет, прошедшие с момента открытия вируса, в мире умерло 24 миллиона человек, то есть население Бельгии и Голландии вместе взятых. Всего за это время заразилось "чумой XX века" 40 миллионов человек, и пока эпидемия не выказывает никаких признаков затухания. В России она распространяется со стремительной скоростью. По данным 2002 г. число ВИЧ-инфицированных уже превысило 200 тысяч (и это только официальная статистика, которая отличается от действительной как минимум в 5-10 раз). Если ВИЧ будет распространяться с той же скоростью, то более 5 миллионов россиян станут ВИЧ-положительными к 2007 году (по данным www.aids.ru).

ВИЧ это сравнительно небольшой, достаточно просто устроенный вирус с уникальной системой репродукции. Данный вирус имеет три фермента, необходимых ему для успешной репликации - обратную транскриптазу, интегразу и протеазу. Обратная транскриптаза осуществляет синтез двухцепочечной ДНК с вирусной РНК, интеграза встраивает ДНК провируса в геном клетки-хозяина, а протеаза нарезает предшественников вирусных белков на относительно короткие полипептидные цепи, способствуя образованию новых вирионов (Katz R.A., Skalka A.M., 1994; Freed E.,2001).

Реакция синтеза ДНК с матрицы РНК является специфической особенностью представителей семейства Ретровирусов. Поэтому обратная транскриптаза - фермент, осуществляющий этот процесс, привлекает внимание со стороны ученых, как наиболее перспективная мишень действия противовирусных препаратов.

В первую очередь в качестве ингибиторов обратной транскриптазы были использованы аналоги нуклеозидов (2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты (dNTP). Первым из нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы, принесшим реальный успех в лечении и профилактике ВИЧ-инфекции, был 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин (азидотимидин, АЗТ). Этот нуклеозид является производным пиримидинового нуклеозида тимидина, в положении З'-гетероцикла молекулы которого находится азидная (N3) группа (Островский, 1999).

Однако вскоре стали понятны недостатки длительного применения азидотимидина. Во-первых, уже через несколько месяцев лечения появляются варианты вируса, обладающие устойчивостью к действию препарата и лечебный эффект АЗТ исчезает (аминокислотные замены, вызывающие устойчивость к АЗТ впервые описаны Larder et al, 1989); во-вторых, это ряд сильных побочных действий препарата, заключающихся в подавлении функций многих органов. Были разработаны другие соединения, аналоги нуклеозидов - 2',3'-дидезоксицитидин (ddC), 2',3'-дидезоксиинозин (ddl), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (d4T) и 2',3'-дидезокси-3'-тиоцитидин (ЗТС) и некоторые другие. В настоящее время для лечения ВИЧ-инфекции практически нигде не применяется монотерапия (лечение одним препаратом), т.к. использование двух или более соединений значительно снижает вероятность появления мутаций и не требует таких высоких концентраций препаратов (Johnson, 1996). Наиболее надежным является использование сочетания соединений нуклеозидной и ненуклеозидной природы. Если аналоги нуклеозидов блокируют синтез ДНК, встраиваясь в растущую цепь, то вещества ненуклеозидного происхождения связываются непосредственно с обратной транскриптазой, меняя ее конформацию таким образом, что дальнейшая ее активность становится невозможной (Litvak S., 1996). Препараты из группы ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ-1 обладают рядом преимуществ - более низкой токсичностью, более высоким сродством к ферменту, а в сочетании с аналогами нуклеозидов значительно повышают активность последних (De Clercq, 1999).

Таким образом, поиск новых ингибиторов репликации ВИЧ-1 остается актуальным в настоящее время. Для того, чтобы использовать их с наибольшей эффективностью, необходимо изучить механизмы взаимодействия новых соединений с обратной транскриптазой ВИЧ-1. Особенный интерес вызывают те соединения, о биологической активности которых уже есть данные.

Давно известно, что глицирризиновая кислота (ГК), активный компонент корня солодки (Gyicyrrhiza sps.) подавляет репликацию ВИЧ в культуре клеток (Ito et al, 1988). Позднее было показано, что глицирризиновая кислота (ГК) более активна на ранних стадиях инфекции (Плясунова О.А. и др., 1992). Кроме того, данные о противовирусной активности глицирризиновой кислоты и в отношении других вирусов -гепатита В и С, Марбург, Герпесвирусов и по последним данным, Коронавирусов (ТОРС вирус, или SARS). Это соединение обладает и другими биологическими активностями - противоопухолевой, противовоспалительной, антиаллергической и т.д. (Толстиков Г.А. и др. 1997).

Однако, несмотря на большое количество данных о противовирусной активности ГК и ее производных, на настоящий момент очень мало известно о механизмах ее действия в клетке. Есть сообщения об ингибировании ГК различных киназ, в частности, казеин киназы 2 (участвует в фосфорилировании обратной транскриптазы ВИЧ-1, тем самым повышая ее активность (Harada S. et al, 1998)) и протеин киназы С, которая фосфорилирует рецептор CD4 на поверхности Т-лимфоцитов, необходимый для связывания вируса с клеткой (Kazuhiro Н. et al, 1991). С другой стороны, из литературных данных известно, что некоторые природные тритерпены, выделенные из растений Shizandra sphaerandra, Maprounea africana и других, могут служить ингибиторами обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ-1 (Matthee G. et al 1999; Vlietinick A., 1998).

Целью настоящей работы являлось изучение молекулярных механизмов анти-ВИЧ активности глицирризиновой кислоты и ее производных, в том числе способность этих соединений ингибировать рекомбинантную ОТ ВИЧ-1. Также нашей целью являлось исследование ингибирующей активности в отношении ОТ ВИЧ-1 ряда производных бетулина, другого природного тритерпена, и новых синтетических производных хинонов. Для определения возможных мишеней действия ГК в клетке была использована технология фагового дисплея.

Таким образом, перед настоящим исследованием стояли следующие задачи:

1) проверить ингибирующую активность ГК и ее производных в отношении рекомбинантной ОТ ВИЧ-1 и ее мутантных форм, несущих аминокислотные замены, обусловливающие устойчивость к АЗТ;

2) выяснить характер взаимодействия ГК и ее производных с АЗТ и невирапином при совместном ингибировании;

3) проверить ингибирующую активность бетулина и его производных в отношении рекомбинантной ОТ ВИЧ-1 и АЗТ-устойчивых форм ОТ;

4) исследовать ингибирующую активность ряда производных хинонов в отношении ОТ ВИЧ-1;

5) применив метод фагового дисплея, описать возможные мишени противовирусного действия ГК.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ильина, Татьяна Валерьевна

Выводы

Исследование ингибирующей активности ряда производных глицирризиновой кислоты показало, что пента-О-никотинат ГК, моноаммонийная соль ГК, глицирретовая кислота и ее дипептиды ингибируют рекомбинантную обратную транскриптазу ВИЧ-1. В этом ряду пента-О-никотинат ГК показал себя самым активным ингибитором ОТ с константой ингибирования 6,2 мкМ. Пента-О-никотинат ГК эффективно ингибирует активность мутантных форм ОТ, несущих аминокислотные замены, обусловливающие устойчивость к ази дотими дину.

Показано, что при совместном ингибировании ОТ пента-О-никотинат ГКом и азидотимидин-трифосфатом наблюдается аддитивный эффект. Совместное ингибирование пента-О-никотинатом ГК и невирапином выявило взаимонезависимый и синергический эффект их совместного действия. Показано, что эффект совместного ингибирования ОТ азидотимидин-трифосфатом и глицирризиновой кислоты выше ожидаемого, что говорит о синергическом механизме их действия.

Установлено, что аминокислотные производные бетулина эффективно ингибируют рекомбинантную обратную транскриптазу ВИЧ-1 и ее АЗТ-устойчивые формы. Наиболее активным ингибитором ОТ является дипептид бетулоновой кислоты, константа ингибирования ОТ дикого типа для данного соединения составляет 14 мкМ.

Исследовние ингибирующей активности производных нафто- и антрахинонов показало, что данные соединения ингибируют рекомбинантную обратную транскриптазу ВИЧ-1 как дикого типа, так и ее мутантные формы, при этом они показывают разный тип ингибирования. Константы ингибирования для наиболее активных соединений - 25 и 45 мкМ.

5. Методом фагового дисплея были отобраны пептиды, специфически взаимодействующие с глицирризиновой кислотой. Была показана гомология отобранных пептидов с поверхностными белками ряда вирусов человека, в том числе ВИЧ-1 (85% пептидов имеют гомологию с гликопротеидом gpl20). Найдена гомология проанализированных пептидов с обратной транскриптазой (44 % пептидов).

6. Показана гомология отобранных пептидов с белками человека: тирозин киназами (55% пептидов среди отобранных показали гомологию), серин-треониновым киназам (37% пептидов) и некоторым другим белкам. Анализ аминокислотных последовательностей выявил общие закономерности - повышенное содержание гидрофобных аминокислот; повышенная частота сайтов фосфорилирования для некоторых киназ: казеинкиназы I (в случайных последовательностях 23%, в проанализированных пептидах 37%), глюкоген синтазы киназы 3 (GSK3, в случайных последовательностях 7%, в пептидах 17%).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ильина, Татьяна Валерьевна, Кольцово

1. Мазин А.В., Кузноделов К.Д., Краев А.С. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. М.: «Наука». 1990

2. Маниатис Т., Фрт Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: «Мир». 1984

3. Карамов Э.В., Богомолов Б.П., Жданов В.М. Обзор центров, сотрудничающих с ВОЗ по вирусным инфекциям. М. 1986. С.4-7

4. Островский В.А. Синтетические лекарственные средства против ВИЧ/СПИД. 1999. Соровский образовательный журнал. № 9. С.44-51

5. Петренко Н.И, Петухова В.З., Шатров М.М Синтетические трансформации высших терпеноидов V. Синтез и спектральные данные производных глицирретовой кислоты, содержащих аминокислотные фрагменты. 2000. Журнал органической химии. Т.36(7). С. 1013-1026

6. Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. Изучение анти-ВИЧ активности (3-глицирризиновой кислоты. 1992. Вопросы вирусологии. Т.37(5-6). С.235-238

7. Покровский А.Г., Плясунова О.А., Гашникова Н.М., Мамаева О.А., Федюк Н.В. Хронически инфицированная ВИЧ-1 культура моноцитов человека U937 как модель для оценки эффективности анти-ВИЧ препаратов. 2001. Вопросы вирусологии. № 6. С. 38-42

8. Покровский А.Г., Федюк Н.В., Абдуллаев С.М., Болтина Л.А., Толстиков Г.А. Индуктор гамма интерферона// Заявка на патент РФ № 2003134868 от 01.12.03

9. Розовская Т.А., Белогуров А.А., Лукин М.А., Чернов Д.Н., Куханова М.К., Бибилишвили Р.Ш. Обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека: выделение и субстратная специфичность. 1993. Молекулярная биология. Т.27. С.618-629

10. Руднева ИА., Карамов Э.В., Горчакова ТА. и др. Штамм перевиваемых клеток моноцитов человека продуцент вируса иммунодефицита человека 1 типа. Патент РФ № 1554370, выдан 19.03.1993

11. Семенова Е.А., Плясунова OA., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Шулъц Э.Э., Толстиков ГА., Покровский А.Г. Ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 производными высших терпеноидов. 2003. Доклады Академии Наук. Т.391(4). С. 218-220

12. Толстиков Г.А., Шулъц Э.Э., Болтина Л.А., Толстикова Т.Г. Солодка. Неиспользуемые возможности здравоохранения России. Химия в интересах устойчивого развития. 1997. Т.5. С.57-73

13. Толстиков Г.А., Болтина Л.А., Шулъц Э.Э., Покровский А.Г. Глицирризиновая кислота. 1997. Биоорганическая химия. Т.23(7). С. 691-709

14. Толстиков Г.А., Шулъц Э.Э., Сафарова Г.М., С.пирихин Л.В. Получение 2-фурилцикланонов диеновым синтезом. 1990. Журнал органической химии. Т. 28(6). С. 1283-1296

15. Шульц Э.Э., Петрова Т.Н., Шакиров М.М., Черняк Е.И., Гранкина В.П., То.чсткков Г.А. Фенольные соединения подземной части солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) сибирских популяций. 2000. Химия в интересах устойчивого развития. Т.8. С.453-457

16. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М: Мир. 1966. С. 864

17. Хесин Р. М. Непостоянство генома. М.: «Наука». 1984. С.237

18. Ahmad N., Venkatesan S. Nef protein of HIV-1 is a transcriptional repressor of HIV-1 LTR. 1988. Science. Y.241. P.1481-1485

19. Akihisa T, Ogihara J, Kato J, Yasukawa K, Ukiya M, Yamanouchi S, Oishi K. Inhibitory effects of triterpenoids and sterols on human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase. 2001. Lipids. V.36(5). P.507-512

20. Bagasra O., Whittle P., Heins В., Pomerantz R.J. Anti-human immunodeficiency virus type 1 activity of sulfated monosaccharides: comparison with sulfated polysaccharides and other polyions. 1991. J. Infect. Dis. V.164(6). P.1082-1090

21. Baltina LA. Chemical modification of glycyrrhizic acid as a route to new bioactive compounds for medicine. 2003. Curr. Med. Chem. V.10(2). P. 155-171

22. Balzarmi J., De Clercq E., Serafinowski P., Dorlcmd E., Harrap K.R. Synthesis and antiviral activity of some new S-adenosyl-L-homocysteine derivatives. 1992. J. Med. Chem. V.35(24). P.4576-83

23. Bean P. The use of alternative medicine in the treatment of hepatitis C. 2002. Am. Clin. Lab. V.21(4). P. 19-21

24. Berube, P., Barbeau,B., Cantin,R, Sekaly,R.-P., ТгетЫауМ- Repression of Human Immunodeficiency Virus Type 1 LTR-driven gene expression by binding of the virus to its primary cellular receptor, the CD4 molecule. 1996. J. Virol. V.6. P.4009-4016

25. В irk В., Sonnerborg A. Variations in HIV-1 pol gene associated with reduced sensitivity to anti-retroviral drugs in treatment-naive patients. 1998. AIDS. V.12. P.2369-2375

26. Boyer P.L., Ferris A.L., Hughes S.H. Mutational analysis of the fingers domein of HIV-1 reverse transcriptase. 1992. J. Virol. V.66. 7533-7537

27. Boyer P.L., Ferris A.L., Clark A. Mutational analysis of the fingers and palm subdomeins of HIV-1 reverse transcriptase. 1994. J. Mol. Biol. V. 243. P.472-483

28. Bukrinsky, M, Sharova,N., Stevenson,M. Human Immunodeficiency Virus Type 1 2-LTR circles reside in a nucleoprotein complex which is different from the preintegration complex. 1993. J. Virol. V.ll. P.6863-6865

29. Caputo, A., Grossi, M., Rossi, C„ Campion, D., Balboni,PJ. The tat gene and protein of the Human Immunodeficiency Virus Type 1. 1995. Microbiologica. V.18. P. 87-П0

30. Chang,L.J., Zhang,С. Infection and replication of Tat" HIV: genetic analyses of LTR and tat mutations in primary and long-term human lymphoid cells. 1995. Virology. V.211. P.157-169

31. A3. С hang W.S., Yan G.F., Chiang H.С. Inhibitory effects of phenolic carboxylic acid analogues on xanthine oxidase. 1995. Anticancer Res. V.15(5). P.2097-2100

32. Chen I.J., Neamati N., MacKerell A.D. Jr. S tincture-based inhibitor design targeting HIV-1 integrase. 2002. Cuit. Drug Targets Infect. Disord. V.2(3). P.217-234

33. Cinatl J., Morgenstern В., Bauer G., Chandra .P, Rabenau H., Doerr H.W. Glycyrrhizin, an active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronavirus. 2003. Lancet. V.361(9374). P.2045-2046

34. Cowan M.M. Plant products as antimicrobial agents. 1999. Clin. Microbiol. Rev. V.12. P.564-582

35. C.rance J.M., Scaramozzino N., Jouan A., Garin D. Interferon, ribavirin, 6-azauridine and glycyrrhizin: antiviral compounds active against pathogenic flaviviruses. 2003. Antiviral Res. V.58(l). P.73-79

36. Cullen, B.R. Mechanism of Action of Regulatory Proteins Encoded by Complex Retroviruses. 1992. Microbiological Reviews. V.9. P.375-394

37. Dharmaratne H.R., Tan G.T., Marasinghe G.P., Pezzuto J.M. Inhibition of HIV-1 reverse transcriptase and HIV-1 replication by Calophyllum coumarins and xanthones. 2002. Planta Med. V.68(l). P.86-87

38. Darrick S.H., Kim L., Chen Z, Nguyen V.T., Pezzuto J., Qiu S., Lu Z.Z. A concise semi-synthetic approach to betulinic acid from betulin. 1997. Synth. Commun. V. 27(9). P.1607-1612

39. Debyser Z., Cherepanov P., Van Maele В., De C.lercq E., Wit\>rouw M. In search of authentic inhibitors of HIV-1 integration. 2002. Antivir. Chem. Chemother. V.13(l). P.1-15

40. De S.K., Marsh J. W. HIV-1 Nef Inhibits a common activation pathway in NIH-3T3 cells. 1994. J. Biol. Chem. V.269(9). P.6656-6660

41. De Clercq E. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) for the treatment of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infections: strategies to overcome drug resistance. 1996. Medical virology. V.6. P.97-110

42. De Clercq E. Perspectives of non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) ii the therapy of HIV-1 infection. 1999. Farmaco. V.54(l-2). P.26-45

43. De Clercq E. The emerging role of fusion inhibitors in HIV infection. 1999. Drugs R D. V.2(5). P.321-331

44. De Clercq E. Current lead natural products for the chemotherapy of humai immunodeficiency virus (HIV) infection. 2000. Med. Res. Rev. V.20(5). P.323-349.

45. De Clercq E. Inhibition of HIV infection by bicyclams, highly potent and specific CXCR4 antagonists. 2000. Mol. Pharmacol. V.57(5). P.833-839

46. De Clercq E., Schols D. Inhibition of HIV infection by CXCR4 and CCR5 chemokine receptor antagonists. 2001. Antivir. Chem. Chemother. V.l. P. 19-31

47. De Clercq E. New anti-HIV agents and targets. 2002. Med. Res. Rev. V.22(6). P.531-565.

48. Dumaz N., Milne D.M., Meek D.W. Protein kinase CK1 is a p53-threonine 18 kinase which requires prior phosphorylation of serine 15. 1999. FEBS Lett. V.463(3). P.312-316

49. EsnoufR., Ren J., Ross C., Jones Y., Stammers D., Stuart D. Mechanism of inhibition of HIV-1 reverse transcriptase by non-nucleoside inhibitors. 1995. Nat. Strict Biol. V.2(4). P.303-308

50. Essex M. Human immunodeficiency viruses in the developing world. 1999. Ad. Virus. Res. V.53. P.71-88юз

51. Farnei Ch., Haseltine W.A. Integration of humah immunodeficiency vims type 1 DMA in vitro. 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.81(6). P.4164-4168

52. Farnei Ch., Haseltine W.A. Circulisation of humah immunodeficiency vims type 1 DNA in vitro. 1991. J. Virol. V.65. P.6942-695

53. FreedE.O. HIV-1 replication. 2001. Somat. Cell. Mol. Genet. V.26(l-6). P.13-33

54. Fujisawa Y., Sakamoto M., Matsushita M., Fujita Т., Nishioka K. Glycyrrhizin inhibits the lytic pathway of complement—possible mechanism of its antiinflammatory effect on liver cells in viral hepatitis. 2000. Microbiol. Immunol. V.44(9). P.799-804

55. Furman P.A., Fyfe J.A., SaintClair M.H. Posphorylation of 3'-azido-3;-deoxythymidine and selective interaction of the 5'-triphosphate with HIV-1 reverse transcriptase. 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. V.83. P.8333-8337

56. Garg R., Gupta S.P., Gao H., Babu M.S., Debnath A.K., Hansch C. Comparative Quantitative Stmcturemrnus sign Activity Relationship Studies on Anti-HIV Drugs. 1999. Chem. Reviews. V. 99(12). P. 3525-3601

57. Hatano Т., Yasuhara Т., Miyamoto K., Okuda T. Anti-human immunodeficiency virus phenolics from licorice. 1988. Chem. Pharm. Bull. V.36(6). P.2286-2288

58. Hatomi M., Tanigawa K., Fujihara M., Ito J., Yanahira S., Ohtsuki K. Characterization of bovine and human lactoferrins as glycyrrhizin-binding proteins and their phosphorylation in vitro by casein kinase II. 2000. Biol. Pharm. Bull. V.23. P.1167-1172

59. Hattori Т., Ikematsu S., Koito A., Matsushita S., Maeda Y., Hada M., Fujimaki M., Takalsuki K. Preliminary evidence for inhibitory effect of glycyrrhizin on HIV replication in patients with AIDS. 1989. Antiviral Res. V.5-6. P.255-261

60. Harrich D., Ulich C., Gaynor R.B. A critical role for the TAR element in promoting efficient Human Immunodeficiency Virus Type 1 Reverse transcription. 1996. J. Virol. V.6. P.4017-4027

61. Havsteen B. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacology and Therapeutics. 2002. V.96(2-3). P.67-202

62. Higuchi H., Mori К., Kaio A., Ohkuma Т., Endo Т., Kaji H. Antiretroviral activities of anthraquinones and their inhibitory effects on reverse transcriptase. 1991. Antiviral. Res. V. 15(3). P. 205-216

63. Holz-Smith S.L., Sun C, Jin L, Matthews T.J., Lee K.-H., C.hen С H. Role of Human Immunodeficiency Virus (HIV) Type 1 Envelope in the Anti-HIV Activity of the Betulinic Acid Derivative IC9564. 2001. Antimicrob. Agents Chemother. V. 45. P. 60-66

64. Hofmann K, Bucher P., Falquet. L., Bairoch A. The PROSITE database, its status in 1999. 1999. Nucleic Acids Res. V.27. P.215-219.

65. Howcroft Т.К., Palmer L.A., Brown J., Rellahan В., Kashanchi F. HIV Tat represses transcription through Spl-like elements in the basal promoter. 1995. Immunity. V.3. P.127-138

66. Huang Y., Zhang L., Ho L. Biological Characterization of nef in Long Term Survivors of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection. 1995. J. Virol. V.69( 12). P.8142-8146

67. Huang L., Chen C.H. Molecular targets of anti-HIV-1 triterpenes. 2002. Curr. Drug Targets Infect. Disord. V.2(l). P.33-36

68. Huang X., Miller W. A time-efficient, linear-space local similarity algorithm. 1991. Advances in Applied Mathematics. V. 12. P.337-357

69. Jacobo-Molina A., Ding J., Nanni R.G. Ciystal structure of of HIV-1 reverse transcriptase complexed with double-stranded DNA at 3.0 a resolution shows bent DNA. 1993. Proc. Natl. Acad. Science. V.92. P. 1222- 1226

70. Johnson V. Combination therapy for HIV-1 infection-overview: preclinical and clinical analysis of antiretroviral combinations. 1996. Antiviral Res. V.29. P.35-39

71. Jonckheere H, Anne J, De Clercq E. The HIV-1 reverse transcription (RT) process as target for RT inhibitors. 2000. Med. Res. Rev. V.20(2). P. 129-154

72. Kah-aichev Z, Walder R., Garzaro D. Anti-HIV activity of extracts from Calendula officinalis flowers. 1997. Biomed. Pharmacother. V.51(4). P. 176-80

73. Kashiwada Y., Hashimoto F., C.osentino L.M., Chen C.-H., Garrett P.E., Lee K.H. Betulinic acid and dihydrobetulinic acid derivatives as potent anti-HIV agents. 1996. J. Med. Chem. V. 39. P. 1016-1017

74. Katz R.A., Skalka A.M. The retroviral enzymes. 1994. Annu. Rev. Biochem. V.63. P.133-173

75. Klimkait. Т., Strebel K., Hoggan M.D., Martin M.A., Orenstein J.M. The human immunodeficiency virus type 1-specific protein vpu is required for efficient virus maturation and release. 1990. J. Virol. V.64(2). P.621-629

76. Kuritzkes D.R. Resistance to protease inhibitors. 2002. J. HIV Ther. V.7(4). P.87-91

77. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. 1970. Nature. V.2. P.680-685

78. Lau A.F., Siedlecki J., Anleitner J., Patterson G.M., C.aplan F.R., Moore RE. Inhibition of reverse transcriptase activity by extracts of cultured blue-green algae (cyanophyta). 1993. PlantaMed. V.59(2). P.148-151

79. Lee-Huang S., Huang P.L., Nara P.L., Chen H.C., Kung H.F., Huang P., Huang H.I., Huang P.L. MAP 30: a new inhibitor of HIV-1 infection and replication. 1990. FEBS Lett. V.272(l-2). P. 12-18

80. Levy J. A. Pathogenesis of Human Immunodeficiency Virus Infection. 1993. Microbiological Reviews. V. 11. P. 183-289

81. Li В.О., Fu Т., Dongyan Y., Mikovils J.A., Ruscetti F.W., Wang JM. Flavonoid baicalin inhibits HIV-1 infection at the level of viral entty. 2000. Biochem. Biophys. Res. Commun. V.276(2). P.534-538

82. Lifrak S. Retroviral reverse transcriptase. Molecular biology Intellegence Unit. 1996. P.208

83. Mahmood N., Pizza C., Aquino R., De Tommasi N., Piacente S., Colman S., Burke A., Hay A.J. Inhibition of HIV infection by flavanoids. 1993. Antiviral Res. V.22(2-3). P.189-199

84. Majumdar C., Stein C.A., Cohen J.S., BroderS., Wilson S.H. Stepwise mechanism of HIV reverse transcriptase: primer function of phosphorothioate oligodeoxynucleotide. 1989. Biochemistry. V.28. P. 1340-1346

85. Maldarelh F., Sato H., Berthold E., Orenstain J., Martin M.A. Rapid induction of apoptosis by cell-to-cell transmission of Human Immunodeficiency Vims Type 1. 1995. J. Virol. V.69(10). P.6457-6465

86. Mdisuse I.Т., him Y.A., Hattori M, Correa M„ Gupta M.P. A search for anti-viral properties in Panamanian medicinal plants. The effects on HIV and its essential enzymes. 1999. J. Ethnopharmacol. V.64(l). P. 15-22

87. Merluzzi V.J., Hargra\>e K.D., Labadia M., Grozinger K., Skoog M., Wu J.C., Shih C.K., Eckner K, Hattox S., Adams J. Inhibition of HIV-1 replication by a noimucleoside reverse transcriptase inhibitor. 1990. Science. V.250(4986). P. 14111413

88. Min B.S., Nakamura N., Miyashiro H., Kim Y.H., Hattori M. Inhibition of human immunodeficiency vims type 1 reverse transcriptase and ribonuclease H activities by constituents of Juglans mandshurica. 2000. Chem. Pharm. Bull. V.48(2). P. 194-200

89. Mlinaric A., Kreft S., UmekA., Strukelj B. Screening of selected plant extracts for in vitro inhibitory activity on HIV-1 reverse transcriptase (HIV-1 RT). 2000. Pharmazie. V.55(l). P.75-77

90. Morin M.J. From oncogene to drug: development of small molecule tyrosine kinase inhibitors as anti-tumor and anti-angiogenic agents. 2000. Oncogene. V. 19(56). P.6574-6583

91. Motti C., NuzzoM., MeolaA., Galfre G., Felici F., Cortese R., Nicosia A., Mcmaci P. Recognition by human sera and immunogenicity of HBsAg mimitopes selected from an M13 phage display library. 1994. Gene. V. 146. P. 191-198

92. Mui Ph. W., Jacober S.P., Hargrave K.D., Adams J., Ciystal structure of nevirapine, a non-nucleoside inhibitor of HIV-1 reverse transcriptase, and computational alignment with a structurally diverse inhibitor. 1992. J. Med. Chem. V.35. P.201-202

93. Nakashima H., Murakami Т., Yamamoto N., Sakagami H., Tanuma S., Ha tan о Т., Yoshida Т., Okuda Т. Inhibition of human immunodeficiency viral replication by tannins and related compounds. 1992. Antiviral Res. V.18(l). P.91-103

94. Nair V. HIV integrase as a target for antiviral chemotherapy. 2002. Rev. Med. Virol. V. 12(3). P. 179-193

95. Neer E.J., Clapham D.E. Roles of G protein subunits in transmembrane signaling. 1988. Nature. V.333. P.129-130

96. Olukoga A., Donaldson D. Liquorice and its health implications. 2000. J. R. Soc. Health. V. 120(2). P.83-89

97. Ono K., Nakane H., Fukushima M., Chermann J.-C., Barre-Sinoussi F. Differential inhibitory effects of various flavonoids on the activities of reverse transcriptase and cellular DNA and RNA polymerases. 1990. Eur. J. Biochem. V. 190. P.469

98. Pauza C.D. 2-LTR cicular viral DNA as a marker for human immunodeficiency vims type 1 infection in vitro. 1994. Virology. V.205. P.470-478

99. Pearson L., Garcia J. A transdominant tat mutant that inhibits tat- induced gene expression from the Human Immunodeficiency Vims Long Terminal Repeats. 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. V.87. P.5079-5083

100. Pedersen O.S., Pedersen E.B. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors: the NNRT1 boom. 1999. Antivir. Chem. Chemother. V.10(6). P.285-314

101. Pettit G.R., Green В., Вомуег W.J. Steroids and related natural products. VI. The structure of a-apoallobetulin. 1961. J. Org. Chem. V.8. P.2879-2883

102. Pi ret В., Legrand.-Poels,S., Sappey €., Piette J. NF-kB transkription factor and Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) activation by methylene blue photosensitization. 1995. Eur J. Biochemistry. V.228. P.447- 455

103. Ploeger В., Mensinga Т., Sips A., Meulenbelt J., DeJongh• J. A human physiologically-based model for glycyrrhzic acid, a compound subject to presystemic metabolism and enterohepatic cycling. 2000. Pharm. Res. V.12. P. 1516-1525

104. Pluymers W., De Clercq E., Debyser Z. HIV-1 integration as a target for antiretroviral therapy: a review. 2001. Curr. Drug Targets Infect. Disord. V.l(2). P.133-49

105. Plyasunova O.A., Pokrovsky A.G., Baltina L. Design of anti-HIV agents based on glycyrrhizic acid // Abstract book v.2 of Tenth International Conference on AIDS, International Conference on STD, Yokohama, Japan. 1994. P.7-12

106. Pokholok D., Gudima S., Yesipov D., Dobrynin V., Rechinsky V., Kochetkov S. Interactions of the HIV-1 RT AZT-resistant mutant with substrates and AZT-TP. 1993. FEBS Lett. V.325(3). P.237-241

107. Pokholok D., Gudima S., Yesipov D., Dobrynin V., Rechinsky V., Kochetkov S. Interactions of the HIV-1 RT AZT-resistant mutant with substrates and AZT-TP. 1993. FEBS Lett. V.325(3). P.237-241

108. Popov S., Rexach M, Ratner L., Blobel G., Bukrinsky M. Viral protein R regulates docking of the HIV-1 preintegration complex to the nuclear pore complex. 1998. J. Biol. Chem. V.273(21). P. 13347-13352

109. Prichard M.N., Shipman C.h. A three-demensional model to analyze drug-drug interactions. 1990. Antiviral Res. V.14. P. 181-201

110. Pulgar V., Marin O., Meggio F., Allende C.C., Allende J.E., Pinna LA. Optimal sequences for non-phosphate-directed phosphorylation by protein kinase CK1 (casein kinase-l)--a re-evaluation. 1999. Eur. J. Biochem. V.260(2). P.520-526

111. Ren J., Esnouf R, Garman E., Somers D., Ross C., Kirby /., Keeling J., Darby G., Jones 7., Stuart D. High resolution structures of HIV-1 RT from four RT-inhibitor complexes. 1995. Nat. Struct. Biol. V.2(4). P.293-302

112. Res tie Т., Muller В., Goody R.S. RNAseH activiry of HIV-1 reverse transcriptases is confined exclusively to the dimeric forms. 1992. FEBS Lett. V.300. P. 97-100

113. Romero D.L. Advances in development of HIV reverse transcriptase inhibitors. 1994. Ann. Rep. Med Chem. V.29. P. 123-132

114. Suhnel J. Evaluation of synergism or antagonism for the combined action of antiviral agents. 1990. Antiviral Res. V.13. P.23-40

115. Schinazi R.F., C.hu C.K., Babu J.R., Oswald B.J., Saalmam V., Cannon D.L., Eriksson B.F.H., Nasr M. Anthraquinones as a new class of antiviral agents against human immunodeficiency vims. 1990. Antiviral Res. V. 13. P. 265-272

116. SekizaM'a Т., Yanagi K., Itoyama Y. Glycyrrhizin increases survival of mice with herpes simplex encephalitis. 2001. Acta Virol. V.45(l). P.51-54

117. Shibala Sh, Takanashi K., Yano S., Harada M., Saito H., Tamura Y., Kumagai A., Hirabayashi K., Yamamoto M., Nagata N. Chemical modification of glycyrrhetinic acid in relation to the biological activities. 1987. Chem. Pharm. Bull. V.35. P. 19101918

118. Shimoyama Y., Ohtaka H., Nagata N., Munakata #., Hayashi N., Ohtsuki K. Physiological correlation between glycyrrhizin, glycyrrhizin-binding lipoxygenase and casein kinase II. 1996. FEBS Lett. V.391. P.238-242.

119. Smith G.P., Petrenko V.A. Phage Display. 1997. Chem.Reviews. V.97. P.391-410

120. Scott J.K., Smith G.P. Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library. 1990. Science. V.249. P.386-390

121. Simmonds P., Balfe P., Ludlam C.A., Bishop J.O., Вгом'п A.J. Analysis of sequence diversity in hypervariable regions of the external glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. 1990. J. Virol. V.64(12). P.5840-5850

122. Smith G.P. 1992. Cloning in fuse vector: A laboratory manual. Division of Biological Sciences, Unuversity of Missouiy, Columbia

123. Suhnel J. Evaluation of synergism or antagonism for the combined action of antiviral agents. 1990. Antiviral research. V.13. P.23-40

124. Svinarchuk F.P.,Konevetz D.A., Phasunova J.F., Pokrovsty A.G., Vlassov V.V. Inhibition of HIV proliferation in MT4 cells by antisense oligonucleotide conjugated to lipophilic groups. 1993. Biochimie. V. 75. P.243-247

125. Tan G.T., Kinghorn A.D., Hughes S.H., Pezzuto J.M. Psychotrine and its O-methyl ether are selective inhibitors of human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase. 1991. J. Biol. Chem. V.266(35). P.23529-23536

126. Tan G.T., Pezzuto J.M., Kinghorn A.D., Hughes S.H. Evaluation of natural products as inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) reverse transcriptase. 1991. J. Nat. Prod. V.54(l). P.143-54

127. Tarrago-Litvak L., Andreola M.L., Nevinsky G.A., Sarih-Cottin L., Litvak S. The reverse transcriptase of HIV-1: from enzymology to therapeutic intervention. 1994. FASEB J. V.8(8). P.497-503

128. Thomson R.H. Naturally occuring quinones.III. Recent advances. N.Y. Chapman and Hall. 1987. P.732

129. Tochikura T.S., Nakashima H., Yamamoto N. Antiviral agents with activity against human retroviruses. 1989. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. V.2(5). P.441-447

130. Quan Y., Motakis D., BuckheitR. Jr., Xu Z.Q., FlavinM.T., PamiakM.A., Wainberg M.A. Sensitivity and resistance to (+)~calanolide A of wild-type and mutated forms of HIV-1 reverse transcriptase. 1999. Antivir Ther. V.(4). P.203-209

131. Ugolini S., Mondor .1, Sattentau Q.J. HIV-1 attachment: another look. 1999. Trends Microbiol. V.7(4). P. 144-149

132. Vlietinck A.J., De Bruyne Т., Apers S., Pieters L.A. Plant-derived leading compounds for chemotherapy of human immunodeficiency vims (HIV) infection. 1998. Planta Med. V.64(2). P.97-109

133. Vila J., Walker J.M., It arte E., Weber M.J., Sando J. Phosphorylation of protein kinase С by Casein kinase 1. 1989. FEBS Lett. V.255. P.205-208.

134. WongK., Cantley L.C. Cloning and characterization of a human phosphatidylinositol 4-kinase. 1994. J. Biol. Chem. V.269. P.28878-28884

135. Yuan X., Matsuda Z, Matsuda M., Essex M., Lee Т.Н. Human immunodeficiency vims vpr gene encodes a virion-associated protein. 1992. AIDS Res. Hum. Retroviruses. V.6(ll). P. 1265-1271

136. Zhang C.F., Nakamura N., Tewtrakul S., HattoriM., Sun Q.S., Wang Z.Т., Fujiwara T. Sesquiterpenes and alkaloids from Lindera chunii and their inhibitory activities against HIV-1 integrase. 2002. Chem. Pharm. Bull. V.50(9). P. 1195-12001. ОТ АВТОРА

137. Особая признательность научному руководителю и заведующему лабораторией ретровирусов Покровскому Андрею Георгиевичу, благодаря которому состоялась данная работа.

138. Исследования были выполнены при поддержке грантов Минобразования РФ «Фундаментальные исследования в области естественных наук» и гранта Международного Научного Технического Центра 1198-98.