Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности вируса гепатита C в острой и хронической стадиях инфекции и дифференциация стадий

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности вируса гепатита C в острой и хронической стадиях инфекции и дифференциация стадий"

005536094

Астраханцева Ирина Владимировна

ОСОБЕННОСТИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С В ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ СТАДИЯХ ИНФЕКЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ

СТАДИЙ

03.02.02 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

31 ОКТ 2013

Нижний Новгород - 2013

005536094

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» и в Центре по контролю и предотвращению заболеваний г. Атланта, США

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор, директор НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ФГБОУ ВПО ННГУ, зав. кафедрой молекулярной биологии и иммунологии ФГОУ ВПО ННГУ им. Н.И. Лобачевского

Новиков Виктор Владимирович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории клеточной

инженерии ФГБУ «НИИ вирусологии им. Кущ длла Александровна

Д.И. Ивановского»

Доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией вирусных гепатитов ФГУН НИИ эпидемиологии им. Ак. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, профессор кафедры эпидемиологии ФГБОУ «Нижегородская медицинская академия»

Быстрова Татьяна Николаевна

Ведущая организация: ФГБУ «Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»

Защита состоится «¿О » И-О&бьмЯ^ 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д208.131.01 в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, г.Москва, ул. Гамалеи, д. 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России

Автореферат разослан 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Около 170 миллионов человек в мире больны вирусным гепатитом С, который может быть причиной цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Возбудитель этого широко распространенного заболевания - вирус гепатита С (ВГС) - передается парентерально и на сегодняшний день является основной причиной посттрансфузионных гепатитов [Alter M., 2007].

ВГС является имеющим оболочку РНК-содержащим вирусом, принадлежащим к семейству Flaviviridae [Choo Q., 1989]. На всех стадиях заболевания существует как гетерогенная популяция различных, но близкородственных вирусных частиц, относящихся к так называемым квазивидам [Afonso A.M., 1999]. Гетерогенность популяции способствует быстрой селекции мутантов, более приспособленных к иммунному ответу организма хозяина, и формированию хронической инфекции [Penin F., 2001]. РНК вируса гепатита С остается на детектируемом уровне в крови и печени на протяжении более чем 20 лет у 85% инфицированных пациентов [Alberti А., 1999]. Острая инфекция у большинства пациентов протекает бессимптомно, только около 25-30% пациентов с острым гепатитом С спонтанно элиминирует вирус [Maheshawari А., 2008]. Если вирус персистирует в организме более чем 6 месяцев, то заболевание считается перешедшим в хроническую форму.

Квазивиды формируются благодаря высокой вариабельности отдельных участков генома вируса, в частности генов, кодирующих поверхностные белки El и Е2. Наиболее высокая вариабельность характерна для региона, называемого HVR1 и локализованного на N-конце белка Е2 [Afonso A.M., 1999]. Данный регион содержит 27 аминокислот и формирует главный поверхностный антиген вируса, являющийся также доминантным эпитопом для нейтрализующих антител [Farci Р., 1994, 1996, Shimizu Y.K., 1994,1997, Zibert А., 1997].

Высокая вариабельность HVR1 последовательностей коррелирует с появлением мутантов, позволяющих вирусу избегать иммунного ответа, и играет важную роль в поддержании персистенции вируса во время хронической инфекции [Erickson A.L., 2001, Shimizu Y.K., 1997, Kurosaki M., 1994, McAllister J., 1998, Van Doom L„ 1995, Weiner A., 1995]. Кроме того, уровень и природа замен в HVR1 в период ранней стадии инфекции коррелирует с исходом заболевания [Farci Р., 2000]. Считается, что вариабельность нейтрализующих эпитопов является одной из причин, затрудняющих создание вакцины против вирусного гепатита С, однако,

3

А.

несмотря на высокую вариабельность этого участка, показано присутствие сильной негативной селекции против некоторых аминокислотных замен, обеспечивающей консервативность аминокислот в отдельных положениях, что указывает на важную биологическую роль HVR1 в жизненном цикле вируса. Таким образом, характеристика популяции квазивидов ВГС и их свойств на разных этапах заболевания важна для понимания их биологического значения при остром и хроническом гепатитах С, что может помочь в создании вакцины [Chen S., 2007].

Дифференциальная диагностика стадий острого гепатита С от хронического важна для успешной терапии больных. Терапия а-ИНФ-2Ь и рибавирином, начатая на начальной стадии инфекции, ведет к излечению инфекции в 98% случаев. Успешный исход терапии, начатой в хронической стадии заболевания, наблюдается только в 42-82% случаев [Pawlotsky J., 2006]. Ни один из таких маркеров как РНК вируса гепатита С, антитела к ВГС класса IgG, увеличение активности аланиноаминотрансферазы в сыворотке или плазме крови [Daniels D.S., 2007] не может быть использован для детекции острой инфекции, т.к. все эти маркеры могут быть обнаружены также при хронической форме заболевания. Кроме того, дифференциальная диагностика острой и хронической инфекции, основанная на клинической симптоматике, оценке эпидеомиологических факторов риска, не всегда эффективна, поскольку у большинства больных острым гепатитом С заболевание протекает бессимптомно [Pawlotsky J., 2006, Chung R.T., 2005]. Такие методы, как определение анти-ВГС IgM [Coppola N., 2009, Chen R.J., 1992], измерение анти-ВГС IgG авидности [Klimashevskaya S., 2007] и последовательное определение титра вируса в крови [McGovern В.Н., 2009] были предложены как маркеры острой ВГС-инфекции. Польза анти-ВГС IgM, как маркера острой инфекции остается противоречивой [Coppola N., 2009, Chen R.J., 1992]. Другие методы, предполагают использование изменений в концентрации вируса для определения острой инфекции, но требует отбора нескольких образцов крови в определенные промежутки времени [McGovern В.Н., 2009, Николаева Н.И., 2006]. Исходя из приведенных выше данных существует необходимость в создании новых тестов и алгоритмов, позволяющих с достаточной точностью дифференцировать острое бессимптомное течение вирусного гепатита С от хронического.

Цель работы: Провести сравнительный анализ аминокислотных последовательностей гипервариабельного участка HVR1 белка Е2 изолятов вируса гепатита С и на основе полученных данных разработать новые

подходы к дифференциальной диагностике острого и хронического гепатита С.

Задачи исследования:

1. Осуществить сравнительную характеристику вариаций аминокислотных последовательностей НУШ белка Е2 при остром и хроническом вирусном гепатите С.

2. Оценить свойства НУШ белка Е2 квазивидов вируса при острой и хронической формах вирусного гепатита С.

3. Изучить влияние сероконверсии на изменения в популяции квазивидов вируса гепатита С.

4. Разработать мультиплексные тесты на базе технологии Ьшшпех (анти-ВГС

и анти-ВГС ^М) для детекции гуморального ответа на структурные и неструктурные белки вируса гепатита С.

5. Создать модели для дифференциальной диагностики острой и хронической стадий вирусного гепатита С.

Научная новизна. Впервые были оценены свойства гипервариабельного участка 1 белка Е2 вируса гепатита С на разных стадиях инфекции для выявления направления эволюции вирусных квазивидов на острой и хронической стадиях заболевания. При сравнении 10 показателей, отражающих биохимические и физико-химические свойства указанного участка аминокислотной последовательности белка Е2, обнаружены статистические значимые различия между изолятами вируса, полученными от больных острым и хроническим гепатитом С. Кроме того, впервые выявлены статистически значимые различия по каждому из следующих свойств: количество основных аминокислот в сегменте, изоэлектрическая точка, объем, заряд сети, доступная площадь поверхности, полярность, и гидрофобность. Впервые на основе информации о свойствах аминокислотных последовательностей НУШ была построена модель, применимая для разделения изолятов вируса гепатита С на две группы, соответствующие острой и хронической стадии гепатита С. По указанным свойствам участков НУШ модель позволяет проводить дифференциальную диагностику острой и хронической стадий инфекции с точностью, равной 88%.

Впервые были обнаружены значимые различия между популяциями квазивидов у пациентов с острой и хронической инфекцией. Кроме этого обнаружено пять аминокислотных позиций НУШ, которые вносят значительный вклад в дифференциацию стадий.

Впервые на основе технологии Ьштпех разработан мультиплексный тест для определения анти-ВГС и ^М против структурных и

неструктурных белков ВГС. Данный тест позволяет при минимальных

затратах образца (Ijjji плазмы или сыворотки крови) определять антитела против восьми антигенов в одной лунке.

Результаты данных тестов использованы для разработки алгоритма на основе модели логистической регрессии для дифференциальной диагностики стадий острого и хронического гепатита С. Точность модели составила 90,8% для образцов плазмы крови больных острым гепатитом С и 97,2% для образцов плазмы крови больных с хронической стадией инфекции.

Научно-практическая ценность. Обнаружены существенно значимые отличия физико-химических и биохимических свойств участка HVR1 белка Е2 изолятов вируса гепатита С, характерные для больных острой и хронической формами вирусного гепатита С, которые позволили построить модель для дифференцировки стадий заболевания. Данная модель может быть использована в исследованиях процессов эволюции вируса в организме хозяина, при разработке вакцин против вирусного гепатита С. Разработан иммунологический тест для дифференциальной диагностики острой и хронической стадий вирусного гепатита С, который применим для мониторинга интерферонотерапии вирусного гепатита С, поскольку лечение а-ИНФ-2Ь и рибавирином, начатое на начальной стадии инфекции, намного эффективнее в сравнении с терапией, проводимой в хронической стадии заболевания. Тест позволяет проводить диагностику при минимальных затратах плазмы или сыворотки крови.

Положения, выносимые на защиту:

1. При прогрессировании вирусного гепатита С от острой к хронической стадии изменяются биохимические свойства гипервариабельного участка 1.

2. При прогрессировании инфекции вирусного гепатита С от острой к хронической стадий изменяются молекулярные свойства гипервариабельного участка 1.

3. Специфическая реактивность IgG против структурных и неструктурных белков вируса позволяет дифференцировать острую и хроническую стадии вирусного гепатита С.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации доложены на конференции Emerging Technologies of Medical Importance for the Diagnosis of Infectious Diseases and the Detection of Pathogenic Microbes (Пекин, Китай 2008), на 15-том Международном Симпозиуме Гепатита С и родственных вирусов ( International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses) (Сан Антонио, Техас, США, 2008), на 10-ой международной конференции молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетике инфекционный заболеваний (International Conference

on Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics of Infectious Diseases) (Амстердам, Нидерланды, 2010), на международной конференции по биоинформатике и биомедицине (ВIBM) (Атланта, Джорджия, США, 2011), на 20-том Международном Симпозиуме Гепатита С и родственных вирусов (International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses) (Мельбурн, Австралия, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МинОбрНауки России для публикаций основных результатов исследования.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 130 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 8 таблицами, включая 3 таблицы приложения. Список цитируемой литературы состоит из 186 источников.

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и интерпретирован лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Образцы. В работе использовано 26 коммерческих анти-ВГС сероконверсионных панелей, одиннадцать из которых получены от компании Zeptometrix (Buffalo, США) [кат. №: 6211, 6212, 6213, 6214, 6215, 6228 9041,9046, 9047, 9054, 9055, 9058], 5 от компании NABI (Boca Raton, США) [кат. №: 10, 20, 30, 40, 60], 5 панелей - от Serologicals (Clarkston, США) [кат. №: 4212, 4812В, 4813, 4814, 4814В], 3 панели [кат. №: 908, 920, 921 ] от компании Seracare, Inc (West Bridgewater, США), и 2 панели - от компании Profile Diagnostic (Sherman Oaks, США) [кат. №: RP006, RP040], Каждая панель представляла собой образцы плазмы крови, взятые через определенные интервалы времени у доноров, у которых наблюдалась сероконверсия анти-ВГС антител, что позволило отнести данные образцы к образцам, соответствующим группе «Острый гепатит С». Два образца было получено от компании Complex Antibody Inc. (Флорида, США). В них была обнаружена РНК вируса при отсутствии анти-ВГС антител, что позволило их также отнести к группе образцов, полученных от больных с недавней ВГС-инфекцией и обозначенной как «Острый гепатит С». У всех доноров не наблюдалось клинических симптомов гепатита и они не подвергались антивирусной терапии.

Коллекция плазмы крови больных хроническим гепатитом С включала в себя 141 образец. 64 образца плазмы крови было получено от компании

Seracare, Inc. и 77 - от Американского Красного Креста. Все образцы были анти-ВГС IgG положительны согласно тесту RIBA и имели определяемый уровень РНК вируса.

Было использовано также 15 образцов плазмы крови пациентов, спонтанно выздоровевших от ВГС-инфекции [Klimashevskaya S., 2007]. Коллекция была получена из Института исследования системы крови (Blood Systems Researsh Institute, Сан-Франциско, США). Образцы были положительны на анти-ВГС антитела, но РНК ВГС не детектировалась с момента взятия образца крови на протяжении 72 недель.

В качестве контрольной группы были использованы 100 образцов плазмы крови доноров, отрицательных на все маркеры гепатитов А, В, С и ВИЧ (Complex Antibody, Incorp., Флорида, США).

Все вышеописанные образцы были использованы для разработки и оценки мультиплексных диагностических тестов.

Для исследования биохимических и молекулярных свойств гипервариабельного участка были проанализированы изоляты из 172 образцов плазмы крови.

Было использовано восемнадцать образцов от 10 сероконверсионных панелей компании Zeptometrix (Буффало, США) и два образца, полученных от компании Complex Antibody Inc.. Из каждой из восьми сероконверсионных панелей (кат. № 6212, 6213, 6214, 6215, 6228, 9041, 9047 и 9058, далее в тексте Z1-Z8, соответственно) было отобрано по два образца: один образец до начала сероконверсии в период определяемой виремии и один после сероконверсии анти-ВГС антител. Из двух панелей (кат. № 9046, 9054) были использованы только образцы после начала сероконверсии, т.к. образцы периода сероконверсионного окна были недоступны. Шесть образцов плазмы крови из колекции Seracare, Inc. и 89 образцов плазмы крови, отобранные в ходе эпидеомилогических исследований [Campo D., 2012], представляли собой группу образцов, полученных от лиц с хроническим гепатитом С.

Кроме того, из ранее опубликованных источников была использована информация о квазивидах, полученных из изолятов 37 пациентов с острым гепатитом С [Farci Р., 2000; Herring, 2005; Liu L., 2010; von Hahn, 2007] и шести с хроническим [Herring, 2005].

Группа «Острый гепатит С» включала в себя 1120 клонированных последовательностей, группа «Хронический гепати С» - 1479 клонированных последовательностей.

Пептиды HVR1. Пептиды, соответствующие регионам HVR1, охарактеризованным у различных пациентов с острым гепатитом С, были протестированы на реактивность с антителами класса IgG больных вирусным гепатитом С. С этой целью было синтезировано 70 пептидов, длиной в 31 аминокислоту, включающих в себя последовательности, соответствующие гипервариабельным участкам 1, принадлежащим разным вариантам

квазивидов, выявленным в изолятах восьми сероконверсионных панелей (Z1-Z8). Кроме того, для изучения кроссреактивности антител было протестировано 324 описанных ранее пептида, построенных из 31 аминокислоты и соответствующих региону HVR1 [Campo D., 2012]. Для контроля неспецифического связывания был протестирован 31 не-ВГС пептид.

Рекомбинантные ВГС антигены. Антигены были получены от ООО «НПО «Диагностические системы», г.Нижний Новгород:

1. Кор белок, аа 1 -100, генопит 1Ь, кат.№ АНСV111

2. NS3#201, аа 1192-1459 , генотип lb, кат№ AHCV201

3. NS3#207, аа 1356-1459, генотип 1а, кат.№ AHCV207

4. NS3#208, аа 1356-1459, генотип lb, кат.№ AHCV208

5. NS3#210, аа 1356-1459, генотип 2с, кат.№ AHCV210

6. NS3#215, аа 1356-1459, генотип 1с, кат.№ AHCV215

7. NS4, аа 1691-1710, 1712-1733, 1921-1940, генотип 1,2,3,5, кат.№

AHCV300

8. NS5, аа 2212-2312, генотип lb, кат.№ AHCV402

Лабораторные методы.

Выделение РНК, обратная транскрипция. Выделение нуклеиновых кислот из образцов плазмы было произведено с помощью Roche MagNa Pure LC инструмента и набора реагентов MagNa Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche Diagnostic, Mannheim, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Для получения кДНК обратная транскрипция была произведена с помощью универсального и специфичного праймеров, как было описано ранее [Ramachandran S., 2008].

Клонирование методом ограниченных разведений ПЦР и RT-гнездовое ПЦР. Метод ограниченных разведений, позволяет амплифицировать единичную молекулу ДНК. Для этой цели кДНК разводится до концентрации, при которой около 50% реакций (из 100 повторов), не производят ПЦР продукта. Для первого раунда амплификации HVR1 использовались праймеры: Fl-TGGCTTGGGATATGATGATGAACT и R1-GCAGTCCTGTTGATGTGCCA. Затем был проведен второй раунд ПЦР с использованием праймеров F2-GGATATGATGATGAACTGGT и R2-ATGTGCCAGCTGCCGTTGGTGT. Ампликон был секвенирован с использование набора реагентов BigDye v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CIIIA), и автоматического секвенатора 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Полученные последовательности были выровнены относительно друг друга, далее был выделен участок в 87 нуклеотидных оснований, соответствующий HVR1. Число полученных клонов зависело от титра вируса в образце и в среднем составляло 29±9. Предварительный анализ

последовательностей производился с помощью программ Lasergene DNA & Protein analysis software (Version 8.0, DNASTAR Inc., Madison, WI).

Иммуноферментный метод определения антител против HVR1. Пептиды в концентрации 10 цг/мл, разведенные в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСР-буфер), были сорбированы в лунках 324-луночного планшета (Corning Incorporated Costar, Нью-Йорк, США), который инкубировался в течение 16 часов при температуре 4°С. После окончания инкубации планшет промыли пять раз ФСР-буфером с добавлением 0,5% Твина-20. Разведенная в 500 раз плазма крови была добавлена в лунки планшета и инкубирована в течение 90 минут при температуре 37°С. В качестве коньюгата были взяты мышиные антитела против IgG человека (Сорбент-Сервис, Москва, Россия). Реакция была проявлена с помощью раствора тераметилбензидина (ТМБ) (ООО НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород, Россия). Оптическая плотность была измерена при длине волны 450 - 605 нм.

Мультиплексная система Luminex. Мультиплексный тест был представлен смесью 8 микросфер, связанных с 8 рекомбинантными антигенами ВГС (ООО «НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород). Белки были ковалентно связаны с микросферами стандартной методикой. При проведении анти-ВГС мультиплексного теста в каждую лунку планшета добавляли по 2000 микросфер, связанных с разными антигенами. В качестве коньюгата использовали антитела против IgG или IgM человека, меченные биотином (Jackson Immuno Research West Grove, США). Реакцию проявляли стрептавидином меченным R-фикоэритрином.

Интенсивность флуоресценции была измерена на аппарате Luminex 100 (Qiagen, Valencia, США) с программным обеспечением MasterPlex СТ vl.O (MiraiBio, San Francisco, США). Все измерения были произведены в двух повторностях, после чего интенсивность флуоресценции была усреднена (МИФ). Коэффициент позитивности был рассчитан как отношение МИФ образца к критическому значению.

Статистическая обработка результатов.

Положительное давление эволюции. Наиболее часто встречающийся подход к определению положительного давления эволюции включает в себя оценку отношения несинонимичных мутаций (dN) к синонимичным (dS). В нашем исследовании мы использовали метод фиксированных эффектов и расчетный метод SLAC (Single-Likelihood Ancestor Counting). Пакет программ, с помощью которых производился расчет, находится в свободном доступе на сайте http://www.datamonkey.org.

Анализ молекулярных дисперсий. Чтобы оценить степень гетерогенности квазивидов в каждом изоляте была рассчитана дивергенция методом Nei и Li (AMOVA) [Nei М„ 1979]. Для выявления аминокислотных

отличий между квазивидами изолятов двух групп и для оценки различий в частоте встречаемости той или иной аминокислоты была проанализирована генетическая структура последовательностей квазивидов. Результаты оценки были представлены, как коэффициент <Dst (аналог Fst). Расчеты производились с помощью пакета программ ARLEQUIN (http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3).

Построение филогенетических деревьев «методом объединения соседей». С целью визуализации аминокислотных изменений между квазивидами внутри пациента были построены филогенетические деревья. Для этого был применен метод объединения соседей (MJN) с помощью пакета программ NETWORK 4.0 (www.fluxus-engineering.com).

Анализ биохимических свойств последовательностей. Каждая последовательность HVR1 была трансформирована в последовательность цифровых значений соостветсвующих 10-и свойствам: гидрофобности, объему, полярности, заряду, изоэлектрической точки, гибкости, возможности формирования ß-структуры, возможности формирования а-спирали, доступности поверхности, стурктурных особенностей белка и присутствия основных аминокислот. После этого была произведена оценка значимости различий между группами «Острый гепатит С» и «Хронический гепатит С» используя критерий различия a priori выделенных групп (метод MRPP). Расчет данного метода производился с помощью программного обеспечения MATLAB, используя метод перестановок (п=10000). Тест производился для каждой переменной (одного свойства) и для всех переменных вместе (всех 10 свойств). Для оценки вклада переменной в разделение изолятов на группы использовались стандартизированные коэффициенты дискриминантных функций и обычную в таких случаях F-статистику - отношение межгрупповой дисперсии к внутригрупповой.

Картирование биохимических свойств и классификация групп. Картирование биохимическийх свойств последовательностей было проведено с помощью метода RadViz. Это нелинейная многомерная техника визуализации данных, способная представить данные полученные по нескольким осям измерения в двумерном пространстве. Для этой цели консенсусная последовательность каждого изолята была трансформирована в последовательность цифровых значений, соответствующих 10 свойствам описанным выше. Прогностическая способность модели была оценена процедурой скользящего контроля методом контроля по отдельным объектам. Данные методы были выполнены с помощью пакета программ ORANGE [122, 123] (http://orange.biolab.si).

Обработка данных мультиплексного теста Luminex. Т.к. от сероконверсионных панелей было получено несколько образцов плазмы крови, то был расчитан средний коэффициент позитивности для каждого антигена каждой панели. F-тест был применен для сравнения групп, который

считался статистически значимым при pO.OOl. Анализ был произведен с помощью пакета программ SAS (SAS Institute, Сагу, США). Для классификации образцов как принадлежщих, к какой либо из групп была использована мультивариантная логистическая регрессионая модель, построенная с помощью программного обеспечения MATLAB. Проверка прогностической способности модели была проведена с помощью процедуры скользящего контроля методом контроля по отдельным объектам. Точность прогностической способности модели в случае сероконверсионных панелей рассчитывалась, как процент правильно классифицированных образцов к общему числу тестируемых образцов панели. Результат точности модели был представлен как среднее в каждой группе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Генетическая структура квазивидов. На первом этапе работы были охарактеризованы последовательности региона HVR1 изолятов квазивидов, полученных от больных острым и хроническим вирусным гепатитом С. Дивергенция аминокислотных последовательностей регионов HVR1 квазивидов, выделенных из образцов плазмы крови больных хроническим вирусным гепатитом С, была статистически значимо выше уровня различий (дивергенции) аминокислотных последовательностей региона HVR1 квазивидов в образцах плазмы крови больных острым гепатитом С (р=0,008; ДИ 95%: 0,07-0,11 и 0,02-0,07, соответственно). Аминокислотная дивергентность в 23-х позициях статистически значимо различается между образцами крови, полученных от больных острым и хроническим вирусным гепатитом С (рис.1). Были проанализированы последовательности региона HVR1 квазивидов в изолятах 19 пациентов с острой инфекцией, отобранных до и после появления анти-ВГС антител (8 образцов плазмы крови из сероконверсионных панелей и 11 образцов описанных Farci Р. (2000). Аминокислотная дивергенция региона HVR1 квазивидов, полученных из изолятов с острой инфекцией после сероконверсии (появления антител), была в два раза выше, чем у образцов с острой инфекцией до появления антител (р=0,0467).

Величина соотношения dN/dS для HVR1 статистически значимо не различалась между группами (р=0,065). Однако мы обнаружили 24 изолята, полученные от больных хроническим гепатитом С, и 2 изолята от больных с острым гепатитом С, у которых отдельные аминокислотные позиции HVR1 находились под воздействием положительного отбора. Отсутствие отбора или слабое его действие на данный регион генома ВГС во время ранней стадии инфекции, вероятно, объясняется либо отсутствием, либо слабой авидностью анти-HVRl антител [Coppola, 2007; Klimashevskaya S., 2007]. Brown и соавт. [2007] в своем исследовании при изучении четырех генотипов

ВГС обнаружили 6 аминокислотных позиций HVR1 (позиции 1, 8, 12, 14, 21 и 22), находящиеся под воздействием положительного отбора. Хотя бы одна из этих позиций находилась под воздействием положительного отбора у 15 изолятов с хронической ВГС-инфекцией. Позиции 14 и 21 находились под воздействием положительного отбора в 2 изолятах с острой ВГС-инфекцией. Lara и соавт. [2011] также описали пять позиций HVR1 (8, 11, 14, 17, 18), изменения которых коррелируют с успешным излечением после антивирусной интерферонотерапии. Было обнаружено, что позиции 11 и 17 подвергались положительному отбору в 5 изолятах, выделенных от пациентов с хронической формой вирусного гепатита С.

0,3

л н

и

8 0,25

н S

о и

С. 0,2

й

п

К 0.15

X

сайты HVR1

Рисунок 1. Аминокислотная дивергенция позиций региона НУЯ1. Показано среднее значение дивергентности для каждой группы. Серый цвет характеризует изоляты, полученные от больных с острым гепатитом С, черный цвет - от больных с хроническим гепатитом С.

В поиске доказательств адаптивных изменений под воздействием иммунного ответа, формирущегося при вирусном гепатите С, была исследована возможность воздействия положительного эволюционного отбора в изолятах, полученных от больных острым гепатитом С до и после сероконверсии (п=19). Обнаружено, что у пяти пациентов одна или две позиции (8, 14, 17 и 21) находились под воздействием положительного отбора.

Различия между изолятами, полученными от больных с острым и хроническим гепатитом С, были оценены с помощью метода АМОУА. Была

обнаружена небольшая, но статистически достоверная разница между группами (1,18%, р=0,0003). Частота вариаций аминокислот на 5 позициях (рис.2) статистически отличалась в зависимости от стадии ВГС-инфекции. Это позиции 5 (4,71% вариаций, р=0,02), 7 (1,76% вариаций, р=0,04), 12 (4,49% вариаций, р=0,002), 16 (4,2% вариаций, р=0,02) и 18 (4,54% вариаций, р=0,00"^._____

и

сайты Н\"Ш

Рисунок 2. Анализ молекулярных дисперсий по отдельныйм позициям НУШ. По оси X показан процент генетических вариаций. Представлены только позиции со статистически значимыми вариациями (р<0,05).

100

10 1 ■ Вся выборка

■ Генотип 1

Внутри Внутри Между образца группы группами

Рисунок 3. Оценка вариаций между популяциями квазивидов методом молекулярных дисперсий

Т.о. были обнаружены небольшие, но статистически значимые вариации в строении вариантов НУШ, которые были ассоциированы со стадией заболевания. Эти различия были существенны для некоторых

аминокислотных позиций HVR1, но не были связаны с принадлежностью вируса к генотипу. Паттерн различий не изменился, когда анализ был отдельно проведен только для изолятов, принадлежащих к генотипу 1 (рис.

3)

В дополнение был проведен анализ молекулярных дисперсий для выявления процента вариаций между регионами HVR1 популяций квазивидов в изолягах до и после сероконверсии в острой фазе ВГС-инфекции (19 пациентов). Были найдены статистически значимые вариации у 7 пациентов (Z2, ТА, TI, Z8, F4, F10 и F12), значения вариаций варьировались от 9,4% до 80,4%. Также были оценены вариации по индивидуальным аминокислотным позициям региона HVR1 (рис. 4). Достоверные вариации аминокислот были найдены в позициях 1, 12, 14, 17, 18,21,24.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 »3 Ii 15 16 17 IS 19 20 ГI ^ 23 24 25 Ээ 27 33 29

Позиции НУШ

Рисунок 4. Позиции НУЯ1 со статистически значимыми вариациями аминокислот до и после сероконверсии. Повышение процента вариациий показано оттенком цвета - от холодного к теплому

На рисунках 5 и 6 показаны филогенетические деревья построенные методом объединения соседей (МЖ) для 19 пациентов с острой ВГС-инфекцией. Только в четырех сероконверсионных панелях (Т2, Р4, Р7 и Р12) доминантная до сероконверсии последовательность НУЮ не была обнаружена после появления анти-ВГС антител.

Рисунок 5. Филогенетические деревья (МЛЧ) изолятов от сероконверсионных моделей. Желтым цветом представлены квазивиды до появления антител, синим — после. Аминокислотные изменения показаны красным цветом.

• •••

.8 .

(f—-

F2

X

РЛ

il *

t I "

F5

F6

F7

F8

0-4

F9

F10

ri

Y-0

о -

F11

F12

Q- - <>

/1

< .- » •

Рисунок 6. Филогенетические деревья (MJN) изолятов, описаных Farci и соавт. Желтым цветом представлены квазивиды до появления антител, синим - после. Аминокислотные изменения показаны красным цветом.

Все описанные выше различия в частоте встречаемости аминокислот на определенных позициях HVRI могут являться маркером конформационных изменений изучаемого сегмента и тем самым его свойств.

Антитела класса IgG против региона HVR1. В представленной работе сероконверсия анти-ВГС антител не оказывала должного эффекта на изменения в сегменте HVR1 изолятов вируса. Отсутствие значимых изменений может объясняться: (i) коротким временным промежутком между получением образцов плазмы крови от одного и того же пациента, изменения могут появиться позже [Pfafferott, 2011]; (ii) отсутствием влияния сероконверсии на вирусную популяцию. В то же время в тех случаях, когда изменения все же происходили, они приводили к значительным изменениям в структуре популяции квазивидов вируса.

Структура и биохимические свойства региона HVR1 квазивидов вируса гепатита С. Были обнаружены небольшие, но статистически значимые различия в популяция квазивидов изолятов, отобранных у больных острым и хроническом вирусном гепатитом С (1,18%, р=0,0003). При этом частота вариаций аминокислот была наиболее значимой на 5 позициях HVR1 участка (5, 7, 12, 16 и 18) (рис. 7). Следующим шагом было изучение, как эти различия отражаются на биохимических свойствах всего сегмента HVR1 и физико-химических свойствах каждой отдельной позиции. Для этой цели каждая последовательность HVR1 была трансформирована в последовательность цифровых значений, соответсвующих 10-и свойствам. При сравнении двух групп по всем 10 свойствам всех позиций HVR1 разница между ними была статистически значимой (метод MRPP, р=0,0109). При сравнении всех позиций HVR1 по каждому из свойств в отдельности, следующие свойства статистически значимо между двумя группами различались, - были выше при хронической ВГС инфекции: количество основных аминокислот в сегменте (метод MRPP, р=0,009), изоэлектрическая точка (метод MRPP, р=0,0044), объем (метод MRPP, р=0,0087), заряд сети (метод MRPP, р=0,0117) и доступная площадь поверхности (метод MRPP, р=0,0187). При сравнении каждой отдельной аминокислотной позиции полярность, объем и гидрофобность статистически значимо различалась между двумя группами по 10 позициям HVR1, таким как 1, 4, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 21, 22 и 29 (рис. 7). В хронической стадии ВГС-инфекции количество основных аминокислотных остатков на позициях 1, 14 и 21 было больше, чем в острой стадии. В то же время в позиции 15 количество основных аминокислотных остатков преобладало в острой стадии ВГС-инфекции (рис. 7). Также при остром и хроническом гепатите С различался заряд участка и его изоэлектрическая точка (р=0,0117; р=0,0044, соответственно). Различия этих свойств также наблюдались по позициям 14, 15 и 21 в ту же сторону что и количество основных аминокислотных остатков в сегменте (рис. 7). Кроме того, в зависимости от стадии инфекции в позиции 22 наблюдался различный заряд аминокислот, а в позиции 16 различалась изоэлектрическая точка. Все

эти свойства связаны между собой и способны влиять на инфекционность вируса._____________________

-20

2 о

а g

«20

Й40

.1

I

■ Гидрофобность

■ Объем

■ Изоэлектрическаяточка

■ ß-структура

Мгг>*3"1ЛЮГ--00СГ|О

Н t—I t—I i—I f—I *—I т—Ii—I г-sj

L0.Q_0.0_Q_0_Q_Q_

позпщш HVR1

■ Основные AA

■ Заряд

■ Гибкость

■ а-спираль

ГО LH UD г^ со сг> с fN IN ГМ ГМ РМ fN (N та

0-0.0.0.0-0-0. о

Рисунок 7. Биохимические свойства позиций HVR1. По оси Y показано отношение средних значений каждого свойства в квазивидах изолятов с хронической ВГС-инфекцией к значениям в квазивидах изолятов с острой ВГС-инфекцией по отдельным позициям HVR1 и в целом по сегменту. Показано только 53 статистически значимо различающихся переменных (р<0,05)

Как было описано ранее в экспериментах с псевдочастицами ВГС в отсутствие основных аминокислотных остатков, инфекционность снижалась до того же уровня, который наблюдался у псевдочастиц ВГС с удаленным HVR1 сегментом [Callens, 2005]. Присутствие или отсутствие основных аминокислот в сегменте HVR1 в определенных позициях модулировало инфекционность вирусных псевдочастиц. Эти результаты говорят о том, что данный сегмент вовлечен во взаимодействие с рецепторами гепатоцитов хозяина. Кроме того считается, что сегмент HVR1 является мишенью для нейтрализующих антител. По последним данным, выход вирусного генома в цитозоль требует pH-зависимого слияния вирусной и клеточной мембран. Предполагают, что антитела хозяина могут подавлять процесс слияние и таким образом блокировать вирусную инфекционность [Edwards, 2012].

Возможно, что изменение количества аминокислотных остатков с основными свойствами по мере прогрессирования инфекции, представляет собой процесс адаптации вируса к иммунному ответу хозяина. Более гидрофобные свойства у больных ХГ С по сравнению с больными острым гепатитом С проявлялись в позициях 5 и 12, позиция 15 обладала более гидрофобными свойствами в острой стадии инфекции. Три из этих позиций также показывали статистически значимую разницу аминокислотных вариаций в тесте АМОУА (позиции 5, 12 и 16), как было описано выше. Позиция 6 была консервативна и содержала чаще всего глицин, такие позиции как 2, 7, 23 и 24 также были сравнительно консервативны по сравнению с другими.

Классификация групп. Как следует из данных, представленных в предыдущем разделе, были обнаружены значимые различия в свойствах участка НУЮ на разных стадиях ВГС-инфекции, то есть при острой и хронической стадиях вирусного гепатита С. Далее была исследована возможность использования данной информации для разделения изолятов на две группы - «острый ВГС» и «хронический ВГС». На рисунке 8 показана модель, сконструированная методом линейных проекций и основанная на 18 переменных.

Рисунок 8. ЯасМг проекция консенсусных последовательностей НУЯ1, основанная на 18 переменных. Синим цветом показаны последовательности от образцов, принадлежащих группе «острый ВГС», красным - «хронический ВГС». Плотность цвета прямо пропорционально вероятности, того, что проецируемая последовательность принадлежит к данной группе.

В качестве переменных использовались физико-химические свойства отдельных позиций консенсуных последовательностей участка НУИ.1 или биохимические свойства всего сегмента: гидрофобность позиций 5, 12 и среднее значение по сегменту, гибкость позиций 16 и 12, полярность позиции 29, способность к формированию а-спирали позиций 4 и 12, изоэлектрическая точка позиций 16 и 19, способность к формированию Р-структуры позиций 12 и 29, объем позиций 11, 15 и 29, относительные частоты а.о. в белке позиций 16 и 18 и количество основных аминокислот в сегменте. После процедуры скользящего контроля по отдельным объектам, точность разделения между группами составила 88 %. Для дополнительной оценки точности модели была построена кривая ошибок или ЯОС-кривая. Площадь под кривой ошибок составляла 0,94, показывая, что точность

Было выявлено, что регионы НУЮ квазивидов вируса, выявленных в изолятах, полученных от больных острым и хроническим гепатитом С существенно отличаются друг от друга по биохимическим и физико-химическим свойствам. Это позволило нам предположить, что существует возможность создания диагностического теста для дифференциальной диагностики разных стадий ВГС-инфекции, то есть дифференциальной диагностики острого и хронического вирусного гепатита С.

Метод дифференциальной диагностики острого и хронического гепатита С. При тестировании образцов плазмы крови сероконверсионных панелей антитела класса ^М против белков вируса гепатита С были обнаружены только в 69.2% случаев (18 образцов). В семи из 18 положительных на антитела образцах присутствовали антитела только к одному из антигенов. При разделении группы «острый гепатит С» на две подгруппы: «ранний острый гепатита С» (до 65 дней после последнего анти-ВГС отрицательного результата) и «поздний острый гепатит» С (после 65 дней) заметили, что ^М антитела присутствуют в 75% случаев в первой подгруппе и в 50% случаев во второй подгруппе. Кроме того, было замечено, что только у двух пациентов анти-ВГС ^М детектировали до появления анти-ВГС При анализе серологического профиля пациентов с

хронической инфекцией только у 54,6% из них были обнаружены антитела класса ^М против белков ВГС (77 из 141 пациентов). Неполный серологический профиль наблюдался у 11 из них. Реактивность антител класса ^М против кор-белка была достоверно выше (р<0.05) при хроническом гепатите С, чем при остром на разных стадиях. Реактивность ^М-антител против белка N54 была достоверно выше (р<0,05) для образцов плазмы крови, полученных от пациентов с ранним острым гепатитом С в сравнении с другими группами. Реактивность же антител класса ^М в отношении других антигенов не показала статистически значимых различий между группами и подгруппами.

При тестировании образцов плазмы крови сероконверсионных панелей на присутствие антител класса против белков вируса гепатита С, обнаружили, что некоторые из них показывали неполный сероконверсионный профиль, то есть специфическую ^в-реактивность только против одного из антигенов. Кор-антиген являлся самым иммунореактивным белком, так как реагировал с 78.1% образцов плазмы крови больных с острой ВГС-инфекцией (107 из 137 образцов) и с 99,3% образцов плазмы больных хроническим гепатитом С (140 из 141 образцов).

Так как сероконверсионная панель, представляет собой несколько образцов плазмы крови, взятой у лица с острым гепатитом С, то среднее значение коэффициента позитивности было рассчитано для каждого антигена такого пациента. Различия между средними значениями реактивности между группами с 95% доверительным интервалом были статистически значимыми для всех тестируемых белков. Для классификации полученных данных по группам, согласно стадиям заболевания, была применена мультивариантная модель логистической регрессии. Наиболее статистически значимые различия были найдены между группами ранней острой инфекции и группой хронической инфекции.

Точность модели для разделения других групп имела низкую точность и соответственно большой процент ошибки (50-60% составлял процент образцов, чья принадлежность к группе была предсказана правильно). Таким образом, основываясь на специфическом иммуном ответе разделить с достаточно высокой точностью по 8 белкам удалось только две группы образцов плазмы крови: «ранний острый гепатит С» (до 65 дней, после последнего анти-ВГС отрицательного результата) и «хронический гепатит С». Полученная мультивариантная модель классифицировала доноров на группы с точностью 100% для ранней острой инфекции и 97,9% для хронической инфекции.

Для дополнительной оценки надежности модели была построена ЯОС-кривая. Площадь под кривой составляла 0,9972, показывая, что точность разделения между образцами, полученными от больных острым гепатитом С и больных хроническим гепатитом С достаточно высока. Была произведена оценка прогностической способности классификационной модели для неизвестных образцов плазмы с помощью процедуры скользящего контроля методом контроля по отдельным объектам. Точность классификации после проведения данной процедуры составила 90,8% для пациентов с острым вирусным гепатитом С и 97,2% для пациентов с хроническим вирусным гепатитом С.

ВЫВОДЫ:

1. При острой и хронической стадиях гепатита С обнаружены статистически значимые различия в таких свойствах участка HVR1, как количество основных аминокислот в сегменте, изоэлектрическая точка, объем, заряд сети и доступная площадь поверхности.

2. Различия в свойствах участка HVR1 дали возможность сконструировать модель, позволяющую разделять стадии острого и хронического гепатита С с точностью, равной 88%.

3. Дивергентность аминокислотной последовательности участка HVR1 квазивидов изолятов вируса гепатита С при хронической стадии инфекции статистически выше в сравнении с изолятами, полученными от больных с острой стадией инфекции. Различия обнаружены как для аминокислотной последовательности в целом, так и для отдельных позиций, таких как 5, 7, 12 и 16.

4. На основе технологии Luminex, разработаны мультиплексные тесты, которые позволяют определять у больных вирусным гепатитом С специфическую реактивность IgM и IgG антител против структурных и неструктурных белков вируса.

5. Результаты тестирования специфической реактивности IgG против структурных и неструктурных белков вируса гепатита С были использованы для построения модели, с помощью которой можно дифференцировать раннюю острую стадию ВГС-инфекции от хронической с точностью 90,8% и 97,12%, соответственно.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ, ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Астраханцева И.В., Кампо Д., Новиков В.В., Худяков Ю.Е. Влияние сероконверсии на изменения в участке HVR1 белка Е2 вируса гепатита С//Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2012. №2(3). С. 5-11

2. Astrakhantseva I.V., Campo D., Araujo A., Teo C-G., Khudyakov Y., Kamili S. Différences in variability of hypervariable région 1 of hepatitis С virus (HCV) between acute and chronic stages of HCV infection//In silico Biology. 2011-2012, №11, vol.5-6. P. 163-173

3. Araujo A., Astrakhantseva I.V, Fields H.A., Kamili S. Distinguishing Acute from Chronic Hepatitis С Based on Antibody Reactivities to Spécifié Hepatitis С Virus Structural and Non-structural Proteins// Journal of Clinical Microbiology. 2011. №49, vol.l. P.54-57.

4. Campo D., Astrakhantseva I.V., Araujo A., Dimitrova Z., Matveeva E.M., Teo C-G., , Kamili S„ Khudyakov Y. Intra-Host Evolution of HCV HVR1 during Seroconversion//20th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses. Melbourne, Australia, October 6-10, 2013.

5. Astrakhantseva I.V., Campo D., Araujo A., Teo C-G., Khudyakov Y., Kamili S. Variation in Physicochemical Properties of the Hypervariable Region 1 during Acute and Chronic Stages of Hepatitis С Virus Infection// IEEE Xplore Digital Library, doi: 10.1109/BIBMW.2011.6112357.

6. Astrakhantseva I.V., Campo D., Araujo A., Xia G-l, Teo C-G., Kamili S. Amino acid variation of HVR1 region during acute and chronic stages of hepatitis С virus infection// 10th International Conference on Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics of Infectious Diseases, Amsterdam. The Netherlands, November 3-5, 2010.

7. Astrakhantseva I., Araujo A., Ulanova Т., Obriadina A., Kamili S. Specific IgM responses to structural and non-structural HCV Antigen//15th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses. San Antonio, TX, USA, October 5-9, 2008.

8. Araujo A., Astrakhantseva I., Dimitrova Z., Ulanova Т., Obriadina A., Fields H. Simultaneous detection of antibodies to hepatitis С virus protein using the Luminex system to distinguish acute from chronic hepatitis СП Emerging Technologies of Medical Importance for the Diagnosis of Infectious Diseases and the Detection of Pathogenic Microbes. Beijing, China, April 6-10, 2008. P.15

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГС - вирусный гепатит С РНК - рибонуклеиновая кислота ИНФ - интерферон

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

МИФ - медианая интенсивность флуоресценции

ПЦР — полимеразная циклическая реакция

кДНК - комплиментарная дезорибонуклеиновая кислота

HVR1 - гипервариабельный участок 1

IgG - иммуноглобулин G

IgM - иммуноглобулин М

MJN - метод объединения соседей

AMOVA - анализ молекулярных дисперсий

Подписано в печать 7.10.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1. Заказ № 813. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в РИУ ИНГУ им. Н.И. Лобачевского. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Астраханцева, Ирина Владимировна, Нижний Новгород

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

Астраханцева Ирина Владимировна

ОСОБЕННОСТИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С В ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ СТАДИЯХ ИНФЕКЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ СТАДИЙ

03.02.02 - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/ ПП Л -Т / * Л 1А

уч£и i сюч' i а!

На правах рукописи

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор, Виктор Владимирович Новиков

НИЖНИЙ НОВГОРОД 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................6

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................12

1.1. Структурная и молекулярная организация вируса гепатита С..............12

1.1.1. Кор-белок...................................................................................................14

1.1.2. Белки оболочки..........................................................................................15

1.1.3 Неструктурные белки...................................................................................16

1.2. Жизненный цикл вируса...............................................................................18

1.3. Молекулярная эволюция вирусов................................................................21

1.4. Генетическая гетерогенность ВГС................................................................24

1.4.1. Гипервариабельный участок НУШ...........................................................27

1.4.2. Свойства участка НУШ..............................................................................29

1.5. Иммунный ответ хозяина на вирус..............................................................31

1.5.1. Т-клеточный ответ.......................................................................................31

1.5.2. Вирусные факторы, влияющие на иммунный ответ................................36

1.5.3. В-клеточный иммунный ответ....................................................................38

1.6. Диагностика ВГС-инфекции..........................................................................42

1.6.1. Детекция вирусной РНК в тканях организма............................................42

1.6.2. Клиническая диагностика вирусного гепатита С.....................................44

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................................48

2.1. Материалы.......................................................................................................48

2.2. Методы.............................................................................................................51

2.3. Статистическая обработка результатов...................................................57

III. РЕЗУЛЬТАТЫ........................................................................................................63

3.1. Структура квазивидов участка НУШ белка Е2.......................................63

3.2. Антитела класса 1оО против региона Н VII1.............................................71

3.3. Свойства квазивидов участка НУШ белка Е2........................................75

3.4. Классификация групп...................................................................................78

3.5. Метод дифференциальной диагностики острого и хронического

гепатита С.................................................................................................................80

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.........................................................................88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................102

ВЫВОДЫ....................................................................................................................105

БЛАГОДАРНОСТИ...................................................................................................106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................107

ПРИЛОЖЕНИЕ 1...........................................................................................................1

ПРИЛОЖЕНИЕ 2..............................................................................:..........................11

ПРИЛОЖЕНИЕ 3.........................................................................................................16

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АСАТ - аспартатаминотранфераза

AJIAT - аланинаминотрансфераза

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВГС - вирусный гепатита С

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

РНК - рибонуклеиновая кислота

ИНФ - интерферон

МИФ - медиана интенсивности флуоресценции НТР - нетранслируемые регионы

кДНК - комплиментарная дезорибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная циклическая реакция

ХГС - хронический гепатит С

ФСР - фосфато-солевой раствор

AMO VA - анализ молекулярных дисперсий

dN - несинонимичные мутации

dS - синонимичные мутации

CTL - цитотоксические Т лимфоциты

HLA - человеческий лейкоцитарный антиген

HVR1 - гипервариабельный участок 1

IgG - иммуноглобулин G

IgM - иммуноглобулин М

IRES - участок внутренней посадки рибосомы

MJN - метод объединения соседей

NK - естественные киллеры

Th - Т-хелперные лимфоциты RIBA - рекомбинантный иммуноблот

RT-ПЦР - полимеразная циклическая реакция с обратной транскрипцией

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Около 170 миллионов человек в мире больны вирусным гепатитом С, который может быть причиной цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Возбудитель этого широко распространенного заболевания - вирус гепатита С - передается парентерально и на сегодняшний день является основной причиной гемоконтактных гепатитов [30].

ВГС представляет собой имеющий оболочку РНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Flaviviridae [52]. На всех стадиях заболевания вирус существует как гетерогенная популяция различных, но близкородственных вирусных частиц, относящихся к так называемым квазивидам [25]. Гетерогенность популяции способствует быстрой селекции мутантов, более приспособленных к иммунному ответу организма хозяина и формированию хронической инфекции [127]. РНК вируса гепатита С остается на детектируемом уровне в крови и печени на протяжении более чем 20 лет у 85% инфицированных пациентов [27]. Острая инфекция у большинства пациентов протекает бессимптомно, только около 25-30% пациентов с острым гепатитом С спонтанно элиминирует вирус [10, 111]. Если вирус персистирует в организме более чем 6 месяцев, то заболевание считается перешедшим в хроническую форму.

Квазивиды формируются благодаря высокой вариабельности отдельных участков генома вируса, в частности генов, кодирующих поверхностные белки Е1 и Е2. Наиболее высокая вариабельность характерна для региона, называемого HVR1 и локализованного на N-конце белка Е2 [25]. Данный регион содержит 27 аминокислот и формирует главный поверхностный антиген вируса, являющийся также доминантным эпитопом для нейтрализующих антител [68, 69, 143, 144, 162].

Высокая вариабельность HVR1 последовательностей коррелирует с появлением мутантов, позволяющих вирусу избегать иммунного ответа, и играет важную роль в поддержании персистенции вируса во время хронической инфекции [65, 103, 115, 143, 151, 155]. Кроме того, уровень и природа замен в HVR1 в период ранней стадии инфекции коррелирует с исходом заболевания [67]. Считается, что вариабельность нейтрализующих эпитопов является одной из причин, осложняющих создание вакцины против вирусного гепатита С. Однако, несмотря на высокую вариабельность этого участка, показано присутствие сильной негативной селекции против некоторых аминокислотных замен, обеспечивающей консервативность аминокислот в отдельных положениях, что указывает на важную биологическую роль HVR1 в жизненном цикле вируса. Таким образом, характеристика популяции квазивидов ВГС и биохимических свойств участка HVRlHa разных этапах заболевания важна для понимания их биологического значения при остром и хроническом гепатитах С, что может помочь в создании вакцины [51].

Дифференциальная диагностика острого гепатита С от хронического важна для успешной терапии больных. Терапия а-ИНФ-2Ь и рибавирином, начатая на начальной стадии инфекции, ведет к излечению инфекции в 98% случаев. Успешный исход терапии, начатой в хронической стадии заболевания, наблюдается только в 42-82% случаев [180]. Ни один из таких маркеров как РНК вируса гепатита С, антитела к белкам вируса класса IgG, увеличение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке или плазме крови не может быть использован для детекции острой инфекции, т.к. все эти маркеры могут быть обнаружены также при хронической форме заболевания [59]. Кроме того, дифференциальная диагностика острого и хронического гепатита С, основанная на клинической симптоматике, оценке эпидеомиологических факторов риска, не всегда эффективна, поскольку у большинства больных острым гепатитом С заболевание протекает бессимптомно [54, 180]. Такие методы, как определение

анти-ВГС ^М [50, 56], измерение авидности антител класса 1^0 против белков вируса [94] и последовательное определение титра вируса в крови [117] были предложены как маркеры острой ВГС-инфекции. Польза анти-ВГС ^М, как маркера острой инфекции, остается противоречивой [50, 56]. Другие методы, предполагают использование изменений в концентрации вируса для определения острой инфекции, но требует отбора нескольких образцов крови в определенные промежутки времени [17, 117]. Исходя из приведенных выше данных существует необходимость в создании новых тестов и алгоритмов, позволяющих с достаточной точностью дифференцировать острое бессимптомное течение вирусного гепатита С от хронического.

Цель работы: Провести сравнительный анализ аминокислотных последовательностей гипервариабельного участка НУЯ1 белка Е2 изолятов вируса гепатита С и на основе полученных данных разработать новые подходы к дифференциальной диагностике острого и хронического гепатита С.

Задачи исследования:

1. Осуществить сравнительную характеристику вариаций аминокислотных последовательностей НУЮ белка Е2 при остром и хроническом вирусном гепатите С.

2. Оценить свойства НУЯ1 белка Е2 квазивидов вируса при острой и хронической формах вирусного гепатита С.

3. Изучить влияние сероконверсии на изменения в популяции квазивидов вируса гепатита С.

4. Разработать мультиплексные тесты на базе технологии Ьштппех (анти-ВГС

и анти-ВГС ^М) для детекции гуморального ответа на структурные и неструктурные белки вируса гепатита С.

5. Создать модели для дифференциальной диагностики острой и хронической стадий вирусного гепатита С.

Научная новизна. Впервые были оценены свойства гипервариабельного участка 1 белка Е2 вируса гепатита С на разных стадиях инфекции для выявления направления эволюции вирусных квазивидов на острой и хронической стадиях заболевания. При сравнении 10 показателей, отражающих биохимические и физико-химические свойства указанного участка аминокислотной последовательности белка Е2, обнаружены статистические значимые различия между изолятами вируса, полученными от больных острым и хроническим гепатитом С. Кроме того, впервые выявлены статистически значимые различия по каждому из следующих свойств: количество основных аминокислот в сегменте, изоэлектрическая точка, объем, заряд сети, доступная площадь поверхности, полярность, и гидрофобность. Впервые на основе информации о; свойствах аминокислотных последовательностей НУЮ была построена модель, применимая для разделения изолятов вируса гепатита С на две группы, соответствующие острой и хронической стадии гепатита С. По указанным свойствам участков НУЮ модель позволяет проводить дифференциальную диагностику острой и хронической стадий инфекции с точностью, равной 88%.

Впервые были обнаружены значимые различия между популяциями квазивидов у пациентов с острой и хронической инфекцией. Кроме этого обнаружено пять аминокислотных позиций НУШ, которые вносят значительный вклад в дифференциацию стадий.

Впервые на основе технологии Ьшшпех разработан мультиплексный тест для определения анти-ВГС и ^М против структурных и неструктурных белков ВГС. Данный тест позволяет при минимальных затратах образца (1 цл плазмы или сыворотки крови) определять антитела против восьми антигенов в одной лунке.

Результаты данных тестов использованы для разработки алгоритма на основе модели логистической регрессии для дифференциальной диагностики стадий острого и хронического гепатита С. Точность модели составила 90,8% для

образцов плазмы крови больных острым гепатитом С и 97,2% для образцов плазмы крови больных с хронической формой инфекции.

Научно-практическая ценность. Обнаружены существенно значимые отличия физико-химических и биохимических свойств участка HVR1 белка Е2 изолятов вируса гепатита С, характерные для больных острой и хронической формами вирусного гепатита С, которые позволили построить модель для дифференцировки стадий заболевания. Данная модель может быть использована в исследованиях процессов эволюции вируса в организме хозяина, при разработке вакцин против вирусного гепатита С. Разработан иммунологический тест для дифференциальной диагностики острой и хронической стадий вирусного гепатита С, который применим, как дополнительный критерий оценки целесообразности терапии, поскольку лечение а-ИНФ-2Ь и рибавирином, начатое на начальной стадии инфекции, намного эффективнее в сравнении с терапией, проводимой в хронической стадии заболевания. Данный тест также может быть применим для проведения эпидемиологических исследований. Тест позволяет проводить диагностику при минимальных затратах плазмы или сыворотки крови. Положения, выносимые на защиту:

1. При прогрессировании вирусного гепатита С от острой к хронической стадии изменяются биохимические свойства гипервариабельного участка 1.

2. При прогрессировании инфекции вирусного гепатита С от острой к хронической стадий изменяются молекулярные свойства гипервариабельного участка 1.

3. Специфическая реактивность IgG против структурных и неструктурных белков вируса позволяет дифференцировать острую и хроническую стадии вирусного гепатита С.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации доложены на конференции Emerging Technologies of Medical Importance for the Diagnosis of Infectious Diseases and the Detection of Pathogenic

Microbes (Пекин, Китай 2008), на 15-том Международном Симпозиуме Гепатита С и родственных вирусов ( International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses) (Сан Антонио, Техас, США, 2008), на 10-ой международной конференции молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетике инфекционный заболеваний (International Conference on Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics of Infectious Diseases) (Амстердам, Нидерланды, 2010), на международной конференции по биоинформатике и биомедицине (BIBM) (Атланта, Джорджия, США, 2011), на 20-том Международном Симпозиуме Гепатита С и родственных вирусов (International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses) (Мельбурн, Австралия, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МинОбрНауки России для публикаций основных результатов исследования.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 130 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 8 таблицами, включая 3 таблицы приложения. Список цитируемой литературы состоит из 196 источников.

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и интерпретирован лично автором, при содействии научного руководителя В.В. Новикова и коллектива лаботорного отделения отдела вирусных гепатитов Центра по контролю и предовращению заболеваний (США, Атланта).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структурная и молекулярная организация вируса гепатита С

В таксономической иерархии ВГС относят к роду Нерастгт семейства Памшгid.de [52].

Вирионы ВГС представляют собой мелкие сферические частицы диаметром 55-60 нм, обладают липопротеиновой оболочкой толщиной приблизительно 6 нм. Пеплос окружает нуклеокапсид диаметром 30-35 нм, предположительно икосаэдрической симметрии [89, 142]. Было продемонстрировано, что плавучая плотность ВГС в инфекционной фракции сыворотки (1,06-1,08 г/мл) ниже, чем в неинфекционной (1,17 г/мл) [78]. Данные наблюдения, как предполагается, отражают тот факт, что вирус неспецифически взаимодействует с фракцией липопротеинов низкой плотности. Вирионы, ассоциированные с липопротеиновой фракцией, относительно более инфекционны, чем в составе фракции, в которой вирионы покрыты антивирусными иммуноглобулинами и образуют иммунные комплексы. Наблюдаемая вариабельность в плавучей плотности также отражает присутствие дефектных вирусных частиц, диаметром 30-35 нм, по-видимому, представляющих собой нуклеокапсиды [112]. Таким образом, ВГС может циркулировать в плазме инфицированных пациентов в различных формах.

Геномом ВГС является РНК положительной полярности размером 94009600 нуклеотидов [78]. РНК имеет одну открытую рамку считывания, фланкированную с 5'-и З'-концов нетранслируемыми регионами [16,84].

Открытая рамка считывания кодирует полипротеин, величина которого варьирует у разных изолятов вируса и имеет размер от 3008 до 3037 аминокислотных остатков [148]. Оба НТР содержат высоко консервативные РНК

структуры, которые имеют важное значение для репликации генома вируса и репликации полипротеина [128]. 5-конец НТР включает в себя участок внутренней посадки рибосомы, который связывается с рибосомальной 40S субъединицей и инициирует трасляцию полипротеина по кэп-независимому механизму [177]. З'НТР содержит три шпилькообразные