Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунологические и биохимические методы детекции вирусов иммунодефицита человека I и II типа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммунологические и биохимические методы детекции вирусов иммунодефицита человека I и II типа"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ И Л\ Е И И Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

ЛУКАШОВ Владимир Владимирович

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ ВИРУСОВ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА I и II ТИПА

03.00.06 — вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

с

Москва 1990

Работа выполнена в Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР.

Научные руководители:

член-корреспондент АМН СССР профессор

С. М. Клименко,

старший научный сотрудник Э. В. Карамов.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Н. Н. Носик, кандидат биологических наук В. В. Зверев.

Ведущая организация — Институт микробиологии и эпидемиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР.

Защита диссертации состоится « . . . » . . . . 1991 года в 14 ч на заседании специализированного совета Д 001.20.01 при Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР (Москва, 123098, ул. Гамалеи, 16).

Автореферат разослан « . . . » . . . . 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

Актуальность проблемы

" В 1981 г. в С111Л были зафиксированы первые случаи нового, ранее не известного заболевания, позднее названного синдромом приобретенного иммунодефицита человека (СПИД).

Отсутствие эффективных средств профилактики и сам характер заболевания, имеющего длительный скрытый период, во время которого возможна передача этиологического агента СПИД - вируса иммунодефицита человека - от инфицированного лица другим людям, привели к широкому распространению этой болезни, которая зафиксирована сейчас в 157 странах. По оценке Всемирной Организации Здравоохранения, на сегодняшний день в мире насчитывается до 8 млн. инфицированных ВИЧ, число больных СПИД в ближайшие годы может достичь 1 млн. человек.

Важной мерой ограничения роста СПИД в мире является раннее и точное выявление вирусоносителей. Имеющиеся в настоящее время тест-системы для скрининга сывороток на наличие антител к ВИЧ обладают высокой чувствительностью, но большое число ложнополоэш-тельных результатов требует подтверждения данных первичного исследования в тестах второго уровня. Наибольшее распространение в качестве подтверждающего теста получил метод иммуноблотинга, однако и он не гарантирует абсолютной точности. ВОЗ рекомендует проводить серодиагностику СПИД несколькими независимыми методами и создание альтернативных иммуноблотингу экспертианых методов является важной задачей.

После идентификации ВИЧ в качестве нового ретровируса началось изучение ранее известных ингибиторов обратных транскриптаз в качестве средств химиотерапии СПИД. Важные результаты были получены при исследовании аналогов природных нуклеозидов. Наибольшее распространение в качестве средства для лечения СПИД получил ази-дотимидин. Этот препарат обладает высокой эффективностью в подавлении обратной транскриптазы ВИЧ, но не лишен недостатков, среди которых неос..одимо выделить высокую токсичность, прежде всего для клеток красного костного мозга'. Кроме того, от больных СПИД выделен ряд штаммов ВИЧ, устойчивых к действию азидотимидина, поэтому актуальной проблемой является разработка новых препаратов для химиотерапии СПИД.

Ш^ЖЛ-.-кЗЦЗ!!!! исследования

Целью настоящей работы била разработка метода раднсиммуноп-

рецкпитадии для серодиагностики СПИД, • апробация этого метода на референс-панелях сывороток крови и в ходе сероэпидемиоюгических . исследований и изучение действия ряда химиопрепаратов в качестве ингибиторов репродукции ВИЧ.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать экспертизный метод радиоиммунопреципитации с использованием ,2ь~1- и ^-меченого вьюокоочищениого антигена для определения антител' к индивидуальным белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Определить чувствительность и специфичность разработанного метода на панели референс-сывороток и в ходе сероэпидемиологических исследований.

2. Провести сравнительное изучение различных методов детекции антигена ВИЧ - определения обратнотранскриптазной активности, ELISA, непрямой иммунофлуоресценции. ,

3. Разработать клеточную модель для изучения действия противовирусных препаратов, изучить влияние ряда соединений на репродукцию ВИЧ.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан модифицированный метод радиоиммунопреципитации с использованием <2М- и ^S-меченого антигена для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2. '

2. При изучении панели референс-сывороток и в ходе сероэпидемиологических исследований групп риска установлено, что с помощью модифицированного метода радиоиммунопреципитации удается повысить надежность выявления антител к БИЧ по сравнению с имеющимися методами.

3. С помощью различных методов определения вируса изучены характеристики линий-продуцентов ВИЧ и разработана клеточная модель для скрининга анти-ВИЧ препаратов.

4. Изучено действие 2',3'-дидезоксинуклеозидов о (тимидина, аденозша, цитидина и гуанозина), их 5'-фосфитов и 5'-фосфитов 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов на репродукцию БИЧ. Показано, что '

а) исследованные ' аналоги монофосфатов модифицированных нуклеозидов эффективно ингибируот репродукцию ВИЧ и обеспечивают высокую-, степень зашиты клеток'от. цитоиатичоского действия вирусной инфекции;. ' ' . ' . . •' '. б) использование /суммы аналогр'в йетьряс приро?д!)ь:>:, нуклеоги-

дов обеспечивает высокую антивирусную активность и низкий цито-токсический эффект.

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате проведенных исследований разработаны модифицированные методы радиоиммунопреципитации с использованием 1гМ- и ^ Б-меченых антигенов для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-1 и ЕИЧ-2. При исследовании контрольных положительных и отрицательных сывороток и в ходе сероэпидемиологических исследований показано, что чувствительность и специфичность разработанных модификаций РИП превышают аналогичные характеристики коммерческих тест-систем, основанных на методе иммуноблотинга.

Показано,.что дожноположительные и ложноотрицателъные результаты тестирования сывороток в различных подтверждающих диаг-ностикумах Имеют различную причину. Сделан вывод, что для надежного выявления инфицированности ВИЧ необходимо использование, нескольких альтернативных конфирмационных тестов.

Показано, что характер перекрестных реакций между антигенами ВИЧ-2 и антителами к ВИЧ-1 при использовании метода радиоиммунопреципитации отличается от такового, показанного ранее для иммуноблотинга- С одной стороны, это затрудняет дифференциальную диагностику ВИЧ-1 и ВИЧ-2 инфекций методом РИП, но, с другой стороны, позволяет не пропустить случаи ВИЧ-2 инфекции при исследовании сывороток на антитела к ВИЧ-1.

При изучении производных нуклеозидов (2',3'-дидезоксинуклео-аидов и их 5'-фосфитов, а также 5' -фосфитов 3' -азидо-2', 3' -дидез-оксинуклеозидов (тимидина, аденозина, гуанозина, цитидина)) методами ИфА, обратнотранскриптазной реакции, • рекламирования показано; что изученные соединения эффективно ингибируют репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МГ-4. Применение б'-фосфитов позволяет снизить цитптоксичность препаратов и в ряде случаев повысить их антивирусную активность. Применение эквимолярной смеси четырех Б*-фосфитов азидонуклеоэидов позволяет повысить выживание клеток в инфицированной культуре по сравнению с отдельными препаратами.

Апробация работы

Основные результаты проведенных исследований были доложены

на конкурсах молодых ученых Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН ССОР (1988, 1989 гг.), на 1-ой Республиканской конференции молодых ученых-медиков Литовской ССР (г.Каунас, 1988 г.), на Республиканской конференции "Актуальные вопросы СПИД в Литовской ССР" (г.Каунас, 1988 г.), на III Всесоюзном совещании "Культивирование клеток человека и животных" (г. Пущино, 1990 г.)».на Республиканской конференции "Новые методы диагностики С1ВД и других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы" (УССР, г.Алушта, 1990 г.), на Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990 г.).

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 123 стр. машинописного текста и состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Выводы". Работа содержит 7 таблиц и 13 рисунков. Список литературы включает 166 наименований.

\

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка метода радиоиммунопреципитации для определена антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и оценка его репрезентативности

В настоящее время для серодиагностики СПИД в СССР испольау ются в качестве подтверждающих зарубежные коммерческие тест-сис темы, основанные на методе иммуноблотинга (ИВ). Как было показе но, метод ИБ не гарантирует 100Х надежности тестирования. На» был разработан альтернативный ИВ модифицированный метод радиои» мунопреципитации (РМ1) для определения антител к индивидуальш белкам ВИЧ -1 и БИЧ-2. •

При разработке метода.оценивалась возможность применения качестве антигена высокоочмценного препарата ВИЧ, меченого и лизата меченых г* 5-метионином клеток1 продуцентов ВИЧ. Изуч лась возможность использования различных хронически инфицирова

пых ВОТ клеточных линий в качестве источника вируса Определено, что отечествен!!;.;! моноцитарная линия ЭВК/ИРА-3 пригодна для создания на ее основе тест-систем для детекции АТ к ВИЧ-1.

Нами показано, что использование как Л25Ь, так и ^ 5-меченых антигенов ВИЧ-1 позволяет определять в исследуемых сыворотках антитела к следующим вирусным белкам: др120/1б0, рбб, р55/51, ВР41, р24, р17, однако частота определения антител к конкретным белкам неодинакова при использовании различным образом меченых препаратов ВИЧ.

Для сравнения характеристик двух модификаций метода радиоим-мунопреципитации (с использованием I и ^Э-меченых антигенов ВИЧ - РШ1-1 и РИП-Б) была исследована панель сьшороток, включающая 17 отрицательных образцов, 15 контрольных положительных сьшороток крови боданых СПИД иностранных граждан и 10 первичноположи-тедьных в ИФА сывороток, наличие антител к ВИЧ в которых не было подтверждена в ИБ.

Исследование панели положительных, сывороток показало, что. обе модификации РИП не уступают по своей чувствительности имму-ноблоту, а использование 415" 1-меченого антигена ВИЧ позволяет более надежно выявлять антитела к поверхностным белкам ВИЧ -вр120/160 и ет>41 (табл. 1).

Таблица 1. Выявляемость антител к конкретным белкам ВИЧ при тестировании 15 сывороток больных СПИД методами иммуноблотин-га и радиоиымунопреципитации.

метод выявлены антитела к:

тестирования ¡гр120/160 рбб р51/55 £Гр41 р31 р24 р17

иммуноблотинг

"Пи РогЛ" 10 13 15 12 ■ 14 15 13

РИП-1 15 11 13 15 13 15 13

РИП-Б - 12 14 15 15 15 14 10

Из 17 контрольных отрицательных сывороток, тестированных методом РИП, ни одна не реагировала с мечеными вирусными белками, в то время как в ИБ в одной из сывороток выявлялись антитела к белку ер120., Учитывая отрицательные результаты тестирования этой сы-

- б -

воротки б двух коммерческих ИФА и в РШ], . эта реакция была расценена нами как неспецифическая. . .

Наибольшие отличия i-'-nçqy двумя модификациями РИП бшп: об наружны при анализе 10 лошоположительных в 1Ш сывороток. Es исследование в ИБ не выявило наличия в них антител к каким-ллбс вирусным белкам; ' аналогичные результаты. были получены и в РИП-1. При тестирование.зке этих сывороток в РКП-S в 3 из них были обнаружены реакции с ;'ежами из области gpl20/160 и в 2 образцах - с бедками р55/51. Последующее исследование этих сывороток в агглю-тинационном тесте "Serodia" показало, что результаты РИП-S являются ложнополозштельными. Учитывая тот факт, что сыворотки stoi группы принадлежали лицам с аутоиммунными заболеваниями в анамнезе, дш. je фальшпозитивные реакции объясняются, по-видимому, неспецифическими реакциями с клеточными компонентами.

Поскольку основным подтверждающим тестом в_ серодиагностика СПИД является иммуноблотинг, мы сравнили чувствительность и спе> цифичкость предлагаемого нами метода рёдйоишунопреципитации i характеристиками коммерческого ИБ фирмы "Du Pont", США.

Сравнение методов проводили на панели сывороток, включаете 37 отрицательных и 214 положительных в ИФА "Organon" образцов. П данным ИБ все первичноположтельные сыворотки были разделены н три группы: 162 из них являлись истинно положительными, то ест имели антитела к спектру белков ВИЧ, достаточному для постановк диагноза ВИЧ-инфекции, 38 сывороток образовывали группу сомни тельных или "неопределяемых",. по терминологии ВОЗ, - в них опре делялись антитела лишь к отдельным вирусным белкам и 24 сыворотн были нами отнесены к группе ложнополоштельных, поскольку методе иммуноблотинга в них не выявлялись антитела к каким-либо белкг

вич. •

Охарактеризованные в ИВ "Du Pont" сыворотки были затем исс ледованы методом РШ с использованием <гс1-меченого препарата H Специфичность разработанного метода РИП определяли на naaej из 37 отрицательных в ИФА сывороток, включающей образцы, получе» ные от здоровых доноров крови (20 сывороток), лиц, перенесших аз тоиммунные. заболевания (5); 12 сывороток принадлежали не othoci щимея к группам риска СПИД людям, у которых было выявлено налич) HBs-антигена - сывороточного маркера вируса гепатита В

Исследование показало, что ни одна из отрицательных в И1 сывороток не давала положительных результатов ни в ИБ, ни в. РИ Сомнительные результаты имели в ИБ две сыворотки , (оба случая

слабые полосы в области gpl20/160). в ~ °Дна сыворотка

tep4l). Согласно литературным данным, при наличии отрицательных результатов в двух тестах ИФА такие сыворотки нужно считать отри-цателышми да:аз при наличии противоречащих данных ИВ, а результаты самого иммуноблота - не сомнительными, а ложноположительными. Таким образом, в наших исследованиях специфичность иммуноблота Ьсазалась равной 94,6%, в то время как специфичность разработанного метода РИП - 97,3%. Интересно, что ложнополомительные в ИЕ йиворотки при тестировании в РИП были отрицательными, что позволяет говорить о разных причинах ложноположительности обоих методов.

В различных исследованиях специфичность ИВ при тестировании панелей сывороток здоровых доноров крови составляет 95-100Х и снижается до 802 при использовании сывороток людей с аутоиммунными заболеваниями и реципиентов органов. Наиболее частыми ложнопо-гюзштельными результатами являются неспецифические реакции с бел-Йами р55/51 и кр41. В нашей работе ложноположительные результаты ЙВ были получены при исследовании сывороток беременной женщины и здорового донора,, а фалыппозитивный результат РИП принадлежал лицу, перенесшему ревматизм.

Чувствительность РИП определяли, используя 152 положительные i ИФА и ИВ сыворотки. Результаты тестирования этой панели приведены в табл. 2.

Таблица 2.л Сравнение результатов тестирования 152 контрольных положительных сывороток методами ИВ и РИП

метод выявлены антитела к:

Тестирования 6Р120/160 рбб P55/51 ¿р41 р31 р24 р17

иммуноблоти"г 130 129 148 148 118 150 110

рил' 152 119 150 150 110 152 ' 99

Все 152 положительные в ИВ сыворотки при тестировании их в РИП также давали положительные результаты. Сравнение выявляемости

антител к отдельным вирусным белкам показало, что РИП по сравнению с ИБ обладает большей чувствительностью к иммуноглобулинам, . направленным против поверхностных гликопротедаов ер120/160 БИЧ (частота определения антител к этому белку составила 100Х для РИП и только 86% - для ИБ). Методом РИП также лучше .выявлялись антитела к р55/51 и др41 (в 99% сывороток против 072 у ИБ). Достоверных отличий в чувствительности РИП и ИБ к антителам против р24 БИЧ при исследовании этой панели сывороток обнаружено не было. Ваэйко отметить, что антитела именно к этим вирусным белкам являются наиболее ценными с точки зрения постановки диагноза инфекции БИЧ, поэтому наши данные свидетельствуют в пользу большей информативности и надежности РИП по сравнению с ИБ, несмотря на несколько худшую выявляемость АТ к рбб, р31 и р17.

Чувствительность РИП и ИБ сравнивали также путем титрования контрольной положительной сыворотки. Результаты исследования приведены в табл. 3.

Таблица 3. Результаты титрования контрольной положительной сыворотки в РИП и ИБ. Указано максимальное разведение, в котором, определялись антитела к конкретно вирусным белкам

титр сыворотки, в котором определялись вирусный белок антитела-методом

иммуноблотинга радиоиммунопреципитации

ет>120/1б0 1/3200 1/25600

рбб 1/6400 1/1600

р55/51 1/3200 1/3200

ЙР41 1/12800 1/25600

р31 1/6400 1/3200

р24 1/6400 1/25600

р17 1/1600 1/400 '

Полученные данные показывают, что чувствительность РИП к антителам против конкретных . вирусных белков превышает таковую для ИБ по отношению к анти-ер120/1б0 в 8 раз, анти-гр41 -,в 2 раза и анти-р24 - в, 4 раза.' Тестированная положительной сыворотка давала, позитивный результат в РИП-при разведении ее -в.'25600 раз (выявля-

лксь антитела против gpl20/160, sp«. и р24), в то время как в ИВ максимальный титр составлял 6400 (реакции с белками рбб, ст>41, р31 и р24) - в 4 раза меньше.

Преимущества РИП перед ИВ определяются по меньшей мере двумя особенностями первого метода. При постановке реакции радиоимму-нопреципитации реакция антиген-антитело происходит в жидкой фазе, создающей лучзше условия для мультивалентного связьшания. Кроме того, вирусные белки в этой методике не подвергаются столь жесткой обработке, как это происходит в ИВ, что позволяет сохранятся конформации их антигенных эпитопов. Меньшая чувствительность ИБ по отношению к gpl20/160 объясняется и трудностями переноса этого белка на нитроцеллшозную мембрану.

Еще одним отмеченным нами преимуществом радиоиммунопреципи-тации является. значительно меньшее количество вирусного материала, необходимого для обследования одной сыворотки. Согласно литературным данным, иммуноблотинг требует 2-20 мкг препарата ВИЧ на пробу, для РИП это количество в нашем исследовании составляло около 1 t/кг. Таким образом, использование для получения меченого I препарата ВИЧ с помощью реакции с хлорамином Т не уступает по выходу продукта более распространенной методике с применением реактива Болтона-Хантера.

Среди преимуществ РИП необходимо отметить и большую ее экономичность по отношению к исследуемой сыворотке (расход сыворотки в 5-10 раз меньие, чем при тестировании в ИБ).

Использование метода радиоиммунопреципитации в сероэпидемиологических обследованиях групп риска для тестирования сывороток, имеющих сомнительные результаты иммуноблотинга •

. В работе были исследованы 38 сывороток крови людей, принадлежащих к группам риска СПИД и имеющих сомнительные или неопределяемые результаты иммуноблотинга при наличии положительных результатов И... Сыворотки были получены из районов СССР, в которых выявлялись случаи инфекции ВИЧ (Элиста, Волгоград, Астрахань, Ленинград, Таллинн, Вильнюс). Их исследование в ИБ проводили при помощи коммерческих тест-систем фирм "Bio Ràd" и "Du Pont", США.

Результаты тестирования этой панели сывороток приведены в табл. 4.

Из таблицы видно, что исследование 38 сомнительных в имму-. ноблоте сывороток методом РИП обнаружило в 24 из них спектр анти-

результаты тестирования в ИБ

результаты тестирования в РИП

заключение

13

14 •15 16 17 '18 •19 20 21 22

23

24

25

26

|р24, |£р41,

gpl20/160 gpl20/160

р24, р55/51

р24, gp41, р55/51, gpl20/160 р24, gp41, gpl20/160

р']7, р24, gp41, gp'120/160

р24, P55/51, рбб р24, gp41, р55/51, рбб, gpl20/160

р24

р17, р24 •р17, р55/51

р55/51

■ SP41

ер120 +-р24 +-, gp41

ЕГР41

-X

р24, igp41

gp41

ep4i,

р24.

£р41, gpl20/160

gpl20/160 р31, gp41, р55/51. gpl20/160

р24, ер41, gpl20/160 :

N

Табл. 4 Результат тестирования-положительных в ИФА и со тельнщ в иммуноблоте;;сывороток методом РИП. Оценка рез татов проводилась согласно критериям ВОЗ . г.;

тел к ВИЧ, достаточный для постановки диагноза инфекции этого вируса, и в 14 случаях не позволило окончательно ответить на этот вопрос. В некоторых случаях (сыворотки 5, б, 23, 25-27, 31, 32, 25, 37) радиоиммунопреципигация не выявляла антител к каким-либо вирусным белкам, хотя методом ИВ в них определялись анти-ВИЧ иммуноглобулины. В большинстве из этих сывороток выявлялись антитела против р55/51 и р17. Объяснением этих несовпадений результатов РШ и КЗ мокет служить несколько .меньшая чувствительность.РИП к антителам, направленным против внутренних белков вируса, однако, по нажму мнении, весы/а вероятно, что эти сыворотки являются анти-ВИЧ отрицательными, а результаты ИФА и ИВ - ложноположительны-ми. Окончательно выяснить этот вопрос могли бы повторные исследования сывороток этих лиц через несколько месяцев.

Анализ спектра антител сомнительных в ИБ сывороток свидетельствует о большей чувствительности РИП к антителам против поверхностных гликопротеинов ВИЧ. Действительно, иммуноглобулины этой направленности выявлялись в 24 сыворотках, то есть во всех образцах, признанных нами положительными, в то время как методом иммуноблота лишь в трех сыворотках определялись антитела к гр41, причем одна из этих сывороток была отрицательной в РИП. По нашему мнению, с учетом ранее приведенных данных о большей чувствительности РИП, этот -результат свидетельствует о ложноположительной реакции иммуноблотинга (сыворотка 37).

Нами была тестирована сыворотка пациента кожно-венерического диспансера г. Вильнюса Т., имевшая повторные положительные результаты тестирования в ИФА. Мэтодом иммуноблотинга в этой сыворотке определялись только анти-р55/51 антитела (см. табл.4, образец 28). При исследовании в РИП наш были выявлены антитела к р24, др41 и ер120/160, что дало основание для постановки диагноза инфекции ВИЧ. Повторное исследование сыворотки крови пациента Т. через три месяца методом ИВ также обнаружило в ней наличие антител к этим салкам.

Таким образом,. определение характеристик модифицированного метода РИП для определения антител к ВИЧ-1 и сравнение их с характеристиками коммерческого ИВ показало, что разработанная нами методика позволяет с большей чувствительностью и специфичностью выявлять антитела к ВИЧ. Ее применение на практике дает возможность дискриминировать сомнительные результаты иммуноблотинга на истинно- и ложноположительные.

' - 12 -

Определение антител к ВИЧ-2 методом радиоиммунопреципитации

При разработке метода радиоиммунопреципитации для определения антител к ВИЧ-2 в сыворотках крови наш был использован чгу1-меченый препарат ВИЧ-2, полученный из хронически инфицированной этим вирусом лимфобластоидной линии клеток человека CEM/LAV-2.

Нами показано,. что метод РИП позволяет в исследуемой сыво~ рсжке определить антитела против следующих белков ВИЧ-2: р1б, р26, рЗб, gp41, р50, рб8, ер140.

При исследовании контрольных положительных антисывороток против ВИЧ-1 было показано, что при использовании РИП возможны перекрестные реакции между антителами к ВИЧ-1 и антигенами ВИЧ-2, причем их характер значительно отличается от такового, показанного для иммуноблота. Как известно, сыворотки, положительные на ВИЧ-1, но не ВИЧ-2, в иммуноблоте обычно не реагирует с поверхностными гликопротеинами ВИЧ-2 и дают перекрестные реакции с внутренними белками ВИЧ-2. Применяя метод радиоиммунопреципитации, в 7 из 14 исследованных контрольных положительных на ВИЧ-1 человеческих сывороток мы обнаружили перекрестное реагирование с gp4i ВИЧ-2. Одна сыворотка реагировала также и с gpl40. Сыворотка крови кролика, иммунизированного ВИЧ-1, реагировала с gp41 и рб8 ВИЧ-2.

С другой стороны, наши результатьМюдтвервдают возможность перекрестных реакций между внутренними белками обоих вирусов. Из исследованных нами 14 сывороток в 7 обнаруживались реакции с р26, в двух - с р50 и в одной - с рб8.

Для определения возможности обратной перекрестной реакции (т.е. между антителами к ВИЧ-2 и антигенами ВИЧ-1) сыворотка, содержащая антитела к ВИЧ-2, была исследована в РИП с использованием радиоактивного препарата ВИЧ-1. Тестирование показало, что использование такой методики позволяет выявить антитела к gp41 и gpl20/16Q, что также не совпадает с литературными данными о дифференциальной диагностике ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с помощью иммуноблотинга.

На наш взгляд, полученные данные объясняются большей чувствительностью РИП к антителам против поверхностных иммуноглобулинов ВИЧ, что, с одной стороны, не позволяет или, по меньшей мере, затрудняет проведение дифференциальной диагностики ВИЧ-1 и ВИЧ-í инфекций методом РИП,.' но, с другой стороны, позволяет определит! не выявленные иммуноблотом антитела.. . , . ■ . .

Изучение влияния производных природных нуклеозидов и их 5'- фосфитов на репродукцию вируса иммунодефицита человека

Разработка клеточной модели для скрининга ингибиторов репродукции ВИЧ

Для создания экспериментальной модели с целью изучения действия препаратов, подавляющих обратную транскриптазу вируса иммунодефицита человека нами были исследованы пермиссивные для ВИЧ' лимфобластоидные линии МГ-4, Н9,'СЕМ, HUT и- моноцитарная линия клеток человека U937.

В работе был использован штамм 111В ВИЧ, инфекционную активность которого определяли на культуре МТ-4 по 50Х-ной гибели клеток на 7-е сутки после заражения.

Клетки заражали дозой вируса,, составляющей 1000 TCID-5Q. Динамику вирусной инфекции в различных клеточных линиях изучали, используя методы твердофазного иммуноферментного анализа, обратной транскрипции, непрямой иммунофлуоресценции, рекламирования, а также подсчетом числа живых и мертвых клеток.

Полученные данные показывают, что при использованной нами методике инфицирования ИФА и ОТР определяют появление вирусного материала в культуральной жидкости на 2-3 сутки после заражения клеток. Максимальное содержание вирусных белков в среде выявляется, начиная с 4-ых суток и связано с отпочковыванием от клеток новых вирионов. Второй пик содержания вирусного материала в среде наблюдается на 7-10 сутки и определяется главным образом высвобождением белков ВИЧ из разрушающихся клеток. Согласно полученным, данным, полная гибель клеток в культуре происходит на 10-12 сутки после начала инфекции. Использование метода рекламирования показало, что. нормальное образование клеточных кластеров в культуре нарушается уже на первые сутки, следовательно, этот метод способен зафиксировать наиболее ранние изменения, происходящие в ходе вирусной инфекции.

Из пяти изученных нами пермиссивных для ВИЧ клеточных культур наиболее продуктивными линиями были МГ-4 и СЕМ. Результаты непрямой иммунофлуоресценции показывают, что количество клеток, экспонирующих антигены ВИЧ на своей поверхности, достигает в этих клетках 70-90Х, в то время, как для других линий эти цифры значительно меньше. Кроме высокой продуктивности, преимуществом культуры МГ-4 является и возможность применения метода рекластрирова-

1пш, поэтому именно эта линия была использована нами в качестве модели для изучения действия препаратов, подавляющих репродукцию ВИЧ.

Мнгибирование репродукции ВИЧ в культуре клеток производными 2* ,3' -дидегюксинуклеозидов к их 5'-фосфитами

В работе было изучено действие 2' ,3'-дидезоксинуклеозидов (Т, А, в, С) и их 5'-фосфитов, а таете 5'-фосфитов 3'-азидо2' ,3'-дидезоксинуклеозидов на репродукцию ВИЧ в культуре клеток. Химическое строение и условные обозначения препаратов представлены на рис. 1.

Подавление репродукции ВИЧ 5'-фосфитами 3'-азидо-2',3*-диде-аоксинуклеозидов t

Действие IB-IVB и их эквимолярной смеси на репродукцию ВИЧ в 'культуре клеток МГ-4 оценивали на 4 и 7 сутки инфекции при помощи твердофазного иммуноферыентного анализа, методами рекластрирова-ния и определения обр&тнотранскриптазной активности, а также подсчетом числа жизнеспособных клеток.

Результаты исследований приведены в табл. 5 и 6 и на рис. 2.

Полученные данные показывают, что все четыре соединения проявляет высокую активность в подавлении репродукции вируса .иммунодефицита человека, при этом индекс селективности для них достаточно высок (особенно для IB). Этот показатель был выше для 1В по сравнению с AzT в 5 раз. По абсолютной активности в подавлении продукции БИЧ соединения этого ряда можно расположить в следующей порядке - JB > IIB > HIB > IVB, что несколько отличается от такового для соответствующих им нуклеозидов, хотя во всех случаях анти-ВИЧ активность фосфитов выше, чем у соответствующих нуклеозидов.

Отдельно необходимо отметить пониженную цитотоксичность суммы всех четырех фосфитов, которая в 2-2,5 раза меньше токсичности любого из препаратов. Хотя этот эффект не очень велик,, его, по-видимому, можно считать иллюстрацией в пользу того,- что искажение пула внутриклеточных нуклеозидов при применении индивидуального ингибитора ВИЧ является одной из причин, определяющих его

- IT-

h

обозначение препарата В R1 R2 название препарата

I тимин-1-ил H- Н- 2' ,3'-дидезокси-нуклеозид

II аденин-9-ил

III гуанин-9-ил

IV цитозин-1-ил

IA тимин-1-ил H- 0 -Р-ОН » н 5'-фосфит 2', 3'-дидезоксинуклео-зид

IIA аденин-9-ил

I IIA гуанин-9-ил

IVA цитозин-1-ил

IB тимин-1-ил 0 II -Р-ОН 1 н 5'-фосфит 3'-азидо 2',3'-ди-дезоксинуклеозид

IIB , аденин-9-ил

HIB , гуанин-9-ил

IVB цитозин-1-ил

AZT, A3T тимин-1-ил н- З'-азидо 2' ,3'-дезоксигимидин

Рис. 1' Строение; и условные обозначения исследованных в работе производных' нуклеозидов .''..-••.•'.'"

с О

с.О t~

-tu

n п w ы tj и и

14 Ii tJ

u г.

JSJ

u

M i-i f.! t.l U tsi

tt

fh

IÄ-I IM j

Я n >55 iM м а

1'.Д И Ei

ct М-Ш

ES WJ H"i'l/Müii"b3 ti.l-I 1,1.) I WJrHfe, im I Iii. ! 1(1 lii Ii !• wrw

Graph H Graph L eüäGraph К

accoma r* ,__u . 1

fi-ttsa о/ зи i J

EZZ3Gr5Ph I GZZiGf'dPh И ESGraph u ЕЭGraph F E23 Graph E EZSGraph' Б ШШGraph С £¿¿3 Graph В Graph R

сутки

■ Рис. 2. Ингибированио продукции ВИЧ-специфических антигенов в культуре клеток Ш-4 Б'-фосфитами 3'-азидо-2',3'-дидезоксинук-леозидов (данные ИФА)

по оси ординат - содержание антигенов ВИЧ, в Z от контроля А - контроль без препаратов . В,С - азидотимидш (соответственно 1 и 10 мкМ) D.E - IB ■ '

F.G - ¡¡8 H,I- I1IB J.K - IYB

L, М - сумма 4-ex фосфитов

Таблица 5. Результаты определения защитного действия 5'-фосфитов 3"-азидо-2" ,3'-дидезоксинуклеозидов методом регистрирования и подсчетом числа жизнеспособных клеток (в скобках указана ошибка измерения).

препарат концентрация, способность клеток ■ живые клетки, мкМ к рекластрированию в % на 7 суг.

4 сутки 7 сут^и

AzT

1 10

+++ ++

71 (3) 73 (3)

IB

1 10

+++ +++

+-+-

80 (6) 75 (4)

IIB

. 1 10

+4-++

72 (4) 70 (4)

HIB 1 +++ - 69 (5)

10 +++ - 68 (5)

IVB 1 +- - 68 (3)

10 ++ - 69 (4)

эквимолярная

смесь 4-х по 0,25 +++ + 72 (3)

фосфитов 2,5 +++ + 81 (3)

контроль

без - - - 19(2) препаратов

неинфициро-

ванные - +++. .+++• 96 (2)

■ клетки ' . ■ •

токсичность.

В табл. 5 приведены данные по определению активности фосфитов в ингибировании ' репродукции ВИЧ методом рекламирования. Под

действием вирусной инфекции нарушается характерный для линии Ш-4 процесс образования »слетками конгломератов - мастеров. ССосфиты Iß-IVB, подавляя репродукцию БИЧ, способствуют сохранению клеток в кластерном состоянии. Как видно из таблицы, все изученные препарат и проявляют свой защитный эффект до четвертых суток инфекции. IIa седьмые сутки инкубации ни ЛЗТ, ни IIB-IVB не обеспечивают нормального роста клеток. Определенный защитный эффект при использовании отдельных препаратов проявляет лишь IB. В то же время смесь четырех фосфитов способствует сохранению клеток с состоянии кластеров,

IIa рис.2 показано содержание вирусных антигенов в пробах с изучаемыми препаратами, определенное методом ЙФЛ. Количество вирусных белков при применении IB-IVB и их смеси существенно снижается по сравнению с контролем (столбик 1). Результаты ишуиофер-ментного анализа показывают, что' все фосфиты близки по эффективности, IB не уступает AzT, а остальные несколько слабее. Смесь фосфитов проявляет себе как наиболее сильный ингибитор; ее противовирусный эффект превосходит активность I и AsT.

Изучение действия 2' ,3' -дидезоксинукпеозядов и их б'-фосфи-" тов на репродукцию ВИЧ

Еще одним классом соединений, изученных нами в качестве ингибиторов репликации ВИЧ в культуре клеток, , являлись.2*,3'-диде-воксинуклеоэиды (Т, A, G, С) и их б'-фосфиту.

Результаты исследований приведены в тайл.6 и на рис.3.

Пэлученные данные показывают, что наученные соединения обладают выраженной ингибируодиы эффектом на репродукцию ВИЧ в культуре клеток, причем наиболее сильными антивирусными препаратами этого ряда являются IV и IVA, индекс селективности которых по своему порядку сравним с таковым для A3?. Использование препаратов III, IV, IA, 111А и IVA в концентрации-от од до 1 шШ обеспечивает более чем GOX-ное снижение содержания вирусных бедное в инфицированной культуре; для соединения I, II ara концентрат» составляет 1-10 мкМ. Хотя методом Щк нам не удалось выявить снижения продукции ВИЧ-специфических антигенов при использовании IIA в концентрациях до 10 мкЫ, данные OTP показывают, что и этот препарат ингибирует репродукцию ВИЧ ;

Сравнение ED-50 и индексов селективности изученных 5'-фосфитов и соответствующих нуклеозидов показывает, что использование

- ЛЧ

tm -

EfflGrsph Ь И=ёGraph G SSSGraph F EZZBGraph E ЕШ Graph D ESGraph С аЭGraph В BGraph П

Рис. 3. Ингибирование продукции антигенов ВИЧ в культуре клеток МГ-4 дидезоксинуклеозидами и их 5'-фосфитами ( на 7-е сутки после инфицирования)

по осй ординат - содержание антигенов ВИЧ, в 7. от контроля по оси абсцисс - концентрация препаратов, мкМ А - I •

В - II С - III

D - IY . ' ; ■

Е - IA • '

F - ПА ■* ■-'■.•■-.•

Q - ША

Н - IYA - • ."

Таблица 0. Определение цитотоксичности и антивирусной активности изучавшихся производных дидезоксинлшеозидов и их ¡3' -фосфитов.

(а) CD50 определяли подсчетом числа жизнеспособных клеток на 7 сутки культивирования в присутствии соответствующих препаратов

(б) Концентрацию препаратов, ингибирующую репродукцию ВИЧ на 50Х, определяли методом обратной транскрипции на 7 сутки после инфицирования клеток

С в) Индекс селективности - отношение CD50 к ED50

препарат CD50, ED50, индекс

мкМ мкМ селективности •

Ca) . (б) (в)

AzT 72 i 0,0? 1029

" I 180 1,23 146

11 235 14,1 17

Ш 222 8,0 28

" IV 115 0,06 1917

IA 136 1,31 104

ПА 205 9,2 22

II1A 202 . 4,6 44

IVA 212 0,12 1767

IB 102 0,02 5100 . .

IIB 104 0,3 347

IIIB 140 0,9 156

' IVB ' 104 >1 <104

смесь IB-IVB 250 0,09 2778

таких аналогов монофосфата для II и III позволяет повысить противовирусный эффект этих соединений. В случае IA наблюдается снижение активности, а анти-ВИЧ эффект IV и IVA приблизительно равен друг другу при несколько меньшей токсичности последнего.

Задача поиска более эффективных и менее токсичных производных 2',3'-дидезоксинуклеозидов напрямую связана с проблемой их кинирования до 5'-трифосфатов. Решение проблемы, во-первых,

возможно путем поиска таких замещающих группировок, введение'которых в 3'-положение деэоксирибозы повышало бы активность соединения в конкуренции аа связывание с киназами в сравнении с природными нуклеозидами и способствовало бы более успешному их трифосфорилированию.

Другим возможным подходом к решению проблемы является исследование аналогов монофосфатов производных нуклеозидов. Поскольку определяющим (наиболее медленным) этапом активирования нуклеозидов в трифосфат является присоединение первой фосфатной группы,• использование соединений, уже имеющих в 5*-положении группу, функционально заменяющую фосфатную, могло бы способствовать ускорению процесса ,

К настоящему времени в мире синтезированы и изучены в качестве ингибиторов ВИЧ несколько классов аналогов монофосфатов: 5'-фосфонометилены, метилфосфонаты и некоторые другие. В литературе имеются данные, свидетельствующие об анти-ВИЧ активности фосфономегиленовых производных по гидраксилу при С2(5)-9-(2' ,3'-диоксипропил)-аденина, 3' -азидо-дидезоксинуклеозидов, мегилфосфо-иата АгТ. Наш была изучена активность другого ряда аналогов монофосфатов - фосфитов (или фосфонатов) - нуклеозидов. Исследование показало высокую антивирусную активность фосфитов и снижение их цитотоксичности по сравнению с соответствующими нуклеозидами, что говорит о безусловной перспективности дальнейшего изучения аналогов монофосфатов производных нуклеозидов в качестве терапевтических средств в лечении СПИД.

Выводи

1. Разработан модифицированный метод радиоиммунопреципитации с использованием I- и ^Б-меченого антигена для определения

. антител к индивидуальным белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

2. При изучении панели референс-сывороток и в ходе сероэпи-демиологических исследований групп риска установлено, что с помощью модифицированного метода радиоиммунопреципитации удается повысить надежность выявления антител к ВИЧ по сравнению с имеющимися коммерческими тест-системами, основанными на методике им-муноблотинга.

3. Изучены вирусологические параметры пермиссивных для ВИЧ клеточных линий. Показаны преимущества использования линии МТ-4 в качестве модели для скрининга антивирусных препаратов.

4. Изучено действие отечественных препаратов - 2'-, 3'-дидезоксинуклеозидов (тимндика, аденозина, цитидина и гуанозина), их 5'-фосфитов и 5'-фосфитов 3'-азидо-2' ,3'-дидезоксинуклеозидов на репродукцию ВИЧ. Показано, что

а) исследованные соединения эффективно ингибируют репродукцию ВИЧ и обеспечивают высокую степень защиты клеток от цитопати-ческого действия вирусной инфекции;

б) использование суммы фосфитов четырех 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов приводит к снижению цитотоксического эффекта и обеспечивает высокую антивирусную активность.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Марушевская М.Е, Чаплинскас С. А., Горбачева А. П., Кожевникова Л. К., Лукашов ЕВ. и др. Модифицированный метод иммунобло-тинга для определения антител к ВИЧ. "Фундаментальные и прикладные вопросы проблемы СПИД". Сборник работ Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР. Ы. , 1988, стр. 157-1597

2. Чаплинскас С. А. , Родова М. А., Лукашов Е Е , Карамов Э. Е , Руднева И. А. Сравнение результатов тестирования панели сывороток разными тест-системами. "Сундаментальные и прикладные вопросы проблемы СПИД". Сборник работ Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР. И. , 1988, стр. 173-176.

3. Чаплинскас С. А.,. Шрушевская М. Е , Барсов Е. Е , Лукашов ЕЕ и др. Сравнительный анализ разрабатываемых тест-систем для определения'антител к БИЧ. Сборник научных трудов 1-ой Республиканской конференции молодых ученых-медиков. Каунас, 1989, стр. 9196.

4. Карамов Э. Е',. Чаплинскас С.А., Лукашов ЕЕ и др. Метода иммунохимической диагностики инфекции ВИЧ. Вопросы инфекционной патологии в Литве, 1989, н,231, стр. 156-159.

5. Лукашов Е Е , Слепушкин Е А., Горчакова Т. А., Горбачева А. П. Определение антител к ВИЧ методом радиоиммунопреципитации. Молекулярная биология и медицина. Всесоюзная школа-семинар. Ленинград, май 1990 г. Тезисы работ, 11, 1990, стр.96.

6. Лукашов Е Е , Горчакова Т. А., Атражева Е. Ш. Н-фосфонать азидонуклеозидов ингибируют репродукцию ВИЧ в культуре клеток. Молекулярная биология и медицина. Всесоюзная школа-семинар. . Ленинград, май 1990 г. Тезисы работ.' И., 1990, стр.121.

7. Чаплинскас С. А., Карамов Э. В., Лукашов ЕЕ и др. СПИД I

- 23 -

Литве. Здравоохранение, 1990, н. 3, стр. 19-23.

8. Гольдберг Е. 3. , Лукашов В. Е , Фаворов М. О. , Краевский A.A. и др. Ингибирование ДНК-полимеразы ВГВ человека производными нуклеозидтрифосфатов. Итоги науки и техники. Вирусология. Т. 22. U., 1990. Вирусные гепатиты. Материалы международного симпозиума, Ростов, 1990 г. стр. 40.

9. Лукашов а Е , Корнилаева Г. В., Руднева И. А., Горчакова Т. А., Карамов Э. В. Создание клеточной модели для скрининга препаратов, подавляющих репродукцию ВИЧ. Культивирование клеток-человека и животных. Материалы 111 Всесоюзного совещания, Пущино, 1990 Г., стр. 110-111.,

10. Карамов Э.В., Руднева И. А. , Лу}сашов Ей 'и др. Экспер-тизные методы диагностики СПИД с помощью перевиваемых клеточных линий, чувствительных к инфекции ВИЧ. Культивирование клеток человека и животных. Материалы 111. Всесоюзного совещания, Пущино, 1990 г., стр. 101-102.